ES2320801T3 - Procedimiento para la fabricacion de sulfato de celulosa con caracteristicas mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de sulfato de celulosa (CS) sustituido regio-selectivo caracterizado por una combinación de las etapas siguientes: a) hinchamiento de celulosa natural en un disolvente aprótico polar; b) adición de un reactivo sulfatante y un reactivo acetilante, para la esterificación simultánea y distribución de grupos acetato y grupos sulfato a lo largo y entre las cadenas poliméricas; c) directamente seguido de una neutralización completa con una base, de preferencia hidróxido sódico, con lo que el sulfato sin disociar el grupo acetilo se transfiere en una sal sódica del sulfato de acetato de celulosa, con lo que la neutralización directamente siguiente evita la disociación de grupos acetato y consiguientemente la degradación de las cadenas de celulosa; y d) subsiguiente precipitación, desacetilación, la- vado y secado del SCS, con lo que el SCS se caracteriza por una viscosidad de solución que es superior a 10 mPas a una concentración de 1% en agua.
Description
Procedimiento para la fabricación de sulfato de
celulosa con características mejoradas.
El invento se refiere a un procedimiento para la
fabricación de sulfato de celulosa sódica sustituida
regio-selectiva (SCS) con características
mejoradas, así como, la aplicación de este SCS mejorado para la
micro-encapsulación de sustancias biológicamente
activas. Estos tipos de microcápsulas, también conocidos como
microcápsulas simplex, se obtienen mediante instilación de una
solución acuosa del sulfato de celulosa mejorado en una solución
acuosa de un policatión, de preferencia pDADMAC (cloruro de
poli(dialil-dimetil amonio)) o análogos.
El sulfato de celulosa sódica (SCS) es un
polímero soluble en agua conocido desde hace tiempo del semiéster
de ácido sulfúrico de celulosa. El SCS se forma mediante la
esterificación de los grupos hidroxilo de la celulosa con un agente
sulfatante, por ejemplo anhídrido de ácido sulfúrico, ácido
sulfúrico o sus derivados seguido de la conversión del semiéster
acidificado en una sal sódica neutra.
Se conocen métodos básicos para la producción de
SCS, durante la cual la sulfatación puede llevarse a cabo en una
fase heterogénea sin disolución del polímero (heterogénea) o en una
fase homogénea junto con disolución del polímero (cuasi homogenea)
o después de disolución del polímero (homogénea).
Lukanoff, B. y Dautzenberg, H. (1994, Das
Papier, Heft 6, 287-298) refinaron adicionalmente un
método heterogéneo bien conocido para la fabricación (US 2.539.451;
US 2.969.355) con el uso de ácido sulfúrico y propanol como medio
de reacción y agente sulfatante. Para este tipo de método de
fabricación heterogéneo, como por Bohlmann et al. (2002,
Chemie Ingenieur Technik, 74, 359-363) el medio de
reacción se prepara primero a partir de ácido sulfúrico al 96% e
isopropanol en una relación molar de 1,8:1. La sulfatación de la
celulosa se lleva a cabo en esta a 5ºC durante un periodo de tiempo
de 150 minutos. Para abortar la reacción la mezcla reaccional se
separa del semiéster de ácido sulfúrico de celulosa con alcohol y se
lava. Por último el producto lavado se transfiere a sal sódica
utilizando hidróxido sódico.
Inconvenientes fundamentales de este método de
sulfatación de celulosa heterogéneo radican en el hecho de que
existe una dificultad de control, reacción exotérmica, que conduce
inevitablemente a irregularidades en la distribución de
sustituyentes a lo largo de y entre la cadena polimérica y así
afecta la solubilidad y nivel de polimerización del sulfato de
celulosa obtenido. Otro inconveniente agravante de este método de
fabricación heterogéneo debe verse en la rápida y eficiente
degradación de la cadena de celulosa durante la sulfatación
precedente. Con el fin de reducir la degradación de la celulosa la
reacción de sulfatación termina en etapas de lavado que eliminan
adecuadamente calor y así impiden una elevación ulterior de la
temperatura. Sin embargo el proceso de difusión y proceso de
fuente, así como la estructura morfológica de la celulosa tienen
una influencia considerable sobre el curso de la reacción, debido a
que la reacción se produce con un mantenimiento global de la
estructura física fijada de la celulosa.
Con el fin de obtener la solubilidad de agua
completa del sulfato de celulosa fabricado heterogéneamente sin
separación de la porción insoluble en el grado de
(DS)-gama de sustitución <0,8, se recomienda una
pre-activación de la celulosa en DD 295858 A5 y DE
4019116 A1, con lo que solo se obtienen los productos con viscosidad
muy baja con máximo de 8,5 mPas en solución acuosa al 1%. Durante
la inserción de este sulfato de celulosa para la producción de
microcápsulas simplex debe apreciarse que se forman solo
microcápsulas con una consistencia mecánica muy estrecha.
De conformidad con la DE 4021049 el sulfato de
celulosa con alta viscosidad puede aislarse de los productos de
reacción que se generan, si bien a través de etapas adicionales en
el proceso las partes insolubles en agua pueden separarse y las
partes solubles contenidas con una viscosidad muy baja pueden
separarse por lavado (véase Lukanoff, B. y Dautzenberg, H.: 1994,
Das Papier, FET 6, 287-298).
Como resultado el método de producción
heterogéneo, convirtiendo la celulosa en una completamente soluble
en agua, conduce a productos con ratios de sustitución relativamente
altos (mínimo DS = 0,7), y consiguientemente una distribución de
sustituyente inhomogénea y a pesar de uso de celulosa de partida de
alto peso molecular con baja viscosidad.
La sulfatación homogénea de la celulosa conduce
usualmente a la formación de intermedio de celulosa orgánicamente
soluble, a través de la cual puede suprimirse la degradación de la
cadena de la celulosa en una gama aceptable durante la reacción de
sulfatación. Cuando la sulfatación se lleva a cabo después o
simultáneamente con la disolución completa de la estructura de fase
sólida en un disolvente aprótico bipolar tiene lugar un intercambio
uniforme de sustituyentes. El producto final tiene una viscosidad
de solución superior y es ya en parte completamente soluble en agua
con valor DS de 0,25. Como ejemplo, utilizando acetato de celulosa
con un DP relativamente bajo (Cuoxam-DP aprox. 250,
DS=2,4) la viscosidad de la solución del SCS sintetizado se obtiene
en la gama de 10 mPas (medición de una solución al 2% en NaOH 2N en
un viscosímetro Ubbelohde) (véase DE 4435180).
A través de ulteriores modificaciones del
proceso de fabricación basado en la esterificación homogénea de los
acetatos de celulosa parcialmente sustituidos puede obtenerse una
sustitución regio-selectiva de los grupos OH sobre
los diversos átomos de C de la unidad de anhidroglucosa de la
celulosa. Wagenknecht et al. (DE 4435082; DE 4435180 y Das
Papier, 1996, 712-720) describe la sulfatación
regio-selectiva sobre la posición C2/C3 o C6, con
lo que se utiliza acetato de celulosa orgánicamente soluble como un
polímero de partida.
Inconvenientes fundamentales son el grado bajo
de polimerización del conjunto en acetato de celulosa disponible en
el comercio (Cuoxam-DP aprox. 200 a 350), de modo
que después del estado corriente de la técnica ningún acetato de
celulosa puede producir un sulfato de celulosa con una viscosidad de
solución superior a aproximadamente 10 mPas en una solución acuosa
al 1%. Es todavía deseable la modulación de una gama de viscosidad
de solución deseada del SCS obtenido del DP de partida dado del
acetato de celulosa.
La aceto-sulfatación de la
celulosa natural como un principio básico para la producción de
sulfato de acetato de celulosa, acetato de celulosa o sulfato de
celulosa a través de esterificación mixta se conoce desde hace
tiempo. Así se introduce ácido sulfúrico como reactivo con
anhídrido de ácido acético en un ácido acético glacial como medio
de reacción (US 2.683.143; US 2.969.356; US 3.086.007; US 3.075.963;
US 4.005.251). En lugar de clorosulfonato sódico de ácido
sulfúrico puede utilizarse también (US 2.969.355). Como resultado
de la prueba por Chauvelon (Chauvelon, G et al., Carbohydrate
Research 338 (2003) 743-750) para la producción de
sulfato de acetato de celulosa soluble en agua es visible una fuerte
inconsistencia de esta reacción heterogénea, de modo que el
producto final puede obtenerse solo mediante fraccionación.
Además se conoce que una
aceto-sulfatación de celulosa es posible bajo
disolución del éster de sulfato de acetato de celulosa formado
utilizando N,N-dimetilformamida como un medio de
reacción. En este caso puede utilizarse como una mezcla reaccional
anhídrido/trióxido de azufre (Wagenknecht, W. et al.,
"Cellulosics: materials for selective separations and other
Technologies", Kennedy, Phillips, Williams, Horwood (1993)
205-211 o anhídrido acético/ácido clorosulfónico
(Wagenknecht,W., Das Papier 50 (1996) 12,712-720).
Se obtiene DS-sulfato hasta aproximadamente 0,8
exclusivamente en posición C6 en el sulfato de celulosa soluble en
agua sustituido de la unidad de anhidroglucosa después de
eliminación alcalina de los grupos acetilo inestables.
Los inconvenientes del sulfato de celulosa
sintetizado de conformidad con este método están en la asimetría de
la distribución de la sustitución por DS>0,6, que conduce a la
heterogeneidad en una solución acuosa y por tanto a la inutilidad
para la producción de membranas simplex.
El SCS como polianión, que debe reunir las
necesidades de conformidad con el invento para la producción
automática de microcápsulas simplex esféricas de un tamaño
definido, firmeza mecánica suficiente y estabilidad de largo plazo,
debe reunir una lista de exigencias:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
El mayor inconveniente del procedimiento de
fabricación heterogéneo, así como homogéneo, es la degradación
incontrolada de la longitud de la cadena durante la reacción de
sulfatación. Como resultado de esta degradación de la longitud de
la cadena no ha sido posible, hasta ahora, producir SCS, que sea
completamente soluble en agua en un DS de 0,3 hasta próximo a 1, de
preferencia de 0,3 a 0,6, y cuya viscosidad en solución en una
solución al 1% se encuentra en un pequeño rango, o sea de 15 a 60
mPas sobre el curso de la reacción de
aceto-sulfatación.
Una viscosidad de solución ajustable
suficientemente alto del SCS disuelto es especialmente interesante
cuando se utiliza SCS para encapsular material biológicamente
activo, entonces en el procedimiento utilizado para esto una
suspensión del material biológicamente activo en una solución de SCS
acuosa gotea de una boquilla en una solución
contra-iónica. La formación de gotas, homogeneidad
de las gotas y la reproducibilidad del tamaño de las gotas es
directamente dependiente de la viscosidad de la solución del SCS
disuelto. Por otra parte, el espesor y firmeza de las paredes de
la cápsula están influenciados por el grado de polimerización y la
concentración del SCS.
Si bien una viscosidad de solución muy baja
permite la formación de gotas y por tanto una encapsulación
potencial del material biológico, esto conduce también a
irregularidades en la formación de gotas citada y de las
microcápsulas que surgen de esta. Estos tipos de irregularidades
son visibles en la falta de homogeneidad, distribución desigual del
tamaño, carencia de estabilidad y envolvente irregular de materiales
biológicos. Una viscosidad de solución muy baja del SCS disuelto
en agua es por tanto un inconveniente agravante del SCS producido
convencionalmente y todos los productos generados de este.
Este inconveniente, o sea la viscosidad de
solución muy baja, está motivado parcialmente por la limitación de
los diversos procesos de fabricación para utilizar un material crudo
de celulosa particular. El acetato de celulosa que se encuentra
en el comercio, comúnmente utilizado
(celulosa-2,5-acetato) tiene una
media de 250-270 unidades de polímero (DP). Solo
desde este límite de DP no puede obtenerse SCS de alta viscosidad.
Durante la producción de SCS, especialmente durante la sulfatación
con reactivos fuertemente acídicos, se conduce a una degradación
adicional de la cadena, a través de lo cual se reduce adicionalmente
la viscosidad de la solución. Típicamente se obtiene la viscosidad
de la solución de bajo 10 mPas (véase por ejemplo DE 4435180).
La pulpa de madera, que se utiliza en ocasiones
como material crudo, tiene valores DP de entorno de 600. El uso de
pulpa de madera en los procedimientos de fabricación bien conocidos
descritos antes conduce a degradación distintiva de la cadena y
correspondiente a la de un producto final con una viscosidad de
solución muy baja.
Idealmente debería transformarse celulosa de
alto peso molecular natural tal como linters de algodón, que tienen
altos valores de DP de alrededor de 1250-1400
unidades de polímero, en SCS, con el fin de obtener las cadenas de
polímero mas largas posibles y así una alta viscosidad de
solución.
