ES2321245T3 - Conjugados de compuestos peptidicos solubles con agentes de union a membranas. - Google Patents
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Abstract
DERIVADOS SOLUBLES DE POLIPEPTIDOS SOLUBLES QUE CONTIENEN ELEMENTOS DE UNION DE MEMBRANAS, SU UTILIZACION EN TERAPIA Y PROCEDIMIENTOS E INTERMEDIOS QUE INCLUYEN LOS ELEMENTOS DE UNION DE MEMBRANAS DE PEPTIDOS.
Description
Conjugados de compuestos peptídicos solubles con
agentes de unión a membranas.
Esta invención se refiere a derivados
polipeptídicos.
Fundamentalmente, todos los fármacos proteicos
se administran como disoluciones y actúan in vivo en fase de
disolución. Sin embargo, en bioquímica y en farmacología, un gran
número de proteínas control y mediadoras están asociadas con las
membranas plasmáticas de las células, o actúan dentro o sobre ellas.
Excepto las versiones solubles, truncadas, de una clase de estas
moléculas, no se han desarrollado proteínas asociadas a membranas
como agentes terapéuticos. Existen dos razones principales para esta
situación. En primer lugar, la sobreexpresión de proteínas que se
mantienen retenidas en las membranas de las células productoras está
limitada por la baja capacidad de las membranas para las proteínas
y, a menudo, por los efectos tóxicos de la retención cuando la
expresión es intrínsicamente eficaz. En segundo lugar, la extracción
de estas proteínas desde las membranas requiere detergentes o
disolventes orgánicos, lo cual a menudo da como resultado a la
inactivación de la proteína, conduce a dificultades para lograr la
alta pureza necesaria para el uso del fármaco, y normalmente produce
un producto que es difícil de formular para la administración
intravenosa. Además, la retención de elementos de anclaje a
membranas muy hidrófobos puede provocar que las proteínas se asocien
fuertemente con proteínas de unión a lípidos en la sangre cuando se
administran por vía intravenosa, evitando, con ello, su acceso a
las membranas celulares.
Las versiones solubles, truncadas, de las
proteínas asociadas a membranas solucionan las dificultades de
producción asociadas con las proteínas de longitud completa. Sin
embargo, estas moléculas truncadas carecen de la capacidad de unión
a membranas y de la especificidad de las proteínas de longitud
completa, siendo estas propiedades ventajosas o incluso
fundamentales para la actividad terapéutica deseada.
Las principales clases de interacciones de las
proteínas con las membranas pueden resumirse como sigue:
1. Interacciones directas y específicas con
grupos de cabeza fosfolipídicos o con otras regiones hidrófilas de
lípidos complejos, o indirectamente con proteínas que ya están
insertas en la membrana. Esto último puede incluir todos los tipos
de proteínas de membranas intrínsecas indicadas a continuación, y
estas interacciones se realizan normalmente con dominios
extracelulares o secuencias en bucle de las proteínas de la
membrana;
2. A través de un anclaje mediante una única
región helicoidal transmembrana hidrófoba cerca del extremo terminal
de la proteína. Estas regiones presentan habitualmente una cara
hidrófoba alrededor de la circunferencia completa del cilindro de
la hélice y el traslado de esta estructura al entorno hidrófilo de
la masa de agua es energéticamente desfavorable;
3. Una secuencia corta de aminoácidos
generalmente catiónicos en el lado citoplásmico de la membrana a
menudo proporciona mayor anclaje; esta secuencia se sitúa
C-terminal a la hélice transmembrana;
4. A través del uso de múltiples (normalmente de
2-12 y habitualmente 4, 7 y 10) regiones
transmembrana que normalmente se predice que serán helicoidales o
casi helicoidales. Aunque normalmente estas regiones son globalmente
hidrófobas, con frecuencia muestra algún comportamiento anfipático
(una capa hidrófoba externa y una capa hidrófila más interna que
puede identificarse dentro de una agrupación de hélices localizada
en la bicapa lipídica);
5. A través de restos de fosfatidilinositol
unidos postraduccionalmente (anclajes GPI). Son generados por una
vía biosintética específica que reconoce y elimina un tramo
específico de aminoácidos C-terminales, y crea una
unidad de diacilglicerol asociada a la membrana a través de un
espaciador de carbohidratos hidrófilo al polipéptido;
6. En un proceso relacionado, un único grupo
ácido graso, como miristoílo, palmitoílo o prenilo, puede unirse
postraduccionalmente a uno o más sitios en una proteína (normalmente
en el N- o C-terminal). De nuevo, pueden eliminarse
aminoácidos (tal como la caja CAAC C-teminal en las
proteínas Ras).
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Las membranas artificiales se consideran
complejos lipídicos que imitan las propiedades básicas de la
membrana celular, es decir, una vacuola lipídica con un interior
acuoso y una química de superficie que se parece a la membrana
celular. La membrana artificial contiene, de forma típica,
fosfolípidos o sus análogos, y puede ser unilaminar o bilaminar, y
la superficie externa contendrá grupos cargados similares a los
grupos colina del fosfolípido más abundante. El prototipo de
membrana artificial se conoce como liposoma, y las tecnologías para
la construcción de liposomas, incluyendo la incorporación de agentes
terapéuticamente útiles en ellos, es muy conocida por los expertos
en la técnica. Los liposomas se han evaluado en una serie de estados
de enfermedad, y en el mercado se encuentran disponibles liposomas
que contienen el antifúngico anfotericina. Además, se han descrito
proteoliposomas. Por ejemplo, se ha indicado que el uso de
inmunoliposomas que encapsulan anfotericina B resulta beneficioso
en el tratamiento de infecciones fúngicas experimentales en modelos
animales (por ejemplo, Hospenthal, D. et al. (1989), J. Med.
Microbiol., 30, 193-197; Dromer, F. et al.
(1990), Antimicrob. Agents Chemother.,
34:2055-2060).
Los análogos de membranes naturales o
artificiales a menudo tienen una estructura relacionada e imitarán
una o más propiedades de la membrana. Un ejemplo es el suministro
de una superficie artificial que tiene grupos colgantes que imitan
los grupos bipolares de fosfolípidos que se encuentran en el
exterior de las superficies celulares. Por ejemplo, el documento WO
92/06719 (Biocompatibles Limited) decribe fosfolípidos naturales y
sintéticos que pueden revestirse sobre una superficie artificial,
por ejemplo, un dispositivo que, cuando se usa, se pone en contacto
con fluidos biológicos o que contienen proteínas para proporcionar
una mayor biocompatibilidad y hemocompatibilidad, y el documento WO
94/16749 describe otros grupos bipolares que pueden utilizarse para
mejorar la biocompatibilidad de una manera similar.
La presente invención proporciona un derivado
soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo dicho derivado dos
o más elementos de unión a membranas heterólogos con baja afinidad
por membranas, asociados covalentemente con el polipéptido, cuyos
elementos son capaces de interaccionar, independientemente y con
adición termodinámica, con componentes de membranas celulares o
artificiales expuestos a fluidos extracelulares, como se define en
la reivindicación 1.
"Heterólogo" significa que los elementos no
se encuentran en la proteína nativa de longitud completa, a partir
de la cual puede derivarse una proteína soluble.
Un "polipéptido soluble" es un derivado
truncado de una proteína de longitud completa que carece de su
capacidad natural de unión a membranas y/o un polipéptido que tiene
un nivel de solubilidad en un medio acuoso >100 \mug/ml.
Un "elemento de unión a membranas con baja
afinidad por membranas" es un elemento que sólo tiene una
afinidad moderada por las membranas, que su constante de
disociación es mayor que 0,1 \muM, preferiblemente de 1
\muM-1 mM. Los elementos tienen preferiblemente un
tamaño <5 kDa.
El derivado debe incorporar suficientes
elementos con baja afinidad por los componentes de las membranas
para producir un derivado con una afinidad alta (preferiblemente
con una constante de disociación de 0,01-10 nM) por
membranas específicas. Los elementos se combinan de forma que crean
una alta afinidad global por la membrana diana concreta, pero la
combinación carece de esta alta afinidad por otras proteínas para
las cuales los elementos individuales pueden ser ligandos (de baja
afinidad).
Los elementos deben escogerse de forma que
mantengan una solubilidad útil en un medio de formulación
farmacéutica, preferiblemente >100 \mug/ml.
Por tanto, la invención estimula la localización
del polipéptido en las membranas celulares y, por tanto,
proporciona uno o más de varios efectos biológicamente
significativos con potenciales ventajes terapéuticas, que
incluyen:
- Potencia: la actividad antagonista del
receptor se localiza sobre la misma superficie que el mismo
receptor; puede producirse un aumento en la concentración eficaz
como resultado de la reducción en los grados de libertad
difusiva.
- Farmacocinética y frecuencia de dosificación:
se espera que la interacción de una proteína derivatizada con tipos
celulares de vida larga o proteínas séricas prolongue el tiempo de
residencia plasmático de la proteína y produzca un efecto depot
mediante el depósito sobre superficies celulares.
- Especificidad: muchos procesos patológicos
clínicamente importantes están asociados con tejidos y tipos de
células específicos.
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Por tanto, la administración dirigida de la
proteína modificada a regiones de la membrana que contengan
marcadores de membranas asociados a una patología puede mejorar el
índice terapéutico de la proteína dirigida.
En la técnica se conoce lo siguiente:
D1: documento
EP-A-0114787
(Ciba-Geigy), 1 de agosto, 1984;
D2: CA, 64:75429 (1966);
D3: J. Biol. Chem., 265(4), 5 de febrero,
1990, pp. 2317-2323;
D4: J. Immunol., 146(1), 1 de enero,
1991, pp. 250-256;
D5: documento
WO-A-9406826 (United Biomedical
Inc.), 31 de marzo, 1994;
D6: documento
WO-A-9400571 (Smith Kline Beecham),
6 de enero, 1994;
D7: documento
WO-A-9322343 (The Rockefeller
University), 11 de noviembre, 1993.
D1 describe el compuesto
N-miristoil-L-cisteína
(p. 49, líneas 13-16). D2 describe el compuesto
N-miristoiletanotiol. Ambos compuestos pueden
usarse para preparar los derivados de la presente invención.
D3-D7 describen derivados
solubles de polipéptidos solubles. La diferencia entre estos
documentos y la presente invenciones es que la técnica anterior
proporciona diferentes compuestos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inhibidores del complemento pueden dirigirse
a células del endotelio vascular, miocitos, eritrocitos y
linfocitos. Los inhibidores del complemento pueden ser útiles en
lesiones isquémicas, transplantes e inflamación.
Las proteínas reguladoras del complemento
incluyen CR1 (CD35); DAF (CD55); MCP (CD46); CD59; factor H; y
proteína de unión C4; y sus híbridos o muteínas, como
CR1-CD59 (S.G.E1 Feki y D.T. Fearon, Molecular
Immunology, 33 (supl. 1), p. 57, 1996), MCP-DAF
(P.J. Higgins et al., J. Immunology, 158,
2872-2881, 1997) y fragmentos polipeptídicos de CR1
solubles.
El derivado comprende preferiblemente comprende
de dos a ocho, más preferiblemente de dos a cuatro elementos de
unión a membranas.
Los derivados de ácidos grasos adecuados
incluyen miristoílo (12 unidades de metileno), que es
insuficientemente largo o hidrófobo para permitir una unión de alta
afinidad a membranas. Los estudios con péptidos miristoilados (por
ejemplo, R.M. Peitzsch y S. McLaughlin, Biochemistry, 32,
10436-10443, 1993) han demostrado que tienen unas
constantes de disociación eficaces con sistemas lipídicos modelo de
-10^{-4} M y que aproximadamente 10 de los 12 grupos metileno
están enterrados en la bicapa lipídica. Por tanto, los grupos acilo
alifáticos con aproximadamente 8 a 18 unidades de metileno,
preferiblemente de 10-14, son elementos de unión a
membranas adecuados. Otros ejemplos de derivados de ácidos grasos
adecuados incluyen tioles y aminas alifáticas de cadena larga (de
8-18, preferiblemente de 10-14
metilenos), esteroides y derivados de farnesilo.
Se ha descubierto que la unión a membranas está
asociada con una modificación limitada (de un único sitio) con
grupos acilo grasos cuando se combina con una agrupación de
aminoácidos básicos en la secuencia de la proteína que puede
interaccionar con grupos de cabeza fosfolipídicos ácidos y
proporcionar la energía adicional para conseguir la unión a la
membrana. Esta combinación de efectos se ha denominado el
"interruptor electrostático-miristoílo" (S.
McLaughlin y A. Aderem, TIBS, 20:272-276, 1994; J.F.
Hancock et al., Cell, 63, 133-139, 1990). Por
tanto, los elementos de unión a membranas adecuados son secuencias
de aminoácidos básicos como las que se encuentran en proteínas como
Ras y MARCKS (sustrato de C-quinasa rico en
alanina miristoilada, P.J. Blackshear, J. Biol. Chem., 268,
1501-1504, 1993) que media en el "interruptor"
electrostático a través de la fosforilación reversible de restos
serina dentro de la secuencia y una neutralización concomitante de
la carga positiva neta. Estas secuencias incluyen, pero no se
limitan a las secuencias consecutivas de lisina y arginina, como
(Lys)n, en la que n es de 3 a 10, preferiblemente de 4 a
7.
Los ejemplos adecuados de secuencias de
aminoácidos que comprenden aminoácidos básicos incluyen:
i) DGPKKKKKKSPSKSSG
ii) GSSKSPSKKKKKKPGD
iii) SPSNETPKKKKKRFSFKKSG
iv) DGPKKKKKKSPSKSSK
v) SKDGKKKKKKSKTK
(el N-terminal
aparece a la
izquierda).
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Las secuencias i) a v) son ejemplos de
secuencias de interruptor electrostático.
Opcionalmente, puede incorporarse una
disociación condicional de las membranas en los derivados de la
invención, utilizando mecanismos como la sensibilidad al pH
(interruptores electrostáticos), la regulación a través de la unión
de iones metálicos (utilizando Ca^{2+} y Zn^{2+} endógenos, y la
incorporación de sitios de unión a iones en los elementos de unión
a membranas), y la ruptura por proteasas (por ejemplo, plasminolisis
de secuencias de unión a membranas ricas en lisina para liberar y
activar la prouroquinasa).
La porción polipeptídica de los derivados de la
invención puede prepararse mediante la expresión, en hospedantes
adecuados, de genes modificados que codifiquen el polipéptido
soluble de interés más uno o más elementos de unión a membranas
peptídicos y, opcionalmente, restos como cisteína para introducir
grupos conectores para facilitar la derivatización postraduccional
con otros elementos de unión a membranas.
Un proceso para la preparación comprende
expresar ADN que codifica la porción polipeptídica de dicho derivado
en una célula hospedante recombinante y recuperar el producto, y
después modificar postraduccionalmente el polipéptido para
introducir químicamente los elementos de unión a membranas.
En particular, el aspecto recombinante del
proceso puede comprender las etapas de:
i) preparar un vector de expresión replicable
capaz, en una célula hospedante, de expresar un polímero de ADN que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha porción
polipeptídica;
ii) transformar una célula hospedante con dicho
vector;
iii) cultivar dicha célula hospedante
transformada bajo condiciones que permiten la expresión de dicho
polímero de ADN para producir dicho polipéptido; y
iv) recuperar dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso recombinante puede realizarse
mediante técnicas recombinantes convencionales, tales como las
descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989), y DNA Cloning, vol. I, II y III (D.M. Glover, ed., IRL Press
Ltd.). La invención puede utilizar un proceso para preparar el
polímero de ADN mediante la condensación de unidades mono-, di- u
oligoméricas de nucleótidos apropiadas.
La preparación puede realizarse de forma
química, enzimática o mediante una combinación de ambos métodos,
in vitro o in vivo según sea apropiado. Por tanto, el
polímero de ADN puede prepararse mediante el acoplamiento
enzimático de los fragmentos de ADN apropiados, mediante métodos
convencionales como los descritos por D.M. Roberts et al.,
en Biochemistry, 1985, 24, 5090-5098.
Los fragmentos de ADN pueden obtenerse mediante
la digestión de ADN que contiene las secuencias requeridas de
nucleótidos con las enzimas de restricción apropiadas, mediante
síntesis química, mediante polimerización enzimática, o mediante
una combinación de estos métodos.
La digestión con enzimas de restricción puede
realizarse en un tampón apropiado a una temperatura de
20ºC-70ºC, de modo general en un volumen de 500
\mul o menor con 0,1-10 \mug de ADN.
La polimerización enzimática del ADN puede
realizarse in vitro utilizando una ADN polimerasa, tal como
ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) en un tampón apropiado que
contenga los nucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP según
se requiera, a una temperatura de 10ºC-37ºC, de modo
general en un volumen de 50 \mul o menor.
El acoplamiento enzimático de fragmentos de ADN
puede realizarse utilizando una ADN ligasa, tal como ADN ligasa de
T4, en un tampón apropiado a una temperatura de 4ºC a 37ºC, de modo
general en un volumen de 50 \mul o menor.
La síntesis química del polímero de ADN o los
fragmentos puede realizarse mediante la química de fosfotriéster,
fosfita o fosforamidita convencionales, utilizando técnicas en fase
sólida como las descritas en "Chemical and Enzymatic Synthesis of
Gene Fragments - A Laboratory Manual" (eds. H.G. Gassen y A.
Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones
científicas, por ejemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S.
Sproat y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.
Sproat y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.
Matteucci y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.
Matteuci y M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical
Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the
American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat,
J. McMannus y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y
H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
Preferiblemente, se emplea un sintetizador de ADN automático (por
ejemplo, sintetizador 381A de Applied Biosystems).
El polímero de ADN puede prepararse acoplando
dos o más moléculas de ADN que juntas comprenden una secuencia de
ADN que codifica el polipéptido.
Las moléculas de ADN pueden obtenerse mediante
la digestión con enzimas de restricción apropiados de vectores que
portan las secuencias codificadoras requeridas.
