ES2320860T3 - Produccion de celulas sanguineas mediante la activacion de cd163. - Google Patents
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Abstract
Utilización de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD163 que puede activar el CD163 en la preparación de una composición para el tratamiento de la citopenia, la anemia o la neutropenia.
Description
Producción de células sanguíneas mediante la
activación de CD163.
La presente invención se refiere a unos
procedimientos y composiciones destinadas a la estimulación del
crecimiento, proliferación, diferenciación y/o movilización de
células madre que conducen a la producción de células sanguíneas.
Más particularmente, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la proliferación de la hematopoyesis, incluyendo
la estimulación de la eritropoyesis y la mielopoyesis, a través de
la estimulación de las células madre, y de las células progenitoras
eritroides y mieloides, respectivamente.
Recientemente se ha identificado un receptor
depurador de la hemoglobina en monocitos y macrófagos (Kristiansen,
2001). Este receptor depura la hemoglobina a través de la mediación
de la endocitosis de complejos de
haptaglobina-hemaglobina. Este receptor también se
ha identificado como M130/CD163, una proteína transmembrana de fase
regulada aguda sobre la que se ha informado que se expresa
exclusivamente en monocitos y macrófagos. El CD163 pertenece a la
superfamilia del receptor depurador del grupo B rico en cisterna,
una familia de receptores que incluye el CD5, CD6 y WC1 que están
presentes en los linfocitos B, T y T
CD4^{-}8^{-}\gamma\delta, respectivamente. Los complejos de
hemoglobina y haptoglobina multimérica presentan una afinidad
funcional más elevada para el CD163 que los complejos de hemoglobina
y haptoglobina dimérica.
Los estudios previos sobre el entrecruzamiento
mediado por el anticuerpo del CD163 en cultivos de monocitos han
demostrado que la ligación del CD163 de superficie induce unas
señales dependientes de tirosina quinasa que da como resultado la
mobilización del calcio intracelular, la producción de inositol
trifosfato y el incremento de la secreción de citoquinas
antiinflamatorias, incluyendo la interleuquina 6
(IL-6) y el factor de estimulación de la colonia de
granulocitos macrófagos (GM-CSF) (van den Heuvel
et. al., 1999).
La hematopoyesis se define como la producción y
el desarrollo de las células madre, incluyendo los eritrocitos,
granulocitos, monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos,
megacariócitos, linfocitos B y linfocitos T (Wintrobe, 1999). La
hematopoyesis ocurre como resultado de la proliferación y
diferenciación de las células madre hematopoyéticas. Las células
madre hematopoyéticas son células pluripotentes que pueden dar
origen a las múltiples líneas celulares que se encuentran en la
sangre. Las células madre hematopoyéticas se encuentran en la médula
ósea y su crecimiento, proliferación y diferenciación se ven
influidos tanto por factores de crecimiento hematopoyético como por
las células estromales en el interior de la médula ósea. Se cree que
la células madre se encuentran normalmente en un estado quiescente
de no división hasta que son estimuladas por factores específicos de
crecimiento después de lo cual se dividen y dan origen a células
progenitoras altamente proliferativas que se dedican a la producción
de células sanguíneas de una o más líneas, tales como líneas
eritroide, mieloide o linfoide.
Algunos trastornos clínicos, denominados
citopenias, se caracterizan por el nivel disminuido de un tipo
específico de célula en la sangre circulante. Por ejemplo, la
neutropenia es un trastorno en el que existe un nivel reducido de
neutrófilos circulantes. Este trastorno se puede tratar con el
GM-CSF o el G-CSF, dos factores de
crecimiento hematopoyético distintos. Sin embargo, la
administración de estos factores de crecimiento se asocia a menudo
con una elevada incidencia de efectos secundarios adversos. Por
ejemplo, la administración de G-CSF después de un
transplante alógeno de médula ósea puede dar como resultado una
disnea, dolor torácico, náuseas, hipoxia, diaforesis, anafilaxis,
sincope y enrojecimiento. (Khoury et. al., 2000).
La neutropenia también se asocia al SIDA y
actualmente se trata con factores de crecimiento
(Dubreuil-Lemaire et. al., 2000). Asimismo,
existen formas de neutropenia congénita severa (Dale et. al.,
2000) en el que un pequeño porcentaje de los pacientes son
resistentes a la administración de factores de crecimiento.
La anemia es la consecuencia patológica de la
insuficiencia de hemoglobina para satisfacer los requerimientos de
transporte de oxígeno del cuerpo. Históricamente, algunas anemias se
han tratado con transfusiones de sangre o de hematíes. La
existencia de varias complicaciones asociadas a las transfusiones
hace que este tratamiento no sea deseable, incluyendo reacciones
hemolíticas, febriles o alérgicas, junto con el riesgo potencial de
la transmisión de enfermedades. Para el tratamiento de la anemia, es
deseable la estimulación del crecimiento y el desarrollo de las
células eritroides (eritropoyesis). Existen varias causas que
provocan la anemia, que incluyen la pérdida excesiva de sangre, el
aumento de destrucción de glóbulos rojos, disminución de la síntesis
de glóbulos rojos y una producción anormal de hemoglobina. La
disminución de la producción de glóbulos rojos puede ser debida a
una deficiencia de hierro (en la dieta, absorción deficiente del
tracto gastrointestinal, transporte o utilización ineficaz del
hierro para desarrollar glóbulos rojos), a una producción
insuficiente de eritropoyetinas (Epo) (insuficiencia renal) o
colapso de la médula ósea. Como la actividad eritropoyética de la
médula ósea está a salvo de anemias dependientes de hierro y Epo,
estas anemias son susceptibles de ser tratadas con terapias de
hierro y Epo, respectivamente.
La anemia debida a las deficiencias de hierro se
trata normalmente mediante la administración oral o intravenosa de
hierro. Los pacientes con insuficiencia renal crónica padecen
generalmente anemias dependientes de Epo debido a la incapacidad de
los riñones de producir Epo. Estos pacientes se someten a diálisis y
el 90% son clínicamente anémicos. El tratamiento tradicional para
la anemia en pacientes sometidos a diálisis que consiste en
múltiples transfusiones de sangre se ha sustituido ampliamente por
la administración de Epo. De hecho, \sim 88% de todos los
pacientes sometidos a diálisis son tratados con Epo. Un tercio de
los pacientes tratados con Epo desarrollan hipertensión, que se
puede corregir generalmente con fármacos de antihipertensivos. La
Epo estimula a las progenitoras eritroides para diferenciarlas en
glóbulos rojos maduros y sintetizar la hemoglobina, la proteína
principal de los glóbulos rojos.
El principal factor limitante de la terapia con
Epo es el coste de un tratamiento de larga duración. La dosis típica
de Epo para los pacientes con insuficiencia renal crónica es de 225
unidades/kg/semana administrada en tres dosis. El reembolso del
sistema sanitario para el tratamiento con Epo en EE.UU es de 10,00
dólares por 1.000 unidades, por consiguiente, el coste habitual para
un paciente de 70 kg de peso será de \textdollar8.000 anualmente.