Los linters de algodón se utilizan como material
crudo en el método de ácido sulfúrico/propanol heterogéneo, sin
embargo este método de fabricación, como ya se ha indicado, conduce
a un número considerable de rotura de cadenas, de modo que los
productos resultantes después de la síntesis exhiben solo una baja
viscosidad de solución. Como el procedimiento de fabricación
heterogéneo tampoco permite una distribución uniforme de los grupos
sulfato, las características del producto, o sea la solubilidad en
agua del SCS, se ven influenciadas negativamente.
Es pues objeto de este invento el proporcionar
un procedimiento de fabricación adicional y mejorado para SCS
sustituido regio-selectivo, que evite los
inconvenientes del estado del arte y que permita el ajuste deseado
de la viscosidad de la solución con completa solubilidad en agua del
producto final, con el DP dado del material bruto celulósico
utilizado.
El objeto es a bordado a través de las etapas
del procedimiento de la reivindicación principal 1. Modalidades
excepcionales se describen en las características de las
reivindicaciones dependientes.
Para este método la celulosa, de preferencia
linters de algodón, se disuelve mediante una reacción
cuasi-homogénea en un disolvente polar mediante
esterificación mixta con una mezcla de reactivos, constituida por
un agente acetilante y un agente sulfatante en un éster mixto de
acetato-sulfato. Como una ventaja la celulosa se
deja primero que se hinche en el medio de reacción a temperatura
aumentada, de preferencia en la gama de 30 a 100ºC, durante un
tramo de tiempo largo, de preferencia de 0,5 a 12 horas, bajo
agitación mantenida y se deja reposar a temperatura ambiente
durante ulterior intumescencia. Por último bajo agitación mantenida
se adiciona la mezcla reactiva previamente preparada, conteniendo
de preferencia un agente acetilante, un agente sulfatante y un
disolvente polar de composición definida. El nivel de sustitución
parcial de sulfato DS y acetato DS puede ajustarse una forma
conocida por el experto en el arte hasta un máximo de un total de
DS-3 utilizando la relación molar de los reactivos
entre sí y la relación molar frente a celulosa. La reacción de
aceto-sulfatación tiene lugar, de preferencia, en
una gama de temperatura de 30 a 80ºC, con lo que el sulfato de
acetato de celulosa que se produce se autodisuelve en el sistema de
reacción para formar una solución viscosa. En caso que la
temperatura se mantenga predominantemente a un nivel predeterminado
constante, la viscosidad de la solución de polímero disminuye a
medida que prosigue la reacción, de modo que esta viscosidad puede
ajustarse a un nivel predeterminado.
De conformidad con el invento es importante que
se detenga la degradación adicional, mediante neutralización
definida, y por consiguiente fijando el nivel de polimerización y la
viscosidad de la solución del sulfato de celulosa que se obtiene
después del reprocesado.
Para la neutralización los grupos de semiéster
de sulfato se transforman sin eliminación de los grupos acetilo
antes o alternativamente, también simultáneamente a la precipitación
en su forma de sal sódica. Bajo las condiciones de conformidad con
el invento, en adición a esto, los grupos de semiéster de sulfato se
neutralizan cuidadosamente, sin descomposición de los grupos
acetilo a cualquier ratio, antes o alternativamente también
simultáneamente a la precipitación con un neutralizador básico, de
preferencia NaOH, disuelto en un neutralizador y/o precipitador
apropiado.
A continuación el éster mixto de sulfato de
celulosa, que se ha precipitado preferentemente en una forma
particular, se lava con un medio de lavado apropiado, de
preferencia con etanol conteniendo acetato sódico o una mezcla de
etanol y agua.
Luego se lleva a cabo el reprocesado para el
producto final a través de hidrólisis alcalina de los gruidos
acetilo en una fase heterogénea con la ayuda de NaOH etanólico,
reneutralización hasta un valor pH próximo a 7, lavados repetidos
de preferencia con etanol acuoso hasta estar libre de sal y
subsiguiente secado del sulfato de celulosa sódico en vacío a
aproximadamente 40ºC.
\newpage
Después de este proceso de síntesis exento de
residuos, el sulfato de celulosa sódico claramente soluble puede
producirse con DS por encima o igual a 0,3, lo que muestra un
intercambio ventajoso, uniforme y regio-selectivo
de sustituyentes de los grupos de semiéster de sulfato en posición
C6 y se identifica con una viscosidad de solución ajustable en una
gama de 10 mPas a 500 mPas, de preferencia 15 a 400 mPas, mas
preferentemente 20 a 300 mPas, mas preferentemente 15 a 100 mPas,
mas preferentemente de 20 a 60 mPas con una concentración dada del
1% en agua.
Como sea que los productos obtenidos son
sustancialmente puros no es necesario purificación adicional de
estos mediante diálisis o ultracentrifugación.
Si bien en los métodos conocidos hasta ahora la
neutralización se llevó a cabo al final después de la etapa de
lavado y/o desacetilación, los inventores muestran, que cuando se
lleva a cabo la neutralización directamente al final en la etapa de
sulfatación y sin desacetilación anterior o etapas de lavado, la
cualidad del SCS producido es claramente mejor. Pueden obtenerse
también resultados satisfactoriamente buenos cuando la
neutralización se lleva a cabo al mismo tiempo que la
precipitación.
Para la neutralización, de conformidad con el
invento del procedimiento se adiciona una base o una solución
alcalina, de preferencia NaOH, a la mezcla reaccional con lo que la
base, solución alcalina o NaOH se coordina exactamente con el
reactivo sulfatante. Por ejemplo 1 mol de un ácido
tri-básico, tal como ácido clorosulfónico se
neutraliza con 3 moles de NaOH y 1 mol de un acido
di-básico, tal como ácido sulfúrico, se neutraliza
con 2 moles de NaOH.
Es ventajoso durante la neutralización operar
con rapidez, ya que las cadenas poliméricas son siempre atacadas y
degradadas en medios acídicos, y por tanto el acortamiento del
tiempo durante la neutralización reduce esta degradación de la
longitud de la cadena de polímero.
Con el ajuste en las etapas de proceso relativas
al proceso de fabricación de SCS de conformidad con el invento y la
previa neutralización en sistema ácido, el proceso de fabricación
puede controlarse con respecto a la degradación de la longitud de
la cadena polimérica. El SCS generado de conformidad con el invento
no posee viscosidad estructural o solo muy baja en una solución
acuosa al 1% y al mismo tiempo es ajustable en las gamas de
viscosidad de solución de 10 a 500 mPas, mas preferentemente de 15 a
400 mPas, mas preferentemente de 20 a 300 mPas, mas preferentemente
de 15 a 100 mPas, mas preferentemente de 20 a 60 mPas, medido en una
solución acuosa al 1% a 25ºC.
Además el SCS creado de conformidad con el
procedimiento del invento es acuosoluble sin dejar residuo y tiene
un valor DS a partir de 0,25 como frente al producido por
procedimientos heterogéneos utilizando la reacción de
H_{2}S_{4}/isopropanol, de modo que no deben eliminarse
componentes insolubles en agua con un tratamiento adicional.
De conformidad con el método del invento es
posible utilizar como material de partida celulosas de diferente
origen y con varios valores DS. De preferencia puede utilizarse
celulosa de alto peso molecular, especialmente ultra pura y
sustancialmente linters de algodón exentos de metal pesado. De este
modo el grado de polimerización limita los rangos ajustables de
viscosidad.
Como una opción de conformidad con el invento
para el procedimiento de fabricación la celulosa se hincha en un
disolvente polar como, por ejemplo,
N,N-dimetilacetamida (DMAc),
N-metilpirrolidona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO) o
N,N-dimetilformamida (DMF). Se utiliza de
preferencia DMF.
En adición el procedimiento de conformidad con
el invento puede llevarse a cabo con la opción de que para la
esterificación mixta de sulfatos de acetato de celulosa solubles en
disolventes orgánicos y con un DS total de hasta 3 se utiliza como
el agente sulfatante ácido sulfúrico, ácido amidosulfúrico, trióxido
de azufre, cloruro de sulfurilo o ácido clorosulfónico. De
preferencia se utiliza como el agente sulfatante ácido
clorosulfónico.
El procedimiento de conformidad con el invento
puede llevarse a cabo con la opción de que para la esterificación
mixta de sulfatos de acetato de celulosa, que es soluble en
disolventes orgánicos y tiene un total DS de hasta 3, se utiliza
como el agente acetilante combinado con cloruro de acetilo o
anhídrido acético.
La producción de SCS de conformidad con el
invento debe tener lugar, de preferencia, bajo las condiciones
descritas a continuación:
Se hincha primero la celulosa natural a una
temperatura de hasta 150ºC, de preferencia 30 a 100ºC, mas
preferentemente de 40 a 80ºC durante hasta 24 horas, de preferencia
durante hasta 12 horas, mas preferentemente durante 3 a 8 horas y
como un periodo subsiguiente a temperatura ambiente, de modo que el
enfriamiento de hinchamiento adicional a temperatura ambiente (TA)
se lleve a cabo durante hasta 48 horas. Durante todo el tiempo del
hinchamiento la suspensión estará de preferencia agitada. Durante
el hinchamiento adicional a TA la agitación deja de ser
necesaria.
A continuación el agente sulfatante y el agente
acetilante se adicionan a la celulosa hinchada con agitación
constante y a una temperatura de reacción de 0ºC hasta 110ºC, tal
como de preferencia de 20 a 80ºC, mas preferentemente de 30 a 70ºC,
mas preferentemente 40 a 65ºC, mas preferentemente de 50 a 60ºC.
Mientras se produce la constante agitación el
semiéster de sulfato de acetato de celulosa obtenido se disuelve
totalmente y la viscosidad se reduce lentamente hasta que se alcanza
la fluidez deseada y prevista de la solución polimérica, lo cual
puede definirse experimentalmente.
La neutralización subsiguiente directamente se
lleva a cabo de preferencia bajo cuidadosa agitación constante a
temperatura ambiente (TA), con lo que la solución polimérica puede
todavía estar caliente en comparación con la temperatura de
reacción, o sea la reacción se llevará a cabo, por ejemplo a 50ºC, y
después que se haya enfriado un poco se adicionará al baño de
neutralización/precipitación mientras está todavía caliente. La
relación del baño de neutralización/baño de precipitación frente a
la solución de polímero es de 3 a 10, de preferencia de 3 a 5.
Como una condición el SCS que se produce de conformidad con este
procedimiento de fabricación es básicamente estéril, exento de
endotoxinas y/o metales pesados. Para esta finalidad el
procedimiento se lleva a cabo bajo condiciones estériles y
particularmente condiciones exentas de gérmenes. Particularmente
las condiciones y materiales crudos han de elegirse de modo que no
sea detectable en el producto final levadura, bacterias aeróbicas,
salmonellas, E. coli. Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, etc. El contenido de endotoxinas del producto
final se encuentra dentro de la gama de 0,02 a 0,11 I.E/ml y se
detecta con una prueba LAL de conformidad con la farmacopea Europea
Ph. Eur. 4.00 Method C (turbidimétricocinético) con una solución
acuosa al 1% de SCS.
En adición debe prestarse atención al hecho de
que los materiales crudos utilizados están también exentos de
metales pesados como, por ejemplo, Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn y
Cu, de modo que el SCS fabricado no excede los valores de umbral
siguientes:
Contenido de metal pesado total sin hierro:
\leq 10 ppm,
Contenido de hierro: \leq 20 ppm,
con lo que el contenido de metal
pesado total sin hierro contiene la suma de todos los metales
pesados
pensables.
Por este motivo se prefiere que solo se utilicen
para las reacciones materiales y aparatos que no emitan ninguna
cantidad detectable de uno de los metales pesados antes citados.
De conformidad con otra modalidad el SCS
producido con este método debe ser regioselectivamente sustituido.
Se prefiere tener un intercambio homogéneo exclusivo de
sustituyentes en la posición C6 o alternativamente un intercambio
de hasta el 30% de los grupos de éster sulfato en la posición C2/3.
Los reactivos que se utilizan controlan la sulfatación
regioselectiva deseada de conformidad con el estado de los métodos
del arte (Wagenknecht et al., 1996).
El SCS de conformidad con el invento es
especialmente apropiado para uso en microencapsulación de materiales
bilógicos. En base de su viscosidad de solución ajustable es
fácilmente obtenible ajustar los rangos de la viscosidad de 10 a 50
mPas, 40 a 70 mPas, 60 a 100 mPas, 80 a 200 mPas, 150 a 300 mPas o
250 a 500 mPas (con la medición de una solución acuosa al 1% en un
viscosímetro Ubbelohde) sin cambiar esencialmente la concentración
de la solución polimérica. Así pues, este SCS permite una
manipulación sin complicaciones y un ratio asombrosamente alto de
velocidad de trabajo durante la encapsulación de material
biológico.
En contraste a esto se ha descrito muy
limitadamente en los numerosos métodos para la producción de sulfato
de celulosa soluble en agua, aquellos que pueden utilizarse para la
producción de productos de microcápsulas, aquellos que tienen una
firmeza mecánica considerable y aquellos que obtienen las exigencias
bioquímicas para un uso médico potencial.
Así pues se han presentado en DD 218734 A4 y DE
3306259 C2 métodos para la producción de microcápsulas, con los que
se ha descrito la inmovilización de los objetos biológicos viables.