La estructura concreta de las moléculas de ADN y
la forma en que se obtienen depende de la estructura del producto
deseado. El diseño de una estrategia adecuada para la construcción
de la molécula de ADN que codifica el polipéptido es un asunto
rutinario para los expertos en la técnica.
En particular, debe considerarse la utilización
de codones de la célula hospedante concreta. Los codones pueden
optimizarse para un nivel alto de expresión en E. coli
utilizando los principios indicados en Devereux et al.
(1984), Nucl. Acid Res., 12, 387.
La expression del polímero de ADN que codifica
el polipéptido en una célula hospedante recombinante puede
realizarse mediante un vector de expresión replicable capaz de
expresar el polímero de ADN en la célula hospedante.
\newpage
El vector de expresión replicable puede
prepararse rompiendo un vector compatible con la célula hospedante
para proporcionar un segmento de ADN lineal que tiene un replicón
intacto, y combinar dicho segmento lineal con una o más moléculas
de ADN que, junto con dicho segmento lineal, codifican el
polipéptido bajo condiciones de acoplamiento.
El acoplamiento del segmento lineal y más de una
molécula de ADN puede realizarse de modo simultáneo o secuencial
como se desee.
Por tanto, el polímero de ADN puede preformarse
o formarse durante la construcción del vector, como se desee. La
elección del vector vendrá determinada, en parte, por la células
hospedante, que puede ser procariota, tal como E. coli, o
eucariota, tal como C127 de ratón, mieloma de ratón, ovario de
hámster chino, fúngica, por ejemplo, hongos filamentosos o
"levaduras" unicelulares, o una célula de insecto, tal como
Drosophila. La célula hospedante también puede estar en un
animal transgénico. Los vectores adecuados incluyen plásmidos,
bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes derivados, por
ejemplo, de baculovirus o vaccinia.
El polímero de ADN puede ensamblarse en vectores
diseñados para el aislamiento de líneas celulares de mamífero
transformadas de forma estable que expresen el fragmento, por
ejemplo, vectores de papilomavirus bovino en células C127 de ratón,
o vectores amplificados en células de ovario de hámster chino (DNA
Cloning, vol. II, D.M. Glover, ed., IRL Press, 1985; Kaufman, R.J.
et al., Molecular and Cellular Biology, 5,
1750-1759; Goeddel, D.V. et al., solicitud
de patente europea nº 0093619, 1983).
La preparación del vector de expresión
replicable puede realizarse de forma convencional con enzimas
apropiadas para la restricción, la polimerización y el acoplamiento
del ADN, mediante procedimientos descritos, por ejemplo, en
Sambrook et al., citado anteriormente. La polimerización y el
acoplamiento puede realizarse como se describió anteriormente para
la preparación del polímero de ADN. La digestión con enzimas de
restricción puede realizarse en un tampón apropiado a una
temperatura de 20ºC-70ºC, de modo general en un
volumen de 50 \mul o menor con 0,1-10 \mug de
ADN.
La célula hospedante recombinante se prepara
transformando una célula hospedante con un vector de expresión
replicable bajo condiciones transformantes. Las condiciones
transformantes adecuadas son convencionales y se describen, por
ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente, o "DNA
Cloning", vol. II, D.M. Glover, ed., IRL Press, 1985.
La elección de las condiciones transformantes
viene determinada por la célula hospedante. Por tanto, un hospedante
bacteriano, tal como E. coli, puede tratarse con una
disolución de CaCl_{2} (Cohen et al., Proc. Nat. Acad.
Sci., 1973, 69, 2110) o con una disolución que comprenda una mezcla
de RbCl, MnCl_{2}, acetato de potasio y glicerol, y después con
ácido 3-[N-morfolino]propansulfónico, RbCl y
glicerol, o mediante electroporación como describen, por ejemplo,
los fabricantes de un electroporador Bio-Rad
Laboratories, Richmond, California, EEUU. Las células de mamífero
en cultivo pueden transformarse mediante coprecipitación con calcio
del vector de ADN sobre las células o utilizando liposomas
catiónicos.
El cultivo de la célula hospedante transformada
bajo condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN se
realiza de forma convencional como se describe, por ejemplo en
Sambrook et al., y "DNA Cloning", citado anteriormente.
Por tanto, preferiblemente a la célula se le suministra un nutriente
y se cultiva a una temperatura menor que 45ºC.
El producto proteico se recupera mediante
métodos convencionales según la célula hospedante. Por tanto, cuando
la célula hospedante es bacteriana, tal como E. coli, y la
proteína se expresa de forma intracelular, la célula puede lisarse
de forma física, química o enzimática, y el producto proteico
aislarse a partir del lisado resultante. Cuando la célula
hospedante es de mamífero, el producto se aisla normalmente a partir
del medio nutriente.
Cuando la célula hospedante es bacteriana, tal
como E. coli, el producto obtenido del cultivo puede requerir
un plegamiento para su óptima actividad funcional. Esto será más
probable si la proteína se expresa como cuerpos de inclusión.
Existe una serie de aspectos del proceso de aislamiento y de
plegamiento que se considera importante. En particular, el
polipéptido preferiblemente se purifica parcialmente antes del
plegamiento para minimizar la formación de agregados con proteínas
contaminantes y para minimizar el plegamiento incorrecto del
polipéptido. Por tanto, la eliminación de proteínas contaminantes
de E. coli mediante el aislamiento específico de los cuerpos
de inclusión y la posterior purificación adicional antes del
plegamiento son aspectos importantes del procedimiento.
El proceso de plegamiento se realiza de tal
forma que se minimice la agregación de estados de plegamiento
intermedio del polipéptido. Por tanto, debe considerarse
cuidadosamente, entre otras cosas, el tipo y la concentración de
las sales, la temperatura, la concentración de proteína, las
concentraciones del tampón redox y la duración del plegamiento. Las
condiciones exactas para cualquier polipéptido concreto en general
no puede predecirse y deben determinarse mediante experimentos.
Existen numerosos métodos disponibles para el
plegamiento de proteínas de cuerpos de inclusión y son conocidos
por los expertos en la técnica. Los métodos implican, en general,
romper todos los enlaces disulfuro en el cuerpo de inclusión, por
ejemplo con 2-mercaptoetanol 50 mM, en presencia de
una alta concentración de un desnaturalizante, tal como urea 8 M o
hidrocloruro de guanidina 6 M. La siguiente etapa consiste en
eliminar estos agentes para permitir que se produzca el plegamiento
de las proteínas. La formación de los puentes disulfuro requiere un
medio oxidante y éste puede proporcionarse mediante una serie de
formas, por ejemplo mediante aire, o mediante la incorporación de
un sistema redox adecuado, por ejemplo una mezcla de glutatión
reducido y oxidado.
Preferiblemente, el cuerpo de inclusión se
solubiliza utilizando urea 8 M, en presencia de mercapetanol, y la
proteína se pliega, después de la eliminación inicial de las
proteínas contaminantes, mediante la adición de tampón frío. Los
tampones adecuados pueden identificarse utilizando las técnicas
descritas en I. Dodd et al., "Perspectives in Protein
Engineering and Complementary Technologies", Mayflower
Publications, 66-69, 1995. Un tampón adecuado para
muchos de los constructos de SCR descritos en la presente es
etanolamina 20 mM que contiene glutatión reducido 1 mM y glutatión
oxidado 0,5 mM. El plegamiento se realiza preferiblemente a una
temperatura en el intervalo de 1ºC a 5ºC a lo largo de un periodo de
1 a 4 días.
Si se observa cualquier precipitación o
agregación, la proteína agregada puede eliminarse mediante una serie
de formas, por ejemplo mediante centrifugación o mediante
tratamiento con precipitantes, tales como sulfato de amonio.
Cualquiera que sea el procedimiento adoptado, el polipéptido
monomérico es el principal producto soluble.
Si la célula bacteriana segrega la proteína
normalmente no es necesario el plegamiento.
La porción polipeptídica del derivado de la
invención puede incluir una cisteína C-terminal para
facilitar la modificación postraduccional. Un polipéptido soluble
que incluye una cisteína C-terminal también forma
parte de la invención. Se prefiere la expresión en un sistema
bacteriano para las proteínas de un tamaño moderado (hasta
aproximadamente 70 kDa) y con <- 8 puentes disulfuro. Las
proteínas más complejas en que una Cys terminal libre puede
provocar un replegamiento o problemas de estabilidad puede requerir
la expresión estable en líneas celulares de mamífero (en especial
CHO). Esto también será necesario si se va a introducir
postraduccionalmente un elemento de unión a membranas de
carbohidratos. El uso de células de insecto infectadas con
baculovirus recombinante que codifica la porción polipeptídica
también es un procedimiento general útil para preparar proteínas
más complejas y se prefiere cuando se desea realizar ciertos
procesos postraduccionales (como la palmitoilación) de manera
biosintética (véase, por ejemplo, M.J. Page et al., J. Biol.
Chem., 264, 19147-19154, 1989).
Un método preferido para manipular proteínas
derivatizadas en el C-terminal con cisteínas es como
un disulfuro mixto con mercaptoetanol o glutatión, o como el
tioderivado de
2-nitro-5-carboxifenilo,
como se describe de mono general a continuación en la sección
"Metodos".
Los elementos de unión a membranas peptídicos
pueden prepararse utilizando una síntesis en estado sólido
convencional, como el método de Merrifield, y este método puede
adaptarse para que incorpore los elementos de unión a membranas no
peptídicos, tales como los grupos N-acilo derivados
de los ácidos mirístico o palmítico en el N-terminal
del péptido. Además, la activación de un resto aminoácido para el
posterior enlace a una proteína puede lograrse durante la síntesis
química de estos elementos de unión a membranas. Los ejemplos de
estas activaciones incluyen la formación del disulfuro de
2-piridilo mixto con una
tiol-cisteína o la incorporación de un grupo
N-haloacetilo. Ambos grupos son capaces de
reaccionar con tioles libres a través de intercambio de disulfuros y
la alquilación, respectivamente. Los péptidos pueden prepararse
opcionalmente como la amida C-terminal y/o con un
grupo bloqueante N-terminal convencional, tal como
acetilo.
La invención puede utilizar una elemento de
unión a membranas peptídico que comprende una o más derivatizaciones
seleccionadas de:
- un resto cisteína terminal opcionalmente
activado en el grupo tiol;
- un grupo N-haloacetilo (en el
que halo significa cloro, bromo o yodo) localizado en el
N-terminal del péptido o en un grupo
\varepsilon-amino de un resto lisina;
- un grupo amida en el
C-terminal;
- un grupo bloqueante
N-terminal; y
- un grupo N-acilo de ácido
graso en el N-terminal o en un grupo
\varepsilon-amino de un resto lisina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos de formación de puentes químicos y
los reactivos adecuados para su formación incluyen los descritos en
los documentos EP0109653, EP0152736, EP0155388 y EP02844413.
El grupo de formación de puentes tiene
generalmente la fórmula:
(I)-A-R-B-
\newpage
en la que cada uno de A y B, que
pueden ser iguales o diferentes, representa -CO-,
-C(=NH_{2}^{+})-, maleimido, -S- o un enlace, y R es un enlace
o un grupo conector que contiene una o más unidades -(CH_{2})- o
unidades de fenilo meta-, orto- o
para-disustituido, preferiblemente orto o para,
opcionalmente junto con una porción
hidrófila.
Cuando la porción polipeptídica del derivado de
la invención y un elemento de unión a membranas peptídico incluyen
ambos una cisteína C-terminal, el grupo de formación
de puentes químicos tendrá la forma de -S-S-. El
puente se genera, en general, mediante la química del intercambio de
disulfuros convencional, mediante la activación de un tiol sobre un
polipéptido y la reacción del tiol activado con un tiol libre sobre
el otro polipéptido. Estos procedimientos de activación utilizan
disulfuros que forman aniones tiolato estables tras la ruptura del
enlace S-S e incluyen reactivos como
2,2'-ditiopiridina y ácido
5,5'-ditio-2-nitrobenzoico
(DTNB), que forman disulfuros mixtos intermedios capaces de la
posterior reacción con tioles para producir enlaces disulfuro
estables.
R puede incluir restos que interaccionan con
agua para mantener la solubilidad acuosa del enlace, y los restos
adecuados incluyen -CO-NH-,
-CO-NMe-, -S-S-, -CH(OH)-,
-SO_{2}-, -CO_{2}-,
-(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}- y
-CH(COOH)-, en los que m es un número entero de 2 o más, o
polímeros hidrófilos lineales, tales como polietilenglicol,
polipropilenglicol, poliglicina, polialanina o polisarcosina.
Otros ejemplos de R incluyen
-(CH_{2})_{r}-,
-(CH_{2})_{p}-S-S-(CH_{2})_{q}-
y
-(CH_{2})_{p}-CH(OH)-CH(OH)-(CH_{2})_{q}-,
en los que r es un número entero de al menos 2, preferiblemente al
menos 4, y p y q son independientemente números enteros de al menos
2.
En otro aspecto, R puede tomar la forma de
-U-V-W-, en el que U es
(CH_{2})_{2}CONH(CH_{2})_{n}, en el
que n es un número entero de 3 a 8, V es O, S, NR_{a} O
NR_{a}-NR_{a}, en los que cada R_{a} es H o
alquilo C_{1-6}, NH-O o
O-NH, y W es bencilo sustituido en la posición 2 ó 4
con el grupo B. En una realización preferida, R es
(CH_{2})_{2}CONH(CH_{2})NH-(4-fenilo),
en el que n es un número entero de 3 a 8. El grupo de formación de
puentes de fórmula (I) puede derivarse de un agente conector de
fórmula (II):
(II)X-R_{1}-Y
en el que R_{1} es un enlace o un
grupo conector, y X e Y son grupos funcionales capaces de reaccionar
con grupos aminoácido de la superficie, preferiblemente un grupo
lisina o cisteína, el grupo amino N-terminal, una
hidroxilo-serina catalítica o un grupo de unión a
proteínas, y X, R_{1}- e Y se eligen para que generen el grupo de
formación de puentes -A-R-B-
requerido.
Los agentes preferidos son aquellos en los que X
e Y son diferentes, conocidos como agentes heterobifuncionales.
Cada extremo de la molécula agente se hace reaccionar, a su vez, con
cada polipéptido que se va a conectar en reacciones diferentes. Los
ejemplos de agentes heterobifuncionales de fórmula (II)
incluyen:
-
3-(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo;
- 4-(N-maleimido)caproato
de succinimidilo;
- hidrocloruro de propionimidato de
3-(2-piridil)metilo;
- hidrocloruro de
4-N-[2-N-(3-[2-piridilditio]etilcarbonil)aminoetil]aminobenzoato
de 4'-amidinofenilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros agentes adecuados se describen en los
documentos EP0109653, EP0152736, EP0155388 y EP0284413, en
particular los de fórmula (II) en el documento EP0155388, y (III)
en el documento EP0284413.
En cada caso, Y es capaz de reaccionar con un
grupo tiol sobre un polipéptido, que puede ser un tiol nativo o uno
introducido como un grupo de unión a proteínas.
El grupo de unión a proteínas es una
funcionalidad derivada mediante la modificación de un polipéptido o
una proteína con un reactivo específico para una o más cadenas
laterales de aminoácidos, y que contiene un grupo capaz de
reaccionar con una sección rompible sobre el otro polipéptido. Un
ejemplo de un grupo de unión a proteínas es un grupo tiol. Un
ejemplo de una sección rompible es un enlace disulfuro. Como
alternativa, la sección rompible puede comprender una función
\alpha,\beta-dihidroxi.
Como ejemplo, la introducción de una función de
tiol libre mediante la reacción de un polipéptido con
2-iminotiolano,
3-(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo (con la posterior reducción) o
N-acetil homocisteína tiolactona, permite el acoplamiento
del grupo de unión a proteínas con una estructura Y reactiva con
tiol. Como alternativa, el grupo de unión a proteínas puede
contener una entidad reactiva con tiol, tal como el grupo
6-maleimidohexilo o un grupo
2-piridilditio, que puede reaccionar con un tiol
libre en X. Preferiblemente, el grupo de unión a proteínas se
deriva de agentes modificadores de proteínas, tales como
2-iminotiolano, que reaccionan con los grupos
\varepsilon-amino de lisina en las proteínas.
Cuando X representa un grupo capaz de reaccionar
directamente con la cadena lateral de los aminoácidos de una
proteína, es preferiblemente un grupo
N-succinimidilo. Cuando X representa un grupo capa
de reaccionar con un grupo de unión a proteínas, es preferiblemente
un grupo piridiltio. Cuando X representa un grupo capaz de
reaccionar con una hidroxilo-serina catalítica, es
preferiblemente un grupo 4-amidinofenil éster
opcionalmente sustituido con uno o más grupos de captación de
electrones que aumentan la reactividad del éster, del tipo
contenido en los compuestos de fórmula (II) en el documento
EP0155388, y (III) en el documento EP0284413.
En los anteriores procesos, la modificación de
un polipéptido para introducir un grupo de unión a proteínas se
realiza preferiblemente en un medio tamponado acuoso a un pH de
entre 3,0 y 9,0, dependiendo del reactivo usado. Para un reactivo
preferido, 2-iminotiolano, el pH es preferiblemente
6,5-8,5. La concentración de polipéptido es
preferiblemente alta (>10 mg/ml) y el reactivo modificador se
utiliza en un exceso molar moderado (de 1,1 a 5 veces), dependiendo
de la reactividad del reactivo. La temperatura y la duración de la
reacción están preferiblemente en el intervalo de
0ºC-40ºC y de 10 minutos a 7 días. El grado de
modificación del polipéptido puede determinarse ensayando los
grupos de unión introducidos.
Estos ensayos puede ser técnicas de la química
de proteínas convencionales, tales como valoración con ácido
5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico.
