ES2321160T3 - Metodo de separacion cromatigrafica de paclitaxel y cefalomanina. - Google Patents
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Abstract
Método para separar paclitaxel de cefalomanina que comprende: obtener un material de partida que contiene paclitaxel y cefalomanina; disolver el material de partida en un disolvente que tiene la siguiente fórmula: en la que R 1 es hidrógeno o metilo y R 2 es un grupo alquilo o arilalquilo que contiene de cuatro a siete átomos de carbono, para formar una mezcla; someter la mezcla a cromatografía en columna usando un único disolvente de la fórmula facilitada anteriormente como eluyente para obtener una fracción eluida de paclitaxel, una fracción eluida de cefalomanina y un residuo; y secar por separado las fracciones de paclitaxel y cefalomanina para obtener formas cristalinas separadas de paclitaxel y cefalomanina, respectivamente.
Description
Método de separación cromatográfica de
paclitaxel y cefalomanina.
Esta invención se refiere a la separación de
paclitaxel de su análogo cefalomanina partiendo de extractos de
plantas del género Taxus o sus cultivos celulares. En
particular, se separa paclitaxel de cefalomanina mediante
cromatografía en columnas de gel de sílice de fase directa.
El paclitaxel, anteriormente denominado
"Taxol" es un agente anticancerígeno excepcionalmente
prometedor. Se aisló de la corteza de Taxus brevifolia por
Wani et al. en 1971 (J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, 1971) y se
definió su estructura usando métodos químicos y análisis
cristalográfico de rayos X.
El paclitaxel ha sido aprobado por la Food and
Drug Administration ("Agencia de Alimentos y Medicamentos")
para el tratamiento del cáncer de mama y de ovarios y actualmente se
encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de cánceres de
pulmón y colon (por ejemplo, véase W.P. McGuire y E.K. Rowinsky,
Paclitaxel in Cancer Treatment, M. Dekker, Nueva York 1995, páginas
1 a 337).
Una fuente natural primaria de paclitaxel es la
corteza del tejo del Pacífico, Taxus brevifolia. También se
ha encontrado que el paclitaxel está presente en las partes epigeas
y las raíces de otras especies de tejo, incluyendo el tejo europeo
(Taxus baccata), tejos asiáticos (Taxus wallichiana y
Taxus chinensis) y tejos cultivados para fines ornamentales
(por ejemplo, Taxus media).
El método de aislamiento de paclitaxel de
cualquier recurso natural es complejo y caro, en parte debido a las
concentraciones relativamente bajas en los materiales vegetales pero
también debido a la presencia de uno de sus congéneres, la
cefalomanina. Los contenidos de y las razones entre paclitaxel y
cefalomanina varían en los materiales vegetales dependiendo de la
especie y de la parte de la planta en cuestión. En general, se ha
encontrado que el contenido de paclitaxel y cefalomanina oscila
desde el 0,001% hasta el 0,08% y del 0,001% al 0,22%,
respectivamente (K. M. Witherup et al., J. Nat. Prod., 53,
1249, 1990; R.G. Kelsey et al., J. Nat. Prod., 55, 912,
1992; N.C. Wheeler et al., J. Nat. Prod., 55, 432, 1992). En
particular, la especie Taxus media que, siendo un material
vegetal renovable, es el material de partida usado más comúnmente
para la preparación de paclitaxel, contiene en promedio la mayor
concentración de cefalomanina en comparación con las demás
especies.
Incluso las técnicas de producción de paclitaxel
basadas en cultivos celulares de tejo, a las que recientemente se
les ha dado un empuje sustancial para evitar la extracción
convencional de material vegetal caro, producen una cantidad
relevante de cefalomanina además de paclitaxel.
La única diferencia estructural entre paclitaxel
y cefalomanina implica la parte de cadena lateral del compuesto,
dando lugar así a propiedades químicas similares. Por tanto, los dos
compuestos tienen propiedades cromatográficas muy similares y es
difícil una separación limpia de estos compuestos relacionados. Se
han propuesto varios métodos cromatográficos, basados
principalmente en el uso de cromatografía de fase inversa o caras
columnas de fase ligada (J.H. Cardellina, J. Liq. Chromatogr., 14,
659, 1991; S.L. Richheimer et al., Anal. Chem. 64, 2323,
1992; E.R.M. Wickremesinhe et al., J. Liq. Chromatogr., 16,
3263, 1993; K.M. Witherup et al., J. Liq. Chromatogr., 12,
2117, 1989), pero éstas no pueden adaptarse fácilmente para un
funcionamiento a gran escala comercial. Por este motivo, la
disponibilidad de métodos que permitan la separación de paclitaxel y
cefalomanina sigue siendo un tema de gran importancia práctica.