En 1995, 175.000 pacientes norteamericanos se sometieron a diálisis
dando como resultado un valor de mercado por encima de
\sim\textdollar883 millones sólo para esta indicación. Se estima
que el coste de esta terapia será de \sim\textdollar1,1 miles de
millones en 1996. Por consiguiente, sería beneficioso para el
paciente y para el sistema de asistencia sanitaria encontrar nuevas
terapias que reduzcan la necesidad de la Epo para el tratamiento de
la anemia. El descubrimiento de otros agentes capaces de reducir los
requerimientos de Epo para el tratamiento de anemias dependientes de
Epo sería ventajoso.
Además, existen varios tipos de anemias que no
responden a la terapia con Epo. Ejemplos de estos tipos de anemia
incluyen la anemia inducida por la quimioterapia y la anemia por
enfermedad crónica, incluyendo las malignas. Los pacientes con
inmunodeficiencia adquirida también pueden padecer anemia, como
ocurre con pacientes con SIDA que son tratados con AZT. Estos tipos
de anemia pueden ser debidos a una eritropoyesis ineficaz como
resultado o bien de una supresión de la producción de Epo, o bien de
una disminución de la respuesta de la médula ósea a la Epo. El
tratamiento de estos tipos de anemia implica el tratamiento del
trastorno primario; sin embargo, si el trastorno primario no se
puede tratar fácilmente, entonces la terapia para la anemia puede
incluir transfusiones de glóbulos rojos. Los efectos secundarios
adversos de la transfusiones reacciones hemolíticas agudas y
retardadas y el riesgo potencial de enfermedades transmisibles de
las transfusiones.
En vista de lo expuesto anteriormente, existe la
necesidad en la técnica de desarrollar procedimientos mejorados para
aumentar el número de glóbulos rojos en un paciente a través de la
estimulación de la hematopoyesis.
Los inventores de la presente invención han
determinado que la activación del receptor depurador de la
hemoglobina CD163, puede estimular el crecimiento, proliferación y
diferenciación de los progenitores tanto eritroides como mieloides,
conduciendo a un incremento de la producción de glóbulos rojos. Los
inventores también han demostrado que el CD163 se expresa por las
células madre hematopoyéticas CD34^{+}.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para la estimulación del crecimiento,
la proliferación, la diferenciación y/o la movilización de una
célula madre capaz de expresar el receptor CD163, o de responder a
la vía de transducción de señal estimulada por el receptor, que
comprende la administración de una cantidad eficaz de una sustancia
que puede activar el CD163 en la célula madre, de una célula o de un
animal que lo necesite.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la estimulación de la hematopoyesis que comprende
la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar el CD163 de una célula o de un animal que lo necesite.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la estimulación de la eritropoyesis que comprende
la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar el CD163 de una célula o de un animal que lo necesite.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la estimulación de la mielopoyesis que comprende
la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar el CD163 de una célula o de un animal que lo necesite.
La presente invención asimismo incluye unas
composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de un
anticuerpo que puede activar el CD163 mezclado con un diluyente o un
vehículo adecuado.
La presente invención proporciona asimismo un
aditivo para el cultivo de células útil para potenciar el
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la movilización
de células madre y/o progenitoras que comprende una cantidad eficaz
de un anticuerpo que puede activar el CD163.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la selección de células madre o progenitoras en
una muestra que comprende (a) el contacto de la muestra con un
anticuerpo que puede unir el CD163 y (b) la selección de células que
están unidas a la sustancia.
Otras características y ventajas de la presente
invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la
descripción detallada siguiente. Debería entenderse, sin embargo,
que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque
indican formas preferidas de realización de la invención se
proporcionan únicamente a título ilustrativo.
A continuación, se describirá la invención en
relación con las figuras en las que:
La Figura 1 es un análisis Western blot de la
células CD34+ utilizando un anticuerpo
anti-CD163.
La Figura 2 muestra el efecto de un anticuerpo
en el CD163 en ensayos de formación de colonias hematopoyéticas.
La Figura 3 muestra que la inmunoreactividad del
CD163 es detectable en las células lisadas preparadas a partir de
las colonias BFU-E.
Tal como se ha mencionado anteriormente, los
inventores presentes han demostrado que las células madre CD34^{+}
expresan el receptor depurador de la hemoglobina CD163. Por
consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento
para la estimulación del crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula madre que
comprende la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo
que puede activar el CD163 en la célula madre para una célula o un
animal que lo necesite. La presente invención también proporciona
una utilización de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar el CD163 para estimular el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula madre. La presente
invención proporciona además una utilización de una cantidad eficaz
de un anticuerpo que puede activar el CD163 para preparar un
medicamento que estimula el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula madre.
La expresión "anticuerpo que puede activar el
CD163" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todos
los anticuerpos que se pueden unir, entrecruzar o ligar al receptor
CD163 depurador de la hemoglobina o un receptor relacionado con el
CD163 en las células y que da como resultado la estimulación del
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la movilización
de la célula.
La expresión "estimular el crecimiento, la
proliferación, la diferenciación y/o la movilización de una célula
madre" tal como se utiliza en la presente memoria significa que
el anticuerpo puede estimular o aumentar el crecimiento, la
proliferación, la diferenciación y/o la movilización de una célula
madre en comparación con el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula madre en ausencia
del anticuerpo.
La expresión "cantidad eficaz" tal como se
utiliza en la presente memoria significa una cantidad eficaz y en
dosis y durante periodos de tiempo necesarios para conseguir el
resultado deseado (por ejemplo, la estimulación del crecimiento, la
proliferación, la diferenciación y/o la movilización de células
madre, de células progenitoras eritroides y/o mieloides y/o la
estimulación de la hematopoyesis, la eritropoyesis o la
mielopoyesis).
El término "animal" tal como se utiliza en
la presente memoria incluye todos los miembros del reino animal y es
preferentemente un humano. La administración de una sustancia a un
animal incluye tanto las administraciones in vivo como ex
vivo.
La expresión "una célula" tal como se
utiliza en la presente memoria incluye una sola célula así como
varias o una población de células. La administración de una
sustancia a una célula incluye tanto las administraciones in
vivo como ex vivo.
La expresión "célula madre" tal como se
utiliza en la presente memoria significa que una célula que es capaz
de diferenciarse en cualquier célula en un animal incluyendo las
células hematopoyéticas. La célula madre expresará o será capaz de
expresar el receptor CD163 o de responder a la vía de transducción
de señal estimulada por el receptor.
Preferentemente, la célula madre es una célula
madre CD34+. Las células CD34+ se consideran tradicionalmente
células "madre" en el sentido de que son capaces tanto de
autorenovarse como de autorepoblarse en un individuo con células de
todas las líneas hematopoyéticas. Las células CD34+ se definen más
tarde en subpoblaciones mediante la coexpresión de otros marcadores,
tales como el CD38, y la capacidad de estas subpoblaciones de
reinjertarse y volver a repoblar el sistema hematopoyético (por
ejemplo, Henon et. al., 2001).