El SCS que se utiliza es así producido utilizando el método
N_{2}O_{4}/SO_{2}/DMF. El uso de óxido pegajoso altamente
tóxico es un inconveniente fundamental de este método, en donde un
primer proceso redox forma éster mixto de nitrito sulfato, que es
soluble en dimetilformamida (DMF). Después de aislamiento de los
grupos de éster de nitrito de celulosa inestable los productos
secundarios tóxicos resultantes, especialmente dimetilnitrosamina
carcinogénica debe eliminase del sulfato de celulosa antes que
pueda utilizarse con objetos biológicos vivientes, particularmente
cuando se utiliza para uso biomédico. Sin embargo las microcápsulas
que se producen de conformidad con el procedimiento del invento son
apropiadas para uso médico.
En la DE 4021050 A1 y EP 0892852 la producción
de SCS se describe utilizando un método de H_{2}SO_{4}
heterogéneo. Se intenta utilizar este SCS para la producción de
microcápsulas simplex para uso y para inmobilizar objetos
biológicos viables. Debido a la degradación de la longitud de la
cadena y la sulfatación irregular durante la producción de SCS no
puede evitarse el aislamiento de partes insolubles en agua y/o la
separación de partes moleculares altamente sustituidas. Las
microcápsulas de SCS fabricadas de este modo son menos estables y
se forman de modo muy carente de homogeneidad. Estas son por tanto
no apropiadas para uso médico por ejemplo en forma de
inyecciones.
DD 298643A5 y DD 299313A5 describe un método
para la fabricación de un sulfato de celulosa sustituido,
regio-selectivamente, en la posición C6, que se
generó utilizando una celulosa de trialquilsililo soluble en
disolventes inorgánicos, y que conduce a productos con una amplia
gama de viscosidades de solución. Se cita además que estos
productos pueden utilizarse en el campo de biotecnología, farmacia
y medicina. Sin embargo, estas áreas potenciales de uso no están
soportadas por ningún dato experimental. Se considera como una
seria desventaja de esta tecnología que parece no ser posible
establecer una viscosidad de solución deseada aun cuando el DS se
mantenga estable y que la viscosidad de solución depende obviamente
del DP del material de partida y el nivel de sulfatación (Philipp
et al., Das Papier 49 (1995)2,
58-64).
La DE 19837673 A1, DE 19838535 y WO 2000010694
A1 describe el uso del éster aniónico de la sulfoalquil celulosa
como un componente simplex aniónico para la producción de membranas
planas. Una producción de membranas planas simplex es
fundamentalmente diferente de la producción de cápsulas. Así pues
no pueden extraerse conclusiones para el uso de SCS para la
producción de microcápsulas.
Asimismo en Richau, K, et al., J Membr.
Sci 1996, 113, 31-41 y en DD 298790 A5 se ha
descrito que SCS con una baja viscosidad, que se fabricó a partir
de celulosa-2.5-acetato que se
encuentra en el comercio, puede utilizarse para la producción de
membranas planas simplex (Cellulose Chem. Technol. 25(1991)
343-354). La fabricación de membranas planas
simplex es fundamentalmente diferente de la fabricación de cápsulas
y no pueden extraerse conclusiones para el uso de SCS para la
producción de microcápsulas, especialmente no para la producción de
microcápsulas útiles en un área biomédica.
Wagenknecht et al (DE 4435180 C1; Das
Papier 50 (1996) 12, 712-720) describe la síntesis y
empleo de SCS para membranas planas simplex, que se produce a
partir de acetato de celulosa. El SCS así producido mediante la
sulfatación homogénea de principalmente
celullosa-2.5-acetato molecular en
N,N-dimetilformamdia con diferentes agentes
sulfatantes y descomposición subsiguiente de los grupos acetilo, con
lo que se lleva a cabo el reprocesado libre de sal. La viscosidad
de solución del SCS producido de este modo es insatisfactoriamente
baja. Si bien este SCS podría ser útil para la fabricación de
membranas planas simplex, que pueden utilizarse para una separación
de disolventes. Las microcápsulas que se producen a partir del SCS
producido de este modo son menos estables y de forma muy carente de
homogeneidad. No son por tanto apropiadas para uso médico por
ejemplo en forma de inyecciones.
El SCS de baja viscosidad, como se describe en
DE 4435180, se califica también, por ejemplo, para la separación de
disolventes sin destilación a través de preevaporación. El SCS
descrito en DE 4435180 se fabrica sulfatando acetato de celulosa
que se encuentra en el comercio y muestra cadenas de polímero
acortadas así como una baja viscosidad de solución. Las
microcápsulas que se producen con este tipo de SCS son raramente
estables y se forman con carencia de homogeneidad. Estas son por
tanto no apropiadas para uso médico, por ejemplo en forma de
inyecciones y para liberación reproducible de sustancias
farmacéuticas.
Como resumen se determina que se conocen
numerosos métodos para la producción de SCS, que sin embargo
proporcionan todos productos finales que tienen una viscosidad de
solución muy baja, distribución irregular de sustituyentes,
constituido completa o predominantemente por fibras cortas debido a
numerosas degradaciones de la cadena o se contaminan con el empleo
de reactivos tóxicos.
Asimismo cuando se utiliza este SCS, a nivel de
laboratorio, para la microencapsulación de materiales biológicos,
las cápsulas prueban ser inestables y como no homogéneas en su
tamaño y espesor de la membrana. Se apreciaron también impactos
negativos considerables con la carga tóxica causada por el proceso
de fabricación sobre la viabilidad de las células encerradas, o mas
bien por la biocompatibilidad de las cápsulas.
Otro objeto del presente invento es por tanto
producir a partir de celulosa natural sulfatos de celulosa
claramente solubles con estructura molecular definida, así como
producir SCS biológicamente compatible completamente soluble en
agua con características de solubilidad mejoradas, que pueda
utilizarse como material auxiliar para uso biológico y medicinal, y
que pueda utilizarse especialmente para la inmovilización de objetos
biológicos activos en micro-cápsulas a partir de
membranas simplex.
A diferencia del método previamente descrito de
fabricación de productos finales el SCS producido de conformidad
con el invento se distingue, por ejemplo, por una gama de viscosidad
de solución ajustable definida, que puede obtenerse utilizando un
material de partida con grado de valor de polimerización (DP)
adecuadamente alto y controlando una lenta degradación de cadena
durante la fase homogénea del proceso de fabricación. El SCS, que
se produce con el método corrientemente descrito, a través de estas
características, resuelve los problemas previamente descritos
durante la micro-encapsulación de materiales
biológicos.
Básicamente las microcápsulas pueden dividirse
en tres categorías: esferas sólidas, esferas recubiertas y esferas
huecas.
Las esferas sólidas pueden producirse mientras
sustancias gelatinizantes (por ejemplo agarosa, gelatina) se
disipan en el agregado fluido como gotas y se enfrían por debajo de
su punto de fusión para solidificarlas. La matriz utilizada para
esferas sólidas presenta una combinación de, por ejemplo, alginato y
cloruro cálcico (CaCl_{2}) u otros iones de metal polivalente.
Las esferas huecas pueden producirse como esferas sólidas mediante
la instilación de la solución polimérica en un baño con iones con
carga contraria. Los iones con carga contraria utilizados no deben
penetrar las gotitas que se sumergen en estos en base de las
limitaciones de difusión. Por consiguiente tiene lugar la reacción
de enlace solo en la superficie superior de la gota, a través de la
cual se desarrolla una membrana estable entorno de un núcleo fluido.
Con la disolución de un núcleo enlazado o disolviendo el núcleo de
una esfera sólida puede también desarrollarse esferas huecas. Las
esferas revestidas pueden producirse a partir de esferas sólidas o
huecas mediante la deposición de una o varias capas adicionales, de
sustancias de formación complejas, que se obtienen de
poli-iones con cargas opuestas (por ejemplo PLL
(poli-L-lisina), Chitosan).
Existe una variedad de métodos y variaciones
técnicas correspondientes conocidas para la fabricación de
microcápsulas. En el caso mas simplex el goteo simplex de un fluido
que fluye a través de una cánula produce las cápsulas. La fuerza
del peso y el producto de la tensión interfacial y diámetro externo
de la cánula determina el tamaño de las gotas que gotean. Este
procedimiento es aplicable solo para cápsulas mayores de 1 mm pero
tiene solo una productividad limitada.
Con el proceso llamado Air-Jet,
también proceso Air-Stripping, una gota de fluido
eyectada gravimétricamente se lleva al final de una alimentación
capilar concéntrica a través de un flujo de gas laminar que fluye
entorno del capilar. Con este proceso puede reducirse el diámetro
de la gota.
Con el proceso Air-Knife el
chorro de fluido eyectado se rompe en finas gotitas mediante un
remolino turbulento de aire. Sin embargo ambos procedimientos
tienen una baja productividad de aproximadamente
0,1-2 ml/min.
En contraste al proceso Air-Jet,
en donde la formación de gotas se lleva a cabo puramente de forma
gravimétrica y por tanto no es apropiado para soluciones con alta
viscosidad, el proceso Jet-Cutter proporciona un
flujo constante de fluido con presión dada. El chorro de fluido se
disipa mecánicamenete utilizando un hilo giratorio. Las partículas
esféricas se crean a partir de cilindros de fluido separados con
interdependiendcia de la tensión superficial del flujo sobre una
ruta de caida correspondiente. Adverso a este proceso es el sistema
relativo al corte y desperdicio de pulverización.
Una formación de gotas con soporte
electrostático acelera la formación de gotas en el capilar a través
de la aplicación de un fuerte campo eléctrico entre el capilar y el
baño de integración, con lo que caen gotas sustancialmente pequeñas
del capilar como en el caso de goteo gravimétrico.
Durante el proceso de formación de gotas con la
ayuda de discos giratorios, se introduce un fluido acuoso en la
proximidad del punto medio de un disco de giro rápido y luego fluye
a través de la fuerza centrífuga que se crea en el borde del
disco. En el borde del disco la película de fluido se descompone en
pequeñas gotitas. La formación de gotas se mejora con la
heterodinación de una oscilación sobre el fluido.
Durante el proceso de formación de gotas con un
cilindro giratorio el fluido acuoso fluye a través de un cilindro
giratorio con aberturas definidas. La fuerza centrífuga facilita la
formación de gotas en el borde del cilindro, en donde el fluido se
transforma en pequeñas gotitas.
La formación de gotas a partir de chorros de
fluidos hace posible aumentar el volumen de flujo y por consiguiente
la productividad. Aquí pueden diferenciarse principalmente 3
métodos:
En el caso de proceso de corriente de inmersión
se inyecta una corriente de fluido a altas velocidades en otro
fluido. Debido a la alta fuerza de cizalladura el chorro se disipa
para formar finas gotitas, sin embargo con gran variación de
tamaños.
En el caso de proceso de vibraciones la
superimposición de una oscilación sinusoidal con frecuencia
apropiada disipa un chorro laminar de fluido que se eyecta de una
boquilla. El principio se retrotrae a Lord Rayleigh (Proc.
London Math. Soc 10(4), 4-13, 1878),
quien había dispuesto un flujo de fluidos no así viscosos, que
desintegrara un cilindro de fluidos, cuando aumenta la longitud de
onda de una oscilación rotacionalmente simétrica, como lo hace el
rango del chorro no perturbado. La longitud de onda óptima depende
del diámetro, la viscosidad dinámica, la densidad y la tensión
superficial del fluido.
En adición a este existen numerosos otros
métodos y modificaciones del método antes descrito. Renken y
Hunkeler dan una visión de este proceso (Renken A. y Hunkeler D.,
Microencapsulation: A review of Polymers and Technologies with a
Focus on Bioartificial Organs, Polimery, 43(9),
530-537 (1998)).
Todos estos métodos como se ha descrito antes
son apropiados para la producción de microcápsulas como se establece
en este invento.
Se utilizaron máquinas de encapsulación
(TE-50R) fabricadas por la compañía Inotech
(Dottikon, Siza) para la producción de microcápsulas, o sea a
partir de gotitas de SCS con distribución de tamaño homogénea.
Estas operan en base al proceso de vibración antes descrito. Para
uso biomédico todas las etapas de proceso citadas en esta
descripción pueden también llevarse a cabo bajo condiciones
estériles. Una descripción de una máquina de encapsulación de esta
índole y la funcionalidad puede hallarse, por ejemplo, en la EP 1
062 032 B1.
De conformidad con Lord Rayleigh, durante el
proceso de encapsulación, se suministra una solución acuosa de SCS
a partir de un contendor de almacenamiento a través de una boquilla
con la ayuda de presión de aire constante o una bomba peristáltica
o propulsión lineal con el fin de generar un chorro de fluido
constante. De este modo puede ajustarse un flujo de volumen
constante y por consiguiente pueden generarse cápsulas de igual
calibre. Dependiendo de la solubilidad y viscosidad de solución,
que se acondiciona mediante las características químicas del SCS
según el invento, que es ajustable libremente para una boquilla dada
dentro de una amplia gama, es posible una alta velocidad de
trabajo. Pueden utilizarse flujos de volumen en el rango de
1-15 ml/min, de preferencia 6-9
ml/min dependiendo de del capilar de eyección.