Preferiblemente, se introducirá una media de 0,5-0,3
moles de grupo de unión a proteínas por mol de polipéptido. El
polipéptido modificado puede separarse del exceso de agentes
modificadores mediante técnicas convencionales, tales como
diálisis, ultrafiltración, filtración en gel y precipitación en
disolventes o en sales. El material intermedio puede conservarse en
una disolución congelada o liofilizarse.
Cuando el agente conector de fórmula (II)
contiene un grupo amidino fenil éster X, el agente primero se hace
reaccionar preferiblemente con una enzima polipeptídica a través del
grupo X, y la reacción se realiza preferiblemente bajo las
condiciones descritas para la introducción de grupos bloqueantes en
la solicitud de patente europea publicada nº 0.009.879. Tras
librarse del exceso de reactivo mediante técnicas adecuadas, tales
como una cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento o
una diafiltración, la enzima acilada entonces puede hacerse
reaccionar con el otro polipéptido a una proporción de
aproximadamente 1:1 en un tampón no nucleofílico a pH
7,0-8,0 y 0ºC-30ºC durante hasta 6
h. Sin embargo, resulta preferible realizar el acoplamiento por
debajo de 10ºC (preferiblemente a 0ºC-4ºC) para
minimizar la hidrólisis de la enzima acilada.
Cuando se introduce un grupo de unión a
proteínas de esta manera, el grupo de formación de puentes (I) se
formará a partir de una reacción del agente conector (II) y el grupo
de unión a proteínas.
Los polipéptidos que se van a conectar se hacen
reaccionar por separado con el agente conector o el reactivo para
introducir un grupo de unión a proteínas añadiendo, de forma típica,
un exceso del reactivo al polipéptido, normalmente en un tampón
neutro o moderadamente alcalino, y después de la reacción se
eliminan los materiales de bajo peso molecular mediante filtración
en gel o diálisis. Las condiciones precisas de pH, temperatura,
tampón y tiempo de reacción dependerán de la naturaleza del reactivo
utilizado y del polipéptido que se va a modificar. La reacción de
conexión del polipéptido se realiza preferiblemente mezclando los
polipéptidos modificados en un tampón neutro en proporción
equimolar. Otras condiciones de reacción, por ejemplo tiempo y
temperatura, deben elegirse para obtener el grado deseado de
conexión. Si están implicadas reacciones de intercambio de tiol, la
reacción debe realizarse preferiblemente bajo una atmósfera de
nitrógeno. Preferiblemente, se producen productos
UV-activos (por ejemplo, de la liberación de
piridin-2-tiona procedente de los
derivados de 2-piridilditio), de forma que el
acoplamiento puede controlarse.
Después de la reacción de conexión, el conjugado
de polipéptidos puede aislarse mediante una serie de procedimientos
cromatográficos, tales como filtración en gel, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía de
interacción hidrófoba. Estos procedimientos pueden ser variantes a
baja presión o de alto rendimiento.
El conjugado puede caracterizarse mediante una
serie de técnicas, que incluyen filtración en gel a baja presión o
de alto rendimiento, electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS o enfoque isoeléctrico.
Los elementos de unión a membranas que son
derivados de ácidos grasos se unen postraduccionalmente al elemento
de unión a membranas peptídico, preferiblemente en el terminal de la
cadena polipeptídica. Preferiblemente, cuando la porción
polipeptídica recombinante del derivado de la invención contiene el
elemento de unión a membranas peptídico, tiene una cisteína
exclusiva para el acoplamiento al derivado de ácido graso. Cuando
el polipéptido recombinante tiene un resto cisteína se añade un
derivado de tiol del ácido graso a la proteína recombinante
replegada en una etapa tardía de la purificación (pero no
necesariamente la etapa final) y con una concentración del reactivo
preferiblemente por debajo de la concentración crítica de micelas.
Uno del derivado de ácido graso y el péptido recombinante tendrá el
grupo tiol activado como se describió anteriormente para las
reacciones de intercambio de tiol. El derivado de ácido graso es
preferiblemente N-(2-miristol)aminoetanol o
N-miristoil-L-cisteína,
N-(2-miristoil)aminoetanotiol o
N-miristoil-L-cisteína.
Las estrategias genéricas convenientes de la
última etapa de la purificación son una cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC) sobre un medio C2-C8 y una
cromatografía de intercambio catiónico para la separación de
proteínas derivatizadas y no derivatizadas en las que se ha
insertado una combinación de interruptor
electrostático-hidrofóbico.
Los derivados de esta invención pueden
administrarse como composiciones farmacéuticas.
Por consiguiente, la presente invención también
proporciona una composición farmacéutica que comprende un derivado
de la invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Las composiciones según la invención pueden
formularse según procedimientos rutinarios para la administración
mediante cualquier vía, tal como la vía oral, tópica, parenteral,
sublingual o transdérmica, o mediante inhalación. Las composiciones
pueden tomar la forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos,
pastillas para chupar, cremas o preparaciones líquidas, tales como
disoluciones o suspensiones orales o parenterales estériles, o en
forma de un pulverizado, aerosol u otros métodos convencionales de
inhalación.
Las formulaciones tópicas de la presente
invención pueden presentarse, por ejemplo, como ungüentos, cremas o
lociones, ungüentos oculares o gotas oculares u óticas, vendas
impregnadas y aerosoles, y pueden contener aditivos convencionales
apropiados, tales como conservantes, disolventes para ayudar a la
penetración del fármaco y emolientes en ungüentos y cremas.
Las formulaciones también pueden contener
vehículos convencionales compatibles, tales como bases para cremas
o ungüentos, y etanol o alcohol oleílico para lociones. Estos
vehículos pueden estar presentes de aproximadamente 1% a
aproximadamente 98% de la formulación. De forma más habitual,
formarán hasta aproximadamente 80% de la formulación.
Los comprimidos y las cápsulas para la
administración oral pueden estar en una forma de presentación de
dosis unitaria, y pueden contener excipientes convencionales, tales
como agentes ligantes, por ejemplo jarabe, goma arábiga, gelatina,
sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona; cargas, por ejemplo
lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o
glicina; lubricantes para la formación de comprimidos, por ejemplo
estearato de magnesio, talco, polietilenglicol o sílice;
disgregantes, por ejemplo almidón de patata; o agentes humectantes
aceptables, como laurilsulfato de sodio. Los comprimidos también
pueden contener agentes para la estabilización de fármacos
polipeptídicos frente a la proteolisis, y agentes potenciadores de
la absorción para macromoléculas. Los comprimidos también pueden
estar revestidos según métodos muy conocidos en la práctica
farmacéutica normal.
Los supositorios contendrán bases para
supositorio convencionales, por ejemplo mantequilla de cacao u otro
glicérido.
Para la administración parenteral se preparan
formas de dosificación unitaria fluidas utilizando el compuesto y
un vehículo estéril, siendo preferida el agua. El compuesto,
dependiendo del vehículo y la concentración utilizada, se disuelve
en el vehículo. Para preparar las disoluciones, el compuesto puede
disolverse en agua para inyección y esterilizarse mediante
filtración antes de introducirlo en un vial o ampolla adecuados y
sellarse.
Las formulaciones parenterales pueden incluir
sistemas de liberación sostenida, tales como la encapsulación
dentro de microesferas de polímeros biodegradables, tales como
poli-ácido láctico-co-glicólico.
De forma ventajosa, en el vehículo pueden
disolverse agentes como un anestésico local, un conservante y
agentes tamponantes. Para potenciar la estabilidad, la composición
puede congelarse después de ser introducida en el vial y el agua
puede eliminarse al vacío. Entonces el polvo liofilizado seco se
sella en el vial y puede suministrarse un vial adjunto de agua para
inyección para reconstituir el líquido antes del uso. De forma
ventajasa se incluye un tensioactivo o un agente humectante en la
composición para facilitar la distribución uniforme del
compuesto.
Las composiciones de esta invención también
pueden presentarse de forma adecuada para la administración al
tracto respiratorio como polvos para inhalar o un aerosol o una
disolución desde un nebulizador, o como un polvo microfino para la
insuflación, por sí solo o en combinación con un vehículo inerte
como lactosa. En este caso, las partículas del compuesto activo
tienen unos diámetros, de forma adecuada, menores que 50 micras,
preferiblemente menores que 10 micras, por ejemplo unos diámetros en
el intervalo de 1-50 micras, 1-10
micras o 1-5 micras. Cuando resulte apropiado
pueden incluirse pequeñas cantidades de antiasmáticos y
broncodilatadores, por ejemplo aminas simpatomiméticas como
isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina;
derivados de xantina como teofilina y aminofilina; y
corticosteroides como prednisolona, y estimulantes adrenales como
ACTH.
Las formulaciones en polvo microfino pueden
administrarse de forma adecuada en un aerosol como una dosis
dosificada, o mediante un dispositivo activado por la respiración
adecuado.
Las formulaciones en aerosol en dosis
dosificadas adecuadas comprenden propelentes, codisolventes como
etanol, tensioactivos como alcohol oleílico, lubricantes como
alcohol oleílico, secantes como sulfato de calcio, y modificadores
de la densidad como cloruro de sodio, convencionales.
Las disoluciones adecuadas para un nebulizador
son disoluciones esterilizadas isotónicas, opcionalmente tamponadas,
por ejemplo a un pH de 4-7, que contienen hasta 20
mg ml^{-1} del compuesto pero más generalmente de 0,1 a 10 mg
ml^{-1}, para su uso con un equipo de nebulización
convencional.
\newpage
La cantidad de material administrado dependerá
de la potencia del derivado y de la naturaleza del trastorno y el
médico que supervise el tratamiento la decidirá según las
circunstancias. Sin embargo, en general, una cantidad eficaz del
polipéptido para el tratamiento de una enfermedad o trastorno estará
en el intervalo de dosis de 0,01-100 mg/kg diarios,
preferiblemente de 0,1 mg-10 mg/kg diarios,
administrados en hasta cinco dosis o mediante infusión.
No se indican efectos toxicológicos adversos con
los compuestos de la invención dentro del intervalo de dosificación
descrito anteriormente.
La invención también proporciona un derivado de
la invención para su uso como un medicamento. La invención
proporciona además el uso de un derivado de la invención para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de aquellos
trastornos asociados con la inflamación o con la activación
inapropiada del complemento. En un aspecto preferido, la presente
invención puede utilizarse en la terapia de trastornos que impliquen
la actividad del complemento y diversos trastornos inflamatorios e
inmunológicos.
El polipéptido soluble que se derivatiza según
la invención es un inhibidor del complemento soluble, tal como un
fragmento polipeptídico de CR1 soluble.
Constituyendo aproximadamente 10% de las
globulinas en el suero normal, el sistema del complemento está
compuesto de muchas proteínas diferentes que son importantes en la
respuesta del sistema inmunológico a antígenos extraños. El sistema
del complemento se activa cuando sus componentes primarios se rompen
y los productos, sólos o con otras proteínas, activan otras
proteínas del complemento, lo cual da como resultado una cascada
proteolítica. La activación del sistema del complemento conduce a
una diversidad de respuestas que incluyen una mayor permeabilidad
vascular, la quimiotaxis de células fagocíticas, la activación de
células inflamatorias, la opsonización de partículas extrañas, la
destrucción directa de células y daños en tejidos. La activación del
sistema del complemento puede ser desencadenada por complejos de
antígeno-anticuerpo (la vía clásica) o, por ejemplo,
mediante lipopolisacáridos presentes en las paredes celulares de
bacterias patógenas (la vía alternativa).
Se ha demostrado que el receptor de tipo 1 del
complemento (CR1) está presente sobre las membranas de eritrocitos,
monocitos/macrófagos, granulocitos, células B, algunas células T,
células dendríticas foliculares esplénicas, y podocitos
glomerulares. El CR1 se une a los componentes del complemento C3b y
C4b y también se ha denominado receptor C3b/C4b. Se conoce la
organización estructural y secuencia primaria de un alotipo de CR1
(Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med.,
165:1095-1112; Klickstein et al., 1988, J.
Exp. Med., 168:1699-1717; Hourcade et al.,
1988, J. Exp. Med., 168:1255-1270; documento WO
89/09220, documento WO 91/05047). Está compuesto de 30 repeticiones
consenso cortas (SCR) que contienen cada una aproximadamente
60-70 aminoácidos. En cada SCR se conservan
aproximadamente 29 de la media de 65 aminoácidos. Se ha propuesto
que cada SCR forma una estructura en bucle triple tridimensional a
través de enlaces disulfuro con la tercera y la primera, y la cuarta
y la segunda semicisteínas en enlaces disulfuro. El CR1 también
está dispuesto como 4 repeticiones homólogas largas (LHR) de 7 SCR
cada una. Después de una secuencia conductora, la molécula de CR1
consiste en el LHR-A N-terminal,
las siguientes dos repeticiones, LHR-B y
LHR-C, y la LHR-D más
C-terminal, seguido de 2 SCR más, una región
transmembrana putativa de 25 restos y una cola citoplásmica de 43
restos.
Basándose en que la molécula madura de CR1 tiene
un resto glutamina N-terminal predicho, denominado
en lo sucesivo resto 1, los primeros cuatro dominios SCR de
LHR-A se definen en la presente como que consisten
en los restos 2-58, 63-120,
125-191 y 197-252, respectivamente,
del CR1 maduro.
Se han generado varios fragmentos solubles de
CR1 a través de procedimientos de ADN recombinante eliminando la
región transmembrana de los ADN que se expresan (documento WO
89/09220, documento WO 91/05047). Los fragmentos de CR1 solubles
eran funcionalmente activos, se unieron a C3b y/o a C4b, y mostraron
una actividad del cofactor factor I que depende de las regiones que
contienen. Estos constructos inhiben las funciones relacionadas con
el complemento in vitro, como el estallido oxidativo de
neutrófilos, la hemolisis mediada por el complemento, y la
producción de C3a y C5a. Un constructo soluble concreto,
sCR1/pBSCR1c, también muestra actividad in vivo en una
reacción de Arthus pasiva inversa (documento WO 89/09220, documento
WO 91/05047; Yeh et al., 1991, J. Immunol., 146:250), la
supresión de la inflamación y la necrosis miocárdica postisquémica
(documento WO 89/09220, documento WO 91/05047; Weisman et
al., Science, 1990, 249:146-1511; Dupe, R. et
al., Trombosis & Haemostasis (1991), 65(5), 695) y
aumenta las tasas de supervivencia tras un transplante (Pruitt y
Bollinger, 1991, J. Surg. Res., 50:350; Pruitt et al., 1991,
Transplantation, 52:868). Además, la coformulación de sCR1/pBSCR1c
con el complejo activador de
estreptoquinasa-plasminógeno humano
p-anisoilado (APSAC) produjo una actividad
antihemolítica similar que el sCR1 por sí solo, lo cual indica que
la combinación del inhibidor del complento sCR1 con un agente
trombocítico resulta factible (documento 91/05047).
El fragmento polipeptídico de CR1 soluble
codificado por sCR1/pBSCR1c, que corresponde a los restos
1-1929 de CR1, puede derivatizarse según la
invención.
Se ha demostrado que los polipéptidos solubles
que corresponden a partes de CR1 poseen actividad inhibidora del
complemento funcional, incluyendo actividad antihemolítica. El
documento WO 94/00571 describe polipéptidos solubles que
comprenden, en su secuencia, de una a cuatro repeticiones consenso
cortas (SCR) seleccionadas de SCR 1, 2, 3 y 4 de la repetición
homóloga larga de A (LHR-A) como los unicos dominios
de SCR estructural y funcionalmente intactos de CR1, e incluyen al
menos SCR3.
En aspectos preferidos, el polipéptido
comprende, en su secuencia, SCR 1, 2, 3 y 4 de
LHR-A, o SCR 1, 2 y 3 de LHR-A como
los unicos dominios de SCR estructural y funcionalmente intactos de
CR1.
En un aspecto, el polipéptido puede
representarse simbólicamente como sigue:
(A)NH_{2}-V^{1}-SCR1-W^{1}-SCR2-X^{1}-SCR3-Y^{1}-OH
en el que SCR1 representa los
restos 2-58 del CR1 maduro, SCR2 representa los
restos 63-120 del CR1 maduro, SCR3 representa los
restos 125-191 del CR1 maduro, y V^{1}, W^{1},
X^{1} e Y^{1} representan enlaces o secuencias de aminoácidos
cortas conectoras, preferiblemente con una longitud de 1 a 5 restos,
y que se derivan preferiblemente de secuencias interdominio nativas
en
CR1.
En una realización preferida, W^{1}, X^{1} e
Y^{1} representan los restos 59-62,
121-124 y 192-196, respetivamente,
del CR1 maduro, y V^{1} representa el resto 1 del CR1
opcionalmente conectado a través de su N-terminal a
metionina.
En otro aspecto, los polipéptidos pueden
representarse simbólicamente como sigue:
(B)NH_{2}-V^{2}-SCR1-W^{2}-SCR2-X^{2}-SCR3-Y^{2}-SCR4-Z^{2}OH
en el que SCR1, SCR2 y SCR3 son
como se definió anteriormente, SCR4 representa los restos
197-252 del CR1 maduro, y V^{2}, W^{2},
X^{2}, Y^{2} y Z^{2} representan enlaces o secuencias de
aminoácidos cortas conectoras, preferiblemente con una longitud de
1 a 5 restos, y que se derivan preferiblemente de secuencias
interdominio nativas en
CR1.
En realizaciones preferidas, W^{2}, X^{2},
Y^{2} y Z^{2} representan los restos 59-62,
121-124, 192-196 y el resto 253,
respetivamente, del CR1 maduro, y V^{2} representa el resto 1 del
CR1 opcionalmente conectado a través de su
N-terminal a metionina.
En una realización particular de la fórmula (B),
la arginina 235 se reemplaza por histidina.
En la realización preferida de la fórmula (B),
el resto 235 es arginina.
