ES2320434T3 - Timidina quinasas vegetales y su uso. - Google Patents

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Abstract

Un polinucleótido aislado, que codifica una timidina quinasa vegetal, cuyo polinucleótido tiene al menos 73%, preferiblemente al menos 75%, más preferido al menos 80%, incluso más preferido al menos 90%, todavía más preferido al menos 95%, lo más preferido al menos 98% de identidad con la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 3, cuando se determina a lo largo de su longitud completa.

Description

Timidina quinasas vegetales y su uso.
Campo técnico
Esta invención se refiere a nuevas timidina quinasas vegetales y a su uso en terapia génica. Más específicamente, la invención proporciona nuevas timidina quinasas obtenidas de tomate.
En otros aspectos, la invención proporciona polinucleótidos nuevos que codifican las timidina quinasas vegetales, construcciones de vectores que comprenden el polinucleótido, células huésped que llevan el polinucleótido o vector, procedimientos de sensibilización de células a fármacos, procedimientos de inhibición de agentes patógenos en animales de sangre caliente y procedimientos de síntesis de monofosfatos.
En una realización preferida, la invención proporciona una combinación única de una timidina quinasa vegetal y el análogo de nucleósido AZT para tratar el crecimiento celular anómalo.
Técnica anterior
El ADN está compuesto de cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósidos, proporcionados por la ruta salvaje o una nueva. La enzima clave de la ruta nueva es la ribonucleótido reductasa, que cataliza la reducción del grupo 2'-OH de los difosfatos de nucleósidos, y las enzimas salvajes clave son desoxirribonucleósido quinasas, que fosforilan desoxirribonucleósidos a los correspondientes monofosfatos de desoxirribonucleósido.
Las desoxirribonucleósido quinasas de diferentes organismos difieren en su especificidad de sustrato, regulación de la expresión génica y localización celular. En las células de mamífero hay cuatro enzimas con especificidades que se superponen, las timidina quinasas 1 (TK1) y 2 (TK2), desoxicitidina quinasa (dCK) y desoxiguanosina quinasa (dGK), que fosforilan los desoxirribonucleósidos de purina y pirimidina. TK1 y TK2 son específicas de pirimidina y fosforilan la desoxiuridina (dUrd) y timidina (dThd), y TK2 también fosforila la desoxicitidina (dCyd). dCK fosforila dCyd, desoxiadenosina (dAdo) y desoxiguanosina (dGuo), pero no la dThd. dGK fosforila dGuo y dAdo. TK1 y dCK son citosólicas, y TK2 y dGK se localizan en las mitocondrias, aunque informes recientes indican una localización también citoplasmática de TK2.
Basándose en la homología con una timidina quinasa derivada de un virus Myxoma, se ha propuesto un gen del arroz que codifica una timidina quinasa [Hemayet Ullah, Dominique Robertson, and Roger C. Fites: A Gene for Thymidine Kinase in Plants (Nº de acceso AF066050; Plant gene register PGR99-048) Plant Physiol. 1999 119 1567]. Sin embargo, sólo se aisló una secuencia parcial, cuya secuencia no es suficiente para la expresión de la proteína activa.
Se han anotado dos trozos de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como timidina quinasas putativas en GenBank^{TM} (Nº de acceso AAF13097 y BAB09824). Sin embargo, hasta la fecha todavía no se han llevado a cabo trabajos experimentales dirigidos a la caracterización, propiedades, localización, uso o función biológica de quinasas vegetales.
La AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina, Zidovudina, Retrovir®) es un análogo de nucleósido usado en el tratamiento de infecciones por el VIH. La etapa limitante de la velocidad de su activación en células humanas es la activación del monofosfato de AZT (AZTMP) al difosfato de AZT.
Se ha sugerido usar la timidina quinasa de tipo 1 del virus Herpes Simplex humano (HSV1-TK), que tiene una actividad de monofosfato de timidina quinasa endógena, para el tratamiento por terapia génica de infecciones por el VIH. La HSV1-TK está relacionada filogenéticamente con la TK2 humana, pero no con la TK1 humana. Además, se ha sugerido el uso de HSV1-TK con el fin de mejorar la actividad antivírica de la zidovudina, y se ha mostrado que el uso de HSV1-TK en combinación con la AZT es capaz de matar bacterias E. coli transformadas. Sin embargo, debido a que se cree que la fosforilación del AZTMP es la etapa limitante de la velocidad en la activación de la AZT en seres humanas, no se han llevado a cabo trabajos experimentales dirigidos a una combinación eficaz de la AZT y una timidina quinasa para usar en el tratamiento del cáncer humano o en otras enfermedades humanas relacionadas con el crecimiento celular anómalo.
Resumen de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas timidina quinasas vegetales para convertir análogos de nucleósidos en sustancias tóxicas, y útiles para convertir análogos de nucleósidos en monofosfatos y monofosfatos de análogos de nucleósidos en los correspondientes difosfatos. Los genes de timidina quinasas vegetales aislados se pueden usar en terapia génica para matar selectivamente células que contienen los genes (y que se exponen a al menos un análogo de nucleósido) y las timidina quinasas aisladas proporcionadas por la presente invención se pueden usar para los procedimientos industriales importantes de fosforilación de nucleósidos y/o análogos de nucleósidos. Las timidina quinasas aisladas también se pueden usar para matar células inyectando las enzimas en las células y sometiendo las células a al menos un análogo de nucleósido. Siempre que se haga referencia a un análogo de nucleósido y/o su monofosfato, se entiende que este análogo de nucleósido preferiblemente es un análogo de desoxinucleósido, más preferiblemente un análogo de desoxirribonucleósido, y más preferiblemente la AZT.
Más específicamente, la invención proporciona una combinación única de una timidina quinasa vegetal y el análogo de nucleósido AZT para tratar el crecimiento celular anómalo.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican enzimas timidina quinasas vegetales obtenidas de tomate (Lycopersicum esculentum). Estas timidina quinasas vegetales han resultado ser especialmente eficaces en la fosforilación de la AZT y tienen una actividad de monofosfato quinasa endógena alta inesperada, especialmente en monofosfatos de análogos de nucleósidos tales como el AZTMP.
En otro aspecto la invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican enzimas timidina quinasa derivadas de plantas, cuyas enzimas timidina quinasas, cuando se comparan con la timidina quinasa de tipo 1 del virus Herpes Simplex humano (HSV1-TK), disminuyen al menos tres (3) veces la dosis letal (DL_{100}). Preferiblemente, este análogo de nucleósido es la AZT.
En un tercer aspecto, la invención proporciona polinucleótidos mutados y/o truncados aislados que codifican variantes de la enzima timidina quinasa obtenidas de plantas.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona enzimas timidina quinasa expresadas por un polinucleótido de la invención, o variantes de enzima timidina quinasa expresadas por un polinucleótido mutado (y/o truncado) de la invención.
En un quinto aspecto, la invención proporciona enzimas timidina quinasa vegetales obtenidas de tomate (Lycopersicum esculentum).
En un sexto aspecto, la invención proporciona construcciones de vectores que comprenden un polinucleótido de la invención y un promotor operativamente unido al polinucleótido.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona líneas celulares empaquetadas capaces de producir viriones infecciosos que comprenden un vector de la invención.
En un octavo aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un polinucleótido de la invención, o un vector de expresión de la invención.
En un noveno aspecto, la invención proporciona procedimientos de sensibilización de células a profármacos, cuyos procedimientos comprenden las etapas de (i) transfectar o transducir una célula con una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima timidina quinasa vegetal que promueve la conversión de dicho profármaco en un fármaco (citotóxico), o suministrar de otra forma la timidina quinasa vegetal a la célula; y (ii) suministrar un profármaco a dicha célula; por los que la célula es más sensible al fármaco (citotóxico) que al profármaco.
En un décimo aspecto, la invención proporciona procedimientos para inhibir agentes patógenos en animales de sangre caliente, cuyos procedimientos comprenden administrar a dichos animales un polinucleótido de la invención, o un vector de la invención.
En un decimoprimer aspecto, la invención se refiere al uso de las enzimas timidina quinasa vegetales de la invención para la fosforilación de nucleósidos o análogos de nucleósidos.
