ES2321584T3 - Fk228 reducido y su uso. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto representado por la fórmula (I) ** ver fórmula** en el que R1 y R2 son iguales o diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o un grupo protector de tiol, o una de sus sales.
Description
FK228 reducido y su uso.
La presente invención se refiere a un compuesto
que tiene una actividad inhibidora de histona desacetilasa y al uso
del mismo.
La histona desacetilasa es una enzima de
metalodesacetilación que tiene Zn en un centro activo (M.S. Finnin
et al., Nature 401, 188-193 (1999)). Se
considera que esta enzima cambia la afinidad de diversas histonas
acetiladas para DNA. El fenómeno biológico directo llevado a cabo
por la misma es un cambio estructural de cromatina. La unidad
mínima de estructura de cromatina es un nucleosoma en el que DNA de
146 pb está arrollado 1,8 veces en dirección contraria a las agujas
del reloj alrededor de un octámero de histona (H2A, H28, H3 y H4,
cada uno 2 moléculas, histona nuclear). La histona nuclear
estabiliza la estructura del nucleosoma mediante la interacción de
la carga positiva del extremo N de cada proteína de histona con DNA.
La acetilación de la histona está controlada por el equilibrio
entre la reacción de acetilación, en la que está implicada histona
acetiltransferasa, y la desacetilación, en la que está implicada
histona desacetilasa. La acetilación de la histona se produce en un
residuo de lisina del extremo N de proteína de histona que está
evolutivamente bien conservada. Por consiguiente, se considera que
la proteína de histona nuclear pierde la carga eléctrica del
extremo N, la interacción con DNA está atenuada y la estructura del
nucleosoma se hace inestable. Por lo tanto, se considera que la
desacetilación de histona produce lo opuesto, o estabilización de la
estructura del nucleosoma. Sin embargo, hay mucho que clarificar
con respecto al grado de cambio de estructura de cromatina debido a
la acetilación y su relación con el control de la transcripción
derivado de forma
secundaria.
secundaria.
Por otra parte, se ha informado que un compuesto
representado por la fórmula (IV)
(en lo sucesivo también denominado
en la presente memoria sustancia FR901228) deriva una potente
actividad antitumoral al inhibir selectivamente histona
desacetilasa. Por otra parte, esta sustancia provoca una alta
acetilación de histona en células tratadas, como resultado de la
cual deriva actividad de control de la transcripción para diversos
genes, actividad inhibidora del ciclo celular y actividad inhibidora
de la apoptosis
(JP-B-7-64872, H.
Nakajima et al., Exp. Cell Res. 241, 126-166
(1998)). Aunque, por lo tanto, han existido diversos informes sobre
inhibidores de histona desacetilasa derivados de sustancias
presentes en la naturaleza, la sustancia FR901228 es un primer
agente farmacéutico que tiene acetilación de histona conectada con
fenómenos biológicos expresados por la misma, y con cuya utilidad
clínica ha estado de acuerdo. La sustancia FR901228 tiene un enlace
de disulfuro en una
molécula.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un compuesto que tenga una actividad inhibidora de
histona desacetilasa más fuerte y un inhibidor de histona
desacetilasa que comprenda el compuesto. Otro objetivo de la
presente invención es proporcionar el uso del compuesto que tiene
una actividad inhibidora de histona desacetilasa como un agente
farmacéutico.
Como resultado de los estudios intensivos
realizados por los presentes inventores en un intento de alcanzar
los objetivos mencionados anteriormente, se ha encontrado que, al
reducir el enlace de disulfuro de la sustancia FR901228 hasta una
forma tiólica, puede producirse una actividad inhibidora de histona
desacetilasa más fuerte y, además, que este compuesto es útil como
un agente farmacéutico, lo que daba como resultado la terminación
de la presente invención. De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona lo siguiente.
(1) Un compuesto representado por la fórmula
(I)
en la que R^{1} y R^{2} son
iguales o diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o un grupo
protector de tiol, o una de sus
sales.
(2) El compuesto del (1) mencionado
anteriormente, en el que R^{1} y R^{2} son cada uno un átomo de
hidrógeno, o una de sus sales.
(3) El compuesto del (2) mencionado
anteriormente, que está representado por la fórmula (II)
en la que R^{1} y R^{2} son
cada uno un átomo de hidrógeno (en lo sucesivo también denominado en
la presente memoria una sustancia FR135313), o una de sus
sales.
(4) Un método de producción de un compuesto de
cualquiera de los (1)-(3) mencionados anteriormente o una de sus
sales, que comprende una etapa para segmentar un enlace de disulfuro
en un compuesto representado por la fórmula (III)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(en lo sucesivo también denominado
en la presente memoria
FK228).
(5) El método de producción del (4) mencionado
anteriormente, en el que el compuesto de la fórmula (III) está
representado por la fórmula (IV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(en lo sucesivo también denominado
en la presente memoria sustancia
FR901228).
(6) El método de producción del (5) mencionado
anteriormente, que comprende una etapa para cultivar una cepa
bacteriana perteneciente al género Chromobacterium, que es
capaz de producir un compuesto de la fórmula (IV), en un medio
nutritivo acuoso bajo condiciones aeróbicas y recuperando el
compuesto, y una etapa para segmentar un enlace de disulfuro en el
compuesto recuperado de la fórmula (IV).
\newpage
(7) Un inhibidor de histona desacetilasa que
comprende un compuesto de cualquiera de los (1)-(3) mencionados
anteriormente, o una de sus sales.
