ES2322332T3 - Composiciones para estimular la regeneracion del sistema nervioso y reparacion mediante la regulacion de la sintesis de poliamidas y arginasa 1. - Google Patents

Composiciones para estimular la regeneracion del sistema nervioso y reparacion mediante la regulacion de la sintesis de poliamidas y arginasa 1. Download PDF

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Abstract

El uso de una composición que comprende arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para la preparación de una composición farmacéutica para la estimulación de la regeneración neural en una enfermedad neurodegenerativa.

Description

Composiciones para estimular la regeneración del sistema nervioso y reparación mediante la regulación de la síntesis de poliamidas y arginasa 1.
Campo técnico de la invención
Esta invención se refiere a la identificación nueva de la arginasa como una actividad enzimática que puede invertir la inhibición de la regeneración neuronal en el sistema nervioso central y periférico. Se describen ensayos para monitorizar los efectos de diversos agentes sobre la expresión de arginasa y así sobre la regeneración y reparación neuronal, y para identificar agentes que bloquearán o estimularán los efectos inhibitorios sobre el crecimiento neuronal. Esta invención se refiere también a las composiciones que comprenden arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa, una célula que expresa arginasa, o putrescina, que pueden invertir los efectos inhibitorios de la mielina sobre la regeneración neural en una neurona. Se proporciona el uso de las composiciones en la preparación de composiciones farmacéuticas para la estimulación del crecimiento o la regeneración neuronal en el sistema nervioso, para el tratamiento de lesiones o daños en el tejido nervioso o las neuronas, y para el tratamiento de la degeneración neural asociada a afecciones, trastornos o enfermedades.
Antecedentes de la invención
El sistema nervioso central (SNC) mamífero adulto no se regenera tras una lesión, a pesar del hecho de que hay presentes muchas moléculas que estimulan el crecimiento nervioso y axonal. El sistema nervioso periférico (SNP) mamífero adulto, en contraste, sí se regenera hasta cierto punto. Se cree que la falta de regeneración del SNC está provocada por la presencia de moléculas que evitan o inhiben activamente la regeneración. En el SNP, en la medida en que las neuronas pueden regenerarse, se piensa que estos inhibidores se eliminan o se inactivan, y así el axón en re-crecimiento no los encuentra. Por lo tanto, se cree que la incapacidad bien documentada del SNC mamífero adulto de regenerarse tras una lesión resulta de la predominancia de las moléculas inhibitorias. Existen al menos tres factores que son responsables de la carencia de regeneración: la formación de una cicatriz glial, los inhibidores de la regeneración en la mielina y la capacidad de crecimiento intrínseca de los axones adultos. La formación de la cicatriz glial conlleva cierto tiempo tras la lesión. Por lo tanto, sería ventajoso favorecer el crecimiento en esta "ventana de oportunidad", antes de que se forme la cicatriz. Los obstáculos principales inmediatamente después de la lesión, por lo tanto, son los inhibidores de la regeneración neuronal presentes en la mielina.
Para superar la acción de estos inhibidores, se podrían neutralizar o se podría cambiar la capacidad de crecimiento del axón de forma que los axones no respondiesen a la mielina que les inhibe. De esta manera, se parecerían a los axones jóvenes, que se regeneran in vivo y que no son inhibidos por la mielina in vitro. Previamente se demostró que si los niveles endógenos de cAMP se elevan en las neuronas más viejas, artificialmente con dibutiril cAMP o mediante pretratamiento de las neuronas con neurotrofinas ("sensibilización"), no son inhibidas ni por la mielina en general ni por un inhibidor específico de la mielina, la glicoproteína asociada a la mielina (MAG). Véase Cai, D. et al., Neuron 22:89-101 (1999); véanse también las patentes de EE.UU. nº 5.932.542 y 6.203.792. En el documento WO 27/01352, los efectos inhibitorios de MAG se superan, por ejemplo, con una forma soluble de MAG (MAG-Fe). También se ha demostrado que el nivel endógeno de cAMP en las neuronas jóvenes es muy elevado, y que su capacidad de regenerarse in vivo y de crecer con mielina es dependiente de cAMP (Cai et al., anteriormente mencionado; 2001). La caída de la concentración de cAMP neuronal parece ser paralela al cambio regulado en el desarrollo que disminuye la capacidad de los axones para regenerarse. Así, los niveles de cAMP pueden desempeñar un papel importante en la regulación de la capacidad de una neurona de experimentar la regeneración axonal. Los efectores posteriores que son directamente responsables del crecimiento neuronal mejorado con mielina siguen siendo desconocidos. Unos candidatos pueden ser las poliaminas, tales como espermidina y espermina, y su precursor de diamina putrescina, que están distribuidos de forma ubicua en las células procarióticas y eucarióticas y en los tejidos eucarióticos.
Las poliaminas están implicadas en un gran número de funciones celulares, que incluyen muchas que implican a los ácidos nucleicos, tales como la replicación del ADN, la expresión de genes y la síntesis de péptidos (para una revisión, véase, p.ej., Tabor y Tabor, Annu. Rev. Biochem., 53, págs. 749-790 (1984)). Se ha demostrado en algunos sistemas que las poliaminas son esenciales para la proliferación y la diferenciación celular durante la cicatrización de heridas. Se considera posible que debido a que las poliaminas son importantes en la cicatrización de heridas tisulares, también pueden funcionar en la regeneración axonal en el sistema nervioso, que puede suceder con o sin una proliferación celular concomitante.
Las poliaminas son abundantes en el sistema nervioso de los mamíferos (véase, p.ej., Bernstein et al., Prog. Neurobiol., 57 (5), págs. 485-505 (1999)). Además, se ha demostrado que las poliaminas estimulan la regeneración de las neuritas de axones lesionados en neuronas de hipocampo de rata cultivadas (Chu et al., Brain Res., 673, págs. 233-241 (1995)). Se ha informado que el tratamiento con poliaminas exógenas acelera la regeneración axonal y la recuperación funcional de nervios periféricos comprimidos (nervios ciáticos y faciales de rata) (Dornay et al., Exp. Neurol., 92, págs. 665-674 (1986); Kauppila et al., Exp. Neurol., 99, págs. 50-58 (1988), Brain Res., 5775, págs. 299-303 (1992)). En los mismos tipos de nervios periféricos, sin embargo, otros autores han informado que las poliaminas exógenas no tuvieron efectos significativos sobre la regeneración neural (Wong y Mattox, Exp. Neurol., 111, págs. 263-266 (1991)). Las poliaminas parecen incrementar la supervivencia de ciertas neuronas simpáticas tras la lesión axonal (Gilad y Gilad, Brain Res., 724, págs. 141-144 (1988)). Las poliaminas también parecen desempeñar un papel en el desarrollo del tejido nervioso neonatal (Slotkin y Bartolome, Brain Res. Bull., 17, págs. 307-320 (1986)). De manera interesante, la biosíntesis de las poliaminas está incrementada en las neuronas tratadas con cAMP (Morris y Slotkin, J. Pharmacol. Exp. Therapeutic., 233, págs. 141-147 (1985)) o con factor de crecimiento nervioso (MacDonnell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, págs. 4681-4684 (1977)). Las poliaminas son, por lo tanto, candidatos para moléculas que actúan en una ruta de señalización mediada por cAMP para regular la capacidad regenerativa neural en presencia de los inhibidores de la mielina.
Las poliaminas se sintetizan en las células mamíferas a partir del aminoácido arginina en una ruta que implica al menos tres etapas catalíticas (véase la Figura 1 para un diagrama esquemático de la síntesis de poliaminas). La primera etapa en la síntesis de poliaminas es la conversión de arginina a ornitina y urea, catalizada mediante la enzima arginasa. La ornitina se convierte en putrescina (una diamina) por la enzima ornitina descarboxilasa (ODC), la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de poliaminas (Shantz, L.M. y Pegg, A.E., Int. J. Biochem. Cell Biol. 31(1), págs. 107-122 (1999); Wu, G. y Morris, S.M., Jr., Biochem. J., 336, págs. 1-17 (1998)). La putrescina, a su vez, es el precursor de la poliamina espermidina, que se puede convertir en una diversidad de otras poliaminas, tales como espermina (véase la Figura 1).
En varios sistemas celulares, la ornitina descarboxilasa (ODC) y la arginasa están co-inducidas (Salimuddin et al., Am. J. Physiol., 277, págs. E110-117 (1999)). Así, la arginasa puede regular la disponibilidad de ornitina para la síntesis de poliaminas, a pesar de la observación de que la conversión de ornitina en putrescina mediante ODC es la etapa limitante de la velocidad en la síntesis de poliaminas. El apoyo adicional para esta idea proviene de las observaciones de que ciertas células deficientes de arginasa no pueden proliferar a menos que se proporcionen poliaminas u ornitina. Por ejemplo, la actividad de arginasa es gravemente deficiente en las células endoteliales de ratas BB diabéticas (un modelo animal de la diabetes mellitus tipo I humana) (Wu y Meninger, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 265, H1965-H1971 (1993)), y estas células exhiben un deterioro notable de la proliferación (Meninger et al., J. Vasc. Research, 33 (S1): 66 (1996)). También se han observado las correlaciones entre la actividad de arginasa y la síntesis de poliaminas en el riñón y el intestino. Sin embargo, no se ha establecido una relación causal entre la actividad de arginasa y la síntesis de poliaminas.
Los genes de arginasa se hallan en las bacterias, hongos, vegetales y animales. Se han identificado dos isoformas de arginasa codificadas por genes distintos en las células de mamíferos (Shi et al., Mammalian Genome, 9, págs. 822-824 (1998)). Las dos isoformas de arginasa difieren en las propiedades moleculares e inmunológicas, la distribución tisular, la localización subcelular, y la regulación de la expresión. La arginasa de tipo I (arginasa I) es una enzima citosólica sumamente expresada en el hígado, y detectada solamente en otros pocos tejidos. Su papel principal, pero no el único, es como componente del ciclo de la urea. La arginasa de tipo II (arginasa II) es una enzima mitocondrial que se expresa en grados variables en varios tejidos, pero con poca o ninguna expresión detectable en el hígado. Una de las funciones de la arginasa II es regular los niveles de óxido nítrico (NO) compitiendo con la óxido nítrico sintetasa por la arginina, cuya disponibilidad es uno de los factores limitantes de la velocidad en la producción de NO celular (Gotoh y Mori, J. Cell Biol., 144, págs. 427-434 (1999)). El NO, a su vez, es importante en el sistema nervioso como molécula de señalización implicada en la supervivencia celular, la memoria y la diferenciación
celular.
La arginasa I y II son aproximadamente un 70% idénticas a nivel de la secuencia de aminoácidos, y difieren principalmente en que la arginasa II tiene una secuencia de señalización proteica mitocondrial (véase, p.ej., Morris et al., Gene, 193, págs. 157-161 (1997); incorporado en el presente documento como referencia). La comparación de las secuencias de arginasa de hígado de rata, humano, Xenopus laevis, levadura y plásmido TiC58 de Agrobacterium ha revelado tres residuos de histidina conservados. A nivel enzimático, las actividades de la arginasa I y la arginasa II son similares, pero distinguibles porque la arginasa II no es tan susceptible a la retroinhibición mediante ornitina como lo es la arginasa I. Hay razones para creer que la arginasa II, como la arginasa I, puede incrementar las poliaminas citosólicas incrementando la ornitina mitocondrial, que después se transporta de nuevo al citosol (véase Jenkinson et al., Comparative properties of arginases, Comp. Biochem. Physiol., 114B, págs. 107-132 (1996)).
Las arginasas I y II se inducen en líneas celulares de macrófagos murinos mediante cAMP. Una combinación de cAMP, dexametasona y lipopolisacáridos (LPS) conduce a la estimulación de la arginasa I en el riñón, pero no en el intestino delgado, lo que sugiere la regulación específica de tejido de la expresión de la arginasa. Parece que las isoformas de arginasa pueden desempeñar papeles funcionales diferentes pero parcialmente coincidentes. Hasta la fecha, no hay datos del papel de las isoformas de arginasa en el crecimiento neuronal o en la regeneración axonal.
