ES2320848T3 - Procedimiento para la prediccion de fracturas oseas mediante mediciones de osteocalcina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la evaluación de la fragilidad ósea y el riesgo de fractura, o la osteoporosis, en una persona, que comprende las etapas siguientes a) medir la concentración de osteocalcina gamma-carboxilada (COC) por medio de por lo menos un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo que es específico para la osteocalcina gammacarboxilada y siendo un anticuerpo o fragmento cuya especificidad para la osteocalcina gamma-carboxilada depende de la presencia de iones Ca 2+ , disminuyendo dicha especificidad en presencia de dichos iones Ca 2+ ; y también la concentración de osteocalcina intacta (IOC) u osteocalcina total (TOC) en una muestra de suero o de plasma de dicha persona, b) comparar la razón determinada COC/IOC o COC/TOC, para dicha persona con la razón media COC/IOC o la razón media COC/TOC, determinadas a partir de mediciones en unas muestras de fluidos corporales similares de la población del mismo sexo y edad, y c) utilizar la razón determinada COC/IOC o COC/TOC que es inferior a la razón media COC/IOC o la razón media COC/TOC como indicación de osteoporosis, fragilidad ósea o aumento del riesgo de fractura ósea en dicha persona.
Description
Procedimiento para la predicción de fracturas
óseas mediante mediciones de osteocalcina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la evaluación de la fragilidad ósea y el riesgo
de fractura, y la osteoporosis, utilizando como marcador una
determinación cuantitativa de la razón de osteocalcina humana (hOC)
\gamma-carboxilada circulante con respecto a la
concentración de hOC total o con respecto a la de hOC intacta.
La osteocalcina humana (hOC), también denominada
proteína Gla ósea (BGP), es la proteína no colagenosa más abundante
sintetizada por los osteoblastos de hueso (Poser et. al. J
Biol Chem 1980; 255:8685-91). Aunque la mayor parte
de la osteocalcina sintetizada se absorbe a la hidroxiapatita de
hueso mediante ácidos glutámicos
\gamma-carboxilados (Gla), una pequeña parte de la
misma pasa a la circulación sanguínea en la que puede detectarse
(Price et al. J Biol Chem 1981; 256:12760-6).
También se cree que parte de la hOC hallada en la sangre se origina
a partir del proceso de resorción, cuando se libera la hOC en el
interior de los tejidos óseos durante la degradación ósea (Gundberg
y Weinstein J Clin Invest 1986; 77:1762-7). Los
niveles de hOC circulante se han utilizado ampliamente en las
investigaciones clínicas como marcador de la formación ósea (Power
y Fottrell Crit Rev Clin Lab Sci 1991; 28:287-335) y
se ha demostrado que los niveles de hOC séricos están
correlacionados con las mediciones de densidad mineral ósea en
muchas situaciones (Yasamura et al. J Clin Endocrinol Metab
1987; 64:681-S).
Los resultados discordantes obtenidos a partir
de diferentes ensayos de hOC han dificultado la utilización
generalizada de hOC en aplicaciones clínicas (Masters et al.
Clin Chem 1994; 40:358-63, Deftos et al.
Clin Chem 1992; 38:2318-21, Delmas et al. J
Bone Miner Res 1990; 5:5-11 y Diego et al.
1994; 40:2071-7). Este fenómeno podría explicarse
parcialmente debido a los diferentes formatos de ensayo es decir
ensayos de tipo sándwich frente a competitivos o debido a las
diferentes técnicas de detección. En la actualidad no se encuentra
disponible ningún patrón de calibración. Sin embargo, incluso si se
utiliza la misma preparación patrón, los niveles de hOC medidos en
diferentes laboratorios no pueden compararse directamente (Delmas
et al. J Bone Miner Res 1990). La diversidad de la propia
molécula de hOC en circulación presenta una contribución evidente a
su inmunorreactividad en diversos ensayos. El grado de
\gamma-carboxilación dependiente de la vitamina K
del residuo de ácido glutámico varía (Poser et. al. J Biol
Chem 1980; 255:8685-91). La insuficiencia de
\gamma-carboxilación de hOC purificada a partir de
hueso se ha indicado por Cairns y Price, J Bone Min Res 1994;
9:1989-97 y confirmado en estos estudios (Hellman
et al. J Bone Miner Res 1996; 11:1165-75).
Se sabe que cuando Ca^{2+} se une a residuos de Gla se forma una
estructura de hélice \alpha (Hauschka y Carr, Biochemistry 1982;
21:2538-47 y Atkinson et al. Eur J Biochem
1995; 232: 515-21). Tras la eliminación de
Ca^{2+} con EDTA se destruye esta conformación helicoidal. La
conformación de OC descarboxilada se encuentra aproximadamente
entre la forma helicoidal o de hélice aleatoria. Por tanto, en
disolución el péptido aparece como una estructura flexible y no
puede definirse una única conformación para el mismo (Atkinson et
al. Eur J Biochem 1995; 232:515-21). Los
enlaces peptídicos entre los residuos de arginina 19 y 20 y entre
los residuos 43 y 44 son susceptibles de experimentar hidrólisis
tríptica que conduce a los péptidos 1-19,
20-43, 45-49, 1-43
y 20-49 que pueden ser los productos principales de
la degradación de hOC en la circulación (Farrugia y Melick, Calcif
Tissue Int 1986; 39:234-8, Hellman et al. J
Bone Miner Res 1996; 11: 1165-75 y Gamero et
al. J Bone Miner Res 1994; 9:255-4). Se han
descubierto múltiples formas inmunorreactivas de hOC en circulación
(Garnero et al. J Bone Miner Res 1994;
9:255-4) y también en la orina (Matikainen et
al. J Bone Miner Res 1999; 14:431-8, Taylor
et al. J Clin Endocrin Metab 1990;
70:467-72). Los fragmentos de hOC pueden producirse
o bien durante la degradación osteoclástica de la matriz ósea o como
resultado de la degradación catabólica de la proteína circulante
tras la síntesis por
osteoblastos.
osteoblastos.