En un decimosegundo aspecto, la invención proporciona procedimientos de fosforilación de nucleósidos o análogos de nucleósidos, cuyos procedimientos comprenden las etapas de (i) someter el nucleósido o análogo de nucleósido a la acción de la enzima timidina quinasa vegetal de la invención, y (ii) recuperar el nucleósido o análogo de nucleósido fosforilado.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a artículos que contienen un análogo de nucleósido y una timidina quinasa obtenida de planta de acuerdo con la invención, o un gen que codifica dicha timidina quinasa obtenida de planta, o un vector que comprende dicho gen que codifica dicha timidina quinasa obtenida de planta, como una combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva en terapia de cáncer.
Otros objetivos de la invención serán evidentes para el experto en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos.
Descripción detallada de la invención Timidina quinasas vegetales
En su primer aspecto la invención proporciona nuevas proteínas que tienen actividad de enzima timidina quinasa (TK), y cuyas proteínas se obtienen de plantas. Más específicamente, las nuevas enzimas timidina quinasa vegetales se obtienen del tomate (Lycopersicum esculentum).
En el contexto de la presente invención, una timidina quinasa es una enzima capaz de fosforilar timidina, pero que no se capaz de fosforilar un nucleósido de purina usando los ensayos descritos en el Ejemplo 3, Tabla 5. Una timidina quinasa puede o no fosforilar desoxicitidina.
Las enzimas timidina quinasa de la invención son particularmente útiles para el tratamiento del crecimiento celular anómalo por activación de análogos de nucleósidos, en particular de ATZ.
Basándose en un alineamiento de secuencias de aminoácidos múltiple de Clustal W (1.82) de las timidina quinasas del tomate, pino y arroz, se identificaron tres patrones y varios restos conservados, semiconservados y menos conservados, como se muestran en la siguiente Tabla 1. En la Tabla 1, el alineamiento empieza con el resto de aminoácido nº 65 de la TK1 del arroz, porque los primeros 64 aminoácidos no se alinean con las otras timidina quinasas.
TABLA 1 Alineamiento de secuencias de aminoácidos múltiples de CLUSTAL W (1.82)
1
Por lo tanto, en una realización preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención comprende uno o más de los siguientes tres patrones:
Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe (Patrón I)
Val Ala Gly Leu Asp Gly (Patrón II)
Tyr Met Pro Val Cys Arg (Patrón III)
En otra realización preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención comprende la región Lid.
Val Al Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (región Lid), en la que A1 se selecciona de Thr y Val, A2 se selecciona de Thr y Lys, A3 se selecciona de Ala y Ser, y A4 se selecciona de Leu y Val.
En una realización más preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención comprende todos los restos conservados identificados en la Tabla 1.
Identidad de los polipéptidos
En otra realización preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención comprende la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 4 o como SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, todavía más preferido al menos 90%, todavía más preferido al menos 95% de identidad, lo más preferido al menos 98% de identidad, cuando se determina a lo largo de la longitud entera de SEQ. ID.
En el contexto de esta invención "identidad" es una medida del grado de homología de secuencias de aminoácidos. Con el fin de caracterizar la identidad, las secuencias objeto se alinean de modo que se obtenga la homología (correspondencia) de orden mayor. Basándose en estos principios generales, el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo BLASTP [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250], que está disponible en la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI), y usando los parámetros por defecto sugeridos en el mismo (es decir, Matriz = Blosum62; Hueco abierto = 11; Extensión de huecos = 1; Penalizaciones por hueco x_dropoff = 50; Esperado = 10; tamaño de palabra = 3; Filtro activado). El algoritmo BLAST determina el % de identidad de secuencia en un intervalo de superposición entre las dos secuencias alineadas. Para los propósitos de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula en un intervalo de superposición de al menos 50 aminoácidos, más preferiblemente al menos 75 aminoácidos, más preferiblemente al menos 100 aminoácidos, calculándose el intervalo por BLASTP con los parámetros por defecto.
Los resultados de esta comparación con BLASTP se presentan en la Tabla 2.
TABLA 2 Comparación con BLASTP de secuencias de proteínas de timidina quinasas de diferente origen vegetal
2
En una realización preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención se obtiene de tomate, y tiene al menos 80%, incluso más preferidamente al menos 90%, todavía más preferido al menos 95%, lo más preferido al menos 98% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 4 ó 5.
Polipéptidos variantes
En una realización más preferida la enzima timidina quinasa vegetal de la invención comprende la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 4 o como SEQ ID NO: 5.
En el contexto de esta invención, la expresión "análogo funcional" significa un polipéptido (o proteína) que tiene actividad de timidina quinasa y que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia presentada como SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, en una o más posiciones de aminoácidos. Dichos polipéptidos análogos incluyen polipéptidos que comprenden sustituciones conservativas, variantes de corte y empalme, isoformas, homólogos de otras especies, y polimorfismos.
Como se define en el presente documento, la expresión "sustituciones conservativas" indica la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen
(i) la sustitución de un resto no polar o hidrófobo tal como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, metionina, fenilalanina o triptófano por otro, en particular la sustitución de alanina, leucina, isoleucina, valina o prolina por otro; o
(ii) la sustitución de un resto polar neutro (no cargado) tal como serina, treonina, tirosina, asparagina, glutamina o cisteína por otro, en particular la sustitución de arginina por lisina, glutamina por ácido aspártico o glutamina por asparagina; o
(iii) la sustitución de un resto cargado positivo tal como lisina, arginina o histidina por otro; o
(iv) la sustitución de un resto cargado negativo tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.
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La expresión sustitución conservativa también incluye el uso de un resto aminoácido sustituido en lugar de un resto aminoácido original, con la condición de que los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
Las modificaciones de esta secuencia primaria de aminoácidos pueden dar como resultado proteínas que tienen actividad sustancialmente equivalente comparadas con el polipéptido homólogo no modificado, y por lo tanto se pueden considerar análogos funcionales de las proteínas originales. Dichas modificaciones pueden ser deliberadas, p. ej., por mutagénesis dirigida, o pueden ocurrir espontáneamente, e incluyen variantes de corte y empalme, isoformas, homólogos de otras especies y polimorfismos. Dichos análogos funcionales también están contemplados de acuerdo con la invención.
Deleciones C-terminales
En otra realización la invención proporciona enzimas timidina quinasa vegetales que tienen deleciones C-terminales cuando se comparan con la enzima original (salvaje). Dichas enzimas truncadas se pueden obtener por técnicas convencionales, p. ej., mutagénesis dirigida, o como se describe en los ejemplos de trabajo.
De acuerdo con la invención, se ha encontrado que las deleciones C-terminales crean enzimas con propiedades mejoradas, en particular mayor estabilidad y/o mejor especificidad de sustrato, cuando se compara con la enzima de tipo salvaje.
En una realización más preferida, la invención proporciona enzimas timidina quinasa que tienen una deleción C-terminal del orden de 1-60 restos de aminoácidos, preferiblemente 1-50 restos de aminoácidos, más preferido 1-40 restos de aminoácidos, incluso más preferido 1-30 restos de aminoácidos, todavía más preferido 1-26 restos de aminoácidos, lo más preferido 1-24 restos de aminoácidos.
En una realización incluso más preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención es una enzima timidina quinasa obtenida del tomate que tiene una deleción C-terminal de 26 restos de aminoácidos. En una realización más preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención es una enzima timidina quinasa que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5.
Polinucleótidos que codifican timidina quinasas vegetales
En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican enzimas timidina quinasa vegetales obtenidas de tomate, preferiblemente las enzimas timidina quinasa vegetales descritas antes.
Protocolo de hibridación
En una realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención es capaz de hibridar con la secuencia de polinucleótido presentada como el SEQ ID NO: 3, o su cadena complementaria.
La hibridación puede llevarse a cabo al menos en condiciones de restricción baja, pero preferiblemente en condiciones de restricción media o alta.
Las condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridación en condiciones de restricción baja, media o alta, respectivamente, entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga, implica sumergir previamente el filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN que se van a hibridar en 5 x SSC [cloruro sódico/citrato sódico; véase, Sambrook y col.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} Ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989] durante 10 minutos, y prehibridar el filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt [véase, Sambrook y col.; citado antes], SDS al 0,5% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado tratado con ultrasonidos 100 \mug/ml [véase, Sambrook y col.; citado antes], seguido de hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda con cebado aleatorio [Feinberg A P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13], marcada con ^{32}P-dCTP (actividad específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aproximadamente 45ºC.