(8) Una composición farmacéutica para el
tratamiento o la profilaxis de un tumor, trastornos inflamatorios,
diabetes, una complicación diabética, talasemia homocigótica,
fibrosis, cirrosis, leucemia promielocítica aguda (APL, por sus
siglas en inglés), rechazo de trasplante de órganos o una enfermedad
autoinmune, que comprende un compuesto de cualquiera de los (l)-(3)
mencionados anteriormente, o una de sus sales, como un ingrediente
activo.
(9) Un potenciador de la expresión o promotor de
la reactivación de un transgén, que comprende un compuesto de
cualquiera de los (1)-(3) mencionados anteriormente, o una de sus
sales, como un ingrediente activo.
(10) El potenciador de la expresión o promotor
de la reactivación de un transgén del (9) mencionado anteriormente,
que es un agente farmacéutico.
(11) El potenciador de la expresión o promotor
de la reactivación de un transgén del (10) mencionado anteriormente,
en el que el agente farmacéutico es para terapia génica.
(12) Uso de un compuesto de cualquiera de los
(l)-(3) mencionados anteriormente, o una de sus sales, para la
producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o la
profilaxis de un tumor, trastornos inflamatorios, diabetes, una
complicación diabética, talasemia homocigótica, fibrosis, cirrosis,
leucemia promielocítica aguda (APL, por sus siglas en inglés),
rechazo de trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune.
(13) Uso de un compuesto de cualquiera de los
(l)-(3) mencionados anteriormente, o una de sus sales, para la
producción de un potenciador de la expresión de un transgén o un
promotor de la reactivación de un transgén.
(14) El uso del (13) mencionado anteriormente,
en el que el potenciador de la expresión de un transgén o el
promotor de la reactivación de un transgén es para terapia
génica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un compuesto
representado por la siguiente fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que R^{1} y R^{2} son
iguales o diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o un grupo
protector de tiol, o una de sus sales. Preferiblemente, tanto
R^{1} como R^{2} son átomos de hidrógeno, más preferiblemente
una sustancia FR135313 representada por la siguiente
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles de las definiciones mencionadas
anteriormente y sus realizaciones preferibles se dan en lo
siguiente.
El término "inferior" usado en la presente
memoria descriptiva significa 1 a 6 átomos de carbono, a no ser que
se indique otra cosa.
En la presente invención, un grupo protector de
tiol adecuado es el usado generalmente en este campo, que se
ejemplifica por, pero no se limita a, los siguientes: los que forman
tioéter para proteger al grupo tiol, tales como un grupo bencilo
que tiene opcionalmente sustituyentes (el sustituyente se
ejemplifica por alcoxi inferior (por ejemplo, metoxi, etc.),
aciloxi (por ejemplo, acetoxi, etc.), hidroxi, nitro, picolilo,
N-óxido de picolilo, antrilmetilo, difenilmetilo, fenilo,
t-butilo, adamantilo, aciloximetilo (por ejemplo,
pivaloiloximetilo,
butoxi(terciario)-carboniloximetilo,
etc.);
los que forman monotio, ditio o aminotioacetal
para proteger al grupo tiol, tales como
alcoxi(inferior)-metilo (por ejemplo,
metoximetilo, isobutoximetilo, etc.), tetrahidropiranilo,
benciltiometilo, feniltiometilo, tiazolidina, acetamidometilo,
benzamidometilo;
los que forman tioéster para proteger al grupo
tiol, tales como butoxi(terciario)-carbonilo
(BOC), acetilo y su derivado, benzoílo y su derivado;
los que forman tioéster ácido de carbamina para
proteger al grupo tiol, tales como carbamoílo, fenilcarbamoílo,
alquil(inferior)-carbamoílo (por ejemplo,
metilcarbamoílo, etilcarbamoílo, etc.). Más específicamente, se usa
preferiblemente cada grupo protector descrito en PROTECTIVE GROUPS
IN ORGANIC SYNTHESIS, Segunda Edición, T.W. Greene, P. G. M. Wuts
WILEY-INTERSCIENCE.
El compuesto de la fórmula (I) mencionado
anteriormente puede tener un estereoisómero, tal como un isómero
óptico o un isómero geométrico, basado en un átomo de carbono
asimétrico y un doble enlace, todos los cuales isómeros y sus
mezclas también están incluidos en la presente invención. Por otra
parte, el compuesto de la fórmula (I) puede formar una sal, que
también está incluida en la presente invención. La sal es una sal
biológicamente aceptable que generalmente es atóxica, y está
ejemplificada por sales con sales por adición de bases y ácidos,
incluyendo sales con una base inorgánica tal como una sal de metal
alcalino (por ejemplo, sal sódica, sal potásica), una sal de metal
alcalinotérreo (por ejemplo, sal cálcica, sal magnésica), una sal
amónica, sales con una base orgánica tal como una sal de amina
orgánica (por ejemplo, sal de trietilamina, sal de
diisopropiletilamina, sal de piridina, sal de picolina, sal de
etanolamina, sal de trietanolamina, sal de diciclohexilamina, sal
de N',N'-dibenciletilendiamina), una sal por adición
de ácido inorgánico (por ejemplo, hidrocloruro, hidrobromuro,
sulfato, fosfato), una sal por adición de ácido carboxílico o ácido
sulfónico orgánico (por ejemplo, formiato, acetato,
trifluoroacetato, maleato, tartrato, fumarato, metanosulfonato,
bencenosulfonato, toluenosulfonato y similares), una sal con un
aminoácido básico o ácido (por ejemplo, arginina, ácido aspártico,
ácido glutámico). Además, también se incluyen en la presente
invención sus compuestos de solvato (por ejemplo, un compuesto de
inclusión tal como un hidrato).