Los datos recientes confirman la presencia tanto de arginasa I como de arginasa II en el sistema nervioso central. Los estudios de hibridación in situ demostraron que la arginasa II está distribuida de manera uniforme en el SNC en la mayoría de las neuronas y astrocitos (Braissant et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 70, págs. 231-241 (1999)). Los estudios inmunohistoquímicos han demostrado la expresión difusa de la proteína arginasa I en el SNC (Nakamura et al., Brain Res., 530, págs. 108-112 (1990)). No hay disponibles datos sobre la localización de la proteína arginasa II.
Sería útil poder regular los inhibidores de la regeneración axonal en las neuronas para el tratamiento de pacientes con lesiones o trastornos degenerativos del sistema nervioso en los que la regeneración neural es un problema. Ya que las rutas moleculares que median en el crecimiento y la regeneración neuronal no se han identificado de manera precisa, es difícil diseñar estrategias eficaces para bloquear la acción de las moléculas inhibitorias neuronales que impiden la regeneración neural. En particular, sería útil poder inducir o incrementar de otra manera la actividad de arginasa en las células neuronales para analizar si tal inducción puede, por sí sola o en combinación con otras moléculas, aliviar la inhibición del crecimiento axonal por la mielina y los inhibidores de la mielina, tales como la glicoproteína asociada a la mielina (MAG).
Resumen de la invención
La presente invención resuelve los problemas indicados anteriormente mediante la identificación de la arginasa como una enzima cuya actividad puede invertir la inhibición por la mielina de la regeneración neural en el sistema nervioso central y periférico. Se demuestra que el cAMP induce los niveles de polinucleótidos y polipéptidos de arginasa en las neuronas. También se identifica un papel fisiológico para la arginasa en el sistema nervioso central (SNC), demostrando por primera vez que la expresión de la arginasa es necesaria y suficiente para el crecimiento de las neuritas en presencia de inhibidores gliales. También se demuestra que la sobreexpresión de arginasa en las células nerviosas es suficiente para incrementar las poliaminas hasta niveles que alivian la inhibición de la regeneración neuronal por la mielina y los inhibidores de mielina tales como MAG.
La presente invención proporciona una composición que comprende un agente que es arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa, una célula que expresa arginasa o que comprende putrescina, que puede superar la regulación del crecimiento dependiente de mielina de una neurona afectando a los niveles endógenos de las poliaminas (tales como espermidina o espermina, o el precursor putrescina) en la neurona. En una realización, el agente incrementa las poliaminas en una neurona particular en una etapa particular del desarrollo hasta un nivel que supera la regulación del crecimiento dependiente de mielina. En las realizaciones preferidas, el agente afecta al nivel endógeno de putrescina y de las poliaminas derivadas de putrescina en una neurona.
En el presente documento se describe una composición que comprende un agente modulador de arginasa que incrementa la actividad biológica de la arginasa en una neurona (es decir, un agonista de arginasa neuronal), en una cantidad eficaz para alterar el crecimiento o la regeneración neuronal. En particular, el agonista de arginasa comprende una molécula de ácido nucleico que, tras la expresión en una neurona, puede incrementar la actividad biológica de la arginasa. Preferiblemente, el agente aplicado en los usos de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica arginasa, o las muteínas, análogos, fusiones o fragmentos de la misma, que tienen una actividad biológica de arginasa en una neurona.
La presente invención también proporciona una composición para el uso en un método para el alivio (parcial o completo) de la inhibición por mielina o por MAG del crecimiento o la regeneración neuronal alterando los niveles de poliaminas endógenas; y una composición para el uso en un método para el alivio (parcial o completo) de la inhibición por mielina o MAG del crecimiento o la regeneración neuronal alterando la bioactividad de la arginasa en una neurona de una manera que puede afectar al sistema nervioso. También se proporcionan composiciones para el uso de los métodos para la regulación del crecimiento o la regeneración neural en el sistema nervioso, para el tratamiento de lesiones o daños del tejido nervioso o las neuronas, y para el tratamiento de la degeneración neural asociada a trastornos o enfermedades de una manera que puede afectar al sistema nervioso.
Se puede emplear una etapa de monitorización del crecimiento de una neurona después de la etapa de administración de la composición.
En el presente documento se describe un ensayo para determinar si el crecimiento de las neuritas de un tipo particular de neurona a una edad particular se estimula o se inhibe en presencia de mielina o MAG y de un agente modulador de la arginasa. En una realización, el método comprende las etapas de:
a)
cultivar una primera muestra de un tipo seleccionado de células neuronales en un sustrato permisivo para el crecimiento que comprende mielina purificada;
b)
cultivar una segunda muestra del tipo seleccionado de células neuronales en un sustrato permisivo para el crecimiento que comprende mielina purificada y al menos un agente modulador de la arginasa añadido; y
c)
comparar la cantidad relativa de crecimiento de neuritas en las células cultivadas de a) y b);
en el que cuando el crecimiento relativo de las neuritas en las células cultivadas de b) es mayor que en a), el crecimiento de las neuritas del tipo seleccionado de células neuronales se estimula mediante el agente modulador de arginasa en presencia de mielina; y cuando el crecimiento relativo de las neuritas en las células cultivadas de b) es menor que en a), el crecimiento de las neuritas del tipo seleccionado de células neuronales se inhibe mediante el agente modulador de arginasa en presencia de mielina. El o los agentes moduladores de arginasa se pueden añadir antes, después o de forma simultánea con respecto a la adición de mielina a las células neuronales seleccionadas. Preferiblemente, la mielina es mielina purificada a partir del sistema nervioso central (SNC).
De forma alternativa, el método comprende las etapas de:
a)
cultivar una primera muestra de un tipo seleccionado de células neuronales en un sustrato permisivo para el crecimiento que comprende MAG;
b)
cultivar una segunda muestra del tipo seleccionado de células neuronales en un sustrato permisivo para el crecimiento que comprende MAG y al menos un agente modulador de la arginasa añadido; y
c)
comparar la cantidad relativa de crecimiento de neuritas en las células cultivadas de a) y b);
en el que cuando el crecimiento relativo de las neuritas en las células cultivadas de b) es mayor que en a), el crecimiento del tipo celular neuronal seleccionado se estimula mediante el agente modulador de arginasa en presencia de MAG; y cuando el crecimiento relativo de las neuritas en las células cultivadas de b) es menor que en a), el crecimiento de las neuritas del tipo celular neuronal seleccionado se inhibe mediante el agente modulador de arginasa en presencia de MAG. El o los agentes moduladores de arginasa se pueden añadir antes, después o de forma simultánea con respecto a la adición de MAG a las células neuronales seleccionadas.
Preferiblemente, el sustrato permisivo para el crecimiento que comprende MAG es una superficie que comprende moléculas de MAG unidas. Más preferiblemente, la superficie es una célula modificada para producir MAG en la superficie celular. También se prefiere que el sustrato permisivo para el crecimiento comprenda formas solubles de MAG.
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Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Biosíntesis de poliaminas - - Esquemática.
Figura 2: El Crecimiento Axonal Mejorado con MAG Inducido Mediante la Elevación de los Niveles de cAMP Es Dependiente de la Transcripción. (A) Se colocaron en placas neuronas cereberales aisladas a una densidad de 20.000 neuronas por pocillo en una monocapa de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban MAG (barras rayadas) o células CHO de control (barras negras), y se cultivaron durante la noche antes de fijarlas e inmunoteñirlas para GAP43 para visualizar las neuritas. Se midió la longitud de la neurita más larga por neurona, de 180-200 neuronas, y los resultados son la longitud media +/- EEM. Cuando se indica, se añadió a cada cultivo dibutiril cAMP (dbcA) 1 mM en presencia o ausencia del inhibidor de la transcripción, 5,6-dicloro-1-b-D-ribofuranosilbencimidazol (DRB) a 5 \muM. (B) Se colocaron en placas neuronas cereberales (1 x 10^{6}) en poli-L-lisina y se cultivaron durante la noche con factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) a 200 ng/ml (denominado sensibilización) en presencia o ausencia de DRB a 5 \muM, antes de transferirlas a monocapas de células
CHO.
Figura 3: El Crecimiento Axonal Mejorado con Mielina Inducido Mediante la Elevación de los Niveles de cAMP Es Dependiente de la Transcripción. (A) Se colocaron en placas neuronas cereberales aisladas a una densidad de 20.000 neuronas por pocillo en un sustrato de mielina de SNC purificada y se cultivaron durante la noche antes de fijarlas e inmunoteñirlas para GAP43. Se midió la longitud de la neurita más larga por neurona, de 180-200 neuronas, y los resultados son la longitud media +/- EEM. Cuando se indica, se añadió a cada cultivo dibutiril cAMP (dbcA) 1 mM en presencia o ausencia del inhibidor de la transcripción, 5,6-dicloro-1-b-D-ribofuranosilbencimidazol (DRB) a 5 \muM. (B) Se colocaron en placas neuronas cereberales (1 x 10^{6}) en poli-L-lisina y se cultivaron durante la noche con factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) a 200 ng/ml, (denominado sensibilización) en presencia o ausencia de DRB a 5 \muM, antes de transferirlas al sustrato de mielina de SNC.
Figura 4: La Sensibilización de las Neuronas con Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro (BDNF) o Dibutiril (Db) cAMP Estimula los Niveles de ARN de Arginasa I en las Neuronas Cereberales. El ARN aislado de neuronas cereberales sin tratamiento (carril 2), de neuronas cereberales expuestas durante la noche a BDNF (200 ng/ml) (carril 3) o dbcAMP (1 mM) (carril 4), se sometió a transcripción inversa y a PCR semicuantitativa (A); o PCR cuantitativa (B); mediante el uso de cebadores específicos para arginasa I. Como control positivo, el ARN aislado de tejido hepático se sometió a procedimientos de RT-PCR y de PCR cuantitativa mediante el uso de los mismos cebadores ((A), carril 1; (B), "Hígado").
Figura 5: La Proteína Arginasa I Se Estimula en las Neuronas Cereberales tras el Tratamiento con dbcAMP, BDNF o GDNF durante Diversos Periodos de Tiempo. Las neuronas cereberales se dejaron sin tratar (-) o se expusieron a (A) 200 ng/ml de BDNF o (B) dbcAMP 1 mM durante 1 hora (h), 3 h, 21 h o 24 h; o (C) 200 ng/ml de GDNF (+) durante 1 h, 3 h o 5 h, y las células se lisaron en presencia de inhibidores de proteasas. La proteína total (23 \mug) se sometió a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (12%) (SDS-PAGE), se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se inmunotiñó con un anticuerpo hacia Arg I. Las flechas indican la posición del polipéptido de
ArgI.
Figura 6: Un Inhibidor de Ornitina Descarboxilasa (ODC) Anula el Efecto Bloqueante de dbcAMP en la Inhibición del Crecimiento Axonal Mediante MAG y Mielina. Se colocaron en placas neuronas cereberales con (A) células CHO que expresaban MAG (barras rayadas) o células CHO de control (barras negras); o (B) un sustrato de mielina de SNC purificada, en presencia (+) o ausencia (-) de dbcAMP (dbcA) 1 mM y/o hidrocloruro de DL-a-difluorometil-ornitina (DFMO) 1 mM, y se cultivaron durante la noche antes de fijarlas e inmunoteñirlas para GAP43. Se midió la neurita más larga de al menos 180-200 neuronas. Los resultados se muestran como la longitud media de las neuritas +/-
EEM.
Figura 7: Un Inhibidor de ODC Bloquea el Efecto Sensibilizante de BDNF sobre la Inhibición por MAG o Mielina y la Putrescina Lo Restablece. Se sensibilizaron neuronas cereberales durante la noche con o sin BDNF (200 ng/ml), en presencia o ausencia de DFMO (1 mM), con o sin putrescina (10 \muM), antes de transferirlas a (A) células CHO que expresaban MAG (barras rayadas) o de control (barras negras); o (B) un sustrato de mielina de SNC purificada. Tras una incubación adicional, las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para GAP43. Se midió la neurita más larga de cada neurona para 180-200 neuronas. Los resultados se muestran como la longitud media de las neuritas +/-
EEM.
Figura 8: Un Inhibidor de ODC Bloquea el Efecto Sensibilízante de GDNF en la Inhibición por MAG. Se sensibilizaron neuronas cereberales con (+) o sin (-) GDNF (200 ng/ml) en presencia (+) o ausencia (-) de DFMO (1 mM) antes de transferirlas a células CHO que expresaban MAG (barras rayadas) o de control (barras negras). Tras una incubación adicional, las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para GAP43. Se midió la neurita más larga de cada neurona para 180-200 neuronas. Los resultados se muestran como la longitud media de las neuritas +/-
EEM.
