ES2321289T3

ES2321289T3 - Metodo de diagnostico serologico.

Info

Publication number: ES2321289T3
Application number: ES03762723T
Authority: ES
Inventors: Didier Raoult
Original assignee: Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Current assignee: Aix Marseille Universite
Priority date: 2002-07-03
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2023-07-02
Also published as: WO2004005932A3; DE60325857D1; EP1518124B1; AU2003264681A1; US20050233394A1; CA2491407A1; EP1518124A2; FR2841988A1; AU2003264681A8; FR2841988B1; WO2004005932A2; ATE421089T1

Abstract

Método de diagnóstico serológico in vitro, en el que se detecta la presencia de anticuerpos específicos de un agente microbiano infeccioso en una muestra a ensayar, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas en las que: a) se deposita sobre un soporte sólido un primer antígeno (Ag 1) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A, y por lo menos un segundo antígeno (Ag 2) que es característico de un agente infeccioso microbiano (Ag2), y b) se hace reaccionar el primer (Ag 1) y el(los) segundo(s) (Ag 2) antígenos con una muestra a ensayar, y c) se detecta si una inmunoglobulina humana (Ac1) reacciona con el primer antígeno (Ag1) haciendo reaccionar el producto de la reacción (Ag1-Ac1) con una sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina humana y que no reacciona con el primer antígeno (Ag1), y d) se controla que dicha muestra a ensayar contiene un suero humano detectando si unas inmunoglobulinas humanas reaccionan con el primer antígeno.

Description

Método de diagnóstico serológico.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de las enfermedades infecciosas humanas. Más particularmente, se refiere al campo del diagnóstico indirecto por serología. Uno de los métodos de laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas humanas es la serología microbiana. Se trata de un método de diagnóstico indirecto que se basa en la búsqueda en el suero de un paciente de anticuerpos específicos del agente microbiano infeccioso, a saber, una bacteria, un virus, un parásito o un hongo responsable de una patología (denominada a continuación "microbio"). Este método de diagnóstico es primordial para el diagnóstico de las infecciones con microorganismo de cultivo y de identificación difícil, en particular los virus, las bacterias intracelulares estrictas y las bacterias intracelulares facultativas del género Rickettsie, Coxiella, Bartonella, Tropheryma, Ehrlichia, Chlamydia, Mycoplasma, Treponema, Boffelia, y Leptospira, por ejemplo.

Técnicamente, la serología microbiana consiste en detectar en el suero del paciente una reacción antígeno - anticuerpo en la que el antígeno está representado por todo o una fracción del agente microbiano infeccioso a detectar, y el anticuerpo está representado por las inmunoglobulinas humanas específicas de dicho agente microbiano infeccioso presentes en el suero del paciente. Se puede cuantificar ensayando sucesivamente una serie de diluciones crecientes de razón 2 o de razón 10 del suero del paciente.

Habitualmente, un método de diagnóstico serológico comprende más particularmente las siguientes etapas:

1.: Depositar el antígeno sobre un soporte sólido tal como unas microperlas de látex, especialmente en la técnica de detección por aglutinación en la que se recubren unas microperlas de látex con el antígeno microbiano a ensayar y se aglutinan entre sí por el suero del paciente que presenta unos anticuerpos específicos, siendo esta aglutinación visible a simple vista; o sobre un portaobjeto de vidrio o microplaca de filtración para las técnicas de detección por inmunofluorescencia o técnica enzimática, especialmente de tipo ELISA "Enzyme Linked Immunosorbent Assay", o sobre una hoja de nitrocelulosa o de nylon para las técnicas de detección de tipo transferencia western, en la que los antígenos microbianos separados por electroforesis y después transferidos sobre un soporte sólido (hoja de nitrocelulosa o de nylon) reaccionan separadamente entre sí con el suero del paciente. Estas técnicas de detección son bien conocidas por el experto en la técnica,

2.: Descomplementar el suero por calentamiento hasta 56ºC durante 30 minutos,

3.: Poner en contacto el antígeno que corresponde al agente microbiano infeccioso con el suero del paciente, y después incubar bajo unas condiciones de tiempo, de temperatura, de higrometría, de agitación mecánica y de fuerza iónica del medio que permitan la reacción antígeno-anticuerpo,

4.: Lavar con cuidado y de forma general para eliminar el suero del paciente en exceso no-fijado al soporte sólido,