La estimulación de las células madre puede
facilitar la movilización de las células de los sitios
extravasculares de la médula para hacer circular la sangre que se
requiere para los protocolos que utilizan donantes de sangre
periférica para transplantes autólogos o heterólogos. El
recombinante humano G-CSF se utiliza ampliamente
para movilizar las células madre CD34* (para revisión, véase
Korbling, 1998). Tal como los inventores han demostrado, la
expresión del CD163 por parte de las células CD34+, es posible que
la estimulación de la vía del CD163 en dichas células da como
resultado su crecimiento y su proliferación y la posible
movilización en la sangre periférica. La utilización de los
estimuladores del CD163 (por ejemplo, un anticuerpo de
entrecruzamiento) en lugar de, o conjuntamente con unas cantidades
reducidas de, G-CSF puede dar como resultado la
movilización de células madre transplantables sin los efectos
secundarios que se asociarán con la administración de citoquina.
Los inventores han demostrado que la activación
de la vía del CD163 puede ser útil para la estimulación de la
hemataopoyesis de múltiples líneas al mostrar que las células
progenitoras tanto eritroides como mieloides se pueden estimular
mediante la activación del CD163. La estimulación de la
hematopoyesis es útil para generar tanto células sanguíneas como
células del sistema inmunológico incluyendo los eritrocitos y las
células mieloides (tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos,
neutrófilos, basófilos y megacariocitos) y las células linfoides
(células B, células T y células NK), así como las células
dendríticas de origen tanto mieloide como linfoide.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para la estimulación de la
hematopoyesis que comprende la administración de una cantidad eficaz
de una sustancia que puede activar el CD163 en una célula o en un
animal que lo necesite. La presente invención también proporciona la
utilización de una cantidad eficaz de una sustancia que puede
activar el CD163 para estimular la hematopoyesis. Además, la
presente invención proporciona la utilización de una cantidad eficaz
de una sustancia que puede activar el CD163 para preparar un
medicamento para estimular la hematopoyesis.
La estimulación de la hematopoyesis es útil para
el tratamiento de una amplia variedad de afecciones, incluyendo las
citopenias así como para estimular el desarrollo de células
sanguíneas para su utilización en transplantes o para estimular las
células del sistema inmunitario para su utilización en tratamientos
de inmunodeficiencias.
La frase "estimular la hematopoyesis" tal
como se utiliza en la presente memoria significa que la sustancia
puede estimular o potenciar el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula madre
hematopoyética o una célula progenitora hematopoyética (como una
progenitora eritroide, mieloide o linfoide) en comparación con el
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la movilización
de una célula madre hematopoyética o una célula progenitora en
ausencia de la sustancia.
Un experto en la materia puede determinar si la
sustancia que puede activar el CD163 puede estimular la
hematopoyesis o no. Por ejemplo, el ensayo de formación de colonias
es un procedimiento para cuantificar las células madre
hematopoyéticas y progenitoras (McCulloch, 1984). En el ensayo de
formación de colonias, las células se siembran en un medio
semisólido como metilcelulosa en presencia de varias citoquinas que
favorecen el crecimiento, la supervivencia y la diferenciación de
las células hematopoyéticas progenitoras. Los tipos de colonias
hematopoyéticas que se forman incluyen: unidad formadora de
estallido de la serie eritroide (BFU-E), unidades
formadoras de colonias - eritroide (CFU-E),
unidades formadoras de colonias de granulocitos y de macrófagos
(CFU-GM), unidad formadora de colonias de
macrófagos (CFU-M), unidades formadoras de colonias
de megacariocito (CFU- Meg) y colonias de granulocito, monocito y
megacariocito (GEMM). En los ensayos semisólidos, las células madre
o progenitoras responden a varias citoquinas y varias combinaciones
de estas citoquinas se han optimizado para el crecimiento y
diferenciación de los progenitores eritroides (por ejemplo,
IL-3 en combinación con EPO) o colonias
granulopoyéticas/monocito (por ejemplo, IL-1\beta,
IL-6 y SCF). Se necesitan algunas combinaciones
para enumerar tanto las colonias mieloides como las eritroides
independientemente, además de la enumeración de colonias
"mezcladas" más primitivas (por ejemplo, aquellas que incluyen
o bien G-SCF y GM-CSF, para la
revisión ver Messner, 1991, 7: 18-22). Cada célula
madre o célula progenitora prolifera y se diferencia para formar un
colonia morfológicamente diferente. Los dos tipos de progenitores
eritroides funcionalmente diferentes (BFU-E y
CFU-E) se identifican en base a sus capacidades de
formar colonias morfológicamente reconocibles cuando se hacen
crecer en un medio semisólido. La BFU-E representa
el progenitor eritroide más primitivo y forma unas colonias con
varios grupos, hemoglobinizados. La CFU-E es un
progenitor eritroide más diferenciado que forma unas colonias más
pequeñas, hemoglobinizadas. La BFU-E es el
progenitor más tempranamente identificable completamente implicado
en la eritropoyesis y presenta mayor capacidad para la
auto-renovación que la CFU-E más
madura. Para desarrollarse, las colonias progenitoras eritroides
generalmente requieren la presencia de eritropoyetina (Epo) en el
medio. Sin embargo, los progenitores eritroides primitivos
proliferan de un modo Epo-independiente.
Al mismo tiempo que proporcionan un medio para
cuantificar las células madre hematopoyéticas y progenitoras, el
ensayo de formación de colonias proporciona asimismo un medio para
obtener información acerca de los factores que afectan la
proliferación y diferenciación de la progenie de células madre y
células progenitoras. Por ejemplo, las colonias progenitoras
eritroides surgen de una célula progenitora única que se divide y se
diferencia de modo que la colonia madura está compuesta
predominantemente de eritroblastos hemoglobinizados.
Morfológicamente, el tamaño de una colonia eritroide puede
proporcionar información acerca de la velocidad o la extensión de la
proliferación de la progenie del progenitor eritroide. También, una
colonia eritroide más roja puede sugerir un contenido mayor de
hemoglobina, y un grado posiblemente mayor de diferenciación de los
eritroblastos.
Como se ha mencionado anteriormente, los
inventores han mostrado que la activación de CD163 incrementa la
proliferación y diferenciación de las células eritroides. Por
consiguiente, en otra forma de realización, la presente invención
proporciona un procedimiento para la estimulación de la
eritropoyesis que comprende la administración de una cantidad
eficaz de una sustancia que puede activar CD163 en una célula o un
animal que lo necesita. La presente invención proporciona también
la utilización de una cantidad eficaz que puede activar CD163 para
estimular la eritropoyesis. La presente invención proporciona
también la utilización de una cantidad eficaz de una sustancia que
puede activar CD163 para preparar un medicamento que estimula la
eritropoyesis.
La frase "estimula la eritropoyesis" como
se utiliza en la presente memoria significa que el anticuerpo puede
estimular o potenciar el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula eritroide o una
célula progenitora eritroide o célula madre cuando se compara al
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la
movilización de una célula eritroide o una célula progenitora
eritroide o célula madre en ausencia del anticuerpo. Un experto en
la materia puede determinar si el anticuerpo que puede activar CD163
puede estimular o no la eritropoyesis. Por ejemplo, se puede
utilizar el ensayo de formación de colonias descrito anteriormente y
en los ejemplos.