El grado de
\gamma-carboxilación dependiente de la vitamina K
en los residuos de ácido glutámico varía, de modo que la hOC
circulante es un conjunto de moléculas de hOC con
\gamma-carboxilación variable (Cairns y Price J
Bone Min Res 1994;9:1989-97). Durante los últimos
años, se ha investigado la relevancia del grado de
\gamma-carboxilación de osteocalcina para predecir
el estado del recambio óseo. Es conocido que la osteocalcina se une
al contenido mineral óseo, la hidroxiapatita, mediante ácidos
glutámicos \gamma-carboxilados. Por tanto, la
hidroxiapatita se ha utilizado para distinguir la forma de proteína
completamente \gamma-carboxilada de las formas no
carboxilada o subcarboxilada (uchOC) (Price et al. J Biol
Chem 1981;256:12760-6). Se ha informado de que la
capacidad de unión a hidroxiapatita de la osteocalcina circulante es
anormalmente baja en ancianos cuando se compara con el grupo
premenopáusico (Knapen et al. Ann Intern Med
1989;111:1001-5, Merle y Delmas Bone Miner
1990;11:237-45). Szulc et al. (J Clin Invest
1993;91:1769-74, J Bone Miner Res
1994;9:1591-5, Bone 1996;18:487-8)
han demostrado que la uchOC circulante es un marcador del riesgo de
fractura de cadera en una población de mujeres internadas y que la
BMD (densidad mineral ósea) disminuye significativamente en mujeres
con uchOC elevada. Sin embargo, los ensayos basados en
hidroxiapatita proporcionan solamente una estimación bruta del
grado de carboxilación. La separación completa de las dos formas es
difícil debido a la unión incompleta de formas carboxiladas a
concentraciones inferiores y particularmente debido a la unión no
específica de osteocalcina subcarboxilada a concentraciones
superiores (Merle y Delmas Bone Miner
1990;11:237-45, Käkönen et al. Protein
Expres Purif 1996;8:137-44, Szulc et al. J
Clin Invest 1993;91:1769-74). Además, los
procedimientos podrían ser sensibles a los cambios en condiciones
tampón y la calidad de los reactivos de hidroxiapatita empleados.
Gundberg et al. demostraron que N-terminal se
une menos. Recientemente, Vergnaud et al. (J Clin Endocrinol
Metab 1997;82:719-24) desarrollaron un nuevo ELISA
para detectar uchOC basado en AcM, con baja reactividad cruzada con
respecto a la hOC carboxilada. Utilizando este inmunoensayo
específico demostraron que la uchOC, pero no la hOC total, predecía
el riesgo de fractura de cadera independientemente de la masa ósea
en mujeres ancianas que provenían de la población general. Las
fracturas osteoporóticas presentan graves consecuencias entre los
ancianos. Dan como resultado una elevada mortalidad, una frecuente
hospitalización, costes sanitarios elevados, deterioro funcional,
dolor y una reducción de la calidad de vida (Ross Arch Intern Med
1996;156:1399-411). Por tanto, son necesarios
procedimientos válidos fácilmente implementados para evaluar el
riesgo de fractura.
Una baja densidad ósea predice la aparición de
fractura (Hui et al. Ann Intern Med
1989;111:355-61, Melton et al. J Bone Miner
Res 1993;8:1227-33) y de fractura de cadera
(Cummings et al. Lancet 1993;341:72-5). La
osteocalcina sérica como medida del aumento de recambio óseo es un
determinante de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas, y las
concentraciones séricas de osteocalcina aumentan al avanzar la edad
(Garnero et al. J Bone Miner Res 1996;
11:337-49, Melton et al. J Bone Miner Res
1997;12:1083-91), tanto en hombres como en mujeres
(Epstein et al. Lancet 1984;307-10). Los
resultados referentes a la relación entre la osteocalcina y la
aparición de fractura son contradictorios, ya que algunos autores
sugieren que existe una asociación positiva (Riis et al.
Bone 1996;19:9-12), mientras que otros sugieren que
no existe ninguna asociación (\ring{A}kesson et al. J Bone
Miner Res 1995;10:1823-9, Garnero et al. J
Bone Miner Res 1996;11:1531-8).
El grado de
\gamma-carboxilación dependiente de la vitamina K
de la osteocalcina (Plantalech et al. J Bone Miner Res
1991;6:1211-6, Obrant et al., J Bone Miner
Res 1999;14:555-60) se reduce con el envejecimiento
(Knapen et al. Ann Intern Med
1989;111:1001-5, Merle y Delmas Bone Min
1990;11:237-45) y afectando la capacidad de unión a
calcio de la proteína puede conducir a osteopenia (Pastoreau et
al. J Bone Miner Res 1993;8:1417-26). A la par
de estos hallazgos, las altas proporciones de osteocalcina
subcarboxilada se asocian a la aparición de fracturas de cadera en
los ancianos internados (Szulc et al. J Clin Invest
1993;91:1769-74). Este hallazgo se apoyó por los
resultados de un estudio caso-control dentro de un
estudio de gran perspectiva entre mujeres sanas que viven en una
comunidad de ancianos (Vergnaud et al. J Clin Endocrinol
Metab 1997;82:719-24).