5.: Aplicar un anticuerpo secundario de detección que es una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana, especialmente una inmunoglobulina de cabra conjugada con una sustancia de fluorocromo, generalmente iso-tio-sulfato de fluoresceína, o una enzima, generalmente una peroxidada, e incubar bajo unas condiciones de tiempo, de temperatura, de higrometría, de agitación mecánica y de fuerza iónica del medio que permitan la reacción antígeno-anticuerpo,

6.: Lavar con cuidado y de forma general para eliminar la inmunoglobulina conjugada, no fijada, en exceso,

7.: Detectar una reacción leyendo con la ayuda de un equipo tal como un microscopio de fluorescencia para la técnica de inmunofluorescencia indirecta, o un lector de densidad óptica para la técnica de detección enzimática de tipo ELISA. La lectura de la reacción de transferencia western se realiza a simple vista, o después de cargar digitalmente el gel, y análisis por un programa de densitometría.

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Cada una de esas etapas puede ser una fuente de errores de manipulación que dan como resultado una ausencia de reacción antígeno-anticuerpo y, por lo tanto, una reacción falsamente negativa. Un error de manipulación conduce por lo tanto de forma eventual a interpretar como negativa una reacción que es en realidad positiva (falso negativo). Un error frecuente en la realización de los ensayos serológicos, especialmente para los ensayos serológicos en batería realizados sobre un gran número de sueros a ensayar, se debe a defectos en la introducción de los sueros a ensayar, especialmente por pipeteado. Estos errores intervienen especialmente en las etapas que implican el desplazamiento de la muestra a ensayar, especialmente por pipeteado, puesto que algunos recipientes que contienen especialmente el soporte sólido sobre el cual se deposita el antígeno a detectar, pueden no ser llenados inadvertidamente con el suero humano a ensayar. Se sabe que el pipeteado del suero supone un riesgo de error de 1%, relacionado con un problema totalmente técnico por ausencia de pipeteado por la pipeta, o un error humano por ausencia de pipeteado
inadvertida.

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Estos errores imponen la introducción de controles en la realización de la reacción. La incorporación sistemática durante cada nueva manipulación de un suero de control negativo, es decir, que no contiene ningún anticuerpo específico del antígeno a ensayar, permite interpretar las reacciones positivas. Asimismo, la incorporación de un suero de control positivo, es decir, que contiene el anticuerpo específico del antígeno a ensayar en un título conocido, permite verificar la calidad del antígeno y de la inmunoglobulina conjugada.

Si no existe ningún control de que el suero a ensayar ha sido efectivamente introducido en el ensayo serológico, y si por inadvertencia el suero a ensayar no se introduce en el ensayo serológico, la reacción antígeno bacteriano-anticuerpo sérico probablemente no existirá, y el ensayo se interpretará, falsamente, como negativo (falso negativo).

El documento DE 1000322 describe la realización de anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas, de origen animal, a título de control de la presencia de suero en una muestra a ensayar por trasferencia western. El artículo Europeen Journal of Clinical investigation, 1999 (29, 697-699) de JA GARROTE et al., describe un inmunoensayo de detección visual que implica el uso de una sustancia de detección constituida de un conjugado de proteína A-oro coloidal.

La proteína A es un polipéptido de 42 kDa, y es un constituyente de la pared de las cepas de Staphylococcus aureus, unas proteínas similares pero diferentes se caracterizan en la superficie de las bacterias del género Streptococcus [Langone J. J. Adv. lmmunol. 1982, 32: 157-251].

Se sabe que una fracción de la pared de Staphylococcus aureus se une a las inmunoglobulinas humanas, y que la proteína A es el constituyente de la pared de Staphylococcus aureus que se une al suero humano [Forsgren A. y J. Sjöquist. J. lmmunol. 1966, 97: 822-827], y más particularmente en el extremo Fc de las inmunoglobulinas humanas. La proteína A dispone de cuatro sitios de unión con el extremo Fc de las inmunoglobulinas, incluyendo dos sitios de fijación que son móviles durante una misma reacción antígeno-anticuerpo. Se ha realizado el análisis cristalino de esta reacción [Deisenhofer J. Biochemistry 1981, 20: 2361-2370]. Se ha estudiado la afinidad de la proteína A por los diferentes sueros animales [Kronvall G. Seal US, Finstad J., Williams RC Jr. J. lmmunol. 1970104:140-147; Richman DD, Cleueland PH, Oxman MN, Johnson Km. J. lmmunol. 1982 128: 2300-2305], y está proteína A presenta una afinidad por los sueros de origen animal, especialmente el caballo, los bóvidos, el cerdo, el conejo, la cobaya y el ratón; y a un grado menor el hámster, la rata y la oveja. Por el contrario, el suero de polluelo y de cabra no reacciona con la proteína A.