La estimulación de la eritropoyesis resulta útil
para el tratamiento de la anemia. Por consiguiente, en una forma de
realización específica, la presente invención se refiere a un
procedimiento para el tratamiento de la anemia que comprende la
administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar CD163 en una célula o animal que lo necesitan. La presente
invención puede proporcionar además la utilización de una cantidad
eficaz de un anticuerpo que puede activar CD163 para tratar la
anemia, La presente invención puede proporcionar además la
utilización de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar CD163 para preparar un medicamento para tratar la
anemia.
Los inventores han mostrado asimismo que la
activación de CD163 incrementa la proliferación de las células
mieloides. Por consiguiente, en otra forma de realización, la
presente invención proporciona un procedimiento para la estimulación
de la mielopoyesis que comprende la administración de una cantidad
eficaz de un anticuerpo que puede activar CD163 en una célula o
animal que lo necesita. La presente invención proporciona también
una utilización de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar el CD163 para estimular mielopoyesis. La presente invención
proporciona asimismo la utilización de una cantidad eficaz de un
anticuerpo que puede activar CD163 para preparar un medicamento que
estimula la mielopoyesis.
La frase "estimula la mielopoyesis" como se
utiliza en la presente memoria significa que el anticuerpo puede
estimular o potenciar el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de una célula mieloide o una
célula progenitora mieloide o célula madre cuando se compara al
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la movilización
de una célula mieloide o una célula progenitora mieloide o célula
madre en ausencia del anticuerpo. Un experto en la materia puede
determinar si el anticuerpo que puede activar CD163 puede estimular
o no la eritropoyesis. Por ejemplo, se puede utilizar el ensayo de
formación de colonias descrito anteriormente y en los ejemplos.
La estimulación del crecimiento, de la
proliferación, la diferenciación y/o la movilización de las células
mieloides se puede utilizar para tratar las neutropenias. La
estimulación de las células mieloides mediante la activación de
CD163 del patrón de CD163 puede sustituir/aumentar la efectividad de
los factores de crecimiento en la superación de las neutropenias
asociadas a los transplantes de médula ósea con el beneficio añadido
de unos efectos secundarios más leves. El procedimiento se puede
utilizar adicionalmente para tratar las neutropenias asociadas al
SIDA o las neutropenias congénitas severas. Por consiguiente, en una
forma de realización específica, la presente invención proporciona
un procedimiento para el tratamiento de la neutropenia que comprende
la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar CD163 en una célula o un animal que lo necesita. La presente
invención proporciona también la utilización de una cantidad eficaz
de un anticuerpo que puede activar CD163 para tratar la neutropenia.
La presente invención proporciona asimismo la utilización de una
cantidad eficaz de un anticuerpo que puede activar el CD163 para
preparar un medicamento para tratar la neutropenia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, y
como se entiende bien en la técnica, "tratar" o
"tratamiento" es un enfoque para obtener unos resultados
beneficiosos o deseados, que incluye los resultados clínicos. Los
resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no
se limitan a, el alivio o la mejora de uno o más síntomas o
manifestaciones, disminución de la extensión de la enfermedad, un
estado estabilizado (es decir no empeoramiento) de la enfermedad, la
prevención de la diseminación de la enfermedad, retraso o
enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejora o
paliación del estado de una enfermedad, y remisión (ya sea parcial o
total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" puede
significar también una supervivencia prolongada cuando se compara
con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento.
La presente invención incluye la utilización de
unos anticuerpos antiCD163.
Los anticuerpos frente CD163 pueden proceder de
fuentes comerciales fácilmente disponibles de Serotec Inc, o Maine
Biotechnology Services. Además, un experto en la materia puede
preparar fácilmente unoa anticuerpos frente a CD163 utilizando unos
procedimientos conocidos en la técnica como los descritos por Kohler
y Milstein , Nature, 1975, 256:495 y en las patentes US nº RE
32.011; nº 4.902.614; nº 4.543.439 y nº 4.411.993, que se incorporan
a la presente memoria como referencia. (ver también Monoclonal
Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,
Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.), 1980 y Antibodies:
A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1988, que también se incorpora a la presente
memoria como referencia).
Por ejemplo, mediante la utilización de CD163,
los antisueros policlonales o anticuerpos monoclonales se puede
preparar utilizando los procedimientos estándar. Un mamífero (por
ejemplo, un ratón, un hámster o un conejo) se pueden inmunizar con
una forma inmunogénica del péptido que obtiene una respuesta del
anticuerpo en el mamífero. Las técnicas que confieren
inmunogenicidad en un péptido incluyen la conjugación a vehículos u
otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la
proteína o péptido se pueden administrar en presencia de un
adyuvante. El progreso de la inmunización se puede monitorizar
mediante la detección de los títulos de los anticuerpos plasmáticos
o séricos. Los procedimientos de ELISA estándar u otros de
inmunoensayo se pueden utilizar con el inmunógeno como antígeno para
evaluar los niveles de anticuerpos. Después de la inmunización, se
puede obtener el antisuero y, si se desea, los anticuerpos se aíslan
del suero.
Para producir los anticuerpos monoclonales, las
células que producen anticuerpos (linfocitos) se pueden extraer de
un animal inmunizado y se fusionan con unas células de mieloma
mediante los procedimientos de la fusión de células somáticas
estándares inmortalizando de este modo estas células y produciendo
las células de hibridoma. Dichos procedimientos son bien conocidos
en la técnica, (por ejemplo, la técnica de hibridoma desarrollada
originariamente por Kohler y Milstein (Nature 256,
495-497 (1975)) así como otras técnicas como el
procedimiento de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et
al., Inmunol. Today 4, 72 (1983)), la técnica
EBV-hibridona para producir los anticuerpos
monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies in
Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., páginas
77-96), y el cribado de las bibliotecas de
anticuerpos combinatorios (Huse et al., Science 246, 1275
(1989)). Las células de hibridoma se puede cribar inmunoquímicamente
para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con el
péptido y se pueden aislar los anticuerpos monoclonales.
El térmico "anticuerpo" tal como se utiliza
en la presente memoria pretende incluir sus fragmentos que también
reaccionan específicamente con CD163, o su péptido. Los anticuerpos
se pueden fragmentar utilizando las técnicas convencionales y los
fragmentos se criban para la utilidad del mismo modo que se ha
descrito anteriormente. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2
se pueden generar mediante el tratamiento del anticuerpo con
pepsina. El fragmento F(ab')2 se puede tratar para reducir
los puentes disulfuro para producir los fragmentos Fab'.
