ES2320421T3

ES2320421T3 - Anticuerpos para el diagnostico de un receptor p2x7 no funcional y el tratamiento de canceres y otras afecciones.

Info

Publication number: ES2320421T3
Application number: ES02715313T
Authority: ES
Inventors: Angus Gidley-Baird; Julian Alexander Barden
Original assignee: Intreat Pty Ltd
Current assignee: Intreat Pty Ltd
Priority date: 2001-01-17
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2009-05-22
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: CN100497385C; CN1541222A; JP4457169B2; HK1138013A1; EP1961767A2; US20170327592A1; US20200071419A1; US7531171B2; US20150274839A1; CN101555283B; US20080131438A1; WO2002057306A1; US8080635B2; EP1360203A1; US20110092674A1; EP1360203B1; JP2004528286A; MY158262A; US10450380B2; TWI319011B

Abstract

Anticuerpo que se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7, que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 1, en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis, y donde el anticuerpo no se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 1, en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación trans.

Description

Anticuerpos para el diagnóstico de un receptor P2X_{7} no funcional y el tratamiento de cánceres y otras afecciones.

Campo técnico

Esta invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de enfermedades, incluyendo cánceres. Los tipos de enfermedades con los que está relacionada esta invención incluyen cánceres derivados de células epiteliales y linfoma maligno. La invención también se refiere a otras afecciones, tales como estados preneoplásicos, síndrome de intestino irritable e infecciones víricas y otras. Es muy posible que la invención también sea aplicable a otras enfermedades y afecciones.

Antecedentes

La adenosina trifosfato (ATP) puede activar receptores purinérgicos regulados por ligando conocidos como receptores P2X. Se han identificado los subtipos de receptor P2X_{1} a P2X_{7}. Se sabe que diferentes subtipos de receptor P2X están presentes en muchas células, incluyendo células epiteliales y leucocitos, que incluyen linfocitos, timocitos, macrófagos y células dendríticas (Nihei et al. (2000) Blood 96 (3): 996-1005).

Los receptores P2X son permeables a iones de calcio así como a algunos otros cationes, tales como potasio y sodio (Buell et al. (2000) Blood 92 (10): 3521-3528). Un flujo de entrada de iones de calcio en una célula a través de un receptor P2X puede asociarse con muerte celular.

Se piensa que el subtipo P2X está implicado en la apoptosis o muerte celular programa en muchos tipos celulares (Nihei et al. (2000) Blood 96 (3): 996-1005 y Ferrari et al. (1997) Neuropharmacology 36 (9): 1295-1301). En presencia de ATP, el receptor P2X_{7} expresado en la superficie de una célula es capaz, en un segundo, de abrir canales de calcio a través de la membrana celular (Ferrari et al. (1997) Neuropharmacology 36 (9): 1295-1301). La exposición continua a ATP puede conducir a la formación de grandes poros, en un intervalo de unos pocos segundos a diez segundos, que permiten que la célula se sature con un exceso de calcio, induciendo la apoptosis (Buell et al. (1998) Blood 92 (10): 3521-3528).

Las secuencias de aminoácidos de los receptores P2X_{7} humano y de rata se conocen, por ejemplo, de la patente US Nº 6.133.434 (Buell et al.). Remítase también a la Figura 1 en este documento.

Generalmente, la exposición a ATP no da como resultado una apoptosis en el caso de células cancerosas epiteliales, por ejemplo. Se ha descubierto que dichas células expresan receptores P2X_{7} que son incapaces de formar poros. Estos se consideran receptores no funcionales.

En líneas celulares de cáncer humano, tales como PC3 de próstata y MCF7 de mama, así como en líneas celulares animales que incluyen hibridomas de roedores, el receptor P2X_{7} se encuentra en la superficie celular en una conformación no funcional.

Las células B de pacientes con linfoma maligno expresan receptores P2X_{7} no funcionales. El linfoma se desarrolla a partir de clones malignos que escapan a la destrucción citolítica. Este proceso conduce a la acumulación progresiva de linfocitos B malignos y, por lo tanto, a linfadenopatía y/o esplenomegalia.

Descripción resumida de la invención

En un primer aspecto, esta invención proporciona una sonda para la detección de una enfermedad o afección, estando la sonda adaptada para distinguir entre receptores P2X_{7} funcionales y receptores P2X_{7} no funcionales. Preferiblemente, la sonda distingue entre receptores P2X_{7} funcionales y no funcionales por detección de un cambio en relación con la unión de adenosina trifosfato (ATP) a los receptores, o por detección de un cambio en la unión de una o más proteínas necesarias para la formación de poros en receptores P2X_{7}. En una realización alternativa, la sonda detecta una o más partes del receptor P2X_{7} expuestas en ausencia de ATP unido. Dicha parte de receptor puede incluir un monómero de P2X_{7}.

La invención también proporciona un procedimiento para detectar una enfermedad o afección, incluyendo el procedimiento las etapas de usar la sonda de la invención para distinguir entre receptores P2X_{7} funcionales y receptores P2X_{7} no funcionales, proporcionando un perfil de expresión de receptor, y comparando el perfil de expresión de receptor con el de un perfil normal. El cambio puede detectarse, por ejemplo, como se ha indicado anteriormente en relación con la propia sonda.

La sonda puede ser natural o artificial. Preferiblemente, la sonda es un anticuerpo que puede ser policlonal, monoclonal, recombinante, un anticuerpo humanizado o un fragmento apropiado del mismo. El anticuerpo se dirige preferiblemente contra un epítopo localizado en un dominio extracelular adyacente a un sitio para la unión a ATP. En el caso de receptores P2X_{7} humanos, la sonda está preferiblemente adaptada para distinguir entre receptores funcionales que tienen una secuencia en la que la prolina del aminoácido 210 está en la conformación trans y receptores no funcionales que tienen una secuencia en la que la prolina del aminoácido 210 está en la conformación cis.

La sonda puede prepararse usando cualquier técnica adecuada, como será fácilmente evidente para un experto en la materia.