Dependiendo de la finalidad la solución acuosa
el SCS puede contener componentes adicionales en diferentes partes.
Para esto el material encapsulado es el primer considerando. En
adición a esto pueden adicionarse componentes adicionales en
proporciones variables (por ejemplo substrato, agente anticongelante
(por ejemplo glicerina, DMSO) proteínas, disolventes o sal, como,
por ejemplo NaCl al 0,9%) o el SCS puede disolverse directamente en
soluciones especiales (por ejemplo medio de cultivo celular).
Un transmisor de vibraciones crea y transmite
una vibración sinusoidal vertical fluyendo a través de la boquilla
en un rango variable de 100 a 4000 Hz. Para la producción de
microcápsulas se utilizan de preferencia frecuencias de en el rango
de 600 a 3000 Hz. En adición a la frecuencia puede variarse también
la amplitud de la vibración entre 0 y 100%. Con esta vibración
vertical que se crea puede obtenerse la disipación del chorro de
fluido eyectado en gotitas con el mismo volumen. Principalmente
con la vibración sinusoidal vertical puede obtenerse la producción
de un tamaño de cápsula definido.
Con el fin de impedir la colisión de las gotitas
durante la fase de vuelo se crea un desplazamiento de carga en el
chorro eyectado de fluido aplicando un alto voltaje, en el rango de
0,8 a 1,5 kV, entre la boquilla y un electrodo con carga positiva
(ánodo). Haciendo pasar una corriente a través de un brazo de
voltaje las gotitas con carga negativa, que están polarizadas
negativamente sobre la boquilla, son llevadas en la dirección del
ánodo y así dirigidas horizontalmente.
Las gotitas aniónicas resultantes desarrollan en
su superficie una membrana simplex en forma de carcasa que circunda
un núcleo de fluido no acomplejado; la carcasa se forma a través de
la acomplejación del poli-electrolito aniónico
contenido en la gotita con el poli-electrolito
catiónico (por ejemplo pDADMAC) contenido en el baño de
acomplejación sobre la interfase de fase de la gotita. El espesor
de la membrana aumenta con la duración que permanece en la solución
acuosa del catión polimérico.
El baño de acomplejación consiste en una
solución acuosa de un catión polimérico con diferentes pesos
moleculares. La estabilidad de la membrana simplex que se forma se
determina de esta forma mediante las características químicas
(grupos funcionales, número y distribución de los sustituyentes).
Para el proceso de encapsulación son apropiados, por ejemplo,
dodecilamina, etilendiamina, piperacina, azul de metileno, arginina,
poli(clorhidrato de alilamina), trietilamina o espermina.
Se utilizan de preferencia polímeros con grupos de amonio
cuaternarios, mas preferentemente sales de polidialildimetil
amonio) o poli(vinilbenciltrimetil amonio), preferentemente
cloruro de poli(dialildimetil amonio) (pDADMAC) o cloruro de
poli(vinilbenciltrimetilamonio).
El nivel de integración, o sea la estabilidad de
las microcápsulas creada se correlaciona adicionalmente con la
longitud de la cadena del policatión utilizado. El peso
molecular medio puede encontrarse en el rango de 10.000 a 500.000,
de preferencia entre 15.000 y 50.000 en el caso de pDADMAC. La
concentración apropiada de pDADMAC para la encapsulación está en el
rango de 0,5-5% (peso/v), de preferencia en el rango
de 0,8-2% (p/v).
La solución de policatión acuosa puede contener
componentes adicionales en proporciones variables dependiendo de la
finalidad, por ejemplo sustancia, que reduce la tensión superficial
de la solución acuosa, disolventes orgánicos, agentes
anti-congelación (glicerina, DMSO) o sal, como, por
ejemplo NaCl al 0,9% o el policatión puede disolverse directamente
en soluciones especiales (por ejemplo medio de cultivo).
En el baño de acomplejación existe un agitador
magnético, que crea una corriente vertical hacia la dirección de
caida de las gotas y así transporta las gotitas que se forman fuera
de la región en donde están cayendo las nuevas gotas de modo que se
minimiza el riesgo de una agregación de microcápsulas no todavía
completamente formadas. Además el agitador mantiene las gotitas en
flotación, lo que es ventajoso para la convección de la reacción
formadora de membrana y también la etapa de lavado
subsiguiente.
Para la producción de microcápsulas de
conformidad con el invento ha de protegerse en primer lugar una
solución acuosa de SCS. La solución de SCS debe tener una
concentración entre 1% y 4% (p/v), de preferencia entre 1,5% (p/v)
y 3% (p/v). Dependiendo de la fuerza de cizalladura de los
parámetros apropiados pueden leerse de un diagrama de viscosidad.
Así pues, por ejemplo, una solución al 1% del SCS, según el invento,
debe exhibir una viscosidad de solución en el rango de 10 a 500
mPas, de preferencia de 10 a 200 mPas, mas preferentemente entre 15
y 80 mPas, mas preferentemente entre 20 y 50 mPas o entre 40 y 60
mPas.
De conformidad con una modalidad el SCS,
fabricado de conformidad con el invento, adopta básicamente forma
de partículas esféricas, o sea microcápsulas en el sentido de la
invención exhibiendo un diámetro de of 0.1-50
\mum, 1-100 \mum, 50-250 \mum,
50-500 \mum, 100-250 \mum,
100-500 \mum, 250-500 \mum,
250-700 \mum, 500-1000 \mum,
700-1500 \mum, 1000-2500 \mum,
1500-3000 \mum, 2500-4000 \mum,
3000-5000 \mum. Las microcápsulas exhiben de
preferencia un diámetro de 200-1500 \mum, mas
preferentemente de 600-800 pm.
Para uso biomédico la solución de SCS, creada a
partir del SCS generado de conformidad con el invento, puede
esterilizarse con métodos corrientes, por ejemplo a través de
radiación radioactiva. La estabilidad del SCS generado de
conformidad con el invento se autoprobó durante la esterilización en
vapor durante 30 minutos a 121ºC.
El SCS producido de conformidad con el invento
es particularmente apropiado para producir microcápsulas mas
estables y mas homogéneas. Estas microcápsulas son apropiadas para
abarcar objetos biológicos, por ejemplo bacterias, virus,
levaduras, células y tejido para uso biomédico, pero también para la
producción de ingredientes farmacológicamente activos en escala
biotecnológica. Estos pueden utilizarse también para la
inmobilización de ingredientes farmacológicamente activos, por
ejemplo catalizadores en polvo, coloides, complejos metálicos,
enzimas anticuerpos, colorantes y pigmentos para uso técnico.
Las cápsulas producidas de conformidad con el
invento son así especialmente apropiadas para uso en medicina
veterinaria y humana, debido a que reunen las altas exigencias como
se expone a continuación.
Para el uso de microcápsulas en el sistema
circulatorio sanguíneo o en tejido animal o humano, o sea órganos,
por ejemplo para el tratamiento de cáncer, es necesario que las
microcápsulas sean correspondientemente uniformes y reproducibles
en una variedad de tamaños de modo que por una parte pueda evitarse
la congestión/bloqueo de la cánula de inyección y/o vasos
sanguíneos. Además puede garantizarse la aplicación de una cantidad
constante de agentes encapsulados por cápsula (por ejemplo
ingredientes farmacológicamente activos, enzimas, número de células
por cápsula). La geometría esférica de las cápsulas garantiza un
buen flujo, por ejemplo en catéteres y uno igual en todas las
direcciones y liberación ideal de los ingredientes
farmacológicamente activos.
Además, la ligera compresibilidad de las
cápsulas es útil debido a que reduce las posibilidades de que la
cápsula quede adherida y por tanto el bloqueo del catéter, por
ejemplo con cápsulas comprimidas. Un menor espesor sobre la
superficie superior de la cápsula, especialmente en fluidos
biológicos, impide la aglomeración de la cápsula. El SCS, que se
ha producido con el método descrito en el invento anterior, en base
de la viscosidad de solución ajustable permite una manipulación sin
complicaciones y una velocidad inesperadamentee elevada del trabajo
durante la encapsulación de materiales biológicos, siendo esto
especialmente ventajoso para la fabricación industrial de
compuestos farmacéuticos basados en microcápsulas.
Ventajas y aplicaciones adicionales del invento
se han descrito mas adelante en base de ejemplos que se han llevado
a cabo con respecto a las figuras:
La figura 1 muestra una medición microscópica de
la distribución de tamaños de las cápsulas de SCS con diferentes
tamaños deseados (figura 1 A-D) fabricado en
diferentes partidas utilizando el encapsulador Inotech
IE-50R y un Zeiss Axiovert para la determinación de
la distribución del tamaño de la cápsula. En cada caso la solución
de SCS así como la solución de pDADMAC comprendió 1% de NaCl (p/v).
La amplitud de la oscilación de las boquillas ascendió a 100% cada
vez. Los otros parámetros variables se ajustaron como sigue.
Con la elección de los parámetros apropiados
para la producción de cápsulas puede obtenerse una amplia gama de
tamaños para las microcápsulas que se producen. El ancho de banda
oscila entre 10 y 5000 \mum dependiendo de la viscosidad de
solución ajustable del SCS producido de conformidad con el invento.
Las microcápsulas de todos los tamaños probados que se forman
exhiben una geometría esférica casi perfectamente ideal y un alto
nivel de reproducibilidad.
La Figura 2, como en la figura 2a y 2b, muestra
el comportamiento de crecimiento de las células HEK 293 en cápsulas
de SCS en varios puntos en el tiempo. Para ello las cápsulas se
cultivaron en medio DMEM con una glucosa al 4,5% (p/v) (Gibco,
Glawsgow) y 10% de suero vacuno fetal (FCS) (Gibco, Glasgow) durante
un periodo de tiempo de 36 días. En varios momentos se tomaron
partes alícuotas.
La Figura 2a muestra cualitativamente, desde la
izquierda arriba a la derecha abajo, el aumento en el número de
células en las microcápsulas, para lo cual se tomaron muestras los
días 1, 2, 3, 7, 14 y 21 después de encapsulación. Una solución de
SCS acuosa (2% p/v) utilizada para encapsulación contuvo
inicialmente 2 x 10^{6} células/ml y en adición 1% de NaCl (p/v).
Otros parámetros para encapsulación fueron:
Concentración de la solución de pDADMAC: 1,1%
(p/v), diámetro deseado de la cápsula: 600 \mum, diámetro de las
boquillas: 200 \mum, volumen corriente: 6,1 ml/min, amplitud:
100%, Frecuencia: 900 Hz y voltaje de dispersión:
1100 V.
1100 V.
La Figura 2b muestra el comportamiento de las
células HEK293 encapsuladas en las cápsulas con un diámetro deseado
de 600 a 1200 \mum bajo aplicación de la prueba MTT (Roche,
Mannheim) para células inmobilizadas vivientes. Para esto las
cápsulas ese cultivaron en matraces de cultivo
T75-cell durante un período de tiempo de 36 días.
Los parámetros para la encapsulación en cápsulas de 600 \mum (- -)
corresponde a los descritos en la figura 2a. Para la encapsulación
en cápsulas de 1200 \mum (- -) se utilizaron los parámetros
siguientes: La solución de SCS al 2% utilizada para encapsulación
contuvo inicialmente 1,5 x 10^{6} células/ml y en adición 1% de
NaCl (p/v). Otros parámetros para la encapsulación fueron:
Concentración de la solución de pDADMAC: 2,5%
(p/v), diámetro de las boquillas: 300 \mum, volumen corriente:
12,9 ml/min, amplitud: 100%, frecuencia: 600 Hz y voltaje de
dispersión: 1200 V.
Ambas curvas no pueden compararse directamente,
pero ambas muestran un comportamiento de crecimiento logarítmico
ideal de las células HEK 293. Esta confrontación muestra que ninguno
de los SCS acomplejados, ni el SCS no acomplejado dentro de la
cápsula tienen un efecto citotóxico o una influencia negativa sobre
las células encapsuladas.
La Figura 3 muestra una vista microscópica de
las cápsulas de SCS, que contienen células HEK 293, después de la
profunda congelación y descongelación. Las cápsulas se cultivaron
durante 21 días en medio DMEM con 4,5 g/l de glucosa (Gibco,
Glasgow) y 10% de suero vacuno fetal (Gibco, Glasgow) antes de la
congelación profunda. La congelación intensa se llevó a cabo en
medio DMEM con DMSO al 10% (v/v). Después de un periodo de
incubación de 2 horas se enfriaron las cápsulas hasta -80ºC. El
proceso de descongelación se llevó a cabo bajo ligera agitación a
38ºC en un baño de agua. Para un cultivo ulterior el medio DMSO se
sustituyó repetidamente por medio DMEM recién preparado con el fin
de eliminar el exceso de DMSO. Por medio de la prueba MTT es
posible identificar que las células inmobilizadas han supervivido
al proceso de congelación y descongelación a pesar de la alta
densidad de las células dentro de la cápsula y que estas pueden
cultivarse posteriormente. Después de la descongelación permaneció
intacta la estructura macroscópica de la membrana y la geometría de
la cápsula.
