ES2320344T3

ES2320344T3 - Polimorfismo del gen cyp1a2 canino.

Info

Publication number: ES2320344T3
Application number: ES04745392T
Authority: ES
Inventors: Daisuke c/o Astellas Pharma Inc. TENMIZU; Yasuhisa c/o Astellas Pharma Inc. FUKUNAGA; Kiyoshi c/o Astellas Pharma Inc. NOGUCHI
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2003-05-29
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2009-05-21
Anticipated expiration: 2024-05-28
Also published as: EP1672069A4; CA2511404A1; CA2511404C; EP1672069A1; JP3767632B2; DE602004019552D1; US20060051766A1; JPWO2004106521A1; EP1672069B1; ATE423202T1; US7399587B2; WO2004106521A1

Abstract

Un procedimiento in vitro para detectar un polimorfismo genético del CYP1A2 canino caracterizado por la determinación de una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22).

Description

Polimorfismo del gen CYP1A2 canino.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una detección de variaciones individuales en el metabolismo farmacológico mediante la determinación de un polimorfismo de un solo nucleótido (denominado en lo sucesivo PSN) de un gen CYP1A2 de un perro (concretamente, un perro Beagle) usado en un análisis de medicamentos, un procedimiento para seleccionar un perro usado en un análisis de medicamentos y un ADN para determinar una secuencia de una región polimórfica.

Antecedentes de la técnica

El metabolismo farmacológico es un cambio en una estructura química de un compuesto generado por una acción enzimática en un cuerpo vivo. Tal enzima, que contribuye al metabolismo del fármaco, se denomina enzima metabolizante del fármaco. Originariamente, se considera que las enzimas metabolizantes de fármacos catalizan las reacciones sintéticas o las reacciones de descomposición de biomoléculas tales como los esteroides, los ácidos grasos o los ácidos biliares, pero que pueden metabolizar los fármacos administrados a o que invaden el cuerpo (i.e., sustancias foráneas), mediante lo que las sustancias foráneas son eliminadas del cuerpo.

Una reacción metabolizante de un fármaco está básicamente compuesta por una reacción de fase I y una reacción de fase II. En la reacción de fase I, se introducen uno o más grupos funcionales polares en un fármaco mediante oxidación, reducción y/o hidrólisis. En la reacción de fase II, se unen una o más biomoléculas, tales como el ácido glucurónico, el ácido sulfúrico o la glutationa, al o a los grupos funcionales generados en la reacción de fase I. Las reacciones de fase I y de fase II confieren una excelente solubilidad en agua al fármaco, y por consiguiente, el fármaco es fácilmente excretado del cuerpo.

Las enzimas metabolizantes que contribuyen al aproximadamente 80% de todas las reacciones metabolizantes de fármacos de fase I se denominan "citocromo P450" (en lo sucesivo, denominado "CYP"). Los CYP tienen un peso molecular de aproximadamente 50.000 y contienen un protohemo como grupo prostético. Si se considera 100 como el peso molecular medio de un aminoácido, el CYP está compuesto por aproximadamente 500 aminoácidos. En la clasificación y la nomenclatura de los CYP, los CYP se denotan sistemáticamente colocando un número arábigo que indica la "familia" y un carácter alfabético que indica la "subfamilia" detrás de "CYP". Se considera familia a un grupo de moléculas de CYP que muestran una homología (secuencia de aminoácidos) de más del 40%. Se considera subfamilia a un grupo de moléculas de CYP que muestran una homología de más del 55%. Cuando una familia contiene dos o más subfamilias, las subfamilias se denotan por orden alfabético (por ejemplo, CYP2A, CYP2B y CYP2C). Las diversas moléculas de CYP contenidas en una subfamilia se denotan colocando un sufijo de número arábigo más (por ejemplo, CYP1A1). Actualmente, las familias de 1 a 4 se conocen como los CYP de tipo de metabolismo farmacológico en mamíferos (referencia no de patente 1).

Como condiciones preferidas de los perros usados como animales grandes de laboratorio, caben mencionar, por ejemplo, (1) la homogeneidad en la forma, la respuesta fisiológica o similares, (2) que no tengan una carencia genética y (3) que tengan un registro claro de los datos del nacimiento (tales como el origen o la fecha de nacimiento). La variedad más preferible que cumple las condiciones anteriores es la de los Beagle (referencia no de patente 2). Por lo tanto, un Beagle es una variedad animal ampliamente usada en los análisis de animales grandes por razones de seguridad y de toxicidad o farmacocinética, cuando se rastrean los compuestos en la etapa de búsqueda. A este respecto, los CYP caninos que contribuyen al mecanismo de metabolismo farmacológico en un Beagle son cada vez más claros. Se han identificado algunas familias de CYP caninos mediante diversas técnicas de clonación. Se han clonado las secuencias completas o parciales codificantes de CYP1A1 y CYP1A2 (referencia no de patente 3), de CYP2B11 (referencia no de patente 4), de CYP2C21 y CYP2C41 (referencia no de patente 3 y referencia no de patente 5), de CYP2D15 (referencia no de patente 6), de CYP2E1 (referencia no de patente 7) y de CYP3A12 y CYP3A26 (referencia no de patente 8 y referencia no de patente 9). Con respecto a casi todos los CYP descritos anteriormente, se han determinado las secuencias completas que contienen un marco de lectura abierto (denominado en lo sucesivo ORF), pero la secuencia codificante de CYP1A2 sólo ha sido determinada parcialmente. Una familia de CYP1 humano incluye dos subfamilias, A y B, que son inducidas por hidrocarburos aromáticos policíclicos (tales como el 3-metilcolantreno) o por la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD, dioxina). El mecanismo de metabolismo farmacológico en la familia de los CYP1 se mantiene mejor entre los CYP, y por tanto la especificidad de sustrato en seres humanos es muy similar a la de los animales de laboratorio. La oxidación de hidrocarburos aromáticos policíclicos carcinogénicos o micotoxinas, o la hidroxilación de los átomos de nitrógeno en aminas aromáticas o aminas heterocíclicas son reacciones típicas, y la familia de los CYP1 está estrechamente relacionada con una activación metabólica de un carcinógeno (referencia no de patente 10).

En un Beagle, se ha confirmado que el CYP1A1 es expresado ligeramente en los pulmones, pero que no se expresa en el hígado. El CYP1A2 sólo se expresa en el hígado y representa aproximadamente el 4% de todos los CYP expresados en el hígado (referencia no de patente 3 y referencia no de patente 11).

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Hay una diferencia individual en la sensibilidad a fármacos que está asociada con la de una capacidad de metabolismo farmacológico. Hasta el momento, se ha encontrado una diferencia en una capacidad de metabolismo farmacológico derivada de una diferencia en la dinámica interna. Los más comúnmente conocidos son la tolbutamida, la debrisoquina y la esparteína. Se ha aclarado que tal diferencia en la dinámica farmacológica interna se debe a una diferencia en una actividad de una enzima metabolizante provocada por uno o varios polimorfismos de un solo nucleótido [PSN] en un gen CYP que metaboliza el fármaco. Más concretamente, cuando se sustituye una o más bases de los cuatro tipos de bases contenidos en el ADN, se producirá la sustitución del o de los aminoácidos en una proteína enzimática, la introducción de un codón de terminación en una secuencia de ADN o un desplazamiento de marcos. La sustitución de uno o varios aminoácidos a veces puede reducir una actividad enzimática, y la introducción de un codón de terminación y un desplazamiento de marcos a veces pueden generar una proteína inmadura. Por lo tanto, se conocen fármacos en los que se observa una diferencia individual notable en la dinámica interna provocada por uno o varios PSN en una enzima metabolizante de fármacos (referencia no de patente
12).

En cuanto a los PSN en un gen CYP1A2 humano, se informó sobre la disminución de una cantidad de CYP1A2 expresada mediante un PSN de -3858G>A (mutación CYP1A2*1C) y un PSN de -164C>A (mutación CYP1A2*1F) ubicados en la región de secuencia arriba del gen. Sin embargo, en cuanto al PSN de -164C>A, se informó que hubo un aumento de una cantidad de CYP1A2 expresada generado por un factor medioambiental, i.e., tabaquismo, en comparación con factores genéticos. No se han identificado las funciones de otros PSN en el gen CYP1A2 humano (referencia no de patente 13, referencia no de patente 14 y referencia no de patente 15).

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Los PSN se examinan más ampliamente en los CYP, pero se pueden obtener nuevos descubrimientos a partir de enzimas distintas de los CYP o transportadores de fármacos. La tiopurina S-metiltransferasa (denominada en lo sucesivo TPMT) es una enzima que cataliza la metilación de algunos fármacos de tiopurina. La TPMT se localiza principalmente en el hígado, pero también se localiza en los eritrocitos y, por tanto, los eritrocitos se usan para analizar fenotipos en seres humanos. Usando una actividad TPMT en eritrocitos como índice, las actividades en blancos mostraron un perfil trifásico. El grupo que presentaba una actividad elevada representó el 88,6%, el grupo que presentaba una actividad media representó el 11,1% y el grupo que presentaba una actividad baja representó el 0,3%. Evans et al. analizaron un gen de TPMT en un paciente con leucemia con una pancitopenia aguda mediante la 6-mercaptopurina, y revelaron que el gen tenía tres mutaciones puntuales (TPMT*2, TPMT*3A y TPMT*3C) con sustituciones de aminoácidos que causaron la desaparición de la actividad enzimática (referencia no de patente 16). Salavaggione et al. examinaron un polimorfismo en la TPMT canina. Un análisis de fenotipos reveló las mismas diferencias individuales que las encontradas en seres humanos, pero no se encontraron PSN relevantes en la TPMT canina mediante un diagnóstico génico (referencia no de patente 17).

Además, se publicaron algunos PSN en un gen MDR1 (resistencia multifarmacológica) humano codificante de un transportador farmacológico, la glicoproteína P (denominada en lo sucesivo gp P). Hoffmeyer et al. publicaron que se analizaron caucasianos para descubrir que una mutación génica de C a T en la posición 3.435 del exón 26 del gen MDR1 codificante de la gp P reducía una cantidad de MDR1 expresada en el tracto digestivo y que se produjo el aumento de la concentración de digoxina en plasma tras la administración oral (referencia no de patente 18). Mealey et al. revelaron que las diferencias de la sensibilidad hacia un antibiótico macrolido, la ivermectina, en el sistema nervioso central de un perro Collie se debían a la gp P inmadura generada por una mutación de cambio de marco en el gen mdr1 (referencia no de patente 19).