En el pasado, se propusieron métodos de
separación de paclitaxel y cefalomanina, basados en la diferente
reactividad de los dos compuestos frente a oxidantes. Se encontró
que el doble enlace olefínico que existe en el residuo tíglico de
la cefalomanina podía oxidarse mediante la reacción con tetróxido de
osmio (D.G.I. Kingston et al., J. Nat. Prod., 55, 259, 1992)
u ozono (J.T. Beckvermit et al., J. Org. Chem., 61, 9038,
1996), mientras que el paclitaxel no experimentaba ninguna
transformación química durante las reacciones de oxidación. Otro
enfoque consideró el tratamiento de mezclas de paclitaxel y
cefalomanina con bromo (J.M. Rimoldi et al., J. Nat. Prod.,
59, 167, 1996). El tratamiento con bromo, realizado en condiciones
controladas de temperatura y tiempo de reacción, provoca la
formación de dibromocefalomanina, mientras que el paclitaxel no se
ve afectado por este reactivo químico. Sin embargo, estos métodos
tienen un inconveniente en el uso de reactivos tóxicos tales como
tetróxido de osmio y, en cualquier caso, dan como resultado la
destrucción o transformación de cefalomanina en sus derivados, a
partir de los cuales sólo puede regenerarse la cefalomanina a través
de difíciles procedimientos sintéticos. Por tanto, existe todavía
la necesidad de una separación económica, sencilla, segura y eficaz
de cefalomanina de paclitaxel. Por consiguiente, el objetivo
primario de esta invención es proporcionar un método sencillo para
separar paclitaxel y cefalomanina a partir de sus mezclas o
extractos de tejo.
La presente invención proporciona un método para
separar paclitaxel de cefalomanina y otros compuestos relacionados.
En particular, este método comprende obtener un material de partida
que contiene paclitaxel y cefalomanina; disolver el material de
partida en uno cualquiera de varios disolventes particularmente
definidos para formar una mezcla; someter la mezcla a cromatografía
en columna para obtener una fracción eluida de paclitaxel, una
fracción eluida de cefalomanina y un residuo; y secar por separado
las fracciones de paclitaxel y cefalomanina para obtener formas
cristalinas separadas de paclitaxel y cefalomanina, respectivamente.
El disolvente es preferiblemente formiato de butilo o acetato de
butilo o bencilo.
Sorprendentemente, se encontró que podía
obtenerse paclitaxel y cefalomanina sumamente puros con grandes
rendimientos mediante separación cromatográfica en una columna de
gel de sílice de fase directa usando un disolvente como eluyente.
Preferiblemente, este disolvente tiene la siguiente fórmula
general:
en la que R_{1} es hidrógeno o
metilo y R_{2} contiene preferiblemente cuatro átomos de carbono,
es decir, puede ser n-butilo, isobutilo,
sec-butilo o t-butilo. Estos
disolventes no se usan frecuentemente en la purificación
cromatográfica en columna de rutina, pero proporcionan resultados
prácticos sorprendentemente buenos en el caso específico de la
separación de
paclitaxel-cefalomanina.
El material de partida de esta invención puede
ser una mezcla de cefalomanina y paclitaxel solos en cualquier
razón o un extracto de raíces, hojas, ramas, semillas frescas o
secas de Taxus, o sus mezclas. El método de esta invención
puede implicar también un extracto obtenido a partir de un cultivo
celular. Estos materiales de partida los conoce generalmente un
experto en la técnica de modo que no es necesario mencionarlos
adicionalmente en el presente documento.
El extracto en cuestión puede ser un extracto
bruto o uno purificado, habiéndose tratado este último con
disolventes convencionales y sometido a una purificación
cromatográfica preliminar. De nuevo, estas técnicas las conoce bien
el experto de modo que no es necesario hacer una mención adicional
en el presente documento. El material de partida puede estar en
forma de un sólido, un jarabe o un material gomoso semisólido,
dependiendo de las condiciones experimentales usadas para su
preparación. El material puede someterse simplemente a cromatografía
en columna tras su disolución en uno de los disolventes descritos
en el presente documento.
La purificación cromatográfica de la invención
utiliza un gel de sílice de fase directa simple, en una cantidad de
aproximadamente 50 a 100 partes en peso del material de partida,
dependiendo de su composición.
La cromatografía en columna con los disolventes
de la invención es rápida, no requiere altas presiones y se realiza
en condiciones normales de gravedad.
La tabla 1 muestra el comportamiento de la
cefalomanina y el paclitaxel en el análisis de cromatografía en
capa fina usando placas de gel de sílice y una serie de los
disolventes de la invención que permite una separación
satisfactoria de los dos compuestos.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de los disolventes descritos en esta
invención para aislar paclitaxel y cefalomanina mediante
cromatografía en una columna de gel de sílice de fase directa
ofrece varias ventajas.