Según un aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la evaluación de la fragilidad ósea
y el riesgo de fractura, o la osteoporosis, en una persona, que
comprende las etapas siguientes
- a)
- medir la concentración de osteocalcina gamma-carboxilada (COC) por medio de por lo menos un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo que es específico para la osteocalcina gamma-carboxilada y siendo un anticuerpo o fragmento cuya especificidad para la osteocalcina gamma-carboxilada depende de la presencia de iones Ca^{2+}, disminuyendo dicha especificidad en presencia de dichos iones Ca^{2+}; y también la concentración de osteocalcina total (TOC) u osteocalcina intacta (IOC) en una muestra de suero o de plasma de dicha persona,
- b)
- comparar la razón determinada COC/TOC o COC/IOC para dicha persona con la razón media COC/TOC (razón media COC/TOC) o COC/IOC, respectivamente determinadas a partir de mediciones en unas muestras de fluidos corporales similares de la población del mismo sexo y edad,
- y
- c)
- utilizar la razón determinada COC/TOC o COC/IOC que es inferior a la razón media COC/TOC o COC/ IOC, respectivamente como indicación de osteoporosis, fragilidad ósea o aumento del riesgo de fractura ósea en dicha persona.
Según otro aspecto, esta invención se refiere a
un kit para la evaluación de la fragilidad ósea y el riesgo de
fractura ósea, o la osteoporosis en una persona, que comprende un
reactivo de captura que consiste en por lo menos un anticuerpo
monoclonal o policlonal o fragmento del mismo que es específico para
la osteocalcina gamma-carboxilada en una muestra de
suero o de plasma de dicha persona que es un anticuerpo o fragmento
cuya especificidad por la osteocalcina
gamma-carboxilada depende de la presencia de iones
Ca^{2+}, disminuyendo dicha especificidad en presencia de dichos
iones Ca^{2+}, y un reactivo de detección, que puede detectar el
complejo formado entre el reactivo de captura y el antígeno; y que
comprende asimismo otro reactivo de captura que consiste en por lo
menos un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo,
pudiendo capturar dicho anticuerpo o fragmento cualquier
osteocalcina (OC intacta; OC total) en una muestra de suero o de
plasma de una persona, y un reactivo de detección, que puede
detectar el complejo formado entre el reactivo de captura y el
antígeno.
Figura 1. Una representación de los epítopos
reconocidos por los AcM utilizados en ensayos de hOC de dos sitios.
La molécula se ha dividido en cuatro zonas supuestas, de las que
cada una está reconociéndose por diferentes AcM. Los aminoácidos
amino y carboxi-terminales se han marcado como 1 y
49, respectivamente. Los sitios sensibles a proteasa se han
indicado como R-R
(arginina-arginina), los tres residuos de Gla se
muestran también como el puente disulfuro
(C-C).
\newpage
Figura 2. Curvas de
dosis-respuesta de los ensayos nº 2 (IOC, cuadrado
en negro), nº 4 (TOC, círculo en negro) y nº 9 (COC, triángulo en
negro) dados como recuentos de fluorescencia frente a
concentraciones convencionales de hOC a lo largo del intervalo
(0,017, 13,5 nM) y CV intraensayo correspondientes (símbolos en
blanco) calculados a partir de 12 repeticiones.
Figura 3. Las razones de concentración COC/TOC
(nº 9/nº 4) y COC/IOC (nº 9/nº 2) en sujetos tratados con warfarina
(n=37) y sujetos control (n=30). Las líneas horizontales de los
diagramas de cajas representan los percentiles 10, 25, 50, 75 y
90.
Para la evaluación de riesgo de fractura entre
los ancianos son necesarios procedimientos válidos y de fácil
puesta en práctica. Las hOC \gamma-carboxilada,
total e intacta séricas se midieron mediante ensayos
inmunofluorométricos de osteocalcina en 792 personas que viven en
su hogar de 70 años o mayores mediante ensayos inmunofluorométricos
de dos sitios en una etapa. La aparición de fracturas se siguió
durante cinco años. La hOC \gamma-carboxilada
sérica y especialmente, la razón de hOC
\gamma-carboxilada con respecto a hOC total o hOC
\gamma-carboxilada con respecto a hOC intacta
predecían la aparición de fracturas independientemente de otros
factores de riesgo de fracturas iniciales relacionados con los
sujetos. El mayor riesgo relativo se daba en la población mayor de
80 años y el valor de predicción duraba tres años. La medición de la
razón es un procedimiento válido y de fácil puesta en práctica para
la evaluación de riesgo de fractura entre los ancianos.
En la presente invención, debe entenderse que la
expresión "osteocalcina intacta" o IOC en una muestra de
fluido corporal de una persona incluye el fragmento de longitud
completa de la molécula de osteocalcina, independientemente de su
gamma-carboxilación. Debe entenderse que la
expresión "osteocalcina total" o TOC en una muestra de fluido
corporal de una persona incluye el fragmento de longitud completa
y/o un fragmento NH_{2}-terminal grande de la
molécula de osteocalcina, independientemente de su
gamma-carboxilación. La expresión "osteocalcina
gamma-carboxilada" o COC incluye las
osteocalcinas mono-, di- y tricarboxiladas, pero no formas no
carboxiladas de osteocalcina. Fluidos corporales adecuados para la
medición de estos marcadores son por ejemplo suero, plasma u
orina.
orina.
Puede considerarse que una persona pertenece a
un grupo con propensión a padecer osteoporosis, fragilidad ósea o
aumento del riesgo de fractura ósea si dicha razón del fluido
corporal de la persona de "osteocalcina
gamma-carboxilada con respecto a osteocalcina
intacta" (COC/IOC) o de "osteocalcina
gamma-carboxilada con respecto a osteocalcina
total" (COC/TOC) es inferior al valor de COC/IOC o al valor de
COC/TOC medio de la población del mismo sexo y edad.