Se incluye en el alcance de la invención que la sonda pueda distinguir entre receptores funcionales y no funcionales mediante la detección de otros cambios conformacionales que ocurren en un sitio para unión a ATP. Por ejemplo, el cambio detectado puede ser en un aminoácido distinto de la prolina mencionada anteriormente. Un ejemplo de dicho aminoácido es Pro 199. Como otro ejemplo, el cambio detectado puede ser en algún otro sentido.

La sonda también puede estar adaptada para detectar otras regiones del receptor P2X_{7} que no cambian por el estado funcional. La conformación de las subunidades monoméricas que carecen de ATP unido puede ser detectable usando la sonda, puesto que el epítopo seleccionado puede detectar específicamente la forma de una región de la superficie del receptor accesible solamente cuando no está unido el ATP. La sonda puede detectar un cambio en la unión de una o más proteínas, tales como proteínas accesorias u otras, necesarias para la formación de poros. Los ejemplos no limitantes de dichas proteínas son laminina, integrina, beta-actina, alfa-actinina y supervilina.

En la presente invención, puede usarse un anticuerpo específico de subtipo P2X_{7} para detectar específicamente o unirse a receptores P2X_{7} no funcionales expresados en o sobre células que forman parte de tejido preneoplásico, tejido neoplásico muy temprano, tejido neoplásico avanzado y sobre cualquier célula neoplásica que exprese receptores P2X_{7} no funcionales. Por lo tanto, el receptor P2X_{7} se detecta o se une solamente cuando está en la conformación regulada cerrada o no funcional, aun cuando puede expresarse normalmente en las membranas celulares y de otro modo puede ser parcialmente capaz de funcionar como un canal.

Además, la conformación de las subunidades monoméricas que carecen de ATP unido también es detectable con el anticuerpo, porque el epítopo seleccionado detecta específicamente la forma de una región de la superficie accesible solamente cuando no está unido el ATP.

En la presente invención, los receptores P2X_{7} no funcionales pueden detectarse o unirse mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra un epítopo que experimenta un cambio conformacional a partir de la estructura presente en receptores funcionales. Se ha descubierto que la secuencia de aminoácidos de los receptores no funcionales puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de receptores funcionales, de modo que la causa del cambio conformacional en los receptores está relacionada con la interacción de los receptores con ATP. Como se ha expuesto anteriormente, las moléculas de ATP actúan como agonistas de receptores, de modo que cuando se une ATP a los receptores, son capaces de abrir un canal a través de la membrana celular para el flujo de entrada de iones de calcio. Por lo tanto, la no funcionalidad está causada por una ausencia de unión apropiada de los agonistas de ATP a los receptores, por razones que pueden incluir un déficit en la disponibilidad local de ATP por un déficit de producción o un aumento en la velocidad de degradación. Si se altera la unión de ATP a los receptores, se altera la conformación del receptor. Esto puede detectarse mediante el uso de un anticuerpo especialmente diseñado para unirse a la región de la proteína afectada por la unión del ATP.

En el caso de receptores P2X_{7} humanos, la secuencia específica implicada en el cambio conformacional puede incluir la Pro210, que experimenta un cambio en la conformación de la forma trans a la forma cis en ausencia de ATP unido. Por lo tanto, en el caso de receptores humanos, una secuencia de epítopo apropiada contra la que debe generarse un anticuerpo puede incluir la Pro210, y puede abarcar cualquier lado de este resto, en un grado apropiado necesario para inducir una respuesta de anticuerpos.

A modo de ejemplo no limitante, ésta puede incluir un segmento que abarque desde la Gly200 al Thr215. Además, puede usarse un segmento homólogo de otros mamíferos, tales como rata, en el que éste presente reactividad cruzada con tejido humano. Como ejemplo, puede usarse el mismo segmento Gly200 a Thr215 en rata, aunque existen dos sustituciones de aminoácidos en la secuencia de rata en comparación con la secuencia humana (remítase a la patente US Nº 6.133.434, por ejemplo).

En el caso de receptores no humanos, la secuencia específica puede determinarse mediante un experimento adecuado.

La detección de receptores P2X_{7} no funcionales de acuerdo con la invención puede mostrar un patrón de distribución en el que los receptores funcionales (y, por lo tanto, las células normales) pueden quedar esencialmente sin marcar. Sin embargo, pueden detectarse conformaciones no funcionales de receptores P2X_{7}, inicialmente en los núcleos y citoplasmas de células, en una fase muy temprana en una preneoplasia. Por ejemplo, en el caso de cáncer de células epiteliales, usando el procedimiento de la invención puede ser posible detectar una preneoplasia varios años antes de la aparición patológica normal de cáncer como se detecta mediante portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina ("H y E") de tejidos biopsiados. Por lo tanto, pueden detectarse cánceres tales como de próstata, piel y mama mucho antes de lo que actualmente es el caso, con las ventajas de la introducción de una terapia temprana.

El alcance completo de las enfermedades y afecciones que pueden detectarse mediante la sonda y el procedimiento de la invención no se ha determinado todavía. Sin embargo, se piensa que éstas incluyen cánceres de células epiteliales, tales como cánceres de próstata, mama, piel, pulmón, cuello uterino, útero, estómago, esófago, vejiga, colon y vagina, así como cánceres sanguíneos incluyendo linfoma maligno, síndrome de intestino irritable e infección por virus, tales como VIH, u otros organismos patológicos, tales como Mycobacterium tuberculosis. Una infección puede provocar que se expresen receptores no funcionales directamente por inhibición de los cofactores necesarios para la funcionalidad, o mediante la regulación positiva de los cofactores que actúan inhibiendo la función de P2X_{7} en células epiteliales u otras, volviendo de este modo a la célula infectada menos susceptible a la destrucción por apoptosis.

A menos que se indique otra cosa, la expresión "enfermedad o afección", como se usa en este documento, pretende incluir todas las enfermedades y afecciones específicas expuestas en el párrafo anterior.

En el caso específico de síndromes de intestino irritable ("IBS"), se ha descubierto ahora que, en pacientes con esta afección, la mucosa intestinal, que normalmente expresa receptores P2X_{7} en los linfocitos ampliamente distribuidos presentes en el estroma bajo el epitelio, se vuelve regulada positivamente. En pacientes afectados, esta expresión aumentada puede observarse desde el duodeno hasta la mucosa rectal. La expresión aumentada puede encontrarse en regiones aisladas o puede estar aumentada en general a lo largo de la longitud completa del tracto intestinal en casos más extremos.