En otro aspecto, el polipéptido puede
representarse simbólicamente como sigue:
(C)NH_{2}-X^{3}-SCR3-Y^{3}-OH
en el que SCR3 es como se definió
anteriormente, y X^{3} e Y^{3} representan enlaces o secuencias
de aminoácidos cortas conectoras, preferiblemente con una longitud
de 1 a 5 restos, y que se derivan preferiblemente de secuencias
interdominio nativas en
CR1.
En una realización preferida de la fórmula (C),
X^{3} representa los aminoácidos 122-124, del CR1
maduro opcionalmente conectados a metionina, e Y^{4} representa
los aminoácidos 192-196 del CR1 maduro.
En otro aspecto, el polipéptido puede
representarse simbólicamente como sigue:
(D)NH_{2}-X^{4}-SCR3-Y^{4}-SCR4-Z^{4}-OH
en el que SCR3 y SCR4 son como se
definió anteriormente, y X^{4}, Y^{4} y Z^{4} representan
enlaces o secuencias de aminoácidos cortas conectoras,
preferiblemente con una longitud de 1 a 5 restos, y que se derivan
preferiblemente de secuencias interdominio nativas en
CR1.
En una realización preferida de la fórmula (D),
X^{4} representa los aminoácidos 122-124, del CR1
maduro opcionalmente conectados a metionina en su
N-terminal, e Y^{4} y Z^{4} representan los
aminoácidos 192-196 y 253, respectivamente, del CR1
maduro.
El polipéptido de CR1 soluble se derivatiza
según la invención mediante cualquier estrategia conveniente de las
indicadas anteriormente. En una realización preferida, el
polipéptido de CR1 soluble consiste en los restos
1-196 de CR1 y con una metionina
N-terminal, y el derivado comprende un grupo
miristoílo y una o más secuencias polipeptídicas seleccionadas
de:
- DGPKKKKKKSPSKSSGC
- GSSKSPSKKKKKKPGDC
- CDGPKKKKKKSPSKSSK
- SKDGKKKKKKSKTKC
- CSAAPSSGFRILLLKV
- AAPSVIGPRILLLKVAGC
- y
- DGPSEILRGDFSSC
(el N-terminal
aparece a la
izquierda).
\vskip1.000000\baselineskip
El inhibidor del complemento soluble, tal como
un polipéptido de CR1 soluble, derivado de esta invención es útil
en el tratamiento de muchas enfermedades y trastornos mediados por
el complemento o relacionados con el complemento que incluyen, pero
no se limitan a los listados a continuación.
- -
- esclerosis múltiple,
- -
- accidentes cerebrovasculares,
- -
- síndrome de Guillian Barré,
- -
- daños cerebrales traumáticos,
- -
- enfermedad de Parkinson,
- -
- encefalitis alérgica,
- -
- enfermedad de Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- complicaciones en la hemodiálisis,
- -
- rechazo hiperagudo de aloinjertos,
- -
- rechazo de xenoinjertos,
- -
- toxicidad inducida por interleuquina-2 durante la terapia con IL-2,
- -
- hemoglobinuria nocturna paroxísmica.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- inflamación en enfermedades autoinmunológicas,
- -
- enfermedad de Crohn,
- -
- síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos,
- -
- daños térmicos, incluyendo quemaduras o congelación,
- -
- uveitis,
- -
- psoriasis,
- -
- asma,
- -
- pancreatitis aguda.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- infarto de miocardio,
- -
- angioplastia de balón,
- -
- aterosclerosis (inducida por colesterol) y reestenosis,
- -
- hipertensión,
- -
- síndrome postbomba en bypass cardiopulmonar o hemodiálisis renal,
- -
- isquemia renal,
- -
- isquemia intestinal.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- fallo de múltiples órganos,
- -
- choque séptico.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- artritis reumatoide,
- -
- lupus eritematoso sistémico (SLE),
- -
- nefritis de SLE,
- -
- nefritis proliferativa,
- -
- glomerulonefritis,
- -
- anemia hemolítica,
- -
- miastenia grave.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- infertilidad mediada por anticuerpos o por el complemento.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también se dirige a una
composición farmacéutica para tratar una enfermedad o un trastorno
asociado con la inflamación o la activación inapropiada del
complemento, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de
un inhibidor del complemento soluble, tal como un polipéptido de CR1
soluble, derivado de esta invención, y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
También se proporciona el uso de un inhibidor
del complemento soluble, tal como un polipéptido de CR1 soluble,
derivado de esta invención, para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno asociado con
la inflamción o la activación inapropiada del complemento.
Para inhibir la activación del complemento y, al
mismo tiempo, proporcionar una terapa trombolítica, las
composiciones pueden comprender además una cantidad
terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico. Una cantidad
eficaz de un agente trombolítico está en el intervalo de dosis de
0,01-10 mg/kg, preferiblemente de
0,1-5 mg/kg.
Los agentes trombolíticos preferidos incluyen,
pero no se limitan a estreptoquinas, activador del plasminógeno del
tipo tisular humano y moléculas de uroquinasa, y sus derivados,
fragmentos o conjugados. Los agentes trombolíticos pueden
comprender una o más cadenas que pueden fusionarse o unirse de
manera reversible con otros agentes para formar moléculas híbridas
(documento EP-A-0297882 y documento
EP 155387), como por ejemplo uroquinasa unida a plasmina (documento
EP-A-0152736), una enzima
fibrinolítica unida a un polímero hidrosoluble (documento
EP-A-0183503). Los agentes
trombolíticos también pueden comprender muteínas de activadores de
plasminógeno (documento
EP-A-0207589). En una realización
preferida, el agente trombolítico puede comprender una enzima
fibrinolítica reversiblemente bloqueada in vitro como se
describe en la patente de EEUU nº 4.285.932. La enzima más
preferida es el complejo activador de
estreptoquinasa-p-anisoil-plasminógeno,
anistreplasa, como se describe en la patente de EEUU nº 4.808.405
(Monk et al., 1987, Drugs, 34:25-49).
Las vías de administración para las
composiciones terapéuticas individuales o combinadas de la presente
invención incluyen las vías convencionales, tales como por ejemplo
la infusión intravenosa o la inyección en embolada. Los inhibidores
del complemento activos y los agentes trombolíticos pueden
administrarse juntos o de forma secuencial en cualquier orden.
La invención puede utilizarse en un método para
tratar una afección trombótica, en particular el infarto de
miocardio agudo, en un ser humano o un animal no humano. Este método
comprende administrar a un ser humano o a un animal que necesite
este tratamiento, una cantidad eficaz de un inhibidor del
complemento soluble, tal como un polipéptido de CR1 soluble,
derivado según esta invención, y una cantidad eficaz de un agente
trombolítico. Un inhibidor del complemento soluble, tal como un
polipéptido de CR1 soluble, derivado de esta invención y un agente
trombolítico pueden utilizarse para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una afección trombótica en un ser humano o
en un animal. Estos métodos y usos pueden realizarse como se
describe en el documento WO 91/05047.
Esta invención puede utilizarse en un método
para tratar el síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos
(ARDS) en un ser humano o en un animal no humano. Este método
comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un
inhibidor del complemento soluble, tal como un polipéptido de CR1
soluble, derivado según la invención.
La invención puede utilizarse en un método para
retrasar el rechazo hiperagudo de aloinjertos o el rechazo
hiperagudo de xenoinjertos en un ser humano o un animal no humano
que recibe un transplante, mediante la administración de una
cantidad eficaz de un inhibidor del complemento soluble, tal como un
polipéptido de CR1 soluble, derivado según la invención. Esta
administración puede ser al paciente o mediante la aplicación al
transplante antes de la implantación.
La invención puede utilizarse en un método para
tratar heridas en un ser humano o un animal no humano, mediante la
administración tópica o parenteral, es decir, las vías intravenosas,
de una cantidad eficaz de un inhibidor del complemento soluble, tal
como un polipéptido de CR1 soluble, derivado según la invención.
Los siguientes métodos y ejemplos ilustran la
invención.
El ejemplo 5 proporciona un elemento de
administración dirigida a membranas que puede utilizarse en el
derivado de la invención como se define en las
reivindicaciones.
Los ejemplos 15, 16 y 17 no se realizan según la
invención reivindicada y se incluyen como referencia.
La ruptura del ADN mediante endonucleasas de
restricción se realizó según las instrucciones del fabricante
utilizando los tampones suministrados. Se llevaron a cabo
digestiones dobles de manera simultánea si las condiciones del
tampón eran las adecuadas para ambas anzimas. En caso contrario, las
digestiones dobles se llevaron a cabo de manera secuencial, de
forma que enzima que requiere la menor condición salina se añade
primero a la digestión. Cuando se completa la digestión, la
concentración de sales se altera y se añade la segunda enzima.
Los acoplamientos se realizaron con una ADN
ligasa de T4 adquirida en Promega, como se describe en Sambrook
et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press.
El aislamiento de plásmidos se realizó mediante
el método de lisis alcalina descrito en Sambrook et al.
(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbour Laboratory Press, o mediante uno de dos kits
disponibles en el Mercado: el Promega Wizard^{TM} Plus
Minipreps y el kit Qiagen Plasmid Maxi, según las instrucciones del
fabricante.
Los fragmentos de ADN se retiraron de los geles
de agarosa y el ADN se extrajo utilizando uno de tres kits
disponibles en el mercado: el kit de extracción en gel QIAEX o el
kit de extracción en gel Qiaquick (QIAGEN Inc., EEUU), o GeneClean
(Bio 101 Inc., EEUU), según las instrucciones del fabricante.
Los plásmidos se transformaron en E. coli
BL21 (DE3) (Studier y Moffat (1986), J. Mol. Biol., 189:113), E.
coli XLI-blue, BL21 (DE3) pLys-S
o BLR (DE3) pLys-S, que se habían hecho competentes
utilizando cloruro de calcio como se describe en Sambrook et
al. (1989). Las líneas celulares se adquirieron como cultivos
competentes congelados en Stratagene. E. coli JM109 se
adquirió como un cultivo competente congelado en Promega.
El ADN plasmídico se secuenció con un Vistra DNA
Labstation 625. La química de la secuenciación se realizó
utilizando un kit de secuenciación en ciclos Terminator con tinte
fluorescente Thermo Sequenase de Amersham International (RPN 2435),
junto con su kit de precipitación Terminator con tinte fluorescente
TMP (RPN 2433), según las instrucciones del fabricante.
Las secuencias producidas mediante el anterior
procedimiento se analizaron con un secuenciador de ADN Perkin Elmer
ABI Prism 377. Ésta es una técnica electroforética que utiliza geles
de acrilamida al 4% de 36 cm x 0,2 mm, siendo detectados los
fragmentos de ADN marcados de forma fluorescente mediante una cámara
con dispositivo acoplado cargado, según las instrucciones del
fabricante.
Los oligonucleótidos se adquirieron en
Cruachem.
El plásmido pT7-7 (Tabor, S.
(1990), Current Protocols in Molecular Biology, F.A. Ausubel, Brent,
R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith y K. Struhl,
eds., pp. 16.2.1-16.2.11, Greene Publishing and
Wiley-Interscience, Nueva York) contiene ADN que se
corresponde con los nucleótidos 2065-4365 de pBR322
y, como el pBR322, puede movilizarse mediante un plásmido
conjugativo en presencia de un tercer plásmido ColK. Una proteína de
movilidad codificada por ColK actúa sobre el sitio nic en el
nucleótido 2254 de pBR322, iniciando la movilización desde este
punto. El pT7-7 se digirió con LspI y
BgIII, y los extremos 5' que sobresalen se rellenan con el
fragmento de Klenow de ADN polimerasa I. El fragmento de ADN
plasmídico se purificó mediante una electroforesis en gel de
agarosa, los extremos romos se unieron y se transformaron en E.
coli DH1 mediante electroporación utilizando un pulsador de
genes Bio-Rad y siguiendo las condiciones
recomendadas por los fabricantes. El plásmido resultante pBROC413
se identificó mediante un análisis de enzimas de restricción del ADN
plasmídico.
La delección en pBROC413 desde el sitio
LpsI inmediatamente cadena arriba del promotor f10 hasta el
sitio BgIII en el nucleótido 434 de pT7-7
deleciona el ADN que se corresponde con los nucleótidos
2065-2297 de pBR322. El sitio nic y las
secuencias adyacentes, por tanto, se delecionan, lo cual hace que
pBROC413 no sea movilizable.
El SDS-PAGE se realizó de modo
general utilizando el sistema Novex (British Biotechnology), según
las instrucciones del fabricante. Se emplearon geles precargados de
acrilamida 4-2096. Las muestras para la
electroforesis, incluyendo los patrones de peso molecular de
proteínas (por ejemplo, kit LMW, Pharmacia o Novex Mark 12) se
diluyeron normalmente en tampón que contenía SDS al 1% (p/v) (con o
sin 2-mercaptoetanol al 5% (v/v)), y se dejó a
temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 30 min antes de la
aplicación al gel.
Existe una serie de métodos para lograr las
valoraciones objetivo. La razón por la cual puede ser necesario
realizar una reducción selectiva de disulfuros es que, durante el
aislamiento y la purificación de proteínas con múltiples grupos
tiol, en particular durante el replegamiento de proteínas con
múltiples grupos tiol totalmente desnaturalizadas, pueden
producirse apareamientos de disulfuro inapropiados. Además, incluso
si se produce un apareamiento de disulfuro correcto, es posible que
una cisteína libre en la proteína pueda bloquearse, por ejemplo con
glutatión. Estos derivados son en general bastante estables. Para
que sean más reactivos, por ejemplo para la posterior conjugación
con otro grupo funcional, necesitan ser selectivamente reducidos,
por ejemplo con ditiotreitol (DTT) o HCl de
tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y
después modificarse opcionalmente con una función que sea
moderadamente inestable. Un ejemplo de esto último es el reactivo de
Ellman (DTNB) que produce un disulfuro mixto. En el caso en que se
omite el tratamiento con DTNB es necesario prestar una cuidadosa
atención al diseño experimental para asegurarse de que la
dimerización de la proteína que contiene grupos tiol libres se
minimice. La referencia a la expresión "selectivamente
reducido" anterior significa que las condiciones de reacción,
por ejemplo la duración, la temperatura, las proporciones molares de
los reactivos, deben controlarse con cuidado de forma que la
reducción de los enlaces disulfuro dentro de la arquitectura
natural de la proteína se miminice. Todos los reactivos están
disponibles en el mercado, por ejemplo en Sigma o Pierce.
\newpage
Los siguientes ejemplos generales ilustran el
tipo de condiciones que pueden utilizarse y que son útiles para la
generación de tioles libres y su modificación opcional. Las
condiciones de reacción específicas para lograr una reducción
óptima de los grupos tiol y/o la modificación se determinan, de
forma ideal, para cada lote de proteínas.
El TCEP puede prepararse como una disolución 20
mM en Hepes 50 mM (aproximadamente pH 4,5) y puede conservarse a
-40ºC. El DTT puede prepararse a 10 mM en fosfato de sodio, pH 7,0,
y puede conservarse a -40ºC. El DTNB puede prepararse a 10 mM en
fosfato de sodio, pH 7,0, y puede conservarse a -40ºC. Todos los
reactivos anteriores se utilizan, de forma típica, a equivalencia
molar o a un exceso molar frente a la concentración de proteínas,
identificándose las concentraciones precisas, de forma ideal, de
manera experimental. La duración y la temperatura de la reacción se
determinan, de modo similar, de manera experimental. De modo
general, la duración estará en el intervalo de 1 a 24 horas, y la
temperatura estará en el intervalo de 2ºC a 30ºC. El exceso de
reactivo pueden retirarse de modo conveniente mediante intercambio
de tampón, por ejemplo utilizando Sephadex G25 o Sephadex G50. Un
tampón adecuado es fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0, o la disolución
puede dejarse sin tratar.
Se añadió cloruro de miristoílo (1,0 mmol) con
agitación vigorosa a piridina seca enfriada en hielo (1,0 ml) y
seguido inmediatamente de N-hidroxisuccinimida (1,5
mmol). La mezcla se agitó a 4 h a temperatura ambiente
(aproximadamente 23ºC). Se añadió la base libre de
2-aminoetanotiol (1,1 mmol) como un sólido a la
mezcla y se dejó reaccionar durante 6 h a temperatura ambiente,
seguido de 3 días a 4ºC. El producto se trató con agua (5 ml), se
agitó a 1 h a temperatura ambiente y se filtró, lavando con agua
fría. El sólido blanco se disolvió en sulfóxido de dimetilo y se
reprecipitó con agua y después se secó al vacío sobre pentóxido de
fósforo. El rendimiento final fue de 0,21 g (aproximadamente 70%).
Una valoración de los grupos tiol utilizando reactivo de Ellman
indicó que el producto contenía aproximadamente 45% de tioles
libres.
El péptido:
| Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-Cys-NH_{2} | (SEQ ID NO:5) |
se preparó utilizando una síntesis en fase
sólida a través de la estrategia general de Fmoc/tBu desarrollada
por Sheppard y Atherton (E. Atherton y R.C. Sheppard, Solid Phase
Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989). Se empleó una resina de
polidimetilacrilamida sobre un soporte de diatomita (Macrosorb 100)
como soporte sólido y se derivatizó con etilendiamina.
Las reacciones de acoplamiento se realizaron
utilizando reactivos protegidos con
N-\alpha-Fmoc preactivados con
N,N'-diisopropilcarbodiimida/N-hidroxibenzotriazol
(en un exceso molar de 4 veces) con control con azul de bromofenol.
Las rupturas con Fmoc utilizan piperina al 20% en DMF. Las
reacciones para ensamblar la cadena peptídica se realizaron
mediante ciclos repetidos de acoplamiento y desprotección,
incluyendo la unión del reactivo de unión Rink modificado (ácido
p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluorenil-9-ilmetoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]fenoxiacético)
diseñado para producir una amida C-terminal tras la
ruptura final. Las funcionalidades de cadena lateral de los
aminoácidos individuales se protegieron como sigue: Ser
(t-butilo), Lys (Boc), Asp
(O-t-butilo), Cys (tritilo).