Ya se introdujo Staphylococcus aureus como antígeno detector en unos ensayos serológicos de anticuerpos específicos [Ryding U, Esperson F, Sôderquist B, Christensson B. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2002, 42: 9-15]. Los trabajos publicados han mostrado la ausencia de especificidad de estos ensayos.

El objeto de la presente invención es la adición de un control que detecta la inclusión del suero a ensayar durante unas reacciones de serologías bacterianas.

Se ha descubierto de manera fortuita durante un trabajo serológico en unos pacientes que presentan una endocarditis, que los sueros de esos pacientes reaccionaban todos frente a Staphylococcus aureus, y se ha demostrado, según la presente invención, que se trataba de una propiedad general, a saber, que la reacción de un suero humano con un antígeno que contiene la proteína A no estaba alterada en el caso de suero humano de patología infecciosa, incluyendo las patologías infecciosas que modifican mayoritariamente el porcentaje y la naturaleza de las inmunoglobulinas segregadas tales como las enfermedades víricas que implican los virus V.I.H., C.M.V. o también Epstein-Barr. En efecto, si se conocía que la proteína A se unía con cualquier suero humano normal, no se conocía que esta propiedad se conservaba para unos sueros humanos extraídos en unos pacientes que presentan diferentes patologías infecciosas. No se conocía tampoco que el Staphylococcus aureus podía desempeñar ese papel de "portador" de proteína A durante unas reacciones de serología bacteriana.

La presente invención consiste por lo tanto esencialmente en añadir una bacteria de Staphylococcus aureus a título de antígeno para controlar que la muestra a ensayar contiene ciertamente un suero de origen humano, y para detectar una reacción antígeno-inmunoglobulina humana con una sustancia específica.

En efecto, se ha descubierto que en la medida en la que la proteína A reacciona con unas inmunoglobulinas humanas de manera no específica, incluso en un caso de patología infecciosa importante, es posible usar esta proteína A como control positivo de la introducción de un suero humano en la muestra a ensayar, puesto que por otro lado la proteína A no reacciona con ciertos anticuerpos.

Más precisamente, la presente invención proporciona un método de diagnóstico serológico in vitro en el que se detecta la presencia de anticuerpos específicos de un agente microbiano infeccioso en una muestra a ensayar, caracterizado porque se controla que dicha muestra a ensayar contiene un suero humano detectando si unas inmunoglobulinas humanas reaccionan con un antígeno que contiene una bacteria de Staphylococcus aureus.

Según la invención, se realizan las etapas en las que:

-: se hace reaccionar la muestra a ensayar con un primer antígeno (Ag_{1}) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que comprende la proteína A, y

-: se detecta la presencia de un producto de reacción antígeno-anticuerpo (Ag_{1}-Ac_{1}) en el que el anticuerpo (Ac_{1}) es una inmunoglobulina humana, haciendo reaccionar dicho producto de reacción con una sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina humana y que no reacciona con dicho primer antígeno.

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Mediante la expresión "detección de inmunoglobulina humana que reacciona con un antígeno que contiene la proteína A" se entiende que se puede determinar un nivel de dilución de la muestra a ensayar que contiene un suero humano, y más particularmente un nivel de dilución del suero humano a ensayar, nivel más allá del cual ya no se detecta más dicha inmunoglobulina humana que haya reaccionado con dicho antígeno que comprende la proteína A debido al método de detección llevado a cabo.

Según la invención, se realizan las etapas siguientes en las que:

a): se deposita sobre un soporte sólido el primer antígeno que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A (Ag_{1}) y uno o más segundos antígenos (Ag_{2}) que son característicos de un agente o respectivamente de varios agentes infecciosos microbianos, y

b): se hacen reaccionar los primeros (Ag_{1}) y los segundos (Ag_{2}) antígenos con una muestra de suero a ensayar, y

c): se detecta si una inmunoglobulina humana (Ac_{1}) reacciona con el primer antígeno (Ag_{1}) haciendo reaccionar el producto de la reacción (Ag_{1}-Ac_{1}) con un anticuerpo secundario de detección (Ac_{2}) que es una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A.