Los derivados de anticuerpo quimérico, es decir,
las moléculas de anticuerpo que combinan una región variable animal
no humana y una región humana constante que también están
contempladas en el alcance de la invención. Las moléculas de
anticuerpo quimérico pueden incluir, por ejemplo, el dominio de
unión de antígeno a partir de un anticuerpo de un ratón, una rata u
otras especies con unas regiones humanas constantes. Se pueden
utilizar los procedimientos convencionales para preparar los
anticuerpos quiméricos que contienen una región de inmunoglobulina
variable que reconoce los antígenos CD163. (Ver , por ejemplo,
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81.6851 (1985);
Takeda et al., Nature 314, 352 (1985), Cabilly et al.,
patente US nº 4.816.567; Boss et al., patente US nº
4.816.397; Tanaguchi et al., solicitud de patente europea EP
1 714 96; publicación de patente europea 0173494, patente británica
GB 2177096B). Se espera que los anticuerpos quiméricos pueden
resultar menos inmunogénicos en un sujeto humano que el anticuerpo
no quimérico correspondiente.
Los anticuerpos monoclonales o quiméricos
específicamente reactivos con una proteína de la invención como se
describe en la presente memoria se pueden humanizar asimismo
mediante la producción de unas regiones quimera humanas constantes,
en cuyas partes de las regiones variables, particularmente las
regiones marco conservadas del dominio de unión de antígeno, son de
origen humano y son las regiones hipervariables tienen un origen no
humano. Dichas moléculas de inmunoglobulina se preparan mediante
técnicas conocidas en la técnica, (por ejemplo, Teng et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 7308-7312 (1983);
Kozbor et al., Immunology Today , 4, 7279 (1983); Olsson
et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982) y
publicación PCT WO92/06193 o EP 0 239 400). Los anticuerpos
humanizados también se pueden producir comercialmente (Scotgen
Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña).
Los anticuerpos específicos, o los fragmentos de
los anticuerpos, reaccionan frente a CD163 se pueden generar
también mediante el cribado de las bibliotecas de expresión de los
genes que codifican para las inmunoglobulinas, o sus porciones,
expresadas en bacterias con unos péptidos producidos a partir de las
moléculas de ácidos nucleicos que codifica para CD163 o sus partes.
Por ejemplo, los fragmentos Fab completos, las regiones VH y las
regiones FV se pueden expresar en bacterias que utilizan las
bibliotecas de expresión de fagos (Ver por ejemplo Ward et
al., Nature 341, 544-546: (1989); Huse et
al., Science 246, 1275-1281 (1989), y McCafferty
et al., Nature 348, 552-554 (1990)).
Alternativamente, un ratón SCID-hu, por ejemplo el
modelo desarrollado por Genpharm Inc, se puede utilizar para
producir anticuerpos o sus fragmentos.
Los anticuerpos de la invención incluyen también
unos anticuerpos bifuncionales que comprende un anticuerpo
específico para CD163 unido directamente a otro anticuerpo
específico para otro antígeno en la superficie de la célula madre.
Los anticuerpos bifuncionales se pueden preparar mediante
acoplamiento químico de un anticuerpo a otro, por ejemplo mediante
la utilización de
N-succinimidil-3-(2-piridiltio)
propionato (SPDP). Los anticuerpos de la invención incluyen también
unos anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos
contienen una región variable de un anticuerpo específico para
CD163 y una región específica variable para por lo menos un
antígeno en la superficie de las células madre que se van a marcar.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar mediante la
formación de hibridomas híbridos. Los hibridomas híbridos se pueden
preparar utilizando unos procedimientos conocidos en la técnica como
los que se describen en Staerz & Bevan, (1986, PNAS (USA) 83:
1453) y Staerz & Bevan (1986, Inmunology Today, 7:241). Los
anticuerpos biespecíficos también se puede construir por unos medios
químicos que utilizan unos procedimientos como los que se han
descrito en Staerz et al., (1985, Nature, 314:628) y Perez
et al., (1985 Nature 316:354), o mediante la expresión de los
constructos de gen de inmunoglobulina recombinante.
También se pueden identificar las otras
sustancias que pueden activar CD163. Por ejemplo, las sustancias que
se pueden unir a CD163 en las células madre o las células
progenitoras se puede identificar mediante la reacción de CD163 con
una sustancia que se une potencialmente a CD163, y después se
detecta si se han formado los complejos entre CD163 y la
sustancia.
Un procedimiento para la identificación de
sustancias que se pueden unir a CD163 que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- reacción CD163 y una sustancia de prueba, en unas condiciones que permite la formación de un complejo entre CD163 y la sustancia control, y
- b)
- ensayo de los complejos de CD163 y la sustancia de prueba, para la sustancia libre o para CD163 no acomplejado, en el que la presencia de complejo indica que la sustancia de prueba es capaz de unirse a CD163.
Las condiciones que permiten la formación de los
complejos de una sustancia y CD163 se deben seleccionar teniendo en
cuenta los factores así como la naturaleza y las cantidades de la
sustancia y la proteína.
El complejo sustancia-CD163, la
sustancia libre y las proteínas no acomplejadas se pueden aislar
mediante unos procedimientos de aislamiento convencionales, por
ejemplo, salting out, cromatografía, electroforesis, filtración en
gel, fraccionamiento, absorción, electroforesis en gel de
poliacrilamida, aglutinación o sus combinaciones. Para facilitar el
ensayo de los componentes, se puede utilizar un anticuerpo frente a
CD163 o la sustancia, o CD163 marcado, o una sustancia marcada. Los
anticuerpos CD163, o las sustancias se pueden aislar con una
sustancia detectable.
El CD163 o la sustancia de prueba utilizada en
el procedimiento se puede insolubilizar. Por ejemplo, el CD163 o
sustancia se puede unir a un vehículo adecuado. Los ejemplos de
vehículos adecuados son agarosa, celulosa, dextrano, sefarex,
sefarosa, carboximetilcelulosapoliestireno, papel de filtro, resina
intercambiadora de iones, película de plástico, tubo de plástico,
perlas de cristal, sílice, copolímero de poliamino metil viniléter
ácido maléico, copolímero de ácido amino, copolímero de
etileno-ácido maléico, nylon, seda, etc. El vehículo se puede
presentar en forma de, por ejemplo, tubo, placa de ensayo, perlas,
disco, esfera, etc.
El CD163 o sustancia insolubilizada se puede
preparar mediante la reacción del material con un vehículo insoluble
adecuado utilizando procedimientos químicos o físicos, por ejemplo,
acoplamiento de bromuro cianógeno.
El CD163 o sustancia de prueba también se puede
expresar en la superficie de una célula en el ensayo anterior.