La Figura 4 muestra el espectro de RMN ^{13}C
de la partida b2 del ejemplo 1b2. Como resultado de la sustitución
regioselectiva del grupo hidroxilo por un grupo sulfato en la
posición C_{6}, la señal se desplazó de 60 a 67 ppm. No pudo
detectarse grupos acetato o cualquier sustitución de grupos sulfato
en posiciones C_{2} o C_{3}. El valor DS determinado (DS_{6}
= 0,4) muestra buena concordancia con el valor DS calculado de la
determinación de azufre.
Las modalidades o ejemplos que siguen no deben
tomarse como limitaciones del invento. Además en el contexto de la
descripción los ejemplos o modalidades de estas variaciones,
elementos y combinaciones se han hecho sin limitación, las cuales
en combinación o modificación de si mismas tienen las
características contenidas en la descripción general, en los
ejemplos, las reivindicaciones o los diagramas si bien o aún cuando
en estas combinaciones o características o cambios no se muestren o
describan explicitamente en una modalidad, sino que conduzcan a un
sujeto modificado o a nuevas etapas en el proceso, o sea una nueva
secuencia o etapas de proceso.
Ejemplo
1a
Se administra 10,7 g de celulosa de contenido
seco del 93,73% (linters de algodón con un Cuoxam-DP
de 1230) a 333 ml de dimetilformamida (DMF). Se hincha la celulosa
a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 14 horas.
Se inicia la esterificación mixta, después de
hinchado con éxito, adicionando la mezcla reaccional, que está
constituida por 8 ml/mol de unidad de anhidroglucosa (AGU) de
anhídrido de ácido acético (47 ml) como agente acetilante y 0,7
mol/mol de ácido clorosulfónico AGU (2,9 ml) como agente sulfatante
así como 100 ml de DMF. La síntesis se lleva a cabo a una
temperatura de 50ºC. La celulosa empieza disolverse y después de
unas 3 horas se dispone de una solución de polímero transparente
claro.
Después de 5 horas se lleva a cabo la
neutralización/precipitación bajo agitación constante mediante lento
vertido de la solución de polímero (dentro de aproximadamente 15
minutos) en un medio de neutralización/precipitación, que está
constituido por 42,9 g de hidróxido sódico (NaOH), 80 g de H_{2}O
y 20 g de acetato sódico completado hasta 1,5 l con etanol y tiene
de preferencia la temperatura ambiente. Después de haberse
completado el vertido de la solución polimérica en el medio de
neutralización/precipitación se agita durante otra 1 hora. A
continuación se filtra y se lava tres veces, cada vez con 600 ml de
solución de lavado constituida por 4% (peso/peso) de acetato sódico
en mezcla de etanol-agua (1:1, w/w).
A continuación se lleva a cabo la desacetilación
con la adición de 333 ml de reactivo desacetilante (13 g de NaOH,
27 g de H_{2}O completado con 333 ml de etanol). Se agita la
mezcla durante alrededor de 1 hora y se deja reposar durante unas
12 horas. La neutralización de la mezcla se lleva a cabo ajustando
el valor pH hasta 8,0 con una mezcla de ácido
acético-etanol (1:1, p/p). A continuación se lava
tres veces con 1 l de etanol. Se seca a 40ºC en vacío.
La proporción y la cantidad de agentes
acetilante y sulfatante utilizados dependen de la sustitución
regioselectiva deseada en las posiciones C_{2}, C_{3} y
C_{6}. Los expertos en el arte conocen las proporciones
apropiadas de la mezcla. El SCS obtenido es claramente soluble en
agua y tiene un DS = 0,33 y una viscosidad de 25 mPas en una
solución acuosa al 1%.
Los métodos que siguen se utilizaron para
caracterización analítica del sulfato de celulosa de conformidad
con el invento:
Después de combustión cuantitativa de las
muestras de SCS se determinaron los elementos C, H, N y S en % por
medio de análisis elemental (equipo de Carlo Erba), en donde se
calcula el grado de sustitución de grupos de éster sulfato a partir
del contenido de azufre (teniendo en cuenta el contenido de humedad
de la preparación) de conformidad con
DS_{sulfato} \
= \ 162 \ x \ % \ S/(3200 - 102 \ x \ % \
S)
El análisis se realizó después de pulpado
especial de la celulosa y derivados de celulosa por medio de
ICP-OES (Inductively Coupled
Plasma Optical Emission Spectrometry;
Perkin Elmer).
El grado parcial de sustitución en las
posiciones individuales del AGE se calcula a partir del espectro de
RMN ^{13}C de soluciones de sulfato de celulosa sódico en D_{2}O
integrando las áreas de señal y comparando los integrales
superficiales de SCS sustituido y no sustituido. Los espectros de
midieron utilizando un espectrómetro Bruker MSL 400 a una
frecuencia de 100,63 MHz, en donde se utilizó tetrametilsilano como
una referencia para el desplazamiento químico.
En adición a la evaluación óptica de soluciones
acuosas al 1% del sulfato de celulosa sódico, se mide el valor de
turbidez a un ángulo de 90º en un turbidímetro tipo 2100AN
(Hach-Lange GmbH, Düsseldorf, Alemania) en NTU
(Nephelometric Turbidity Units).
La viscosidad cinemática de soluciones acuosas
al 1% del sulfato de celulosa sódico se mide a 25ºC en un
viscosímetro capilar automático Viscoboy 2 + SAE/KM2 (Lauda,
Alemania). Las viscosidades se dan en mPas después de conversión
utilizando la densidad.
Ejemplo 1.b1 y
1.b2
Se adiciona lentamente 21.1 g de linters de
algodón (contenido en seco al 94,86%, DP = 1264) a 550 ml de DMF
(dimetilformamdia) bajo agitación constante a 80ºC durante 8 horas,
se enfría hasta temperatura ambiente (TA) y se agita durante 12
horas mas. Después de hinchamiento se inició una esterificación
mixta adicionando la mezcla de reactivo constituida por 8 mol/mol
de unidades de anhidroglucosa (AGU) de anhídrido de ácido acético
(93 ml) 0,9 mol/mol de AGU de ácido clorosulfónico (7,4 ml) hasta un
volumen total de 200 ml con DMF. La mezcla reactiva se adicionó
luego rápidamente a la solución de celulosa a 50ºC mientras se
agitaba con rapidez. Como resultado de la formación de sulfato de
acetato de celulosa se obtuvo una solución de polímero transparente
amarillenta después de aproximadamente 1 hora y media. Después de
4,5 h se dividió la partida en dos porciones. La mitad de la
solución polimérica se extrajo y se adicionó al medio de
neutralización y precipitación, constituido por 42,9 g de NaOH, 80
g de H_{2}O y 20 g de acetato sódico completado hasta un volumen
de 1,5 l con etanol (b1). La otra mitad (b2) se agitó durante 3
horas y media a 50ºC y luego se adicionó al medio de neutralización
y precipitación. Después de producirse la precipitación se
filtraron ambas partidas por separado y se lavaron tres veces con
600 ml de solución de lavado (4% de acetato sódico (p/p) en mezcla
de etanol-agua (1:1, w/w)). Se inició la
desacetilación adicionando 333 ml de un reactivo de desacetilación
(13 g de NaOH, 27 g de H_{2}O completado hasta un volumen de 333
ml con etanol). Ambas partidas se agitaron durante 1 hora y se
dejaron reposar durante 12 horas a temperatura ambiente. Se ajustó
el pH utilizando una mezcla de ácido acético-etanol
(1:1, p/p). Ambos preparados de sulfato de celulosa se lavaron
luego tres veces con 1 l de etanol en cada caso y se secaron a 40ºC
en vacío. Las propiedades del SCS obtenido se dan en la Tabla aa.
La figura 4 muestra el espectro de RMN ^{13}C de la partida b2.
Como resultado de la sustitución regio-selectiva del
grupo hidroxilo por un grupo sulfato en la posición C_{6}, la
señal se desplaza de 60 a 67 ppm. No pudieron detectarse grupos
acetato ni ninguna sustitución de grupos sulfato en las posiciones
C_{2} o C_{3}. El valor DS determinado (DS_{6} = 0,4)
muestra buen acuerdo con el valor DS calculado de la determinación
de azufre.
Ejemplo 1.c1 y
1.c2
Como se ha descrito en el ejemplo 1b se
prepararon dos formulaciones de SCS diferentes utilizando diferentes
productos químicos de partida. El pesado o adición de los
productos químicos se llevó a cabo utilizando espátulas de metal.
Se utilizó un agitador de metal para el proceso de precipitación.
En la partida c2 solo se utilizaron productos químicos con
contenidos de metal extremadamente bajos. En adición se evitó
durante la síntesis cualquier contacto con equipo conteniendo metal
tal como agitadores, espátulas, etc. El análisis de los contenidos
de metal pesado de ambas formulaciones se ofrece en la Tabla bb.
Ejemplo
1.d1
Se sigue el mismo procedimiento que en el
ejemplo 1b a excepción de que en lugar de linters de algodón se
utilizó un polvo de celulosa molido Arbocell M80 de Rettenmayer
(Alemania). Se convirtió cuoxam (DP = 750, contenido en seco =
94,16%) con 11 mol/mol de unidades de anhidroglucosa (AGU) de
anhidrido de ácido acético y 1 mol/mol de AGU de acido
clorosulfúrico en 200 ml de DMF. Después de la desacetilación se
purificó el producto obtenido mediante diálisis y subsiguiente
liofilización. El sulfato de celulosa sódico soluble claro (SCS)
obtenido en agua tuvo un DS = 0,49 y una solución acuosa al 1% tuvo
una viscosidad de 15 mPas.
Ejemplo
1.d2
Se utilizaron linters de algodón como en el
ejemplo 1a pero en su lugar se utilizaron 11 mol/mol de unidades de
anhidroglucosa (AGU) de anhídrido de ácido acético y 1,1 mol/mol de
AGU de ácido clorosulfónico en 200 ml. El sulfato de celulosa
sódico soluble claro (SCS) obtenido en agua tiene un DS = 0,57 y una
solución acuosa al 1% tiene una viscosidad de 120 mPas.
Ejemplo 1.e1 y
1.e2
Se produjo sulfato de celulosa sódico (SCS) como
se ha descrito en el ejemplo 1a. Adicionalmente se llevaron a cabo
las etapas de síntesis después de la desacetilación como se describe
en el ejemplo a1 pero para el ejemplo e2 esto se llevó a cabo en
una caja laminar para la comparación del grado de contaminación.
Los resultados se exponen en la Tabla dd.
La prueba de esterilidad se llevó a cabo de
conformidad con la recomendación de la "European Farmacopoeia
4" en el medio líquido "thioglycollate medium" para
microorganismos anaeróbicos y "trypticase soy broth" para
micro-organismos aeróbicos. En adición se utilizó
también el medio líquido bajo nutriente "1/4 strength peptone
yeast extract broth". Después de la preparación del medio
nutriente se virtió 10 ml de una vez en viales con tapón roscado.
Estos se sometieron luego a autoclave a 121ºC. Cada vial se inoculó
con 1 ml de muestra y luego se controló la temperatura durante 14
días a 28ºC. Cada prueba se llevó a cabo utilizando una doble
formulación. Como control estéril se utilizó bajo las mismas
condiciones dos viales no inoculados de cada medio.
Estos viales en los que se observó la turbidez o
sedimento se calificaron como contaminados. La muestra e2, que se
preparó bajo condiciones estériles no mostró turbidez o sedimento y
se consideró exenta de bacterias.
Ejemplo
1.f
Se adicionaron 10,7 g de linters de algodón (TG
= 93,9%, DP = 1351) a 230 ml de DMF y como se ha descrito en el
ejemplo 1a y se dejaron hinchar mientras se agitaba continuamente
durante 8 horas. La temperatura de partida se ajustó a 80ºC.
Después de enfriamiento hasta temperatura ambiente se mantuvo la
mezcla sin agitación durante 12 horas mas. Después de tener lugar
el hinchamiento se inició esteriicaicón mixta con la adición de
mezcla reaccional. La mezcla reaccional se produjo por separado
mediante enfriamiento y agitación adicionando de forma sucesiva 11
mol/mol de unidades de anhidroglucosa (AGU) de anhídrido de ácido
acético (64 ml) y 1 mol/mol de AGU de ácido cloruro de sulfurilo (5
ml) hasta 100 ml de DMF. La mezcla reaccional se adicionó luego
rápidamente a la celulosa mientras se agitaba de forma continua. A
continuación la temperatura de reacción se llevó hasta 50ºC.