En el compuesto de la fórmula (I) de la presente
invención, el enlace de disulfuro del compuesto (FK228) representado
por la fórmula (III) se segmenta, y puede denominarse FK228
reducido o forma tiólica de FK228 (en lo sucesivo en la presente
memoria las series de los compuestos de la presente invención
también se denominan generalmente una forma tiólica de FK228).
La presente invención también proporciona un
método de producción de la forma tiólica de FK228 de la presente
invención. El método de producción de la forma tiólica de FK228 de
la presente invención incluye característicamente una etapa para
segmentar el enlace de disulfuro de FK228. La segmentación de este
enlace puede efectuarse mediante un método conocido en este campo
hasta un grado que no influya adversamente en la actividad
inhibidora de histona desacetilasa de la forma tiólica de FK228
obtenida, o mediante un método modificado según sea necesario.
Más específicamente, la segmentación del enlace
de disulfuro se alcanza usando un compuesto tiólico usado
generalmente para un tratamiento de reducción de una proteína que
tiene generalmente un enlace de disulfuro, tal como mercaptoetanol,
ácido tioglicólico, 2-mercaptoetilamina,
bencenotiol, paratiocresol, ditiotreitol. Preferiblemente, se usan
mercaptoetanol y ditiotreitol. Un compuesto tiólico en exceso puede
retirarse mediante diálisis, filtración en gel. Puede usarse un
compuesto distinto al tiólico, electrolisis, tetrahidroborato
sódico, hidruro de litio y aluminio, sulfito y similares.
El tratamiento de reducción mencionado
anteriormente se efectúa según sea apropiado mediante un
procedimiento conocido dependiendo del tipo de agente reductor. Por
ejemplo, cuando se usa mercaptoetanol o ditiotreitol, este reactivo
se añade a FK228 y se hacen reaccionar a temperatura ambiente - bajo
calentamiento durante 15 min - durante la noche, preferiblemente a
temperatura ambiente durante la noche (véase Biochemical Experiment
Method 8, chemical modification of SH group, Masatsune Ishiguro,
Japan Scientific Societies Press, IV, chemical modification of
disulfide bond; Bio-chemical Experiment Method 10,
quantitative determination of SH group, Hiroshi Matsumoto, Toyo
Kuninori, Japan Scientific Societies Press, III, reduction of SS
bond).
Un compuesto que ha de ser el material de
partida de la forma tiólica de FK228 de la presente invención, a
saber, FK228 o una de sus sales, es una sustancia conocida y
disponible. Por ejemplo, la sustancia FR901228, que es uno de los
estereoisómeros de FK228, puede obtenerse al cultivar una cepa
bacteriana perteneciente al género Chromobacterium, que es
capaz de su producción, bajo condiciones aeróbicas y recuperando la
sustancia del caldo de cultivo. La cepa bacteriana perteneciente al
género Chromobacterium, que es capaz de producir sustancia
FR901228, es, por ejemplo, la cepa Chromobacterium violaceum
WB968 (FERM BP-1968). La sustancia FR901228 puede
obtenerse a partir de esta cepa de producción de acuerdo con el
documento
JP-B-7-64872. La
sustancia FR901228 se recupera preferiblemente de una cepa
bacteriana perteneciente al género Chromobacterium, que es
capaz de producir sustancia FR901228, debido a que puede obtenerse
más fácilmente. Además, una sustancia FR901228 sintetizada o
semisintetizada también es ventajosa debido a que una etapa de
purificación adicional es innecesaria o menor. Alternativamente,
FK228 puede semisintetizarse o sintetizarse completamente de acuerdo
con un método conocido convencionalmente. Más específicamente,
puede usarse el método presentado por Khan W. Li et al. (J.
Am. Chem. Soc., vol. 118, 7237-7238 (1996)).
Otro aspecto de la forma tiólica de FK228 de la
presente invención es un compuesto en el que R^{1} y/o R^{2}
son/es un grupo protector de tiol. Este compuesto puede prepararse
al introducir un grupo protector de tiol en el compuesto de la
presente invención en el que R^{1} y R^{2} son átomos de
hidrógeno.
Un agente adecuado para introducir un grupo
protector de tiol que ha de usarse en esta reacción se determina
apropiadamente dependiendo del grupo protector que ha de
introducirse. Por ejemplo, pueden mencionarse los usados
generalmente, tales como el cloruro del grupo protector
correspondiente (por ejemplo, cloruro de bencilo, cloruro de
metoxibencilo, cloruro de acetoxibencilo, cloruro de nitrobencilo,
cloruro de picolilo, N-óxido de cloruro de picolilo, cloruro de
antrilmetilo, cloruro de isobutoximetilo, cloruro de feniltiometilo,
etc.) y alcoholes del grupo protector correspondiente (alcohol
difenilmetílico, alcohol adamantílico, alcohol acetamidometílico,
alcohol benzamidometílico, etc.), dinitrofenilo, isobutileno,
dimetoximetano, dihidropirano, cloroformiato de
t-butilo.
Esta reacción puede llevarse a cabo de acuerdo
con un método convencionalmente conocido para un agente introductor
de grupos protectores o una combinación adecuada de tales métodos.
La desprotección del grupo protector también es conocida por los
expertos normales en la técnica (PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC
SYNTHESIS, Segunda Edición, T.W. Greene, P.G.M. Wuts
WILEY-INTERSCIENCE). Como un ejemplo específico,
cuando el agente introductor es cloruro de bencilo, la protección
del grupo tiol se alcanza mediante la reacción en presencia de
hidróxido sódico 2 N y etanol a 25ºC durante 30 min, y su
desprotección se alcanza mediante tratamiento en presencia de sodio
y amoníaco durante 10 min.