En cuanto a los PSN caninos asociados con las enzimas metabolizantes de fármacos, Paulson et al. informaron que los perros Beagle se podían dividir en un grupo metabolizador extensivo (denominado en lo sucesivo ME) y en un grupo metabolizador lento (denominado en lo sucesivo ML) con respecto a una velocidad metabólica de un inhibidor de la ciclooxigenasa II, el celecoxib. Se cree que una subfamilia de CYP2D puede contribuir al polimorfismo, pero se desconocen más datos (referencia no de patente 20).

Miyashita et al. revelaron que hay dos grupos de perros Beagle que tienen diferentes patrones de metabolitos a partir de un inhibidor de la fosfodiesterasa IV, la 4-ciclohexil-1-etil-7-metilpirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona, en plasma (referencia no de patente 21).

Azuma et al. publicaron que los perros Beagle presentaban diferencias individuales en una concentración de metabolitos a partir de un agonista del receptor de la \alpha7-nicotina acetilcolina, el GTS-21, en plasma, y sugirieron que las diferencias en una cantidad de CYP1A expresada podrían contribuir a las diferencias individuales (referencia no de patente 22).

De manera similar, Mise et al. publicaron que las diferencias en una cantidad de CYP1A expresada en perros Beagle provocó diferencias individuales en una concentración de un antagonista frente a la benzodiazepina, el AC-3933, en plasma (referencia no de patente 23).

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Sin embargo, no se han identificado los PSN de los CYP caninos que pueden aclarar las diferencias individuales en un análisis de fenotipos de una capacidad metabolizante farmacológica en perros Beagle en un diagnóstico
génico.

: (referencia no de patente 1): Ryuich Kato y Tetsuya Kamataki ed., "YAKUBUTUTAISHAGAKU-IRYOUYAKUGAKU/DOKUSEIGAKU NOKISOTOSHITE-", 2ª Ed., TOKYOKAGAKUDOUZIN, Oct. 2000, p. 9-19;

: (referencia no de patente 2): Hiroshi Otokawa, "INUNOSEIBUTUGAKU", 1ª Ed., ASAKURASYOTEN, Sep. 1969, p. 179-187;

: (referencia no de patente 3): "Molecular pharmacology", EE.UU., 1990, Vol. 38, p. 644-651;

: (referencia no de patente 4): "Archives of biochemistry and biophysics", EE.UU., 1990, Vol. 281, p. 106-115;

: (referencia no de patente 5): "Drug metabolism and disposition", EE.UU., 1998, Vol. 26, p. 278-283;

: (referencia no de patente 6): "Archives of biochemistry and biophysics", EE.UU., 1995, Vol. 319, p. 372-382;

: (referencia no de patente 7): "Drug metabolism and disposition", EE.UU., 2000, Vol. 28, p. 981-986;

: (referencia no de patente 8): "Biochimica et biophysica acta", EE.UU., 1991, Vol. 1088, p. 319-322;

: (referencia no de patente 9): "The journal of pharmacology and experimental therapeutics", EE.UU., 1997, Vol. 283, p. 1425-1432;

: (referencia no de patente 10): Ryuich Kato y Tetsuya Kamataki ed., "YAKUBUTUTAISHAGAKU-IRYOUYAKUGAKU/DOKUSEIGAKU NOKISOTOSHITE-", 2ª Ed., TOKYOKAGAKUDOUZIN, Oct. 2000, p. 19-20;

: (referencia no de patente 11): "Xenobiotica", Reino Unido, 1996, Vol. 26, p. 755-763;

: (referencia no de patente 12): Warner Kalow, Urs Meyer y Rachel Tyndale ed., Tomohisa Ishikawa trans-ed., "PHARMACOGENOMICS - 21SEIKINOSOUYAKUTOKONOIRYOU-", 1ª ed., TECHNOMICS, Dec. 2002, p. 29-43;

: (referencia no de patente 13): "J. of Biochemistry", Japón, 1999, Vol. 125, Vol. p. 803-808;

: (referencia no de patente 14): "British journal of clinical pharmacology", Reino Unido, 1999, Vol. 47, p. 445-449;

: (referencia no de patente 15): "Pharmacogenetics", EE.UU., 1999, Vol. 9, p. 367-375;

: (referencia no de patente 16): Ryuich Kato y Tetsuya Kamataki ed., "YAKUBUTUTAISHAGAKU-IRYOUYAKUGAKU/DOKUSEIGAKU NOKISOTOSHITE-", 2ª Ed., TOKYOKAGAKUDOUZIN, Oct. 2000, p. 141-155;

: (referencia no de patente 17) "Pharmacogenetics", EE.UU., 2002, Vol. 12, p. 713-724;

: (referencia no de patente 18): "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", EE.UU., 2000, Vol. 97, p. 3473-3478;

: (referencia no de patente 19): "Pharmacogenetics", EE.UU., 2001, Vol. 11, p. 727-733;

: (referencia no de patente 20): "Drug metabolism and disposition", EE.UU., 1999, Vol. 27, p. 1133-1142;

: (referencia no de patente 21): "The 17th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics, poster session", Japón, 2002, 20PE-46;

: (referencia no de patente 22): "Drug metabolism and pharmacokinetics", Japón, 2002, p. 75-82;

: (referencia no de patente 23): "Drug metabolism and disposition", EE.UU., 2004, Vol. 32, p. 240-245;

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Revelación de la invención Problemas a resolver mediante la invención

Debido a que se lleva a cabo un análisis del efecto farmacológico o un análisis de la toxicidad para los compuestos candidatos a ser medicamentos usando perros que presentan grandes diferencias individuales en una capacidad metabolizante que afecta a la dinámica interna de la que depende el efecto farmacológico o la toxicidad de cada compuesto, existen considerables diferencias individuales en el análisis del efecto farmacológico o en el análisis de la toxicidad, y por lo tanto, los datos resultantes son ampliamente variables.

Los objetivos de la presente invención son proporcionar un procedimiento conveniente capaz de llevar a cabo un rápido diagnóstico génico de un gen CYP1A2 de perros (concretamente, de perros Beagle) usados en un análisis del efecto farmacológico o en un análisis de la toxicidad antes del análisis, y que sea además capaz de dividir los perros en un grupo que tenga una capacidad metabólica normal (un grupo ME) y en un grupo que tenga una capacidad metabólica baja (un grupo ML); y mediante el mismo, hacer posible la realización de un análisis del efecto farmacológico o un análisis de la toxicidad con individuos genéticamente homogéneos, así como la evaluación de un efecto farmacológico o una toxicidad de manera exacta.

Procedimientos para resolver los problemas

Los presentes inventores han realizado estudios intensivos y, por consiguiente, seleccionaron la 4-ciclohexil-1-etil-7-metilpirido[2,3-D]pirimidin-2(1H)-ona como un compuesto de análisis que era un sustrato específico de CYP1A2; determinaron los PSN en un gen CYP1A2 canino, lo que determinó los tipos ME y ML del compuesto de análisis; y descubrieron la generación de un codón de terminación mediante una sustitución de una base en el ORF del gen CYP1A2 del tipo ML. Además, los presentes inventores establecieron procedimientos convenientes (un procedimiento de PCR alelo específica y un procedimiento de secuencias directas) para detectar secuencias en los sitios de los PSN de una muestra sanguínea; determinar secuencias de las regiones de los PSN de los grupos ME y ML (cinco individuos por grupo) a los que se administró la 4-ciclohexil-1-etil-7-metilpirido[2,3-D]pirimidin-2(1H)-ona; y confirmar la generación de un codón de terminación mediante una sustitución de una base en todos los individuos del grupo ML, y que todos los individuos del grupo ME tenían un gen CYP1A2 sin tal codón de terminación recién generado heterogéneamente u homogéneamente; completándose así la presente invención.

La presente invención se refiere a:

[1] un procedimiento in vitro para detectar un polimorfismo genético del CYP1A2 canino caracterizado por la determinación de una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22);

[2] un procedimiento in vitro para determinar qué perro es un metabolizador extensivo o un metabolizador lento a la velocidad del metabolismo farmacológico, procedimiento que comprende:

preparar una muestra de ácido nucleico procedente de un perro y determinar una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22 o en la posición 87 del exón 4);

[3] un procedimiento in vitro para seleccionar un perro usado en un análisis de medicamentos, que comprende determinar qué perro es un metabolizador extensivo o un metabolizador lento a la velocidad del metabolismo farmacológico mediante el procedimiento de [2]:

[4] un procedimiento para analizar un efecto farmacológico y/o una toxicidad de un fármaco de análisis que comprende administrar un fármaco de análisis a un grupo metabolizador extensivo o a un grupo metabolizador lento mediante el procedimiento de [3];

[5] un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos que se hibrida con una cadena sentido o con una cadena antisentido de un gen CYP1A2 canino que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o la secuencia de nucleótidos constituida por los nucleótidos 63-1.601 de la SEC ID N.º 22, o un polimorfismo genético del mismo, en condiciones restrictivas, y que se selecciona del grupo constituido por:

[1] un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, en el que hay contenida una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22, siendo C la base correspondiente;

[2] un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, en el que hay contenida una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22, siendo T la base correspondiente; y

[3] un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, que es una cadena complementaria al ADN monocatenario (1) o (2);

[6] un ADN monocatenario de [5], constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º 14 ó 16, y

[7] un agente para diagnosticar un polimorfismo en una actividad metabólica de un fármaco que es un sustrato específico del CYP1A2 canino, agente que comprende como ingrediente activo un reactivo para detectar una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22), siendo dicho agente el ADN monocatenario según lo definido en [5] o [6].

Efectos de la invención

En la presente invención, los presentes inventores descubrieron un PSN en el que una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (i.e., en la posición 87 del exón 4) está sustituida de C a T. Según el PSN, un codón codificante de arginina (Arg) situado en la posición 373 de CYP1A2 cambia a un codón de terminación. Por consiguiente, el CYP1A2 no es expresado en un perro que tenga un genotipo T/T, prediciéndose así que las concentraciones de los fármacos metabolizados por el CYP1A2 en plasma pueden volverse sumamente elevadas en comparación con un perro que tenga un genotipo C/C o un genotipo C/T. Según lo descrito en los ejemplos, esta predicción ha sido demostrada a partir de la dinámica interna de un inhibidor de la fosfodiesterasa IV, compuesto A. Además, los presentes inventores establecieron un procedimiento de PCR alelo específica y un procedimiento de secuencias directas, como procedimientos capaces de detectar convenientemente el PSN. Los presentes inventores llevaron a cabo un diagnóstico génico de CYP1A2 de 65 perros usando estos procedimientos para revelar una frecuencia alélica.