Después el filtro se lava dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, SDS al 0,5% a una temperatura de al menos 55ºC (condiciones de restricción baja), más preferido de al menos 60ºC (condiciones de restricción media), todavía más preferido de al menos 65ºC (condiciones de restricción media/alta), incluso más preferido de al menos 70ºC (condiciones de restricción alta), y todavía lo más preferido de al menos 75ºC (condiciones de restricción muy altas).
Los ácidos nucleicos complementarios o ácidos nucleicos señal pueden marcarse por procedimientos convencionales conocidos en la materia, para detectar la presencia de oligonucleótidos hibridados. El procedimiento de detección más común es el uso de autorradiografía con, p. ej., sondas marcadas con ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P, que después pueden detectarse usando una película de rayos X. Otros marcadores incluyen ligandos, que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimiluminiscentes, enzimas o anticuerpos, que después pueden servir como miembros de parejas de unión específicas para un ligando marcado.
Identidad de las secuencias de ADN
En otra realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene al menos 73%, preferiblemente al menos 75%, más preferido al menos 80%, incluso más preferido al menos 90%, todavía más preferido al menos 95%, lo más preferido al menos 98% de identidad con la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 3 cuando se determina a lo largo de la longitud entera del SEQ ID NO:. Para los propósitos de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula cuando BLASTN proporciona un intervalo de solapamiento de al menos 100 nucleótidos, determinándose el intervalo con los parámetros por defecto. Más preferiblemente, el intervalo de superposición es al menos 150 nucleótidos, más preferiblemente al menos 225 nucleótidos, más preferiblemente al menos 300 nucleótidos.
En el contexto de esta invención, "identidad" es una medida del grado de homología de secuencias de nucleotidos. Con el fin de caracterizar la identidad, las secuencias objeto se alinean de modo que se obtenga la homología de orden mayor (correspondencia). Basándose en estos principios generales, el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos o dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo BLASTN [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250], que está disponible en la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI), y usando los parámetros por defecto sugeridos en el mismo (es decir, Recompensa por una correspondencia = 1; Penalización por una correspondencia = -2; Opción de cadena = ambas cadenas; Hueco abierto = 5; Hueco de extensión = 2; Penalizaciones por hueco x_dropoff = 50; Esperado = 10; Tamaño de palabra = 11; Filtro activado). El algoritmo BLAST determina el % de identidad de secuencia en un intervalo de superposición entre las dos secuencias de nucleótidos alineadas. Para los propósitos de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula en un intervalo de superposición de al menos 100 nucleótidos, calculándose el intervalo por BLASTN con los parámetros por defecto. Más preferiblemente, el intervalo de superposición es al menos 300 nucleótidos.
Los resultados de esta comparación con BLASTN se presentan en la Tabla 3.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 3 Comparación con BLASTN de secuencias de nucleótidos de timidina quinasas de diferente origen vegetal
3
Secuencias de ADN análogas
En su realización más preferida, el polinucleótido aislado de la invención comprende la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 3 o un análogo funcional de la misma.
En el contexto de esta invención, el término "análogo funcional" cubre polinucleótidos con modificaciones conservativas y polinucleótidos que codifican polipéptidos funcionalmente equivalentes.
En el contexto de esta invención, la expresión "polinucleótidos con modificaciones conservativas" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas.
Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que una alanina es especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones de modificación conservativa. Todas las secuencias de ácido nucleico en el presente documento, que codifican un polipéptido, también describen todas las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
Vectores de expresión
En un tercer aspecto, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden el polinucleótido aislado de la invención y un promotor operativamente unido al polinucleótido.
El vector de expresión de la invención preferiblemente es uno adecuado para llevar a cabo la expresión en un organismo eucariota.
En una realización más preferida, el vector de expresión de la invención es un vector de virus, en particular un vector de virus Herpes simplex, un vector de adenovirus, un vector de virus asociado a adenovirus, un vector de lentivirus, un vector de retrovirus o un vector de virus vaccinia.
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Líneas celulares de empaquetamiento
En un cuarto aspecto, la invención proporciona líneas celulares de empaquetamiento capaces de producir un virión infeccioso, cuya línea celular comprende un vector de la invención.
Las células de empaquetamiento se refieren a células que contienen los elementos necesarios para la producción de virus recombinantes infecciosos, de los que carece un vector de virus recombinante. En la técnica anterior se conocen procedimientos para preparar líneas celulares de empaquetamiento.
Células huésped
En un quinto aspecto, la invención proporciona una célula huésped aislada que comprende el polinucleótido aislado de la invención, o el vector de expresión de la invención.
En una realización preferida, la célula huésped de la invención es una célula bacteriana, preferiblemente una célula eucariota, en particular una célula de mamífero, una célula humana, un oocito, o una célula de levadura.
En una realización más preferida, la célula huésped de la invención es una célula humana, una célula de perro, una célula de mono, una célula de rata, una célula de cerdo o una célula de ratón.
Composiciones farmacéuticas
Para usar en terapia, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención se puede administrar de cualquier forma conveniente. En una realización preferida, la enzima timidina quinasa vegetal de la invención se incorpora en una composición farmacéutica junto con uno o más adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes, y la composición farmacéutica la prepara el experto usando procedimientos convencionales conocidos en la materia.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender la enzima timidina quinasa vegetal de la invención, o anticuerpos contra una timidina quinasa vegetal. La composición puede administrarse sola o combinada con uno o más de otros agentes, fármacos u hormonas.
La composición farmacéutica de esta invención, se puede administrar por cualquier vía adecuada, pero no limitada a la aplicación oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual o rectal, vía bucal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intracisternal, intracapsular, intrapulmnar, transmucosa o por inhalación.
Se pueden encontrar más detalles sobre técnicas para la formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).
El principio activo se puede administrar en una o varias dosis diarias. Las dosificaciones adecuadas actualmente contempladas son entre 0,5 ng y aproximadamente 50 \mug/kg de timidina quinasa/kg de peso corporal por administración, y de aproximadamente 1,0 ng/kg a aproximadamente 100 \mug/kg diarios.
La dosis administrada debe, por supuesto, ajustarse con cuidado a la edad, peso y afección del individuo que se va a tratar, así como a la vía de administración, forma y régimen de dosificación, y el resultado deseado y la dosificación exacta debe determinarlos, por supuesto, el médico.
En otras realizaciones, la timidina quinasa vegetal de la invención se puede administrar por suministro genético, usando líneas celulares y vectores como se describe a continuación en los procedimientos de tratamiento.
Por lo tanto, en otra realización preferida, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el polinucleótido de la invención, o un vector de la invención, o una célula de empaquetamiento de la invención, o una célula huésped de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Para generar dichas líneas celulares terapéuticas, el polinucleótido de la invención se puede insertar en un vector de expresión, p. ej. un plásmido, virus u otro vehículo de expresión, y unir operativamente a secuencias de control de la expresión por ligado en una forma en la que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión.
Las secuencias de control de la expresión adecuadas incluyen promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, codones de inicio, señales de corte y empalme para intrones, y codones de parada, todos mantenidos en el marco de lectura correcto del polinucleótido de la invención, para permitir así la traducción correcta del ARNm. Las secuencias de control de la expresión también pueden incluir componentes adicionales tales como secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.
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Procedimientos de tratamiento
La presente invención, que se refiere a polinucleótidos y proteínas, polipéptidos, fragmentos de péptidos o derivados producidos a partir de los mismos, así como a anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas, péptidos o derivados, se pueden usar para tratar o aliviar trastornos o enfermedades de un cuerpo animal vivo, incluyendo un ser humano, cuyo trastorno o enfermedad sea sensible a la actividad de un agente citotóxico.
El trastorno, enfermedad o afección puede ser en particular un cáncer o una infección vírica.
Las células de cáncer son células que proliferan rápidamente con la capacidad de invadir y metastatizar tejidos adyacentes y por lo tanto comprometen la función de partes del cuerpo esenciales conduciendo a la enfermedad grave y la muerte. Los tratamientos habituales son cirugía, radiación y quimioterapia, y recientemente ha surgido un nuevo tratamiento, la terapia génica. En la terapia con profármacos enzimáticos dirigidos por genes (GDEPT), se suministra un gen a las células de cáncer y se expresa en estas. La correspondiente enzima después convierte el profármaco administrado en una forma activa, parando la proliferación celular. Uno de los sistemas de GDEPT se basa en desoxirribonucleósido quinasas y diferentes profármacos, análogos de nucleósidos.