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En un modo de realización ventajoso, el primer antígeno es una bacteria entera de Staphylococcus aureus que comprende la proteína A. Se pueden usar más particularmente las bacterias de Staphylococcus aureus depositadas en las colecciones públicas tales como las bacterias depositadas en A.T.C.C. con el nº 29213 y en C.N.C.M del Instituto Pasteur (Francia) con el número 65.8T.

Por otro lado, más allá de las cepas tipo, se puede usar como antígeno Ag_{1} cualquier cepa bacteriana identificada como Staphylococcus aureus.

También ventajosamente, la presencia de un producto de la reacción se detecta con una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana que es una inmunoglobulina de origen animal, preferiblemente una inmunoglobulina de cabra o de polluelo.

Como soporte sólido, se puede usar cualquier dispositivo adaptado para la manipulación de suspensiones celulares y bacterianas, y especialmente unos tubos, unos portaobjetos de vidrio, unos tubos Bijoux o unas placas rígidas de microtitulación de polietileno, poliestireno, cloruro de polivinilo o nitrocelulosa, que comprenden unos micropocillos.

Como tipo de marcado de la inmunoglobulina anti-humana, se usa por lo tanto de forma ventajosa un marcado enzimático, radioactivo o fluorescente, siendo este último tipo de marcado preferido.

La expresión "marcado fluorescente" significa que el anticuerpo se ha hecho fluorescente por acoplamiento o complejación con un agente fluorescente apropiado tal como el iso(tio)cianato de fluoresceína.

La expresión "marcado radioactivo" significa que el anticuerpo lleva un isotopo radioactivo que permite cuantificarlo mediante recuento de su radioactividad asociada, pudiendo el isotopo ser portado bien sobre un elemento de la estructura del anticuerpo, por ejemplo los restos de tirosina constitutivos, o bien sobre un radical apropiado que le ha sido fijado.

La expresión "marcado enzimático" significa que el anticuerpo específico está acoplado o complejado con una enzima que, asociada con el uso de agentes reactivos apropiados, permite una medición cuantitativa de ese anticuerpo específico.

El sustrato y los agentes reactivos se eligen de manera que el producto final de la reacción o de la secuencia de reacciones provocada por la enzima y que usa estas sustancias sea:

-: una sustancia teñida o fluorescente que se difunde en el medio líquido que rodea la muestra ensayada y que es objeto de la medición final espectrofotométrica o fluorimétrica, respectivamente, o que es objeto de una evaluación visual; eventualmente con relación a una escala de colores calibrada,

-: o bien una sustancia teñida insoluble que se deposita sobre la muestra ensayada y que puede ser objeto de una medición fotométrica por reflexión, o de una evaluación visual, eventualmente con relación a una escala de colores calibrada.

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Cuando se usa una inmunoglobulina hecha fluorescente, la fluorescencia asociada con la muestra ensayada se lee directamente sobre un aparato apropiado.

Cuando se usa una sonda radioactiva, como por ejemplo el yodo 125, la radioactividad asociada con la muestra ensayada se recuenta en un contador gamma usando cualquier método adecuado y, por ejemplo, después de la solubilización de las células por una disolución alcalina (por ejemplo una disolución de sosa) y de la recuperación de la disolución que contiene la radioactividad con la ayuda de un tampón absorbente.

Cuando se usa una enzima sobre el anticuerpo específico, se obtiene la aparición de un producto teñido o fluorescente añadiendo una disolución que contiene el sustrato de la enzima y uno o más agentes reactivos auxiliares que permiten obtener finalmente como producto de reacción un producto teñido soluble en el medio, o un producto teñido insoluble, o bien un producto fluorescente soluble, tal como se ha explicado anteriormente. Después, la señal luminosa que procede de las muestras así tratadas se mide con la ayuda del equipo adaptado para cada caso: fotómetro de transmisión, o de reflexión o fluorímetro, respectivamente. Alternativamente, también se puede evaluar a simple vista la coloración obtenida, ayudándose eventualmente de una escala calibrada de disoluciones teñidas.