Figura 9: El Tratamiento con Putrescina Sola Es Suficiente para Superar la Inhibición y Permitir el Crecimiento Posterior con MAG o Mielina. Se sensibilizaron neuronas cereberales durante la noche con putrescina a concentraciones crecientes que oscilaban en el intervalo 0-100 \muM. Las neuronas sensibilizadas se transfirieron a células CHO que expresaban MAG o células de control (A) o a un sustrato de mielina de SNC (B) para una incubación adicional. Las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron después para GAP43. Se midió la neurita más larga de cada neurona para 180-200 neuronas. Los resultados se muestran como el porcentaje del control. (A) El 100% es la longitud media de las neuritas +/- EEM de las neuronas sensibilizadas sin putrescina y cultivadas posteriormente con células CHO de control. (B) El 100% es la longitud media de las neuritas +/- EEM de las neuronas sensibilizadas sin putrescina y cultivadas posteriormente con sustrato de mielina de SNC.
Figura 10: La Expresión de Arginasa Se Incrementa Después De una Lesión Condicionante del Nervio Ciático de Neuronas DRG y Este Incremento Se Correlaciona con la Capacidad de Crecer con MAG y Mielina. Se seccionó transversalmente el nervio ciático del lado izquierdo a nivel de la mitad del muslo en ratas en la etapa P 18. En los momentos indicados tras la lesión, se aislaron los ganglios de la raíz dorsal (DRG) del lado lesionado (I) y del lado contralateral sin lesionar (C), se extrajeron las proteínas y se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia mediante el uso de un anticuerpo policlonal anti-arginasa I. U = control sin operar. La flecha indica la posición del polipéptido de ArgI.
Figura 11: La Sobreexpresión de Arginasa en las Neuronas Cereberales Mediante Transferencia Génica Mediada por Adenovirus Es Suficiente para Superar la Inhibición por MAG y Mielina. Se colocaron en placas de 24 pocillos las neuronas cereberales (1x10^{6}) y se infectaron con adenovirus que contenían ArgI-GFP o GFP solo. Tras el cultivo durante la noche, las neuronas infectadas se transfirieron a células CHO que expresaban MAG (barras rayadas) o de control (barras negras) para el crecimiento de las neuritas. Las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para GAP43. Las neuronas con tinción doble de GAP43 y GFP se consideraron infectadas positivamente. Se midió la longitud de la neurita más larga por neurona para 120-150 neuronas infectadas positivamente. (A) Las neuronas infectadas positivamente con ArgI se tiñen doblemente con GAP43 y GFP. (B) Transferencia de Western de 5 \mug de lisados de proteínas de neuronas infectadas con adenovirus-ArgI y GFP solamente. La flecha indica la posición del polipéptido de ArgI. (C) Los resultados se muestran como la longitud media de las neuritas +/- EEM de las neuronas infectadas con GFP (GFP) o infectadas con ArgI (ArgI) cultivadas con MAG.
Figura 12: La Expresión de Arginasa Es Elevada en las Neuronas DRG Jóvenes que No Se Inhiben, y Es Menor en las Neuronas Más Viejas que Se Inhiben, por MAG y Mielina. Se aislaron neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) del día posnatal P0 - P7 y se lisaron con tampón RIPA. Los 32 \mug de proteínas totales se sometieron a SDS-PAGE (12%) antes de transferirlos a una membrana de nitrocelulosa e inmunoteñirlos con un anticuerpo hacia ArgI. La flecha indica la posición del polipéptido de ArgI.
Figura 13: La Capacidad de las Neuronas DRG Jóvenes de Crecer con MAG y Mielina se Bloquea Mediante el Inhibidor de ODC, DFMO. Se aislaron neuronas DRG del día posnatal 1 (P1) y se colocaron en placas con células CHO que expresaban MAG (barras rayadas) o de control (barras negras), con (+) o sin (-) DFMO 1 mM. Tras la incubación durante la noche, las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para GAP 43. Se midió la neurita más larga de cada una de 120-150 neuronas DRG. Los resultados se muestran como la longitud media de las neuritas +/-
EEM.
Figura 14: La Sobreexpresión de Arginasa en las Neuronas DRG Más Viejas Mediante la Transferencia Génica Mediada por Adenovirus es Suficiente para Superar la Inhibición por MAG. Se colocaron en placas de 24 pocillos las neuronas DRG del día posnatal 5 (0,5 x 10^{6}) y se infectaron con adenovirus que contenían ArgI-GFP o GFP solamente. Tras el cultivo durante la noche, las neuronas infectadas se transfirieron a células CHO que expresaban MAG (barras rayadas) o de control (barras negras) para el crecimiento de las neuritas. Las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para GAP43. Las neuronas con una tinción doble de GAP43 y GFP se consideraron infectadas positivamente. Se midió la longitud de la neurita más larga para 120-150 neuronas infectadas positivamente. Los resultados se muestran como la longitud media de las neuritas +/- EEM de las neuronas infectadas con GFP (GFP) o de las neuronas infectadas con ArgI (ArgI) cultivadas con MAG.
Descripción detallada de la invención
Para que la invención descrita en el presente documento se pueda comprender completamente, se expone la siguiente descripción detallada.
Definiciones y Técnicas Generales
A menos que se defina de otra manera en el presente documento, las expresiones científicas y técnicas usadas con respecto a la presente invención tendrán los significados que entienden normalmente las personas de experiencia habitual en la técnica. Además, a menos que sea necesario de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán las formas plurales, y los términos plurales incluirán las formas singulares. En general, las nomenclaturas usadas con respecto al, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, neurobiología, genética y química de proteínas y de ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son las conocidas y usadas normalmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se llevan a cabo en general según los métodos convencionales conocidos en la técnica, y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a lo largo de toda la presente memoria descriptiva, a menos que se indique de otra manera. Véase, p.ej., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 y los suplementos hasta 2001); Crawley et al., Current Protocols in Neuroscience, John Wiley and Sons (1997 y los suplementos hasta 2001); Kleitman et al., Culturing Nerve Cells, págs. 337-78, MIT Press, Cambridge, MA/Londres, Inglaterra (G. Banker y K. Goslin, Eds.) (1991); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Las reacciones enzimáticas y las técnicas de cultivo celular y de purificación se llevan a cabo según las instrucciones del fabricante, tal como se llevan a cabo normalmente en la técnica o como se describen en el presente documento. Las nomenclaturas usadas con respecto a, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son las conocidas y usadas normalmente en la técnica. Las técnicas habituales se usan para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación, formulación, y administración farmacéutica, y el tratamiento de los pacientes.
Las siguientes expresiones, a menos que se indique de otra manera, se entenderá que tienen los siguientes significados:
El término "arginasa" se refiere a una enzima que es capaz de catalizar la conversión del aminoácido arginina (arg) a ornitina. Tal conversión se puede estudiar mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos para los expertos en la técnica, que incluyen los ensayos enzimáticos que usan un sustrato marcado o detectable de otra manera. En una realización preferida, la arginasa se obtiene de una célula mamífera, p.ej., de rata, ratón, bovina humana. En una realización más preferida, la arginasa se obtiene mediante la expresión de un polinucleótido derivado de una célula mamífera, p.ej., de rata, ratón, bovina o humana, tal como de: a) la secuencia polinucleotídica hepática de ArgI humana (nº de acceso de GenBank NM 000045 y las referencias citadas en ese documento, las cuales se incorporan en el presente documento como referencia); b) la secuencia polinucleotídica de ArgII humana (nº de acceso de GenBank NM 001172 y las referencias citadas en ese documento, las cuales se incorporan en el presente documento como referencia); o c) de una secuencia polinucleotídica de arginasa que hibrida en condiciones rigurosas con a) o b). En una realización aún más preferida, la arginasa se obtiene mediante la expresión de un polinucleótido derivado de una neurona o célula glial de mamífero.
La expresión "actividad de arginasa" se refiere a una actividad enzimática de una arginasa, o una muteína, proteína homóloga, análogo, derivado, fusión o fragmento de la misma, que cataliza la conversión de arginina (arg) a ornitina. Los ensayos enzimáticos de arginasa son bien conocidos para los expertos en la técnica. En una realización preferida, una característica de la actividad de arginasa, p.ej., las constantes de asociación y disociación, las velocidades catalíticas y las velocidades de recambio de sustrato, es igual que esa característica poseída por la arginasa expresada a partir de la secuencia polinucleotídica hepática de ArgI humana (nº de acceso de GenBank NM 000045 y las referencias citadas en ese documento). En otra realización preferida, la actividad de arginasa es diferente de la de una arginasa expresada a partir de la secuencia polinucleotídica hepática de ArgI humana (nº de acceso de GenBank NM 000045 y las referencias citadas en ese documento). Una actividad de arginasa que es diferente puede ser una, p.ej., que tiene un incremento o disminución de la actividad catalítica, o que tiene una constante de asociación y/o disociación diferente en comparación con la de una arginasa expresada a partir de la secuencia polinucleotídica hepática de ArgI humana (nº de acceso de GenBank NM 000045 y las referencias citadas en ese documento).
Un agente que altera o modula la "actividad", "bioactividad" o "actividad biológica" de la arginasa en una neurona se refiere a un agente que puede incrementar (agonista) o disminuir (antagonista) directamente o finalmente la actividad enzimática de la arginasa (la conversión de arginina a ornitina), o los resultados inmediatamente medibles de tal actividad (p.ej., síntesis incrementada de ornitina y de poliaminas derivadas) en una neurona. La actividad de arginasa se puede modular alterando los niveles de la proteína o del ADN o ARN que codifican la arginasa, o de un agente modulador de la arginasa en una neurona. La actividad de arginasa se puede modular también mediante la mutación o la alteración directa de una molécula polinucleotídica o polipeptídica de arginasa. Tales mutaciones o alteraciones incluyen, pero sin limitación, aquellas que alteran una constante de afinidad por el sustrato o la velocidad de unión, una velocidad de disociación del sustrato, la velocidad catalítica o de recambio de la enzima, y la constante de unión de una subunidad de arginasa a otra subunidad o molécula homóloga o heteróloga que afecta (incrementa o disminuye) la catálisis por parte de la molécula de arginasa. La actividad de arginasa en una neurona se puede modular también mediante la asociación (covalente o no covalente) con otro agente o factor.
La actividad de arginasa se puede medir directamente mediante ensayos enzimáticos específicos de arginasa (mencionados más adelante) o indirectamente ensayando los niveles de ácidos nucleicos que codifican la arginasa en una célula (p.ej., mediante RT-PCR, análisis de transferencia de Northern u otros métodos para medir los niveles de un ARN en estado estable que codifica la arginasa), o las moléculas proteicas específicas de arginasa en una célula (p.ej., mediante una diversidad de procedimientos de inmunoafinidad, que incluyen las técnicas de transferencia de Western, ensayos ELISA, y similares), todas las cuales son técnicas que son muy conocidas para los expertos en la técnica, y que se describen en el presente documento.
La actividad de arginasa a modular según la invención se puede expresar a partir de un polinucleótido o polipéptido de tipo natural (endógeno o exógeno) que codifica la arginasa. La actividad se puede expresar también a partir de un polinucleótido o proteína modificado que codifica arginasa, lo que incluye, pero sin limitación, muteínas, análogos, fusiones o fragmentos de los mismos que tienen actividad biológica de arginasa en una neurona.
Las expresiones "crecimiento axonal" o "regeneración axonal", como se usan en el presente documento, se refieren tanto a la capacidad de un axón para crecer como a la capacidad de un axón para brotar. Un brote de un axón se define como una nueva prolongación que se extiende desde un axón existente o en crecimiento (véase, p.ej., Ma et al., Nat. Neurosci., 2, págs. 24-30 (1999)).
El término "MAG" se refiere a la glicoproteína asociada a la mielina, que es una molécula derivada de la mielina que estimula o inhibe el crecimiento y la regeneración neuronal en el SNC y en el SNP, dependiendo del tipo de célula y de la etapa del desarrollo de la neurona. El término "MAG" se refiere también a un "derivado de MAG", que es una molécula que comprende al menos un dominio extracelular de MAG, en la que la molécula de MAG se ha alterado (p.ej., mediante técnicas de ADN recombinante para hacer una quimera con porciones de otras moléculas fusionadas a la molécula de MAG, o mediante modificación química o enzimática), o se ha mutado (p.ej., deleciones internas, inserciones, reordenamientos y mutaciones puntuales). Los derivados de MAG, a menos que se indique de otra manera, mantienen la actividad de MAG.