La forma tiólica de FK228 de la presente
invención tiene una potente actividad inhibidora de histona
desacetilasa, y es útil como un inhibidor de histona desacetilasa
en diversos mamíferos, incluyendo el ser humano, tales como mono,
ratón, rata, conejo, cerdo, perro, caballo, vaca.
Por otra parte, debido a su actividad inhibidora
de histona desacetilasa, una composición farmacéutica que contiene
la forma tiólica de FK228 de la presente invención es útil como un
agente para el tratamiento o la profilaxis de las enfermedades (por
ejemplo, un trastorno inflamatorio, diabetes, una complicación
diabética, talasemia homocigótica, fibrosis, cirrosis, leucemia
promielocítica aguda (APL, por sus siglas en inglés), protozoiasis)
inducidas por una expresión génica anormal. Además, la composición
farmacéutica de la presente invención es útil como un agente
antitumoral e inmunosupresor que evita el rechazo del trasplante de
órganos y las enfermedades autoinmunes ejemplificadas
posteriormente. Específicamente, se eligen las siguientes
enfermedades.
Las reacciones de rechazo por trasplante de
órganos o tejidos, tales como corazón, riñón, hígado, médula ósea,
piel, cornea, pulmón, páncreas, intestino delgado, un miembro,
músculo, nervio, disco intervertebral, traquea, mioblasto,
cartílago, etc.;
reacciones del injerto contra el huésped después
del trasplante de médula ósea;
enfermedades autoinmunes tales como artritis
reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto,
esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes tipo I, etc.;
infecciones provocadas por microorganismos
patógenos (por ejemplo, Aspergillus fumigatus, Fusarium
oxysporum, Trichophyton asteroides, etc.);
enfermedades inflamatorias o hiperproliferativas
de la piel o manifestaciones cutáneas de enfermedades mediadas
inmunológicamente (por ejemplo, psoriasis, dermatitis atópica,
dermatitis de contacto, dermatitis eczematoide, dermatitis
seborreica, liquen plano, pénfigo, penfigoide bulloso, epidermolisis
bullosa, urticaria, angioedema, vasculitis, eritema, eosinofilia
dérmica, lupus eritematoso, acné y alopecia areata);
enfermedades autoinmunes del ojo (por ejemplo,
queratoconjuntivitis, conjuntivitis vernal, uveitis asociada con la
enfermedad de Behcet, queratitis, queratitis herpética, queratitis
cónica, distrofia epitelial corneal, queratoleucoma, pénfigo
ocular, úlcera de Mooren, escleritis, oftalmopatía de Graves,
síndrome de VogtKoyanagi-Harada,
queratoconjuntivitis seca (ojo seco), flicténula, iridociclitis,
sarcoidosis, oftalmopatía endocrina, etc.);
enfermedades obstructivas reversibles de las
vías respiratorias [asma (por ejemplo, asma bronquial, asma
alérgica, asma intrínseca, asma extrínseca y asma del polvo),
particularmente asma crónica o inveterada (por ejemplo, asma tardía
e hipersensibilidad de las vías respiratorias), bronquitis,
etc.];
inflamaciones mucosales o vasculares (por
ejemplo, úlcera gástrica, lesión vascular isquémica o trombótica,
enfermedades isquémicas del intestino, enteritis, enterocolitis
necrosante, daños intestinales asociados con quemaduras térmicas,
enfermedades mediadas por leucotrieno B4);
inflamaciones/alergias intestinales (por
ejemplo, enfermedades celíacas, proctitis, gastroenteritis
eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis
ulcerativa);
enfermedades alérgicas relacionadas con los
alimentos con manifestación sintomática remota del tracto
gastrointestinal (por ejemplo, migraña, rinitis y eczema);
enfermedades renales (por ejemplo, nefritis
intersticial, síndrome de Goodpasture, síndrome urémico hemolítico
y nefropatía diabética);
enfermedades nerviosas (por ejemplo, miositis
múltiple, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de
Meniere, neuritis múltiple, neuritis solitaria, infarto cerebral,
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis
lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés) y
radiculopatía);
enfermedades isquémicas cerebrales (por ejemplo,
lesión de cabeza, hemorragia en el cerebro (por ejemplo, hemorragia
subaracnoide, hemorragia intracerebral), trombosis cerebral,
embolismo cerebral, ataque cardíaco, apoplejía, ataque isquémico
transitorio (TIA, por sus siglas en inglés) y encefalopatía
hipertensiva);
enfermedades endocrinas (por ejemplo,
hipertiroidismo y enfermedad de Basedow);
enfermedades hemáticas (por ejemplo, aplasia de
glóbulos rojos pura, anemia aplástica, anemia hipoplástica, púrpura
trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmune,
agranulocitosis, anemia perniciosa, anemia megaloblástica y
aneritroplasia);
enfermedades óseas (por ejemplo,
osteoporosis);
enfermedades respiratorias (por ejemplo,
sarcoidosis, fibrosis pulmonar y neumonía intersticial
idiopática);
enfermedades de la piel (por ejemplo,
dermatomiositis, leucoderma vulgar, ictiosis vulgar,
fotosensibilidad y linfoma de células T cutáneo);
enfermedades circulatorias (por ejemplo,
arteriosclerosis, aterosclerosis, síndrome de aortitis,
poliarteritis nodosa y miocardosis);
enfermedades del colágeno (por ejemplo,
escleroderma, granuloma de Wegener y síndrome de Sjogren);
adiposis;
fascitis eosinofílica;
enfermedades periodontales (por ejemplo, daño a
la encía, el periodontio, el hueso alveolar o el cemento);
síndrome nefrótico (por ejemplo,
glomerulonefritis);
alopecia de patrón masculino, alopecia
senil;
distrofia muscular;
pioderma y síndrome de Sezary;
enfermedades asociadas con anormalidades
cromosómicas (por ejemplo, síndrome de Down);
enfermedad de Addison;
enfermedades mediadas por oxígeno activo (por
ejemplo, lesión en órganos (por ejemplo, trastornos de circulación
isquémica de órganos (por ejemplo, corazón, hígado, riñón, tracto
digestivo, etc.) asociadas con la conservación, el trasplante o las
enfermedades isquémicas (por ejemplo, trombosis, infarto cardíaco,
etc.));
