ES2320602T3

ES2320602T3 - Alfa-amilasas mutantes.

Info

Publication number: ES2320602T3
Application number: ES98911122T
Authority: ES
Inventors: Yuji Hatada; Kaori Ikawa; Susumu Ito
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1997-03-31
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 2009-05-25
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: EP0985731A1; EP0985731A4; WO1998044126A1; JP4126098B2; US6486113B1; CN1251613A; DE69840500D1; CN1197969C; DK0985731T3; EP0985731B1

Abstract

Un gen que codifica una alfa-amilasa mutante alcalina licuefactiva que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, donde un resto de metionina de la posición 202 está substituido por un resto de un aminoácido no oxidable; y (b) la secuencia de aminoácidos de (a) donde además el resto de arginina de la posición 181 y el resto de glicina de la posición 182 están eliminados.

Description

\alpha-amilasas mutantes.

Campo técnico

La presente invención se refiere a \alpha-amilasas mutantes licuefactivas que tienen el pH óptimo en un intervalo alcalino y una excelente resistencia a agentes oxidantes y que son útiles especialmente como enzimas para detergentes que comprenden agentes oxidantes, y sus genes.

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Antecedentes de la técnica

Se han incorporado diversas enzimas a los detergentes con el propósito de mejorar su efecto detergente, y se ha considerado incorporar una \alpha-amilasa, por ejemplo, contra las manchas de almidón. Sin embargo, la \alpha-amilasa incorporada a un detergente debe ser una \alpha-amilasa alcalina, ya que el detergente comprende un tensioactivo, y el pH de una disolución detergente está en un intervalo alcalino.

A este propósito, se han comercializado recientemente detergentes en los que se incorpora un componente blanqueador oxidante esperando no solo un efecto detergente contra la suciedad, sino también una acción blanqueadora. Se ha considerado incorporar \alpha-amilasa también en estos detergentes que contienen un agente blanqueador oxidante. Sin embargo, la \alpha-amilasa normal se desactiva fácilmente en presencia de un agente oxidante y por lo tanto no se ha podido incorporar a los detergentes que contienen un agente blanqueador oxidante.

Se han realizado investigaciones para conferir a esta \alpha-amilasa resistencia frente a agentes oxidantes. Más específicamente, el documento WO 94/02597 proporciona proteínas mutantes resistentes al agente oxidante por substitución de un aminoácido no oxidante, específicamente leucina (Leu), treonina (Thr) o glicina (Gly) por un resto de metionina de una \alpha-amilasa derivada de B. licheniformis. Los documentos WO 94/18314 y WO96/30481 describen que cuando los restos Met correspondientes a la posición 197 y a la posición 15 de entre los restos de metionina de la misma enzima descrita anteriormente, se reemplazan específicamente por, Ala, Ile o Thr y Leu, Thr, Asp, Ser, Val o Ile respectivamente, la resistencia a los agentes oxidantes y la estabilidad al calor de la enzima mejoran. Sin embargo, todas estas \alpha-amilasas mutantes son enzimas que tienen un pH óptimo en un intervalo entre neutro y ácido, y por consiguiente existe una demanda para el desarrollo de una \alpha-amilasa alcalina que tenga un pH óptimo más alto con el propósito de utilizarla en los detergentes.

Por otro lado, en cuanto a una técnica para conferir resistencia a la \alpha-amilasa alcalina frente los agentes oxidantes, el documento WO 96/23873 describe solamente \alpha-amilasas mutantes resistentes a agentes oxidantes obtenidas al modificar la secuencia SEQ ID NO:1 (NCIB 12512) que codifica una \alpha-amilasa. Según el documento WO 96/23873, teniendo en cuenta los resultados de la \alpha-amilasa derivada de B. licheniformis (documento WO 94/18314) y similares, se describe que cuando la Met correspondiente a la posición 202 en la Fig. 2 de NCIB 12512 se substituye por Leu, Phe, Ala, Thr, Val o Ser, la \alpha-amilasa mutante resultante se vuelve resistente a los agentes oxidantes para un tratamiento con H_{2}O_{2} 200 mM. Además, el documento WO 96/23873 describe \alpha-amilasas mutantes que muestran, además de una resistencia a la oxidación aumentada, una estabilidad térmica mejorada como resultado de la delección de una Arg de la posición 181 y una Gly de la posición 182 según Suzuki et al. (J. Biol. Chem., 264, 18933-18938, 1989). Sin embargo, la semivida (t_{1/2}) de la actividad enzimática de las \alpha-amilasas mutantes obtenidas de esta manera está comprendida en unos intervalos de entre solamente 10 y 20 minutos para las primeras y de entre 10 a 30 minutos para las últimas, y por lo tanto no son satisfactorias como enzimas para incorporar a detergentes con ambas características, resistencia a agentes oxidantes y estabilidad frente a los mismos.

El documento WO 97/0324 describe una \alpha-amilasa licuefactiva alcalina nueva que presenta una resistencia frente a los tensioactivos que le hace especialmente útil como componente de los detergentes. Sin embargo, este documento no menciona hasta qué punto esta \alpha-amilasa podría ser resistente en condiciones oxidantes.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar una \alpha-amilasa que tenga un pH óptimo en un intervalo alcalino y resistencia fuerte y duradera a los agentes oxidantes, y su gen, y una composición detergente que comprenda esta \alpha-amilasa.