En los casos menos afectados, los receptores P2X_{7} totales están regulados positivamente, pero todos éstos son funcionales y no penetran en el epitelio. En casos más graves, la expresión total del receptor P2X_{7} es incluso mayor y las áreas más afectadas del intestino presentan receptores que no son funcionales. Éstos pueden localizarse en la mucosa del ciego, por ejemplo, y penetrar en el epitelio. Los casos más graves son aquellos en los que la expresión total del receptor P2X_{7} está adicionalmente aumenta y la mayoría de los receptores son no funcionales con una penetración celular epitelial aumentada.

Como se ha analizado anteriormente, la no funcionalidad de receptores P2X_{7} está causada por la ausencia de una unión apropiada del agonista de ATP a los receptores. Las razones para esto pueden incluir un déficit en la disponibilidad local de ATP por un déficit de producción o un aumento en la velocidad de degradación por la degradación enzimática de ATP por ecto-ATPasa. Si se altera la unión de ATP a los receptores, se altera la conformación del receptor, como ya se ha analizado, y esto puede detectarse usando la sonda de la invención. Sin embargo, la detección de la distribución total de receptor P2X_{7} se consigue mejor usando un epítopo contra otras regiones del dominio extracelular del receptor P2X_{7} que no estén afectadas por la unión de ATP.

Se incluye en el alcance de esta invención el uso de uno o dos anticuerpos específicos de subtipo P2X_{7} para distinguir específicamente entre distribución total de P2X_{7} y la proporción de receptores que no son funcionales y se expresan en la mucosa intestinal. Por lo tanto, los dos anticuerpos usados juntos pueden detectar tanto el recuento total de receptor como los canales de receptores presentes solamente en una conformación regulada cerrada o no funcional. El primer anticuerpo está adaptado para detectar expresión total de receptor P2X_{7}. La sonda que comprende o está unida al anticuerpo de la invención puede proporcionar el segundo anticuerpo para la detección de IBS, no sólo distinguiendo entre receptores P2X_{7} funcionales y no funcionales, sino también permitiendo la detección de otras regiones en las que el receptor no cambie por el estado funcional. Los anticuerpos pueden usarse por separado o juntos. Preferiblemente, se usan en combinación.

La detección de todos los receptores P2X_{7}, por separado de receptores P2X_{7} no funcionales, determina la gravedad de la afección. La expresión de receptores P2X_{7} no funcionales en la mucosa gastrointestinal se produce en un patrón en el que las células normales quedan esencialmente sin marcar. Por lo tanto, la conformación no funcional de P2X_{7} se detecta primero en el estroma bajo el epitelio, variando de parches aislados en casos leves del síndrome a expresión considerable a lo largo de toda la longitud del tracto gastrointestinal con parches aislados de infiltración de receptores no funcionales en el epitelio.

La invención también proporciona un procedimiento de diagnóstico del síndrome de intestino irritable, que comprende detectar el perfil de expresión de P2X_{7} de células y/o tejido y comparar el perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejido normal. Preferiblemente, la detección del perfil de expresión de P2X_{7} incluye el uso de uno o más anticuerpos. Además, se prefiere que dicho anticuerpo o anticuerpos sean diferentes de la sonda de la invención, en el sentido de que no detecten cambios en relación con la unión de ATP a los receptores P2X_{7}. La preparación de dichos anticuerpos será fácilmente evidente para un experto en la materia.

La invención también incluye el uso de uno o más anticuerpos para diagnosticar el síndrome de intestino irritable.

El diagnóstico puede usarse en microscopia convencional empleando técnicas inmunohistoquímicas convencionales.

El tratamiento terapéutico para esta afección se analiza a continuación, en relación con el tercer aspecto de esta invención.

El diagnóstico usando la sonda y el procedimiento de la invención puede llevarse a cabo usando técnicas de formación de imágenes in situ para detectar la distribución en tejidos corporales. Además, puede usarse microscopía convencional, microscopía confocal y separación de células activadas por fluorescencia. Pueden usarse técnicas inmunohistoquímicas normales para ensayar biopsias de linfa, próstata, mama, piel, pulmón, útero, vejiga, cuello uterino, estómago, esófago y similares, también aspiraciones con aguja fina de mama y otros tejidos y frotis de células, tales como los tomados para la detección de cáncer cervical. Pueden usarse otras técnicas con la sonda y el procedimiento de la invención.

Esta invención proporciona un anticuerpo para tratar una enfermedad o afección, estando el anticuerpo adaptado para distinguir entre receptores P2X_{7} funcionales y receptores P2X_{7} no funcionales, y estando adaptado para unirse solamente a receptores no funcionales. Preferiblemente, el anticuerpo distingue entre los receptores funcionales y no funcionales por detección de un cambio en relación con la unión de adenosina trifosfato (ATP) a los receptores, o por detección de un cambio en la unión de una o más proteínas necesarias para la formación de poros en receptores P2X_{7}, y estando adaptado para unirse solamente a receptores no funcionales. En otra realización, el anticuerpo distingue entre los receptores funcionales y no funcionales por detección de partes del receptor expuestas en ausencia de ATP unido.

El anticuerpo para tratar enfermedades y afecciones puede ser el mismo que el anticuerpo que puede usarse como la sonda para diagnosticar enfermedades y afecciones. Dicho anticuerpo podría usarse para tratar cánceres de piel tópicamente, por ejemplo. Para el tratamiento sistémico del cáncer, el anticuerpo o sus fragmentos activos deberían humanizarse para minimizar los efectos secundarios por respuestas inmunes indeseables.

El anticuerpo de la invención puede usarse para tratar enfermedades o afecciones en mamíferos, incluyendo seres humanos. Se han expuesto anteriormente ejemplos de enfermedades o afecciones en relación con la sonda de la invención.