La presente invención asimismo también unas
composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos que
activan CD163 para la utilización en la estimulación de la
hematopoyesis, la estimulación de la eritropoyesis, la estimulación
de la mielopoyesis o para la estimulación del crecimiento, la
proliferación, la diferenciación y/o la movilización de las células
madre y/o células progenitoras. Por consiguiente, la presente
invención proporciona una composición farmacéutica para la
estimulación la hematopoyesis que comprende una cantidad eficaz de
un anticuerpo que puede activar CD163 mezclado con un vehículo o
diluyente adecuado. La presente invención proporciona también una
composición farmacéutica para la estimulación de la eritropoyesis
que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede
activar CD163 mezclado con un vehículo o diluyente adecuado. La
presente invención proporciona también una composición farmacéutica
para la estimulación de la mielopoyesis que comprende una cantidad
eficaz de un anticuerpo que puede activar CD163 mezclado con un
vehículo o diluyente adecuado. La presente invención proporciona
además una composición farmacéutica para la estimulación el
crecimiento de las células madre, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización que comprende una cantidad eficaz
de un anticuerpo que puede activar CD163 mezclado con un vehículo o
diluyente adecuado. La presente invención proporciona además una
composición farmacéutica para la estimulación del crecimiento de las
células eritroides y/o mieloides, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización que comprende una cantidad eficaz
de un anticuerpo que puede activar CD163 mezclado con un vehículo o
diluyente adecuado.
Para la estimulación de la eritropoyesis, la
composición farmacéutica puede contener además uno o más factores
hematopoyéticos de crecimiento tales como la eritropoyetina. Para la
estimulación de la mielopoyesis, la composición farmacéutica puede
incluir además uno o más factores hematopoyéticos de crecimiento
tales como G-CSF, GM-CSF,
IL-3, etc.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser
para una utilización intralesional, intravenosa, tópica, rectal,
parenteral, local, inhalada o subcutánea, intradérmica,
intramuscular, intratecal, transperitoneal, oral e intracerebral.
Las composiciones se pueden presentar en forma líquida, sólida o
semisólida, por ejemplo, píldoras, pastillas, cremas, cápsulas de
gelatina, cápsulas, supositorios, cápsulas de gelatina blanda,
geles, membranas, comprimidos, soluciones o suspensiones.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pueden concebir para su administración en humanos o en animales.
Las dosis que se deben administrar dependen de las necesidades de
cada individuo, del efecto deseado y de la vía de administración
seleccionada.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
preparar mediante procedimientos conocidos per se para la
preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que se
pueden administrar a pacientes, y de modo que una cantidad eficaz de
la sustancia activa se combina en una mezcla con un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se describen,
por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA
1985).
Sobre esta base, la composición farmacéutica
incluye, aunque no exclusivamente, el compuesto o la sustancia
reactiva asociada con uno o más vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables, y contenida en soluciones tamponadas
con un pH adecuado e isosmótico con los fluidos fisiológicos. Las
composiciones farmacéuticas pueden contener además otros agentes que
pueden estimular la hematopoyesis, la eritropoyesis o la
mielopoyesis, o que pueden estimular el crecimiento, la
proliferación, la diferenciación y/o la movilización de células
madre y/o células progenitoras.
Los anticuerpos que activan el CD163 se pueden
utilizar como aditivos en medios de cultivo para potenciar el
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la movilización
de células progenitoras y/o madre de mamíferos o para estimular la
hematopoyesis, la eritropoyesis o la mielopoyesis. Por consiguiente,
la presente invención proporciona un aditivo para cultivo de células
útil para potenciar el crecimiento, la proliferación, la
diferenciación y/o la movilización de células progenitoras y/o madre
que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo que puede activar
el CD163. Los anticuerpos que activan el CD163 se pueden añadir a un
medio sin suero que se utiliza tradicionalmente para la expresión de
células madre hematopoyéticas. Por ejemplo, un medio sin suero con
la adición de factores de crecimiento tales como el factor de
células madre (SCF), interleuquina 3 (IL-3),
GM-CSF, ligando Flt (FL), trombopoyetina (TPO) y el
factor de estimulación de colonias de granulocitos
(G-CSF) (tal como se describe en Kobari et.
al., 2000) se puede complementar con un anticuerpo, que puede
activar el CD163.
Tal como se ha descrito anteriormente en la
presente memoria, los inventores han demostrado la presencia del
receptor del CD163 en las células CD34+ derivadas de la sangre del
cordón umbilical o de la médula ósea adulta o de sangre periférica.
La presencia del CD163 en estas células puede proporcionar un
importante herramienta de investigación y clínica ya que la
subpoblación de CD34+/CD163^{+} de las células se puede examinar
más para su habilidad de reinjertar y repoblar los diversos
compartimientos del sistema hematopoyético. Además, las células
"madre" derivadas de varias fuentes (médula ósea, sangre
periférica movilizada o sangre del cordón umbilical) se pueden
enriquecer, o clasificar para, la expresión del CD163.
La sustancia es un anticuerpo que se puede unir
al CD163 y las células se seleccionan utilizando técnicas
inmunoquímicas. Por ejemplo, las células madre que expresan el
receptor del CD163 se pueden "clasificar" o seleccionar
mediante la utilización de un anticuerpo anti-CD163,
mediante la formación de complejos de este anticuerpo con un
soporte sólido, extrayendo las células CD163 positivas de las otras
células en la muestra y extrayendo posteriormente las células CD163
positivas del soporte sólido. Por ejemplo, los anticuerpos
anti-CD163 pueden formar complejos en perlas
magnéticas. Las células CD163 positivas se pueden unir al anticuerpo
y se pueden extraer las células CD163 positivas de otras células en
la muestra con una fuente magnética. En la separación de las
células no CD163 positivas, las células CD163 positivas se pueden
despegar de las perlas magnéticas. Alternativamente, la expresión
de las células CD163 en células madre se puede utilizar para
clasificar estas células a través de la clasificación celular por
activación fluorescente (FACS) utilizando un
anti-CD163 marcado fluorescentemente. Muchos otros
procedimientos para purificar las células CD163 positivas serán
obvios para los expertos en la materia. El procedimiento se puede
utilizar para seleccionar células capaces de formar colonias de
líneas tanto eritroides como mieloides. Por consiguiente, la
presente invención proporciona un procedimiento para seleccionar
las células capaces de formar colonias de líneas tanto eritroides
como mieloides que comprende (a) el contacto de la muestra con un
anticuerpo que se puede unir al CD163 y (b) la selección de células
que están unidas a la sustancia, en la que las células unidas son
capaces de formar colonias de líneas tanto eritroides como
mieloides. La presente invención también proporciona un
procedimiento para seleccionar las células que son potencialmente
capaces de repoblar organismos con células de líneas tanto
eritroides como mieloides que comprende (a) el contacto de la
muestra con un anticuerpo que se puede unir al CD163 y (b) la
selección de células que están unidas a la sustancia, en la que las
células unidas son potencialmente capaces de formar colonias de
línea tanto eritroides como mieloides.
La invención también incluye la utilización de
un anticuerpo que se une al CD163 en un protocolo de selección
negativa para extraer las células progenitoras o madre de una
muestra. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
procedimiento para la extracción de células hematopoyéticas de una
muestra que comprende (a) el contacto de la muestra con un
anticuerpo que se puede unir al CD163 y (b) la extracción de las
células que se unen a la sustancia de la muestra.