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Descripción de la invención

A la vista de las circunstancias anteriores, los presentes inventores han prestado atención a una enzima producida por Bacillus sp. KSM-AP 1378 (documento WO 94/26881), que es un tipo de \alpha-amilasa licuefactiva alcalina, y han llevado a cabo diversas investigaciones. Como resultado, se ha encontrado que cuando el resto de metionina en la posición 202 de la secuencia de aminoácidos, denominada a partir de ahora SEQ ID NO:1, se substituye por un resto aminoácido no oxidable, la \alpha-amilasa mutante resultante llega a tener una resistencia fuerte y duradera a los agentes oxidantes y una actividad amilasa excelente en un intervalo de pH alcalino, lo que conduce a la conclusión de la presente invención.

Según la presente invención se proporciona una \alpha-amilasa mutante que tiene una secuencia de aminoácidos que se obtiene substituyendo por un resto de aminoácido no oxidable el resto de metionina de la posición 202 en la secuencia denominada a partir de ahora SEQ ID NO:1, la cual constituye una \alpha-amilasa alcalina licuefactiva.

Según la presente invención, se proporciona también un gen que codifica la \alpha-amilasa mutante.

Según la presente invención, se proporciona además una composición detergente que comprende la \alpha-amilasa mutante.

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Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 4 ilustran la homología entre la secuencia de aminoácidos de una enzima \alpha-amilasa madura (KSM-AP 1378, KAM) producida por Bacillus sp. KSM-AP 1378 y la secuencia de aminoácidos de enzimas \alpha-amilasas maduras producidas por otras bacterias del genero Bacillus. NCIB 12512 y NCIB 12513 son \alpha-amilasas descritas en el documento WO 95/26397, NCIB 12289 es una \alpha-amilasa descrita en el documento DK 94/0353 (DK 94-1271), #707 es una \alpha-amilasa producida por Bacillus sp. #707, y BAA, BSA y BLA son \alpha-amilasas producidas respectivamente por B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus y B licheniformis. Un asterisco * debajo de los caracteres indica que existe homología en todas las \alpha-amilasas.

La Figura 5 ilustra con un gráfico la resistencia al calor y la resistencia a los agentes quelantes (EDTA, EGTA y zeolita) de las \alpha-amilasas mutantes por delección de aminoácido (\DeltaRG). \medbullet: tipo silvestre, \medcirc: \DeltaRG, y \Delta: \DeltaRG/Met202Thr. El gráfico A ilustra la resistencia al calor (tratadas a diversas temperaturas durante 30 minutos, en condiciones de pH 8,5, en Tris-HCl 50 mM) y los gráficos B a D ilustran la resistencia a agentes quelantes (tratadas a 30ºC durante 30 minutos en presencia de cada uno de los diferentes agentes quelantes a diversas concentraciones, en condiciones de pH 8,5, en Tris-HCl 50 mM).

La Figura 6 ilustra esquemáticamente la introducción de una mutación en un gen de la \alpha-amilasa y la elevada producción extracelular de un gen de la \alpha-amilasa mutante por Bacillus subtilis.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente la introducción de una mutación en un gen de la \alpha-amilasa y la elevada producción extracelular de un gen de la \alpha-amilasa mutante por Bacillus subtilis (continuación de la Figura 6). La parte "Análisis de la secuencia" entre paréntesis se solapa con la Figura 6.

Las Figuras 8 y 9 ilustran con gráficos la resistencia a la oxidación con H_{2}O_{2} de diferentes \alpha-amilasas mutantes por substitución con un aminoácido de la metionina en posición 202, que se expresan en Bacillus subtilis y purificadas completamente. El gráfico A ilustra la actividad residual después de un tratamiento con H_{2}O_{2} al 2% durante los periodos de tiempo recomendados en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,5; en presencia de CaCl_{2} 0,1 mM) según las condiciones de la presente invención (método KAO) y el gráfico B muestra la actividad residual después de un tratamiento con H_{2}O_{2} 200 mM durante los periodos de tiempo recomendados en un tampón Britton-Robinson (pH: 9,0; en presencia de CaCl_{2} 0,1 mM) según las condiciones descritas en el documento WO 96/23873 (método W); con el propósito de comparar, el resultado de la \alpha-amilasa derivada de NCIB (12512, SEQ ID NO:1 en el documento WO 96/23873) se añade en el gráfico B (indicado por una línea de puntos en el dibujo). \medcirc: tratado previamente en ausencia de H_{2}O_{2} (control), y \medbullet: tratado previamente con H_{2}O_{2} a la concentración recomendada.

Las Figuras 10 y 11 ilustran con gráficos la resistencia a la oxidación con H_{2}O_{2} de diversas \alpha-amilasas mutantes por substitución con un aminoácido de la metionina en la posición 202, que se expresan en Bacillus subtilis y purificadas completamente. El gráfico A ilustra la actividad residual después de un tratamiento con H_{2}O_{2} 500 mM durante los periodos de tiempo recomendados en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,9; en presencia de CaCl_{2} 0,1 mM) según las condiciones de la presente invención (método KAO) y el gráfico B ilustra la actividad residual después del tratamiento con H_{2}O_{2} 200 mM durante los periodos de tiempo recomendados en un tampón Britton-Robinson (pH: 9,0; en presencia de CaCl_{2} 0,1 mM) según las condiciones descritas en el documento WO 96/23873 (método W); con el propósito de comparar, el resultado de la \alpha-amilasa derivada de NCIB (12512, SEQ ID NO:1 en el documento WO 96/23873) se añade en el gráfico B (indicado por una línea de puntos en el dibujo). \medcirc: tratado previamente en ausencia de H_{2}O_{2} (control), y \medbullet: tratado previamente con H_{2}O_{2} a la concentración recomendada.