enfermedades intestinales (por ejemplo, choque
endotóxico, colitis pseudomembranosa y colitis inducida por
fármacos o radiación);
enfermedades renales (por ejemplo, insuficiencia
renal isquémica aguda, fallo renal crónico);
enfermedades pulmonares (por ejemplo, toxicosis
provocada por oxígeno pulmonar o fármacos (por ejemplo, paracort,
bleomicina, etc.), cáncer de pulmón y enfisema pulmonar);
enfermedades oculares (por ejemplo, cataratas,
enfermedad de almacenamiento del hierro (siderosis bulbar),
retinitis pigmentosa, placas seniles, cicatrización del vítreo,
quemadura alcalina corneal);
dermatitis (por ejemplo, eritema multiforme,
dermatitis bullosa por inmunoglobulina A lineal, dermatitis por
cemento);
y otras enfermedades (por ejemplo, gingivitis,
periodontitis, sepsis, pancreatitis y enfermedades provocadas por
contaminación ambiental (por ejemplo, contaminación del aire),
envejecimiento, un carcinógeno, metástasis de carcinoma e
hipobaropatía)];
enfermedades provocadas por liberación de
histamina o liberación de leucotrieno C4; restenosis de la arteria
coronaria después de angioplastia y
prevención de adhesiones posquirúrgicas;
enfermedades autoinmunes y estados inflamatorios
(por ejemplo, edema mucosal primario, gastritis atrófica
autoinmune, menopausia prematura, esterilidad masculina, diabetes
mellitus juvenil, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmitis simpática,
uveitis inducida por lentes de contacto, leucopenia idiopática,
hepatitis crónica activa, cirrosis idiopática, lupus eritematoso
discoide, orquitis autoinmune, artritis (por ejemplo, artritis
deformante) o policondritis);
infección por virus de inmunodeficiencia humana
(HIV, por sus siglas en inglés), sida;
conjuntivitis alérgica;
cicatriz hipertrófica y queloide debidos a
trauma, quemadura o cirugía.
Por otra parte, la forma tiólica de FK228 de la
presente invención es útil como un potenciador de la expresión o
promotor de la reactivación de un transgén debido a su actividad
inhibidora de histona desacetilasa.
En la presente invención, potenciación de la
expresión de un transgén significa la potenciación en la célula
huésped de la expresión de un gen exógeno transducido mediante
ingeniería genética en las células de ser humano y diversos
animales (por ejemplo, ratón, rata, cerdo, perro, caballo, vaca). La
potenciación de la expresión del transgén puede ser a nivel celular
(es decir, in vitro) o a nivel individual (es decir, in
vivo), dando preferencia a aquel in vivo.
Según se usan en la presente memoria, in
vivo e in vitro significa que estos términos se usan en
este campo. Esto es, "in vivo" significa que las
funciones y respuestas biológicas buscadas se expresan dentro de
tejidos del cuerpo vivo, e "in vitro" significa que
tales funciones y respuestas se expresan en un tubo de ensayo
(sistema de cultivo tisular, sistema de cultivo celular, sistema no
celular).
En la presente invención, reactivación de un
transgén significa la liberación de la supresión de la expresión
(silenciación) de un gen exógeno transducido mediante ingeniería
genética en las células de ser humano y diversos animales (por
ejemplo, ratón, rata, cerdo, perro, caballo, vaca) y la presente
invención puede promover la reactivación. Además de la liberación
de la silenciación, la presente invención puede promover la
actividad de transcripción de un transgén que muestra expresión
estable a un nivel constante, y potenciar la expresión. Tal efecto
también está incluido en la "reactivación del transgén" de la
presente invención. La promoción de la reactivación del transgén
puede ser a un nivel celular (es decir, in vitro) o a nivel
individual (es decir, in vivo), dándose preferencia a
aquella in vivo.
Un gen exógeno puede transducirse mediante un
método conocido en el campo pertinente. Por ejemplo, puede usarse
beneficiosamente la transferencia de DNA mediante un método físico
(método de microinyección, método de electroporación), la
transferencia de DNA mediante un método químico (método del fosfato
cálcico, método de DEAE-dextrano, etc.), un método
biológico (vector viral tal como retrovirus y adenovirus), nuevos
métodos tales como el método de liposomas de HVJ.
Cuando se usa la forma tiólica de FK228 de la
presente invención o una de sus sales como un agente farmacéutico,
puede usarse como una preparación farmacéutica sólida, semisólida o
líquida que contiene forma tiólica de FK228 o una de sus sales como
un ingrediente activo mezclado con un portador o excipiente orgánico
o inorgánico para aplicación oral o parenteral. El ingrediente
activo puede mezclarse con un portador farmacéuticamente aceptable
atóxico típico adecuado para la forma de dosificación, tal como un
polvo, un comprimido, una pella, una cápsula, un supositorio, un
líquido, una emulsión, una suspensión, un aerosol, una pulverización
y otra forma para el uso. Cuando es necesario, pueden usarse agente
auxiliar, estabilizante, adherente. Estos portadores y excipientes
pueden esterilizarse cuando sea necesario, o puede aplicarse un
tratamiento de esterilización después de la formulación como una
preparación. La forma tiólica de FK228 o una de sus sales están
contenidos en el potenciador de la expresión o promotor de la
reactivación en una cantidad suficiente para producir un efecto
deseado sobre el estado que requiere la potenciación de la expresión
de un transgén o su reactivación. En particular, cuando el
potenciador de la expresión y promotor de la reactivación de un
transgén de la invención se usa para una terapia génica, es
preferible la administración parenteral, a saber, administración
intravenosa, administración intramuscular, administración directa
al tejido, administración a la cavidad intranasal, administración
intradérmica, administración al fluido cerebroespinal,
administración al tracto biliar, administración intravaginal.