Las expresiones "bioactividad de MAG" y "actividad biológica de MAG" se refieren a la capacidad de una molécula, especialmente una forma alterada o mutante de MAG, de inhibir o estimular el crecimiento de las neuritas de un tipo celular neuronal seleccionado de una edad particular, tal como se detecta en un ensayo de crecimiento de neuritas tal como los descritos en el presente documento, en la misma dirección cualitativa que la MAG soluble o de superficie celular. La expresión "actividad de unión de MAG" se refiere a la capacidad de una molécula, especialmente una forma alterada o mutante de MAG, de competir con la MAG de la superficie celular o la MAG soluble por la unión a neuronas dependiente de ácido siálico en un ensayo tal como los descritos en el presente documento. Por ejemplo, los inhibidores preferidos de MAG mantienen la actividad de unión de MAG, pero tienen una bioactividad de MAG reducida o ausente. La expresión "actividad de MAG" se refiere de forma genérica a la bioactividad de MAG y a la actividad de unión, tal como se describieron anteriormente.
La expresión "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 15 bases de longitud, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleótidos. La expresión incluye las formas monocatenarias y bicatenarias del ADN y el ARN, y las orientaciones codificante y complementaria con respecto a las secuencias codificantes. Además, un polinucleótido puede incluir nucleótidos naturales y/o modificados unidos entre sí mediante enlaces nucleotídicos naturales y/o no naturales.
La expresión "nucleótido natural" mencionada en el presente documento incluye los desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos naturales. La expresión "nucleótidos modificados" mencionada en el presente documento incluye los nucleótidos con grupos de hidratos de carbono modificados o sustituidos y similares. La expresión "enlaces nucleotídicos" mencionada en el presente documento incluye los enlaces nucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, fosforodiselenato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, p.ej., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al., patente de EE.UU. nº 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como referencia.
La expresión "variante alélica" se refiere a una de dos o más formas naturales alternativas de un gen, en las que cada gen posee una secuencia nucleotídica única. En una realización preferida, los alelos diferentes de un gen dado tienen propiedades biológicas similares o idénticas.
A menos que se especifique de otra manera, el extremo de la izquierda de una secuencia polinucleotídica en la orientación codificante es el extremo 5', y el extremo de la derecha de la secuencia es el extremo 3'. Además, la dirección hacia la izquierda de una secuencia polinucleotídica en la orientación codificante se denomina dirección 5', mientras la dirección hacia la derecha de la secuencia polinucleotídica se denomina dirección 3'.
La expresión "porcentaje de identidad de secuencias" o "idéntico", en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos, se refiere a los residuos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para proporcionar una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de la identidad de secuencias puede ser a lo largo un tramo de al menos alrededor de nueve nucleótidos, habitualmente al menos alrededor de 20 nucleótidos, más habitualmente al menos alrededor de 24 nucleótidos, generalmente al menos alrededor de 28 nucleótidos, más generalmente al menos alrededor de 32 nucleótidos, y preferiblemente al menos alrededor de 36 o más nucleótidos. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencias nucleotídicas. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas se pueden comparar mediante el uso de FASTA, BLAST, Gap o Bestfit, que son programas informáticos del Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad de secuencias de las regiones con mejor coincidencia entre la secuencia problema y la secuencia de búsqueda (Pearson, 1990). Para fines definitorios, el porcentaje de identidad de secuencias entre las secuencias de ácidos nucleicos se puede determinar mediante el uso de FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o mediante el uso de Gap con sus parámetros por defecto tal como se proporciona en GCG Version 6.1.
La expresión "homología sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma óptima con las inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay una identidad de secuencias nucleotídicas de al menos alrededor del 55%, más preferiblemente del 60% de las bases nucleotídicas, habitualmente al menos alrededor del 70%, más habitualmente al menos alrededor del 80%, preferiblemente al menos alrededor del 90%, y más preferiblemente al menos alrededor del 95-98% de las bases nucleotídicas, tal como se mide mediante cualquier algoritmo de identidad de secuencias conocido, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se discutió anteriormente.
De forma alternativa, existe homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo hibrida con otro ácido nucleico, con una cadena de otro ácido nucleico, o con la cadena complementaria del mismo, en condiciones de hibridación selectivas. Generalmente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando existe al menos un 55% de identidad de secuencias, preferiblemente al menos alrededor del 65%, más preferiblemente al menos alrededor del 75%, y lo más preferiblemente al menos alrededor del 90%, a lo largo de un tramo de al menos alrededor de 14 nucleótidos. Véase, p.ej., Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12, págs. 203-13, (1984).
La hibridación de los ácidos nucleicos se verá afectada por condiciones tales como la concentración salina, la temperatura, los disolventes, la composición de bases de las especies que hibridan, la longitud de las regiones complementarias, y el número de emparejamientos incorrectos de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos que hibridan, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Las "condiciones de hibridación rigurosas" y las "condiciones de lavado rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, dependen de varios parámetros físicos diferentes. Los parámetros más importantes incluyen la temperatura de hibridación, la composición de bases de los ácidos nucleicos, la concentración salina y la longitud del ácido nucleico. Alguien que tenga experiencia habitual en la técnica conoce cómo variar estos parámetros para conseguir una rigurosidad particular de hibridación. En general, la "hibridación rigurosa" se lleva a cabo a alrededor de 25ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para el híbrido de ADN específico en un grupo particular de condiciones. El "lavado riguroso" se lleva a cabo a temperaturas de alrededor de 5ºC menores que la Tm para el híbrido de ADN específico en un grupo particular de condiciones. La Tm es la temperatura a la cual el 50% de la secuencia de interés hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Véase Sambrook et al., anteriormente mencionado, página 9.51, incorporado en el presente documento como referencia.
La Tm para un híbrido ADN-ADN particular se puede estimar mediante la fórmula:
Tm = 81.5^{o}C + 16.6\ (log10[Na+]) + 0.41\ (fracción\ G + C) - 0.63\ (%\ de\ formamida) - (600/l)
en la que l es la longitud del híbrido en pares de bases.
La Tm para un híbrido ARN-ARN particular se puede estimar mediante la fórmula:
Tm = 79.8^{o}C + 18.5\ (log10[Na+])\ + 0.58\ (fracción\ G + C)\ + 11.8\ (fracción\ G + C) 2 - 0.35\ (%\ de\ formamida) - (820/l).
La Tm para un híbrido ARN-ADN particular se puede estimar mediante la fórmula:
Tm = 79.8^{o}C + 18.5(log10[Na+]) + 0.58\ (fracción\ G\ + C) + 11.8\ (fracción\ G + C) 2 - 0.50\ (%\ de\ formamida) - (820/l).
En general, la Tm disminuye 1-1,5ºC por cada 1% de emparejamientos incorrectos entre dos secuencias de ácidos nucleicos. Así, una persona de experiencia habitual en la técnica puede alterar las condiciones de hibridación y/o de lavado para obtener secuencias que tengan grados mayores o menores de identidad de secuencias respecto del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos que hibriden que contengan hasta un 10% de emparejamientos incorrectos respecto de la secuencia de ácido nucleico objetivo, se restarían 10-15ºC de la Tm calculada para un híbrido perfectamente emparejado, y después se ajustarían en consecuencia las temperaturas de hibridación y de lavado. Las sondas pueden hibridar también específicamente al ADN bicatenario en ciertas condiciones para formar una molécula triple u otros complejos de ADN de grado superior. La preparación de tales sondas y las condiciones de hibridación adecuadas se conocen en la técnica.
Como se define en el presente documento, las condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos complementarios que tengan más de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern o para el cribado de una biblioteca es un 50% de formamida/SSC 6X a 42ºC durante al menos diez horas. Los tampones de hibridación pueden incluir también agentes bloqueantes para disminuir la señal de fondo. Estos agentes se conocen bien la técnica. Véase Sambrook et al., anteriormente mencionado, páginas 8.46 y 9.46-9.58.
Como apreciarán los expertos en la técnica, las condiciones de lavado se pueden alterar también para cambiar las condiciones de rigurosidad. Como se definió en el presente documento, una condición de lavado riguroso para el ADN bicatenario de más de 100 pares de bases es un lavado con SSC 0,2x a 65ºC durante 15 minutos (véase Sambrook et al., anteriormente mencionado, para el tampón SSC). El lavado de rigurosidad elevada va precedido preferiblemente por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la sonda de la molécula bicatenaria (SSC 4x 40ºC durante 15 minutos). En general, una proporción señal/ruido de 2x o superior respecto de la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.
Como se define en el presente documento, los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas son todavía sustancialmente homólogos entre sí si codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos entre sí. Esto ocurre, por ejemplo, cuando un ácido nucleico se crea de manera sintética o recombinante mediante el uso de una elevada degeneración de códones, tal como permite la redundancia del código genético.
Los polinucleótidos que codifican la arginasa de esta invención pueden incluir tanto las cadenas codificantes como las complementarias de ARN, cADN, ADN genómico, y las formas sintéticas y los polímeros mixtos de las anteriores. Se pueden modificar químicamente o bioquímicamente, o pueden contener bases nucleotídicas naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, las etiquetas (p.ej., etiquetas fluorescentes, fotométricas, radiactivas o inmunológicas), metilación, fosforilación, biotinilización, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como los enlaces sin carga (p.ej., metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (p.ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (p.ej., polipéptidos), intercaladores (p.ej., acridina, psoraleno, etc.), agentes quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (p.ej., ácidos nucleicos anoméricos \alpha, etc.). También están incluidas las moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en cuanto a su capacidad de unirse a una secuencia designada por medio de enlaces de hidrógeno y de otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces peptídicos sustituyen a los enlaces fosfato en el esqueleto de la molécula.
El término "mutado", cuando se aplica a secuencias de ácidos nucleicos, significa que los nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico se pueden insertar, delecionar o cambiar en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia. Se puede hacer una única alteración en un locus (una mutación puntual) o se pueden insertar, delecionar o cambiar múltiples nucleótidos en un único locus. Además, se puede hacer una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de ácido nucleico. En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico es la secuencia de ácido nucleico de tipo natural de la arginasa. La secuencia de ácido nucleico se puede mutar mediante cualquier método conocido en la técnica.
Las secuencias de control de la expresión "unidas de manera operable" se refieren a una unión en la que la secuencia de control de la expresión está contigua al gen de interés para controlar el gen de interés, así como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a cierta distancia para controlar el gen de interés.
La expresión "secuencia de control de la expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a las secuencias polinucleotídicas que son necesarias para afectar a la transcripción hasta ARN, y, cuando sea apropiado, la expresión de las secuencias que codifican la proteína, a partir de las secuencias polinucleotídicas a las cuales están unidas de manera operable las secuencias de control de la expresión. Las secuencias de control de la expresión son secuencias que controlan la transcripción, los sucesos postranscripcionales y la traducción de las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, secuencias promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento del ARN eficaces tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que incrementan la eficacia de la traducción (p.ej., sitios de unión al ribosoma); secuencias que incrementan la estabilidad de la proteína; y, cuando se desee, secuencias que incrementan la secreción de la proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en los procariotas, tales secuencias de control incluyen en general un promotor, un sitio de unión al ribosoma, y una secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de fusión.
El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el que los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma de un virus que infecta una célula hospedadora particular de interés. Se han desarrollado muchos vectores virales para la transferencia génica a células de mamíferos. A menudo el genoma viral se ha modificado para eliminar genes virales que no son esenciales para la infección o la replicación posterior del virus y la expresión de los genes en una célula hospedadora apropiada. Algunas células hospedadoras se han modificado para expresar productos génicos necesarios para la replicación y la expresión del vector viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (p.ej., los vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano). Otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y por lo tanto se replican junto con el genoma hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de manera operable. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión").
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debería entender que tales expresiones pretenden referirse no solamente a la célula particular, sino a la progenie de tal célula. Debido a que pueden darse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias del medio, tal progenie puede no ser idéntica, de hecho, a la célula original, pero está incluida todavía dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora", tal como se usa en el presente documento.