La Figura 12 ilustra con gráficos la resistencia a la oxidación con H_{2}O_{2} de diversas \alpha-amilasas mutantes, \DeltaRG/
Met202Thr, expresadas en Bacillus subtilis y purificadas completamente. El gráfico A ilustra las actividades residuales después de un tratamiento con H_{2}O_{2} 500 mM durante los periodos de tiempo recomendados en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,9; en presencia de CaCl_{2} 0,1 mM) según las condiciones de la presente invención (método KAO). \medcirc: tratado previamente en ausencia de H_{2}O_{2} (control), y \medbullet: tratado previamente con H_{2}O_{2} a la concentración recomendada.

La Figura 13 representa una curva de pH-actividad de una \alpha-amilasa mutante por substitución con un aminoácido de la metionina en la posición 202, que se expresa en Bacillus subtilis y purificada completamente. El gráfico A representa el tipo silvestre y el gráfico B Met202Leu.

La Figura 14 representa una curva de temperatura-actividad de una \alpha-amilasa mutante por substitución con un aminoácido de la metionina en la posición 202, que se expresa en Bacillus subtilis y purificada completamente. La actividad se determinó después de llevar a cabo la reacción durante 5 minutos a diferentes temperaturas en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,5). El gráfico A representa el tipo silvestre y el gráfico B el mutante Met202Leu.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Las \alpha-amilasas mutantes según la presente invención se obtienen por mutación de una \alpha-amilasa alcalina licuefactiva silvestre [depositada como Bacillus sp. KSM-AP 1378 [FERM BP-3048; fecha de depósito original: 24 de Julio de 1989) en el "National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology" (dirección: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-0046, Japón) de acuerdo con el Tratado de Budapest] descrita previamente por los inventores de la presente invención y descrita en el documento WO 94/26881.

Las \alpha-amilasas mutantes según la presente invención pueden ser aquellas que tienen una secuencia de aminoácidos obtenida substituyendo por un resto de aminoácido no oxidable el resto de metionina de la posición 202 de la \alpha-amilasa licuefactiva que tiene la secuencia de aminoácidos denominada a partir de ahora SEQ ID NO:1. No se impone ninguna limitación especial en la substitución del resto de aminoácido utilizado en tanto que sea un resto de aminoácido no oxidante, y siendo los preferidos por ejemplo, Thr, Ile, Leu, Ala, Val o Ser.

Las \alpha-amilasas mutantes según la presente invención que se obtienen substituyendo por un resto de aminoácido no oxidable un solo resto de metionina de la posición 202 en la secuencia SEQ ID NO:1 tienen cada una semivida (t_{1/2}) de actividad de varias horas (t_{1/2} de la \alpha-amilasa de tipo silvestre: aproximadamente de 10 a 20 minutos) incluso en presencia de H_{2}O_{2} a una concentración tan alta como 500 mM y una resistencia considerablemente excelente a los agentes oxidantes y estabilidad en presencia de éstos, comparadas con las \alpha-amilasas mutantes descritas en el documento WO 96/23873.

Como se ha descrito anteriormente, los mutantes según la presente invención que se obtienen por substitución de la Met de la posición 202 por un aminoácido no oxidante presentan una gran resistencia al H_{2}O_{2} que es un agente oxidante fuerte, incluso a altas concentraciones del mismo. El hecho sorprendente es que la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa principal utilizada en la presente invención tiene una homología del 95,1% con la secuencia de NCIB 12512 (SEQ ID NO:1) descrita en el documento WO 96/23873. La secuencia de aminoácidos difiere sólo en 24 aminoácidos de los 485 aminoácidos totales. En las regiones I, II, III y IV bien conservadas en la familia de las \alpha-amilasas, no hay diferencias. La secuencia de la \alpha-amilasa principal según la presente invención presenta homologías del 86,6%, 94,7%, 86,4%, 66,7%, 68,6% y 68,9%, respectivamente, con las de NCIB 12513 (documento WO 95/26397), (NCIB 12289 (documento DK 94-1271), Bacillus sp. #707, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus y B. licheniformis.

En el caso de la \alpha-amilasa de secuencia SEQ ID NO:1, incluso si otros restos de metionina distintos del resto de metionina de la posición 202, por ejemplo los restos de metionina de las posiciones 9, 10, 105, 116, 208, 261, 309, 382, 430 y 440, se eliminan o se substituyen por otros restos de aminoácidos, no se consigue una mayor resistencia a los agentes oxidantes. Por lo tanto, estos restos de metionina no necesitan ser modificados específicamente. Cuando el resto de metionina de la posición 202 se substituye por otro aminoácido, se prefiere la substitución con Thr, Ile, Leu, Ala, Val o Ser.

Se prefiere especialmente una \alpha-amilasa con una secuencia de aminoácidos obtenida por efectuar otra delección de un resto de arginina de la posición 181 y un resto de glicina de la posición 182 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1, porque presenta también resistencia al calor (resistencia a los agentes quelantes) además de la resistencia a los agentes oxidantes.

Puesto que la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa tipo silvestre utilizada originariamente en esta invención tiene una naturaleza útil desde el punto de vista de la ingeniería de proteínas si se compara con las \alpha-amilasas industriales tales como B. licheniformes, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus, y se le confiere rápidamente una resistencia a la oxidación y al calor (resistencia a los agentes quelantes) creando únicamente un Met202X (X: un aminoácido no oxidable) y una enzima mutante por delección RG, se pueden obtener \alpha-amilasas mutantes que tienen una naturaleza muy útil industrialmente por aplicación de estas mutaciones por separado o bien en combinación.