Tras completar el ensamblaje de los péptidos y
con el péptido aún unido a la resina, el grupo miristoílo se unió
al grupo amino de la glicina N-terminal mediante
acoplamiento directo de ácido mirístico mediante el mismo
procedimiento de activación. Este péptido modificado entonces se
separó de la resina y los grupos protectores de cadenas laterales
se retiraron al mismo tiempo mediante un tratamiento con ácido
trifluoroacético que contenía agua al 2,5% y triisopropilsilano al
2,5%.
El producto bruto se trató con
2,2'-tiopiridina en una disolución de acetato de
amonio 0,01 M a pH 8-9 durante aproximadamente 2
horas, después se acidificó con ácido acético y se purificó mediante
una cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (HPLC) en
ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA)/agua y TFA al 0,1%/acetonitrilo
como componentes del gradiente. Después de una liofilización, el
péptido resultó ser un polvo amorfo blanco, soluble hasta al menos
10 mg/ml en sulfóxido de dimetilo. Una espectrometría de masas de
bombardeo de átomos rápidos produjo unos picos principales a m/e
2107,8, 2129,7 y 2145,8, que corresponden con los iones moleculares
monoprotonados, monosodiados y monopotasiados del péptido. El
contenido en 2-tiopiridilo del péptido se midió
disolviéndolo en aproximadamente 0,03 mM a 0,2 mM en borato de sodio
0,1 M, pH 8,0, y reduciendo mediante la adición de ditiotreitol
hasta 5 mM. Se usó el cambio en la densidad óptica a 343 nm para
calcular la cantidad de
piridin-2-tiona liberada utilizando
un coeficiente de extinción en esta longitud de onda de 8080
cm^{-1} M^{-1}. Esto indicó que el contenido en el péptido era
de aproximadamente 60% de peso seco.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido:
| Cys-Asp-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Ser-Ser-Lys-NH_{2} | (SEQ ID NO:18) |
se preparó mediante síntesis en fase sólida
utilizando el método general descrito en el ejemplo 2 y con las
siguientes variaciones:
a. La lisina C-terminal se
protegió mediante alquilación con el grupo
4-metiltritilo (MTT); todas las demás lisinas se
N-\varepsilon-protegieron con el
grupo t-Boc.
b. El MTT se retiró con ácido trifluoroacético
al 1% v/v en diclorometano y el grupo amino libre exclusivo
resultante se derivatizó con ácido mirístico antes de la
desprotección de las otras lisinas (como se describe en el ejemplo
2).
\vskip1.000000\baselineskip
El N-terminal se acetiló con
anhídrido acético tras completarse el ensamblaje de la cadena
peptídica. La generación del resto
2-piridilditiocisteína se realizó mediante la
reacción del péptido desprotegido con
2,2'-ditiopiridina como se describió anteriormente.
El producto se purificó como se describe en el ejemplo 2. Una
espectrometría de masas de bombardeo de átomos rápidos produjo un
pico de ion molecular a 2221,3 (compárese con 2220,3 para la masa
teórica monoprotonada).
Análisis de aminoácidos:
El análisis de aminoácidos indicó un contenido
peptídico neto en peso de 68,7%. El contenido en disulfuro de
2-piridilo fue de aproximadamente 60% en peso
utilizando el método del ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido:
| Ser-Lys-Asp-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-Cys | (SEQ ID NO:19) |
\newpage
se preparó utilizando el protocolo de síntesis
en fase sólida general del ejemplo 2. La miristoilación, la
amidación C-terminal y la derivatización del resto
Cys se realizó como se describe en el ejemplo 2. Después de la
purificación, una espectrometría de masas produjo el pico principal
a 2040,5, que se corresponde con la forma monoprotonada (teórico:
2039,5).
Análisis de aminoácidos:
El contenido peptídico fue de aproximadamente
56% en peso.
Es un elemento de incorporación a membranas para
su uso en la invención.
El péptido:
| Cys-Ser-Ala-Ala-Pro-Ser-Ser-Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val | (SEQ ID NO:20) |
se preparó utilizando la metodología en fase
sólida general del ejemplo 2 y se N-acetiló como en
el ejemplo 3. El C-terminal se derivatizó
utilizando n-decilamina en lugar del reactivo de
Rink. Una espectrometría de masas del péptido purificado produjo un
pico principal a 1952,3 que se corresponde con un ion molecular
monoprotonado (teórico: 1951,1). También se observó un ion a
1843,3, que se cree que se corresponde a la pérdida del grupo
tiopiridilo en el espectrofotómetro.
Análisis de aminoácidos:
El contenido peptídico en peso fue de 53%.
El plásmido que codifica SCR1-3
de LHR-A de CR1, pDB1013-5
(solicitud de patente WO 94/00571) se digirió con las endonucleasas
de restricción EcoRI y HindIII, y la banda del
plásmido de 2,2 kB se aisló a partir de un gel de agarosa
utilizando un kit de extracción de ADN Qiagen Qiaex según las
instrucciones del fabricante. Este es el fragmento 1. Un segundo
lote de pDB1013-5 se digirió con BanI y
EcoRI, y la banda de 196 pb se extrajo de la agarosa como se
indicó anteriormente. Este es el fragmento 2. Dos oligonucleótidos,
SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, se reasociaron para producir una
concentración final de ADN de 100 pmoles/ul. El oligonucleótido
reasociado tiene una proyección BanI/EcoRI y duplica la
secuencia en el extremo 3' de pDB1013-5 pero además
contiene un codón que codifica cisteína justo antes del codón de
terminación. Este es el fragmento 3.
Los fragmentos 1, 2 y 3 se acoplaron con ADN
ligasa de T4 en una única reacción para producir pDB1030. El
plásmido acoplado se transformó en E. coli JM109 competente
adquirido en Promega. Las colonias resultantes se analizaron
mediante una digestión con endonucleasas de restricción y la
secuencia del ADN confirmó que la secuencia de aminoácidos
codificada de SCR(1-3) (SEQ ID NO:27 del
documento WO 94/00571) se había alterado en un único resto cisteína
C-terminal para producir SEQ ID NO:6.
El pDB1030 se transformó en E. coli BL21
(DE3) competente con cloruro de calcio y las colonias resultantes
se aislaron y se comprobaron para el contenido en plásmidos. Para
expresar la proteína desde pBD1030 en E. coli BL21 (DE3) se
inoculó una única colonia en 10 ml de medio
LB-fosfato (triptona 20 g/l, extracto de levadura
15 g/l, NaCl 0,8 g/l, Na_{2}HPO_{4} 0,2 g/l, KH_{2}PO_{4}
0,1 g/l) que contenía ampicilina 50 ug/ml. El cultivo se cultivó
durante 6 horas a 37ºC, a 230 rpm antes de utilizarse para inocular
100 ml del mismo medio que contenía ampicilina 50 ug/ml. Se cultivó
bajo las mismas condiciones durante la noche. Entonces se
utilizaron 25 ml de cada cultivo para inocular 600 ml del mismo
medio con ampicilina 50 ug/ml en matraces Erlenmeyer de 3 litros.
Las células se cultivaron hasta una DO de 0,8-1,0 a
A_{600} nm. Se añadió IPTG
(isopropil-B-D-galactopiranósido)
hasta una concentración final de 1 mM y se dejó que las células
continuasen su crecimiento durante 3-4 horas más
antes de recolectarlas mediante centrifugación a 8000 g/10 ml. El
sedimento de 2 litros del cultivo se conservó a -80ºC.
Los métodos descritos son fundamentalmente los
detallados en Dodd I. et al. (1995), Protein Expression and
Purification, 6:727-736.
El sedimento celular congelado de E. coli
BL21 (DE3) (pDB1030) se resuspendió en Tris 50 mM/NaCl 50 mM/EDTA 1
mM/PMSF 0,1 mM, pH 8,0, a una proporción de 33 ml para cada litro de
sedimento de cultivo. La suspensión se trasladó a un vaso de
precipitado de vidrio rodeado de hielo y se sonicó (sistema térmico
- Ultrasonics W380; pulso 50 x 50%; tiempo del pulso = 5 seg.)
durante 3-6 minutos, de forma típica. El sedimento
disgregado entonces se congeló y se conservó a -80ºC. Después de
aproximadamente 2 semanas el sonicado se descongeló y se centrifugó
a aproximadamente 8000 g durante 20 min. El sedimento se resuspendió
en Tris 20 mM/urea 8 M/EDTA 1 mM/2-mercaptoetanol
50 mM, pH 8,5 (200 ml) a temperatura ambiente mediante agitación
vigorosa, después se dejó durante 1 h a temperatura ambiente,
seguido de una noche a 4ºC.
A la disolución viscosa se le añadió
SP-Sepharose FF (aproximadamente 30 g de peso
húmedo) que se había lavado con agua y secado por succión. La
mezcla se agitó vigorosamente y se dejó estática durante
1-2 horas a temperatura ambiente. El sobrenadante
se decantó, se dividió en muestras y se rechazó. La suspensión
remanente se resuspendió hasta lograr una suspensión uniforme y se
vertió en una camisa de vidrio y se dejó sedimentar en un lecho
cargado. La columna se equilibró con Tris 0,02 M/urea 8
M/2-mercaptoetanol 0,05 M/EDTA 0,001 M, pH 8,5, a
4ºC. Cuando la A_{280} del eluato se estabilizó en una línea de
base, el tampón se cambió a un tampón de equilibrio que contenía
además NaCl 1 M. Un único pico a A_{280} eluyó con el tampón que
contenía NaCl 1 M; el volumen fue de aproximadamente 50 ml. La
concentración de proteínas de la disolución se estimó mediante la
determinación de A_{280}, utilizando un coeficiente de extinción
molar de 25000 cm^{-1} de una muestra que se había sometido a un
intercambio de tampón (Sephadex G25) en ácido fórmico 50 mM. Esto
mostró que el producto tenía una concentración de proteínas de 1,6
mg/ml. La disolución se conservó a -40ºC.
Se añadieron gradualmente 25 ml del producto
purificado con SP-Sepharose a lo largo de un periodo
de 1 min a 780 ml de etanolamina 0,02 M/EDTA 1 mM frío recién
preparado con agitación continua, y se dejó estático durante 1
h/4ºC. Se añadió glutatión reducido (GSH) hasta 1 mM y se añadió
glutatión oxidado (GSSG) hasta 0,5 mM. La disolución era
transparente y se dejó estática durante aproximadamente
2-3ºC durante 3 días. La disolución entonces se
ultrafiltró utilizando una membrana YM10 hasta un volumen final del
retenido de aproximadamente 35 ml; el retenido era ligeramente
turbio y tenía el aspecto de una disolución translúcida. Se conservó
durante 12 días a 4ºC. Entonces se centrifugó a 30.000 g durante 15
min y el sobrenadante se mezcló con 9 vol. de NaH_{2}PO_{4} 0,1
M/(NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, pH 7,0 (tampón A) a
temperatura ambiente y se centrifugó inmediatamente a 3000 rpm
durante 15 min. El sobrenadante se ultrafiltró (YM10) hasta
aproximadamente 4 ml y después se sometió a un intercambio de
tampón en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0 (5,0 ml); esta disolución
tenía una concentración de proteínas de 1,7 mg/ml mediante un
análisis de A280. Se trató con ácido
ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB)
(exceso molar en 8 veces) durante 30 min a temperatura ambiente. El
contenido en grupos tiol libres, basándose en la medida a A412 y
con un coeficiente de extinción (para el ion tionitrobenzoato libre)
de 13.600, fue de 6 uM equivalente a sólo aproximadamente 10% de
derivatización para producir el producto A. Se cree que la mayoría
del producto es [SCR1-3]-Cys en el
que el tiol C-terminal libre está bloqueado mediante
la reacción con glutatión o con 2-mercaptoetanol
durante la etapa de replegamiento.
El método fue similar al descrito anteriormente,
excepto que se siguió más de cerca los procedimientos descritos en
Dodd et al. (citado anteriormente). En particular, el
retenido ultrafiltrado después del replegamiento se trató
inmediatamente con sulfato de amonio, seguido de una aclaración
mediante centrifugación y una cromatografía con Butyl Toyopearl.
Las fracciones que absorbían a A280 resultantes que eluyeron con
sulfato de amonio de aproximadamente 0,2 a 0,4 M se reunieron y se
consideraron el producto B. Comenzando con 100 mg nominales de
SCR1-3/Cys totalmente reducido, el producto B
contenía 17 mg. El producto contenía una especie principal
determinado mediante SDS-PAGE no reductora con una
pureza estimada de >90% y un peso molecular aparente de 21.000.
Basándose en estudios con preparaciones producidas de forma similar,
se cree que es la forma derivatizada con
S-glutatión y/o S-mercaptoetanol de
la proteína de origen, aunque al menos algunos lotes producidos de
forma similar o conservados durante un tiempo pueden existir como el
variante de cisteína libre. El producto también contenía un
polipéptido con un peso molecular aparente de aproximadamente
40.000. Basándose en estudios con lotes similares de proteína
enriquecida en esta especie se identifició como el dímero de
[SCR1-3]-Cys.
- H_{2}N-[SCR1-3]-Asp-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Pro-Ser-Lys-Ser-Gly-OH
El fragmento 1 y el fragmento 2 de
pDB1013-5 son los mismos que en el ejemplo 6
anterior. Dos oligonucleótidos, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4,
preparados por Cruachem se reasociaron para producir una
concentración final de ADN de 100 pmoles/ul. El oligonucleótido
reasociado tiene una proyección BanI/EcoRI y duplica la
secuencia en el extremo 3' de pDB1013-5 pero además
contiene 17 codones más que codifican DGPKKKKKKSPSKSSGC justo antes
del codón de terminación. Este es el fragmento 4.
Los fragmentos 1, 2 y 4 se acoplaron con ADN
ligasa de T4 en una única reacción para producir pDB1031. El
plásmido acoplado se transformó en E. coli JM109 competente.
Las colonias resultantes se analizaron mediante una digestión con
endonucleasas de restricción y la secuenciación del ADN confirmó que
la secuencia de aminoácidos codificada de
SCR(1-3) (SEQ ID NO:27 del documento WO
94/00571) se había alterado mediante la adición
C-terminal de los aminoácidos DGPKKKKKKSPSKSSGC
para producir SEQ ID NO:7.
El pDB1031 se transformó en E. coli BL21
(DE3) competente con cloruro de calcio y las colonias resultantes
se aislaron y se comprobaron para el contenido en plásmidos. Para
expresar la proteína desde pBD1031 en E. coli BL21 (DE3) se
inoculó una única colonia en 10 ml de medio
LB-fosfato (triptona 20 g/l, extracto de levadura
15 g/l, NaCl 0,8 g/l, Na_{2}HPO_{4} 0,2 g/l, KH_{2}PO_{4}
0,1 g/l) que contenía ampicilina 50 ug/ml. El cultivo se cultivó
durante 6 horas a 37ºC, a 230 rpm antes de utilizarse para inocular
100 ml del mismo medio que contenía ampicilina 50 ug/ml. Se cultivó
bajo las mismas condiciones durante la noche. Entonces se
utilizaron 25 ml de cada cultivo para inocular 600 ml del mismo
medio con ampicilina 50 ug/ml en matraces Erlenmeyer de 3 litros.
Las células se cultivaron hasta una DO de 0,8-1,0 a
A_{600} nm. Se añadió IPTG
(isopropil-B-D-galactopiranósido)
hasta una concentración final de 1 mM y se dejó que las células
continuasen su crecimiento durante 3-4 horas más
antes de recolectarlas mediante centrifugación a 8000 g/10 ml. El
sedimento celular se congeló a -40ºC.
Los métodos descritos son fundamentalmente los
detallados en Dodd I. et al. (1995), Protein Expression and
Purification, 6:727-736, con algunas
modificaciones.
El sedimento celular congelado de E. coli
BL21 (DE3) (pDB1031) se descongeló y se resuspendió en Tris 50
mM/NaCl 50 mM/EDTA 1 mM/PMSF 0,1 mM, pH 8,0, a una proporción de 33
ml para cada litro de sedimento de cultivo. La suspensión se
trasladó a un vaso de precipitado de vidrio rodeado de hielo y se
sonicó (sistema térmico - Ultrasonics W380; pulso 50 x 50%; tiempo
del pulso = 5 seg.) durante 3-6 minutos, de forma
típica. El sedimento disgregado entonces se congeló y se conservó a
-80ºC. Después de aproximadamente 1 día el sonicado se descongeló y
se centrifugó a aproximadamente 8000 g durante 20 min. El sedimento
se resuspendió en Tris 20 mM/urea 8 M/EDTA 1
mM/2-mercaptoetanol 50 mM, pH 8,5 (240 ml) a
temperatura ambiente mediante agitación vigorosa, después se dejó
durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de 5 días a 4ºC.
A la disolución viscosa se le añadió
SP-Sepharose FF (aproximadamente 30 g de peso
húmedo) que se había lavado con agua y secado por succión. La
mezcla se agitó vigorosamente y se dejó estática durante
aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. El sobrenadante se
decantó, se dividió en muestras y se rechazó. La suspensión
remanente se resuspendió hasta lograr una suspensión uniforme y se
vertió en una camisa de vidrio y se dejó sedimentar en un lecho
cargado. La columna se equilibró con Tris 0,02 M/urea 8
M/2-mercaptoetanol 0,05 M/EDTA 0,001 M, pH 8,5, a
4ºC. Cuando la A_{280} del eluato se estabilizó en una línea de
base, el tampón se cambió a un tampón de equilibrio que contenía
además NaCl 1 M. Un único pico a A_{280} eluyó con el tampón que
contenía NaCl 1 M; el volumen fue de aproximadamente 50 ml. La
concentración de proteínas de la disolución se estimó mediante la
determinación de A_{280}, utilizando un coeficiente de extinción
molar de 25000 cm^{-1} de una muestra que se había sometido a un
intercambio de tampón (Sephadex G25) en ácido fórmico 50 mM. Esto
mostró que el producto tenía una concentración de proteínas de 2,8
mg/ml. Un análisis mediante SDS-PAGE/tinción mostró
una banda principal (aproximadamente 80%) a aproximadamente 23.000
Da. La disolución se conservó a -40ºC.