El término "polipéptido" abarca las proteínas y polipéptidos naturales y no naturales, fragmentos, fusiones, mutantes, derivados y análogos de polipéptidos. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
La expresión "fragmento polipeptídico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción aminoterminal y/o carboxiterminal en comparación con un polipéptido de tamaño completo. En una realización preferida, el fragmento polipeptídico es una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones correspondientes de la secuencia natural. Los fragmentos tienen en general una longitud de al menos 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 12, 14, 16 ó 18 aminoácidos, más preferente una longitud de al menos 20 aminoácidos, más preferiblemente al menos 25, 30, 35, 40 ó 45 aminoácidos, e incluso más preferiblemente una longitud de al menos 50 ó 60 aminoácidos, e incluso más preferiblemente una longitud de al menos 70 aminoácidos.
Un "derivado" se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en la secuencia estructural primaria pero que incluyen, p.ej., modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se hallan en el polipéptido nativo. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, la acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, el marcaje, p.ej., con radionucleidos, restos fluorescentes o biotina, y diversas modificaciones enzimáticas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Se conocen en la técnica una diversidad de métodos para el marcaje de polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles para tales fines, e incluyen los isótopos radiactivos tales como 125I, 32P, 35S, y 3H, los ligandos que se unen a antiligandos marcados (p.ej., anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas, y antiligandos que pueden servir como miembros complementarios de unión específica para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad necesaria, la facilidad de conjugación con el cebador, los requisitos de estabilidad, y la instrumentación disponible. Los métodos para marcar polipéptidos se conocen en la técnica. Véase, p.ej., Ausubel et al., 1992.
La expresión "proteína de fusión" se refiere a los polipéptidos que comprenden polipéptidos o fragmentos acoplados a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles, porque se pueden construir para que contengan dos o más elementos funcionales deseados de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferente al menos 20 ó 30 aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 40, 50 ó 60 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 75, 100 ó 125 aminoácidos. Las proteínas de fusión se pueden producir de manera recombinante mediante la construcción de una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido diferente, y después mediante la expresión de la proteína de fusión. De forma alternativa, una proteína de fusión se puede producir químicamente entrecruzando el polipéptido o un fragmento del mismo con otra proteína.
El término "análogo" se refiere tanto a los análogos polipeptídicos como a los análogos no polipéptidos. La expresión "análogo polipeptídico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que está compuesto de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial respecto de una porción de una secuencia de aminoácidos y que tiene actividad enzimática. Generalmente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o inserción o deleción) con respecto a la secuencia natural. Los análogos generalmente tienen una longitud de al menos 20 aminoácidos, preferiblemente al menos 50 aminoácidos o más, y a menudo pueden tener la longitud de un polipéptido natural de tamaño completo.
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La expresión "análogo no polipeptídico" se refiere a un compuesto con propiedades que son análogas a las de un polipéptido de referencia. Un compuesto no peptídico se puede denominar también molécula "mimética peptídica" o "peptidomimética". Véase, p.ej., Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS pág. 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de la modelización molecular computerizada. Se pueden usar moléculas miméticas peptídicas que son estructuralmente similares a los péptidos útiles para producir un efecto equivalente. En general, las moléculas peptidomiméticas son estructuralmente similares a un polipéptido ejemplar (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como una arginasa, pero que tienen uno o más enlaces peptídicos sustituidos opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: - -CH_{2}NH- -, - -CH_{2}S- -, - -CH_{2}-CH_{2}- -, - -CH=CH- - (cis y trans), - -COCH_{2}- -, - -CH(OH)CH_{2}- -, y -CH_{2}SO- -, mediante métodos conocidos en la técnica. También se puede usar la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (p.ej., D-lisina en vez de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos con limitaciones espaciales que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)); por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
Un "mutante polipeptídico" o "muteína" se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene sustituciones, inserciones o deleciones de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo natural. Una muteína puede tener una o más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que un único aminoácido en una posición se ha cambiado por otro aminoácido, una o más inserciones y/o deleciones, en las que uno o más aminoácidos se insertan o se eliminan, respectivamente, en la secuencia de la proteína natural, y/o truncamientos de la secuencia de aminoácidos en alguno o en ambos extremos aminoterminal o carboxiterminal. Además, una muteína puede tener la misma actividad biológica o una actividad biológica diferente en comparación con la proteína natural. Por ejemplo, una muteína puede tener una actividad biológica incrementada o disminuida. En una realización preferida de la presente invención, una muteína tiene la misma actividad de arginasa o una actividad de arginasa incrementada en comparación con la arginasa natural. Una muteína tiene al menos un 50% de homología de secuencias respecto de la proteína de tipo natural, preferiblemente un 60% de homología de secuencias, más preferiblemente un 70% de homología de secuencias. Las muteínas aún más preferidas tienen un 80%, 85% o 90% de homología de secuencias respecto de la proteína de tipo natural. En una realización aún más preferida, una muteína exhibe un 95% de identidad de secuencias, aún más preferiblemente un 97%, incluso más preferiblemente un 98% e incluso más preferiblemente un 99%. La homología de secuencias se puede medir mediante cualquier algoritmo de análisis de secuencias habitual, tal como Gap o Bestfit.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para la formación de complejos proteicos, (4) alteran la afinidad de unión o la actividad enzimática, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica natural. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera de el/los dominio(s) que forma(n) los contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservativa no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (p.ej., un aminoácido de sustitución no debería tender a romper una hélice que se da en la secuencia original, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia original). Los ejemplos de estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Compañía, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991).
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas cumplen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).
Una proteína tiene "homología" o es "homóloga" a una proteína de otro organismo si la secuencia de aminoácidos codificada de la proteína tiene una secuencia similar respecto de la secuencia de aminoácidos codificada de una proteína de un organismo diferente. De forma alternativa, una proteína puede tener homología o ser homóloga a otra proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares. Aunque se dice que las dos proteínas son "homólogas", esto no implica que haya necesariamente una relación evolutiva entre las proteínas. En cambio, el término "homólogo" significa que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares. En una realización preferida, una proteína homóloga es una que exhibe al menos un 55% de identidad de secuencias respecto de la proteína de referencia natural, preferiblemente un 60% de identidad de secuencias, más preferiblemente un 70% de identidad de secuencias. Se prefieren aún más las proteínas homólogas que exhiben un 80%, 85% o 90% de identidad de secuencias respecto de la proteína de referencia. En una realización aún más preferida, una proteína homóloga exhibe un 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencias. Además, aunque en muchos casos las proteínas con secuencias de aminoácidos similares tendrán funciones similares, el término "homólogo" no implica que las proteínas deban ser similares funcionalmente entre sí.
Cuando se usa "homólogo" con referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren a menudo por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo en la cadena lateral con propiedades químicas similares (p.ej., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencias o el grado de homología se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los expertos en la técnica conocen los medios para hacer este ajuste (véase, p.ej., Pearson et al., 1994).
Los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1)
Serina (S), Treonina (T);
2)
Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E);
3)
Asparagina (N), Glutamina (Q);
4)
Arginina (R), Lisina (K);
5)
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V), y
6)
Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
La homología de secuencias para los polipéptidos, que se denomina también identidad de secuencias, se mide generalmente mediante el uso de programas informáticos de análisis de secuencias. Véase, p.ej., el Paquete Informático de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group (GCG), Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El programa informático de análisis de proteínas ajusta las secuencias similares mediante el uso de la medida de la homología asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, que incluyen las sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "BLASTP", "Gap" y "Bestfit", que se pueden usar con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencias o la identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véase, p.ej., GCG Version 6.1.
La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para la determinación de la homología será en general de al menos alrededor de 16 residuos de aminoácidos, normalmente al menos alrededor de 20 residuos, más normalmente al menos alrededor de 24 residuos, generalmente al menos alrededor de 28 residuos, y preferiblemente más de alrededor de 35 residuos. Al realizar una búsqueda en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar las secuencias de aminoácidos.
La búsqueda en bases de datos mediante el uso de las secuencias de aminoácidos se puede medir mediante algoritmos, tales como BLASTP, conocidos en la técnica. Para fines definitorios del porcentaje de identidad de secuencias entre secuencias de aminoácidos, las secuencias polipeptídicas se comparan preferiblemente mediante el uso de FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), tal como se proporciona en GCG Version 6.1. FASTA proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencias de las regiones con mejor superposición entre la secuencia problema y la secuencia de búsqueda (Pearson, 1990).
El término "neurotrofina" se refiere a un factor trófico que ayuda a que una neurona sobreviva o crezca. Una neurotrofina eleva los niveles de AMP cíclico (cAMP) en una neurona.
El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios.
El término "poliamina derivada de putrescina" se refiere a una poliamina producida en una célula a partir de una molécula de putrescina o una molécula que se originó a partir de una molécula de putrescina. La molécula de putrescina puede ser una que se produce en la célula hospedadora o una que se transporta hacia la célula hospedadora.
Un "factor trófico" es una sustancia que ayuda a que una célula sobreviva o crezca, y que eleva los niveles de AMP cíclico (cAMP).
Un análogo de AMP cíclico (cAMP) no hidrolizable es un cAMP que tiene un enlace resistente a fosfodiesterasa, y que por lo tanto tiene una bioactividad mayor que una molécula de cAMP sin modificar. Los ejemplos incluyen dibutiril cAMP (dbcAMP) (Posternak y Weimann, Methods Enzymol., 38, págs. 399-409 (1974)); y Sp-cAMP (Dostmann et al., J. Biol. Chem., 265, págs. 10484-491 (1990)).
A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.
El Crecimiento Axonal Inducido Mediante AMP Cíclico con MAG o Mielina Depende de la Transcripción
Para determinar si el alivio inducido por cAMP de la inhibición del crecimiento axonal por MAG o mielina depende de la transcripción, se añadió un inhibidor transcripcional (5,6-dicloro-1-b-D-ribofuranosilbencimidazol o "DRB") a cultivos neuronales en los que los niveles de cAMP se habían incrementado (véase el Ejemplo 1). Como se muestra en la Figura 2, la elevación de los niveles de cAMP en las neuronas, mediante (A) la adición de dibutiril (db) cAMP directamente a las neuronas que crecen con células que expresan MAG o con células de control; o (B) la sensibilización con neurotrofinas (BDNF), bloquea la inhibición del crecimiento neuronal por MAG. Sin embargo, si el inhibidor transcripcional DRB se incluye en los cultivos, ni dbcAMP ni BDNF bloquean la inhibición; MAG todavía inhibe el crecimiento axonal. Así, la capacidad de dbcAMP y BDNF de bloquear la inhibición dependiente de MAG del crecimiento de las neuritas depende de la producción de uno o más ARNs, y, supuestamente, de la expresión de las proteínas codificadas.
Cuando se llevaron a cabo experimentos similares mediante el uso de mielina del SNC purificada como sustrato en lugar de células CHO que expresaban MAG (Ejemplo 1), se obtuvieron resultados similares (Fig. 3). El bloqueo de la inhibición dependiente de mielina mediado por niveles de cAMP elevados (mediante tratamiento con dbcAMP o mediante sensibilización con BDNF) se pierde completamente en presencia de un inhibidor transcripcional.
La Arginasa se Estimula Cuando se Elevan los Niveles de cAMP
A continuación se quiso determinar qué genes objetivo se estimulan mediante el cAMP elevado tras el tratamiento con dbcAMP o la sensibilización con neurotrofina (p.ej., BDNF y GDNF). Si la síntesis de poliaminas es importante en el bloqueo inducido por cAMP de la inhibición por MAG y mielina, parecería posible que los niveles de expresión de una o más de las enzimas biosintéticas de poliaminas estuvieran estimulados de forma coordinada. La arginasa (Arg), ornitina descarboxilasa (ODC) y S-adenosilmetionina descarboxilasa (SAM) son las primeras tres enzimas implicadas en la producción de poliaminas (Fig. 1). La arginasa es una enzima citosólica que convierte la arginina en ornitina y urea. Una etapa limitante de la velocidad en la síntesis de poliaminas es la conversión posterior de la ornitina en putrescina y CO_{2} por parte de la ornitina descarboxilasa (ODC). La putrescina se puede convertir después en otras poliaminas ("poliaminas derivadas de putrescina") (Fig. 1; véase también Slotkin y Bartolomé, 1986).