Las \alpha-amilasas mutantes según la presente invención se producen, por ejemplo, introduciendo una mutación específica en un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 para producir un gen que codifique una \alpha-amilasa mutante y un vector plásmidico que contenga este gen, produciendo después un transformante por transformación de un huésped utilizando este plásmido, o por recombinación de cromosomas homólogos y cultivo del transformante.

En primer lugar, el ADN que codifica la \alpha-amilasa alcalina licuefactiva que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 puede obtenerse, por ejemplo, según el proceso descrito en la Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública No. 336392/1996.

En cuanto al método para efectuar la mutación específica, se puede adoptar cualquier método en tanto que sea un método realizado comúnmente. Sin embargo, la mutación puede efectuarse, por ejemplo, utilizando "Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit" producido por la compañía Clonetech Co. o "Site-Directed Mutageneis System Mutant-Super Express Km Kit" producido por la compañía TaKaRa, o similares.

La selección de un clon que produzca una \alpha-amilasa mutante resistente a agentes oxidantes se lleva a cabo mediante el cultivo del transformante en un medio que contiene almidón soluble.

A continuación se describen los métodos generales adoptados en la práctica del proceso según la presente invención.

Método de extracción del ADN cromosómico

El aislamiento de un cromosoma a partir de la cepa descrita anteriormente se puede realizar según un método conocido per se en la técnica anterior, por ejemplo, según el método Saito & Miura (Biochem. Biophys. Act., 72, 619-629, 1963).

Método para introducir el plásmido de ADN en Escherichia coli

La introducción de un plásmido de ADN en Escherichia coli se realizó utilizando una célula competente (TaKaRa Co.). A propósito, se añadió almidón azufre al 0,6% a un medio LB sólido con el fin de seleccionar un transformante con actividad amilasa.

Método de preparación del extracto libre de células y del cultivo sobrenadante

Escherichia coli conteniendo el plásmido de ADN deseado fue sometida a un cultivo agitado durante 15 a 24 horas en un medio LB líquido (50 ml) que contiene tetraciclina (15 \mug/ml). El medio de cultivo se centrifugó y los gránulos de células resultantes fueron suspendidos en 5 ml de Tris-HCl 50 mM (ph: 8,0). La suspensión de células fue sometida a ruptura celular mediante un aparato de sonicación. La suspensión de células fraccionadas fue centrifugada y el sobrenadante resultante se extrajo como extracto libre de células. Por otro lado, después del cultivo, el medio de cultivo fue centrifugado y el sobrenadante resultante se utilizó en el ensayo enzimático.

Método de preparación del plásmido de ADN

La preparación de un plásmido de ADN a partir de Escherichia coli recombinante puede realizarse utilizando el método de Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, EE.UU, 1982) según un método conocido per se en la técnica anterior.

Determinación de la secuencia de bases

La determinación de una secuencia de bases puede realizarse utilizando el método de modificación química de Maxam-Gilbert (Methods Enzymol., 65, 499-559, 1980) o el método de terminación de cadena por dideoxinucleótidos (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Saci. EE.UU., 74, 5463-5467, 1977; Smith et al., Nature, Londres, 321, 674-679, 1986).

Método para introducir la mutación específica

La introducción de la mutación específica puede realizarse utilizando un "Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit" (2ª versión) o "Site-Directed Mutageneis System Mutant-Super Express Km Kit" producido por TaKaRa Co. según el protocolo de Clontech Co.

Determinación de la actividad amilasa

La actividad amilasa de cada enzima se determinó por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (método DNS).

Después se llevó a cabo una reacción a 40ºC durante 15 minutos en una mezcla de reacción que contenía almidón soluble en un tampón Tris-Hcl 50 mM (pH: 8,5), se determinó el azúcar reductor formado mediante el método DNS. Con respecto a la actividad enzimática, se definió como unidad la cantidad de la enzima que forma un azúcar reductor equivalente a 1 \mumol de glucosa por minuto.

Determinación del contenido de proteína

El contenido de proteína se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas "Kit Protein Assay" producido por los Laboratorios Bio-Rad utilizando albumina de suero bovino como estándar.

Ensayo de resistencia a la oxidación con H_{2}O_{2}

(1) Primero se determinó la actividad amilasa de la muestra con antelación, y después se diluyó la muestra con un tampón adecuado, por ejemplo, Tris-HCl 50 mM (pH: 8,5 o 8,9) hasta una concentración de enzima amilasa de aproximadamente la mitad de la concentración de enzima amilasa que puede ser determinada directamente sin dilución.

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(2) Se añadieron 5 \mul de catalasa (Behringer Mannheim GmbH, 20 mg/ml) a cada tubo de ensayo (muestra x 5 tubos).

(3) Una solución acuosa de 30% de peróxido de hidrógeno (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) se diluyó con un tampón hasta una concentración final de 200 mM o 500 mM.

(4) Se proporcionaron tubos de ensayo con cierre de rosca (dos tubos con muestra), se añadió a uno de los tubos una mezcla de solución (1 ml) de la solución de enzima preparada en la etapa (1) y un tampón (1 ml), y en el otro tubo se añadió una solución de enzima diluida (3 ml) preparada en la etapa (1). Los tubos se incubaron a 30ºC o 40ºC.

(5) La solución acuosa de peróxido de hidrógeno (3 ml) preparada en la etapa (3) se añadió rápidamente al tubo de ensayo que contiene la solución de enzima diluida (3 ml) y se incubó a 4ºC, y se mezcló el contenido cuidadosamente. Se tomaron 700 \mul de muestra de la mezcla de reacción después de dejarla reposar durante los periodos de tiempo recomendados y se añadieron al tubo de ensayo que contiene la catalasa, proporcionado en la etapa (2) para poner fin a la oxidación. Después de añadirlos, el tubo se conservó en un baño de hielo hasta que se determinó la actividad. Al mismo tiempo, las muestras sin peróxido de hidrógeno incubadas a 30ºC o 40ºC en la etapa (4) se transfirieron también al baño de hielo.