Según lo dilucidado en la presente invención, el CYP1A2 canino a veces contiene el PSN causante del codón de terminación situado en la posición 1.117 (i.e., en la posición 87 del exón 4) y aproximadamente un 15% de los perros presenta el PSN homogéneamente. Como se muestra en los experimentos con el compuesto A, el PSN es un factor principal para las diferencias individuales en la dinámica interna de los fármacos metabolizados por el CYP1A2 en un perro. Los efectos farmacológicos y la toxicidad de un compuesto dependen de la dinámica interna. Por lo tanto, se considera que cuando el compuesto es metabolizado por CYP1A2, se observan notables diferencias individuales en la evaluación de los efectos farmacológicos y de la toxicidad del mismo. Según la presente invención, se puede llevar a cabo con rapidez un diagnóstico génico de CYP1A2 de perros usados en un análisis del efecto farmacológico o en un análisis de la toxicidad antes del análisis. Por consiguiente, se puede llevar a cabo un análisis del efecto farmacológico o un análisis de la toxicidad usando individuos genéticamente homogéneos, pudiéndose evaluar un efecto farmacológico o una toxicidad con mayor exactitud que con los procedimientos convencionales usados con anterioridad a la presente invención.

Mejor modo de llevar a cabo la invención [A] Procedimiento de detección in vitro y procedimiento de selección de perros de la presente invención

En la detección de la presente invención, se está detectando un polimorfismo en un gen CYP1A2 canino mediante la determinación de una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 del gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22). El término "una base correspondiente una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino", como se usa en la presente memoria, significa una base correspondiente a "una base situada en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22" en un gen CYP1A2 canino. Como genes CYP1A2 caninos, hay diversas secuencias de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos parcial de un gen CYP1A2 descrito en "MOLECULAR PHARMACOLOGY", 1990, Vol. 38, p. 644-651; una secuencia de nucleótidos constituida por los nucleótidos 63-1.601 de SEC ID N.º 22 determinada por primera vez por los presentes inventores en la presente invención; o secuencias de nucleótidos de las variantes alélicas de los mismos. Por lo tanto, la base correspondiente a "una base situada en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22" no está concretamente especificada, siempre y cuando sea una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino. Concretamente, no es necesario que cada secuencia flanqueante situada bien en el lado 5' o en el lado 3' de la base número 1.117 coincida exactamente con la de la SEC ID N.º 22.

Además, en el procedimiento de detección de la presente invención, se prepara una muestra de ácido nucleico de un perro, y se determina una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (i.e., en la posición 87 del exón 4) para detectar o determinar qué perro es un metabolizador extensivo (ME) o un metabolizador lento (ML) a la velocidad de metabolismo farmacológico. Cuando la base es un genotipo C/C o un genotipo C/T, se puede suponer que el perro es ME. Cuando la base es un genotipo T/T, se puede suponer que el perro es ML. Como ML, se prefiere el genotipo C/C.

Además, en el procedimiento de selección de perros de la presente invención, se selecciona un perro usado en un análisis de medicamentos mediante la detección o la determinación de si el perro es o no es ME o ML mediante el procedimiento de detección anterior de la presente invención.

1. Preparación de una muestra que contiene ácido nucleico canino

Una muestra de ácido nucleico usada en el procedimiento de la presente invención, preferiblemente, una muestra que contenga ADN genómico canino, se puede preparar a partir de un material aislado de un perro (particularmente, de un perro Beagle), tal como células distintas de células germinales, tejidos u órganos. Como material, se prefieren los leucocitos o las células mononucleares, siendo los leucocitos el material más preferible. Es posible aislar tales materiales según los procedimientos convencionales que se usan comúnmente en un análisis bioquímico.

Por ejemplo, si se usan leucocitos como material, se toma sangre periférica de un perro tal como un perro Beagle, y se separan los leucocitos de la sangre periférica según un procedimiento convencional. Se añaden a los leucocitos obtenidos proteinasa K y dodecil sulfato de sodio (SDS) para digerir y desnaturalizar las proteínas, y luego se lleva a cabo una extracción en fenol/cloroformo para obtener ADN genómico que incluye ARN. Si fuera necesario, es posible eliminar el ARN mediante RNasa. El procedimiento de extracción del ADN genómico no está limitado a la extracción en fenol/cloroformo, pudiéndose extraer el ADN genómico mediante, por ejemplo, un procedimiento conocido [por ejemplo, Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY] o con un equipo de extracción de ADN comercialmente disponible. Además, el ADNc preparado a partir del ARNm canino extraído según un procedimiento convencional se puede usar para detectar un polimorfismo genético.

2. Detección de polimorfismo genético

A continuación, se usa la muestra obtenida que contiene ácido nucleico canino para diagnosticar un genotipo del PSN, revelado por los presentes inventores, en el que una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 (en la posición 87 del exón 4) está sustituida de C a T. A continuación, se explicarán los procedimientos más comunes para detectar un polimorfismo genómico que se pueda usar en el procedimiento de la presente invención.

(1) Procedimiento RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción)

Cuando hay un sitio polimórfico genómico localizado en un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción, es posible detectar el polimorfismo genómico en base a una diferencia en la longitud de cada fragmento de ADN generado mediante la digestión con la enzima de restricción. La detección se puede llevar a cabo, por ejemplo, (a) mediante la digestión del ADN con una enzima de restricción y la realización de una transferencia Southern, o (b) mediante la amplificación de un fragmento de ADN que contenga un sitio polimórfico por PCR, la digestión del producto de PCR con una enzima de restricción y el análisis de los tamaños de los fragmentos de ADN digeridos mediante electroforesis.

Como sonda usada en el procedimiento anterior (a), se prefiere un fragmento de ADN (marcado con, por ejemplo, un isótopo, biotina o un colorante fluorescente) correspondiente a una secuencia que contenga el sitio polimórfico de interés y las secuencias flanqueantes de 5' y 3' (aproximadamente 0,5 a 2 kb). Como sonda PCR usada en el procedimiento anterior (b), se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 4 kb que contenga el sitio polimórfico.

(2) Procedimiento PCR-SSCP (polimorfismo de configuraciones monocatenarias)

El procedimiento PCR-SSCP es un procedimiento en el que se amplifica por PCR un fragmento de ADN que contiene un sitio polimórfico genético, se desnaturaliza térmicamente el producto de la PCR y se somete a electroforesis para separar los ADN monocatenarios que tienen diferentes configuraciones ("Biotechniques", 1994, Vol. 16, p. 296-297; y "Biotechniques", 1996, Vol. 21, p. 510-514). La emigración electroforética de un ADN monocatenario depende de la presencia o de la ausencia de polimorfismos genéticos y, por tanto, es posible llevar a cabo una determinación polimórfica analizando el patrón electroforético. Como patrón para la determinación, es preferible usar una muestra de ADN en la que se determine previamente una secuencia de nucleótidos que contenga el sitio polimórfico, como un ADN molde de PCR, junto con una muestra de análisis. Como sonda para la amplificación por PCR, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 50 a 500 pb que contenga el sitio polimórfico.

(3) Procedimiento de hibridación de ASO (oligonucleótidos de alelo específico)

El procedimiento de hibridación de ASO es un procedimiento en el que un fragmento de ADN que contiene un sitio polimórfico genético se somete a transferencia de puntos sobre un soporte (tal como un filtro de nailon), se lleva a cabo una hibridación con sondas correspondientes a cada polimorfismo genético y se lleva a cabo un tratamiento de lavado conforme a un valor de T_{f} (temperatura de fusión) de cada sonda para detectar un polimorfismo (i.e., cuando una sonda se aparea erróneamente con el sitio polimórfico correspondiente, la sonda hibridada es separada del soporte mediante un tratamiento de lavado) ("Clinica chimica acta"; international journal of clinical chemistry, 1990, Vol. 189, p. 153-157). Como sonda, se prefiere un oligonucleótido sintético que esté constituido por de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos. Para obtener una señal derivada de la sonda, es necesario marcar la sonda con, por ejemplo, un isótopo, biotina o un colorante fluorescente.

(4) Procedimiento de secuenciación directa

El procedimiento de secuenciación directa es un procedimiento en el que se amplifica mediante PCR un fragmento de ADN que contiene un sitio polimórfico genético, y se analiza directamente la secuencia de nucleótidos del ADN amplificado mediante un procedimiento didesoxi ("Biotechniques", 1991, Vol. 11, p. 246-249). Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 4 kb que contenga el sitio polimórfico. Como cebador de la secuencia, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos correspondientes a una secuencia localizada en un 5' de aproximadamente 50 a 300 nt secuencia arriba del sitio polimórfico.

(5) Procedimiento PCR-ASP (PCR con cebador de alelo específico)

En la PCR, se aparean un cebador y un ADN molde, y luego se sintetiza un ADN complementario del terminal 5' al terminal 3' mediante una ADN polimerasa. Cuando una base del terminal 3' del cebador se aparea erróneamente con el molde, se reduce la eficacia de la PCR y no se detecta producto de la PCR mediante electroforesis. El procedimiento de PCR-ASP es un procedimiento en el que se lleva a cabo una PCR usando un cebador, cuya base terminal 3' está diseñada para que sea complementaria a una base mutada por ser detectada, para detectar un polimorfismo genético en base a la presencia o la ausencia del producto amplificado ("Nucleic acids research", 1991, Vol. 19, p. 3561-3567; y "Nucleic acids research", 1992, Vol. 20, p. 4831-4837). Como par de cebadores de PCR usados en este procedimiento, un cebador es un oligonucleótido (preferiblemente, de 15 a 30 nt), cuyo terminal 3' está diseñado para que coincida con el sitio polimórfico, y el otro es preferiblemente un oligonucleótido que está constituido por de 15 a 30 nucleótidos correspondientes a una secuencia a una distancia de aproximadamente 0,05 a 2 kb del sitio polimórfico.