Para determinar si los niveles de cAMP elevados provocan una estimulación de la expresión de arginasa, se sensibilizaron neuronas cereberales con neurotrofinas (BDNF) o dbcAMP (Ejemplo 1), y se extrajo el ARN y las proteínas de las neuronas sensibilizadas (Ejemplo 2). El ARN extraído se usó como molde para la transcripción inversa y la amplificación mediante PCR con el uso de cebadores específicos para el gen que codifica la enzima arginasa I ("Arg I"), una isoforma de arginasa abundante en el tejido hepático, pero escasamente detectable en otros tejidos. Los resultados de la amplificación se muestran en la Figura 4.
Como se muestra en la Fig. 4(a), carril 1, existen niveles significativos de ARN de Arg I detectados en el hígado, un control positivo. También hay ARN de Arg I detectable en las neuronas cereberales (carril 2). Los niveles de ARN de Arg I se incrementaron tras la exposición de las neuronas a BDNF (carril 3) o dbcAMP (carril 4). La Fig. 4(b) muestra mediante PCR cuantitativa que hubo alrededor de dos veces menos ARN de Arg I en las neuronas cereberales sin tratar que en el hígado. Después del tratamiento de las neuronas cereberales con dbcAMP o BDNF, la cantidad de Arg I se incrementó significativamente (P<0,005) alrededor de un 50%.
Estos resultados demuestran que el tratamiento de las neuronas cereberales con dbcAMP o con una neurotrofina (BDNF) induce una estimulación del ARN que codifica la arginasa.
A continuación se estudió la expresión de ArgI en las neuronas cereberales a nivel proteico. Tras la exposición de las neuronas cereberales a dbcAMP o BDNF durante diversos tiempos, se lisaron las neuronas, se extrajeron las proteínas, y las proteínas extraídas se separaron mediante SDS-PAGE antes de transferirlas a una membrana e inmunoteñirlas con un anticuerpo policlonal contra arginasa I (véase el Ejemplo 2).
Como se muestra en la Figura 5, la proteína arginasa I (ArgI) es apenas detectable en las neuronas cereberales (flechas). Después de 1 hora de exposición de las neuronas cereberales a dbcAMP (A) o BDNF (B), la cantidad de proteínas ArgI se incrementó al menos al doble. Este incremento fue máximo alrededor de 3 horas tras el tratamiento, y se mantuvo durante 21 horas. 24 horas después de cada tratamiento, los niveles de proteínas ArgI comenzaron a decaer. De forma interesante, hubo un doblete de bandas proteicas detectado en las neuronas cereberales del peso molecular predicho, 36 KDa, para ArgI mientras que se detectó normalmente solamente una banda proteica en el hígado mediante el uso del mismo anticuerpo policlonal hacia ArgI (Esch et al., J. Neuroscience, 18, págs. 4083-4095 (1998)). Se ha observado que la arginasa I de las neuronas migra por regla general en forma de un doblete cuando se analiza mediante SDS-PAGE. El doblete refleja probablemente una modificación postraduccional de la arginasa I nativa (p.ej., una deleción de uno o más aminoácidos y/o la adición de modificaciones químicas tales como glicosilación, fosforilación, metilación, y similares). Es posible que haya más de una isoforma de ArgI en el sistema nervioso, una de las cuales puede ser específica del cerebro. Es digno de mención que se detecte otra proteína mediante este anticuerpo policlonal anti-ArgI que migra a alrededor de 60 Kda, cuyo nivel de expresión en las neuronas cereberales no difirió con o sin el tratamiento con BDNF o dbcAMP. Esta proteína sirve así como control interno fiable de la cantidad de proteína cargada en cada carril del gel.
Se han clasificado las neurotrofinas en diferentes familias. El factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) pertenece a la familia Trk de neurotrofinas, que incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) y la neurotrofina 4/5 (NT4/5). Las neurotrofinas de la familia Trk actúan por medio de sus receptores de tirosina quinasa Trk de señalización (TrkA, TrkB, y TrkC) y, además, comparten un receptor de baja afinidad común, p75. Además de sus acciones bien establecidas en la regulación de la supervivencia, diferenciación y proliferación celular, estas neurotrofinas de la familia Trk están implicadas en procesos de plasticidad neuronal (Jelsma y Aguayo, Curr. Opin. Neurobiol., 4, págs. 717-725 (1994); Thoenen, Science, 270, págs. 593-598 (1995)). Para investigar si la expresión de la arginasa se estimula tras la exposición de las neuronas a neurotrofinas que pertenecen a diferentes familias moleculares, a continuación se trataron neuronas cereberales con factor neurotrófico derivado de una línea celular glial (GDNF).
Se identificó inicialmente GDNF como un factor trófico específico capaz de mantener la supervivencia neuronal del mesencéfalo anterior embrionario (Lindsay, Nature, 373, págs. 289-290 (1995)). Posteriormente, se ha demostrado que GDNF tiene efectos protectores sobre las neuronas motoras axotomizadas del núcleo facial y de la médula espinal, así como de las neuronas simpáticas, sensoriales y ciliares del sistema nervioso periférico (SNP) (Mason, Mol. Cell Neurosci., 8, págs. 112-119 (1996)). Los estudios posteriores han ampliado la familia similar a GDNF a cuatro miembros: además de GDNF, también se identifican neurturina (NRTN), arternina (ARTN) y persefina (PSP). Esta familia de neurotrofinas actúa a través de un sistema de receptores multicomponente, distinto de los receptores Trk, que comprende un co-receptor de unión de ligandos de elevada afinidad GFR (componente de receptores de la familia GDNF) y la tirosina quinasa Ret (Baloh et al., Curr. Opin. Neurobiol., 10, págs. 103-110 (2000)).
Las neuronas cereberales se dejaron sin tratar (-) o se expusieron a 200 ng/ml de GDNF durante 1 h, 3 h o 5 h, y las células se lisaron en presencia de inhibidores de proteasas. La proteína total (23 \mug) se sometió a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (12%) (SDS-PAGE), se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se inmunotiñó con un anticuerpo hacia Arg I. Como se muestra en la Figura 5 (C), la cantidad de polipéptido ArgI se incrementó al menos al doble tras el tratamiento de las neuronas con GDNF.
En conjunto, los resultados mostrados en la Figura 4 y en la Figura 5 demuestran que la exposición de las neuronas cereberales a dbcAMP o a miembros de dos familias distintas de neurotrofinas (BDNF y GDNF), cada uno de los cuales incrementa los niveles de cAMP endógenos, da como resultado la estimulación de la enzima arginasa I a nivel tanto del ARN como de la proteína. Esta es la primera vez que se ha demostrado que el cAMP induce la expresión de la arginasa en las neuronas.
Para determinar si la estimulación de ArgI inducida mediante BDNF, GDNF o dbcAMP es importante en el bloqueo mediado por cAMP de la inhibición del crecimiento axonal por MAG o mielina, se añadió al ensayo un inhibidor de la enzima ornitina descarboxilasa (ODC), que actúa una etapa más adelante respecto de la arginasa en la ruta biosintética de poliaminas (véase la Figura 1). Se incluyó un inhibidor específico de la ornitina descarboxilasa, hidrocloruro de DL-a-difluorometil-ornitina (DFMO), con BDNF o dbcAMP en los ensayos de crecimiento en neuronas como se describió anteriormente (Ejemplos 1 y 2). Como se muestra en la Figura 6 y se discutió anteriormente, la adición de dbcAMP bloquea la inhibición del crecimiento de las neuritas por MAG (A) o mielina (B) (compárese el dbcA (-) y (+) en las columnas DFMO (-)). El bloqueo de la inhibición provocado mediante la adición de dbcAMP se pierde cuando se incluye el inhibidor de ODC DFMO. En presencia de DFMO, (A) MAG y (B) mielina todavía inhiben cada uno el crecimiento axonal se añada o no dbcAMP (compárese dbcA (-) y (+) en las columnas DFMO (+)). DFMO por sí solo no tiene un efecto significativo sobre la inhibición por (A) MAG o (B) mielina, ni sobre el crecimiento de las neuritas con las células CHO de control (A).
Como se muestra en la Figura 7, cuando se incluyó el inhibidor de ODC DFMO en los cultivos de neuronas cereberales sensibilizadas durante la noche con BDNF, el efecto positivo de BDNF sobre el crecimiento axonal en presencia de (A) MAG o (B) mielina se anuló completamente, y el crecimiento de las neuritas permaneció inhibido. Así, el bloqueo de la conversión de ornitina a putrescina (véase la Figura 1) bloquea el efecto de sensibilización de la neurotrofina sobre el crecimiento de las neuritas. Las neuronas cerebelares se sensibilizaron durante la noche con BDNF, en presencia o ausencia de DFMO (1 mM), con y sin putrescina (10 mM), antes de transferirlas a (A) células CHO que expresaban MAG o células de control o (B) mielina del SNC. La longitud de las neuritas se midió tal como se describió (Ejemplo 1). Como antes, la sensibilización con BDNF bloqueó la inhibición por MAG. La presencia de DFMO durante la sensibilización anuló este efecto de sensibilización, y la adición de putrescina, junto con DMFO, restituyó el efecto sensibilizador de BDNF.
Para ensayar si el inhibidor de ODC DFMO puede bloquear el efecto positivo de GDNF sobre el crecimiento axonal en presencia de MAG, se sensibilizaron neuronas cerebelares durante la noche con o sin GDNF (200 ng/ml), en presencia o ausencia de DFMO (1 mM) (Figura 8). Se midió la longitud de las neuritas como se describió (Ejemplo 1). El efecto positivo de GDNF sobre el crecimiento axonal en presencia de MAG se anuló completamente mediante el bloqueo de ODC, y el crecimiento de las neuritas permaneció inhibido. Así, tal como fue para BDNF, el bloqueo de la conversión de ornitina a putrescina bloquea también el efecto sensibilizador de GDNF sobre el crecimiento de las neuritas.
Se ha demostrado que dos neurotrofinas, BDNF y GDNF, de dos familias distintas de neurotrofinas, estimulan cada una la expresión de Arg I en las neuronas, y cada una supera la inhibición de la regeneración por MAG y mielina mediante la sensibilización; un efecto que se bloquea con el inhibidor de ODC DFMO. Esto implica que dos familias distintas de neurotrofinas ejercen su efecto sobre la regeneración axonal con MAG y mielina actuando por medio de Arg I. Esto no se había demostrado nunca antes, e implica que los otros miembros de cada una de estas familias funcionan de una manera similar.
Para determinar si la putrescina por sí sola puede sustituir el efecto de sensibilización de las neurotrofinas sobre la inhibición por MAG o mielina, las neuronas se sensibilizaron con putrescina a diferentes concentraciones (Figura 9). La sensibilización de las neuronas con putrescina en un intervalo de concentraciones entre 10 \muM y 25 \muM es suficiente para bloquear el efecto inhibitorio de (A) MAG y (B) mielina sobre el crecimiento axonal. El efecto bloqueante de la putrescina sobre MAG se satura a dosis superiores a 25 \muM. Con mielina del SNC, la sensibilización de las neuronas con putrescina a 10 \muM da como resultado un incremento de al menos el doble del crecimiento axonal, que es similar al crecimiento de las neuronas sensibilizadas con 200 ng/ml de BDNF. La sensibilización con putrescina a concentraciones entre alrededor de 10 \muM y 50 \muM incrementa el crecimiento axonal con mielina incluso más drásticamente. El efecto bloqueante sobre la mielina mediante la sensibilización con putrescina se satura a alrededor de 50 \muM de putrescina. Los resultados se presentan como el porcentaje del control, en los que el 100% es la longitud media de las neuritas de las neuronas sensibilizadas con medios Sato solamente, y cultivadas posteriormente con (A) células CHO de control o (B) sustrato de mielina del SNC.
Para determinar si es necesario sensibilizar las neuronas con putrescina para bloquear completamente la inhibición del crecimiento axonal por MAG y mielina, se cultivaron neuronas cerebelares con células CHO que expresaban MAG o con un sustrato de mielina del SNC con diferentes concentraciones de putrescina. Se descubrió que la adición de putrescina sin sensibilización solamente bloquea parcialmente la inhibición del crecimiento axonal por MAG o mielina. En el intervalo de concentraciones entre 15 \muM y 100 \muM, el efecto bloqueante de la putrescina sobre la inhibición por MAG o mielina alcanza una meseta a alrededor de un 64% de inversión.