(6) La actividad amilasa residual de las muestras correspondientes se determinó por el método DNS para conocer su resistencia al agente oxidante (peróxido de hidrógeno). Con el propósito de confirmar el hecho de que la actividad amilasa no se deterioraba solamente por la incubación a 30ºC o 40ºC, se determinaron al mismo tiempo la actividad amilasa de las muestras libres de peróxido de hidrógeno colocadas en el baño de hielo de la etapa (5) y las de las soluciones de enzimas diluidas preparadas en la etapa (1).

Las \alpha-amilasas mutantes obtenidas según la presente invención tienen una resistencia extremadamente alta y duradera a los agentes oxidantes y son por lo tanto útiles como componentes de los detergentes que contienen agentes oxidantes y agentes blanqueadores, de las composiciones para la licuefacción y sacarificación del almidón, y similares.

La composición detergente según la presente invención puede comprender una o más enzimas seleccionadas entre las enzimas desramificantes (pululanasa, isoamilasa, neopululanasa, etc.), \alpha-glicosidasas, glucoamilasas, proteasas, celulasas, lipasas, pectinasas, protopectinasas, liasas del ácido péctico, peroxidasas, laccasas, y catalasas además de las \alpha-amilasas mutantes descritas anteriormente.

Además pueden incorporarse los tensioactivos que se añaden normalmente a los detergentes clásicos tales como tensioactivos aniónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos no-iónicos y tensioactivos catiónicos; secuestrantes de iones metálicos divalentes (agentes quelantes), agentes alcalinizantes, sales inorgánicas, agentes anti-suciedad, eliminadores del cloro, agentes reductores, agentes blanqueadores, disolventes de tintes fluorescentes, bases de perfumes, anti-aglomerantes, activadores enzimáticos, antioxidantes, conservantes, colorantes, colorantes azules, activadores del blanqueado, estabilizantes enzimáticos, reguladores de fase, etc.

La forma de la composición detergente se adecuará a las necesidades de la aplicación final prevista y la composición detergente se puede proporcionar en forma de, por ejemplo, líquido, polvo o gránulos. La composición detergente según la presente invención se puede utilizar como detergente para lavar la ropa, detergente blanqueador, detergente para lavavajillas automáticos, limpiadores para desagües, limpiadores para dentaduras postizas o similares. En particular, se puede utilizar preferiblemente como detergente para lavar la ropa, detergente blanqueador o detergente para lavavajillas automáticos.

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Ejemplos

La presente invención se describe mas adelante con mas detalle mediante los Ejemplos siguientes. Sin embargo, la presente invención no se limita en ningún caso a estos Ejemplos.

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Ejemplo 1

(1) Introducción de la mutación en el gen de la \alpha-amilasa alcalina licuefactiva

Para efectuar la mutación en el codón que codifica la Met de la posición 202, se utilizó el kit "Site-Directed Mutagenesis System Mutant-Super Express Km" producido por TaKaRa Co. y un cebador para introducir la mutación, que pueda substituir un codón de Met de la posición 202, por el codón de otro aminoácido.

Por ejemplo, cuando se usa como cebador para introducir la mutación el 24-mero con la siguiente secuencia 5'TACCTTCTGTATGCAGACATTGAT3', una secuencia CTG localizada entre las posiciones 7 y 9 de esta secuencia es una secuencia que codifica una Leu y que se corresponde con una secuencia ATG que codifica la Met de la posición 202 en una secuencia molde reasociada, de este modo un resto de metionina se sustituye por un resto de leucina por substitución de ATG por CTG en la secuencia (a partir de ahora abreviado como Met202Leu).

En la presente invención, la introducción de la mutación de la Met de la posición 202 da como resultado cinco mutantes \alpha-amilasas resistentes a la oxidación además de Met202Leu.

Los cebadores utilizados para introducir tales mutaciones se muestran a continuación

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El método específico para introducir una mutación se describe a continuación.

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\code{1} Introducción del gen de la \alpha-amilasa en un vector plasmídico pKF19K para introducir la mutación

Un fragmento de 2,1 kb que contiene el gen estructural de la \alpha-amilasa licuefactiva se amplificó a partir de una región promotora que induce alta expresión en un plásmido pHSPLAMY2, para una alta producción de \alpha-amilasa por PCR y para insertarlo en el sitio Sma I de un plásmido pKF19K (denominado pKF19LAMY).

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\code{2} PCR para introducir la mutación

Se preparó la siguiente mezcla de reacción en un tubo de reacción (0,5 ml). Composición de la mezcla de reacción: 10 ng de ADN molde (pFK19LAMY), 5 pmol del cebador de selección, 5 pmol de cebador fosforilado para introducir la mutación, 10 X 5 \mul de tampón II para LA-PCR, 8 \mul de mezcla de dNTP (2,5 mM de cada) y 0,5 \mul de LA Tag de TaKaRa (total 50 \mul). La reacción de PCR se realizó en las condiciones que se describen a continuación: Se repitió durante 25 veces un ciclo de disociación a 94ºC durante 1 minuto, reasociación a 55ºC durante 1 minuto y elongación a 72ºC durante 3 minutos, y después se mantuvo durante 10 minutos a 4ºC. El ADN amplificado se purificó con un kit de purificación de fragmentos de PCR (Behringer Mannheim GmbH) y se utilizó en la transformación.