Los ejemplos no limitativos siguientes son
ilustrativos de la presente invención:
Las células CD34+ derivadas de médula ósea de
adulto crioconservada (ABM) se permeabilizan utilizando una
solución Cytofix/Cytoperm (Pharmingen TRansduction Laboratories, una
división de BD BioSciences; Becton, Dickson and Company) durante 30
minutos a una temperatura de 4ºC, se lavan y después se incuban ya
sea con un anticuerpo control isotípico marcado con fluorescente
(IgG1-FITC) o un anticuerpo monoclonal CD163
anti-humano de ratón Mac-158
marcado fluorescentemente (MBS; Mac158-FITC). En
experimentos paralelos, las células de las mismas muestras de la
misma médula ósea se tiñen también extracelularmente con
anti-CD34 marcado fluorescentemente
(HPCA-2-PE) y
anti-CD45 (H130-FITC). Las muestras
que se analizan utilizando un citómetro de flujo EPICS XL (Beckman
Coulter, Inc) (Resultados presentados en la Tabla 1 indican que
alrededor del 95% de las células de la médula ósea son
CD34^{+}/CD45^{+} y la mayoría de estas células se tiñen también
con el anticuerpo anti-CD163.
Los lisados de células se preparan a partir de
las células CD34+ derivadas de médula ósea adulta mediante la
resuspensión de las células en el tampón CHAPS (0,5% CHAPS, Tris 10
mM, MgCl2 1mM, EDTA 1 mM y glicerol al 10%) que contiene un cóctel
de inhibidores de proteasas. Las células resuspendidas se incuban en
hielo durante 30 minutos. Los lisados se centrifugan y el
sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo. Para el análisis
Western blot, el sobrenadante se resuspende en una loción de carga
de muestra en SDS no reductor. Las muestras se someten después a
electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 8% y se
transfieren a un filtro de nylon. Los filtros de nylon se bloquean
con una solución que contiene leche desnatada y después se sondean
primero con el anticuerpo CD-163
anti-humano Mac-158, seguido por un
anticuerpo anti-ratón-cabra
conjugado con peroxidasa de rábano (BIO-RAD
Laboratories, Inc.) La unión del anticuerpo secundario se detecta
utilizando un equipo de quimioluminiscencia mejorada de Amersham
plc.
Tal como se demuestra en la Figura 1. La
inmunoreactividad de CD163 resulta detectable en el lisado de
células preparado a partir de las células CD34+.
El nivel de expresión extracelular de CD163 por
las células CD34+ se determina utilizando un análisis por citometría
de flujo de las células CD34+ crioconservadas derivadas de la médula
ósea de adulto y de las células mononucleares de baja densidad
(LDMNC) de sangre de cordón umbilical (UCB). Las células se tiñen
con anticuerpos anti-CD34
(HPCA-2-PE) y
anti-CD163 (Mac158-FITC) marcado con
fluorescente y después se analizan utilizando un citómetro de flujo
EPICS XL. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
La mayoría de las células CD163+
co-teñidas con el anticuerpo
anti-CD34, que indica que CD163 es expresado por las
células CD34+. El receptor CD163 humano se ha descrito anteriormente
como un receptor expresado exclusivamente en células tipo
monocito/macrófago. Estos datos demuestran que el CD163 se expresa
también mediante una población de células madre hematopoyéticas
humanas.
El efecto de un anticuerpo monoclonal de ratón
antihumano anti-CD163 (EDHu-1,
Serotec) se ensaya en un ensayo de formación de colonias en
condiciones que favorecen las colonias progenitoras eritroides
(BFU-E). Estas colonias se forman mediante unas
células progenitoras eritroides primitivas únicas en un medio
semisólido y son relativamente grandes y multiagrupadas. Las
células dentro de la colonia normalmente están hemoglobinizadas
después de 12 a 16 días de cultivo. Las células CD34+, enriquecidas
de la sangre de cordón umbilical (UCB), o células CD34+ derivadas
de médula ósea de adulto (ABM) se sembraron en metilcelulosa con
interleucina-3 10 ng/ml (IL-3) y
eritropoyetina 2 U/ml (Epo), en ausencia o presencia de anticuerpo
anti-CD163 a una concentración 50 \mug/ml. Se
evaluó el efecto del anticuerpo en varios progenitores eritroides y
los resultados se presentan en la Tabla 3:
El anticuerpo Anti-CD163, a una
concentración 50 \mug/ml, da como resultado un número mayor de
BFU-E a los que corresponden a las placas control.
Asimismo, se obtienen unos resultados similares utilizando un
anticuerpo anti-CD163 diferente (Mac 158) para
estimular CD163. La estimulación de las células CD34+ a través del
receptor CD163 incrementa la proliferación de progenitoras
eritroides presentes en la sangre de cordón umbilical o médula ósea
adulta.
El efecto de la activación de un anticuerpo
anti-CD163 se ensaya en el ensayo de formación de
colonias en unas condiciones que facilitan la formación de colonias
progenitoras eritroides. Las células CD34+, enriquecidas de sangre
del cordón umbilical se siembran en metilcelulosa (1.000 células/ml)
que contiene 10 ng/ml IL-3 y 2,0 U/ml Epo, en
presencia de ya sea un anticuerpo isótopo control (50 \mug/ml) o
un anticuerpo anti-CD163 (EDHu-1;
50 \mug/ml). Las placas de metilcelulosa se incuban en un
incubador humidificador con 5% de CO_{2}, y se mantuvieron a
37ºC. Las colonias (BFU-E) se enumeran y se evalúa
su morfología después de 14 días. Además para aumentar el número de
colonias eritroides, como se demuestra en el Ejemplo 4, el
anticuerpo anti-CD163 incrementa también el tamaño
y la rojez de las colonias progenitoras eritroides, cuando se
compara con el control isotipo (Figura 2). También se obtienen unos
resultados similares utilizando un anticuerpo
anti-CD163 diferente (Mac158) para estimular CD163.
También se obtienen unos resultados similares utilizando células
CD34+ derivadas de médula ósea adulta. Estos datos sugieren que la
estimulación de CD163 incrementa también la proliferación (tamaño de
colonia mayor) y la diferenciación (producción de hemoglobina mayor
y por ello, colonias más rojas) de las células eritroides presentes
en las colonias BFU-E.
Las células CD34+ de médula ósea de adulto se
siembran en metilcelulosa (1.000 células/ml) en presencia de 10
ng/ml IL-3 y 0,5 o bien 2,0 U/ml Epo. Las placas de
metilcelulosa se incuban en un incubador humidificador con 5% de
CO_{2}, y se mantuvieron a 37ºC. Después de 14 días, las células
de las colonias BFU-E se extraen de las placas, se
lavan, se enumeran y recoge el pellet. Los pellets de las células se
congelan a una temperatura de -80ºC. Se preparan los lisados de las
células a partir de un número equivalente de células y volumen igual
de lisado por estado se someten a un análisis de Western blot como
se describe en el Ejemplo 3.
Como muestra la Figura 3, la inmunoreactividad
de CD163 es fácilmente detectable en los lisados de células
preparados a partir de colonias BFU-E. Además, en
unas condiciones de concentraciones Epo reducidas, el nivel de
inmunoreactividad de CD163 está aumentado, lo que sugiere que Epo
puede modular la expresión de CD163.