Usando como enzima la fosfatasa alcalina, el acoplamiento de esa enzima con el anticuerpo específico se efectúa según el método propuesto por Boehringer Mannheim-Biochemica. Los sustratos preferidos de esa enzima son el fosfato de paranitrofenilo para una lectura fluorométrica, o el fosfato de 5-bromo-4-cloro-umbeliferilo para una lectura fluorométrica, o el fosfato de 5-bromo-4-cloro-6-indolilo para obtener un producto de reacción teñido insoluble. Se puede asimismo usar como enzima la \beta-galactosidasa cuyos sustratos preferidos son el ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido o el 4-metil-umbeliferil-\beta-D-galactopiranósido.

Preferentemente, se pueden acoplar los anticuerpos específicos con la peroxidada. En este caso, el procedimiento de acoplamiento deriva de aquel descrito por M. B. Wilson y P. K. Nakane en lmmunofluorescence and related staining techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wicks ed. Elsevier/North Holland. Ámsterdam 1978, p. 215-224.

Los agentes reactivos usados para revelar la peroxidada conjugada con los anticuerpos específicos contienen agua oxigenada, un sustrato de la enzima, y un cromógeno apropiado por ejemplo ortofenilendiamina o el ácido azino-2,2'-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) o ABTS para obtener un producto final de reacción teñido y soluble en el medio, o bien la diamino-3,3'-bencidina, o el 3-amino-9-etil-carbazol o el 4-cloro-\alpha-naftol para obtener un producto final de reacción insoluble, o bien el ácido parahidroxifenil-propiónico para obtener un producto de reacción fluorescente soluble en el medio.

Otro modo de realización de la invención es el uso de inmunoglobulina acoplada a la acetilcolinesterasa.

La acetilcolinesterasa se acopla al anticuerpo usando preferentemente un procedimiento derivado del descrito en la patente francesa nº 2 550 799, o un procedimiento que comprende esquemáticamente la preparación de fragmentos del anticuerpo mediante una técnica conocida, la modificación de la enzima por reacción con un agente heterobifuncional apropiado y finalmente el acoplamiento de los productos así obtenidos. En este caso, se pueden usar otros procedimientos conocidos de construcción de conjugados inmunoenzimáticos.

La revelación de la actividad enzimática específicamente unida al antígeno reconocido por el conjugado de acetilcolinesterasa se realiza preferiblemente según la técnica bien conocida que utiliza la acetiltiocolina como sustrato de la enzima y el agente reactivo de Ellman o el ácido ditio-5,5'-nitro-2-benzoico como cromógeno, según cualquier variante adaptada al caso en cuestión, por ejemplo aquella descrita por Pradelles et al., en Anal. Chem. 1985, 57:1170-1173.

Más particularmente todavía, se realiza una serie de ensayos con diluciones crecientes de la muestra a ensayar y se usa una sustancia de detección (Ac_{2}) que es una inmunoglobulina conjugada con una sustancia fluorescente, y se verifica si se detecta mediante fluorescencia un producto de reacción (Ag_{1}-Ac_{1}-Ac_{2}) a una dilución de la muestra a ensayar inferior o igual a 1/200, más exactamente igual a la dilución límite usada para la detección del antígeno Ag_{2}, es decir, la dilución más pequeña a partir de la cual la muestra de suero puede dar lugar a la detección de una reacción contra los antígenos específicos Ag_{2}, siendo esta dilución límite variable en función del agente patógeno y del método de detección, y estando generalmente comprendida entre 1:4 y 1:200. Tal como se menciona anteriormente, para cada método de detección se puede determinar un título dado de anticuerpo (Ac_{2}), es decir, un límite dado de dilución del suero a ensayar, más allá del cual ya no se detecta más dicho anticuerpo (Ac_{2}) que se une a la proteína A.

Tal como se muestra en los ejemplos a continuación en el caso de un método de detección por inmunofluorescencia, se demuestra que cualquier suero humano incorporado en una reacción de inmunofluorescencia indirecta a una dilución inferior o igual a 1/200 presenta una reacción frente a Staphylococcus aureus, es decir, que el título de anticuerpos anti-Staphylococcus aureus es de por lo menos 1/200.

En un modo de realización particular, dicho agente microbiano infeccioso que consiste en el segundo antígeno se selecciona de entre unos microorganismos que comprenden una bacteria, un virus, un parásito o un hongo.

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Más particularmente, el segundo antígeno es una bacteria intracelular, y de forma especial el segundo antígeno se selecciona de entre las bacterias del género Rickettsia, Coxiella, Bartonella, Tropheryma, Ehrlichia, Chlamydia, Mycoplasma, Treponema, Borrelia, y Leptospira, no siendo exhaustiva esta lista.