Debe entenderse que el término "fragmento"
de anticuerpo significa un fragmento de anticuerpo producido de
manera recombinante o proteolítica.
La osteocalcina
gamma-carboxilada (COC) se mide por medio de por lo
menos un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo,
siendo dicho anticuerpo o fragmento específico para la osteocalcina
gamma-carboxilada. Se utilizan un anticuerpo
monoclonal o fragmento del mismo, o una mezcla de varios anticuerpos
monoclonales o fragmentos de los mismos para reconocer uno
cualquiera de los epítopos específicos para la osteocalcina
gamma-carboxilada. Preferentemente, el anticuerpo o
fragmento reconoce un epítopo que aparece en la región de los
aminoácidos 17-24 de la molécula de osteocalcina
gamma-carboxilada. Según otra forma ce realización
preferida, el anticuerpo o fragmento reconoce la estructura
terciaria asociada a la osteocalcina gamma-
carboxilada.
carboxilada.
La especificidad del anticuerpo o fragmento por
la osteocalcina gamma-carboxilada depende de la
presencia de iones metálicos divalentes, tales como Ca^{2+}. La
especificidad disminuye en presencia de dichos iones metálicos.
El reactivo de detección debe entenderse como un
anticuerpo monoclonal o policlonal marcado o fragmento del mismo
que puede unirse al complejo formado entre el anticuerpo de captura
(o fragmento de anticuerpo) y el
antígeno.
antígeno.
La invención se da a conocer con mayor detalle
en la sección experimental.
Se produjo GST-rhOC (GST =
glutatión S-transferasa) utilizada como inmunógeno
tal como se describe (Käkönen et al. Prot Exp Purif 1996;
3:137-44). La osteocalcina bovina (bOC) se obtuvo de
Biodesign International, Kennebunkport, ME. El adyuvante completo
de Freund (Fca) y el adyuvante incompleto de Freund (Fia) se
obtuvieron de Sigma Immuno Chemicals, St Louis, MO.
Optimem-1 con glutamax-1, medio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, 10 x líquido),
L-glutamina, piruvato de sodio (sometido a prueba
para cultivo tisular), bicarbonato de sodio (calidad para cultivo
tisular) y disolución de penicilina-estreptomicina
(P/S) se adquirieron de Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island,
NY, Hepes de Boehringer Mannheim, Alemania y el suero bovino fetal
de Hyclone, Logan, UT y se utilizaron como componentes en los medios
de cultivo. Los reactivos y el equipo utilizados para la selección
de líneas celulares de hibridoma específicas de hOC se obtuvieron de
Wallac Oy, Turku, Finlandia excepto la hOC marcada con europio que
se preparó según Hellman et al. (J Bone Miner Res 1996; 11:
1165-75). El biorreactor de fibra hueca Tecnomouse
utilizado para la producción a gran escala de AcM se obtuvo de
Integra Biosciences AG, Wallisellen, Suiza y la proteína
A-agarosa Affigel® para la purificación de los AcM
se obtuvo de Bio-Rad, Richmond,
CA.
CA.
\vskip1.000000\baselineskip
Anteriormente se ha descrito la utilización de
proteína de fusión de OC recombinante como inmunógeno (Matikainen
et al En "Animal cell technology: Developments towards the
21st century" 1995; páginas 475-9). Se inmunizó
por vía intraperitoneal un ratón Balb/c macho de diez meses de edad
con 413 \mug de antígeno de GST-rhOC
(correspondiente a 75 \mug de la parte de rhOC) mezclados con Fca.
Se le administró una inmunización de recuerdo al ratón 15 semanas
más tarde con 358 del mismo antígeno (60 \mug de rhOC) mezclados
en Fia. La dosis de inmunización de recuerdo final, 110 \mug de
antígeno (20 \mug de rhOC) en PBS se administró por vía i.p. tras
8
semanas.
semanas.
Se acopló la osteocalcina bovina a hemocianina
de lapa californiana (KLH) tal como se describe (Young et
al. Prostaglandines 1982; 23:603-13). Se
inmunizaron por vía i.p. dos ratones macho Balb/c de tres meses de
edad con 50 \mug de antígeno de bOC-KLH mezclado
con Fca. Se les administró una inmunización de recuerdo a los
ratones con la misma cantidad de antígeno en Fia. La dosis de
inmunización de recuerdo final, 10 \mug de
bOC-KLH en PBS, se administró por vía
intravenosa.
Tres días tras la inmunización de recuerdo final
se fusionaron esplenocitos a células de mieloma de ratón SP 2/0 tal
como se describió en más detalle anteriormente (Lilja et al.
Clin Chem 1991; 37:1618-25). Se hicieron crecer los
hibridomas en Optimem-1 con
glutamax-1 que contenía suero bovino fetal al 20%.
Se seleccionaron los AcM específicos frente a hOC con un ensayo
inmunofluorimétrico (IFMA) utilizando pocillos de microtitulación
con Ig de conejo anti-ratón y hOC marcada con
europio tal como se describió anteriormente (Matikainen et
al.
1995).
1995).
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la producción a gran escala de los AcM,
se clonaron los hibridomas positivos por lo menos dos veces
mediante el procedimiento de dilución limitante. Se utilizó
Optimem-1 con glutamax-1
complementado con suero bovino fetal al 20% como medio de cultivo.