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\code{3} Introducción en la cepa MV1184 de Escherichia coli y confirmación de la mutación

Se utilizaron células competentes de Escherichia coli MV1184 (TaKaRa Co.) para introducir el producto de la PCR en una cepa de Escherichia coli MV1184 (ara\Delta (lac-proAB) rpsLthi (\diameter80 lacZ\DeltaM15) \Delta (srl-recA) 306::Tn10(tet^{r})F' [traD36proAB^{+}lacI^{q} lacZ\DeltaM15]) utilizando un método de células competentes habitual. Se preparó un plásmido de DNA a partir de varias colonias transformantes cultivadas en un medio agar LB (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de levaduras, 1% de cloruro sódico y 1,5% de agar) que contiene kanamicina (50 \mug/ml), y se realizó un análisis de la secuencia para confirmar la mutación.

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(2) Escrutinio de las \alpha-amilasas mutantes resistentes a agentes oxidantes

En primer lugar cada medio de cultivo transformante fue centrifugado a 12.000 rpm durante 15 minutos con el fin de obtener la \alpha-amilasa mutante según el proceso descrito anteriormente, recuperando de ese modo un sobrenadante del cultivo. Se añadió peróxido de hidrógeno acuoso a cada sobrenadante del cultivo para obtener una concentración final del 2%. Después se dejó reposar la mezcla a 30ºC durante 30 minutos, se determinó la actividad amilasa residual del sobrenadante del cultivo. Al mismo tiempo, se determinó también la actividad amilasa de cada sobrenadante del cultivo libre de peróxido de hidrógeno, tratado en las mismas condiciones.

La actividad residual después del tratamiento con peróxido de hidrógeno se comparó con la de la enzima de tipo silvestre para obtener los 18 mutantes que se consideró que tenían resistencia alta al agente oxidante (que mantienen una actividad entre 85 y 100%). Se prepararon los plástidos correspondientes a partir de los 11 transformantes seleccionados para llevar a cabo el análisis de la secuencia. Por consiguiente quedó claro que el aminoácido de la posición 202, un resto de metionina, era substituido por un resto de treonina (2 clones), un resto de serina (2 clones), un resto de valina (2 clones), un resto de leucina (1 clon), un resto de isoleucina (3 clones) o un resto de alanina (1 clon). Estos mutantes coincidían en los aminoácidos substituidos con las \alpha-amilasas mutantes resistentes a la oxidación obtenidas por una mutación específica. Estos genes de \alpha-amilasa mutantes o las proteínas se denominaron Met202Thr, Met202Ile, Met202Leu, Met202Ala, Met202Val y Met202Ser. En relación con Met202Cys, cuando la enzima estuvo completamente purificada y mezclada con agua, la mezcla se volvió opaca y la enzima precipitó. Es probable que la enzima formase un enlace disulfuro entre sus moléculas para volverse insoluble.

(3) Las \alpha-amilasas mutantes (sobrenadantes) obtenidas por la centrifugación del medio de cultivo expresadas en Escherichia coli se precipitaron con 60% de sulfato de amonio. Los precipitados se dializaron separadamente, y cada porción no adsorbida en una columna DEAE-Toyoperl 650S fue posteriormente concentrada para obtener un preparado purificado parcial de las enzimas mutantes. Se confirmó la resistencia al agente oxidante (H_{2}O_{2}) de las preparaciones obtenidas de este modo. Por consiguiente, las \alpha-amilasas mutantes distintas de Met202Cys presentaban una actividad residual del al menos un 75% incluso después de tratarlas a 30ºC durante 30 minutos en presencia de 1 a 3% de H_{2}O_{2} en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,5).

(4) De manera similar, se utilizaron los siguientes cebadores de manera adecuada para substituir los otros restos de metionina, p. ej., los restos de Met de las posiciones 9, 105, 116, 382 y 430, por los aminoácidos adecuados correspondientes.

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101

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Con respecto a estas substituciones de aminoácidos, cuando se seleccionaba un aminoácido al azar, se consideró que no se podía obtener una estructura de proteína normal debido a impedimentos estructurales estéricos, o si se obtenían, la expresión de la actividad estaba inhibida, y por eso se seleccionaron los aminoácidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa derivada de B. licheniformis. (véanse Figs. 1 a 6). Según se describe en la Solicitud de Patente Japonesa PCT (KOHYO) No. 500243/1995 los mutantes obtenidos por la substitución de uno o ambos restos de metionina en las posiciones 202 y 208 de la \alpha-amilasa licuefactiva derivada de B. stearothermophilus están estabilizados, y en el documento WO96/23878, se hace la misma descripción incluso para la \alpha-amilasa derivada de NCIB 2512. Por lo tanto, la secuencia 5'GCAGACATTGATTATGATCATCCAGAA3' se sintetizó como un cebador para la mutación en la preparación de Met208Tyr.

En este sentido si según el conocido informe de Suzuki et al. (J. Biol. Chem., 264, 18933-18933, 1989), p. ej., la delección especifica de dos aminoácidos, arginina y glicina se reproduce igual en la \alpha-amilasa de la presente invención, es de esperar que no solo se incremente la resistencia a los agentes oxidantes sino también la estabilidad al calor. Por lo tanto, la arginina de la posición 181 y la glicina de la posición 182 de un gen de la \alpha-amilasa de tipo silvestre y de un gen de la \alpha-amilasa con la mutación Met202Thr, posiciones correspondientes al informe de Suzuki et. al., se eliminan utilizando el cebador que se incluye a continuación para la introducción de una mutación, creando así dos \alpha-amilasas mutantes por delección (abreviadas a partir de ahora como \DeltaRG y \DeltaRG/met202Thr,
respectivamente).