Todavía más particularmente, el segundo antígeno que corresponde a una bacteria es responsable de una endocarditis.

En otro modo de realización, el segundo antígeno es un antígeno vírico, especialmente un virus seleccionado de entre los virus V.I.H., C.M.V. o Epstein-Barr.

La presente invención tiene asimismo por objeto un kit de diagnóstico útil para llevar a cabo un método según la invención, que comprende por lo menos un control positivo de la introducción de un suero humano en la muestra a ensayar que comprende un primer antígeno que comprende la proteína A y unos agentes reactivos que permiten detectar la presencia de un producto de reacción del primer antígeno con una inmunoglobulina humana.

Más particularmente, el kit de diagnóstico comprende:

-: un soporte sólido sobre el cual se ha depositado un primer antígeno que comprende la proteína A, y un segundo antígeno que corresponde a un agente microbiano infeccioso a detectar, y una sustancia de detección de un producto de reacción del primer antígeno con una inmunoglobulina humana que comprende una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A de forma preferida una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana que es una inmunoglobulina de carba o de polluelo marcada con un marcado fluorescente.

Otras características y ventajas de la presente invención aparecerán a la luz de los ejemplos a continuación.

Las figuras 1A, 1B y 1C representan unos ensayos de serología bacteriana realizados mediante el método de inmunofluorescencia indirecta que ilustra la invención.

1. Protocolo del método serológico 1) Muestras

Las muestras ensayadas comprenden:

-: suero de persona donante de sangre (n = 100),

-: suero de paciente que presenta una endocarditis (n = 400),

-: suero de paciente que presenta la enfermedad del arañazo de gato debido a la bacteria Bartonella henselae, y

-: suero de paciente que presenta una infección aguda de Coxiella burnetti (n = 50),

-: suero de pacientes que presentan unas infecciones diversas (virus de Epstein-Barr, infección por V.I.H., infección por C.M.V.) (n = 50)

El suero se descomplementa mediante calentamiento a 56ºC durante 30 minutos, se puede conservar a 4ºC si el análisis no se realiza inmediatamente.

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2) Material

-: Portaobjeto DINA TECH(R) de 18 pocillos

-: Microplacas en forma de U para la dilución ref.: Elvetec(R) 025085096

-: Microscopio de fluorescencia

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3) Agentes reactivos

-: Control positivo por antígeno

-: Cola Fluoprep ref.: Biomerieux 75521, conservación a 20ºC

-: Diez alícuotas de antígenos: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Rickettsia conorii ATCC VR-141, Rickettsia slovaca, Rickettsia typhi ATCC VR-144, Coxiella burnetti Cepa Mine Mile ATCC VR-616, Francisella tularensis A TCC 15482, conservados a -30ºC

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-: Bartonella henselae ATCC 49882, Bartonella quintana ATCC 49793, Bartonella clarridgeae (cepa depositada, colección Unité des Rickettsies, Facultad de medicina, Marsella), Bartonella, massilae (cepa depositada, colección Unité des Rickettsies, Facultad de medicina, Marsella). Conservados a 4ºC.

-: Anticuerpos de detección: inmunoglobulina de cabra anti-inmunoglobulina humana IGH (Fluolina-H, bioMérieux sa, Marcy l'Etoile, Francia).

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4) Preparación de los agentes reactivos

-: Los portaobjetos deben ser desgrasados en el alcohol metílico durante un mínimo de 2 h, idealmente toda la noche.

-: Preparación de los antígenos.

Después de descongelar y dejar volver a temperatura ambiente, se diluye al ½ en PBS estéril (conservación a 4ºC). Se asegura previamente la calidad del lote de antígeno ensayándole mediante un suero de control (es decir, con una concentración de anticuerpos conocida) a fin de determinar la dilución óptima de uso de este antígeno.

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5) Preparación de los portaobjetos

-: Se depositan los antígenos sobre los puntos de los portaobjetos desgrasados, con la ayuda de una pluma diferente para cada antígeno. Estas plumas se aclaran, se escurren y se secan después de cada uso.