En primer lugar, la cromatografía en columna
produce paclitaxel prácticamente libre de cefalomanina y, a la
inversa, cefalomanina casi libre de paclitaxel. En segundo lugar, el
uso del gel de sílice de fase directa ofrece considerables ventajas
económicas con respecto al uso de los geles de sílice de fase
inversa descritos en la bibliografía anterior, y en tercer lugar,
el uso de un disolvente para la elución de la columna permite su
rápida recirculación sin recurrir a destilación fraccionada en
operaciones relacionadas con preparaciones en procesos continuos
industriales. Cualquier otro constituyente presente en el material
de partida junto con el paclitaxel y la cefalomanina se elimina
mediante purificación cromatográfica.
Las fracciones eluidas se evaporan a vacío hasta
sequedad, y los residuos se cristalizan mediante un disolvente
adecuado para obtener paclitaxel y cefalomanina en la forma
cristalina deseada.
Por tanto, el método descrito en esta invención
proporciona una solución sencilla para la preparación de cantidades
considerables de paclitaxel libre de cefalomanina, aumentando el
rendimiento de la cantidades obtenidas y fomentando un
procedimiento de producción más económico de este fármaco
antitumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran, pero no
limitan, esta invención.
Ejemplo
1
Se encuentra que un extracto de 290 g, preparado
a partir de 620 kg de Taxus media (planta completa) según el
procedimiento descrito por V. Senilh et al. (J. Nat. Prod.
47, 131, 1984), contiene 183 g de paclitaxel y 81 g de cefalomanina
por medio de análisis de HPLC. Se disuelve el extracto en 3,5 l de
acetato de t-butilo y se carga en una columna que
contiene 60 kg de gel de sílice. Se eluye un total de 1.200 l de
t-butilo. Tras la elución de 350 l de disolvente se
obtienen una fracción de 400 l que contiene paclitaxel y menos del
3% de cefalomanina y otra fracción de 200 l que contiene
cefalomanina y menos del 3% de paclitaxel. Se concentran a vacío
las dos fracciones hasta sequedad, por separado, y se cristalizan
los residuos mediante hexano-acetona. Los 154 g de
paclitaxel y 70 g de cefalomanina así obtenidos tienen una pureza
por HPLC superior al 99%, y sus valores fisicoquímicos y
espectroscópicos concuerdan con la información proporcionada por la
bibliografía (G.N. Chmurny et al., J. Nat. Prod. 55, 414,
1992; C.J. Falzone et al., Tetrahedron Letters, 33, 1169,
1992; V. Senilh et al. J. Nat. Prod. 47, 131, 1984).
\newpage
Ejemplo
2
Se disuelve una mezcla que contiene 70 g de
paclitaxel y 30 g de cefalomanina en 1,5 l de formiato de
t-butilo y se carga en una columna que contiene 10
kg de gel de sílice suspendido en el mismo disolvente. Se eluye la
columna con formiato de t-butilo y se reúnen las
fracciones tras análisis de HPLC/CCF. Se concentran las fracciones
que contienen paclitaxel y cefalomanina hasta sequedad, por
separado, y se cristalizan los residuos mediante acetona y heptano
en razones adecuadas para producir paclitaxel y cefalomanina que
tienen una pureza por HPLC superior al 99%.
Claims (8)
1. Método para separar paclitaxel de
cefalomanina que comprende:
obtener un material de partida que contiene
paclitaxel y cefalomanina;
disolver el material de partida en un disolvente
que tiene la siguiente fórmula:
en la que R_{1} es hidrógeno o
metilo y R_{2} es un grupo alquilo o arilalquilo que contiene de
cuatro a siete átomos de carbono, para formar una
mezcla;
someter la mezcla a cromatografía en columna
usando un único disolvente de la fórmula facilitada anteriormente
como eluyente para obtener una fracción eluida de paclitaxel, una
fracción eluida de cefalomanina y un residuo; y
secar por separado las fracciones de paclitaxel
y cefalomanina para obtener formas cristalinas separadas de
paclitaxel y cefalomanina, respectivamente.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho material de partida contiene cualquier razón de cefalomanina
y paclitaxel.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho material de partida es un extracto de raíces, hojas,
ramas, semillas frescas o secas de Taxus, o sus mezclas.
4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho material de partida es un extracto obtenido de un cultivo
celular de material de Taxus.
5. Método según la reivindicación 1, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho material
de partida está en forma de un sólido, un jarabe o un material
gomoso semisólido.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la estructura del disolvente
incluye R_{1} como hidrógeno o metilo y R_{2} como
n-butilo, isobutilo, sec-butilo o
t-butilo.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la cromatografía en columna se
lleva a cabo utilizando una columna de gel de sílice de fase
directa.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
el gel de sílice se usa en una cantidad de aproximadamente 50 a 100
partes en peso del material de partida.
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