La invención también proporciona un epítopo capaz de causar la generación del anticuerpo del segundo aspecto de la invención. El epítopo incluye preferiblemente la Pro210 y abarca el segmento Gly200 a Thr215 (en la secuencia de P2X_{7} del receptor humano). Preferiblemente, el epítopo debería tener unido en el extremo C-terminal un resto Cys que se entrecruza con toxina diftérica mediante el entrecruzante químico maleimidocaproil-N-hidroxisuccinimida (MCS), de modo que la conformación adoptada por el péptido epitópico unido ocupe una configuración de prolina en cis estable.

Esta conformación peptídica específica está destinada a presentarse a seres humanos o animales con una o más enfermedades o afecciones, especialmente cánceres de células epiteliales, tales como cánceres de próstata, mama, piel, pulmón, cuello uterino, útero, estómago, esófago; vejiga, colon y vagina, así como linfoma maligno, síndrome de intestino irritable e infecciones por virus, tales como el VIH, u otros organismos patológicos, tales como Mycobacterium tuberculosis. Preferiblemente, el paciente montará una respuesta inmune contra el epítopo conjugado aplicado y, de este modo, generará anticuerpos que reconozcan los receptores P2X_{7} no funcionales presentes sobre la superficie de las células afectadas, uniéndose por lo tanto a los mismos y alertando a la célula inmune apropiada para destruir las células que estén formando complejos. También pueden afectarse otras células sensibilizadas para muerte celular.

Debe entenderse que la secuencia a la que se ha hecho referencia anteriormente no es limitante del alcance de la invención, que incluye secuencias alternativas y vehículos y entrecruzantes que produzcan de forma similar una respuesta inmune específica, preferiblemente sólo contra receptores P2X_{7} no funcionales, ignorando preferiblemente todos los receptores funcionales expresados en superficies celulares y, de este modo, evitando efectos secundarios.

La invención, en este segundo aspecto, también proporciona el uso del anticuerpo de la invención como un vehículo terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente para regular la muerte celular programada, dirigiéndose a receptores P2X_{7} anormales o no funcionales expresados en la superficie de células, al tiempo que deje sin tocar todas las células que expresen receptores normales (funcionales). La invención también abarca el uso del epítopo de la invención para causar la generación del anticuerpo, como anteriormente.

La invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección en un paciente, incluyendo a composición una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo, o un epítopo para causar la generación de dicha cantidad, capaz de regular la muerte celular programada de células que tienen expresados en su superficie receptores P2X_{7} anormales o no funcionales.

La cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo o epítopo variará de acuerdo con el paciente y la naturaleza de la enfermedad o afección. Estas variables pueden determinarse por un experto en la materia.

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquiera de los conocidos en la técnica o concebidos a continuación, y adecuados para el uso deseado. Además de vehículos, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir otros ingredientes incluyendo colorantes, conservantes, tampones y antioxidantes, por ejemplo.

La composición farmacéutica de la invención puede adoptar cualquier forma deseada y puede administrarse, por ejemplo, en forma de una pomada, crema, solución, suspensión, polvo, comprimido, cápsula, supositorio u óvulo vaginal.

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse en cualquier forma adecuada, que puede incluir administración oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o tópica.

La invención también proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección en un paciente, incluyendo el método administrar al paciente una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

La invención también proporciona el uso de la composición farmacéutica de la invención en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección en un paciente.

Será evidente para un experto en la materia que puede ser necesario alterar el patrón de uso de la composición farmacéutica de la invención para un efecto óptimo. Puede ser necesario tener en cuenta la naturaleza de la enfermedad o afección, así como su gravedad.

El tercer aspecto de la invención se centra en la expresión de ATPasas (enzimas) que controlan el suministro de ATP a receptores P2X_{7}, por ejemplo en las células B de un paciente de que tiene un linfoma maligno. La apertura del canal de receptores P2X_{7} en leucocitos finaliza mediante la hidrólisis rápida de agonista de ATP por ecto-ATPasas y ecto-ATPdifosfohidrolasas (ecto-ATPDasas). Estas enzimas regulan numerosos procesos fisiológicos que son dependientes de ATP. La especificidad de sustratos de la actividad ATPasa y ATPDasa en linfocitos indica la presencia en los linfocitos de más de un tipo sobre la superficie celular, incluyendo CD39. La proliferación de una o más de estas ATPasas o ATPDasas podría limitar el suministro del ATP necesario para controlar la formación de poros de P2X_{7} y la posterior muerte celular programada necesaria para regular el número de células B.

De forma similar, se piensa que en el caso de IBS, la proliferación de ATPasas puede contribuir a una ausencia de unión apropiada del ATP agonista a los receptores P2X_{7}.

Por consiguiente, en este tercer aspecto, la invención proporciona una preparación para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección en un paciente, incluyendo la preparación una o más sustancias adaptadas para regular la expresión de ATPasas que controlan el suministro de ATP a receptores P2X_{7} en las células o tejidos del paciente. La invención también proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección en un paciente, incluyendo el método la etapa de administrar al paciente una preparación que incluya una o más sustancias adaptadas para regular la expresión de ATPasas que controlan el suministro de ATP a receptores P2X_{7} en las células o tejido del paciente.

Pueden ser ejemplos de dichas ATPasas CD39 o CD73.

Dicha sustancia puede adoptar la forma de un análogo de ATP, preferiblemente no hidrolizable y específico para P2X_{7} u otra sustancia que inhiba la acción de ATPasas locales que reducen la disponibilidad de ATP para el sitio de unión de P2X_{7}. La preparación puede ser en forma de un anticuerpo humanizado dirigido específicamente contra receptores P2X_{7} no funcionales.

La enfermedad o afección es preferiblemente linfoma maligno o IBS, pero la invención también puede abarcar otras enfermedades o afecciones, incluyendo otros cánceres de células epiteliales o sanguíneos o infecciones víricas y otras patológicas.

En el caso de linfoma maligno, las ATPasas controlan el suministro local de ATP a los receptores P2X_{7} para reducir la concentración de ATP disponible para unirse a los receptores P2X_{7} y, de este modo, desactivarlos conduciendo a una reducción significativa de la muerte programada de células B. Estas ATPasas pueden expresarse específicamente en la superficie de las células B y parecen estar reguladas positivamente en el linfoma maligno. Preferiblemente, puede usarse la aplicación de un inhibidor de ATPasa específico para regular la disponibilidad de ATP sobre los receptores P2X_{7}, regulando de este modo la muerte programada de células B.