Después de 6 horas tuvo lugar la neutralización y precipitación
mediante la lenta adición (en unos 15 minutos) - todavía con
agitación continua - de la solución polimérica al medio de
neutralización y precipitación, constituido por 42,9 g de NaOH, 80
g de H_{2}O y 20 g de acetato sódico completado hasta un volumen
de 1,5 l con etanol y que tiene de preferencia la temperatura
ambiente. Después de adicionarse la solución polimérica al medio
de neutralización y precipitación se agitó el conjunto durante una
hora mas. A continuación se filtró la formulación y se lavó tres
veces con 600 ml en cada caso utilizando una solución de lavado (4%
peso/peso) de nitrato sódico y una mezcla de
etanol-agua (1:1, p/p). La desacetilación se
produjo con la adición en cada caso de 333 ml de reactivo de
desacetilación (13 g de NaOH, 27 g de H_{2}O completado hasta un
volumen de 333 ml con etanol). Se agitó la formulación durante 1
hora y se dejó reposar durante unas 12 horas a temperatura
ambiente. Luego se ajustó el pH a 8,0 utilizando una mezcla de
ácido acético-etanol (1:1, p/p). Luego se lavó la
formulación tres veces con 1 l de etanol y se secó a 40ºC en vacío.
El SCS resultante tuvo un contenido de azufre de 6,49%, lo que
resultó en un grado de sustitución DS = 0,51. El valor DS
determinado con el empleo de RMN (DS_{total} = DS_{C6}) fue de
0,55. Una solución acuosa al 1% tuvo una viscosidad de 40 mPas
(mm^{2}/s).
Ejemplo
1g
Se sigue el mismo procedimiento que en el
ejemplo 1f a excepción de que se utiliza como disolvente 250 ml de
N-metil-2-pirrolidona
(NMP). Se inició la esterilización mixta, después del hinchamiento
con la adición de la mezcla reaccional, que consiste en 11 mol/mol
de unidades de anhidroglucosa (AGU) anhídrido de ácido acético (64
ml) como agente acetilante y 0,5 mol/mol de AGU ácido amidosulfúrico
(2,9 ml) como agente sulfatante y 100 ml de
N-metil-2-pirrolidona
(NMP). La síntesis se llevó a cabo a una temperatura de 70ºC. La
precipitación, desacetilación, lavados y secado del producto se
lleva a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1f. El SCS soluble
claramente en agua tiene un contenido de azufre de 5,12% (DS =
0,31). El valor DS determinado utilizado RMN (DS_{total} =
DS_{D6}) resultó en 0,33. Una solución al 1% tiene una viscosidad
de 12 mPas.
Ejemplo
1h
Se sigue el mismo procedimiento que en el
ejemplo 1f a excepción de que se utiliza como disolvente 350 ml de
N,N-dimetil acetamida (DMAc). Se inició la
esterilización mixta, después del hinchamiento con la adición de la
mezcla reaccional, que consiste en 11 mol/mol de unidades de
anhidroglucosa (AGU) anhídrido de ácido acético (64 ml) como agente
acetilante y 0,9 mol/mol de AGU ácido sulfúrico (3 ml, 98% de
H_{2}SO_{4}) como agente sulfatante y 150 ml de DMAc. La
síntesis se llevó a cabo a una temperatura de 70ºC. La
precipitación, desacetilación, lavados y secado del producto se
lleva a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1f. El SCS soluble
claramente en agua tiene un contenido de azufre de 6,93% (DS =
0,45). El valor DS determinado utilizado RMN (DS_{total} =
DS_{D6}) resultó en 0,33. Una solución al 1% tiene una viscosidad
de 5 mPas.
\newpage
Ejemplo
1i
Se sigue el mismo procedimiento que en el
ejemplo 1f a excepción de que se utiliza como disolvente 350 ml de
N,N-dimetil acetamida (DMAc). Se inició la
esterilización mixta, después del hinchamiento con la adición de la
mezcla reaccional, que consiste en 6 mol/mol de unidades de
anhidroglucosa (AGU) cloruro de acetilo (29 ml) como agente
acetilante y 1,5 mol/mol de AGU ácido sulfúrico (4,9 ml) como agente
sulfatante así como 150 ml de DMAc. La síntesis se llevó a cabo a
una temperatura de 70ºC. La precipitación, desacetilación, lavados
y secado del producto se lleva a cabo como se ha descrito en el
ejemplo 1f. El SCS soluble claramente en agua tiene un contenido
de azufre de 10,73% (DS = 0,82). Una solución al 1% tiene una
viscosidad de 5 mPas y un valor de turbidez de 2,5 NTU.
Ejemplo
1j
Se sigue el mismo procedimiento que en el
ejemplo 1f a excepción de que se utiliza como disolvente 350 ml de
NMP. Se inició la esterilización mixta, después del hinchamiento con
la adición de la mezcla reaccional, que consiste en 6 mol/mol de
(AGU) cloruro de acetilo (29 ml) como agente acetilante y 1,5
mol/mol del complejo AGU SO_{3}/DMF (14 g, que se encuentra en el
comercio como complejo 1:1) como agente sulfatante así como 150 ml
de NMP. La síntesis se llevó a cabo a una temperatura de 60ºC. La
precipitación, desacetilación, lavados y secado del producto se
lleva a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1f. El SCS soluble
claramente en agua tiene un contenido de azufre de 9,83% (DS =
0,72). Una solución al 1% tiene una viscosidad de 12 mPas y un
valor de turbidez de 6,6 NTU.
De conformidad con los métodos conocidos (Método
AirJet; Método JetCutter; Método de vibración) para la preparación
de microcápsulas (Orive et al., 2004, Trends Biotechnol, 10
22 (2): 87-92), se adicionó a gotas la solución de
celulosa-sulfato para acomplejado en una solución de
policatión (por ejemplo pDADMAC) con la ayuda de un dispositivo de
encapsulación (Inotech, Modelo IE-50R).
La inmersión de una gota de
celulosa-sulfato en una solución acuosa agitada de
un policatión (pDADMAC) conduce a la formación de una membrana
semi-permeable en la interfase de fase a través de
una reacción de acomplejación que se desarrolla de modo espontáneo,
la cual ubica un núcleo de líquido no acomplejado. Con el progreso
del tiempo de reacción aumenta la consistencia de la membrana a
través de la difusión del policatión en la membrana capsular
durante tiempo, hasta que la densidad de la formación de red
tri-dimensional crea una barrera de difusión para
el polielectrolito.
Para obtener las cápsulas se genera una solución
acuosa homogénea de SCS con una concentración de
celulosa-sulfato de 1,5-3,5% (p/v).
El SCS utilizado para esto tiene un grado de sustitución (DS) entre
0,3 y 0,99. Esta solución de SCS se adiciona gota a gota en una
solución de pDADMAC a 0,8-2% (p/v) con una velocidad
de flujo laminar de 1-15 ml/min a través de una
boquilla de 100-300 \mul. Debido a la baja
viscosidad estructural con una alta tensión superficial al mismo
tiempo de la solución SCS según el invento es posible una alta
velocidad operativa. La formación de gotas y el tamaño de la gota
se determina por uno mediante el flujo de volumen, las
características de fluido físicas, la selección del diámetro de la
boquilla y, en el caso del método de vibración también por la
frecuencia de excitación y la amplitud de la frecuencia, con lo que
se controla la descomposición del chorro de líquido en gotas. Esta
frecuencia se estableció en 600-1100 Hz, con el fin
de generar microcápsulas esféricas con un diámetro de alrededor de
650-700 \mum. El aumento de la frecuencia
resulta en menores tamaño de la cápsula, y el tamaño se vuelve mayor
si desciende la frecuencia. De preferencia una frecuencia de 650
Hz se elige para generar cápsulas con un tamaño medio de 700 \mum
de diámetro con una boquilla de 250 \mum. Para generar cápsulas
con un tamaño medio de 500 \mum ha de seleccionarse una
frecuencia de 1100 Hz y una frecuencia de 500 Hz para generar
cápsulas con un tamaño medio de 800 \mum. Es posible una sintonía
fina modulando los otros parámetros.
Además, el tamaño de las cápsulas se ve también
influenciado por la reacción del sulfato de celulosa con el
pDADMAC. Mayor tiempo de reacción, altas concentraciones y bajo
peso molecular del pDADMC reducen el tamaño de la cápsula. Podría
mostrarse que las microcápsulas simplex, que se preparan con el SCS
según el invento, muestran una geometría esférica reproducible y
cuasi ideal y al mismo tiempo un bajo tamaño de dispersión (figura
1).
El procedimiento de fabricación de microcápsulas
de SCS incluye como las etapas importantes (a) la preparación de la
solución de SCS, (b) la preparación de la suspensión de células de
SCS, (c) la conversión de las cápsulas en gotas, (d) la formación
compleja en el baño de acomplejación y (e) la terminación de la
reacción formadora del complejo.
El SCS de conformidad con el invento se disuelve
primero en solución de sal fisiológica tamponada
(0,8-1,0% (p/v) en una concentración de
1,5-3,5% (p/v) bajo agitación a temperatura ambiente
y el valor pH se ajusta a 7,2 con NaOH 0,1N o HCl 0,1N. La
solución de SCS preparada se somete a autoclave a 121ºC antes de
mezclarse con las células.
Para la encapsulación de las
SCS-cápsulas se utilizan
HEK293-células (ATCC CRL-2828),
Jurkat-células (ATCC TIB-152) o las
HIT-células (ATCC CRL-1777). Sin
embargo, en principio, puede utilizarse una serie de células
adherentes así como de suspensión. Los cultivos de células se
multiplican exponencialmente en métodos de cultivo de células
convencionales, por ejemplo en T75-Lasks o botellas
rodillo y se cosechan después de la formación de una
mono-capa de 90% de confluencia. Las líneas
celulares utilizadas se incuban en medio DMEM con 4,5 g/l de
glucosa (Gibco, Glasgow, UK) con suero vacuno fetal al 10% (Gibco,
Glasgow, UK). Las células liberadas se transfieren en un tubo
Falcon de 50 ml, se centrifugan durante 5 minutos a 200 g y el flujo
sobrenadante se descarta. La pella de células se lava luego
cuidadosamente con el tampón PBS y por último se integran en
solución de SCS, se suspenden homogéneamente en solución de SCS,
transfieren a una jeringa estéril y a continuación se conectan bajo
condiciones estériles, a la unidad de encapsulación equipada con
todas las conexiones de conducción y recipientes, que se someten a
autoclave. El proceso de encapsulación se inicia directamente
después.
Para la encapsulación se aumenta primero la
velocidad hasta una extensión tal que fluya una corriente líquida
uniforme del capilar; luego puede reducirse el flujo de volumen a la
velocidad óptima para una conversión de gotas. La suspensión de
células de SCS de desecho, convertida en gotas hasta este momento,
se intercepta mediante un tanque de captación orientable antes de
caer en un baño de endurecimiento, que se orienta hacia el lateral
después de la formación de un chorro de líquido uniforme (fase
estable), de modo que pueda tener lugar la formación de cápsulas.
Las microcápsulas generadas pueden bombearse de modo continuo del
área de reacción y deben lavarse o diluirse con solución salina
tamponada fisiológica, PBS (solución salina tamponada de fosfato) o
medio de cultivo, con el fin de eliminar el pDADMAC no acomplejado.
Todas las etapas pueden realizarse bajo condiciones estériles.
A continuación sobre un lugar de trabajo
estéril, se toma el fluido sobrenadante del recipiente colector por
medio de una pipeta, después que las cápsulas se han sedimentado y
se sustituye por el medio de cultivo. Directamente después se
cultivan las células encapsuladas en matraces T o en botellas
rodillo a 37ºC, CO_{2} al 5%, humedad saturada y 2 rpm. Después
de 4 a 8 horas se cambia el medio de nuevo, con el fin de eliminar
el pDADMC restante. Mientras se preparan las cápsulas debe
prestarse atención a la esterilidad de todos los componentes y
soluciones.
La determinación de vitalidad a través de
coloración trypan-azul sirve para determinar la
cuenta de células total (células muertas y vivas). El
Trypan-azul (0,8 mM en PBS
(Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania) es un agente
colorante con carga negativa, que puede difundirse de modo selectivo
en las células con un membrana celular no-intacta y
puede dar una coloración azul a su citoplasma. Como resultado las
células muertas aparecen azul-violeta bajo el
microscopio de luz, mientras que las células vivas tienen un color
de blanco a amarillento. La cuenta de las células vivas y las
muertas puede determinarse luego con la ayuda de una cámara de
contador Neubauer microscópicamente.
La determinación de vitalidad con la ayuda de la
prueba MTT (MTT-Proliferation Kit, Roche, Mannheim,
Alemania) incluye solo la cuenta de células vivientes contrario a
la coloración de trypan-azul antes descrita.
Este método de medición es una prueba
calorimétrica, en donde la sal de tetrazolio amarilla
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio-bromuro
(MTT) se absorbe pasivamente en las células vivientes y se reduce a
cristales formazan púrpura, insolubles en agua, mediante la acción
de deshidrogenasas. La cantidad del formazan formado es
proporcional a la cuenta de células vivientes en un periodo de
incubación constante y suficientemente prolongado. La determinación
se realiza fotométricamente a \lambda=570 nm después de un
periodo de incubación de 4 horas a 37ºC.