Se añadieron gradualmente 14 ml del producto
purificado con SP-Sepharose a lo largo de un periodo
de 1 min a 430 ml de HEPES 0,05 M/cloruro de sodio 2 M/EDTA 1 mM
frío recién preparado, pH 8,0, con agitación continua, y se dejó
estático durante 1 h/4ºC. Se añadió glutatión reducido (GSH) hasta 1
mM y se añadió glutatión oxidado (GSSG) hasta 0,5 mM. La disolución
era transparente y se dejó estática durante aproximadamente
2-3ºC durante 3 días. La disolución entonces se
ultrafiltró utilizando una membrana YM10 hasta un volumen final del
retenido de aproximadamente 34 ml; el retenido era ligeramente
turbio. Entonces se centrifugó a 25.000 g durante 15 min y el
sobrenadante se sometió a un intercambio de tampón en fosfato de
sodio 0,1 M, pH 7,0 (46 ml). Esta fracción contenía 2 mg de
proteína basándose en una determinación a A280. La disolución se
mezcló con DTNB (20 mM; 0,65 ml) durante 20 min a 4ºC y después se
ultrafiltró hasta 2,4 ml. Este retenido se sometió a un intercambio
de tampón en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0 (3,0 ml) y se conservó a
-40ºC. Las medidas de absorbancia a 412 nm de la disolución antes
de la ultrafiltración sugieren una derivatización de 25% con
DTNB.
El método fue similar al descrito en (c)
anteriormente excepto que, después de la etapa de ultrafiltración
después del replegamiento, se siguió más de cerca los procedimientos
descritos en Dodd et al. (citado anteriormente). En
particular, el retenido ultrafiltrado después del replegamiento se
trató inmediatamente con sulfato de amonio, seguido de una
aclaración mediante centrifugación y una cromatografía con Butyl
Sepharose. Las fracciones que absorbían a A280 resultantes que
eluyeron con sulfato de amonio de aproximadamente 0,2 a 0,4 M se
reunieron y se consideraron el producto inicial. Un tratamiento
adicional con TCEP fundamentalmente como se indicó anteriormente,
seguido por DTNB, produjo un producto final a una concentración
final de proteína de 10 uM. El producto final contenía una especie
principal determinada mediante SDS-PAGE no reductora
con una pureza estimada de >90% y un peso molecular aparente de
23.000, y contenía aproximadamente 2 moles de TNB por mol de
proteína.
(a) El producto A del ejemplo 6(c) (1,5
ml) se trató con ditiotreitol (30 ul de 0,5 M en agua, concentración
final 10 mM) durante 60 min a 4ºC para producir el péptido libre
SEQ ID NO:6. La disolución amarilla se filtró en gel a 4ºC sobre
una pequeña columna de Sephadex G-25
(PD-10, Pharmacia) en tampón HCl.Hepes 0,05 M, pH
7,5 (3,0 ml). La disolución ligeramente turbia se mezcló con una
disolución de MSWP-1 (ejemplo 2) (equivalentes de
ditiopiridilo 3,8 mM, 150 ul) hasta una concentración final de 0,18
mM (aproximadamente 8 equivalentes molares). La mezcla se mantuvo
durante 2 h sobre hielo y después se filtró en gel como
anteriormente, pero utilizando dos columnas PD10 (se aplicaron 1,6
ml, se eluyeron 3,2 ml). El eluato final no era turbio y se
conservó congelado a -70ºC en partes alícuotas de 0,4 ml.
(b) El producto proteico B de
[SCR1-3]-Cys descrito en el ejemplo
6(d) (1,5 ml, proteína 31 uM) se mezcló con TCEP (20 mM,
0,007 ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 23 h para
producir la proteína libre SEQ ID NO:6. Se añadió
MSWP-1 (ejemplo 2) (10 mM, 0,093 ml) y la disolución
se incubó durante 4 h más. Se sometió a un intercambio de tampón a
0,75 ml de la disolución final en ácido fórmico 50 mM y las partes
alícuotas se dejaron en disolución o se liofilizaron. El producto
era >80% puro mediante SDS-PAGE y tenía un peso
molecular aparente de 23.000, claramente desplazado del peso
molecular del origen de 21.000. El liofilizado se solubilizaba con
facilidad en ácido fórmico 50 mM a una concentración de proteína
estimada de 2 mg/ml.
(c) El producto proteico B de
[SCR1-3]-Cys descrito en el ejemplo
6(d) (21,6 ml, proteína 31 uM) se mezcló con TCEP (20 mM,
0,1 ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 22 h para
producir la proteína libre SEQ ID NO:6. Se añadió
MSWP-1 (20 mM en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0;
0,67 ml) y la disolución se incubó durante 4 h más. Se sometió a un
intercambio de tampón a los 22 ml completos en ácido fórmico 50 mM
utilizando Sephadex G50 (Vt 160 ml). Se obtuvieron tres picos a
A280. El primero, que eluyó a un volumen de 56-106
ml, fue el compuesto del título según un análisis de
SDS-PAGE. La fracción se separó en partes alícuotas
y éstas se conservaron a -40ºC o se liofilizaron. El análisis de
aminoácidos de la disolución de preliofilización indicó una
concentración de proteínas de 0,42 mg/ml. La A280 (longitud de paso
de 1 cm) fue de 0,44. Una HPLC en fase inversa C8 y una
SDS-PAGE indicaron una pureza de aproximadamente
80%. Esta última técnica mostró que la banda principal tenía un
peso molecular aparente de 23.000, claramente desplazado del peso
molecular del origen de 21.000; tras la reducción, la banda de
23.000 se desplazó a dos bandas con pesos moleculares de
aproximadamente 21.000 y aproximadamente 5.000. El liofilizado se
solubilizaba con facilidad en ácido fórmico 50 mM o en PBS "A"
(Dulbecco) a una concentración de proteína estimada de 6 mg/ml.
(d) El
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
de (c) se dividió en partes alícuotas de 0,3 ml y se liofilizó. Las
partes alícuotas individuales se resolubilizaron en ácido fórmico
50 mM (0,3 ml o 0,039 ml).
El compuesto del título puede sintetizarse
utilizando SCR1-3/interruptor activado con TNB (SEQ
ID NO:7) preparado como en el ejemplo 7(d). El
SCR1-3/interruptor activado con TNB se mezcla con un
exceso molar de MAET (ejemplo 1), que puede constituirse, de forma
típica, a 2,0 mg/ml en DMSO, equivalente a aproximadamente 3 mM de
tiol libre. Las condiciones de reacción típicas serían de 1 a 4
horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC utilizando
una concentración de proteína dd 1 a 100 uM. La reacción puede
controlarse comprobando la generación de color amarillo, que está
provocada por la liberación de ion TNB libre. Cuando la reacción se
completa, la disolución puede someterse a un intercambio de tampón
en un tampón adecuado, por ejemplo fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0,
y conservarse a -40ºC hasta que se necesite.
Método
(a)
Se mezclaron 0,02 ml de MSWP-1
(ejemplo 2, 10 mM en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0) con 0,005 ml de
TCEP (20 mM en Hepes 50 mM) y se dejó durante 10 min a temperatura
ambiente. La disolución resultante era la disolución A que contenía
el péptido miristoilado de SEQ ID NO:5. El
SCR1-3/interruptor activado con TNB (SEQ ID NO:7)
preparado de una manera similar a la descrita en el ejemplo
7(c) (0,3 ml, 15 uM en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0) se
mezcló con 0,0056 ml de la disolución A para producir un exceso
molar teórico de MSWP-SH de cinco veces frente a la
proteína. La mezcla se dejó durante 4 h a temperatura ambiente,
seguido de 18 h a 4ºC. Un análisis mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de la proteína,
indicó una banda principal con un M_{r} aparente de 23 K, que se
corresponde con la proteína sin reaccionar, y una banda secundaria
con un M_{r} aparente de 26 K, que se corresponde con la proteína
del título.
Método
(b)
El producto de
SCR1-3/interruptor activado con TNB (SEQ ID NO:7)
(10 um, 0,43 ml) preparado de una manera similar a la descrita en
el ejemplo 7(d) se mezcló con TCEP (5 mM, 0,0026 ml) y se
incubó durante 17 h a temperatura ambiente para producir la
proteína de fusión libre SEQ ID NO:7. Se añadió
MSWP-1 (10 mM, 0,0086 ml) y la incubación continuó
durante 4 h más. En la disolución aparecían partículas pequeñas o
cristales pero por lo demás era transparente. La disolución con
partículas se sometió a un intercambio de tampón en ácido fórmico 50
mM (1,0 ml), se formaron partes alícuotas y se congelaron. Un
análisis mediante SDS-PAGE bajo condiciones no
reductoras mostró una serie de bandas, que incluían una especie con
un peso molecular aparente de 25.000, la especie diana.
El receptor 1 del complemento humano (CR1, CD35)
es un regulador conocido de la activación del complemento que se ha
producido en una forma soluble recombinante que contiene todos los
dominios SCR extracelulares de un alotipo natural principal (Fearon
et al., documento WO 89/09220, documento WO 91/05047). Esta
forma (sCR1) se ha expresado como una proteína activa en células de
ovario de hámster chino (CHO). Se realiza una mutagénesis de la
secuencia de ADN inmediatamente cadena debajo del codón para
Cys-1924 para generar un nuevo resto cisteína
C-terminal.
Un ejemplo adecuado de un terminal modificado de
la secuencia de ADNc de sCR1 es el siguiente:
(5909) Bal I (5914)
.......CCT CTG GCC AAA TGT ACC TCT CGT GCA CAT
TGC TGA
\vskip1.000000\baselineskip
El codón Asp-1930 en CR1 se
sustituye por el de una cisteína (seguido de un codón de terminación
para generar una proteína soluble) mediante el acoplamiento de un
oligonucleótido modificado en el sitio de endonucleasas de
restricción Bal I exclusivo en la posición 5914 (numeración
de Fearon et al., 1989, 1991).
La expresión de este ADNc modificado en células
CHO y el aislamiento del producto mediante procedimientos
cromatográficos convencionales genera una proteína sCR1 modificada
que puede tratarse como en el ejemplo 8(a), (b) o (c) para
acoplarla a MSWP-1 (ejemplo 2) para producir el
compuesto del título.
La proteína
[SCR1-3]-Cys (SEQ ID NO:6) preparada
de una manera similar a la descrita en el ejemplo 6(d)
(proteína 46 uM, 0,20 ml) se mezcló con TCEP (5 mM, 0,0054 ml) y se
incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 h. Se
mezclaron 0,05 ml de esta disolución con 0,025 ml de etanolamina 0,1
M y 0,003 ml de MSWP-2 (véase el ejemplo 3, 5 mM en
DMSO); la disolución se incubó durante 3 h más a temperatura
ambiente. Un análisis de SDS-PAGE mostró que la
banda principal en la preparación tenía un peso molecular aparente
de 23.000, claramente desplazado del peso molecular del origen de
21.000. Se estimó que la pureza de la proteína diana, mediante
SDS-PAGE, era de aproximadamente 80%.
La proteína
[SCR1-3]-Cys (SEQ ID NO:6) preparada
de una manera similar a la descrita en el ejemplo 6(d)
(proteína 46 uM, 0,10 ml) se mezcló con TCEP (5 mM, 0,0037 ml) y se
incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 h. Se
añadió 0,01 ml de etanolamina 0,5 M. Se mezclaron 0,03 ml de esta
disolución de 0,11 ml con 0,0032 ml de MSWP-3
(véase el ejemplo 4, 2 mM en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0); la
disolución se incubó durante 3 h más a temperatura ambiente. Un
análisis de SDS-PAGE mostró que la banda principal
en la preparación tenía un peso molecular aparente de 23.000,
claramente desplazado del peso molecular del origen de 21.000. Se
estimó que la pureza de la proteína diana, mediante
SDS-PAGE, era de aproximadamente 80%.
La proteína
[SCR1-3]-Cys (SEQ ID NO:6) preparada
de una manera similar a la descrita en el ejemplo 6(d)
(proteína 46 uM, 0,08 ml) se mezcló con TCEP (5 mM, 0,0029 ml) y se
incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 h. Se
añadió 0,008 ml de etanolamina 0,5 M. Se mezclaron 0,04 ml de esta
disolución de 0,088 ml con 0,0029 ml de TCPT-1
(véase el ejemplo 5, 2,9 mM en DMSO). El TCPT-1 se
añadió en 6 partes alícuotas a lo largo de un periodo de 2 h para
minimizar la agregación. La disolución se incubó durante 2 h más a
temperatura ambiente. El aspecto final de la mezcla era de una
suspensión coloidal, y una centrifugación a 2000 g durante 1 min
mostró que la proteína diana estaba compartimentalizada en el
precipitado. Un análisis de SDS-PAGE mostró que la
banda principal en la preparación tenía un peso molecular aparente
de 23.000, claramente desplazado del peso molecular del origen de
21.000. Se estimó que la pureza de la proteína diana, mediante
SDS-PAGE, era de aproximadamente 80%.
No es de la
invención
Se diluyó antisuero de conejo policlonal
anti(membranas de eritrocitos humanos) (RAEM) (Dako,
Dinamarca, 13 mg/ml, 0,25 ml) hasta 1,0 ml con fosfato de sodio 50
mM, cloruro de sodio 0,1 M, pH 7,4 (PBS), y se trató con 30 ul de
2-iminotiolano 100 mM en PBS (recién disuelto)
durante 30 min a 25ºC. Se ha demostrado que estas condiciones
(R.A.G. Smith y R. Cassels, Fibrinolysis, 2,
189-195, 1988) introducen un media de
2-3 grupos tiol libres por molécula de
inmunoglobulina G.
El producto se purificó mediante una
cromatografía de permeación en gel en una pequeña columna desechable
de Sephadex G-25m (PD-10,
Pharmacia, Estocolmo, Suecia) a 4ºC. Se trataron 2,5 ml del producto
(volumen total de 3,0 ml, concentración teórica de proteína de
aproximadamente 6,1 uM) con MSWP-1 (ejemplo 2, 0,125
ml de una disolución 5 mM en sulfóxido de dimetilo, concentración
final de aproximadamente 240 uM) y se incubó a 25ºC durante 30 min.
El producto se filtró en gel en una columna PD10 como se indicó
anteriormente para producir 3,0 ml de una disolución de
aproximadamente 5 uM en proteína. Ésta se conservó congelada a
-70ºC.
No es de la
invención
Una disolución madre de estreptoquinasa (SK)
(Behringwerke, Marburgo, Alemania, 12,8 mg/ml, 271 uM, 2,5 ml) se
filtró en gel utilizando una columna PD10 en 3,2 ml de tampón PBS
(véase el ejemplo 15) que contenía Tween 80 al 0,01% p/v (tampón
PST). Se añadió 2-iminotiolano recién preparado (64
ul de 100 mM) y la mezcla se incubó a 25ºC durante 1 h. El producto
se filtró en gel en lotes de 2 x 1,6 ml en 2 x 3,0 ml de PST a 4ºC
en dos columna PD 10. Esta disolución se conservó en partes
alícuotas de 1,5 ml a -75ºC.
La valoración del producto con reactivo de
Ellman (0,1 mM en 0,5 ml de HCl.trietanolamina 0,1 M, pH 8,0) mostró
que contenía aproximadamente 0,3 mM de grupos tiol libres. Esto se
corresponde con una media de 3-3,5 grupos tiol por
molécula de SK. La disolución madre de SK tiolada (2 x 0,5 ml) se
procesó mediante la modificación de una parte alícuota con
MSWP-1 (32 ul de una disolución madre 5 mM en DMSO),
se incubó durante 1 h a 25ºC y se filtró en gel (columna PD10) en
3,0 ml de PST a 4ºC. Se procesó una parte alícuota control en
paralelo sin exposición a MSWP-1. Ambos productos
contenían aproximadamente 0,8 mg/ml de proteína basándose en un
coeficiente de extinción de 0,76 (mg/ml)^{-1} a 280 nm
para SK y se conservaron a -75ºC.
No es de la
invención
La acilenzima reactiva al tiol
4-N-[2-N-(3-[2-piridilditio]etilcarbonil)aminoetil]aminobenzoílo-[Ser-478]-activador
del plasminógeno de tipo tisular humano [PDAEB->tPA] se preparó
mediante el método de Smith y Cassels (Fibrinolysis, 2,
189-195, 1988). El activador del plasminógeno
tisular (Actilyse, Boehringer Ingelheim, Alemania, aproximadamente
2 mg) se disolvió en el tampón PST del ejemplo 16 (1,0 ml) y se
trató con 25 ul de una disolución 20 mM de hidrocloruro de
4-N-[2-N-(3-[2-piridilditio]etilcarbonil)aminoetil]aminobenzoato
de 4'-amidinofenilo (S.B. Kalindjian y R.A.G.
Smith, Biochem. J., 248, 409-413, 1987) en sulfóxido
de dimetilo. La mezcla se incubó durante 1 h a 25ºC y se conservó
congelada a -80ºC. Se redujo mediante la adición de ditiotreitol (5
ul de 0,5 M en agua) durante 30 min a 0ºC, seguido de un
intercambio de tampón en tampón PST (3,0 ml) como se describe en el
ejemplo 16. El producto se dividió inmediatamente en una muestra
retenida (0,6 ml) y una muestra de reacción (2,4 ml) que se mezcló
con MSWP-1 (ejemplo 2, 100 ul de una disolución 5 mM
en sulfóxido de dimetilo) y se incubó durante 90 min en hielo. El
producto se sometió a un intercambio de tampón como anteriormente
en 3,2 ml de PST y se conservó en partes alícuotas a -196ºC.