Además, puede usarse preferiblemente un método liposomático capaz de
la administración directa a la zona y el órgano en el que se
requieren la expresión y la reactivación de un
transgén.
transgén.
La cantidad terapéuticamente eficaz del
ingrediente activo forma tiólica de FK228 y una de sus sales varía
y se determina dependiendo de la edad y el estado del paciente
individual que ha de tratarse y, cuando se usa como un potenciador
de la expresión o un promotor de la reactivación de un transgén, del
tipo del transgén y el tipo de enfermedad en la que se requieren la
potenciación de la expresión y la promoción de la reactivación de un
transgén.
El método de administración de un agente
farmacéutico que contiene la forma tiólica de FK228 de la presente
invención o una de sus sales como un ingrediente activo está libre
de cualquier limitación particular con tal de que pueda
proporcionar el efecto deseado y, por ejemplo, el agente puede
administrarse oralmente o parenteralmente una vez al día o varias
veces al día. Cuando se usa para una terapia génica, la ruta de
administración más adecuada para la expresión y la reactivación del
transgén se selecciona apropiadamente teniendo en cuenta la
naturaleza de uso específica. Por ejemplo, cuando se usa para una
terapia génica de un tumor, es preferible la administración directa
a la célula tumoral (por ejemplo, método liposómico).
El potenciador de la expresión y el promotor de
la reactivación de un transgén de la presente invención se
caracteriza por la potenciación de la expresión de un transgén, así
como la liberación de la supresión de la expresión del transgén, en
donde la interacción con el transgén es un factor importante para
ejercer el efecto. Por lo tanto, la cronología de la administración
del transgén y la administración (in vivo, in vitro)
al sujeto del potenciador de la expresión o promotor de la
reactivación de la presente invención se determinan apropiadamente
de acuerdo con el efecto deseado. Cuando se busca la potenciación de
la expresión de un transgén, por ejemplo, el potenciador de la
expresión del transgén de la invención se administra preferiblemente
junto con o después de la administración del transgén. Cuando se
busca la promoción de la reactivación de un gen ya transducido, el
promotor de la reactivación de un transgén de la invención se
administra preferiblemente cuando la reactivación es necesaria
después de la administración del transgén. Cuando el potenciador de
la expresión o promotor de la reactivación de un transgén de la
presente invención ha de administrarse después de la administración
del transgén, la cronología de la administración se determina
apropiadamente de acuerdo con el efecto deseado y su nivel y el
estado de expresión del gen previamente transducido (nivel de
expresión, posición del transgén).
En particular, el potenciador de la expresión y
promotor de la reactivación de un transgén de la presente invención
pueden aplicarse beneficiosamente a una terapia génica. Para la
terapia génica del cáncer, por ejemplo, transferencia de un gen
suicida, puede aplicarse una vacuna de DNA. Como la transferencia de
un gen suicida, se ejemplifica la transferencia de gen de citosina
desaminasa (enzima para convertir un agente anticanceroso,
5-fluorocitosina (5-FC), desde un
compuesto de tipo inactivo hasta uno de tipo activo) en células
cancerosas. La expresión de este gen en una célula cancerosa puede
potenciarse mediante la presente invención (inducción de efecto
antitumoral mediante la conversión específica para células
cancerosas y eficaz de 5-FC en una
5-FC de tipo activo). Como la vacuna de DNA, se
ejemplifica un gen antigénico asociado a tumores expresado
específicamente en una célula cancerosa. La transferencia del gen a
un paciente con cáncer, o la reactivación de un gen antigénico
endógeno asociado, cuya expresión se suprime, o ambas, proporcionan
la potenciación de la expresión de la función del gen antigénico
asociado a tumores, lo que a su vez mejora la inmunidad al cáncer
del paciente.
En una terapia génica del cáncer, también se
usan gen de p53, gen de citoquina (por ejemplo, gen de IL2, IL12),
gen antisentido (K-ras antisentido) y similares.
Para la terapia génica de la fibrosis quística, puede usarse el gen
de CFTR, y para la terapia génica de la hemofilia, puede usarse un
gen de factor anticoagulante.
La presente invención se explica con más detalle
en lo siguiente por medio de Ejemplos. Es innecesario decir que la
presente invención no está limitada por estos Ejemplos.
FR901228 aislada y purificada de acuerdo con la
descripción del documento
JP-B-7-64872 se usó
como una sustancia de partida. A una mezcla de FR901228 (51,6 mg,
95 \mumol), agua (40 ml) y acetonitrilo (10 ml) se añadió
ditiotreitol (412 mg, 2,66 mmol) y la mezcla se dejó reposar durante
la noche a temperatura ambiente. El acetonitrilo se separó por
destilación y la mezcla se purificó mediante HPLC preparativa (el
lavado se efectuó usando solución acuosa de acetonitrilo al
20%/ácido trifluoroacético al 0,05% y la elución se efectuó usando
una solución acuosa de acetonitrilo al 50%/ácido trifluoroacético
al 0,05%).