La prueba MTT se desarrolló originalmente para
determinar la cuenta de células vivientes de las suspensiones de
células. Una prueba MTT cualitativa puede también realizarse en las
cápsulas intactas. Pero para la determinación cuantitativa las
células deben disolverse de las cápsulas mediante in cubación de las
cápsulas durante 1 hora en solución SDS al 20% (SigmaAldrich,
Alemania) en baño ultrasónico. La cápsula y los fragmentos de
célula todavía disponibles se centrifugan. La prueba MTT se llevó
a cabo de conformidad con las instrucciones del proveedor
(MTT-Proliferation Kit, Roche, Mannheim, Alemania).
La concentración MTT se mide espectrofotométricamente.
Para producir cápsulas de 600 \mum se prepara
una solución de SCS al 2% (p/v) con NaCl al 1% (p/v) y una solución
de pDADMAC al 1,0% (p/v) con NaCl al 1% (p/v). La solución de
pDADMAC se atempera a 30ºC. Se adicionan a gotas 20 ml de SCS en
300 ml de una solución de pDADMAC al 1,0% agitada. El tiempo de
reacción es de 3 minutos.
El diámetro de la boquilla es de 200 \mum. El
flujo de volumen es de 6,1 ml/min. La amplitud de la vibración de
la boquilla se establece al 100%, la frecuencia se fija a 900 Hz.
El voltaje de dispersión es 1100 V.
Para producir cápsulas de 600 \mum con células
inmobilizadas, se adapta el método como se ha descrito bajo el
ejemplo 3. En adición el crecimiento de células confluente al 90%
se tripsina en un matraz T-75, se absorbe en medio
NM (medio DMEM con 4,5 g/l de glucosa + 10% de FCS (Gibco, Glasgow,
UK)) y se pelletiza a 200 g durante 5 minutos. La pella se
suspende de nuevo en PBS y se determina la concentración de células.
Una parte alícuota de la suspensión de células se pelletiza, con
el fin de obtener una concentración de células de 2x10^{6}
células/ml de SCS. La pella lavada se suspende de nuevo en la
solución de SCS y se llena en una inyección. La conversión de la
suspensión de células a gotas tiene lugar directamente después.
Los tamaños de las cápsulas se determinan
microscópicamente en una cámara de contaje Neubauer (microscopio de
luz M200 y software "Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena,
Jena, Alemania) bajo ampliación 4x.
Para determinar las propiedades mecánicas de las
microcápsulas de SCS, se utilizó un dispositivo de medición de
desplazamiento por fuerza (LUMiTexture, Lerche GmbH, Berlin,
Alemania).
Un cuño aplica carga al objeto de prueba con una
velocidad programable, mientras que una escala electrónica mide la
fuerza resultante. A partir de la curva de
fuerza-desplazamiento, pueden determinarse los
parámetros de presión al estallido y la tensión máxima que aparece
en la membrana simplex. Las mediciones de estabilidad se utilizan
para cápsulas sin células inmobilizadas, así como también para
estudiar la estabilidad a largo plazo de cápsulas con células
inmobilizadas.
La medición de las cápsulas, con los mismos
parámetros de encapsulación, pero preparadas con 4 partidas de
producción diferentes muestra que las estabilidades de las cápsulas
obtenidas son absolutamente comparables. Las estabilidades medias
varían en alrededor del 6%. La dispersión entre las partidas
individuales es inferior a la desviación estandard de los rangos de
medición respectivos. Este resultado ilustra que la reacción de
formación del complejo, a través de la cual discurre la formación de
la membrana simplex, puede controlarse muy bien debido a la
síntesis de SCS reproducible y el gobierno del proceso seleccionado.
La estabilidad de la cápsula constantemente alta faculta una
estimación de la usabilidad de las cápsulas producidas para fines
especiales con altas cargas mecánicas y así minimiza el riesgo de un
daño mecánico a las cápsulas. Las cápsulas son adecuadamente
estables para el cultivo en reposo y en recipientes de cultivo
agitados, así como para inyecciones intravenosas y para
implantación en el tejido humano y animal.
La preparación de la cápsula se realizó como se
ha descrito en el ejemplo 3. La estabilidad se midió de conformidad
con el proceso citado en el ejemplo 4. Las cápsulas se cargaron
inicialmente con 300 células/cápsula. La medición se realizó 14
días después.
En caso de que las células suspendidas se
encuentren en la superficie de la gotita puede suceder que estas se
fijen permanentemente en la membrana durante la reacción de
acomplejación entre SCS y pDADMAC. Las estabilidades de las
cápsulas medidas ilustran que las células suspendidas en SCS no
influencian negativamente la estabilidad de la membrana de la
cápsula. Esto es un pre-requisito básico para la
inmobilización de los sólidos no solubles, tal como tejidos,
células humanas y animales, micro-organismos,
micro-partículas, nano-partículas,
enzimas inmobilizadas, catalizadores y sustancias cristalinas
insolubles en agua.
Las cápsulas se preparan y cultivan de
conformidad con el método descrito en el ejemplo 3. Las mediciones
de estabilidad se realizan como se ha descrito en el ejemplo 4.
Inicialmente se encapsulan 300 células/cápsula y se cultivan
durante 60 días en medio DMEM con 4,5 g/l de glucosa + 10% de suero
vacuno fetal (Gibco, Glasgow, UK) a 37ºC y CO_{2} al 5%, en
botellas rodillo a 2 rpm.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mediciones de la resistencia máxima dentro
de la membrana capsular, que aparece justo antes de la destrucción
de las cápsulas, muestra que la estabilidad de la cápsula cae el 18%
durante un cultivo de 60 días de duración, pero es todavía
suficientemente alta para preservar la integridad de las cápsulas.
La membrana simplex formada es resistente al esfuerzo osmótico,
químico y físico, que tiene lugar durante el cultivo de las células
inmobilizadas en el medio de cultivo de células. Esto faculta un
uso en altas concentraciones de sal, valores de cambio de pH y bajo
esfuerzo mecánico permanente.
Para la preparación de cápsulas con un diámetro
de referencia de 250 \mum, se prepara una solución de SCS al 1,5%
(p/v) con NaCl al 1% (p/v) y se prepara una solución de pDADMAC al
0,85% (p/v) con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se
atempera a 30ºC. Se adicionan a gotas 10 ml de SCS en 300 ml de una
solución de pDADMAC al 0,85% agitada. La relación de concentración
de pDADMAC frente a SCS es 17 (g/g). El tiempo de reacción es de 2
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El inyector conductor está equipado con
inyecciones de plástico de 10 ml. El diámetro de la boquilla es de
100 \mum. El flujo de volumen es de 1,5 ml/min. La amplitud de
la vibración de boquilla es del 100%, la frecuencia se fija en 2000
Hz. El voltaje de dispersión es de 1300 V. Los resultados se
muestran en la Figura 1A.
Para preparar cápsulas con un diámetro de
referencia de 520 \mum, se prepara una solución al 1,8% de SCS
(p/v) con NaCl al 1% (p/v) y una solución de pDADMAC al 1,0% (p/v)
con HaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se atempera hasta
30ºC. Se adiciona a gotas 20 ml de SCS en 300 ml de una solución de
pDADMAC al 1,0% agitada. La relación de concentración de pDADMAC
frente a SCS es 11,1 (g/g). El tiempo de reacción es de 3
minutos.
El inyector conductor está equipado con
inyecciones de plástico. El diámetro de la boquilla es de 200
\mum. El flujo de volumen es de 6,1 ml/min. La amplitud de la
vibración de boquilla es del 100%, la frecuencia se fija en 1100
Hz. El voltaje de dispersión es de 1100 V. Los resultados se
muestran en la Figura 1B.
Para preparar cápsulas con un diámetro de
referencia de 700 \mum, se prepara una solución al 2,8% de SCS
(p/v) con NaCl al 1% (p/v) y una solución de pDADMAC al 1,5% (p/v)
con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se atempera hasta
30ºC. Se adiciona a gotas 15 ml de SCS en 8,5 ml de una solución de
pDADMAC al 1,5% agitada. La relación de concentración de pDADMAC
frente a SCS es 10,7 (g/g). El tiempo de reacción es de 3
minutos.
El inyector conductor está equipado con
inyecciones de plástico. El diámetro de la boquilla es de 250
\mum. El flujo de volumen es de 8,5 ml/min. La amplitud de la
vibración de boquilla es del 100%, la frecuencia se fija en 700 Hz.
El voltaje de dispersión es de 1100 V. Los resultados se muestran
en la Figura 1C.
Para preparar cápsulas con un diámetro de
referencia de 1200 \mum, se prepara una solución al 2% de SCS
(p/v) con NaCl al 1% (p/v) y una solución de pDADMAC al 2,5% (p/v)
con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se atempera hasta
30ºC. Se adiciona a gotas 30 ml de SCS en 300 ml de una solución de
pDADMAC al 2,5% agitada. La relación de concentración de pDADMAC
frente a SCS es 10,7 (g/g). El tiempo de reacción es de 5
minutos.
El inyector conductor está equipado con
inyecciones de plástico. El diámetro de la boquilla es de 300
\mum. El flujo de volumen es de 12,9 ml/min. La amplitud de la
vibración de boquilla es del 100%, la frecuencia se fija en 600 Hz.
El voltaje de dispersión es de 1200 V. Los resultados se muestran
en la Figura 1D.
Los tamaños de la cápsula se determinan
microscópicamente en una cámara de contaje Neubauer (microscopio de
luz M 200 y software "Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena,
Jena, Alemania) bajo ampliación 4x.
Para comparar la reproducibilidad de diferentes
partidas de fabricación de cápsulas de SCS con un diámetro de
referencia de 710 \mum se preparan utilizando una solución al 1,7%
de SCS (p/v) con NaCl al 1% (p/v) y una solución de pDADMAC al 1,5%
(p/v) con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se atempera a
30ºC. Se adiciona a gotas 15 ml de SCS con 8,1 ml/min en 300 ml de
una solución de pDADMAC al 1,5% agitada. La relación de
concentración de pDADMAC frente a SCS es 10,7 (g/g). El tiempo de
reacción es de 3 minutos.
El inyector conductor está equipado con jeringas
de plástico. El diámetro de la boquilla es de 250 \mum. El flujo
de volumen es de 8,1 ml/min. La amplitud de la vibración de
boquilla es del 100%, la frecuencia se fija en 750 Hz. El voltaje
de dispersión es de 1350 V. Los resultados se muestran en la Tabla
5.
Los tamaños de la cápsula se determinan
microscópicamente en una cámara de contaje Neubauer (microscopio de
luz M 200 y software "Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena,
Jena, Alemania) bajo ampliación 4x.
Otras especificaciones de fabricación
corresponden al método descrito en el ejemplo 2.
Los ejemplos mostrados en la figura 1 ilustran
que las microcápsulas de SCS mono-dispersadas pueden
fabricarse con diferentes diámetros, lo cual abre un amplio
espectro de las posibilidades de uso de las cápsulas. La desviación
estandard del diámetro de las cápsulas es bajo, del 4% de media. La
variación de partida-a-partida es
baja, del 3,3% para cápsulas con un diámetro de 710 \mum por lo
que es obtenible una alta reproducibilidad cuando se utiliza SCS
producido con el procedimiento del invento. Esto se debe al hecho
de que el chorro de líquido que sale de la boquilla tiene un ratio
de flujo constante, lo cual es posible solo con soluciones
poliméricas muy homogéneas. Esto es especialmente de alta
relevancia para la preparación de las cápsulas con un diámetro
inferior, ya que pequeños cambios en el ratio de flujo conducen a
altas variaciones en el tamaño de las cápsulas. Aún a un diámetro
de media bajo de 265 \mum, se alcanza una desviación estandard
del 4% con el SCS del invento (figura 1a), si bien cambios de
volumen mínimos causados por soluciones de SCS no homogéneas pueden
tener un efecto negativo dramático sobre la distribución del tamaño.
En cápsulas de 520 \mum puede realizarse una desviación
estandard del 2% (figura 1b). La mono-dispersión de
las cápsulas producida faculta una dosificación muy precisa del
material inmobilizado, debido a que la superficie de las cápsulas
puede calcularse exactamente. Las células inmobilizadas crecen en
partículas mono-dispersadas uniformemente. En el
caso de recipientes de cultivo agitados las cápsulas
mono-dispersadas garantizan una dispersión uniforme
y por tanto una condición de crecimiento óptimo para todas las
células cultivadas. Es posible una aplicación de microcápsulas
utilizando una cánula solo para cápsulas con baja dispersión de
tamaño, debido a que estas minimizan el riesgo de bloqueo.
Diámetros de boquilla superiores permiten la inmobilización de
pequeños tejidos aislados con un riesgo de bloqueo mínimo. Las
cápsulas mono-dispersadas pueden prepararse también
con estas (Figura 1C). El tamaño mínimo de las cápsulas que pueden
fabricarse está solo limitado por el método elegido para la
generación de gotas y no por la solución de SCS utilizada.
El comportamiento de crecimiento de células HEK
293 se condujo en un experimento de curso de tiempo.
Para la producción de las cápsulas de SCS,
células divisoras de un matraz T75 en confluencia del 90% se
tripsinizaron, recogieron en medio DMEM y centrifugaron con 200 g
durante 5 minutos. La masa se resuspendió en PBS y se determinó la
concentración de células. Una parte alícuota de la suspensión de
células se pelletizó de nuevo para ajustar una concentración de
células de 2 x 10^{6} células/ml de SCS. La pella lavada se
resuspendió en la solución de SCS y se lleno en una jeringa. La
conversión de la suspensión de células en gotas tuvo lugar
directamente después.