En primer lugar se preparó una cepa congelada de
E. coli que portaba el plásmido pDB1030 mediante cultivo en
placa del cultivo sobre agar LB más ampicilina a 100 \mug/ml. Se
conservaron partes alícuotas de 1 ml en un crioconservante de
glicerol al 10%/PBS y se conservaron en nitrógeno líquido. Se
descongeló un vial de 1 ml y se utilizó para inocular 100 ml de
medio de siembra primario LB^{Amp100} (bactotriptona de Difco, 10
gl^{-1}; extracto de levadura de Difco, 5 gl^{-1}; cloruro de
sodio, 5 gl^{-1}; pH de la preesterilización, 7,4) en un matraz
de 500 ml. La etapa de siembra primaria se incubó a 37ºC durante 3
horas antes de ser trasladada a la etapa de siembra secundaria,
también en 100 ml de LB^{Amp100} por matraz de 500 ml utilizando
un inóculo al 1%. Después de una incubación como se indicó
anteriormente durante 4 horas más, un inóculo al 1% se trasladó a
la etapa de siembra terciaria, 10 litros de LB^{Amp100} en un
fermentador Biolafitte de 15 litros. Los 10 litros del medio de
siembra secundario se esterilizaron in situ durante 45
minutos a 121ºC antes de la inoculación. Tras una incubación
durante 14,5 horas, la siembra terciaria se trasladó al fermentador
de la etapa final como un inóculo al 6%. Las condiciones de
incubación para la etapa de siembra fueron las siguientes: flujo de
aire a 101 min^{-1} (1,0 vvm), temperatura de 37ºC, agitación a
400 rpm (1,9 ms^{-1}) y sobrepresión de 0,2 bar. Se esterilizaron
in situ 300 litros de medio^{Amp100}
fosfato-triptona (bactotriptona de Difco, 20
gl^{-1}; extracto de levadura de Difco, 15 gl^{-1}; cloruro de
sodio, 8 gl^{-1}; biortofosfato de disodio, 2 gl^{-1};
dibiortofosfato de potasio, 1 gl^{-1}; antiespumante Dow Corning
1520, 0,1 gl^{-1}; pH de la preesterilización, 7,4) durante 30
minutos a 121ºC en un fermentador de bioingeniería de 450 l. El
fermentador se inoculó con 20 litros de inóculo procedente de la
etapa de siembra terciaria y se incubó bajo las siguientes
condiciones: flujo de aire a 450 L min^{-1} (1,5 vvm), temperatura
de 37ºC, agitación a 230 rpm (1,5 ms^{-1}) y sobrepresión de 0,5
bar. Después de obtener una DO_{550 \ nm} de 3,5 se añadió IPTG 1
mM. Se realizó la recolección después de una incubación continua
durante 2 horas. Se recuperó una suspensión celular después de una
centrifugación primaria a través de un Westfalia CSA19 (dos
descargas). Las células se volvieron a centrifugar a 4700 rpm (7000
g) durante 30 minutos en una centrífuga Sorvall RC3B. El rendimiento
celular total (peso húmedo) fue de 2,98 kg y se conservó a -80ºC en
lotes de aproximadamente 600 g.
Se aislaron los cuerpos de inclusión de 100 g
(peso húmedo) de sedimento celular y se solubilizaron
fundamentalmente como se describe en el ejemplo 6. La purificación
de la proteína diana a partir de los cuerpos de inclusión
resolubilizados también se describe en el ejemplo 6 con algunas
modificaciones. Las principales fueron:
1. El uso de Macroprep High S (Biorad) en lugar
de S-Sepharose. Se utilizaron 200 g de matriz para
100 g de sedimento celular que se había sonicado. Se produjeron 1,4
g de proteína diana aproximadamente 16% pura en la fracción
solubilizada y parcialmente purificida de los cuerpos.
2. El replegamiento de una muestra de 100 mg de
la proteína parcialmente purificada se realizó diluyendo la
proteína totalmente desnaturalizada (2 mg/ml) en 100 veces en
etanolamina 60 M/EDTA 1 mM frío, seguido de la adición de la pareja
de glutatión redox.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto del anterior proceso fue capaz de
ser modificado con MSWP-1 (ejemplo 2) de una manera
similar a la descrita en el ejemplo 8.
El plásmido pBC04-29 se
construyó a partir del plásmido pDB1013-5 que
codifica SCR1-3 de LHR-A de CR1
(solicitud de patente WO 94/00571) mediante mutagénesis dirigida
específica de sitio QuickChange (Stratagene) según los protocolos
del fabricante. Se utilizaron dos oligonucleótidos complementarios
(SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16) para generar un nuevo sitio de
restricción (silencioso) en G186/P187 y una cisteína
C-terminal. En este caso, la reacción produjo una
mutación de desplazamiento de marco en la posición N195. En la
secuencia resultante, los aminoácidos C-terminales
N195 y K196 se reemplazan por un péptido de 14 aminoácidos
TNANKSLSSISCQT. De manera fortuita, esta secuencia contiene una
cisteína interna cerca del C-terminal, precedida por
una secuencia espaciadora de 11 aminoácidos.
\newpage
El pBC04-29 se transformó en
E. coli BL21 (DE3)pLys-S competente y
las colonias resultantes se aislaron y se comprobó su contenido en
plásmidos. Se inoculó una única colonia en 10 ml de medio LB
(bactrotriptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l)
que contenía ampicilina 50 ug/ml. El cultivo se cultivó durante
6-18 horas a 37ºC, 230 rpm, antes de utilizarse para
inocular 1 litro del mismo medio que contenía ampicilina 50 ug/ml a
una dilución de 1 en 100 en matraces Erlenmeyer de 4 l. Las células
se cultivaron hasta una DO de 0,8-1,0 a A_{600}
nm. Se añadió IPTG
(isopropil-B-D-galactopiranósido)
hasta una concentración final de 1 mM y se dejó que las células
continuasen su crecimiento durante 3-4 horas más o
durante la noche antes de recolectarlas mediante centrifugación a
8000 g/10 min. El sedimento de 1 l del cultivo se conservó a
-80ºC.
Los métodos son fundamentalmente los detallados
en Dodd I. et al. (1995), Protein Expression and
Purification, 6:727-736, posteriormente modificados
como se describe en el ejemplo 18. Brevemente, el sedimento celular
procedente de 1 l del cultivo de (b) se resuspendió en tampón, se
sonicó, y los cuerpos de inclusión se aislaron mediante
centrifugación. Los cuerpos de inclusión se resolubilizaron en 100
ml de tampón totalmente reductor y la proteína diana se purificó en
un Macroprep High S (30 g de peso húmedo). El producto (27 ml a 1,5
mg/ml nominales) que eluyó de la columna en el tampón que contenía
NaCl 1 M se replegó mediante una dilución en 2,5 l de etanolamina
60 mM/EDTA 1 mM frío, añadiéndose los agentes de glutatión redox a
la hora. Después de 3 días a 4ºC, la disolución se ultrafiltró
utilizando una membrana YM10 y el retenido se trató con sulfato de
amonio, se centrifugó y el sobrenadante se purificó en Butyl
Toyopearl 650M (volumen del lecho 53 ml). Un único pico a A280
eluyó mediante un gradiente descendiente de sulfato de amonio. Una
SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras, seguida de
la tinción de las proteínas, reveló un polipéptido principal con un
peso molecular aparente de 22.000, que se cree que es la proteína
diana. Uno de los polipéptidos contaminantes tenía un peso
molecular aparente de aproximadamente 40.000, y se identificó como
el dímero o la forma monomérica de la diana mediante su comparación
con marcadores adyacentes de
[SCR1-3]-Cys. El producto tenía una
concentración estimada de proteína de 30 uM.
\vskip1.000000\baselineskip
El
[SCR1-3(delN195-K196)]TNANKSLSSISCQT
preparado como se describe en el ejemplo 19 (aproximadamente 30 uM
de proteína, 0,1 ml) se mezcló con TCEP (5 mM en Hepes 50 mM, pH
4,5, 0,0072 ml) y se incubó a temperatura ambiente (22ºC) durante
1,5 h. Se mezclaron 0,05 ml de esta disolución con 0,005 ml de
etanolamina 0,5 M y 0,003 ml de MSWP-1 7 mM (véase
el ejemplo 2); la disolución se incubó durante 4 h más a temperatura
ambiente. Un análisis de SDS-PAGE mostró un banda
principal en la preparación que tenía un peso molecular aparente de
25.000, claramente desplazado del peso molecular del origen de
23.000.
El plásmido pBC04-31 se
construyó utilizando el plásmido pBC04-29 (descrito
en el ejemplo 19) y una pareja de oligonucleótidos sintéticos (SEQ
ID NO:25 y SEQ ID NO:26). El pBC04-29 se digirió con
las enzimas de restricción HindIII y ApaI, y el fragmento mayor
(2170 pb) se aisló. Los dos oligonucleótidos se reasociaron mediante
calentamiento hasta >90ºC y enfriando lentamente hasta la
temperatura ambiente y se acoplaron con el fragmento de ADN. El ADN
acoplado se transformó en E. coli XLI-Blue
competente. Las colonias se analizaron para los plásmidos en los
que se hayan insertado los oligonucleótidos buscando la presencia de
un nuevo sitio AvaI en la posición 2733. Tras la digestión con
AvaI, el pBC04-31 produjo fragmentos de 2311 y 495
pb. El ADN de los clones positivos se utilizó para transformar las
cepas de expresión. Los oligonucleótidos insertados añadieron la
secuencia peptídica DGPSEILRGDFSSC al extremo
C-terminal de SCR1-3 y también
repararon el error de desplazamiento de marco observado en
pBC04-29.
La expresión, el aislamiento y la purificación
de [SCR1-3]DGPSEILRGDFSSC se realiza
utilizando pBC04-31 mediante procedimientos
descritos de modo general en el ejemplo 6.
La proteína
[SCR1-3]DGPSEILRGDFSSC, preparada de una
manera similar a la descrita en el ejemplo 21, se hace reaccionar
con MSWP-1 como se describe en el ejemplo 8 para
producir el compuesto del título.
El plásmido pBC04-34 se
construyó utilizando el plásmido pBC04-29 (descrito
en el ejemplo 19) y una pareja de oligonucleótidos sintéticos (SEQ
ID NO:34 y SEQ ID NO:35). El pBC04-29 se digirió con
las enzimas de restricción HindIII y ApaI, y el fragmento mayor
(2170 pb) se aisló. Los dos oligonucleótidos se reasociaron mediante
calentamiento hasta >90ºC y enfriando lentamente hasta la
temperatura ambiente y se acoplaron con el fragmento de ADN. El ADN
acoplado se transformó en E. coli XLI-Blue
competente. Las colonias se analizaron para los plásmidos en los
que se hayan insertado los oligonucleótidos buscando un aumento en
el tamaño del fragmento NdeI/HindIII en 59 pares de bases. La
presencia del codón de cisteína se determinó mediante la presencia
de un sitio DdeI en la posición 2781. El pBC04-34
digerido con DdeI produjo unas bandas de diagnóstico de 481 y 109
pb. El ADN de los clones positivos se utilizó para transformar las
cepas de expresión (véase la siguiente sección). Los
oligonucleótidos insertados añadieron la secuencia peptídica
AAPSVIGFRILLLKVAGC al extremo C-terminal de
SCR1-3 y también repararon el error de
desplazamiento de marco observado en pBC04-29.
La expresión, el aislamiento y la purificación
de [SCR1-3]AAPSVIGFRILLLKVAGC se realiza
utilizando pBC04-34 mediante procedimientos
descritos de modo general en el ejemplo 6.
La proteína
[SCR1-3]AAPSVIGFRILLLKVAGC, preparada de una
manera similar a la descrita en el ejemplo 23, se hace reaccionar
con MSWP-1 como se describe en el ejemplo 8.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad funcional de los inhibidores del
complemento se evaluó midiendo la inhibición de la lisis mediada
por el complemento de eritrocitos de oveja sensibilizados con
anticuerpos de conejo (Diamedix Corporation, Miami, EEUU). El
ensayo se diseña para que sea específico para la vía clásica de la
activación del complemento. Suero humano diluido 1:500 ó 1:400
(concentración final en la mezcla de ensayo) en Hepes 0,1 M/NaCl
0,15 M/gelatina al 0,1%, pH 7,4, se utilizó como fuente del
complemento. El suero se preparó a partir de un grupo de voluntarios
fundamentalmente como se describe en Dacie y Lewis, 1975.
Brevemente, se calentó sangre hasta 37ºC durante 5 minutos, se
retiró el coágulo y el suero remanente se aclaró mediante
centrifugación. La fracción del suero se dividió en pequeñas partes
alícuotas y se conservó a -196ºC o -80ºC. Las partes alícuotas se
descongelaron según fue necesario y se diluyeron en tampón Hepes
inmediatamente antes del uso.
La inhibición de la lisis mediada por el
complemento de eritrocitos de oveja sensibilizados se midió
utilizando un ensayo hemolítico convencional utilizando un formato
de placa de microvaloración con fondo en forma de V como se indica
a continuación.
Se mezclaron 50 \mul de un intervalo de
concentraciones de inhibidor diluido en tampón Hepes con 50 \mul
del suero diluido y 100 \mul de los eritrocitos de oveja
sensibilizados y después se incubó durante 1 hora a 37ºC. Las
muestras se centrifugaron a 1600 rpm a temperatura ambiente durante
3 minutos antes de trasladar 150 \mul del sobrenadante a una
placa de microvaloración de fondo plano y determinar la absorción a
405 ó 410 nm. La lisis máxima (Amax) se determinó incubando suero
con eritrocitos en ausencia de cualquier inhibidor. La lisis de
fondo (Ao) se determinó incubando eritrocitos en ausencia de
cualquier suero o inhibidor. La inhibición se expresó como una
fracción de la lisis celular total, de forma que IH50 representa la
concentración de inhibidor requerida para producir 50% de
inhibición de la lisis.
% inhibición = 1 - [(A - Ao)/(Amax – Ao)].
\vskip1.000000\baselineskip
Los anteriores datos demuestran que:
1. Las actividades inhibidoras del complemento
de la proteína "base" (SCR1-3 del receptor 1
del complemento humano del documento WO 94/00571) y sus derivados
con otra cisteína C-terminal
(SCR1-3/Cys, ejemplo 6) o con una única secuencia
"interruptor" catiónica (SCR1-3/interruptor,
ejemplo 7) son similares.
2. Sin embargo, la incorporación de dos
elementos de unión a membranas (interruptor electrostático y
miristoílo) mediante la adición de MSWP-1, 2 ó 3
(que contienen ambos elementos) a SCR1-3/Cys, o de
tres elementos de unión a membranas mediante la adición de
MSWP-1 al constructo de
SCR1-3/interruptor produce productos que son
significativamente más potentes (aproximadamente
20-200 x) que la base o las proteínas con un único
elemento de unión a membranas. El uso de TCTP-1 que
se dirige a los elementos de membrana que se encuentran en células
CD3-positivas y no a membranas de eritrocitos
produce un conjugado de potencia similar a los derivados de
SCR1-3 sin las características de membranas o con
una única característica de membrana. Por tanto, el aumento en la
potencia en el ensayo que depende de un acontecimiento en la
membrana de eritrocitos (citolisis mediante el complejo del
complemento de ataque a membranas) puede atribuirse a la
administración dirigida a membranas de las proteínas inhibidoras de
la citolisis, mediante la combinación de dos elementos de unión a
membranas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la actividad de
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
en el ensayo hemolítico de la vía clásica utilizando el suero de
cerdo, cobaya, rata o tití. La metodología fue fundamentalmente como
se describe en (I) con pequeñas modificaciones, por ejemplo
pequeños cambios en la concentración del suero utilizada. El
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
se preparó fundamentalmente como se describe en el ejemplo 8c. Los
valores de IH50 para los diferentes sueros fueron: cerdo, 0,2 nM;
cobaya, 0,3 nM; rata, 0,4 nM; tití, 0,2 nM. Estos resultados
demuestran que el
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
es capaz de inhibir la inhibición del complemento por la vía
clásica en el suero de una diversidad de especies animales.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad funcional de los inhibidores del
complemento se evaluó midiendo la inhibición de la lisis mediada
por el complemento de eritrocitos de cobaya fundamentalmente como se
describe en Scesney, S.M. et al. (1996), J. Immunol.,
26:1729-1735. El ensayo se diseña para que sea
específico para la vía alternativa de la activación del
complemento. Se usó suero humano preparado a partir de un grupo de
voluntarios fundamentalmente como se describe en Dacie y Lewis,
1975, como fuente del complemento. Brevemente, se calentó sangre
hasta 37ºC durante 5 minutos, se retiró el coágulo y el suero
remanente se aclaró mediante centrifugación. La fracción del suero
se dividió en pequeñas partes alícuotas y se conservó a -196ºC o
-80ºC. Las partes alícuotas se descongelaron según fue necesario y
se diluyeron en tampón Hepes 0,1 M/NaCl 0,15 M/gelatina al 0,1%/EGTA
8 mM/MgCl_{2} 5 mM, pH 7,4 (tampón A), inmediatamente antes del
uso. Se prepararon eritrocitos de cobaya a partir de sangre
completa de cobaya recogida en tubos revestidos con EDTA como sigue.
La sangre se centrifugó a 1600 rpm durante 5 minutos y el sedimento
de eritrocitos se lavó 3 veces con Hepes 0,1 M/NaCl 0,15 M/gelatina
al 0,1%, pH 7,4, hasta que el sobrenadante del centrifugado fue
fundamentalmente incoloro. Por último, los eritrocitos se
resuspendieron hasta el volumen original de sangre utilizada y se
conservaron a 4ºC. Se utilizaron en un plazo de 2 semanas.