Las fracciones que contienen el compuesto
buscado como objetivo se recuperaron y se liofilizaron para dar
FR135313 como un polvo (14,8 mg, rendimiento 28,7%)
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMF-d_{7}) \delta: 9,35 (1H, s an,
intercambiable), 8,15 (1H, d an, J=9 Hz, intercambiable), 8,01 (1H,
d an, J=7 Hz, intercambiable), 6,83 (1H, d, J=7 Hz, intercambiable),
6,81 (1H, q, 5 Hz), 4,55 (1H, m), 4,15 (1H, dd, J=9 Hz, 8 Hz),
2,97-2,88 (2H, m), 2,73-2,63 (2H,
m), 2,55 (2H, m), 2,44 (1H, t, J=8 HZ, intercambiable),
2,34-2,27 (3H, m), 2,20 (1H, m), 2,08 (1H, t, J=8
Hz, intercambiable), 1,72 (3H, d, J=7 Hz), 0,98 (3H, d, J=7 Hz),
J=7 Hz), 5,72 (1H, m), 5,61-5,54 (2H, m), 4,60 (1H,
dd, J=10 Hz, 0,95 (3H, d, J=7 Hz), 0,88 (3H, d, J=7 Hz), 0,87 (3H,
d,
J=7 Hz).
J=7 Hz).
MS m/e 654 (M+TFA).
La pureza del compuesto elegido como objetivo se
confirmó mediante HPLC bajo las siguientes condiciones.
Condiciones de HPLC
columna: YMC-PACK ProC18 (YMS.
Co., Ltd), 4,6 X 150 mm elución: solución acuosa de acetonitrilo al
50%/ácido trifluoroacético al 0,05%
caudal: 1 ml/min
detección: 214 nm, 254 nm
tiempo de retención: 4,01 min (el tiempo de
retención de la sustancia de partida sustancia FR901228 es 4,27
min).
Se examinó la actividad inhibidora de histona
desacetilasa de la sustancia FR135313 sintetizada en el Ejemplo de
Producción 1.
\vskip1.000000\baselineskip
FM3A de cáncer de mama de ratón fue suministrada
por el Dr. Dai Ayusawa del Medical Department, Yokohama City
University. Esta célula se subcultivó en un medio que contenía FBS
(Flow Laboratories, en lo sucesivo denominado en la presente
memoria medio ES) al 2% a 37ºC, en CO_{2} al 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
El butirato sódico se adquirió de Waco Pure
Chemical Industries, Ltd. y el acetato sódico [^{3}H] se adquirió
de Amersham.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de lisis (pH 6,5):
Tris-HCl (Sigma) 10 mM, bisulfito sódico (Nakarai
Chemical, Ltd) 50 mM, Triton X-100 (Nakarai
Chemical, Ltd) al 1%, cloruro magnésico (Nakarai Chemical, Ltd) 10
mM, sacarosa (Nakarai Chemical, Ltd) al 8,6%
Tampón de lavado (pH 7,4):
Tris-HCl 10 mM, EDTA (Sigma) 13 mM
Tampón de HDA (pH 7,5): fosfato potásico
(Nakarai Chemical, Ltd) 15 mM, glicerol al 5%, EDTA 0,2 mM
\vskip1.000000\baselineskip
La histona acetilada [^{3}H] que ha de ser el
sustrato de histona desacetilasa se preparó al cultivar 1 X
10^{8} células de célula FM3A (suspendida en 50 ml de medio ES) en
presencia de 0,5 mCi/ml de acetato sódico [^{3}H] y butirato
sódico 5 mM a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 30 min, y extraer
inmediatamente la fracción de histona de las células tratadas de
acuerdo con el siguiente método. La radiactividad específica era
0,45 \muCi/mg de histona.
\vskip1.000000\baselineskip
La extracción de proteína de histona de la
célula de cultivo se efectuó de acuerdo con el método de Yoshida
et al. (M. Yoshida et al., J. Biol. Chem. 265,
17174-17179 (1990)). 1 x 10^{8} células de células
FM3A marcadas con acetato sódico [^{3}H] se recuperaron y se
lavaron una vez con PBS. Las células lavadas se suspendieron en 1
ml de tampón de lisis enfriado con hielo y se rompieron mediante un
homogeneizador Dounce. El núcleo se recogió mediante centrifugación
a 1000 rpm durante 10 min y se lavó 3 veces con el tampón de lisis y
a continuación una vez con el tampón de lavado. El residuo se
suspendió en 0,1 ml de agua destilada enfriada con hielo y ácido
sulfúrico concentrado (Waco Pure Chemical Industries, Ltd.) se
añadió a la concentración final de 0,4 N, y la mezcla se mantuvo a
4ºC durante 1 h. La suspensión se centrifugó en una máquina
microcentrífuga a 15.000 rpm durante 5 min, el sobrenadante se
recuperó, a lo que se añadió 1 ml de acetona, y el sobrenadante se
dejó reposar durante la noche a 20ºC. El precipitado se recuperó
mediante centrifugación en una máquina microcentrífuga a 15.000 rpm
durante 10 min y se secó.