(6) Procedimiento de electroforesis sobre gel en gradiente desnaturalizante (DGGE)

El procedimiento DGGE es un procedimiento para detectar un polimorfismo genético en base al hecho de que un heterodúplex que tiene uno o varios apareamientos erróneos en un fragmento de ADN se disocia fácilmente en comparación con un homodúplex ("Biotechniques", 1999, Vol. 27, p. 1016-1018). A medida que se va disociando un heterodúplex, va disminuyendo la emigración electroforética del heterodúplex en gel. Cuando se forma previamente un gradiente de densidad de urea y formamida en un gel de poliacrilamida usado, se pone de relieve una diferencia entre la emigración de un heterodúplex y la de un homodúplex, y por tanto, se puede detectar la presencia de un ADN bicatenario que tenga uno o varios apareamientos erróneos, i.e., la presencia de una o varias mutaciones. Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 0,5 kb que contenga el sitio polimórfico.

(7) Procedimiento de digestión de la RNasa A

La RNasa A (ribonucleasa) no digiere un ARN bicatenario ni un complejo de ARN/ADN, sino que sólo digiere un ARN monocatenario. Cuando se amplifica por PCR un fragmento de ADN que tiene un sitio polimórfico, el producto de la PCR es desnaturalizado para convertirlo en fragmentos de ADN monocatenarios, se hibrida una sonda de ARN marcada con un isótopo con los fragmentos de ADN desnaturalizados, se trata la mezcla con RNasa A y se somete la mezcla de reacción a electroforesis; se digiere en el sitio de apareamiento erróneo la sonda de ARN que se hibrida con un fragmento de ADN que tiene una base mutada, pudiendo ser así detectada como dos bandas ("DNA and cell biology", 1995, Vol. 14, p. 87-94). Como sonda de ARN usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido generalmente por de 15 a 30 nucleótidos y que contenga el sitio polimórfico.

(8) Procedimiento de escisión química

Tras amplificar mediante PCR un fragmento de ADN que contiene un sitio polimórfico, se modifican la "C (citosina)" y la "T (timina)" de un sitio apareado erróneamente de un ADN bicatenario con hidroxilamina y tetróxido de osmio, respectivamente, y luego se trata el fragmento de ADN modificado con piperidina para escindir una parte de sacárido del mismo. Se usa una sonda marcada para formar una cadena doble, se trata la cadena doble como se explica anteriormente y se somete la mezcla de reacción a electroforesis. Cuando se detecta una sonda acortada, el resultado indica la presencia de una mutación ("Biotechniques", 1996, Vol. 21, p. 216-218). Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 4 kb que contenga el sitio polimórfico.

(9) Procedimiento DOL (unión de oligonucleótidos marcados con colorante)

El procedimiento DOL es un procedimiento en el que se amplifica por PCR un fragmento de ADN que contiene un polimorfismo genético, y se unen con una ADN ligasa resistente al calor un cebador con colorante marcado con fluorescencia que contiene al menos una base cercana al sitio polimórfico específico con un terminador con colorante marcado con un colorante fluorescente de cada alelo ("Genome research", 1998, Vol. 8, p. 549-556). Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 2 kb que contenga el sitio polimórfico.

(10) Procedimiento de PCR TaqMan

En el procedimiento de PCR TaqMan, se usan el oligonucleótido marcado con fluorescencia y el oligonucleótido de alelo específico (sonda TaqMan), así como la ADN polimerasa de Taq para llevar a cabo la PCR ("Genetic analysis: biomolecular engineering", 1999, Vol. 14, p. 143-149; y "Journal of clinical microbiology", 1996, Vol. 34, p. 2933-2936). Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 2 kb que contenga el sitio polimórfico. Como sonda TaqMan, cuyos terminales 5' y 3' están marcados con un colorante indicador fluorescente y un atenuador, respectivamente, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos y que contenga el sitio polimórfico. Se pueden detectar mutaciones de bases en un tipo natural y en variantes usando tales sondas.

(11) Procedimiento invasor

En el procedimiento invasor, se usan dos oligonucleótidos marcados sin fluorescencia y un oligonucleótido marcado con fluorescencia. Uno (denominado en lo sucesivo "sonda alélica") de los oligonucleótidos marcados sin fluorescencia está compuesto por una secuencia "flap" [i.e., una secuencia irrelevante con respecto a una secuencia genómica (denominada en lo sucesivo "molde") que contiene un sitio polimórfico por ser detectado] en el lado terminal 5' de la sonda alélica y una secuencia complementaria específica de una secuencia situada en el lado terminal 5' del sitio polimórfico en el molde, en el lado terminal 3' de la sonda alélica. Es decir, el terminal 5' de la secuencia complementaria anterior de la sonda alélica coincide con el sitio polimórfico del molde. El otro oligonucleótido marcado sin fluorescencia (denominado en lo sucesivo "sonda invasora") tiene una secuencia específica complementaria a una secuencia situada en el lado terminal 3' del sitio polimórfico del molde. El terminal 3' de la sonda invasora coincide con el sitio polimórfico del molde, pero no se limita a una base complementaria a una base situada en el sitio polimórfico del molde. El oligonucleótido marcado con fluorescencia (denominado en lo sucesivo "sonda de FRET (de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia"] está compuesto por una secuencia complementaria a la flap, en el lado terminal 3' de la sonda de FRET, y una secuencia palindrómica que forma una cadena doble, situada en el lado terminal 5' de la sonda de FRET. La sonda de FRET está marcada con un colorante fluorescente cerca de su terminal 5', y hay un atenuador, que puede contrarrestar la fluorescencia, unido al terminal 5' de la sonda de FRET.

Primero, la sonda alélica y la sonda invasora se hibridan al molde. Cuando la sonda alélica es complementaria al molde en el sitio polimórfico, el molde, el terminal 5' de la sonda alélica y el terminal 3' de la sonda invasora forman una estructura especial en el sitio polimórfico. Una enzima (denominada en lo sucesivo Cleavase®) que reconoce específicamente la estructura especial y presenta una actividad endonucleasa retira la parte flap de la sonda alélica. La flap retirada se hibrida con el lado terminal 3' de la sonda de FRET. La flap y la sonda de FRET forman, en el terminal 5' al que se une un atenuador de la sonda de FRET, una estructura reconocida específicamente por Cleavase®, y por tanto el nucleótido terminal 5' con el atenuador es eliminado de la sonda de FRET por Cleavase®. Por consiguiente, el colorante fluorescente de la sonda de FRET emite una fluorescencia.

Por el contrario, cuando la sonda alélica no es complementaria y está apareada erróneamente con el molde en el sitio polimórfico, la estructura reconocida específicamente por Cleavase® no se forma, y por tanto, la flap no es retirada de la sonda alélica. En este caso, la flap que no es retirada y se mantiene en la sonda alélica puede ser hibridada con el lado terminal 3' de la sonda de FRET, pero la eficacia de eliminar el nucleótido terminal 5' con el atenuador de la sonda de FRET por Cleavase® es baja en comparación con el caso en el que la flap retirada de la sonda alélica es hibridada con la misma, y por tanto, la potencia de la fluorescencia emitida desde la sonda de FRET es baja. Según el principio descrito anteriormente, es posible detectar un polimorfismo ("Science", 1993, Vol. 5109, 778-783; "The journal of biological chemistry", 1999, Vol. 30, p. 21387-21394; y "Nature biotechnology", 1999, Vol. 17, p. 292-296).

(12) Procedimiento EM/MALDI-TOF (espectrometría de masas mediante desorción por láser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo)

El procedimiento EM/MALDI-TOF es un procedimiento de determinación mediante la síntesis de oligonucleótidos monocatenarios que comprenden una secuencia de nucleótidos diferente correspondiente a cada alelo de un polimorfismo genético de interés, la medición de cada masa de los mismos y la detección de diferencias mediante un espectrómetro de masas ("Genome research", 1997, Vol. 7, p. 378-388; "European journal of clinical chemistry and clinical biochemistry: journal of the forum of European clinical chemistry societies", 1997, Vol. 35, p. 545-548). En el procedimiento EM/MALDI-TOF, se amplifica un fragmento de ADN que contiene un sitio polimórfico mediante PCR, se usa un cebador adyacente al sitio polimórfico para llevar a cabo una reacción de prolongación y se analiza el producto resultante específico de cada alelo en base al espectro de masas. Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 0,5 kb que contenga el sitio polimórfico. Como cebador para detectar un polimorfismo, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos adyacente al sitio polimórfico.

(13) Procedimiento TDI (incorporación de un terminador marcado con colorante dirigida por un molde)

El procedimiento TDI es un procedimiento en el que se amplifica por PCR un fragmento de ADN que contiene un polimorfismo genético, y se usa un cebador diseñado para su aproximación al sitio polimórfico con el fin de incorporar un didesoxinucleótido marcado con un colorante fluorescente diferente correspondiente a cada alelo en el sitio polimórfico, mediante una reacción de prolongación del cebador ("Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 1997, Vol. 94, p. 10756-10761). El producto de prolongación del cebador se analiza, por ejemplo, con un secuenciador de ADN (ABI PRISM 377, Applied Biosystems). Como sonda PCR usada en este procedimiento, se prefiere un oligonucleótido que esté constituido por de 15 a 30 nucleótidos para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,05 a 1 kb que contenga el sitio polimórfico.

(14) Procedimiento de sondas fluorescibles

La sonda fluorescible es un oligonucleótido que tiene un atenuador y un fluoróforo en ambos terminales, respectivamente. Es preferible que la sonda fluorescible tenga una estructura de tallo y bucle compuesta por una parte de tallo de 5 a 7 nucleótidos y una estructura de bucle de 15 a 30 nucleótidos. El fluoróforo no emite fluorescencia mediante una acción del atenuador, ni siquiera aunque se irradie una luz de excitación. Cuando se hibrida una secuencia de nucleótidos de la estructura de bucle con un ADN diana que tiene una secuencia homóloga a la secuencia de nucleótidos de la estructura de bucle, aumenta la distancia entre el fluoróforo y el atenuador, y por tanto, el fluoróforo emite fluorescencia cuando es irradiado con una luz de excitación ("Nature biotechnology", 1998, Vol. 1, p. 49-53; y "IDENSHIIGAKU", 2000, Vol. 4, p. 46-48). La secuencia de nucleótidos de la parte del tallo de la sonda fluorescible no es complementaria a la del ADN diana. En cuanto al valor de la T_{f} de la estructura de tallo de la sonda fluorescible, cuando se añade la sonda fluorescible a una mezcla de reacción para amplificar una región diana mediante la PCR y se mide la fluorescencia a una temperatura de apareamiento de la PCR irradiando una luz de excitación, se emite fluorescencia si la sonda fluorescible tiene una secuencia absolutamente homóloga al gen diana y se hibrida al mismo. Por el contrario, si la sonda fluorescible está apareada erróneamente con el gen diana, la sonda fluorescible no se hibrida a la diana, y por tanto no emite fluorescencia. Es posible detectar un polimorfismo genético mediante este procedimiento.