El polinucleótido de la presente invención puede usarse en particular como un "gen suicida", es decir, un gen susceptible a fármacos. La transferencia de un gen suicida a una célula diana convierte a la célula en sensible a compuestos o composiciones que son relativamente no tóxicos para células normales.
Por lo tanto, en un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para sensibilizar células diana a profármacos, cuyo procedimiento comprende las etapas de
(i) transfectar o transducir la célula diana con una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima timidina quinasa vegetal que promueve la conversión de dicho profármaco en un fármaco (citotóxico), o suministrar de otra forma la timidina quinasa vegetal a la célula; y
(ii) suministrar dicho profármaco a dicha célula diana;
en el que dicha célula diana es más sensible a dicho fármaco (citotóxico) que a dicho profármaco.
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La célula diana puede ser cualquier célula de interés, en particular una célula humana, una célula de perro, una célula de mono, una célula de rata, una célula de gato, una célula de cerdo o una célula de ratón. Preferiblemente, la célula diana es una célula humana.
En su aspecto más amplio, se puede usar cualquier enzima timidina quinasa vegetal. Sin embargo, en una realización preferida, la secuencia de polinucleótido que codifica una enzima timidina quinasa vegetal es una secuencia de polinucleótido de la invención.
En una realización más preferida, el profármaco es un análogo de nucleósido.
En el contexto de esta invención, un análogo de nucleósido preferido para usar de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en aciclovir (9-[2-hidroxi-etoxi]-metil-guanosina), buciclovir (9-(3,4-dihidroxibutil)guanina), famciclovir (diacetato de 2-[2-(2-amino-9H-purin-9-il)etil]-1,3-propanodiol), ganciclovir (9-[2-hidroxi-1-(hidroximetil)etoxil-metil]-guanosina), penciclovir, valciclovir, trifluorotimidina, AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina), AIU (5'-yodo-5'-amino-2',5'-didesoxiuridina), ara-A (arabinósido de adenosina; Vivarabina), ara-C (arabinósido de citidina), ara-G (9-beta-D-arabinofuranosilguanina), ara-T, 1-beta-D-arabinofuranosiltimina, 5-etil-2'-desoxiuridina, 5-yodo-5'-amino-2,5'-didesoxiuridina, 1-[2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil]-5-yodouracilo, idoxuridina (5-yodo-2'-desoxiuridina), fludarabina (9-beta-D-arabinofuranósido de 2-fluoroadenina), gencitabina, 3'-desoxiadenosina (3-dA), 2',3'-didesoxiinosina (ddI), 2',3'-didesoxicitidina (ddC), 2',3'-didesoxitimidina (ddT), 2',3'-didesoxiadenosina (ddA), 2',3'-didesoxiguanosina (ddG), 2-cloro-2'-desoxiadenosina (2CdA), 5-fluorodesoxiuridina, BVaraU ((E)-5-(2-bromovinil)-1-beta-D-arabinofuranosiluracilo), BVDU (5-bromovinil-desoxiuridina), FIAU (1-(2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo), 3TC (2'-desoxi-3'-tiacitidina), dFdC gemcitabina (2',2'-difluorodesoxicitidina), dFdG (2',2'-difluorodesoxiguanosina), 5-fluorodesoxiuridina (FdUrd), d4T (2',3'dideshidro-3'-desoxitimidina), ara-M (arabinonucleósido de 6-metoxipurina), IudR (5-yodo-2'-desoxiuridina), CaFdA (2'-cloro-2'-ara-fluoro-desoxiadenosina), ara-U (1-beta-D-arabinofuranosiluracilo), FBVAU (E)-5-(2'-bromovinil)-1-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)uracilo, FMAU 1-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluracilo, FLT 3'-fluoro-2'-desoxitimidina, 5-Br-dUrd 5-bromodesoxiuridina, 5-C1-dUrd 5-clorodesoxiuridina o dFdU 2',2'-difluorodesoxiuridina.
En una realización más preferida, el análogo de nucleósido para usar de acuerdo con la invención es la AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
La enzima timidina quinasa de la invención se puede usar directamente, por ejemplo, mediante composiciones farmacéuticas inyectadas, implantadas o ingeridas para tratar un proceso patológico sensible a la enzima timidina quinasa.
El polinucleótido de la invención, incluyendo las secuencias complementarias del mismo, se puede usar para la expresión de la enzima timidina quinasa de la invención. Esto se puede lograr mediante líneas de células que expresan dichas proteínas, péptidos o derivados de la invención, o por vectores víricos que codifican dichas proteínas, péptidos o derivados de la invención, o por células huésped que expresan dichas proteínas, péptidos o derivados. Estas células, vectores y composiciones se pueden administrar para el tratamiento de zonas diana para afectar a un proceso patológico sensible a agentes citotóxicos.
Los vectores de expresión adecuados pueden ser un vector vírico derivado de Herpes simplex, adenovirus, lentivirus, retrovirus o virus vaccinia, o de diferentes plásmidos producidos con bacterias, y se pueden usar para el suministro in vivo de secuencias de nucleótidos a un organismo entero o un órgano, tejido o población celular diana. Otros procedimientos incluyen, pero no se limitan, la transfección de liposomas, electroporación, transfección con péptidos vehículo que contienen señales nucleares u otras señales localizadoras, y suministro de genes por sistemas de liberación lenta. Las células específicas se pueden dirigir usando marcadores de superficie celular, tales como marcadores específicos para células de cáncer. Tanto la proteína como una construcción de vector pueden dirigirse a células usando marcadores de superficie celular. Las células que se dividen pueden dirigirse mediante transducción con un vector retrovírico, que sólo infecta células que se dividen.
En otro aspecto más de la invención, las secuencias de nucleótidos "antisentido" complementarias a los nucleótidos de la invención o parte de los mismos, se pueden usar para inhibir o potenciar la expresión de la enzima timidina quinasa.
En otra realización preferida, la invención proporciona procedimientos para inhibir agentes patógenos en animales de sangre caliente, cuyos procedimientos comprenden la etapa de administrar a dicho animal un polinucleótido de la invención o un vector de expresión de la invención.
En una realización más preferida, la secuencia de polinucleótido o el vector de expresión se administran in vivo.
En otra realización preferida, el agente patógeno es un virus, una bacteria o un parásito, o incluso una célula tumoral.
En otra realización preferida, el agente patógeno es una célula inmunitaria autorreactiva.
En una realización incluso más preferida, el procedimiento comprende además la etapa de administrar un análogo de nucleósido a dicho animal de sangre caliente.
Preferiblemente, el análogo de nucleósido se selecciona de los descritos antes.
En una realización más preferida, el análogo de nucleósido para usar de acuerdo con la invención es AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
Sistemas suicidas
Un uso muy importante de los genes que codifican la timidina quinasa de la presente invención, es para los sistemas suicidas en la terapia basada en células y genes. En todos los tipos de terapias celulares y génicas en mamíferos, es necesario tener sistemas que permitan la muerte irreversible de células transplantadas o células que han sido transducidas por la terapia génica.
Básicamente hay dos tipos de terapias basadas en células, las cuales pueden beneficiarse ambas de tener un sistema suicida incorporado basado en las timidinas quinasas de acuerdo con la presente invención. En la terapia de sustitución celular, se transplantan células desnudas a un sujeto para sustituir células que han perdido la capacidad de cumplir su función en el cuerpo o para sustituir células muertas. Una vez que estas células se han transplantado y están completamente integradas en el cuerpo del sujeto, no pueden eliminarse fácilmente por medios quirúrgicos. Teniendo un sistema de suicidio incorporado en el que una timidina quinasa de la presente invención es expresada de forma constitutiva o inducible, las células pueden matarse administrando al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo de nucleósido, tal como AZT. El análogo de nucleósido se puede administrar si las células transplantadas empiezan a proliferar de una forma incontrolada. También se puede querer terminar el tratamiento simplemente porque ya no son necesarias las células de sustitución o porque hay otro tratamiento por otra ruta.
El otro tipo de terapia basada en células incluye células terapéuticas que son transplantadas en el cuerpo para segregar, p. ej., un factor de crecimiento en un determinado sitio. A menudo dichas células terapéuticas están encapsuladas y pueden eliminarse otra vez de forma relativamente fácil del cuerpo, pero se prefiere la incorporación de un sistema suicida porque las células pueden matarse selectivamente sin el uso de cirugía.