Se seleccionaron las líneas celulares 2H9F11F8 (2H9) y 6F9G4E10
(6F9) obtenidas de la inmunización con GST-rhOC y
3H8H2D2A12F12 (3H8) obtenida de la inmunización con bOC para su
caracterización adicional. Se produjeron los AcM en un biorreactor
de fibra hueca Tecnomouse. Se utilizó DMEM (disolución 1 x)
complementado con L-glutamina, Hepes, piruvato de
sodio, bicarbonato de sodio y P/S como medio de cultivo en
circulación intracapilar. Se utilizó Optimem-1 con
glutamax-1 complementado con suero bovino fetal al
2,5% como medio de recogida en la zona extracapilar. Se purificaron
los AcM producidos mediante cromatografía en proteína
A-agarosa utilizando el kit de purificación Affigel®
según las sugerencias del
fabricante.
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
En la determinación de las subclases de los AcM,
las placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina se
obtuvieron de Wallac Oy y los AcM específicos de la subclase Ig de
rata anti-ratón biotinilada de Serotec, Oxford,
Inglaterra. Para el mapeo de epítopos, el péptido de osteocalcina
sintético 7-19 que contenía Glu en el residuo 17 se
adquirió de Bachem, Suiza y la osteocalcina bovina (bOC) se obtuvo
de Biodesign International, Kennebunkport, ME. Se purificó la
osteocalcina de fémures humanos modificando un procedimiento
descrito anteriormente (Gundberg et al. Meth Enzymol 1984;
107:516-544) tal como se explica en detalle por
Hellman et al. (1996). Anteriormente se ha descrito también
la digestión con carboxipeptidasa Y, digestión con tripsina,
alquilación y descarboxilación de hOC (Hellman et al. 1996).
La caracterización detallada de la hOC y sus modificaciones se
describen por Hellman et al. (1996). Las formas recombinantes
de osteocalcina se produjeron tal como se describió anteriormente
(Käkönen et al. Protein Expres Purif 1996;
8:137-44).
La producción y purificación de una forma
truncada de rhOC (rhOC del.) (que carece de 10 residuos de
aminoácido COOH-terminales) de un gen que portaba
una mutación de parada en la región estructural se realizaron en
condiciones similares. Tanto rhOC como rhOC del. presentan una
extensión de tres residuos de aminoácidos en sus extremos NH_{2}
terminales; además, carecen de la
\gamma-carboxilación características de la hOC
aislada a partir de hueso. Los reactivos para la biotinilación,
isotiocianato de biotina (BITC) y el marcado, quelato de europio
(III) de
4-[2(-4-isotiocianatofenil)etinil]-2,6-bis-{[N,N-bis(carboximetil)amino]-metil}piridina
(Takalo et al. Helv Chim Acta 1993;
76:877-83) procedían de Wallac Oy. Las placas de
microtitulación recubiertas con estreptavidina, el tampón Delfia®,
la disolución de lavado Delfia®, la disolución de potenciación
Delfia® y el fluorómetro de investigación Delfia®, modelo 1234
utilizado en mediciones de IFMA se obtuvieron de Wallac Oy. Los
reactivos y el equipo utilizados en los inmunoensayos fueron
similares a lo largo del estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
El marcado de los péptidos para la determinación
de subclases y el mapeo de epítopos se realizaron según Hellman
et al. 1996. Los AcM 3G8, 6F9 y 3H8 pertenecían a la subclase
IgG1 y el AcM 2H9 a la subclase IgG2a tal como se determina según
Matikainen et al., 1995.
Se caracterizaron los AcM para determinar su
unión a hOC intacta, bOC y péptidos trípticos o sintéticos marcados
con Eu tal como se describe (Hellman et al. 1996). El AcM 3H8
obtenido mediante inmunización con bOC conjugado a KLH reconocía el
fragmento 20-43 tríptico. El AcM 6F9 reconocía los
péptidos 1-19 tríptico y 7-19
sintético. El AcM 2H9 reconocía el péptido 20-43
tríptico. El AcM 3G8 reconocía solamente hOC no marcada de longitud
completa y hOC cuando se sometía a prueba con combinaciones de dos
sitios. Resumen de los AcM en la tabla 1. Según la información
obtenida se creó un mapa de epítopos (figura 1).
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Con el fin de crear ensayos de combinación de
dos sitios, se biotinilaron los AcM 3G8, 2H9 y 6F9 con BITC y se
marcaron los AcM 2H9, 6F9 y 3H8 con quelato de europio (III) en las
condiciones de reacción descritas anteriormente (Hellman et
al, 1996). El inmunoensayo de dos sitios utilizaba fluorimetría
de resolución temporal utilizando marcadores de quelato lantánido,
como europio, como sistema de detección (Soini y Lövgren CRC Crit
Rev Anal Chem. 1987; 18:105-53).
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Las combinaciones de dos sitios nº 2, nº 4 y nº
9 se validaron en más detalle mediante la determinación de las
reactividades cruzadas para la hOC alquilada, hOC descarboxilada,
hOC Y-digerida con carboxipeptidasa (CPYhOC), hOC
recombinante y hOC recombinante truncada. Según la información
obtenida mediante la determinación de la reactividad cruzada y el
mapeo de epítopos, el ensayo nº 2
(bio-3G8/Eu-2H9) podía detectar
solamente hOC de longitud completa (hOC intacta o IOC). Los ensayos
nº 4 (bio-2H9/Eu-6F9) y nº 9
(bio-6F9/Eu-3H8) podían detectar la
hOC de longitud completa (1-49) y también el
fragmento NH_{2}-terminal grande
(1-43). Los ensayos nº 2 y nº 4 medían tanto la
forma \gamma-carboxilada como completamente
descarboxilada de hOC. El ensayo nº 9 prefería de manera muy
particular la forma carboxilada de hOC (hOC
\gamma-carboxilada de COC). La determinación de
las constantes de afinidad de los AcM marcados se realizó según
Hellman et al. 1996 utilizando el análisis de Scatchard
(Scatchard, Ann NY Acad Sci 1949; 51: 660-72). En la
tabla 2, se resumen las características de los
ensayos.
ensayos.