(15) Procedimiento de hibridación dinámica de alelo específico (DASH)

En el procedimiento DASH, se usa un cebador en el que el terminal está biotinilado al amplificar un ADN diana (de 60 a 90 pb) a partir de un ADN genómico por PCR ("Nature biotechnology", 1998, Vol. 1, p. 87-88; y "IDENSHIIGAKU", 2000, Vol. 4, p. 47-48). Tras la PCR, se une una cadena que contiene un cebador biotinilado a un pocillo de microvaloración revestido con estreptavidina. Por el contrario, una cadena que contiene un cebador sin modificar no se puede unir al pocillo de microvaloración, y se elimina fácilmente mediante un tratamiento de aclarado con una solución alcalina. Entonces, se hibrida un ADN sonda (preferiblemente, de 15 a 21 nt) con la cadena que contiene el cebador biotinilado. En esta etapa de hibridación, se incorpora en el ADN híbrido una sustancia fluorescente (tal como colorante Syber Green I) que se une específicamente a un ADN bicatenario y emite fluorescencia. Tras la hibridación, el ADN híbrido es desnaturalizado mientras se mide la intensidad de la fluorescencia. Si el ADN diana no es absolutamente complementario y está apareado erróneamente con el ADN sonda, la temperatura a la que se desnaturaliza el ADN híbrido y no se emite fluorescencia es baja en comparación con el caso en el que el ADN diana es absolutamente complementario al ADN sonda. Se puede detectar un polimorfismo genético mediante la observación de la diferencia en la temperatura anterior.

(16) Procedimiento de la sonda candado

El procedimiento de la sonda candado fue desarrollado por Lizardi et al. ("Nature genetics", 1998, Vol. 3, p. 225-232; y "IDENSHIIGAKU", 2000, Vol. 4, p. 50-51). Se diseña una sonda para ser circularizada mediante la hibridación con un ADN diana monocatenario. Se hibrida la sonda con el ADN diana, se une el ADN circularizado con ADN ligasa para convertirlo en ADN circular y se lleva a cabo un tratamiento con fosfatasa alcalina [tal como fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP)] para eliminar un grupo fosfato. Si hay un apareamiento erróneo en el terminal y el ADN no es circularizado, se elimina el grupo fosfato y por tanto, el ADN no puede convertirse en ADN circular. A continuación, se diseña un cebador (1) con respecto al ADN circular y se lleva a cabo una reacción de replicación con ADN polimerasa para obtener multímeros de replicón. Se diseña un cebador (2) con respecto al replicón y se amplifican los ADN bicatenarios con ADN polimerasa usando una mezcla de cebadores (1) y (2). A este respecto, el cebador (1) es diseñado en base a una parte no complementaria al ADN diana. El cebador (2) se diseña en base a una secuencia (que contiene un polimorfismo genético en el terminal 3') complementaria a la parte terminal (ADN diana) de la sonda circularizada (sonda candado). Se usa un cebador en el que la base terminal 3' es sustituida para detectar un polimorfismo. Con respecto a la sonda candado, se lleva a cabo una reacción de amplificación mediante un procedimiento de amplificación por círculo rodante hiper-ramificado (HRCA), que es una modificación del procedimiento de reacción por círculo rodante (RCA). Se trata la mezcla de reacción con una enzima de restricción que reconoce un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción localizado en la sonda candado, y se analiza la presencia o la ausencia de bandas por electroforesis.

(17) Procedimiento UCAN

En el procedimiento UCAN (véase http://www.takara.co.jp), se modifica químicamente el ADN terminal 3' de un cebador de ADN-ARN-ADN (cebador DRD) en el que el ARN está interpuesto entre los ADN para no replicar un ADN molde con ADN polimerasa. El cebador DRD diseñado para ser hibridado con un sitio polimórfico que tenga la posibilidad de sufrir una mutación de una base por la parte de ARN se hibrida con un ADN molde. Si el cebador DRD está absolutamente apareado con el molde, la parte de ARN hibridado del cebador DRD es digerida por RNasa H. Como la digestión genera un nuevo terminal 3', tiene lugar una reacción de prolongación con ADN polimerasa para amplificar el ADN molde. Por el contrario, si el cebador DRD no está apareado con el ADN molde en el sitio (i.e., cuando hay presente un PSN), la RNasa H no digiere el cebador DRD y, por tanto, no se produce la amplificación del ADN. Es posible detectar un polimorfismo genético mediante la detección de la presencia o de la ausencia de la amplificación génica.

(18) Chip de ADN o micromatriz de ADN

En un chip de ADN o en una micromatriz de ADN, se inmovilizan diversas sondas de ADN que contienen diversos sitios polimórficos sobre una base de vidrio y se hibridan muestras de ácidos nucleicos marcados con las sondas para detectar la presencia o la ausencia de polimorfismos mediante una señal fluorescente. Generalmente, el aparato en el que se sintetizan los ADN sobre una base de vidrio se denomina chip de ADN (chip de ADN de oligo) y el aparato en el que se colocan los ADN sobre la base de vidrio se denomina micromatriz de ADN. Como sonda inmovilizada o sintetizada sobre la base, para un chip de ADN de oligo, es preferible un oligonucleótido que esté constituido por aproximadamente 20 nucleótidos y que contenga un sitio polimórfico, y para una micromatriz de ADN, es preferible un ADN bicatenario que esté constituido por de aproximadamente 100 a 1.500 nucleótidos.

(19) Procedimiento ECA (matriz electroquímica)

El procedimiento ECA es un procedimiento de determinación de genes en base a las propiedades electroquímicas de un intercalador que se une a un ADN bicatenario. Se amplifica por PCR una región que contiene un polimorfismo, se híbrida el producto de la PCR con la sonda complementaria a cada alelo inmovilizada sobre una base y se hace reaccionar un intercalador. En este caso, la cantidad de intercalador unida a cada sonda depende de una complementariedad absoluta o una complementariedad imperfecta. Como los intercaladores usados en el procedimiento ECA contienen ferroceno, que tiene propiedades electroquímicas, las señales eléctricas son diferentes en proporción a las cantidades de intercalador unido. El procedimiento ECA es un procedimiento para detectar un polimorfismo genético en base a la diferencia en las señales ("Analytical chemistry", 2000, Vol. 72, p. 1334-1341).

Los procedimientos descritos anteriormente, aunque sin limitarse a ellos, son los procedimientos más comunes para detectar un polimorfismo genético que se pueda usar en la presente invención. En la presente invención, se pueden usar otros procedimientos para detectar un polimorfismo genético, y además, es posible usar tales procedimientos individualmente o en una combinación de los mismos. En los ejemplos descritos a continuación, se describirán las realizaciones de la presente invención que usan el procedimiento de PCR-ASP o el procedimiento de secuenciación directa.

[B] Procedimiento de análisis de la presente invención

En el procedimiento de análisis de la presente invención, mediante al cual se determina si un perro es ME o ML a la velocidad de metabolismo farmacológico mediante el procedimiento de detección de la presente invención, se selecciona un perro usado en un análisis de medicamentos, se administra un fármaco de análisis al grupo ME o al grupo ML, y se analiza el efecto farmacológico y/o la toxicidad del fármaco de análisis. Es preferible usar el grupo ME (más preferiblemente, un perro que tenga un genotipo C/C).

Un procedimiento para analizar un efecto farmacológico de un fármaco de análisis se puede seleccionar apropiadamente según una indicación del fármaco de análisis.

En cuanto al procedimiento para analizar la toxicidad de un fármaco de análisis, se puede usar un procedimiento convencional, y cabe mencionar, por ejemplo, un estudio de la toxicidad de una sola dosis oral en perros Beagle, un estudio de la toxicidad oral durante dos semanas en perros Beagle, un estudio de la toxicidad de una sola dosis intravenosa en perros Beagle, un estudio de la toxicidad intravenosa durante una semana en perros Beagle, un estudio de la toxicidad intravenosa durante cuatro semanas en perros Beagle, un estudio de la toxicidad por infusión intravenosa durante una semana en perros Beagle, un estudio de la toxicidad por infusión intravenosa durante cuatro semanas en perros Beagle, un estudio del aumento de la toxicidad de una sola dosis intravenosa en perros Beagle, un estudio de la toxicidad por infusión intravenosa durante dos semanas en perros Beagle, un estudio de la toxicidad oral durante cuatro semanas en perros Beagle, un estudio de la toxicidad oral durante trece semanas en perros Beagle o un estudio de la toxicidad oral durante cincuenta y dos semanas en perros Beagle (Mahin Maines et al., "Current protocols in toxicology", volumen 1, 2, John Wiley & Sons. Inc., 2001, p. 1.0.1-16.6.5; y Yasuhiko Shirasu y Toyoaki Toyama, ed., "DOKUSEISIKEN handbook", SCIENCE FORUM, mayo de 1980, p. 81-282).

En el procedimiento de análisis de la presente invención, se pueden realizar por separado la etapa de selección de un perro y la etapa de análisis de un efecto farmacológico y/o una toxicidad de un fármaco de análisis. La presente invención incluye un procedimiento que comprende las etapas de preparar un perro que se encuentre en un grupo ME o en un grupo ML mediante el procedimiento de la presente invención y analizar un efecto farmacológico y/o una toxicidad de un fármaco de análisis usando sólo uno de los grupos, el grupo ME o el grupo ML.