Para el tratamiento del linfoma maligno, la sustancia puede incluir un agonista sintético capaz de bloquear ATPasas o ATPDasas de la forma de agonista de P2X_{7} no hidrolizable.

En relación con el síndrome de intestino irritable, la administración de la preparación de la invención pretende restaurar la función del receptor que puede estar reducida por la hiperactividad del músculo subyacente a la región de mucosa afectada. La preparación de la invención puede actuar sobre la mucosa directamente para eliminar estos receptores no funcionales y, por lo tanto, restaurar los mecanismos secretores gastrointestinales locales normales. El tratamiento terapéutico va dirigido a restaurar el suministro local de ATP a los receptores no funcionales, de modo que se restaure la función del receptor normal. Las consecuencias del control de la función del receptor incluyen la restauración del control normal de las secreciones gastrointestinales y la peristalsis. Esto puede conseguirse por aplicación de suministro enteral o sistémico de agonista sintético específico de P2X_{7}, preferiblemente no hidrolizable por ATPasas, por aplicación sistémica de un anticuerpo dirigido contra receptores P2X_{7} no funcionales, preferiblemente un anticuerpo específico humanizado pequeño para eliminar los receptores no funcionales, dejando solamente receptores funcionales.

Si las anomalías de la peristalsis en el músculo liso subyacente son responsables de la reducción de la disponibilidad local de ATP para unirse a los receptores P2X_{7} normales, el tratamiento puede implicar la restauración de este suministro natural de agonista por medio de un límite en la captación o uso de ATP por el músculo liso por aplicación de un tratamiento para limitar temporalmente la motilidad intestinal.

La invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o afección, incluyendo la composición una cantidad farmacéuticamente eficaz de una o más sustancias adaptadas para regular la expresión de ATPasas (enzimas) que controlan el suministro de ATP a receptores de P2X_{7}.

La invención en todos sus aspectos abarca aplicaciones similares de este tipo que podrían realizarse en otras condiciones médicas en las que estén implicados receptores P2X_{7} anormales, como resultado de una infección vírica en la que el virus esté protegido en la célula infectada por regulación positiva de receptor P2X_{7} no funcional, o cuando dichos receptores estén regulados positivamente a partir de la condición celular normal.

La invención también proporciona un método de tratamiento del síndrome de intestino irritable que comprende administrar a un paciente una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente.

La invención también proporciona el uso de dicha composición farmacéutica en el tratamiento del síndrome de intestino irritable.

Puede ser necesario alterar el patrón de uso de uno o más de los agentes farmacéuticamente eficaces anteriores para un efecto óptimo.

Expresado de otra forma, la invención proporciona un método de tratamiento del síndrome de intestino irritable, incluyendo el método administrar una composición adaptada para restaurar la función del receptor P2X_{7}. La función del receptor puede haberse reducido por hiperactividad del músculo subyacente a la región de mucosa afectada. La composición puede ser igual que la expuesta anteriormente para la sustancia incluida en la preparación de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para distinguir entre conformaciones diferentes de proteínas mediante el uso de un epítopo capaz de causar la generación de un anticuerpo, o el propio anticuerpo, para lograr efectos farmacéuticos específicos (inmunización activa así como pasiva) a partir de la unión a todos los miembros de las proteínas con una conformación seleccionada. Un ejemplo de esto serían proteínas priónicas en la conformación que conduce a la afección vCJD. La forma anormal de la proteína podría fijarse como objetivo de un anticuerpo específico, o epítopo que cause la generación del anticuerpo, preferiblemente humanizado y reducido en tamaño para un efecto farmacológico óptimo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor P2X_{7} humano (técnica anterior). Las secuencias 65 a 81 y 200 a 216 están resaltadas y se hace referencia a las mismas a continuación.

Descripción detallada de la invención

Para generar el anticuerpo contra P2X_{7} no funcional, el epítopo usado era la secuencia 200 a 216 de la Figura 1, que contiene una Cys en la posición 216.

Para generar el anticuerpo contra P2X_{7} tanto funcional como no funcional, el epítopo usado era la secuencia 65 a 81 de la Figura 1, a la que se añadió una Cys N-terminal.

Los restos Cys sobre los epítopos se acoplaron mediante un entrecruzante de maleimidocaproil-N-hidroxisuccinimida (MCS) con vehículo de toxina diftérica (DT) con diez epítopos peptídicos unidos a cada vehículo de DT para mantener la estabilidad conformacional y proporcionar una estructura antigénica de mayor tamaño. Estos epítopos conjugados se usaron como los antígenos para inyección en varias especies animales (oveja, conejo y ratón) para generar anticuerpos específicos contra los epítopos de la forma habitual.

El procedimiento para generar anticuerpos está bien documentado en la técnica anterior mediante el uso de mezclas de antígeno/adyuvante inyectadas en animales en momentos particulares. Se exponen a continuación ejemplos específicos para generar los anticuerpos:

Ejemplo 1 Anticuerpos de oveja anti-P2X_{7}

Se diluyeron 500 \mug de conjugado (aproximadamente 100 \mug de epítopo de P2X_{7}) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 0,8 ml y se emulsionaron con 1,2 ml de adyuvante completo de Freund. Se inyectó a ovejas en múltiples sitios tanto por vía subcutánea como intramuscular con la emulsión de antígeno/adyuvante. Ocho semanas después, a las ovejas se les inyectó de nuevo la misma cantidad de conjugado emulsionado con adyuvante incompleto de Freund en múltiples sitios. Esto se repitió 4 semanas después y a los animales se les extrajo sangre de la vena yugular. El suero recogido se ensayó para especificidad a anticuerpo. Después, las ovejas recibieron inyecciones y se les extrajo sangre de forma rutinaria a intervalos de ocho semanas para proporcionar una combinación de suero que contenía los anticuerpos específicos.

A otras ovejas se les inyectó la misma dosis de antígeno conjugado similar al programa anterior pero se usó un adyuvante diferente. En estos animales, se mezclaron 0,7 ml del antígeno diluido con 0,1 ml de una solución Quill A/DEAE dextrano (2,5 mg de Quill A + 25 mg de DEAE dextrano por ml de PBS) y 1,2 ml de ISA50 Montanide. La emulsión se inyectó en múltiples sitios tanto por vía subcutánea como intramuscular. Los anticuerpos producidos usando este adyuvante producían las mismas especificidades que los producidos usando el adyuvante de Freund.