En la terapia génica in vivo, se aplican las mismas consideraciones que con la terapia de sustitución celular. La incorporación de un gen suicida se puede lograr por construcción de un vector vírico que comprende tanto el gen terapéutico como una timidina quinasa de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, el gen terapéutico y la timidina quinasa se insertan bajo el control del mismo promotor, opcionalmente separándolos por una construcción de IRES.
En el caso en el que las células transplantadas se hayan inmortalizado condicionalmente antes de transplante, hay un riesgo teórico de que el oncogén inicie la transcripción después de transplante y que por consiguiente las células transplantadas se conviertan en tumorigénicas. Mediante la presente invención se puede conseguir el control de esta situación. Siempre que las células son inmortalizadas por transducción con un oncogén bajo el control de un promotor inducible (p. ej., el sistema Tet on-off, el promotor Mxl o similar), se inserta una timidina quinasa en la construcción del vector bajo el control del mismo promotor (o usando una construcción de IRES). Esto asegura que siempre que el oncogén sea transcrito, la timidina quinasa también es transcrita y transducida, y las células tumorigénicas pueden matarse selectivamente por administración de un análogo de nucleósido, tal como AZT.
Procedimiento de fosforilación de nucleósidos
La enzima timidina quinasa de la invención puede tener diferentes utilidades que incluyen aplicaciones tanto terapéuticas como biotecnológicas.
En un octavo aspecto, la invención se refiere al uso de la enzima timidina quinasa vegetal de la invención para fosforilar nucleósidos o un análogo de nucleósido, con la condición de que no sea un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
En una realización preferida, la invención proporciona un procedimiento para fosforilar un nucleósido o un análogo de nucleósido, que comprende las etapas de
i) someter el nucleósido o análogo de nucleósido a la acción de la enzima timidina quinasa vegetal de la invención; y
ii) recuperar el nucleósido o análogo de nucleósido fosforilado, con la condición de que no sea un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
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En particular, la timidina quinasa de la presente invención se puede usar para fosforilar didesoxiguanosina.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se ilustra mejor por referencia a los dibujos que acompañan, en los que:
la fig. 1 muestra la actividad de la dTMP quinasa (CPM) a lo largo del tiempo (0 a 120 minutos) de AT-TK1a (\blacksquare), AT-TK1b (\medbullet) y HSV1-TK (\ding{116}), respectivamente; y
la fig. 2 muestra la actividad de la monofosfato de AZT quinasa (CPM) (0 a 120 minutos) de AT-TK1a (\boxempty), AT-TK1b (\medcirc) y HSV1-TK (\nabla), respectivamente.
Ejemplos
La invención se ilustra mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten de ninguna forma el alcance de la invención como se reivindica.
Ejemplo 1 Construcción de un vector de retrovirus que expresa quinasas vegetales
Se clonó el ADNc de quinasas vegetales en un vector de retrovirus basado en el virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) para generar un retrovirus recombinante de replicación deficiente que contiene las quinasas TK1.
Se amplificaron los fragmentos de ADN con la polimerasa Pfu (Stratagene) usando cebadores con sitios diseñados de enzimas de restricción flanqueando.
Se cortaron construcciones de Arabidopsis basados en AT-TK1a con BamHI/XhoI, y se cortaron fragmentos de la PCR del tomate con BglII/XhoI, y se clonaron en el sitio BglII-XhoI del vector plasmídico pLCXSN, que es un vector de transferencia retrovírico obtenido de pLXSN (Clontech, nº cat. K1060-B) por inserción del promotor de CMV secuencia arriba del policonector.
Se obtuvieron 4 construcciones: AtTK1 (PZG53), AtTK1\DeltaC24 (PZG56), TomTK1 (PZG69) y TomTK1\DeltaC26 (PZG59). Se usaron pLCXSN solo y el vector que contiene HSV1-TK (clonado en el sitio BamHI/XhoI) como un control.
Los plásmidos se purificaron usando el kit de plásmidos Qiagen (QIAGEN) y se verificaron las secuencias de ADN de los plásmidos construidos por determinación de la secuencia de ADN.
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Se usaron las siguientes secuencias de cebadores:
5' ccg ctc gag atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg 3' (AT TK1-for; SEQ ID NO: 14);
5' cgc gga tcc tta gat tgt agc agc aac aca gga ttc 3' (AT TK1-rev; SEQ ID NO: 15);
5' cgc gga tcc tta aac aat atg att agt gat gta atg ctt g 3' (AT TK1 DC; SEQ ID NO: 16);
5' gga aga tct tta gac aga ttg tcc att aac ata gtg ctg 3' (T TK1 DC; SEQ ID NO: 17);
5' gga aga tct tta tgg atc aac tag tgg tga ttc taa g 3' (T TK1-rev; SEQ ID NO: 18); y
5' ccg ctc gag atg gct ttt tca tca tct gct aga aac 3' (T TK1-for; SEQ ID NO: 19).
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Para la comparación también se construyó un plásmido de expresión para la timidina quinasa de tipo 1 del virus Herpes simplex humano (HSV1-TK). La timidina quinasa de HSV1 humano se amplificó usando los cebadores:
5' tat agg atc cgc cac cat ggc ttc gta ccc cgg c 3' (HSV1-TK - for; SEQ ID NO: 20); y
5' tat act cga gga ggt cga ctc agt tag cc 3' (HSV1-TK - rev; SEQ ID NO: 21);
y usando el plásmido pCMV-pacTK descrito por Karreman [Karreman C; Gene 1998 218 57-62] como molde.
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Se cultivaron células de empaquetamiento 293T (ATTC CRL-11268) a 37ºC en medio OPTIMEM 1 (Life Technologies, Inc.). El vector plasmídico pLCXSN se transfectó en las células de empaquetamiento usando LipofectAMINE PLUS (Life Technology Inc.) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el suministrador. El medio de las células transfectadas se recogió 48 horas después de transfección, se filtró a través de un filtro de 0,45 mm, se hizo sedimentar por centrifugación (50.000 xg, 90 minutos a 4ºC) y se disolvió en tampón TEN (NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM).
El tampón que contenía virus se usó posteriormente para transducir líneas celulares de cáncer con MDI de 5.
Cultivo de células y transducción de retrovirus
Las células de Glioblastoma U-87 MG (ATCC HTB-14), y glioblastoma U-118 MG (ATCC HTB-15) se adquirieron en American Type Culture Collection. Todas las células se cultivaron en medio esencial mínimo, E-MEM M (Bio Whittaker nº de catálogo 12-611) con suero de ternero fetal de origen australiano al 10% (v/v) (Bio Whittaker nº de catálogo 14-701) y 1 ml/l de gentamicina (Bio Whittaker nº de catálogo 17-518 L). Las células se hicieron crecer a 37ºC en un incubador humidificado con una fase gaseosa de CO_{2} al 5%.
Las líneas celulares se transdujeron con el medio que contenía el retrovirus mezclado con polibreno 5 \mug/ml, se incubaron durante 48 horas y después se cultivaron de forma continua durante 3 semanas en presencia de geneticina 200 \mug/ml (Life Technologies Inc.).
Ensayos de proliferación celular
Las células se sembraron con 1500-2500 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-L-lisina. Se añadió AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina; disponible en sigma) después de 24 horas, y el medio que contenía los análogos de nucleósidos no se cambió.
Se ensayó la supervivencia celular con el ensayo de XTT (Roche) después de 5 días de exposición al fármaco.
Cada experimento se realizó por cuadruplicado. El valor de CI_{50} de los compuestos investigados se calculó como el valor medio de estos experimentos usando SigmaPlot® (Dyrberg Trading, Karlslunde, DK) y se calculó de acuerdo con la siguiente expresión:
d_{I} = Max / (1+([I]/CI_{50}))
en la que
d_{I} = crecimiento celular con la concentración inhibidora determinada por el ensayo XTT;
Max = crecimiento celular máximo determinado por el ensayo de XTT;
[I] = la concentración inhibidora; y
CI_{50} = (concentración inhibidora de 50% del crecimiento) una dosis que inhibe el crecimiento celular en un 50%).
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Expresión de quinasas vegetales de mayor sensibilidad a AZT
Se determinó la sensibilidad al AZT de células no transducidas y de células transducidas con el vector retrovírico solo o el vector que contenía quinasas vegetales.
La citotoxicidad (CI_{50}) se determinó después de 5 días de exposición al fármaco. Los resultados de esta determinación se presentan en la Tabla 4.