[C] ADN monocatenario y agente para diagnosticar un polimorfismo en una actividad metabólica

El ADN monocatenario de la presente invención se hibrida con una cadena sentido o con una cadena antisentido de un gen CYP1A2 canino que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o la secuencia de nucleótidos constituida por los nucleótidos 63-1.601 de la SEC ID N.º 22, o un polimorfismo genético del mismo, en condiciones restrictivas, y es un ADN monocatenario compuesto por de 15 a 30 nucleótidos, seleccionado entre el grupo de:

(1) un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, en el que hay contenida una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22, y la base correspondiente es C [preferiblemente, un ADN monocatenario que está constituido por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 14 (i.e., el cebador S07 natural usado en el ejemplo 4)];

(2) un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, en el que hay contenida una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22, y la base correspondiente es T [preferiblemente, un ADN monocatenario que está constituido por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 16 (i.e., el cebador S07 mutante usado en el ejemplo 4)]; y

(3) un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, que es una cadena complementaria al ADN monocatenario (1) o (2).

El término "una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22" no es un término especificado en concreto, siempre y cuando sea una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22. Concretamente, no es necesario que cada secuencia flanqueante situada bien en el lado 5' o en el lado 3' de la base coincida exactamente con la de la SEC ID N.º 1 ó 22.

El término "condiciones restrictivas", como se usa en la presente memoria, no se especifica en concreto, pero preferiblemente denota las condiciones del sistema de reacción descrito en el ejemplo 4 [un tampón de PCR para KOD (concentración final: 1 x), mezcla de dNTP (concentración final: cada 0,2 mmoles/l), sulfato de magnesio (concentración final: 1 mmol/l), un juego de cebadores de PCR (concentración final: cada 0,3 \mumoles/l) y KOD-plus- (concentración final: 0,02 unidades)] y las condiciones de la reacción PCR descrita en el ejemplo 4 (llevar a cabo una reacción a 94ºC durante 2 minutos, repetir un ciclo constituido por las reacciones a 94ºC durante 15 segundos, a 56ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 30 segundos 35 veces, y llevar a cabo una reacción a 68ºC durante 1,5 minutos).

El ADN monocatenario de la presente invención se puede usar para detectar un polimorfismo genético en una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (i.e., en la posición 87 del exón 4), i.e., una base correspondiente a una base situada en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22 o en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1, más concretamente, para determinar si la base de interés es C o T.

Como ADN monocatenario de la presente invención, el más preferido es un ADN constituido por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 14 ó 16.

La presente invención incluye un agente para diagnosticar un polimorfismo en la actividad metabólica de un fármaco que es un sustrato específico del CYP1A2 canino, agente que comprende como ingrediente activo un reactivo para detectar una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino. El reactivo de detección incluye, por ejemplo, el ADN monocatenario de la presente invención.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora más detalladamente mediante, pero sin quedar bajo ningún concepto limitada por, los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Determinación de los PSN en el gen CYP1A2 de Beagle

En este ejemplo, se usó ARN total aislado de un hígado de Beagle como molde, se determinó una secuencia de nucleótidos parcial de ADNc de CYP1A2 de Beagle mediante un procedimiento de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa), y se determinaron los PSN de un gen CYP1A2 de Beagle según los siguientes procedimientos.

Se anestesiaron y se sacrificaron mediante la administración por vía intravenosa de 50 mg/ml/kg de pentobarbital un Beagle A (tipo ME) y un Beagle B (tipo ML), previamente clasificados mediante un análisis preliminar (véase el ejemplo 7) (dos sujetos en total), y se diseccionó el hígado de cada uno y se congeló de inmediato. Se usó un equipo RNeasy Mini (QIAGEN) para obtener cada ARN total de los riñones congelados según el protocolo del equipo.

Del ARN total obtenido, se usaron 500 ng del ARN total como molde para la síntesis de ADNc a partir del ARN mediante una transcriptasa inversa. La reacción se llevó a cabo usando un equipo de ARN LA PCR versión 1.1 (Takara Shuzo). Las condiciones en la reacción de transcripción inversa se muestran en la tabla 1. El volumen "x \mul" del "agua estéril libre de RNasa" de la tabla 1 significa que el volumen total del sistema de reacción fue ajustado hasta 40,0 \mul mediante la adición de un volumen apropiado de agua estéril libre de RNasa.

TABLA 1

1

[Condiciones de reacción de transcripción inversa: a 30ºC durante 10 minutos, a 55ºC durante 20 minutos, a 95ºC durante 5 minutos y a 5ºC durante 5 minutos (1 ciclo)].

Se usó el ADNc monocatenario sintetizado en la anterior reacción de transcripción inversa como molde para llevar a cabo la PCR mediante la ADN polimerasa KOD-plus^{-} (Toyobo). Como juegos de cebadores de PCR para reconocer una secuencia de nucleótidos parcial del ADNc de CYP1A2 canino, se usaron un juego de cebador S01 (SEC ID N.º 2) y cebador A01 (SEC ID N.º 3), un juego de cebador S02 (SEC ID N.º 4) y cebador A02 (SEC ID N.º 5), un juego de cebador S03 (SEC ID N.º 6) y cebador A03 (SEC ID N.º 7) y un juego de cebador S04 (SEC ID N.º 8) y cebador A04 (SEC ID N.º 9), i.e., cuatro juegos de cebadores de PCR. A este respecto, como cebadores, se usaron Oligos Easy (Proligo, Japón).

Las condiciones de la PCR se muestran en la tabla 2.

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TABLA 2

2

[Condiciones de la PCR: a 94ºC durante 2 minutos, (a 94ºC durante 15 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 1,5 minutos) x 35 ciclos, y a 68ºC durante 1,5 minutos].

Como resultado de la PCR, los tamaños de los fragmentos de ADN amplificados con el juego de cebadores S01 y A01, el juego de cebadores S02 y A02, el juego de cebadores S03 y A03 y el juego de cebadores S04 y A04 fueron de 798 pb, 951 pb, 551 pb y 658 pb, respectivamente. Los fragmentos de ADN amplificados fueron purificados usando ExoSAP-IT (USB) según el protocolo del mismo. Se analizó convenientemente la secuencia de nucleótidos de cada fragmento de ADN purificado con un secuenciador de ADN (ABI PRISM 377, Applied Biosystems) para identificar los sitios polimórficos del gen CYP1A2. En el análisis secuencial, se usaron los cebadores de PCR S01, S02, S03, S04, A01, A02, A03 y A04.

En la tabla 3, se resumen los polimorfismos genéticos encontrados. En la tabla 3, "el n.º de nucleótido de sec." es un número, considerando como "1" al nucleótido inicial de una secuencia de nucleótidos parcial conocida ("Molecular pharmacology", 1990, Vol. 38, p. 644-651) de un gen CYP1A2 de Beagle, y el término "sec. conocida" significa la secuencia de nucleótidos parcial conocida

TABLA 3

3

Entre los PSN, se encontró en el Beagle del grupo B un PSN en el que la base situada en la posición 1.087 del gen CYP1A2 conocido está sustituida de C a T, mediante lo que se cambia el correspondiente aminoácido de arginina a un codón de terminación. Se considera que el PSN puede provocar un cambio notable en la capacidad metabolizadora de CYP1A2 del Beagle B de tipo ML.

Ejemplo 2 Análisis para identificar la secuencia de nucleótidos en la región terminal 5' del gen CYP1A2 de Beagle mediante un procedimiento de RACE en 5'

En este ejemplo, se usó ARN total aislado de un hígado de Beagle como molde, se determinó una secuencia de nucleótidos sin identificar en la región terminal 5' del gen CYP1A2 de Beagle mediante un procedimiento RACE en 5' (amplificación rápida en 5' de extremos de ADNc), y se identificó la longitud completa (del codón de iniciación, metionina con respecto al codón de terminación) de la secuencia de nucleótidos del ADNc de CYP1A2 de Beagle.

Se usaron aproximadamente 0,1 g de tejido de hígado diseccionado del Beagle A de tipo ME del ejemplo 1 para extraer el ARN total mediante un reactivo de Invitrogen TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del mismo.

Se trituraron en un mortero hasta convertirlos en polvo aproximadamente 0,1 g de tejido de hígado de Beagle inmediatamente congelado tras la disección y se suspendieron en 1 ml de reactivo de Invitrogen TRIzol (Invitrogen). Se añadieron a la suspensión 0,2 ml de cloroformo, y se agitó la mezcla y se centrifugó para recoger sólo la capa acuosa. Se trató al capa acuosa mediante un procedimiento de precipitación en isopropanol para recoger ARN en forma de sedimentos. Se disolvieron los sedimentos en 100 \mul de agua libre de RNasa.

A 6,5 \mul (10 \mug) de solución de ARN total extraído, se añadió 1 \mul de 10 x tampón de reacción de DNasa I, 1 \mul de 1U/\mul de ADNasa I y 1,5 \mul de agua libre de RNasa, se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Entonces, se añadió 1 \mul más de 25 mmoles/l de EDTA y se incubó todo a 65ºC durante 10 minutos.

Según el protocolo descrito en el manual del equipo Invitrogen GeneRacer (Invitrogen), se llevó a cabo un procedimiento de RACE en 5' usando 3 \mug del ARN total extraído.

Se trató el ARN total con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CAIP). Tras el tratamiento con CAIP, se llevó a cabo un tratamiento con ácido tabaco pirofosfatasa (TAP), mediante el que se retiró una estructura de casquete del ARNm con casquete para dejar al descubierto el grupo fosfato del terminal 5'. Se unió al ARN tratado con TAP, Oligo de ARN GeneRacer (SEC ID N.º 19) mediante una ARN ligasa de T4, y se trató con TI Invitrogen SuperScript III (Invitrogen) a 50ºC durante 60 minutos. Se usó el ADNc obtenido como molde para llevar a cabo la PCR para amplificar la región terminal 5' con el cebador de 5' GeneRacer (SEC ID N.º 20) y un cebador específico del gen (GSP; SEC ID N.º 21). Las condiciones de reacción se muestran en la tabla 4.

TABLA 4

4

[Condiciones de reacción: a 94ºC durante 2 minutos, (a 94ºC durante 30 segundos y a 70ºC durante 5 minutos) x 5 ciclos, (a 94ºC durante 3 segundos, a 65ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 5 minutos) x 5 ciclos, (a 94ºC durante 30 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 5 minutos) x 5 ciclos, (a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 5 minutos ) x 5 ciclos, y a 68ºC durante 10 minutos].

Se analizó el producto de la PCR mediante electroforesis para detectar aproximadamente 250 pb de fragmento de ADN amplificado. Se purificó el fragmento de ADN con un equipo de purificación sobre gel Invitrogen S.N.A.P. (Invitrogen). Se clonó el fragmento de ADN purificado en el vector pCR4-TOPO con un equipo de clonación Invitrogen TOPO.