\DeltaRG: 5'AAAATATATAAATTC(AGA)(GGT)ACCGGAAAGGCATGGGACTGG3' (las bases entre paréntesis indican las bases eliminadas).

Los plásmidos mutantes descritos anteriormente se expresaron en células de Bacillus subtilis y posteriormente las \alpha-amilasas mutantes producidas se purificaron para determinar la resistencia a la oxidación con H_{2}O_{2}. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

1

Como es evidente según la Tabla 1, se entiende que todos los mutantes Met9Leu, Met105Ile, Met116Asp,
Met382Leu, Met430Ile, Met208Try y \DeltaRG solo tienen una resistencia a la oxidación equivalente a la enzima tipo silvestre, concretamente, no son resistentes a los agentes oxidantes. Por otro lado, \DeltaRG/Met202Thr obtenida por introducción de la mutación \DeltaRG en Met202Thr que presenta una resistencia alta a los agentes oxidantes, manifestó una resistencia alta a los agentes oxidantes, similar a la de Met202Leu que se utiliza como control. Además, es evidente según muestra la Fig. 5 que esta enzima y \DeltaRG mejoran en gran medida su resistencia al calor y en su resistencia a los agentes quelantes (EDTA, EGTA y zeolita) en comparación con la enzima de tipo silvestre.

(5) Las siete \alpha-amilasas mutantes obtenidas por este procedimiento y que tienen gran resistencia a la oxidación con una concentración alta de H_{2}O_{2}, se sometieron a un cultivo masivo. Cada gen mutante se transformó en una cepa ISW 1214 de B. Substilis (LeuA8metB5hsdM1) según el método de transformación de protoplastos (Chang & Cohen, Mol. Gen. Genet., 168, 111-115, 1979) (véanse Figs. 6 y 7) incubando el cultivo a 30ºC durante 3 días en un medio líquido que contiene 4% de líquido de maceración de maíz; 1% de triptosa; 1,0% de extracto de carne; 0,1% de fosfato primario de potasio, MgSO_{4}, 0,01% de NH_{2}O; 2% de maltosa; 0,1% de CaCl_{2}; y 15 \mug/ml de tetraciclina en un matráz de Sakaguchi. El sobrenadante resultante del cultivo se sometió a un fraccionamiento con sulfato de amonio (a una saturación del 60%) y se dializó durante 24 horas contra un tampón Tris-HCl 10 mM (pH: 7,5; que contenía CaCl_{2} 2 mM). Después de la diálisis, el dializado se hizo pasar por una columna de DEAE- Toyopearl equilibrada con el mismo tampón, y la solución tratada obtenida de este modo se aplicó a una columna CM-Toyopearl equilibrada con el tampón mencionado anteriormente. Como resultado, la solución fue adsorbida en la columna, y la enzima deseada fue eluída con un gradiente de concentración de NaCl. Después de que este eluato se concentrara en un filtro de membrana PM-10 (Amicon Co.), el concentrado resultante fue dializado con el tampón descrito anteriormente, obteniendo de esta manera un preparado completamente purificado. Todos los preparados resultantes aparecían como una banda sencilla en una electroforesis SDS (Laemmli, Nature, Londres, 227, 680-685, 1970), y se determinó que sus pesos moleculares eran todos de 55 KDa aproximadamente.

Después de que los preparados completamente purificados de las \alpha-amilasas mutantes correspondientes fueran incubados por separado a 30ºC en un tampón Tris 50 mM (pH: 8,5) que contenía 2% de H_{2}O_{2} (588 mM), se determinó su actividad amilasa residual, analizando de ese modo su resistencia a los agentes oxidantes (método de KAO). Como resultado, la actividad de la \alpha-amilasa de tipo silvestre y de \DeltaRG disminuyó rápidamente como muestran las Figs. 8 a 12, mientras que las \alpha-amilasas mutantes correspondientes mostraban una actividad residual elevada de al menos 80% incluso después de una incubación durante una 1 hora. Además, las \alpha-amilasas mutantes correspondientes mostraban una actividad amilasa residual alta incluso en unas condiciones (tratamiento a 30ºC durante 30 minutos) en las que la concentración de H_{2}O_{2} se incrementaba hasta 2 M, y quedando claro de este modo que adquirían una gran capacidad de resistencia a los agentes oxidantes. Por otro lado, el documento WO96/23873 describe \alpha-amilasas mutantes con una resistencia mejorada a los agentes oxidantes. Sin embargo, se dice que estas \alpha-amilasas mutantes muestran una actividad residual de 20 a 43% después de un tratamiento a 40ºC durante 20 minutos en un tampón Britton 50 mM (pH: 9,0) que contenía H_{2}O_{2} 200 Mm y CaCl_{2} 0,1 Mm (método de W). La resistencia a los agentes oxidantes de las \alpha-amilasas mutantes de la presente invención se analizó utilizando este método W. Como resultado, éstas mostraron una actividad residual de por lo menos 80%, incluso después de un tratamiento durante 1 hora (véanse las Figs. 8 a 12), y quedó claro de este modo que adquirían una gran resistencia a los agentes oxidantes en comparación con las enzimas mutantes del documento WO 96/23873.