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TABLA 4 Sensibilidad (CI_{50}) de líneas de células de glioblastoma a la AZT (mM)
Se muestran las concentraciones que producen 50% de letalidad para cada construcción y línea celular parental. El factor de aumento de sensibilidad se compara con la línea celular parental.
4 
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La diferencia de sensibilidad entre las líneas celulares parentales y las células transducidas con el vector pLCXSN solo era menor de 1 vez. Ambas líneas celulares de glioblastoma, que expresaban quinasas vegetales, mostraron un aumento de la sensibilidad a la AZT. El mayor aumento se detectó para la línea celular U-87 MG que expresaba TK1 de tomate con una disminución de casi 240 veces de la CI_{50} comparado con las células no transducidas.
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Ejemplo 2 Clonación de timidina quinasas
Este ejemplo describe cómo se identificaron los genes que codifican las timidina quinasas de la invención de tomate, pino, arroz y arabidopsis, y cómo se construyeron los vectores que expresan diferentes timidina quinasas.
Basándose en su homología con la TK1 humana, se identificaron dos secuencias del tomato, ACCN BE463259 y ACCN BG129197 (disponibles en Clemson University Genomics Institute, EE.UU.), una secuencia de pino, ACCN AW755132 (disponible en Dr. Ross Whetten, North Carolina State University, EE.UU.), y una EST, ACCN D24903 (disponible en MAFF DNA Bank, 1-2, 2-chome, Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8602, Japón) con homología con la TK1 de arroz postulada (ACCN AF066050) usando la herramienta de búsqueda de homología local (tBLASTn) disponible en la página web NCBI, y usando los ajustes estándar (es decir, Filtro activado, Esperado = 10, Tamaño de palabra = 3, Matriz = Blosum62, Coste de los huecos = Existencia 11 Extensión 1).
\newpage
Partiendo de los cebadores derivados de plásmido, se secuenciaron los insertos. Posteriormente se diseñaron los cebadores basándose en los datos de secuencias recién obtenidos.
La secuencia del inserto en D24903 combinada con la información de secuencia derivada de ACCN AU068889 predecía un ORF para una proteína de 64 aminoácidos más larga que la descrita en AF066050.
Timidina quinasa de tomate
Se amplificó el ORF de la timidina quinasa de tomate por PCR usando los siguientes cebadores:
5' CGC GGA TCC ATG GCT TTT TCA TCA TCT GCT AGA AAC CCA GTT GAC CTG AG 3' (1MS TOTK1-B; SEQ ID NO: 22); y
5' CCG GAA TTC TTA TGG ATC AAC TAG TGG TGA TTC TAA G 3' (2MS TOTK1-E; SEQ ID NO: 23); y
usando el plásmido que contiene ACCN BG129197 como molde.
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El fragmento de la PCR posteriormente se cortó con EcoRI/BamHI y se ligó en el vector pGEX-2T (Amersham-Pharmacia), que también se cortó con EcoRI/BamHI. El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-TOM-TK1.
Timidina quinasa de Arabidopsis thaliana (AT-TK1a)
Se amplificó el ORF de una TK1a de Arabidopsis thaliana (Nº de acceso AAF13097) de una genoteca de ADNc (Stragene) usando los siguientes cebadores:
5' CGC GGA TCC ATG GCG ACT CTC AAA GCT TCC TTT TTG ATC AAA ACC C 3' (1msAtTK1-B; SEQ ID NO: 24); y
5' CCG GAA TTC TTA GAT TGT AGC AGC AAC ACA GGA TTC AGC 3' (2msAtTK1-E; SEQ ID NO: 25).
El fragmento de la PCR posteriormente se cortó con EcoRI/BamHI y se ligó al vector pGEX-2T (Amersham-Pharmacia) que también se había cortado con EcoRI/BamHI. El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-AT-TK1a.
Timidina quinasa de Arabidopsis thaliana (AT-TK1b)
Se amplificó el ORF de TK1b de Arabidopsis thaliana (Nº de acceso BAB09824) de una genoteca de ADNc (Stragene) usando la siguiente estrategia, que también creó varios mutantes de AT-TK1b con deleción N-terminal.
Se amplificó la longitud completa del ORF (ACCN BAB09824) de una genoteca de ADNc (Stratagene) usando los cebadores:
5' ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3' (1mtAtTK1L; SEQ ID NO: 26); y
5' CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC ACT ATG 3' (2mtAtTK1L; SEQ ID NO: 27).
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Este producto de la PCR de longitud completa se usó para amplificar un fragmento con extremos salientes de BamHI/EcoRI, usando los cebadores
5' CGC GGA TCC ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3' (1mtAtTK1L-B; SEQ ID NO: 28); y
5' CCG GAA TTC CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC AC 3' (2mtAtTKl-E; SEQ ID NO: 29).
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El fragmento de la PCR posteriormente se cortó con EcoRI/BamHI y se ligó en el vector pGEX-2T que también se cortó con EcoRI/BamHI. El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-AT-TK1b (P661).
De forma análoga se hicieron deleciones N-terminales y se ligaron en pGEX-2T. Se logró una deleción N-terminal de 22 aminoácidos usando los cebadores
5' CGC GGA TCC TCC ACC GCT CTT CGC TTC TCC 3' (1mtAtTK1I-B; SEQ ID NO: 30); y
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29).
El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-AT-\DeltaN22TK1b (P662).
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Se logró una deleción N-terminal de 45 aminoácidos usando los cebadores
5' CGC GGA TCC TCC ACC AGA AAG CTA CAA ACG 3' (1mtAtTK1-B; SEQ ID NO: 31); y
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29).
El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-AT-\DeltaN45TK1b (P663).
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Se logró una deleción N-terminal de 63 aminoácidos usando los cebadores
5' CGC GGA TCC CAG CCG CTC TCC TCC TCA TC 3' (1mtATTK1S-B; SEQ ID NO: 32); y
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29).
El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-AT-\DeltaN63TK1b (P664).
Timidina quinasa de arroz
La timidina quinasa de arroz se amplificó usando los cebadores
5' CGG GAT CCG GCG GCG GCG GCG GAC AAG TCT CG 3' (1osTK1s-B; SEQ ID NO: 33); y
5' CGG AAT TCT TAC TTG AAA GCA TGG ATA ACC TTG G 3' (2osTK1-E; SEQ ID NO: 34);
y usando D24903 como molde.
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El fragmento de la PCR posteriormente se cortó con EcoRI/BamHI y se ligó en el vector pGEX-2T (disponible en Amersham-Pharmacia) que también se cortó con EcoRI/BamHI. El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-Rice-TK1.
Timidina quinasa de HSV1 (usada para control)
La timidina quinasa de HSV1 se amplificó usando los cebadores
5' CGC GGA TCC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT C 3' (HSV1-for A; SEQ ID NO: 35); y
5' CCG GAA TTC TTA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG 3' (HSV1-rev; SEQ ID NO: 36);
y usando el plásmido pCMV-pacTK descrito por Karreman [Karreman C; Gene 1998 218 57-62] como molde.
El fragmento de la PCR posteriormente se cortó con EcoRI/BamHI y se ligó en el vector pGEX-2T (Amersham-Pharmacia) que también se cortó con EcoRI/BamHI. El plásmido resultante se llamó pGEX-2T-HSV1-TK.
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Ejemplo 3 Expresión y purificación de las timidina quinasas recombinantes
Este ejemplo describe cómo se transformó KY895 con los plásmidos obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2, con el fin de expresar timidina quinasas.
Las células KY895 se transformaron con los plásmidos de expresión del Ejemplo 2, usando técnicas estándar, p. ej., como describen Sambrook y col. [Sambrook y col.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989].
Las células KY895 transformadas se hicieron crecer a una DO600nm de 0,5-06 en medio LB/Ampicilina (100 \mug/ml) a 37ºC y se indujo la expresión de proteína por adición de IPTG hasta 100 \muM. Las células después se hicieron crecer durante 4 h a 25ºC y posteriormente se recogieron por centrifugación. El sedimento celular se sometió a tratamiento con ultrasonidos en el tampón de unión A (NaPO_{4} 20 mM pH 7,3; NaCl 150 mM; Glicerol al 10%; y Triton X-100 al 0,1%) en presencia de un cóctel inhibidor de proteasa (Complete^{TM} - sin EDTA de Roche
Dignostics).