Se analizó la secuencia del fragmento de ADN clonado en el vector pCR4-TOPO para confirmar un solapamiento con una secuencia de nucleótidos parcial conocida de CYP1A2 de Beagle ("Molecular pharmacology", 1990, Vol. 38, p. 644-651). Una secuencia consenso entre 6 clones analizados mediante el procedimiento RACE en 5' es una secuencia de nucleótidos constituida por los nucleótidos 1-170 de SEC ID N.º 22.

A partir del solapamiento obtenido anteriormente de la secuencia parcial de CYP1A2 y la o las secuencias de nucleótidos parciales conocidas del gen CYP1A2 de Beagle, se determinó la secuencia de nucleótidos completa del ADNc de CYP1A2 en el Beagle A de tipo ME usado en el ejemplo 1 como la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22 que tenía el marco de lectura abierto (ORF) de los nucleótidos 63-1.601.

Además, se determinaron las secuencias de nucleótidos completas del ADNc de CYP1A2 en nueve perros Beagle de tipo ME. En el Beagle A, las bases situadas en las posiciones 1.305, 1.361, 1.365 y 1.615 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22 fueron heterogéneamente C/G, C/T, G/A y C/T, respectivamente. Por el contrario, las bases correspondientes en los otros perros Beagle fueron C, C, G y C, respectivamente.

A partir de los resultados, se dilucidó que el PSN (aislado en el ejemplo 1 y generador de un codón de terminación) situado en la posición 1.087 de la secuencia de nucleótidos parcial conocida del gen CYP1A2 corresponde a un PSN en el que una base situada en la posición 1.117 del gen CYP1A2 de Beagle (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22) está sustituida de C a T, y el aminoácido situado en la posición 373 está cambiado de arginina a un codón de terminación.

Ejemplo 3 PSN en el que una base situada en la posición 87 del exón 4 del gen CYP1A2 está sustituida de C a T

Para detectar fácilmente el PSN en el que una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 de Beagle está sustituida de C a T, se examinó una posición del PSN en el ADN genómico.

En este ejemplo, se usó la información de otra familia CYP1 de mamífero para predecir la posición del PSN de interés, se aisló ADN genómico de los leucocitos de Beagle, se llevó a cabo una PCR y se determinaron las secuencias de nucleótidos del ADN genómico que incluían el PSN.

Cuando se prepararon los exones y los intrones del CYP1A1 humano (n.º de acceso del NCBI AF253322), del CYP1A2 humano (n.º de acceso del NCBI AF253322), del CYP1A1 de ratón (n.º de acceso del NCBI X01681), del CYP1A2 de ratón (n.º de acceso del NCBI X01682), del CYP1A2 de rata (n.º de acceso del NCBI K02246) y del CYP1A2 de rata (n.º de acceso del NCBI K03241), el tamaño de cada intrón resultó ser diferente entre las moléculas, conservándose el tamaño de cada exón entre las diferentes especies. Más concretamente, los tamaños de los exones 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de la anterior familia CYP1 de mamífero resultaron ser de aproximadamente 830 pb, de aproximadamente 120 pb, de aproximadamente 89 pb, de aproximadamente 123 pb, de aproximadamente 86 pb y de aproximadamente 285 pb, respectivamente. En base a esta información, se predijo que el PSN de interés estaba localizado en el exón 4.

Para preparar ADN genómico canino, se recogió sangre entera extraída de un Beagle usando una aguja de inyección sin tratar en un tubo de recogida de sangre vacutainer^{TM} estéril (Beckton Dickinson, Japón) con EDTA 2K. Se usó un GEN-TORUKUN^{TM} (para sangre) (Takara Shuzo) para extraer el ADN genómico canino de la sangre entera según el protocolo del mismo.

Para amplificar una región de ADN genómico que contuviera el PSN de interés usando el ADN genómico extraído, se llevó a cabo una PCR con ADN polimerasa KOD-plus^{-} (Toyobo). Como juego de cebadores para determinar una secuencia de nucleótidos del intrón 3, el exón 4 y el intrón 4, se diseñó un cebador sentido S05 (SEC ID N.º 10) en base a la secuencia del exón 3, y se diseñó un cebador antisentido A05 (SEC ID N.º 11) en base a la secuencia del exón
5. Como cebadores, se usaron Oligos Easy (Proligo, Japón). Las condiciones de la PCR se muestran en la tabla 5.

TABLA 5

5

[Condiciones de la PCR: a 94ºC durante 2 minutos, (a 94ºC durante 15 segundos, a 56ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 30 segundos) x 35 ciclos, y a 68ºC durante 1,5 minutos].

Por consiguiente, el tamaño del fragmento de ADN amplificado con el juego de vectores S05 y A05 fue de 1.380 pb. El fragmento de ADN amplificado fue purificado usando ExoSAP-IT (USB) según el protocolo del mismo. Se analizó convenientemente la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN purificado con un secuenciador de ADN (ABI PRISM 377, Applied Biosystems) para identificar los sitios polimórficos del gen CYP1A2. En el análisis secuencial, se usaron los cebadores de PCR S05, A05, S06 (SEC ID N.º 12) y A06 (SEC ID N.º 13).

Por consiguiente, se determinó la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1. La base T situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 es la posición del PSN de interés, i.e., la posición 1117 en un gen CYP1A2 de Beagle.

Las secuencias consenso GT y AG existen en ambos extremos de un intrón en los organismos eucariotas superiores y en la secuencia de nucleótidos de ADNc del CYP1A2. Según la regla "GT-AG", se determinaron las secuencias de nucleótidos del intrón 3, del exón 4 y del intrón 4 del ADN genómico de CYP1A2. Por consiguiente, se considera que los nucleótidos 63-318, los nucleótidos 319-442 y los nucleótidos 443-1.338 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 son el intrón 3, el exón 4 y el intrón 4, respectivamente.

A partir de los resultados anteriores, se dilucidó que el PSN de interés es una sustitución de C a T en la posición 87 del exón 4 del gen CYP1A2.

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Ejemplo 4 Detección de PSN mediante un procedimiento de PCR-ASP

En este ejemplo, para detectar el PSN en el que la base situada en la posición 1.117 del gen CYP1A2 de Beagle (i.e., en la posición 87 del exón 4) está sustituida de C a T, se aisló ADN genómico de leucocitos de Beagle, se llevó a cabo una PCR-ASP y se determinó la presencia del PSN mediante un patrón de electroforesis sobre gel de agarosa según los siguientes procedimientos.

Se extrajo ADN genómico canino según el procedimiento descrito en el ejemplo 3.

Se usó el ADN genómico extraído como molde para llevar a cabo una PCR con ADN polimerasa KOD-plus- (Toyobo). Como juegos de cebadores de PCR para una reacción alelo específica, se usaron dos juegos de cebadores de PCR, i.e., un juego de cebador S07 natural (SEC ID N.º 14) y cebador A07 (SEC ID N.º 15) y un juego de cebador S07 natural (SEC ID N.º 16) y cebador A07. Se reconoce el PSN de interés en la posición 19 (C) de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 14 o en la posición 19 (T) de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 16. Como cebadores, se usaron Oligos Easy (Proligo, Japón). Las condiciones de la PCR se muestran en la tabla 6.

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TABLA 6

6

[Condiciones de la PCR: a 94ºC durante 2 minutos, (a 94ºC durante 15 segundos, a 59ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 30 segundos) x 35 ciclos, y a 68ºC durante 1,5 minutos].

Por consiguiente, el tamaño del fragmento de ADN amplificado con el juego de cebadores de S07 natural y A07 fue de 365 pb, y el amplificado con el juego de cebadores de S07 mutante y A07 también fue de 365 pb. Como resultados de la electroforesis sobre gel de agarosa, con respecto al PSN de C a T situado en la posición 87 del exón 4 del gen CYP1A2, estando presente el alelo C homogéneamente, el fragmento de ADN sólo se amplificó en el caso de la PCR con el juego de cebadores de S07 natural y A07. Cuando estaban presentes ambos alelos heterogéneamente, se amplificó el fragmento de ADN en ambos casos, i.e., en el caso del juego de cebadores de S07 natural y A07 y en el caso del juego de cebadores de S07 mutante y A07. Cuando estaba presente el alelo T homogéneamente, se amplificó el fragmento de ADN sólo en el caso del juego de cebadores de S07 mutante y A07.

Ejemplo 5 Detección de PSN mediante un procedimiento de secuenciación directa

En este ejemplo, para detectar el PSN en el que la base situada en la posición 1.117 del gen CYP1A2 (i.e., en la posición 87 del exón 4) está sustituida de C a T, se aisló ADN genómico de leucocitos de Beagle, se llevó a cabo una PCR y se determinó la presencia del PSN mediante secuenciación directa según los siguientes procedimientos.

Se usó el ADN genómico extraído como molde para llevar a cabo una PCR con ADN polimerasa KOD-plus^{-} (Toyobo). Como cebadores de PCR, se usó un juego de cebadores de PCR del cebador S05 y el cebador A07. Como cebadores, se usaron Oligos Easy (Proligo, Japón). Las condiciones de la PCR se muestran en la tabla 7.

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TABLA 7

7

[Condiciones de la PCR: las mismas que en el ejemplo 3].

Por consiguiente, el tamaño del fragmento de ADN amplificado con el juego de cebadores S05 y A07 fue de 752 pb. El fragmento de ADN amplificado fue purificado usando ExoSAP-IT (USB) según el protocolo del mismo. Se analizó convenientemente la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN purificado con un secuenciador de ADN (ABI PRISM 377, Applied Biosystems) para identificar los sitios polimórficos del gen CYP1A2. En el análisis secuencial, se usaron los cebadores de PCR S08 (SEC ID N.º 17) y A08 (SEC ID N.º 18).

Por consiguiente, los nucleótidos del PSN de C a T de la posición 1.117 del gen CYP1A2 fueron identificados mediante una forma de onda secuencial. Cuando estaba presente el alelo C homogéneamente, sólo se detectó la forma de onda de C. Cuando estaban presentes ambos alelos heterogéneamente, se detectaron ambas formas de onda C y T. Cuando estaba presente el alelo T homogéneamente, sólo se detectó la forma de onda de T.