\vskip1.000000\baselineskip
Histona desacetilasa de ratón se prepurificó de
células FM3A. Células FM3A cultivadas suspendidas (concentración de
1 X 10^{6} células/ml en medio ES, 4 l) en un matraz giratorio de
8 l se recuperaron mediante centrifugación y se suspendieron en 40
ml de tampón de HDA. Las células se rompieron mediante un
homogeneizador Dounce y el núcleo celular se recuperó mediante
centrifugación a 35.000 X g durante 10 min y se rompió
adicionalmente en 20 ml de solución de sulfato amónico 1 M. Una
suspensión turbia de ruptura se sometió a ultrasonidos y se
centrifugó para dar un extracto transparente, al que se añadió
sulfato amónico, y la concentración de sulfato amónico se elevó
hasta 3,5 M, con lo que la histona desacetilasa precipitaba. El
precipitado se disolvió en 10 ml de tampón de HDA y se dializó
frente a 4 l del mismo tampón. El dializado se tamponó con tampón de
HDA. Se aplicó a DEAE-celulosa (DE52, 25 X 85 mm,
Whatman) y se eluyó con 300 ml de NaCl mediante un gradiente lineal
(0-0,6 M). La actividad de histona desacetilasa se
eluyó como una actividad de un solo pico en la fracción de elución
de NaCl 0,2-0,3 M. Como resultado, la histona
desacetilasa se purificaba hasta aproximadamente 60 veces la
actividad específica.
Se mezclaron 4 \mul histona acetilada
[^{3}H] (2500 cpm/5 \mug) y 96 \mul de fracción de histona
desacetilasa en bruto. Una solución en etanol (1 \mul) de
sustancia FR135313 preparada de acuerdo con el Ejemplo de Producción
mencionado anteriormente se añadió a la mezcla a diversas
concentraciones finales y la mezcla se hizo reaccionar a 37ºC
durante 10 min. La reacción se terminó mediante la adición de 10
\mul de ácido clorhídrico concentrado y el ácido acético
[^{3}H] liberado se extrajo con 1 ml de acetato de etilo, del que
se añadieron 0,9 ml a 5 ml de solución de centelleo de tolueno y se
midió la radiactividad.
\vskip1.000000\baselineskip
La sustancia FR135313, que está en una forma
reducida (forma tiólica), mostraba actividad inhibidora de histona
desacetilasa según se muestra en el valor de IC_{50} de no más de
1 ng/ml.
El grupo tiol mostraba una fuerte acción
quelante y, por lo tanto, se considera que la sustancia FR901228
que se convertía en una forma tiólica bajo el ambiente de reducción
inhibe la actividad de histona desacetilasa por su capacidad de
orientación hacia esta enzima, que es una metaloenzima.
El compuesto de la fórmula (I), que es una forma
reducida (forma tiólica) de FK228, particularmente la sustancia
FR135313, que es una forma reducida (forma tiólica) de la sustancia
FR901228, y sus sales tienen una fuerte actividad inhibidora de
histona desacetilasa y son útiles como un inhibidor de histona
desacetilasa o un agente para la profilaxis o el tratamiento de un
trastorno inflamatorio, diabetes, una complicación diabética,
talasemia homocigótica, fibrosis, cirrosis, leucemia promielocítica
aguda (APL, por sus siglas en inglés), rechazo de trasplante de
órganos o una enfermedad autoinmune, y además como un potenciador de
la expresión o un promotor de la reactivación de un transgén.
Al controlar la actividad del grupo tiol, puede
controlarse la actividad inhibidora de histona desacetilasa,
permitiendo de ese modo el desarrollo de un agente farmacéutico
adecuado para diversas aplicaciones clínicas.
Claims (14)
1. Un compuesto representado por la fórmula
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que R^{1} y R^{2} son
iguales o diferentes y cada uno es un átomo de hidrógeno o un grupo
protector de tiol, o una de sus
sales.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R^{1} y R^{2} son cada uno un átomo de hidrógeno,
o una de sus sales.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
2, que está representado por la fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que R^{1} y R^{2} son
cada uno un átomo de hidrógeno, o una de sus
sales.
\newpage
4. Un método de producción de un compuesto de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una de sus
sales, que comprende una etapa para segmentar un enlace de disulfuro
en un compuesto representado por la fórmula (III)
5. El método de producción de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que el compuesto de la fórmula (III) está
representado por la fórmula (IV)
6. El método de producción de acuerdo con la
reivindicación 5, que comprende una etapa para cultivar una cepa
bacteriana perteneciente al género Chromobacterium, que es
capaz de producir un compuesto de la fórmula (IV), en un medio
nutritivo acuoso bajo condiciones aeróbicas y recuperando el
compuesto, y una etapa para segmentar un enlace de disulfuro en el
compuesto recuperado de la fórmula (IV).
7. Un inhibidor de histona desacetilasa que
comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, o una de sus sales.
8. Una composición farmacéutica para el
tratamiento o la profilaxis de un tumor, trastornos inflamatorios,
diabetes, una complicación diabética, talasemia homocigótica,
fibrosis, cirrosis, leucemia promielocítica aguda (APL, por sus
siglas en inglés), rechazo de trasplante de órganos o una enfermedad
autoinmune, que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, o una de sus sales, como un ingrediente
activo.
9. Un potenciador de la expresión o promotor de
la reactivación de un transgén, que comprende un compuesto de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una de sus
sales, como un ingrediente activo.
10. El potenciador de la expresión o promotor de
la reactivación de un transgén de acuerdo con la reivindicación 9,
que es un agente farmacéutico.
11. El potenciador de la expresión o promotor de
la reactivación de un transgén de acuerdo con la reivindicación 10,
en el que el agente farmacéutico es para terapia génica.
12. Uso de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una de sus sales, para
la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o
la profilaxis de un tumor, trastornos inflamatorios, diabetes, una
complicación diabética, talasemia homocigótica, fibrosis, cirrosis,
leucemia promielocítica aguda (APL, por sus siglas en inglés),
rechazo de trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune.
13. Uso de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una de sus sales, para
la producción de un potenciador de la expresión de un transgén o un
promotor de la reactivación de un transgén.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13,
en el que el potenciador de la expresión de un transgén o el
promotor de la reactivación de un transgén es para terapia
génica.
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