En resumen, los datos anteriores indican que la elevación del cAMP, que media en la regeneración axonal en presencia de los efectos inhibitorios de MAG o mielina, induce la estimulación de la arginasa a nivel transcripcional y traduccional. La arginasa lleva a cabo una etapa limitante en la síntesis de poliaminas, y las alteraciones en la ruta biosintética de las poliaminas posteriormente a la arginasa modulan la capacidad de los axones para crecer con MAG o mielina. Si la enzima ODC que actúa posteriormente a la arginasa se bloquea mediante DFMO, el crecimiento axonal mejorado con MAG o mielina inducido mediante niveles elevados de cAMP (tratamiento con dbcAMP o sensibilización con neurotrofina (BDNF)) se anula completamente, a menos que se añada putrescina exógena (10 \muM) para superar el bloqueo de ODC. De forma importante, la sensibilización con putrescina sola es suficiente para bloquear la inhibición por MAG o mielina de una manera dependiente de la dosis. Así, las manipulaciones que modulan los niveles de putrescina y de las poliaminas derivadas de putrescina en una neurona serán útiles para aliviar la inhibición del crecimiento de las neuritas por los inhibidores de mielina tales como MAG.
Sección Transversal del Nervio Ciático y Estimulación de Arginasa
Los axones del SNC normalmente no se regeneran cuando se cortan in vivo. Sin embargo, para las neuronas que tienen dos ramificaciones, una rama periférica y una central, tales como las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), si la rama periférica se corta 1 día o 1 semana antes de cortar los axones centrales, hay una regeneración considerable de estos axones del SNC (Neumann, S. y Woolf, C.J., Neuron, 23, págs. 83-91 (1999); Richardson, P.M. y Issa, V.M.K., Nature, 309, 791-793 (1984); y Richardson, P.M., et al., Nature, 284, págs. 264-265 (1980)). Si los axones del SNC de la neurona DRG se cortan sin una lesión condicionante previa de la rama periférica, no se da la regeneración.
Se quiso determinar si la expresión de la arginasa se incrementa después de una lesión condicionante en el nervio ciático de las neuronas DRG, y si este incremento tiene correlación con la capacidad de crecer con MAG y mielina. Se cortó transversalmente el nervio ciático del lado izquierdo a nivel de la mitad del muslo en ratas en la etapa P18 (Ejemplo 3). Se aislaron y se analizaron en tiempos crecientes tras la lesión (0,5 hr, 1 hr, 4 hr, 8 hr, 18 hr, 2 d, 3 d y 7 d) los ganglios de la raíz dorsal (DRG) del lado lesionado (I) y del lado contralateral sin lesionar (C). Como se muestra en la Figura 10, después de una lesión condicionante en la rama periférica de la neurona DRG, el nervio ciático, el nivel de cAMP supera el doble, y se incrementa la expresión de Arg I. La estimulación de Arg I explica probablemente la regeneración de los axones del SNC tras la lesión condicionante en la rama periférica.
La Estimulación de la Arginasa Bloquea la Inhibición del Crecimiento de las Neuritas por MAG
Para determinar si la estimulación de la arginasa es suficiente para superar la inhibición del crecimiento axonal por MAG, se introdujo un cADN de arginasa I en las neuronas. Para conseguir una eficacia de transfección de casi el 100% en células post-mitóticas, varios grupos han usado vectores virales para administrar proteínas heterólogas en neuronas y glía con una eficacia elevada y una toxicidad baja (véase, p.ej., Ghadge et al., J. Neurosci., 17, págs. 1397-1405 y págs. 8756-66 (1997)). Para sobreexpresar la arginasa en una neurona, se usaron técnicas de transferencia génica mediada por adenovirus. Los sistemas de adenovirus (Adv) se han usado exhaustivamente para expresar proteínas humanas y no humanas. Se pueden usar para infectar una amplia diversidad de células mamíferas, y por lo tanto permiten la expresión de proteínas recombinantes en la mayoría de líneas celulares y tejidos de mamíferos. Tienen ventajas sobre los retrovirus, ya que pueden infectar células post-mitóticas, mientras los retrovirus no
pueden.
Se infectaron neuronas cerebelares con un vector adenoviral que codificaba el cADN de ArgI y un cADN marcador de proteína fluorescente verde (GFP) (Ejemplo 4). Como control, se infectaron neuronas cerebelares con un vector adenoviral correspondiente que codificaba el cADN marcador de GFP sólo. La Figura 11A muestra una neurona que está inmunoteñida positivamente para GFP y GAP43. La Figura 11B muestra proteínas de neuronas cerebelares separadas mediante SDS-PAGE e inmunoteñidas con anticuerpos hacia ArgI (análisis de transferencia de Western) (Ejemplo 4). Tras la inyección, existe una expresión abundante de ArgI (véase la flecha) en las células infectadas con el vector adenoviral de ArgI-GFP, pero no con el vector de GFP de control. Los niveles endógenos de ArgI son indetectables en 5 \mug de proteína de neuronas infectadas con adenovirus de GFP. Arg I se detectó por primera vez tras cargar 23 \mug de proteína total de estas células de control.
Después se comparó la capacidad de crecimiento axonal de las neuronas infectadas con adenovirus de ArgI/GFP y GFP con células CHO que expresaban MAG o células de control. Como se muestra en la Figura 11C, el crecimiento axonal de las neuronas cerebelares que expresaban arginasa I (ArgI) no se inhibe por MAG. Las neuronas infectadas de control que expresaban GFP sola (GFP) permanecen sometidas a la inhibición dependiente de MAG del crecimiento axonal.
En resumen, la elevación del cAMP induce la estimulación de la arginasa I, y la sobreexpresión de la arginasa I es suficiente para superar la inhibición del crecimiento axonal por MAG. Debido a que los niveles de cAMP endógeno tienen correlación con la capacidad regenerativa neuronal durante el desarrollo y tras una lesión, se investigó si los niveles de expresión endógena de ArgI en las neuronas tienen correlación con la capacidad regenerativa neuronal. Se aislaron las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de diferentes días postnatales (entre P0 y P7) y se extrajeron las proteínas totales. Se examinaron los niveles de proteína ArgI endógena a las diferentes edades posnatales mediante análisis de transferencia de Western (Ejemplo 4). Como se muestra en Figura 12, los niveles de proteína ArgI en las neuronas DRG en las etapas P0-P4 son más abundantes que en las neuronas cerebelares posnatales (Figura 5). En algún momento entre los días posnatales 4-5 en las neuronas DRG, sin embargo, hay una disminución marcada de los niveles de proteína ArgI, y este nivel bajo persiste hasta las edades posnatales tardías. La caída de las proteínas ArgI endógenas en las neuronas DRG es similar a la disminución observada previamente del cAMP endógeno durante el desarrollo, lo cual tiene correlación con una pérdida de la capacidad regenerativa en presencia de MAG o mielina. Así, fue posible que la modulación de los niveles de ArgI en las neuronas DRG en desarrollo pudiera afectar a su capacidad de regeneración.
Se ha demostrado que las neuronas DRG cambian su respuesta regenerativa axonal hacia MAG y mielina desde la estimulación hasta la inhibición durante el desarrollo. La transición ocurre drásticamente entre los días posnatales 3-4 (DeBellard et al., Mol. Cell. Neurosci., 7, págs. 89-101 (1996)). Para determinar si la promoción del crecimiento axonal de neuronas DRG de P0-P1 por MAG se puede bloquear si se bloquea una etapa de la ruta biosintética de poliaminas posterior a la arginasa, se aislaron neuronas DRG de P0-P1 y se cultivaron con células CHO que expresaban MAG en presencia del inhibidor irreversible de ODC DFMO (véase anteriormente). Como se muestra en la Figura 13, la estimulación de las neuronas DRG de P0-1 por MAG se anula completamente (e incluso se invierte ligeramente) mediante la adición del inhibidor de ODC DFMO - el crecimiento axonal en las neuronas DRG de P0-1 se inhibe ligeramente en vez de estimularse por MAG. El efecto de DFMO depende de MAG, porque el DFMO solo no tiene efecto sobre el crecimiento de las neuritas en las células CHO de control. Así, en las neuronas DRG jóvenes, el bloqueo de una etapa posterior a la arginasa en la ruta biosintética de poliaminas puede cambiar la respuesta neuronal hacia MAG desde la estimulación a la inhibición.
Para determinar si el incremento de los niveles de expresión de Arg I en las neuronas DRG más viejas es suficiente para bloquear el efecto inhibitorio de MAG sobre el crecimiento axonal, se usó la transferencia génica de ArgI mediada por adenovirus para introducir secuencias de cADN de ArgI en las neuronas DRG del día posnatal 7 (PND7) (Ejemplo 4). La Figura 14 muestra que la sobreexpresión de ArgI en las neuronas DRG alivia la inhibición dependiente de MAG del crecimiento axonal. La capacidad de crecimiento neuronal con MAG se mejora significativamente mediante el incremento de los niveles ArgI.
Estos resultados demuestran que los niveles de expresión de ArgI en las neuronas tienen correlación con la capacidad regulada en el desarrollo de las neuronas de hacer crecer los axones en respuesta a MAG. En las neuronas jóvenes, los niveles de cAMP y ArgI endógenos son elevados, y el crecimiento axonal a partir de estas neuronas se estimula mediante MAG. Durante el desarrollo neuronal, hay una disminución de los niveles de expresión de ArgI que coincide con la disminución de los niveles de cAMP endógeno. Con posterioridad a este cambio del desarrollo, el crecimiento axonal de las neuronas se inhibe en vez de estimularse mediante MAG. Por lo tanto, mediante el cambio de los niveles de expresión de cAMP o ArgI en las neuronas, se puede modular el cambio del desarrollo de las respuestas neuronales hacia MAG. El nivel y la dirección de la modulación deseada de los niveles de poliaminas o de la actividad de arginasa dependerán así del tipo de célula y de la etapa del desarrollo de la neurona seleccionada como objetivo.
De forma importante, la arginasa desempeña también un papel importante en mecanismos anti-apoptóticos y en otros mecanismos de muerte celular neuronal, y es probable que esté implicada en enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple, y similares (mencionadas posteriormente). Se deduce que la modulación de los niveles de poliaminas neuronales mediante la alteración de putrescina o de la actividad de arginasa será terapéutica en estas enfermedades, así como en el tratamiento de las lesiones de la médula espinal y de otros daños en el tejido nervioso.
En conjunto, los resultados demuestran por primera vez que la elevación del cAMP en las neuronas, de forma artificial con db cAMP o mediante sensibilización con neurotrofina, induce la estimulación de la enzima arginasa, que a su vez activa la ruta para la síntesis de putrescina y de otras poliaminas. Estas poliaminas son responsables, al menos en parte, del bloqueo inducido mediante cAMP de la inhibición por mielina y MAG (Fig. 9). Es probable que la actividad de arginasa y los niveles de putrescina sean, por lo tanto, un factor clave en el cambio de la capacidad de crecimiento intrínseca de las neuronas adultas, de forma que ya no se inhiben por MAG y mielina, y así se regeneran tras una lesión in vivo. Se sabe que si los inhibidores de la regeneración presentes en la mielina se bloquean inmediatamente después de la lesión, se puede dar la regeneración. Por lo tanto, es probable que la estimulación artificial de la actividad de arginasa en una neurona después de una lesión in vivo permita que se dé la regeneración. De forma alternativa, es probable que la inhibición de la actividad de arginasa bloquee la regeneración in vivo, lo cual puede ser deseable en ciertas circunstancias. También se espera que el tratamiento de las neuronas con putrescina, o con análogos o derivados de putrescina, tenga tales efectos.
Agentes que Afectan a los Niveles de Putrescina y Poliaminas en las Neuronas
Como se demostró anteriormente, la adición de putrescina a neuronas adultas puede aliviar la inhibición por mielina (y MAG) del crecimiento neuronal. La putrescina, y los análogos y derivados de putrescina que, por ejemplo, tienen semividas más largas, una biodisponibilidad mayor, y similares, serán útiles por tanto en las composiciones según la presente invención. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan composiciones para el uso en métodos para incrementar los niveles de putrescina endógena (y de las poliaminas derivadas) en las células del sistema nervioso, en los que las composiciones comprenden arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa o que comprende putrescina.