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Ejemplo 6 Análisis de frecuencia alélica

En este ejemplo, se usaron los resultados obtenidos en los ejemplos 4 y 5 para analizar la frecuencia alélica del PSN de C a T en la posición 1.117 del gen CYP1A2 (i.e., en la posición 87 del exón 4) según los siguientes procedimientos.

En la tabla 8, se muestran los resultados de un diagnóstico génico de 65 perros Beagle para el PSN de C a T de la posición 1.117 del gen CYP1A2.

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TABLA 8

8

En la tabla 8, "C/C" significa un sujeto que porta homogéneamente el alelo C, en el que la base situada en la posición del gen CYP1A2 (i.e., en la posición 87 del exón 4) es C, "T/T" significa un sujeto que porta homogéneamente el alelo T, en el que la base es T y "C/T" significa un sujeto que porta heterogéneamente ambos alelos. Como se muestra en la tabla 8, C/C se detectó en 25 sujetos (38%), C/T se detectó en 29 sujetos (45%) y T/T se detectó en 11 sujetos (17%). Cada frecuencia alélica fue de 0,61 (alelo C) y de 0,39 (alelo T).

Ejemplo 7 Análisis farmacocinético usando perros Beagle

Se sabe que un inhibidor de la fosfodiesterasa IV, la 4-ciclohexil-1-etil-7-metilpirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona, (véase el ejemplo 7 de la patente japonesa n.º 3110765 o WO97/19078; denominado en lo sucesivo compuesto A) es metabolizado en 5 metabolitos diferentes MM-1 a MM-5 en un perro Beagle. Todos los metabolitos son compuestos en los que se ha añadido un grupo hidroxilo y, por tanto, se consideran productos generados mediante una reacción de metabolismo farmacológico de fase I. Miyashita et al. informaron sobre la división de perros Beagle en dos grupos, i.e., un grupo en el que el MM-2 era el metabolito principal en plasma y un grupo en el que el MM-1 y el MM-5 eran los metabolitos principales ["The 17th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics, poster session", Japón, 2002, 20PE-46].

En este ejemplo, tras la administración oral del compuesto A, se llevó a cabo un análisis farmacocinético según el siguiente procedimiento. En el análisis, se midieron los cambios a lo largo del tiempo en las concentraciones del compuesto sin reaccionar y de los metabolitos.

Se suspendió el compuesto A en solución de metilcelulosa al 0,5% y se administró oralmente la suspensión a 10 perros Beagle macho (0,3 mg/kg). Se recogió sangre de cada sujeto a las 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 y 8,0 horas de la administración. Se extrajo plasma mediante una extracción de líquido-líquido, y luego, se midieron los cambios a lo largo del tiempo en las concentraciones del compuesto sin reaccionar y de los metabolitos en plasma según un procedimiento de medición simultánea (denominado en lo sucesivo procedimiento de CLAR-FL) usando una CLAR y un detector de la fluorescencia.

En la tabla 9, se muestran las condiciones del procedimiento de CLAR-FL que mide el compuesto A y los metabolitos simultáneamente, y en la tabla 10, se muestran los gradientes de concentración de las fases móviles.

TABLA 9

: Columna: COSMOSIL 5PE-MS waters 4,6 (d.i.) x 250 mm

: Temperatura de la columna: 40ºC

: Fase móvil:

: Líquido A: 50 mmoles/l de ácido acético:acetonitrilo = 80:20

: Líquido B: 50 mmoles/l de ácido acético:acetonitrilo = 20:80

: Caudal: 1,0 ml/min

: Detección fluorescente:

: Longitud de onda de excitación: 330 nm

: Longitud de onda fluorescente: 400 nm

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TABLA 10

9

Los perros Beagle para el análisis farmacocinético usado en este ejemplo fueron previamente seleccionados llevando a cabo un análisis de fenotipos. En el análisis farmacocinético, se usaron 5 perros (tipo I), en los que el metabolito principal era MM-2, y 5 perros (tipo II), en los que los metabolitos principales eran MM-1 y MM-5. En la tabla 1 (tipo I) y en la tabla 2 (tipo II), se muestran los cambios a lo largo del tiempo en las concentraciones del compuesto A y de los metabolitos del mismo en plasma.

Como parámetros farmacocinéticos, se calcularon el tiempo de concentración máxima observado (Tmax), la concentración correspondiente al Tmax (Cmax), el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el momento de la dosificación extrapolado hasta el infinito (ABCinf) y la vida media terminal (T1/2). Los resultados se muestran en la tabla 11.

10

En cuanto a los parámetros farmacocinéticos del compuesto sin reaccionar, la Cmax del tipo II fue 7,5 veces la del tipo I y la ABCinf del tipo II fue 9,7 veces la del tipo I. A partir de los resultados, se concluyó que el tipo I era de tipo ME y que el tipo II era del tipo ML.

Además, como resultados del diagnóstico génico para el PSN de C a T en la posición 1.117 del gen CYP1A2 (i.e., en la posición 87 del exón 4) del ejemplo 6, los perros Beagle de tipo ME incluyeron dos sujetos del genotipo C/C y tres sujetos del genotipo C/T, y los perros Beagle de tipo ML incluyeron cinco sujetos del genotipo T/T.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, las diferencias individuales de una capacidad de metabolismo farmacológico de perros usados en, por ejemplo, un análisis del efecto farmacológico o un análisis de la toxicidad se pueden detectar antes del análisis. La presente invención se puede usar en la evaluación de los efectos farmacológicos o de la toxicidad de compuestos.

Aunque la presente invención se haya descrito con referencia a realizaciones específicas, es posible hacer diversos cambios y modificaciones obvios para los expertos en la técnica sin alejarse del ámbito de las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de las figuras

[Figura 1]

La figura 1 es una gráfica que muestra los cambios a lo largo del tiempo en las concentraciones de 4-ciclohexil-1-etil-7-metilpirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona y de los metabolitos de la misma en plasma en perros Beagle de tipo I. El eje horizontal muestra un tiempo (h) y el eje vertical muestra una concentración en plasma (ng/ml). El símbolo "A" significa el compuesto A.

[Figura 2]

La figura 2 es una gráfica que muestra los cambios a lo largo del tiempo en las concentraciones de 4-ciclohexil-1-etil-7-metilpirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona y de los metabolitos de la misma en plasma en perros Beagle de tipo II. El eje horizontal muestra un tiempo (h) y el eje vertical muestra una concentración en plasma (ng/ml). El símbolo "A" significa el compuesto A.

Texto libre del listado secuencial

La secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 19 es un oligo de ARN GeneRacer sintetizado artificialmente.

La secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 20 es un cebador 5' GeneRacer sintetizado artificialmente.

En la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 23, el "Xaa" situado en la posición 415 significa Glu o Gln; el "Xaa" situado en la posición 433 significa Gly; y el "Xaa" situado en la posición 435 significa Ala o Thr.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Polimorfismo genético del CYP1A2 canino

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<130> YO414PCT-712

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<150> JP 2003-152917

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<151> 29-05-2003

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<150> JP 2003-206581

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<151> 07-08-2003

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<160> 23

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1.380

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<212> ADN

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<213> Canis familiaris

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<220>

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<223> Inventor: Tenmizu, Daisuke; Fukunaga, Yasuhisa; Noguchi, Kiyoshi

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<400> 1

11

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Canis familiares

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctccaccat cttctgcttg

\hfill

20

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<210> 3

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Canis familiaris

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgtcctgga cactgcgctc

\hfill

20

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<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccccctcct aatgagctcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggccatgg gtgatccttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctccaccat cttctgcttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caatgacatt ggccactgac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttggggccg gatttgacac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggccatgg gtgatccttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggagtctt atgtacct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccactggttt atgaagac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcccttaat ggaggcctt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgacacccc ctaccacttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatcctgg agatcttccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattggaggt tgaccgcatc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatcctgg agatcttctg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccggtttgg tcttctgtgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacgtggcc agaagtgaga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: un oligo de ARN GeneRacer sintetizado artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacuggagc acgaggacac ugacauggac ugaaggagua gaaa

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: un cebador 5' GeneRacer sintetizado artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgactggagc acgaggacac tga

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactcttca ggcctttggg aagc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1.638

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (63).. (1.601)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 512

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (415).. (415)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" de la posición 415 significa Glu o Gln.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (433).. (433)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" de la posición 433 significa Gly.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (435).. (435)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El "Xaa" de la posición 435 significa Ala o Thr.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

16

17

18

Claims

1. Un procedimiento in vitro para detectar un polimorfismo genético del CYP1A2 canino caracterizado por la determinación de una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22).

2. Un procedimiento in vitro para determinar qué perro es un metabolizador extensivo o un metabolizador lento a la velocidad del metabolismo farmacológico, comprendiendo dicho procedimiento:

determinar una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22) en una muestra de ácido nucleico de un perro.

3. Un procedimiento in vitro para seleccionar un perro usado en un análisis de medicamentos, que comprende determinar qué perro es un metabolizador extensivo o un metabolizador lento a la velocidad del metabolismo farmacológico mediante el procedimiento según la reivindicación 2.

4. Uso de un grupo metabolizador extensivo o de un grupo metabolizador lento seleccionado mediante el procedimiento según la reivindicación 3 en un procedimiento para analizar un efecto farmacológico y/o una toxicidad de un fármaco de análisis.

5. Un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos que se hibrida con una cadena sentido o con una cadena antisentido de un gen CYP1A2 canino que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o la secuencia de nucleótidos constituida por los nucleótidos 63-1.601 de SEC ID N.º 22, o un polimorfismo genético del mismo en condiciones restrictivas, y seleccionado del grupo constituido por:

(1): un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, en el que hay contenida una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22, siendo C la base correspondiente;

(2): un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, en el que hay contenida una base correspondiente a una base situada en la posición 405 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22, siendo T la base correspondiente; y

(3): un ADN monocatenario constituido por de 15 a 30 nucleótidos, que es una cadena complementaria al ADN monocatenario (1) o (2).

6. El ADN monocatenario según la reivindicación 5, constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º 14 ó 16.

7. Un agente para diagnosticar un polimorfismo en una actividad metabólica de un fármaco que es un sustrato específico del CYP1A2 canino, comprendiendo dicho agente como ingrediente activo un reactivo para detectar una base correspondiente a una base situada en la posición 1.117 de un gen CYP1A2 canino (en la posición 1.179 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 22), siendo dicho agente el ADN monocatenario según lo definido en la reivindicación 5 ó 6.