El contenido en proteína de las \alpha-amilasas mutantes resultantes se midió por el método descrito anteriormente para calcular la actividad específica. Como resultado, la \alpha-amilasa de tipo silvestre tenía una actividad específica de 4000 a 5500, mientras que el mutante Met202Ser tenía una actividad específica de 700 a 750, Met202Thr de 2200 a 2400, Met202Val de 1100 a 1400, Met202Ala de 1350 a 1500, Met202Cys de 1450 a 1600, Met202Ile de 1600 a 1800, Met202Leu de 1600 a 2000, \DeltaRG de 3500 a 4500, \DeltaRG/Met202Thr de 2000 a 2500, NCIB 12512, NCIB 12523 y NCBI 12285 de 4000 a 45000, y B. Licheniformis de 1300 aproximadamente (unidad/mg de proteína, cada una).

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Ejemplo 2

Las \alpha-amilasas mutantes resultantes resistentes a la oxidación con H_{2}O_{2}, Met202Leu y Met202Thr se incubaron a 40ºC durante una hora en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,5) que contiene un sistema blanqueador TEAD 10 mM/NaBO_{4} 20 mM. Se determinó su actividad amilasa residual después del tratamiento. Como resultado, el tipo silvestre resultó casi completamente inactivado, mientras que los mutantes Met202Leu y Met202Thr mantuvieron actividades entre 77% y 80% respectivamente.

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Ejemplo 3

Después de incorporar Met202Thr granulada (5%, p/v) a un detergente ultra compacto de la empresa A, el detergente se almacenó durante 4 semanas en un almacén controlado a 40ºC y a una humedad relativa del 80%. Los gránulos se cogieron y se disolvieron en un tampón Tris-HCl 50 Mm (pH: 8,5) que contiene CaCl_{2} 2 mM, y después la solución fue centrifugada (12.000 x g, 20 minutos). Se determinó la actividad amilasa residual del sobrenadante resultante. Si consideramos como 100 la actividad específica del tipo silvestre y de Met202Thr antes del tratamiento, la actividad residual fue de 55% para la primera y de 88% para la segunda.

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Ejemplo 4

Las \alpha-amilasas recombinantes, Met202Leu, Met202Ile, Met202Thr, Met202Val, Met202Cys, Met202Ala y
Met202Ser producidas extracelularmente por B. subtilis ISW 1214, la \alpha-amilasa tipo silvestre y la \DeltaRG se purificaron utilizando la técnica descrita anteriormente. Los preparados purificados resultantes se sometieron a una electroforesis SDS. Como resultado fueron detectadas respectivamente como bandas sencillas y se determinó que sus pesos moleculares eran todos de 55 KDa aproximadamente. Los rendimientos estaban en un intervalo de entre 40 y 60%.

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Ejemplo de referencia 1

Se investigaron las curvas de pH-actividad de las \alpha-amilasas mutantes resistentes a los agentes oxidantes en unos sistemas tampón (50 mM cada uno) con un tampón de intervalo amplio Britton-Robinson combinado con diferentes tipos de tampones. En la Fig. 13 se ilustran como ejemplo los resultados de Met202Thr en los distintos sistemas tampón. Incluso cuando no se utiliza ningún sistema tampón, la curva pH-actividad muestra substancialmente la misma curva que la de la enzima tipo silvestre.

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Ejemplo de referencia 2

Se investigó la curva de referencia temperatura-actividad de la \alpha-amilasa mutante resultante resistente a los agentes oxidantes, se investigó el mutante Met202Thr en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH: 8,5) (tiempo de reacción: 5 minutos). En la Tabla 14 se muestra un ejemplo de los resultados.

Aplicación industrial

Las \alpha-amilasas mutantes según la presente invención tienen un pH óptimo en el intervalo alcalino, una actividad \alpha-amilasa excelente, una resistencia a los agentes oxidantes alta y duradera, y son por lo tanto especialmente útiles como componentes de los detergentes que contienen agentes blanqueadores y agentes oxidantes, y de las composiciones para la licuefacción y sacarificación del almidón.

2

3

4

Claims

1. Un gen que codifica una \alpha-amilasa mutante alcalina licuefactiva que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a): la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, donde un resto de metionina de la posición 202 está substituido por un resto de un aminoácido no oxidable; y

(b): la secuencia de aminoácidos de (a) donde además el resto de arginina de la posición 181 y el resto de glicina de la posición 182 están eliminados.

2. El gen según la reivindicación 1, donde el resto aminoácido no oxidable es Thr, Ile, Leu, Ala, Val o Ser.

3. Un ADN recombinante o un vector que comprende el gen de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Un método de obtención de un transformante que comprende transformar un hospedador con el ADN recombinante o con el vector de la reivindicación 3 y cultivar el transformante.

5. Un transformante que comprende el gen de las reivindicaciones 1 o 2 o el ADN recombinante o el vector de la reivindicación 3 o que se obtiene por el método de la reivindicación 4, adecuado para el cultivo y producción de una \alpha-amilasa mutante tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2.

6. Un método de obtención de un polipéptido codificado por el gen de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende cultivar el transformante de la reivindicación 5 en condiciones tales que el polipéptido se exprese; y recuperar dicho polipéptido.

7. Un polipéptido codificado por el gen de las reivindicaciones 1 o 2 que se obtiene por el método de la reivindicación 6.

8. Un método de obtención de una \alpha-amilasa licuefactiva mutante con un pH óptimo alcalino y una tolerancia alta frente a los agentes oxidantes que comprende las etapas:

(a): substituir por un resto de aminoácido no oxidable el resto de metionina de la posición 202 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y

(b): eliminar el resto de arginina de la posición 181 y el resto de glicina de la posición 182 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

9. Método según la reivindicación 8, donde el resto de aminoácido no oxidable es Thr, Ile, Leu, Ala, Val o Ser.

10. Una composición detergente que comprende el polipéptido de la reivindicación 7.