Se ensayó la capacidad de los extractos para fosforilar los cuatro desoxirribonucleósidos naturales con una concentración fija de 100 \muM de los desoxirribonucleósidos. La mayor actividad específica en cada extracto se fijó en 100%. Entre paréntesis se da la actividad específica correspondiente a 100% en mU/mg.
Los resultados de estas evaluaciones se presentan en la Tabla 5.
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TABLA 5 Actividad de la desoxirribonucleósido quinasa en extractos de células KY895
5 
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Los datos en esta tabla muestran que todas las enzimas son timidina quinasas.
Los extractos se sometieron a centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos, se filtraron y se cargaron en la columna. Después se combinaron dos columnas de 1 ml de glutatión-sepharosa (disponible en Pharmacia) y se equilibraron en tampón de unión A. Después de cargar la muestra, la columna se lavó con 40 ml de tampón de unión A. Posteriormente, la columna se lavó con 5 ml de ATP/MgCl_{2} 10 mM en (A) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, y después 30 minutos a 4ºC. El ATP/MgCl_{2} se eliminó lavando con 10 ml de tampón de unión A.
La proteína GST-tag se escinde de la TK en la columna de unión de GST por escisión con trombina de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pharmacia).
Las constantes cinéticas de la TK purificada se determinaron como describen Munch-Petersen y col. [Munch-Petersen B., Knecht W., Lenz C., Søndergaard L., Piškur J.: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 6673-6679].
Los datos cinéticos se evaluaron por análisis de regresión no lineal usando la ecuación de Michaelis-Menten V = V_{máx} x [S]/(K_{m} + [S]) o ecuación de Hill v = V_{máx} x [S]^{h}/(K_{0,5}^{h} + [S]^{h}) como describen Knecht y col. [Knecht W., Bergjohann U., Gonski S., Kirschbaum B. & Löffler M.: Functional expression of a fragment of human dihydroorotate dehydrogenase by means of the baculovirus expression vector system and kinetic investigation of the purified recombinant enzyme; Eur. J. Biochem. 1996 240 292-301]. K_{m} es la constante de Michaeli, K_{0,5} define el valor de la concentración de sustrato [S] al que v = 0,5 V_{máx} y h es el coeficiente de Hill [Cornish-Bowden A: Fundamentals of enzyme kinetics; Portland Press Ltd., London, 1995, pp. 33; y Liebecg C: IUBMB Biochemical nomenclature and related documents; Portland Press Ltd., London, 1992].
TABLA 6 Relación entre velocidad y concentración de sustrato para Thd para quinasas vegetales recombinantes (r)
7 
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TABLA 7 Relación entre velocidad y concentración de sustrato para la AZT para quinasas vegetales recombinantes
8 
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Las Tablas 6 y 7 demuestran que las TK vegetales fosforilan la AZT de forma más eficaz (k_{cat}/K_{m}) que Thd, lo cual contrasta mucho con rHSV1-TK que fosforila Thd bastante más eficazmente que AZT. Las relaciones [k_{cat}/K_{m} (Thd)]/[k_{cat}/K_{m} (AZT)] para las TK de tomate, Arabidopsis y HSV1 son las siguientes:
tROM-TK1
1,07
rAT-\DeltaN45TK1b
0,06
rAT-TK1a
0,08
rHSV1-TK
72,7
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Ejemplo 4 Crecimiento de KY895 de E. coli transformadas en placas con análogo de nucleósido
Este ejemplo describe cómo las células huésped transformadas con los plásmidos obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2 pueden crecer en placas en presencia del análogo de nucleósido AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
El experimento se llevó a cabo como han descrito Knecht y col. [Knecht, W., Munch-Petersen, B. & Piškur, J.: Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster; J. Mol. Biol. 2000 301 827-837].
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TABLA 8 Crecimiento de células KY895 en presencia de AZT
9 
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pGEX-2T es el vector y está disponible en Amersham-Pharmacia;
pGEX-2T-Dm-dNK es el vector que contiene el gen que codifica una desoxirribonucleósido quinasa multisustrato obtenida de Drosophila melanogaster descrito por Munch-Petersen y col. [Munch-Petersen B., Knecht W., Lenz C., Søndergaard L., Pi\check{s}kur J.: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 6673-6679];
pGEX-2T-Bm-dNK es el vector que contiene el gen que codifica una desoxirribonucleósido quinasa obtenida de Bombyx mori descrita por Knecht y col. [Knecht W., Ebert Petersen G., Munch-Petersen B., Pi\check{s}kur J.: Deoxyribonucleoside kinases belonging to the thymidine kinase 2 (TK2) -like group vary significantly in substrate specificity, kinetics and feed-back regulation; J. Mol. Biol. 2002 315 529-540];
pGEX-2T-huTK1 es el vector que contiene el gen que codifica una timidina quinasa humana (TK1) descrito por Berenstein y col. [Berenstein D., Christensen J.F., Kristensen T., Hofbauer R., Munch-Petersen B.: Valine, not methionine, is amino acid 106 in human cytosolic thymidine kinase (TK1). Impact on oligomerization, stability, and kinetic properties; J. Biol. Chem. 2000 275 (41) 32187-32192].
La Tabla 8 muestra que la timidina quinasa derivada del tomate es la quinasa más potente, cuando se determinó en combinación con el análogo de nucleósido AZT. Esta enzima es aproximadamente 30 veces más activa que la derivada de Herpes simplex.
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Ejemplo 5 Ensayo de la actividad de TK en placas de selección de TK
Este ejemplo describe la determinación de la actividad de timidina quinasa usando células KY895 transformadas con los plásmidos descritos en el Ejemplo 2.
El ensayo de la actividad de timidina quinasa se llevó a cabo como han descrito Knecht y col. [Knecht, W., Munch-Petersen, B. & Pi\check{s}kur, J.: Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster; J. Mol. Biol. 2000 301 827-837].
pGEX-2T es el vector disponible en Amersham-Pharmacia usado como control.
La desoxirribonucleósido quinasa multisustrato de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (pGEX-2T-Dm-dNK), obtenida de acuerdo con Munch-Petersen y col. [Munch-Petersen B., Knecht W., Lenz C., Søndergaard L., Pi\check{s}kur J.: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 6673-6679] se usó como control positivo.
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TABLA 9 Crecimiento en placas de selección de TK
10
Este ejemplo demuestra que todas las enzimas pueden fosforilar la timidina.
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Ejemplo 6 Fosforilación de monofosfatos de nucleósidos a difosfatos de nucleósidos
Se ensayó la actividad de monofosfato de quinasa determinando los productos de las reacciones catalizadas por timidina quinasa, esencialmente como describen Munch-Petersen et al.; J. Biol. Chem. 1998 273 7 3926-3931.
Brevemente, la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 30 nmol/min de timidina a monofosfato de timidina (30 mU) se incubó en 100 \mul de una mezcla de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 (22ºC); MgCl_{2} 2,5 mM; ATP 2,5 mM; ditiotreitol 10 mM; CHAPS 0,5 mM; 3 mg/ml de albúmina de suero bovino; y sustrato marcado con ^{3}H 100 iM (1,8 Ci/mmol).
Se mezclaron muestras de tiempo de 5 \mul de mezcla de reacción con 5 \mul de timidina, TMP, TDP y TTP 5 mM. Se sembraron 5 \mul de esta mezcla en placas de polietilenimina-celulosa, que se desarrollaron de forma ascendente en LiC12 0,5 M. Las manchas con los nucleósidos y nucleótidos se identificaron con luz UV y se cortaron.
La radiactividad en las manchas se extrajo con KCl 0,2 M en HCl 0,1 M, y se determinó por recuento de centelleo de líquidos. 1 pmol de nucleósido/nucleótido radiactivo tiene un recuento de 850 cpm.
Se expresaron y purificaron las timidina quinasas recombinantes como se describe en el Ejemplo 3.
Los resultados de este experimento se presentan en las figuras 1 y 2. Las cpm obtenidas en los tiempos indicados (15, 30, 60, 90 y 120 minutos, respectivamente) se determinaron en las manchas de TDP obtenidas de 2,5 \mul de mezcla de reacción.
Como se esperaba, HSV1-TK fosforila ambos sustratos, pero el sustrato monofosfato de AZT es fosforilado con un grado 10 veces menor que el sustrato timidina. Sin embargo, sorprendentemente, las enzimas TK1 vegetales son capaces de fosforilar el monofosfato de AZT aunque no son capaces de fosforilar TMP. Esta nueva propiedad no se había publicado hasta ahora para ninguna timidina quinasa.