Además de ensayos no competitivos de dos sitios,
los anticuerpos específicos frente a hOC podrían utilizarse en
ensayos competitivos como anticuerpo de captura. En el ensayo
competitivo, las formas de hOC en la muestra compiten con los
péptidos de hOC o hOC marcada con Eu por la unión al número limitado
de AcM de captura. Con los AcM 2H9 y 3H8 también podría utilizarse
bOC marcada
\hbox{con Eu debido a la reactividad cruzada
explicada en la tabla 1.}
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En la sección anterior, se han caracterizado los
AcM empleados. Además de los AcM producidos en cultivos celulares
de hibridoma, también podrían utilizarse fragmentos de anticuerpo
recombinante en el concepto de ensayo. Las hOC y CPYhOC utilizadas
para la normalización de los ensayos se produjeron tal como se
explica en la sección 2. BSA tratada con DTPA (ácido
dietilentriaminopentaacético) en tampón TSA
(Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM,
NaN_{3} 15 mM, pH 7,75) utilizada como diluyente en la
normalización, se obtuvo de Wallac Oy. En la sección 2 se han
enumerado los materiales y el equipo utilizados en los IFMA de
OC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 10 \mul de muestras y patrones a
cada pocillo de placas de microtitulación recubiertas con
estreptavidina seguido de una mezcla de AcM biotinilados y marcados
con Eu en 50 \mul de tampón de ensayo Delfia® que contenía EDTA 5
mM. La cantidad de AcM de captura era de 200 ng/pocillo y 200 (nº 4)
o 100 ng (nº 2 y nº 9) por pocillo de AcM trazadores. Se incubaron
las placas con agitación continua a temperatura ambiente (durante 2
horas) o a +35ºC (durante 1 hora) seguido de un lavado de seis veces
con disolución de lavado Delfia®. Para potenciar la fluorescencia
del quelato de Eu, se añadieron 200 \mul de disolución de
potenciación Delfia® por pocillo, tras lo que se agitaron las placas
durante 30 min. a temperatura ambiente.
\hbox{Se midió la
señal con el fluorómetro de investigación Delfia® (modelo 1234,
Wallac).}
Los tres ensayos permiten una estimación
sensible de hOC en el intervalo de concentración de hOC desde
0,1-90 \mug/l. En la figura 2 se representan los
perfiles de precisión obtenidos de 12 repeticiones de cada
calibrador patrón de cada ensayo. Los CV variaban entre el 2 y el 8
por ciento por encima del intervalo convencional. Los límites de
detección, definidos como la concentración correspondiente al valor
medio de 12 determinaciones del calibrador cero + 2 DE, eran de
0,06, 0,05 \mug/l y 0,07 \mug/l para los IFMA nº 2, nº 4 y nº 9,
respectivamente. Se calcularon las variaciones intra e interensayo
de los ensayos con tres muestras de suero que contenían una
concentración baja, media y alta de hOC. Los CV intraensayo eran
inferiores al 5% (n=12) y los CV interensayo (n=12) eran inferiores
al 8% en cada uno de los ensayos. La linealidad de los ensayos era
excelente tal como se estimaba mediante diluciones de 2, 4 y 8
veces de cinco muestras de suero con el calibrador cero. Las
recuperaciones analíticas de hOC (10, 20 y 50 \mug/l tal como se
cuantifica mediante secuenciación N-terminal)
añadidas a sueros humanos (n=9) fueron del 92\pm8,2%, 91\pm5,3%
y el 95\pm4,6% para los IFMA nº 4 y nº 9, respectivamente. Las
características de estos ensayos se han descrito en detalle por
Käkönen et al. Clin Chem 2000;46:332-7.
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En la sección 3 se han descrito los protocolos
de los IFMA de OC que medían la hOC total (nº 4) o
\gamma-carboxilada (nº 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la respuesta al tratamiento que
afectaba a la \gamma-carboxilación de hOC
utilizando una cohorte clínica de 37 pacientes con tratamiento
continuo con warfarina (19 mujeres y 18 hombres, 73\pm8 años) y
30 controles de la misma edad sin tratar (12 mujeres y 18 hombres,
72\pm6 años). Todas las mujeres eran posmenopáusicas. El fármaco
de warfarina se había administrado para tromboembolia recurrente o
cardiopatía crónica durante por lo menos 12 meses y la dosificación
semanal variaba entre 8,75-78,75 mg (media, 33,6).
Todos menos uno de los pacientes presentaban niveles terapéuticos de
protrombina (PT) con una INR (razón normalizada internacional) de
2,0-3,8 tal como se mide mediante la prueba de
complejo de protrombina (SPA 50, Diagnostic Stago, Francia). Un
paciente tomaba una minidosis fijada de warfarina (1,25 mg/día) y
presentaba un nivel de PT normal. Se midió la concentración de hOC
en las muestras de suero con los IFMA de OC nº 4 y nº 9. Se recogió
el panel de warfarina en el Hospital Universitario de Malmö, Suecia
y se aprobó el estudio en todas las partes por el comité ético
local. La información detallada de este panel se ha notificado por
Obrant et al. J Bone Miner
Res;1999;14:555-60.
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La concentración de hOC tal como se mide con el
ensayo nº 9 era inferior en los pacientes tratados con warfarina en
comparación con los pacientes de control (tabla 3.). A la inversa,
no había ninguna diferencia significativa entre los pacientes
tratados con warfarina y los controles en la cantidad de hOC total
medida mediante el ensayo nº 4. Además, la proporción de hOC
carboxilada/hOC total era extraordinariamente baja en los pacientes
tratados con warfarina en comparación con los controles
(p<0,0001) y un solo nivel de límite de corte de 0,8 separaba
completamente los dos grupos de pacientes (figura 3).