Para la producción de cápsulas de 600 \mum se
tomó solución de SCS al 2% (p/v) con NaCl al 1% (p/v) y pDADMAC al
1,1% (p/v) con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se mantuvo
a una temperatura moderada de 30ºC. 20 ml de solución de SCS se
instilaron en 300 ml de una solución agitada de pDADMAC al 1,1%. El
tiempo de reacción fue de 3 minutos.
El diámetro de la boquilla fue de 200 \mum. El
ratio de flujo se ajustó a 6,1 ml/min. La amplitud de la
oscilación de la boquilla fue del 100%, la frecuencia se ajustó a
900 Hz. El voltaje de dispersión fue de 1100 V.
Para la producción de cápsulas de 1200 \mum se
tomó SCS al 2%, una solución de NaCl al 1% (p/v) y una solución de
pDADMAC al 2,5% (p/v) con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC
se calentó hasta 30ºC.
Se instilaron 30 ml de solución de SCS en 300 ml
de una solución agitada de pDADMAC al 2,5%. La duración de
reacción fue de 5 minutos. El diámetro de la boquilla fue de 300
\mum. El ratio de flujo fue de 12,9 ml/min. La amplitud de la
oscilación de boquilla fue del 100%, se ajustó la frecuencia a 600
Hz. El voltaje de dispersión fue de 1200 V.
La figura 2a muestra de la parte superior
izquierda a la parte inferior derecha la calidad del aumento de
cuenta de células en las micro cápsulas, con lo que se tomaron
muestran de ensayo los días 1, 2, 3, 7, 14 y 21 después de la
encapsulación.
La figura 2a en las fotografías microscópicas se
muestra claramente el buen crecimiento de células de las células
HEK 293 inmobilizadas en las cápsulas de SCS. Las células se
inmobilizaron como células no aglomeradas simples, unidas al inicio
a la superficie interna de la membrana capsular y finalmente
llenaron la cápsula. Las células luego quedaron en aglomeraciones
celulares, a modo de tejido, densas dentro del lumen cápsular.
En la figura 2b se muestra una curva de
crecimiento de células HEK inmobilizadas en cápsulas con 600 \mum,
y/o 1200 \mum. Las gráficas clarifican el aumento de células HEK
293 encapsuladas durante un periodo de 36 días. Las cápsulas de
cultivaron durante este tiempo en matraces T175 con 30 ml de medio
NM. La cuenta de células vivientes por ml de solución de SCS se
determinó con la prueba MTT (MTT-Proliferation Kit,
Roche, Mannheim, Alemania) de conformidad con las instrucciones del
fabricante.
La figura 2b muestra además una fase de
crecimiento logarítmico, sobre una fase transicional expandida con
ratio de crecimiento disminuido basado en la primera encapsulación,
que se transforma en una fase estacionaria final. Aún utilizando
cultivo estático se obtuvieron densidades de células muy altas de
5,61 x 10^{7} células por ml de SCS con cápsulas que tienen un
diámetro de 600 \mum y 3,1 x 10^{7} células por ml de SCS con
cápsulas que tienen un diámetro de 1200 \mum. La mayor densidad
celular en cápsulas menores es proporcional a la superficie de
intercambio específico aumentada, lo que limita la vaga
transferencia de material de gases y nutrientes (Tabla 6).
Los tiempos de duplicación medidos (t_{D}) en
la fase de crecimiento logarítmico previa son como t_{D}_{600 \
\mu m} = 73 horas y t_{D}_{1200 \ \mu m} = 86 horas
comparablemente altos, puesto que en esta difusión de tiempo no
existe todavía un factor de limitación para el crecimiento
celular.
Para las pruebas células divisoras de un matraz
T75 en confluencia del 90% se suspendieron en medio DMEM y
centrifugaron con 200 g durante 5 minutos. La pella se resuspendió
en PBS y se determinó la concentración de células. Una parte
alícuota de la suspensión de células se pelletizó para ajustar una
concentración de células de 2 x 10^{6} células/ml de SCS. La
pella lavada se resuspendió en la solución de SCS y se lleno en una
jeringa. El proceso de encapsulación se inició directamente
después.
Para las producción de cápsulas de 600 \mum
se tomó solución de SCS al 2% (p/v) con NaCl al 1% (p/v) y pDADMAC
al 1,1% (p/v) con NaCl al 1% (p/v). La solución de pDADMAC se
mantuvo a una temperatura de 30ºC. 20 ml de SCS se instilaron en
300 ml de una solución agitada de solución de pDADMAC al 1,1%. La
duración de la reacción fue de 3 minutos.
El diámetro de la boquilla fue de 200 \mum. El
ratio de flujo se ajustó a 6,1 ml/min. La amplitud de la
oscilación de la boquilla fue del 100%, la frecuencia se ajustó a
900 Hz. El voltaje de dispersión fue de 1100 V.
Las cápsulas se cultivaron durante 21 día antes
de congelación en matraces T175 con 30 ml de medio DMEM con 4,5 g/l
de glucosa + FCS al 10%.
La congelación tuvo lugar en medio DMEM con 4,5
g/l de glucosa + FCS al 10% a lo que se adicionó DMSO al 10% (v/v)
adicionales. Después de un tiempo de incubación de 2 horas se
enfriaron las cápsulas hasta -80ºC con un ratio de enfriamiento
constante. Las cápsulas se almacenaron a -80ºC para uso
ulterior.
La imagen microscópica (figura 3) muestra
cápsulas con células inmobilizadas, que se han descongelado y
cultivado luego en medio DMEM durante 24 horas, después de manchado
en vivo con la prueba MTT (MTT-Proliferation Kit,
Roche, Mannheim, Alemania) de conformidad con las instrucciones del
fabricante.
Después de descongelado la estructura de la
membrana macroscópica de las cápsulas permanece completamente
intacta. Las cápsulas mantienen las células inmobilizadas estables
también después de este procedimiento. Como puede verse también
utilizando la prueba MTT las células inmobilizadas sobreviven al
proceso de congelación y descongelación y pueden cultivarse
fácilmente de nuevo, a pesar de la muy alta densidad celular en el
interior de la cápsula. La membrana de la cápsula apareció en
general opaca. Esto hace posible proporcionar cápsulas con alta
concentración de células humanas utilizando métodos de producción
industrial. Asimismo puede proporcionarse el almacenamiento como
partes alícuotas y una crio conservación a expensas razonables.
Claims (24)
1. Método para la producción de sulfato de
celulosa (CS) sustituido regio-selectivo
caracterizado por una combinación de las etapas
siguientes:
a) hinchamiento de celulosa natural en un
disolvente aprótico polar;
b) adición de un reactivo sulfatante y un
reactivo acetilante, para la esterificación simultánea y
distribución de grupos acetato y grupos sulfato a lo largo y entre
las cadenas poliméricas;
c) directamente seguido de una neutralización
completa con una base, de preferencia hidróxido sódico, con lo que
el sulfato sin disociar el grupo acetilo se transfiere en una sal
sódica del sulfato de acetato de celulosa, con lo que la
neutralización directamente siguiente evita la disociación de grupos
acetato y consiguientemente la degradación de las cadenas de
celulosa; y
d) subsiguiente precipitación, desacetilación,
la- vado y secado del SCS, con lo que el SCS se caracteriza
por una viscosidad de solución que es superior a 10 mPas a una
concentración de 1% en agua.
2. Método, de conformidad con la reivindicación
1, caracterizado porque la etapa de neutralización se lleva
a cabo al mismo tiempo que la precipitación.
3. Método, de conformidad con la reivindicación
1 o 2, caracterizado porque el rango de viscosidad de
solución del SCS producido es ajustable entre 10 y 500 mPas, en
particular entre 15 y 400 mPas, mas en particular entre 20 y 300
mPas, mas en particular entre 15 y 100 mPas, mas en particular entre
20 y 50 mPas, basado en una solución al 1% en agua.
4. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes 1 a 3, caracterizado porque la
celulosa natural se expande en un disolvente polar elegido del grupo
de N,N-dimetilacetamida (DMAc),
N-metilpirrolidona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO) y
N,N-dimetilformamida (DMF).
5. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la celulosa
hinchada se sulfata con un agente sulfatante, que se elige del grupo
constituido por ácido sulfúrico, ácido amido sulfúrico, trióxido de
azufre, cloruro de sulfurilo y ácido clorosulfónico.
6. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la celulosa
hinchada se acetila con cloruro de acetilo o anhídrido acético.
7. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el hinchamiento
se lleva a cabo a temperaturas entre la temperatura ambiente hasta
150ºC, en particular de 20º a 100ºC o mas en particular de 40º a
80ºC.
8. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la acetilación
y la sulfatación se llevan a cabo a temperaturas entre la
temperatura ambiente hasta 110ºC, en particular de 20º a 80ºC, en
particular de 30º a 70º o mas en particular de 40º a 65ºC.
9. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque todos los
materiales de partida están esencialmente exentos de metales
pesados tal como Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn o Cu, el contenido
de hierro del SCS producido es \leq 20 ppm, y por tanto, el
contenido de metal pesado total sin hierro del SCS producido es
\leq10 ppm.
10. Sulfato de celulosa sódico (SCS) obtenido
con el método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado porque el rango de la viscosidad de la solución
del SCS producido es ajustable entre 10 y 500 mPas, en particular
15 a 400 mPas, mas en particular de 20 a 300 mPas, mas en particular
de 15 a 100 mPas, mas en particular de 20 a 50 mPas basado en una
solución al 1% disuelto en agua.
11. Sulfato de celulosa sódico (SCS) de
conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el
SCS producido está exento de metales pesados tal como Cd, Pb, Hg,
Fe, Ni, Ti, Mn, Zn o Cu, el contenido de hierro del SCS producido
es \leq 20 ppm, y el contenido de metal pesado total sin hierro
del SCS producido es \leq10 ppm.
12. Método para la producción de microcápsulas
caracterizado por las etapas de método siguientes:
- a)
- preparación de 0,5 a 10% de solución acuosa del SCS de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11;
- b)
- preparación de suspensión de SCS para un proceso de encapsulación mediante adición de materiales a encapsular por la solución de SCS acuosa y opcionalmente la adición de uno o mas substrato, aditivo portador, solución, conservante, sal glicerina o DMSO;
- c)
- instilación de la suspensión de b) en un baño de acomplejación; y
- d)
- acomplejación de las cápsulas en el baño conteniendo un polímero catiónico en solución acuosa.
13. Método, de conformidad con la reivindicación
12, caracterizado porque los materiales encapsulados son de
origen biológico, en particular células naturales o modificadas de
humanos o animales, bacterias naturales o modificadas, virus
naturales o modificados, levaduras naturales o modificadas,
proteínas aisladas o mezclas de proteínas, anticuerpos o fragmentos
de anticuerpos y/o moléculas de ácido nucleico.
14. Método, de conformidad con la reivindicación
12 o 13, caracterizado porque para la instilación se utiliza
el procedimiento de vibración y una frecuencia en el rango de 100 a
4000 Hz.
15. Método, de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14 caracterizado porque la
acomplejación se lleva a cabo en un baño, con lo que se selecciona
un catión polimérico del grupo de dodecilamina, etilendiamina,
piperacina, azul de metileno, arginina, trietiltetramina,
poli(clorhidrato de alilamina), espermina,
poli(cloruro de dialildimetil amonio)(pDADMAC),
poli(cloruro de vinilbenciltrimetilamonio) y una mezcla de
estos.
16. Método, de conformidad con la
reivindicación 15, caracterizado porque la acomplejación se
lleva a cabo en un baño con poli(cloruro de
dimetilalilamonio)(pDADMAC) que tiene un peso molecular medio entre
10.000 y 500.000, de preferencia 10.000 y 50.000.
17. Uso de SCS de conformidad con las
reivindicaciones 10 u 11, para la micro encapsulación de materiales
biológicos.
18. Uso de SCS de conformidad con las
reivindicaciones 10 u 11, en el método de conformidad con las
reivindicaciones 12 a 16.
19. Microcápsulas de SCS, de conformidad con las
reivindicaciones 10 u 11.
20. Microcápsulas de SCS obtenidas en el método
de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.
21. Microcápsulas de SCS de conformidad con las
reivindicaciones 19 o 20, caracterizadas porque tienen una
distribución de tamaño homogénea con un diámetro medio de
0.1-50 \mum,
1-100 \mum, 50-250 \mum,
50-500 \mum, 100-250 \mum,
100-500 \mum, 250-500 \mum,
250-700 \mum, 200-1500 \mum,
500-1000 \mum, 600-800 \mum,
700-1500 \mum, 1000-2500 \mum,
1500-3000 \mum, 2500-4000 \mum,
3000-5000 \mum.
22. Uso de microcápsulas de SCS de conformidad
con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 como
medicamentos.
23. Uso de microcápsulas de SCS de conformidad
con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para la fabricación
de un medicamento para implantación y/o inyección.
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