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<110> Knecht, Wolfgang
\hskip1cm
Munch-Petersen, Birgitte 
\hskip1cm
Piskur, Jure 
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<120> Timidina quinasas vegetales y su uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 504-204-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2002 00794
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-05-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2003 00178
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-02-07
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 660
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<212> ADN
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<213> Pinus taeda 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(660)
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<223>
\newpage
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<400> 1
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11 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 219
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<212> PRT
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<213> Pinus taeda 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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12 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 705
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<212> ADN
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<213> Lycopersicon esculentum 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(705)
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<223>
\newpage
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<400> 3
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13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 234
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<212> PRT
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<213> Lycopersicon esculentum 
\newpage
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<400> 4
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14 
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<210> 5
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<211> 208
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<212> PRT
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<213> Lycopersicon esculentum 
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<400> 5
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15 
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<210> 6
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<211> 831
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<212> ADN
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<213> Oryza sativa 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(831)
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<223>
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<400> 6
16 
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<210> 7
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<211> 276
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<212> PRT
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<213> Oryza sativa 
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<400> 7
17 
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<210> 8
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<211> 717
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(717)
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<223>
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<400> 8
18
19 
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<210> 9
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<211> 238
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 9
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20 
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<210> 10
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<211> 645
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(645)
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<223>
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<400> 10
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21 
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<210> 11
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<211> 214
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 11
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22 
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<210> 12
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<211> 834
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(834)
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<223>
\newpage
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<400> 12
23
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
25
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgctcgaga tggcgactct caaagcttcc tttttg 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcct tagattgtag cagcaacaca ggattc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcct taaacaatat gattagtgat gtaatgcttg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaagatctt tagacagatt gtccattaac atagtgctg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaagatctt tatggatcaa ctagtggtga ttctaag 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgctcgaga tggctttttc atcatctgct agaaac 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tataggatcc gccaccatgg cttcgtaccc cggc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatactcgag gaggtcgact cagttagcc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcca tggctttttc atcatctgct agaaacccag ttgacctgag 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggaattct tatggatcaa ctagtggtga ttctaag 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcca tggcgactct caaagcttcc tttttgatca aaaccc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggaattct tagattgtag cagcaacaca ggattcagc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgagaacat taatctcacc atctc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaaagtgaa cttgctacaa cactatg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcca tgagaacatt aatctcacca tctc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggaattcc taaagtgaac ttgctacaac ac 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcct ccaccgctct tcgcttctcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcct ccaccagaaa gctacaaacg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatccc agccgctctc ctcctcatc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatccgg cggcggcggc ggacaagtct cg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggaattctt acttgaaagc atggataacc ttgg 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatcca tggcttcgta ccccggccat c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggaattct tagttagcct cccccatctc ccg 
\hfill
33

Claims (32)

1. Un polinucleótido aislado, que codifica una timidina quinasa vegetal, cuyo polinucleótido tiene
al menos 73%, preferiblemente al menos 75%, más preferido al menos 80%, incluso más preferido al menos 90%, todavía más preferido al menos 95%, lo más preferido al menos 98% de identidad con la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 3, cuando se determina a lo largo de su longitud completa.
2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 3.
3. Una timidina quinasa vegetal, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos de al menos 80%, incluso más preferido al menos 90%, todavía más preferido al menos 95%, lo más preferido al menos 98% de identidad con una cualquiera de estas secuencias, cuando se determina a lo largo de su longitud completa.
4. La timidina quinasa vegetal de la reivindicación 3, que comprende una o más de los siguientes tres patrones/regiones:
Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe (Patrón I) Val Ala Gly Leu Asp Gly (Patrón II) Tyr Met Pro Val Cys Arg (Patrón III)
Val Al Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (región Lid), en la que A1 se selecciona de Thr y Val, A2 se selecciona de Thr y Lys, A3 se selecciona de Ala y Ser, y A4 se selecciona de Leu y Val.
5. La timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, que comprende todos los restos conservados identificados en la Tabla 1.
6. La timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
7. La timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, que tiene una deleción C-terminal del orden de 1-60 restos de aminoácidos, preferiblemente 1-50 restos de aminoácidos, más preferido 1-40 restos de aminoácidos, incluso más preferido 1-30 restos de aminoácidos, más preferido todavía 1-26 restos de aminoácidos, lo más preferido 1-24 restos de aminoácidos.
8. La timidina quinasa vegetal de la reivindicación 8, que es una enzima timidina quinasa obtenida de tomate y que tiene una deleción C-terminal de 26 restos de aminoácidos, teniendo dicha enzima timidina quinasa vegetal con deleción C-terminal la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
9. La timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que se obtiene de tomate, y cuya enzima muestra al menos 80%, más preferido al menos 90% más preferido todavía al menos 95%, lo más preferido al menos 98% de identidad con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 4.
10. La timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-9, que disminuye al menos tres (3) veces la dosis letal (LD_{100}) de al menos un análogo de nucleósido cuando se compara con la acción de una timidina quinasa obtenida de la timidina quinasa del virus Herpes simplex de tipo 1 (HSV1-TK).
11. Una construcción de vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y un promotor operativamente unido al polinucleótido.
12. La construcción de vector de la reivindicación 11, que es un vector vírico, en particular un vector del virus Herpes simplex, un vector de adenovirus, un vector de virus asociado a adenovirus, un vector de lentivirus, un vector de retrovirus o un vector de virus vaccinia.
13. Una línea celular de empaquetamiento capaz de producir un virión infeccioso que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 11-12.
14. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 11-12.
\newpage
15. La célula huésped de la reivindicación 14, que es una célula humana, una célula de perro, una célula de mono, una célula de rata o una célula de ratón.
16. Una composición farmacéutica que comprende la enzima timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
18. Una composición farmacéutica que comprende la línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 13, o la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 18-19, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
19. Un procedimiento de sensibilización de una célula a un profármaco, cuyo procedimiento comprende las etapas de
(i) transfectar o transducir dicha célula con una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima timidina quinasa vegetal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, que promueve la conversión de dicho profármaco en un fármaco (citotóxico); y
(ii) suministrar dicho profármaco a dicha célula; en el que dicha célula es más sensible a dicho fármaco (citotóxico) que a dicho profármaco, con la condición de que el procedimiento no sea un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica una enzima timidina quinasa vegetal es una secuencia de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 19-20, en el que el profármaco es un análogo de nucleósido.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el análogo de nucleósido es la AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
23. Un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, para usar en un procedimiento de inhibición de un agente patógeno en un animal de sangre caliente, cuyo procedimiento comprende administrar a dicho animal dicho polinucleótido o vector.
24. El polinucleótido o vector de la reivindicación 23, en el que dicha secuencia de polinucleótido o dicho vector se administra in vivo.
25. El polinucleótido o vector de cualquiera de las reivindicaciones 23-24, en el que dicho agente patógeno es un virus, una bacteria o un parásito.
26. El polinucleótido o vector de cualquiera de las reivindicaciones 23-24, en el que dicho agente patógeno es una célula tumoral.
27. El polinucleótido o vector de cualquiera de las reivindicaciones 23-24, en el que dicho agente patógeno es una célula inmunitaria autorreactiva.
28. El polinucleótido o vector de una cualquiera de las reivindicaciones 23-27, para usar en un procedimiento de inhibición de un agente patógeno en un animal de sangre caliente, que además comprende la etapa de administrar un análogo de nucleósido a dicho animal de sangre caliente.
29. El polinucleótido o vector de la reivindicación 28, para usar en un procedimiento de inhibición de un agente patógeno en un animal de sangre caliente, en el que dicho análogo de nucleósido es AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
30. Uso de la enzima timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, para la fosforilación de un nucleósido o un análogo de nucleósido, con la condición de que el uso no sea un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
31. Un procedimiento de fosforilación de un nucleósido o un análogo de nucleósido que comprende las etapas de
i) someter el nucleósido o análogo de nucleósido a la acción de la enzima timidina quinasa vegetal de una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, y
ii) recuperar el nucleósido o análogo de nucleósido fosforilado,
con la condición de que el procedimiento no sea un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
32. Artículos que contienen un análogo de nucleósido y la timidina quinasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, o un gen que codifica dicha timidina quinasa obtenida de planta, o vector que comprende dicho gen que codifica dicha timidina quinasa obtenida de planta, como una combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva en la terapia del cáncer.
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