Ejemplo 2 Anticuerpos de conejo anti-P2X_{7}

Se generaron anticuerpos en conejos usando los mismos dos adyuvantes que con la oveja y los mismos programas de inyección, siendo la única diferencia que se usaron cantidades de 300 \mug del conjugado para la inyección. Los anticuerpos generados tenían las mismas especificidades que los producidos en la oveja y podían discriminarse fácilmente entre los epítopos contra los que se generaron.

Ejemplo 3 Anticuerpos de ratón anti-P2X_{7}

Se generaron anticuerpos en ratón contra los epítopos conjugados y también contra el epítopo no conjugado del epítopo P2X_{7} no funcional (que es capaz de discriminar receptores que no pueden formar poros y, por lo tanto, no logran ser apoptóticos).

En estos experimentos, el adyuvante usado era el producto QIAGEN Pty Ltd, IMMUNEASY^{TM}, que contiene el producto inmunoestimulador CpG DNA (marca registrada de Coley Pharmaceutical Group Inc.).

Se diluyeron 5 \mug de epítopo o epítopo conjugado en 70 \mul de PBS y 30 \mul de adyuvante IMMUNEASY^{TM}. A los ratones se les inyectó en múltiples sitios por vía subcutánea e intramuscular. Este régimen se repitió dos semanas después y de nuevo dos semanas más tarde. Se les extrajo sangre a los ratones ocho días después de la tercera inyección. Los anticuerpos generados en ratones por este procedimiento eran de nuevo capaces de discriminar entre los diferentes epítopos de P2X_{7} y los anticuerpos contra el epítopo no funcional de P2X_{7} dieron los mismos resultados que los generados en ovejas y conejos. Además, los anticuerpos generados contra el epítopo no funcional no conjugado también eran capaces de reconocer este epítopo en tejido tumoral.

Como ilustran los Ejemplos anteriores, pueden generarse sistemáticamente anticuerpos contra diversos epítopos del receptor P2X_{7} en especies diferentes y usando adyuvantes diferentes. En particular, puede generarse de forma rutinaria anticuerpos contra un epítopo del receptor P2X_{7} que identifiquen el receptor en el estado no funcional, en el que no puede formar un poro y llevar a cabo su función apoptótica en condiciones fisiológicas normales.

Ejemplo 4

El anticuerpo que detecta P2X_{7} no funcional se ensayó por unión del anticuerpo a células que expresan P2X_{7} (humano) con función conocida, como revelaba por la capacidad del P2X_{7} para captar etidio o rubidio. Estos canales de proteína P2X_{7} pueden haberse mutado en el par de bases 1513, de modo que los canales no formen poros apoptóticos. Éstos y receptores P2X_{7} no funcionales similares expresados en linfocitos B malignos también se unían al anticuerpo en citometría de flujo y en inmunohistoquímica convencional, mientras que las células que expresaban P2X_{7} funcional normal (capaz de captar calcio, etidio y rubidio con grandes flujos) eran incapaces de unirse al anticuerpo, porque el epítopo seleccionado para detectar los receptores no funcionales no estaba disponible en receptores funcionales. La Pro210 adoptaba una conformación cis en los receptores no funcionales y era específicamente esta conformación la que se estabilizaba en el epítopo conjugado usado para generar el anticuerpo. La Pro210 estaba en la configuración trans en los receptores que se demostró que eran funcionales. Esto era un resultado de la unión de ATP (adenosina trifosfato) al receptor P2X_{7}. Cuando se unía ATP, la Pro210 en un segmento inmediatamente adyacente al sitio de unión a ATP adoptaba una configuración trans.

Esto se verificó usando mutagénesis dirigida para cambiar la Pro210 a una Ala que se fijó en la configuración trans y se descubrió que esta proteína mutante era completamente funcional e incapaz de unirse al anticuerpo generado para detectar el receptor no funcional.

Ejemplo 5

Una verificación adicional de la especificidad del anticuerpo para detectar el receptor no funcional venía de experimentos que marcaban macrófagos que expresaban P2X_{7}. Los macrófagos unían anticuerpo a los receptores P2X_{7} usando el anticuerpo universal de P2X_{7}, pero no unían el anticuerpo a P2X_{7} no funcional hasta que se hubieron expuesto a células cancerosas tales como células de hibridoma de ratón. El contacto entre los macrófagos y las células de hibridoma inducía la expresión en los macrófagos de P2X_{7} no funcional, que se detectó por el anticuerpo contra P2X_{7} no funcional, así como por el anticuerpo P2X_{7} universal.

Los macrófagos y linfocitos de células B extraídos de pacientes con linfoma maligno se ensayaron y todas estas células se unían al anticuerpo contra P2X_{7} universal, así como al anticuerpo contra los receptores P2X_{7} no funcionales, verificando que P2X_{7} era no funcional en todas las células cancerosas detectadas, siendo el poro apoptótico formado por P2X_{7} funcional incapaz de formarse y, por lo tanto, de inducir apoptosis en células cancerosas.

Todas dichas células cancerosas de todos los cánceres de células epiteliales en seres humanos tales como de próstata, mama, intestino, piel, estómago, cuello uterino y otros, así como de linfoma maligno, leucemia linfocítica crónica y tumores cerebrales, así como de los mismos tumores en otros mamíferos que se ensayaron, incluyendo de mama y próstata en perro y de piel en gato, así como todas las células de hibridoma de ratón, todas expresan el mismo P2X_{7} no funcional. La similitud de secuencia entre seres humanos, rata, gato, perro y ratón en los epítopos seleccionados es suficiente para que se realice una identificación positiva en todos los casos anteriores. Esto demuestra que el mecanismo del cáncer en estos mamíferos es idéntico en el sentido de que las células cancerosas expresan receptores P2X_{7} no funcionales incapaces de formar poros apoptóticos que normalmente destruirían la célula cuando se activan. De esta forma, las células cancerosas se vuelven inmortales, interrumpiéndose la apoptosis.