El efecto de los anticuerpos CD163 también se
probó en unos ensayos de formación de colonias sin suero. Las
células mononucleares de baja densidad de sangre periférica adulta
(APB LDMNC) se siembran (1x10^{5} células/ml) en metilcelulosa
que contiene BSA al 1%, insulina 10 \mug/ml, transferrina humana
200 \mug/ml, IL-3 10 ng/ml y EPO 2,0 o bien 2,0
U/ml, con o sin dos anticuerpos anti-CD163
diferentes, EDHu-1 o Mac158. Las placas se incuban
durante 14 días a una temperatura de 37ºC a una concentración de
CO_{2} del 5%, después de la cual las colonias progenitoras
eritroides se enumeran. Como se muestra en la Tabla 4, se detectan
más colonias BFU-E cuando las células se tratan con
los anticuerpos anti-CD163 cuando se compara con las
células no tratadas. Además, las colonias que se forman en
presencia de anticuerpos anti-CD163 son más grandes
y más rojas que las formadas en ausencia del anticuerpo
anti-CD163. De este modo, la activación de CD163 da
como resultado una proliferación incrementada de los progenitores
eritroides, y un aumento en la proliferación y diferenciación de
las células eritroides dentro las colonias BFU-E en
unos ensayos de formación de colonias con suero y sin suero. En
estas condiciones de EPO reducidas, la estimulación de CD163 con
EDHu-1 o bien Mac158 da como resultado un aumento en
el número de colonias progenitores eritroides (Tabla 4). Estas
colonias también son mayores y más rojas que las que están presentes
en las placas control. Se obtienen resultados similares utilizando
CD34+ aislado de médula ósea o sangre de cordón umbilical. También
se obtienen resultados similares en unos ensayos de formación de
colonias que contienen suero. En ausencia de Epo, se detectan unas
colonias no eritroides en los ensayos de formación de colonias, ya
sea en presencia o ausencia de anticuerpos anti CD163.
Estos datos sugieren que la estimulación de
CD163 aumenta la proliferación de progenitores eritroides, así como,
la proliferación y diferenciación de las células eritroides con unas
concentraciones decreciente tanto de los ensayos que contienen suero
y sin suero. Sin embargo, la estimulación de CD163 no sustituye EPO
completamente en la formación de colonias eritroides.
El efecto del entrecruzamiento del anticuerpo
anti-CD163 (EDHu-1) se probó en unos
ensayos de formación de colonias en unas condiciones óptimas para el
crecimiento de las colonias progenitoras mieloides
(CFU-GM) (50 ng/ml SCF, 4 pg/ml
IL-1\beta, 6,25 ng/ml IL-6), CD34+
derivado de la sangre de cordón umbilical se sembraron a
metilcelulosa a una concentración de 2x10^{3} células/ml, con o
sin anticuerpos anti-CD163 a 50 \mug/ml. El efecto
del anti-cuerpo anti-CD163 sobre el
número de CFU-GM se evaluó después de 14 días de
cultivo a una temperatura de 37ºC en la tabla 5.
A una concentración de 50 \mug/ml, el
anticuerpo EDHu-1 da como resultado un aumento 1,7
veces de CFU-GM cuando se compara con la muestra
control. Esto sugiere que los progenitores mieloides tempranos
expresan el receptor CD163 y que la estimulación de este receptor
incrementa la proliferación de estas células.
CD34+ derivadas de células de sangre de cordón
umbilical se siembran en metilcelulosa a una concentración de
2x10^{3} células/ml en unas condiciones óptimas para el
crecimiento de las colonias progenitoras mieloides
(CFU-GM) (50 ng/ml SCF, 4 pg/ml
IL-1\beta, 6,25 ng/ml IL-6) y se
cultivan en un incubador humidificado a una temperatura de 37ºC con
CO_{2} al 5%. Después de 14 días, las células de las colonias
resultantes se extraen, se lavan, enumeran y se examinan por
citometría de flujo para la expresión de CD14 y CD163 que utilizan
los anticuerpos TUK4 y Mac158 marcados fluorescentemente,
respectivamente. Los resultados se presentan en la Tabla 6.
Aunque la presente invención se ha descrito
haciendo referencia a lo que se considera actualmente los ejemplos
preferidos, se debe entender que la invención no se limita a los
ejemplos adjuntos.
Claims (20)
1. Utilización de una cantidad eficaz de un
anticuerpo anti-CD163 que puede activar el CD163 en
la preparación de una composición para el tratamiento de la
citopenia, la anemia o la neutropenia.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el CD163 se expresa mediante una célula madre CD34 positiva.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que si la afección es anemia a continuación se administran uno o
más factores de crecimiento hematopoyético.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que el factor de crecimiento hematopoyético es eritropoyetina.
5. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que si la afección es neutropenia a continuación se administran
uno o más factores de crecimiento hematopoyético.
6. Utilización según la reivindicación 5, en la
que el factor de crecimiento hematopoyético es G-CSF
o GM-CSF.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el anticuerpo es un anticuerpo
quimérico.
8. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el anticuerpo es un anticuerpo
bifuncional.
9. Aditivo para el cultivo de células útil para
potenciar el crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la
movilización de células madre o células progenitoras in vitro
que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo
anti-CD163 que puede activar el CD163.
10. Aditivo para el cultivo de células según la
reivindicación 9 que no tiene suero.
11. Aditivo para el cultivo de células según la
reivindicación 9 que contiene suero.
12. Aditivo para el cultivo de células según una
de las reivindicaciones 9 a 11 para su utilización para aumentar el
crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la movilización
de células progenitoras eritroides in vitro.
13. Aditivo para el cultivo de células según la
reivindicación 12, que comprende asimismo eritropoyetina.
14. Aditivo para el cultivo de células según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para su utilización para
potenciar el crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la
movilización de células progenitoras mieloides in vitro.
15. Aditivo para el cultivo de células según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para su utilización para
potenciar el crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o la
movilización de células progenitoras o madre hematopoyéticas in
vitro.
16. Procedimiento para seleccionar células madre
o progenitoras en una muestra que comprende (a) el contacto de la
muestra con un anticuerpo anti-CD163 que se puede
unir al CD163 y (b) la selección de células que están unidas a la
sustancia.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que las células madre o progenitoras son células CD34
positivas.
18. Procedimiento para seleccionar células
capaces de formar colonias de líneas tanto eritroides como mieloides
que comprende (a) el contacto de la muestra con un anticuerpo
anti-CD163 que se puede unir a CD163 y (b) la
selección de células que están unidas a la sustancia.
19. Procedimiento para seleccionar células que
son potencialmente capaces de repoblar organismos con células de
líneas tanto eritroides como mieloides que comprende (a) el contacto
de la muestra con un anticuerpo anti-CD163 que se
puede unir a CD163 y (b) la selección de células que están unidas a
la sustancia.
20. Procedimiento para seleccionar células madre
o progenitoras de una muestra que comprende (a) el contacto de la
muestra con un anticuerpo anti-CD163 que se puede
unir a CD163 y (b) la extracción de células que se unen a la
sustancia de la muestra.
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