-: El primer portaobjeto de detección debe comprender los siguientes antígenos, siempre depositados en la misma posición a partir de la parte superior y en el sentido de las agujas de un reloj: Staphylococcus aureus, Coxiella burnetii, Rickettsia slovaca, Rickettsia conorii, Rickettsia typhi. Se fijan los portaobjetos durante 10 min. en acetona.

-: El segundo portaobjeto de detección debe comprender los siguientes antígenos, siempre depositados en la misma posición a partir de la parte superior y en el sentido de las agujas de un reloj: Staphylococcus aureus, Bartonella henselae, Bartonella clarridgeae, Bartonella quintana, Francisella tularensis y B. massiliae en el medio. Los portaobjetos se fijan en alcohol metílico durante 10 min..

-: Recordatorio: la lectura con el microscopio estará invertida.

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6) Dilución de los sueros a ensayar.

Los sueros deben ser descomplementados, numerados y procesados informáticamente.

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\bullet Preparación de las diluciones

Se realizan sistemáticamente tres diluciones 1/25, 1/50, 1/100 en un PBS-leche (Para LCR dilución 1/2, 1/4, 1/8, para picadura de garrapata 1/8).

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\bullet Depósito de las diluciones

-: treinta \mul de cada una de las 3 diluciones de cada paciente una bajo la otra.

-: el primer punto del portaobjeto se reserva para el control positivo constituido por un grupo de sueros positivos conocidos para cada uno de los antígenos ensayados.

-: el último punto del portaobjeto se reserva para el control negativo (PBS-leche).

Se deja incubar durante 30 minutos a 37ºC en atmósfera húmeda.

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7) Aclarado de los portaobjetos

Se lavan los portaobjetos con un chorro de PBS y en unos baños de PBS tween, y después con agua destilada.

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8) Depósito de las inmunoglobulinas

Preparación: IgH fluorescente total a diluir en PBS-leche con una gota de azul de Evans al 1/400 (con la condición de que la dilución haya sido ensayada al abrir el frasco según el procedimiento desarrollado en el punto nº 4). Se depositan 30 \mul sobre cada punto. Se deja incubar durante 30 minutos a 37ºC en atmósfera húmeda y después se aclara según el mismo procedimiento descrito anteriormente.

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9) Montaje de los portaobjetos

Se depositan 3 gotas de Fluoprep® sobre los portaobjetos secos. Se coloca un cubreobjeto sin moverlo, y se deja que el Fluoprep® se difunda sobre todo el portaobjeto. Se protege de la luz hasta la lectura.

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10) Lectura

Ésta se realiza sobre el microscopio de fluorescencia. La lectura con microscopio está invertida en relación con el depósito. Se anotan todos los resultados positivos sobre una hoja de trabajo.

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2. Resultados

Se recogió una serie de suero en personas donantes de sangre (controles de la población general) (n = 100) y en pacientes que presentan una endocarditis (n = 40), una enfermedad del arañazo de gato debido a la bacteria Bartonella henselae (n = 50), una infección aguda de Coxiella burnetii (fiebre Q aguda) (n = 50), o unas infecciones diversas caracterizadas por un aumento policlonal no específico del porcentaje de las inmunoglobulinas séricas (infección con virus de Epstein-Barr, infección por V.I.H., infección por C.M.V.) (n = 50).

Este ensayo serológico ha mostrado un título de anticuerpos anti-Staphylococcus aureus 1:400 en 100% de los pacientes que presentan una endocarditis, y un título de 1:200 en 100% de los demás pacientes así como en los donantes de sangre.

Se realizó una operación de control sobre 10 ensayos en los que la muestra a ensayar contenía únicamente la inmunoglobulina conjugada de detección, y en los que el suero de paciente fue voluntariamente omitido. No se detectó ninguna fluorescencia sobre esas 10 muestras confirmando la ausencia de reacción de la inmunoglobulina de cabra con la proteína A. Estos resultados demuestran que cualquier suero humano incorporado en una reacción de inmunofluorescencia indirecta a una dilución \leq 1:200 presenta una reacción frente a Staphylococcus aureus; y que esta reacción no está alterada por las patologías infecciosas, incluyendo las patologías infecciosas que inducen una hipergammaglubulinemia policlonal, y que modifica por lo tanto fuertemente el porcentaje y la calidad de las inmunoglobulinas séricas humanas; y que la ausencia de suero humano se traduce por una ausencia de fluorescencia.