En la sección 3 se han descrito los protocolos
de los IFMA de OC que miden la hOC intacta, total o
\gamma-carboxilada.
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La población consistía en su totalidad en
personas de 70 años de edad o más que vivían en su hogar que
habitaban en cinco municipios rurales alrededor de la ciudad de
Oulu en el norte de Finlandia, a 1 de septiembre de 1991 (N=954).
Los exámenes iniciales se llevaron a cabo durante del 1 de
septiembre de 1991 al 29 de febrero de 1992 por dos equipos que
consistían en un médico, dos enfermeras y un fisioterapeuta.
Setecientos noventa y dos (el 87% de los vivos en el punto medio de
los exámenes) participaron en estos exámenes y el registro de
caídas. Las características de la población se describen en la tabla
4. Basándose en los datos de los registros médicos, las
características de los que no participaron (53 hombres y 64 mujeres)
no diferían de las de los participantes en cuanto a la edad;
hombres 75,5 años (DE 4,8), mujeres 76,9 años (5,3); que vivían
solos (43%); e incapacidad para salir de casa
(11%).
(11%).
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Los equipos de investigación recogieron los
datos por medio de cuestionarios por correo, entrevistas, exámenes
clínicos y pruebas clínicas (Luukinen et al., J Am Geriatr
Soc 1997;45:1302-9; Koski et al., Age Aging
1996;25:29-38). Las enfermeras recogieron muestras
de suero, que se almacenaron tras centrifugación a -72ºC. Se
midieron las muestras con los IFMA de OC nº 2, nº 4 y nº 9. El
análisis de las muestras de suero era ciego en lo que se refiere al
registro de caídas.
El registro de caídas se dispuso tal como se
describió en informes anteriores, y duró desde el día de la recogida
del suero hasta el 31 de diciembre de 1996. Se comprobó la
aparición de fracturas a partir de los registros médicos al final
de cada año de seguimiento (Luukinen et al., J Am Geriatr Soc
1997;45:1302-9; Luukinen et al., J Am
Geriatr Soc 1995;43:871-6). Las fracturas de cadera
se elevaron a un total de 26, las fracturas de muñeca a 21 y otras
fracturas a 65.
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En la tabla 5 se describen las distribuciones de
hOC intacta, hOC total, COC y las razones de COC/IOC y COC/TOC por
edad y sexo. Las concentraciones de IOC no aumentaban al avanzar la
edad en los hombres (Chi-cuadrado de
Kruskal-Wallis = 5,51 df = 3, p = 0,1383), pero
aumentaban en las mujeres (Chi-cuadrado de
Kruskal-Wallis = 30,99, df = 3, p = 0,0001), y eran
superiores en las mujeres que en los hombres
(Chi-cuadrado de Kruskal-Wallis =
25,1 df= 1, p = 0,0001). Las concentraciones de TOC aumentaban al
aumentar la edad en los hombres (ANOVA p = 0,009) y en las mujeres
(p < 0,001), y eran superiores en las mujeres que
en los hombres (p de Kruskal-Wallis
< 0,001). Las concentraciones de COC aumentaban asimismo al
avanzar la edad tanto en los hombres (ANOVA p = 0,012) como en las
mujeres (p < 0,001), y eran superiores en las mujeres que en los
hombres (p de Kruskal-Wallis < 0,001). No había
ninguna diferencia en los valores de COC/IOC entre los grupos de
edades en los hombres (Chi-cuadrado de
Kruskal-Wallis = 3,73 df = 3, p =0,2916), pero las
concentraciones disminuían con la edad en las mujeres
(Chi-cuadrado de Kruskal-Wallis =
18,59 df = 3, p = 0,0003). Los valores de COC/IOC eran superiores
en los hombres que en las mujeres (Chi-cuadrado de
Kruskal-Wallis = 6,26 df = 1, p = 0,0124). No había
ninguna diferencia en los valores de COC/TOC entre los grupos de
edades, ni en los hombres (ANOVA p = 0,587) ni en las mujeres (p =
0,250), pero de nuevo los valores de COC/TOC eran superiores en los
hombres que en las mujeres (p de Kruskal-Wallis <
0,001).
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En los hombres, los valores de COC, COC/IOC y
COC/TOC eran inferiores en los casos de fractura que en los
controles, pero no se encontró ninguna diferencia con respecto a la
TOC o IOC. Las concentraciones de TOC y IOC eran superiores, y de
nuevo los valores de COC/IOC y COC/TOC inferiores en la población
femenina con fracturas que en sus controles, pero los valores de
COC correspondientes no diferían (tabla 6).
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En la tabla 7, se describen las tasas de
incidencia y los riesgos relativos de fractura según IOC o TOC
superiores (\geq+1 DE de la media), COC inferior (\leq -1 DE de
la media) y COC/IOC y COC/TOC inferiores (\leq -1 DE de la
media). Un valor de IOC o TOC superior no estaba asociado a la
aparición de una fractura, pero valores inferiores de COC, COC/IOC
y COC/TOC estaban asociados de manera positiva. Dicotomizado a -1 DE
de la media de la población total del estudio, el riesgo de
fractura relativo bruto en lo que se refiere a una razón COC/IOC y
COC/TOC baja era de 2,31 (1,29-4,13) y 3,47
(2,23-5,42), respectivamente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se asociaron las siguientes variables iniciales
(p < 0,05) a la aparición de fractura durante el periodo de
seguimiento de cinco años: mayor edad (para el aumento de 5 años)
(HR 1,35), sexo femenino (2,44), realizar trabajo pesado fuera de
casa (0,50), incapacidad para salir de casa sin ayuda (2,28),
incapacidad para llevar un peso de 5 kg 100 metros (2,28), escasa
agudeza visual a distancia (2,65), fuerza de extensión de la rodilla
reducida (2,64), miedo frecuente de caerse (2,86), flujo
espiratorio pico bajo (\leq-1 DE de la media)
(1,81), estado cognitivo bajo (resultado de prueba del miniexamen
del estado mental \leq 23 puntos) (1,58), accidente
cerebrovascular pasado (4,35), utilización de medicación contra el
Parkinson (3,78) y utilización de medicación psicotrópica (2,08).