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Ejemplo 6

Como una verificación adicional de que las células cancerosas, tales como linfocitos de células B afectados, son incapaces de inducir apoptosis a través de la función de P2X_{7}, se incubaron células B de pacientes con leucemia que contenían receptores P2X_{7} no funcionales con ATP 5 mM durante 2 horas en cultivo. Los resultados fueron que el exceso de ATP forzó a todos los receptores no funcionales a abrirse e inducir apoptosis que destruyó las células afectadas.

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Ejemplo 7

Como una verificación adicional de que el anticuerpo se une selectivamente a células cancerosas, se trató la piel de pacientes con carcinomas de células basales (BCC) con el anticuerpo contra los receptores P2X_{7} no funcionales, suspendido en una base de crema inerte y aplicado a la lesión y a la piel circundante (remítase al Ejemplo 10 a continuación). En el plazo de 1 semana de aplicación diaria del anticuerpo tópico, había desaparecido todo rastro de las BCC sin efectos sobre la piel circundante puesto que la piel normal estaba desprovista de los receptores.

Aplicaciones de diagnóstico

En este documento se proporcionan descripciones a modo de ejemplo que usan el anticuerpo de P2X_{7} no funcional específico en animales y que demuestran la aplicación universal de la sonda y el procedimiento de la invención para el diagnóstico de la mayoría de cánceres en seres humanos y otros mamíferos.

En tejido de próstata de seres humanos y mamíferos, tales como gatos y perros, cuando se usa el anticuerpo de la invención para el diagnóstico, no se obtiene marcaje en ausencia de lesiones cancerosas o precancerosas. Sin embargo, el procedimiento de diagnóstico de la invención pone de manifiesto los primeros signos de cambio neoplásico cuando todavía no existen cambios morfológicos que lo acompañen detectables mediante tinción con H y E.

En esta fase, es necesario teñir las unidades de receptor que aparecen primero en los núcleos de células epiteliales. Estas migran al citoplasma en fases posteriores de la enfermedad, actuando como un efecto de campo por toda la próstata, de modo que es necesario biopsiar menos tejido para estar seguro de la existencia de un tumor. En fases posteriores de la enfermedad, la tinción se hace más limitada al epitelio apical.

De forma similar, otros cánceres de células epiteliales, como de mama, pulmón, colon y piel en seres humanos y otros mamíferos, tales como gatos y perros, pueden detectarse con márgenes puesto que ya no existe un efecto de campo claro en estos otros tejidos.

El mismo desarrollo de fase se observa en estos otros tejidos, como mama y cuello uterino, precediendo la tinción nuclear a la tinción citoplasmática, mientras que el tejido normal no se tiñe. Los conductos y lóbulos afectados en el tejido mamario se detectan fácilmente debido al efecto de campo local dentro del sistema de conducto afectado individual en la mama, incluso cuando una morfología normal sugiere que no existe cáncer. Los conductos sin afectar adyacentes aparecen sin teñir. De forma similar, los ganglios linfáticos afectados, que drenan directamente el tejido que contiene un tumor, muestran signos del tumor por el efecto de campo de linfocitos afectados. Por lo tanto, pueden detectarse ganglios centinela sin que exista ninguna propagación celular metastásica al ganglio.

Los cánceres de piel, tales como carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, así como melanomas malignos, muestran una tinción positiva para receptores y componentes de canales (monómeros) no funcionales en capas de queratinocitos y melanocitos con márgenes claros, más allá de los cuales la piel normal está sin marcar tanto en la epidermis como profundamente en el interior de la dermis.

Todas las líneas celulares de cáncer de mamíferos ensayadas, tales como de próstata humana (PC3) y de mama (MCF7) e hibridomas de roedores, son positivas para los receptores no funcionales en la superficie celular de modo que se inhibe la apoptosis en estas células cancerosas. La aplicación general de este diagnóstico se observa por medio del mismo marcador en células de hibridoma de ratón que demuestra la naturaleza ubicua del receptor en otros tipos animales aparte de seres humanos. Los linfocitos de células B humanos normales muestran que se expresan receptores P2X_{7} funcionales en la superficie celular, permitiendo de este modo la apoptosis cuando es necesario, mientras que los linfocitos de células B humanos de pacientes con linfoma maligno muestran que se expresan receptores P2X_{7} no funcionales en la superficie celular, reduciendo por lo tanto la apoptosis.

Aplicaciones terapéuticas

Fijar como objetivo este confórmero no funcional de P2X_{7} aparentemente ubicuo expresado en la superficie celular de células cancerosas que intentan experimentar apoptosis puede usarse para tratar la mayoría de los cánceres en seres humanos y otros mamíferos. Se exponen ejemplos a continuación:

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Ejemplo 8

Se cultivaron células de hibridoma de ratón sobre una base de macrófagos tanto en presencia como en ausencia de anticuerpo purificado por afinidad contra P2X_{7} no funcional. Los recuentos celulares pusieron de manifiesto que, por encima de 4 días, mientras las células se coincubaran con IgG normal purificada, crecían de 1 x 10^{4} a 7 x 10^{4}, manteniendo la coincubación con anticuerpo de P2X_{7} no funcional el recuento celular en sólo 1,5 x 10^{4}.

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Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra que anticuerpos generados contra el epítopo no funcional del receptor P2X_{7} pueden inhibir la formación de tumores in vivo.

Como se ha mostrado anteriormente, los anticuerpos generados en oveja contra el epítopo de P2X_{7} no funcional identificaban este receptor apoptótico P2X_{7} no funcional en la superficie de células de hibridoma de ratón. La adición de este anticuerpo a cultivos de células de hibridoma retrasaba el crecimiento de las células. Cuando se inyecten células de hibridoma de ratón en cepas de ratón endogámicas preparadas, causarán formación de tumores.

En este experimento, tres grupos de 10 ratones hembra Balb-c recibieron cada uno los siguientes tratamientos:

Grupo 1:: 10 ratones recibieron cada uno una inyección por vía intraperitoneal (IP) con 1 x 10^{6} células de hibridoma en 0,5 ml de medio de cultivo de células el Día 1. Los Días 2 y 3 recibieron una inyección intraperitoneal de 0,5 ml de medio de cultivo de células.