Para los resultados presentados en las figuras 1A, 1B y 1C, se realizó el ensayo contra tres antígenos, S. aureus ATCC 29 213 en el centro del portaobjeto, R. conorii ATCC VR-141 a la izquierda del portaobjeto, y B. henselae ATCC 49882 a la derecha del portaobjeto.

- figura 1A = sin ningún suero humano,

- figura 1B = con suero humano positivo para R. conorii,

- figura 1C = con suero humano positivo para B. henselae.

La omisión de suero humano conlleva una ausencia de fluorescencia (figura 1A), la introducción de suero conlleva sistemáticamente una fluorescencia frente a S. aureus (figuras 1B y 1C).

Claims

1. Método de diagnóstico serológico in vitro, en el que se detecta la presencia de anticuerpos específicos de un agente microbiano infeccioso en una muestra a ensayar, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas en las que:

a): se deposita sobre un soporte sólido un primer antígeno (Ag_{1}) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A, y por lo menos un segundo antígeno (Ag_{2}) que es característico de un agente infeccioso microbiano (Ag_{2}), y

b): se hace reaccionar el primer (Ag_{1}) y el(los) segundo(s) (Ag_{2}) antígenos con una muestra a ensayar, y

c): se detecta si una inmunoglobulina humana (Ac_{1}) reacciona con el primer antígeno (Ag_{1}) haciendo reaccionar el producto de la reacción (Ag_{1}-Ac_{1}) con una sustancia de detección que es una sustancia que reacciona con una inmunoglobulina humana y que no reacciona con el primer antígeno (Ag_{1}), y

d): se controla que dicha muestra a ensayar contiene un suero humano detectando si unas inmunoglobulinas humanas reaccionan con el primer antígeno.

2. Método de diagnóstico serológico según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha sustancia de detección es un anticuerpo secundario de detección (Ac_{2}) que es una inmunoglobulina de origen animal anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A.

3. Método de diagnóstico serológico según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha inmunoglobulina de origen animal anti-inmunoglobulina humana (Ac_{2}) es una inmunoglobulina de carba o de polluelo.

4. Método de diagnóstico serológico según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha sustancia de detección está marcada mediante marcado fluorescente.

5. Método de diagnóstico serológico según la reivindicación 4, caracterizado porque:

-: se realiza una serie de ensayos a diluciones crecientes de la muestra a ensayar, y se usa una sustancia de detección (Ac_{2}) que es una inmunoglobulina conjugada con una sustancia fluorescente, y

-: se verifica si se detecta mediante fluorescencia un producto de reacción (Ag_{1}-Ac_{1}-Ac_{2}) a una dilución de la muestra a ensayar inferior o igual a 1/200.

6. Método de diagnóstico serológico según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho agente microbiano infeccioso que consiste en dicho segundo antígeno se selecciona de entre unos microorganismos que comprenden una bacteria, un virus, un parásito o un hongo.

7. Método de diagnóstico serológico según la reivindicación 6, caracterizado porque el segundo antígeno (Ag_{2}) es una bacteria intracelular o un virus.

8. Método de diagnóstico serológico según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el segundo antígeno se selecciona de entre las bacterias del género Rickettsia, Coxiella, Bartonella, Tropheryma, Ehrlichia, Chlamydia, Mycoplasma, Treponema, Borrelia, y Leptospira.

9. Método de diagnóstico serológico según la reivindicación 8, caracterizado porque el segundo antígeno que corresponde al agente microbiano infeccioso es una bacteria responsable de una endocarditis.

10. Método de diagnóstico serológico según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el segundo antígeno que corresponde a dicho agente microbiano infeccioso es un antígeno vírico seleccionado de entre los virus V.I.H., C.M.V. o Epstein-Barr.

11. Kit de diagnóstico útil para la realización de un método según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende por lo menos:

-: un soporte sólido sobre el cual se ha depositado por lo menos un segundo antígeno (Ag_{2}) que corresponde a un agente microbiano infeccioso a detectar, y

-: un control positivo de la introducción de un suero humano en la muestra a ensayar que comprende un primer antígeno (Ag_{1}) que comprende una bacteria entera de Staphylococcus aureus que contiene la proteína A, y

-: unos agentes reactivos que permiten detectar la presencia de un producto de reacción del primer antígeno (Ag_{1}) con una inmunoglobulina humana (Ac_{1}), que comprende una sustancia de detección (Ac_{2}) que com-prende una inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana marcada que no reacciona con la proteína A.