Tras introducir estas variables en los análisis de regresión de Cox,
COC y COC/TOC bajas predecían la aparición de fractura, pero IOC y
TOC no lo hacían (tabla 7). El alto riesgo de fractura asociado a
bajas concentraciones de COC y bajas razones de COC/IOC o COC/TOC
aumentaba tras el ajuste para otros factores de riesgo de fractura,
indicando contribuciones independientes.
Dicotomizado a -1 DE de la media de la población
total del estudio, el riesgo de fractura relativo ajustado en lo
que se refiere a una baja razón de COC/TOC era de 3,26
(2,01-5,25). En la población más joven
(70-79 años) los riesgos de fractura relativos
ajustados de múltiples variables en lo que se refiere a IOC, TOC
altas (\geq 1 DE), COC baja, COC/IOC baja y COC/TOC baja eran de
0,63 (0,27-1,46), 1,34 (0,60-3,00),
2,04 (1,12-3,73), y 2,31
(1,16-4,61) y 4,36 (2,46-7,75),
respectivamente. Las cifras correspondientes en la población mayor
(\geq 80 años) eran de 1,05 (0,39-2,82), 1,44
(0,51-4,11), 1,51 (0,50-4,59), 2,64
(0,58-12,13) y 7,02
(2,42-20,39).
El aumento del riesgo de fractura asociado a una
COC/TOC baja encontrada en este estudio se asemeja en magnitud al
riesgo de fractura de cadera relativo presentado anteriormente en lo
que se refiere a una combinación de baja densidad mineral ósea y
osteocalcina con disminución de carboxilación (Vergnaud P et
al., J Clin Endocrinol Metab 1997;82:719-24).
Se encontró que el aumento del riesgo de fractura con una COC/TOC
baja era especialmente elevado entre las personas de mayor edad, lo
que está a la par con el hallazgo de que osteocalcina
subcarboxilada elevada predice fracturas de cadera (Vergnaud P et
al.). Según estos resultados, es probable que los inmunoensayos
simples para determinar la osteocalcina intacta, total y carboxilada
demuestren ser herramientas eficaces en la evaluación a corto plazo
del riesgo de fractura entre los ancianos.
Claims (6)
1. Procedimiento para la evaluación de la
fragilidad ósea y el riesgo de fractura, o la osteoporosis, en una
persona, que comprende las etapas siguientes
- a)
- medir la concentración de osteocalcina gamma-carboxilada (COC) por medio de por lo menos un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo que es específico para la osteocalcina gamma-carboxilada y siendo un anticuerpo o fragmento cuya especificidad para la osteocalcina gamma-carboxilada depende de la presencia de iones Ca^{2+}, disminuyendo dicha especificidad en presencia de dichos iones Ca^{2+}; y también la concentración de osteocalcina intacta (IOC) u osteocalcina total (TOC) en una muestra de suero o de plasma de dicha persona,
- b)
- comparar la razón determinada COC/IOC o COC/TOC, para dicha persona con la razón media COC/IOC o la razón media COC/TOC, determinadas a partir de mediciones en unas muestras de fluidos corporales similares de la población del mismo sexo y edad, y
- c)
- utilizar la razón determinada COC/IOC o COC/TOC que es inferior a la razón media COC/IOC o la razón media COC/TOC como indicación de osteoporosis, fragilidad ósea o aumento del riesgo de fractura ósea en dicha persona.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que COC se mide por medio de un anticuerpo monoclonal o fragmento
del mismo, o una mezcla de varios anticuerpos monoclonales o
fragmentos de los mismos que reconocen cualquiera de los epítopos
específicos para la osteocalcina
gamma-carboxilada.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo
producido de manera recombinante o proteolítica.
4. Kit para la evaluación de la fragilidad ósea
y el riesgo de fractura ósea, o la osteoporosis en una persona, que
comprende un reactivo de captura constituido por lo menos un
anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo que es
específico para la osteocalcina gamma-carboxilada en
una muestra de suero o de plasma de dicha persona y siendo un
anticuerpo o fragmento cuya especificidad para la osteocalcina
gamma-carboxilada depende de la presencia de iones
Ca^{2+}, disminuyendo dicha especificidad en presencia de dichos
iones Ca^{2+}, y un reactivo de detección, capaz de detectar el
complejo formado entre el reactivo de captura y el antígeno; y que
comprende asimismo otro reactivo de captura constituido por lo menos
un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo,
pudiendo capturar dicho anticuerpo o fragmento la OC intacta o la OC
total en una muestra de suero o de plasma de una persona, y un
reactivo de detección, capaz de detectar el complejo formado entre
el reactivo de captura y el antígeno.
5. Kit según la reivindicación 4, en el que el
reactivo de captura es un anticuerpo monoclonal o fragmento del
mismo, o una mezcla de varios anticuerpos monoclonales o fragmentos
de los mismos que reconocen cualquiera de los epítopos específicos
para la osteocalcina gamma-carboxilada.
6. Kit según la reivindicación 4 ó 5, en el que
el fragmento de anticuerpo de captura es un fragmento de anticuerpo
producido de manera recombinante o proteolítica.
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