Grupo 2:: 10 ratones recibieron cada uno una inyección por vía intraperitoneal (IP) con 1 x 10^{6} células de hibridoma en 0,5 ml de medio de cultivo de células que contenía 1 mg de IgG de oveja purificada el Día 1. Los Días 2 y 3 se les inyectaron 0,5 ml de medio de cultivo de células que contenía 1 mg de IgG de oveja purificada.

Grupo 3:: 10 ratones recibieron cada uno una inyección por vía intraperitoneal (IP) con 1 x 10^{6} células de hibridoma en 0,5 ml de medio de cultivo de células que contenía 1 mg de IgG purificada de oveja anti-epítopo no funcional de P2X_{7} el Día 1. Los Días 2 y 3 recibieron una inyección adicional de 0,5 ml de medio de cultivo de células que contenía 1 mg de IgG purificada de oveja anti-P2X_{7}.

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Los ratones de todos los grupos se sacrificaron el Día 11 y se examinaron para determinar la presencia de tumor. Los tumores se extirparon y se pesaron.

Los resultados fueron los siguientes:

1

Un análisis de la varianza mostró una diferencia significativa en el peso tumoral entre los grupos (probabilidad <0,01). El grupo experimental tratado con los anticuerpos anti-P2X7 no funcional era significativamente diferente (p <0,01) de los dos grupos de control. Es decir, el tratamiento con anticuerpos contra el epítopo no funcional de P2X7 reducía significativamente la cantidad de tumor en los animales de experimentación.

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Ejemplo 10

Se aplicó anticuerpo específico purificado por afinidad (para aumentar enormemente la especificidad) a 3 carcinomas de células basales humanos ("BCC") como un líquido mantenido en su lugar durante 7 días o suspendido en una base de crema de dimeticona. No eran detectables rastros de las lesiones de BCC después del tratamiento, mientras que la piel de control estaba en su totalidad sin afectar debido a la ausencia de la diana proteica.

Se piensa que la aplicación a pacientes en general implicaría la producción de un anticuerpo monoclonal humanizado (tal como herceptina) de modo que los cánceres internos pudieran tratarse con la misma eficacia que se puso de manifiesto con la aplicación tópica. Todos los P2X_{7} funcional normales expresados en la superficie celular de células tales como linfocitos deberían permanecer sin afectar por la presencia del anticuerpo para evitar efectos secundarios. Por lo tanto, el anticuerpo debería unirse solamente a proteínas expresadas sobre la superficie celular de células que estén intentando pero sean incapaces de iniciar la apoptosis. Por lo tanto, todas las células diana serían únicamente las que estuvieran intentando autodestruirse por muerte celular programada, incluyendo células cancerosas. Los receptores P2X_{7} en estas células, particularmente células cancerosas, estarían en un estado no funcional o de ATP reducido.

Inmunización activa

También puede usarse la inmunización activa con fines terapéuticos. En este caso, los seres humanos u otros mamíferos deben inmunizarse contra un epítopo o epítopos específicos que estén en una conformación que mimetice la conformación adoptada solamente por los receptores en su forma no funcional (de ATP reducido) en la superficie celular. Debería evitarse una flexibilidad conformacional que incluye la exposición parcial de una forma de epítopo que está presente en receptores funcionales. La configuración en cis del epítopo Gly200-Thr215, como ejemplo, debería fijarse antes del uso por medios apropiados. Como una prueba añadida de que este concepto es válido está la observación de que numerosos animales, incluyendo ratones, conejos y ovejas, usados para generar los anticuerpos no se han visto inmunocomprometidos. Ninguno de estos muchos animales ha desarrollado nunca ningún tumor.

Aplicabilidad industrial

La invención en todos sus aspectos tiene aplicación en los campos de la medicina y la salud humana y veterinaria, con el potencial de permitir un diagnóstico temprano y preciso de enfermedades y un tratamiento eficaz, que en muchos casos es mucho menos invasivo o traumático que los disponibles en la técnica anterior.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet US 6133434 A, Buell [0005][0019]

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

\bulletNIHEI et al. Blood, 2000, vol. 96 (3), 996-1005 [0002][0004]

\bulletBUELL et al. Blood, 1998, vol. 92 (10), 3521-3528 [0003][0004]

\bulletFERRARI et al, Neuropharmacology, 1997, vol. 36 (9), 1295-1301 [0004][0004]

Claims

1. Anticuerpo que se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7, que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 1, en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis, y donde el anticuerpo no se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº: 1, en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación trans.

2. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a un epítopo del receptor P2X7 que incluye la Pro 210 de la SEC ID Nº: 1.

3. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el anticuerpo se une a un epítopo que comprende la secuencia de aminoácidos Gly200 a Thr215 de la SEC ID Nº: 1.

4. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo recombinante; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; y un fragmento de anticuerpo.

5. Péptido para generar un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido comprende un fragmento aminoacídico de la SEC ID Nº: 1, caracterizado porque dicho péptido incluye la prolina 210 en una conformación cis.

6. Péptido de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho fragmento aminoacídico comprende de la Gly200 a la Thr215 de la SEC ID Nº: 1.

7. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para el uso en la detección de una enfermedad o afección.

8. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la fabricación de un agente de diagnóstico para detectar una preneoplasia.

9. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la fabricación de un agente de diagnóstico para detectar un cáncer de células epiteliales.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el cáncer de células epiteliales se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, mama, piel, pulmón, cuello uterino, útero, estómago, esófago, vejiga, colon y vagina.

11. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la fabricación de un agente de diagnóstico para detectar un cáncer sanguíneo.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el cáncer sanguíneo es linfoma maligno.

13. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la fabricación de un agente de diagnóstico para detectar un síndrome de intestino irritable.

14. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, para el uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección.

15. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una preneoplasia.

16. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un cáncer de células epiteliales.

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el cáncer de células epiteliales se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, mama, piel, pulmón, cuello uterino, útero, estómago, esófago, vejiga, colon y vagina.

18. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un cáncer sanguíneo.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el cáncer sanguíneo es linfoma maligno.

20. Uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un péptido de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un síndrome de intestino irritable.