Se mezclaron 50 \mul de un intervalo de
concentraciones de inhibidor diluido en tampón A en una placa de
microvaloración con fondo en forma de V primero con 100 \mul del
suero que se había diluido 1:3 y después con 50 \mul de los
eritrocitos de cobaya (diluidos 1:49 en tampón A) y se incubaron
durante 1 hora a 37ºC. La placa se centrifugó a 1600 rpm durante 3
minutos antes de trasladar 150 \mul de cada sobrenadante a una
placa de microvaloración de fondo plano y determinar la absorción a
405 nm, que refleja la cantidad de lisis en cada disolución de
ensayo. La lisis máxima (Amax) se determinó incubando suero con
eritrocitos en ausencia de cualquier inhibidor. La lisis de fondo
(Ao) se determinó incubando eritrocitos en ausencia de cualquier
suero o inhibidor. La dilución final del suero utilizado en el
ensayo presentaba absorción a 405 nm pero se consideró que el nivel
de absorbancia (aproximadamente 10% de Amax) tenía un efecto
insignificante sobre los resultados globales del ensayo y no se
tomó en cuenta en los cálculos. La inhibición se expresó como una
fracción de la lisis celular total, de forma que IH50 representa la
concentración de inhibidor requerida para producir 50% de
inhibición de la lisis.
% inhibición = 1 - [(A - Ao)/(Amax – Ao)].
Dos partes alícuotas (una liofilizada y
resolubilizada en un tampón neutro, la otra no liofilizada) de un
único lote de
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
preparado de una manera similar a la descrita en el ejemplo
8(c) se ensayaron en el ensayo hemolítico. Los valores de
IH50 para los compuestos fueron:
| [SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1] (no liofilizado) | 310 nM |
| [SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1] (liofilizado) | 480 nM |
Los resultados demuestran que el
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
muestra actividad contra la vía alternativa del sistema del
complemento, y que la liofilización y la posterior resolubilización
de la proteína no afecta (dentro del error experimental) a la
actividad biológica de la proteína.
(i) Se ensayaron moléculas relacionadas con SK
del ejemplo 16 utilizando un ensayo de activador del plasminógeno.
Una disolución de Lys_{77}-plasminógeno humano
purificado (1 uM en tampón PST que contenía glicerol al 25% v/v
[tampón PSTG], 0,5 ml) se incubó con SK tiolada (concentración final
0,1 nM) durante 1 h a 25ºC. Una parte alícuota de esta mezcla (10
ul) se incubó con 1,0 mM del sustrato de plasmina
S-2251
(H-D-Val-Ley-Lys-p-nitroanilida,
KabiVitrum, Estocolmo, Suecia) en HCl.trietanolamina 0,1 M, pH 8,0
(0,5 ml) a 25ºC. La liberación de p-nitroanilina se
controló continuamente a 405 nm. Bajo estas condiciones, una unidad
de sustrato (SU) de actividad plasmina se define como la cantidad
de enzima que produce un aumento en la densidad óptica a 405 nm de
0,001 min^{-1}. Bajo estas condiciones, la SK tiolada (1 nM)
generó plasmina a 4225 SU/ml casi lineal.
El conjugado de
SK-MSWP-1 se diluyó 1:100 en tampón
PSTG y se ensayaron partes alícuotas de 5-50 ul en
el ensayo de activación de plasminógeno. Se descubrió que la
preparación madre contenía aproximadamente 2,9 uM de SK
funcional.
(ii) Se estimó la actividad potencial de las
preparaciones de acil-enzima del ejemplo 17 mediante
una dilución en 25-50 veces en tampón PST y una
incubación durante 2 h a 37ºC, seguido de un ensayo utilizando
S-2288 2 mM
(2HCl.H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida)
bajo las mismas condiciones utilizadas en (i) anterior. Bajo estas
condiciones, la actividad potencial de la preparación de
PDAEB->tPA reducida fue de 2760 SU/ml, y la del conjugado de
MSWP-1/PDAEB->tPA fue de 535 SU/ml.
Se añadieron eritrocitos humanos reunidos (Ortho
A2, Raritan, Nueva Jersey, al 3% v/v, 50 ul) a pocillos de placas
de microvaloración y se añadió anticuerpo de conejo
anti(membranas de eritrocitos humanos) no modificado [RAEM]
o conjugado de RAEM-MSWP-1 del
ejemplo 15 a concentraciones expresadas en relación con la
disolución madre de RAEM sin diluir. Las células se agitaron a
aproximadamente 100 rpm durante 40 min a 25ºC. Se retiraron 5 ul de
cada pocillo y se estudiaron mediante microscopía óptica con un
aumento x 20. Se empleó la siguiente escala de puntuación
visual:
-: No hay grupos, las células se mueven
libremente entre sí.
+: Pequeños grupos (<10 células)
++: Grupos mayores (más de 100 células)
+++: Agregados muy grandes
La preparación de anticuerpos modificada para
que contenga una unidad de unión a membranas fue más eficaz para
inducir la agregación de células porque la unión a la membrana
celular a través de MSWP-1 permite una mayor
concentración eficaz de anticuerpo de unión sobre la superficie de
la membrana.
Se mezcló
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
(2 mg/ml en PBS, 0,25 ml) con 0,5 mCi de 125-yodo
(Amersham) en presencia de 9 nmoles de yoduro de potasio, siguiendo
el procedimiento y utilizando los reactivos de Iodogen (Pierce and
Warriner (Reino Unido), Ltd.). Se dejó que el marcaje se produjese
durante 20 min a temperatura ambiente, la reacción se extinguió con
0,1 ml de yoduro de potasio 1 M , y la disolución se sometió a un
intercambio de tampón en PBS/albúmina al 0,1%. Se utilizó sangre
citrada recogida de un voluntario sano como fuente de eritrocitos
humanos. Se mezcló sangre (0,2 ml) con 10 microlitros de
125-yodo-[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
diluido de forma apropiada (concentración final 700 pM) y se incubó
durante 30 min a 37ºC. Los eritrocitos entonces se aislaron
mediante tres lavados repetidos en PBS/etapas de centrifugación y
las muestras se contaron en un contador gamma Wallac 1470 Wizard.
Los resultados fueron los siguientes:
Utilizando unos valores de 5 x 10^{9}
eritrocitos por ml de sangre y una radiactividad específica de 2,7
x 10^{7} cpm/nmol para el
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
se calculó que aproximadamente 600 moléculas de
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
se unieron por célula (el valor para el "Sedimento
final").
El [SCR1-3]-Cys
(preparado de una manera similar a la descrita en el ejemplo 18) (45
uM, 1,0 mg/ml en fosfato de sodio 0,1 M, sulfato de amonio
aproximadamente 0,2 M, pH 7,0) se redujo parcialmente mediante una
incubación a 25ºC durante 18 h mediante la adición de un exceso en
4 veces molar de
tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP,
Pierce & Warriner (Reino Unido), Ltd.). La disolución se sometió
a un intercambio de tampón en Hepes 50 mM, pH 7,0; tras el
intercambio de tampón, la concentración de proteína era de 22 uM. El
[SCR1-3]-Cys parcialmente reducido
se incubó con un exceso en 4 veces molar del éster succinimidílico
del ácido
6-(fluorescein-5-carboxamido)hexanoico
(Molecular Probes Inc., EEUU) y se incubó durante 1 h a 4ºC. El
exceso de marcador fluorescente se retiró mediante intercambio de
tampón de la disolución de proteína en Hepes 50 mM, pH 7,0. Se
sintetizó el
fluoresceína-[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
añadiendo MSWP-1 (ejemplo 2) para producir un
exceso en 5 veces molar frente a la proteína marcada con
fluoresceína y se incubó durante 4 h a 25ºC. La disolución se
sometió a un intercambio de tampón en PBS y esta disolución se
utilizó para los estudios de microscopía.
El [SCR1-3], 10 mg/ml en ácido
fórmico 50 mM, se mezcló con una proporción 1:10 con NaHCO_{3} 50
mM, pH 8,5; el pH de la disolución se ajustó con NaOH hasta pH 9,5.
La fluoresceína se extrajo de Celite-isotiocianato
de fluoresceína (Celite:fluoresceína 1:10, Sigma) mediante DMSO en
una proporción de 1:4 (p/v). La disolución de
fluoresceína-DMSO se añadió a la disolución de
proteína en una proporción de 1:14 y se incubó durante 1 h a
temperatura ambiente. El exceso de marcador se retiró mediante una
filtración en gel en PBS que contenía Tween-80 al
0,01%, y esta disolución se utilizó para los estudios de
microscopía.
Se recogió sangre citrada de un voluntario sano
y se aislaron los eritrocitos, se lavaron en PBS y se diluyeron 250
veces comparados con el volumen de sangre original. Se incubaron
0,05 ml de eritrocitos con
fluoresceína-[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
2 uM o fluoresceína-[SCR1-3] 2 uM y se incubaron
durante 30 min a 37ºC. Una muestra de 8 microlitros de cada
incubación se montó sobre un portaobjetos y se examinó sobre un
microscopio confocal invertido (Biorad). Las células incubadas con
fluoresceína-[SCR1-3] no mostraron tinción
específica, mientras que en las incubadas con
fluoresceína-[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
apareció una tinción difusa sobre la superficie celular y también
fueron visibles manchas de tinción intensa sobre la membrana
celular. No se observó marcaje de manera intracelular.
Se sedimentaron eritrocitos humanos
tripsinizados y tratados con glutaraldehído (1,0 ml de una
suspensión al 4%) mediante una centrifugación a baja velocidad y se
resuspendieron en un volumen total de 0,5 ml de PST que no contenía
adiciones o que contenía aproximadamente 270 SU de PDEAB->tPA
reducido o conjugado de MSWP-1/PDEAB->tPA del
ejemplo 17. Las mezclas se incubaron mediante agitación suave
durante 5 min a 23ºC y después las células se sedimentaron mediante
una centrifugación, seguido de dos lavados con 1,0 ml de tampón PST.
Por último, las células se suspendieron en 0,5 ml de PST y se
incubaron a 37ºC. Se retiraron muestras de sobrenadante (100 ul)
después de sedimentar. Un ensayo que emplea S-2288
(como anteriormente) mostró que después de 2 h aproximadamente 7%
de la actividad t-PA aplicada estaba presente en el
sobrenadante de las células expuestas a
MSWP-1/PDEAB->tPA, mientras que sólo
aproximadamente 2,8% estaba presente en el sobrenadante de las
células expuestas sólo a PDEAB->tPA reducido. No se detectó
activida t-PA amidolítica en los controles.
Este experimento sugiere que la union reversible
del sitio activo de t-PA a MSWP-1
aumenta la tendencia de esta enzima a unirse a eritrocitos.
Una preparación estabilizada de eritrocitos
humanos (tripsinizada, tratada con glutaraldehído, Sigma,
Gillingham, Reino Unido, al 4% v/v, 0,4 ml) se sedimentó mediante
una centrifugación (aproximadamente 2000 g/2 min) y se resuspendió
en 0,4 ml de tampón PST con SK tiolada 0,1 uM o
SK-MSWP-1 0,1 uM del ejemplo 16.
Las suspensiones se incubaron durante 30 min a
37ºC y después se lavaron mediante dos ciclos de centrifugación y
resuspensión en tampón PST. Por último, se resuspendieron en tampón
PSTG (0,4 ml) que contenía plasminógeno 1 uM y se incubaron y se
ensayaron para plasmina como se describió anteriormente.
La SK-tiolada control generó
plasmina a una velocidad de 522 SU/ml, mientras que el conjugado de
SK-MSWP-1 produjo 6184 SU/ml. Esta
última actividad se corresponde con aproximadamente 2100 moléculas
de SK tioladas/célula.
Se centrifugaron 4 x 2,0 ml de eritrocitos
humanos tripsinizados y tratados con glutaraldehído (Sigma, R0127)
durante 2 min a aproximadamente 3000 rpm. Los sobrenadantes se
rechazaron y las células se resuspendieron en tampón
fosfato/disolución salina/Tween (al 0,01%) (PST) (1 ml por tubo) y
se añadió el
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
del ejemplo 8 hasta una concentración final de 20 ug/ml a tres de
los tubos. Las mezclas entonces se incubaron a 37ºC durante 30 min,
después se lavaron cinco veces mediante centrifugación y lavado en
PST repetidos. Por último, las células se suspendieron en 1 ml de
PST y se mantuvieron a 4ºC.
La capacidad de estas células para inhibir la
lisis mediada por el complemento de eritrocitos de oveja se midió
utilizando el ensayo de inhibición del complemento de la vía clásica
convencional descrito en (I) anteriormente. Los eritrocitos humanos
se añadieron al ensayo a cuatro diluciones diferentes, seguido de
suero humano y después eritrocitos de oveja y una incubación a 37ºC
como es habitual. Los datos de porcentaje de inhibición se muestran
a continuación.
Por tanto, el porcentaje de inhibición para las
células tratadas con
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
a la dilución máxima fue significativamente mayor que las células
sin tratar a la dilución 1/4. Por tanto, las células tratadas con
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
contenían al menos 600 veces más actividad inhibidora del
complemento que las células sin tratar, incluso aunque las células
se hubiesen lavado a fondo para eliminar cualquier
[SCR1-3]-Cys-S-S-[MSWP-1]
no unido.
( <- junto a una secuencia peptídica en { }
significa que la secuencia se extiende desde el C- al
N-terminal)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En la SEQ ID NO: 10, las secuencias
peptídicas se indican entre paréntesis utilizando el código de
aminoácidos de una
letra.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\newpage
SEQ ID NO: 22
\vskip1.000000\baselineskip
Forma monocatenaria de la molécula
de t-PA intacta de 527 restos aminoácidos. El resto
478 (serina) se ha modificado como se muestra a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 23
\newpage
SEQ ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 26
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 27
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 28
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 29
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 30
\newpage
SEQ ID NO: 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 32
\vskip1.000000\baselineskip
lineal, dos cadenas polipeptídicas unidas a
través de disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 33
\newpage
SEQ ID NO: 34
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 35
Claims (19)
1. Un derivado soluble de un polipéptido
soluble, comprendiendo dicho derivado dos o más elementos de unión
a membranas heterólogos con baja afinidad por membranas, asociados
covalentemente con el polipéptido, cuyos elementos no todos
idénticos y son capaces de interaccionar, independientemente y con
adición termodinámica, con componentes de membranas celulares o
artificiales expuestos a fluidos extracelulares, en el que:
(i) el polipéptido soluble es un inhibidor del
complemento soluble;
(ii) al menos un elemento de unión a membranas
es hidrofílico y comprende aminoácidos básicos;
(iii) al menos un elemento de unión a membranas
es un derivado de ácido graso que comprende grupos acilo alifáticos
con aproximadamente 8 a 18 unidades de metileno.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un derivado según la reivindicación 1, en el
que cada elemento de unión a membranas con baja afinidad por
membranas tiene una constante de disociación de 1
\muM-1 mM.
3. Un derivado según la reivindicación 1 ó 2, en
el que cada elemento de unión a membranas tiene un tamaño <5
kDa.
4. Un derivado según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que incorpora suficientes elementos
con baja afinidad por componentes de la membrana para que produzca
como resultado una afinidad por membranas específicas con una
constante de disociación de 0,01-10 nM.
5. Un derivado según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que tiene una solubilidad en un medio
de formulación farmacéutica >100 \mug/ml.
6. Un derivado según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende de dos a ocho elementos
de unión a membranas.
7. Un derivado según la reivindicación 1, en el
que el elemento de unión a membranas es una secuencia de
aminoácidos básicos que incluye (Lys)n, en el que n es de 3 a
10.
8. Un derivado según la reivindicación 7, en el
que la secuencia de aminoácidos se selecciona de:
(i) DGPKKKKKKSPSKSSG
(ii) GSSKSPSKKKKKKPGD
(iii) SPSNETPKKKKKRFSFKKSG
(iv) DGPKKKKKKSPSKSSK
(v) SKDGKKKKKKSKTK
(el N-terminal
aparece a la
izquierda).
9. Un derivado soluble según la reivindicación
1, en el que el polipéptido soluble es un fragmento polipeptídico
de CR1 soluble.
10. Un derivado soluble según la reivindicación
9, en el que el polipéptido de CR1 soluble consiste en los restos
1-196 de CR1 y con una metionina
N-terminal, y el derivado comprende un grupo
miristoílo y una o más secuencias polipeptídicas seleccionadas
de:
DGPKKKKKKSPSKSSGC
GSSKSPSKKKKKKPGDC
CDGPKKKKKKSPSKSSK
SKDGKKKKKKSKTKC
CSAAPSSGFRILLLKV
AAPSVIGPRILLLKVAGC
y
DGPSEILRGDFSSC
(el N-terminal
aparece a la
izquierda).
11. Un derivado soluble según la reivindicación
9 ó 10, seleccionado de SEQ ID NO:8, 31, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 24
y 36.
12. Un derivado soluble de un polipéptido
soluble según la reivindicación 1, en el que el polipéptido soluble
incluye una cisteína C-terminal.
13. El polipéptido de SEQ ID NO:7, 23, 33, 6 ó
14.
14. Un derivado soluble de un polipéptido
soluble según la reivindicación 1, en el que al menos un elemento
de unión a membranas con baja afinidad por membranas es un derivado
de acilo graso C_{10-20} de un amino(alcano
C_{2-6})tiol (opcionalmente
C-sustituido).
15. Un derivado según la reivindicación 14, que
comprende un elemento de unión a membranas seleccionado de
N-(2-miristoil)aminoetanotiol y
N-miristoil-L-cisteína.
16. Una composición farmacéutica que comprende
un derivado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, 14
y 15 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Un derivado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, 14 y 15, para su uso como medicamento.
18. El uso de un derivado según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12, 14 y 15, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno
asociado con la inflamación o con la activación inapropiada del
complemento.
19. Una composición farmacéutica para tratar una
enfermedad o un trastorno asociado con la inflamación o con la
activación inapropiada del complemento, que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un derivado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, 14 y 15, y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
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