La putrescina se puede administrar directamente al líquido cefalorraquídeo (LCR), por ejemplo, mediante una bomba epidural o intratecal o una punción lumbar. Para la administración intratecal o epidural, véase, p.ej., Bragg, C. Practical aspects of epidural and intrathecal narcotic analgesia in the intensive care setting. Heart Lung, 18(6), págs. 599-608 (1989); y Coombs, D.W. et al., Relief of continuous pain by intraspinal narcotics via an implanted reservoir. JAMA, 250, págs. 2336-2339 (1984). De forma alternativa, las células neurales o gliales del sistema nervioso se pueden modificar para que expresen niveles alterados (p.ej., mayores) de putrescina y, aunque esté fuera del alcance de la presente invención, otras poliaminas derivadas. Por ejemplo, la enzima ornitina amino transferasa (OAT) convierte la ornitina en pirrolin-5-carboxilato. Se supone que los inhibidores de OAT, tales como 5-fluoro-metilornitina, incrementarían los niveles de ornitina disponible para la síntesis de poliaminas (J. Mol. Biol., 285, págs. 297-309 (1999)).
Como se describe más adelante, otra manera de modular los niveles de putrescina y de poliaminas derivadas en una neurona es mediante la modulación de la actividad de arginasa en la célula como se describe el presente documento (véase más adelante) mediante un agente modulador de la arginasa. Opcionalmente, se puede monitorizar el crecimiento de al menos una neurona tras la administración de un compuesto de la invención.
Agentes Moduladores de la Arginasa
Ácidos nucleicos y polipéptidos de arginasa Se han aislado y caracterizado cADNs de arginasa I y II humana, de rata y de ratón (véase más adelante). Los polipéptidos de arginasa del mismo tipo de isoforma (tipo I o II) son aproximadamente un 85% - 95% idénticos entre sí a nivel de aminoácidos. Los polipéptidos de arginasa I y II de mamíferos son aproximadamente un 70% idénticos a nivel de la secuencia de aminoácidos, y difieren principalmente en que la arginasa II tiene una secuencia de señalización proteica mitocondrial. (Véase, p.ej., Morris et al., Gene, 193, págs. 157-161 (1997); véanse también los números de acceso a GenBank del NCBI NP 000036.2 y AAH01350.1 para las secuencias polipeptídicas de las arginasas I y II humanas, y NM 00045 y 001172 para las secuencias de cADN de las arginasas I y II humanas, respectivamente).
Una comparación de las secuencias de arginasa de hígado de rata, hígado humano, Xenopus laevis, levadura y plásmido TiC58 de Agrobacterium ha revelado tres residuos de histidina conservados en un segmento de 40 residuos. En las arginasas de humano y de rata, los residuos de histidina conservados se hallan en los residuos de aminoácidos 101, 126 y 141 dentro de las secuencias de aminoácidos conservadas en las posiciones 98-107, 122-131 y 137-146 (Cavalli et al., Biochemistry, 33, págs. 10652-10657 (1994)). Se prevé que las muteínas, fragmentos, análogos, fusiones y derivados polipeptídicos y similares, que comprenden los residuos de aminoácidos conservados 98-107, 122-131 y 137-146 de la arginasa en esas posiciones o en posiciones diferentes (o sustituciones conservativas de los residuos que no son histidinas dentro de esas regiones conservadas, de forma que sigue existiendo una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70%) mantendrán la actividad de arginasa y serán útiles en las composiciones y métodos de la presente invención.
De forma similar, se prevé que los polipéptidos relacionados que tienen actividad de arginasa que pertenecen a la familia anteriormente descrita de proteínas arginasa de mamíferos (es decir, que son al menos alrededor de un 70% idénticas entre sí a nivel de aminoácidos, preferiblemente un 85% - 95% idénticas entre sí a nivel de aminoácidos) serán útiles en la práctica de la presente invención. La base de datos pública GenBank (accesible en www.ncbi.nlm.nih.gov), por ejemplo, contiene 479 entradas de secuencias que están clasificadas como arginasa y relacionadas con arginasa, 294 de las cuales se hallan con la expresión de búsqueda "arginasa mamífera". Se ha definido recientemente una familia de arginasas mediante comparaciones de secuencias y alineaciones de secuencias tridimensionales entre las arginasas eucarióticas y bacterianas, que se puede hallar en (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid =pfam00491).
En las composiciones de la invención se aplican polinucleótidos, que incluyen ADN y ARN monocatenario y bicatenario (codificante o complementario) que son capaces de modular la actividad de arginasa en una neurona. Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden usar directamente para modular la actividad de arginasa en el sistema nervioso, p.ej., mediante la expresión de un polipéptido que tiene actividad de arginasa, o, aunque no es parte de la presente invención, mediante la expresión de un ácido nucleico complementario que inhibe la actividad de arginasa, en una neurona o célula glial. Preferiblemente, se usan las secuencias de ácidos nucleicos de arginasa que codifican un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos conservados 98-107, 122-131 y 137-146 de la arginasa I humana o mamífera. De forma alternativa, se usan las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que comprende una o más sustituciones conservativas de los residuos que no son histidina dentro de los residuos de aminoácidos 98-107, 122-131 y 137-146 de la arginasa I humana o mamífera, de forma que sigue existiendo al menos un 70% de identidad de secuencias de aminoácidos entre los residuos 98 y 146; o aquellos que pueden hibridar en condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos conservados 98-107, 122-131 y 137-146 de la arginasa I humana o
mamífera.
Los cADNs que codifican las enzimas arginasas mamíferas conocidas (de rata, ratón y humano) son aproximadamente un 50% idénticas a nivel del ácido nucleico. Se espera que la expresión de cualquiera de estos ácidos nucleicos de arginasa en una neurona, o en una célula que pueda proporcionar una actividad de arginasa posteriormente a una neurona, sea útil para la modulación de la actividad de arginasa según la presente invención. De forma similar, se espera que las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas en al menos un 50% de identidad de secuencias respecto de aquellas secuencias, especialmente aquellas que comprenden secuencias que codifican los residuos de aminoácidos conservados de la arginasa tal como se discutió anteriormente, serán útiles en la práctica de la presente
invención.
Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden expresar uniéndolas de manera operable a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión apropiado, y empleando ese vector de expresión para transformar un hospedador unicelular apropiado. Las secuencias de control de la expresión son secuencias que controlan la transcripción, los sucesos post-transcripcionales y la traducción de las secuencias de ácidos nucleicos. Tal unión de manera operable de una secuencia de ácido nucleico de esta invención a una secuencia de control de la expresión, por supuesto, incluye, si no formaba ya parte de la secuencia de ácido nucleico, la provisión de un codón de iniciación de la traducción, ATG o GTG, en el marco de lectura correcto en posición 5' de la secuencia de ácido nucleico. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos y sintéticos.
Se puede emplear una amplia diversidad de combinaciones hospedador/vector de expresión para la expresión de las secuencias polinucleotídicas que actúan como agentes moduladores de la arginasa de la invención. Tales combinaciones hospedador/vector de expresión se conocen bien en la técnica y se pueden seleccionar, por ejemplo, basándose en el tipo de célula hospedadora elegida como objetivo para la administración génica. Preferiblemente, una célula hospedadora será una célula hospedadora mamífera. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se puede modificar para que exprese de manera constitutiva el agente modulador de la arginasa de la invención. En las realizaciones alternativas, la célula hospedadora se puede modificar para que exprese el agente modulador de la arginasa de una manera regulada, p.ej., tras recibir una señal molecular, tal como la presencia o ausencia de una molécula reguladora necesaria para la activación mediante las secuencias de control de la expresión. La célula hospedadora puede ser una que se cultiva y después se introduce en un sujeto o paciente que necesita tratamiento. De forma alternativa, la célula hospedadora puede ser una que reside o está en comunicación de otra manera con una parte del sistema nervioso del sujeto o paciente que necesita tratamiento.
En las realizaciones preferidas, se pueden usar como células hospedadoras células eucarióticas, y más preferiblemente, células mamíferas. La expresión en las células mamíferas se puede llevar a cabo mediante el uso de una diversidad de plásmidos, que incluyen pSV2, pBC12BI, y p91023, así como vectores virales líticos (p.ej., virus vaccinia, adenovirus, AAV y baculovirus), vectores virales episomales (p.ej., papilomavirus bovino), y vectores retrovirales (p.ej., retrovirus murinos y VIH), que incluyen lentivectores (véase, p.ej., Consiglio et al., Nature Med., 7, págs. 310-316 (2001)). Los vectores útiles para las células de insecto incluyen los vectores baculovirales y pVL 941. Estos y otros vectores virales y no virales son muy conocidos para los expertos en la técnica de administración de ácidos nucleicos y expresión en células eucarióticas.
Además, se puede usar cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de la expresión en estos vectores para expresar las secuencias polinucleotídicas de esta invención. Tales secuencias de control de la expresión útiles incluyen las secuencias de control de la expresión asociadas a genes estructurales de los vectores de expresión anteriormente mencionados. Las secuencias de control de la expresión que controlan la transcripción incluyen, p.ej., promotores, potenciadores y sitios de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión en las células eucarióticas que controlan los sucesos post-transcripcionales incluyen sitios donantes y aceptores de corte y empalme y secuencias que modifican la semivida del ARN transcrito, p.ej., secuencias que dirigen la adición de poli(A) o sitios de unión para las proteínas de unión al ARN. Las secuencias de control de la expresión que controlan la traducción incluyen sitios de unión al ribosoma, secuencias que dirigen la expresión del polipéptido hacia o dentro de compartimentos celulares particulares, y secuencias en las regiones sin traducir de 5' y 3' que modifican la velocidad o la eficacia de la traducción.
La secuencias de control de la expresión pueden incluir también secuencias que dirigen un ácido nucleico o proteína hacia una localización o compartimento subcelular particular, p.ej., secuencias de localización mitocondrial, secuencias de localización nuclear, secuencias de retención citóplasmática, y secuencias de secreción que dirigen la proteína hacia el retículo endoplásmico y así hacia la ruta de secreción de la célula hospedadora. Los expertos en la técnica conocen bien y apreciarán las propiedades de tales secuencias, y cómo pueden obtenerse de los materiales disponibles.
Los ejemplos de secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40 o adenovirus, las secuencias de corte y empalme de SV40, el promotor/potenciador de CMV, los promotores T3 y T7, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, p.ej., Pho5, los promotores del sistema de reproducción a de levaduras, los promotores GAL1 o GAL10, y otras secuencias promotoras constitutivas e inducibles que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o de sus virus, y diversas combinaciones de las mismas modificadas de manera apropiada para actuar en la célula hospedadora seleccionada. Los promotores que se pueden inducir en el cerebro incluyen, pero sin limitación, los descritos en Chen et al., Mol. Pharmacol., 54, págs. 495-503 (1998); y Tremblay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, págs. 12580-12585 (1998). Los expertos en la técnica apreciarán inmediatamente cómo identificar y usar otras secuencias de control de la expresión que se pueden usar para llevar a cabo la expresión génica regulada en las células del cerebro y del sistema nervioso.
Los vectores de ácidos nucleicos preferidos también incluyen un gen marcador seleccionable o amplificable y medios para seleccionar o amplificar el número de copias del gen de interés. Tales genes marcadores se conocen bien en la técnica. Los vectores de ácidos nucleicos pueden comprender también secuencias de estabilización (p.ej., secuencias similares a ori o ARS y secuencias similares al telómero), o se pueden diseñar de forma alternativa para favorecer la integración dirigida o no dirigida en el genoma de la célula hospedadora. En una realización preferida, las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención se insertan en el marco de lectura en un vector de expresión que permite la expresión de nivel elevado de un ARN que codifica una proteína que comprende la secuencia de ácido nucleico codificada de interés. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de clonación y secuenciación de ácidos nucleicos, y se describen en una colección de manuales de laboratorio, que incluyen Ausubel et al., (anteriormente mencionado). La información de los productos de fabricantes de reactivos biológicos, químicos e inmunológicos también proporciona información útil.
Por supuesto, no todos los vectores y las secuencias de control de la expresión funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención. Tampoco todos los hospedadores funcionan igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias de control de la expresión y hospedadores sin una experimentación excesiva, y sin apartarse del alcance de esta invención. Por ejemplo, al seleccionar un vector, se debe tomar en consideración el hospedador, ya que el vector se debe replicar en él. También se debería considerar el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias, la capacidad de controlar la integración, si la hay, y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como los marcadores para antibióticos o de otro tipo de
selección.
La transformación y otros métodos de introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedadora (p.ej., conjugación, transformación con protoplastos o fusión, transfección, electroporación, administración mediante liposomas, técnicas de fusión de membranas, esferas revestidas con ADN de elevada velocidad, infección viral y fusión de protoplastos) se puede llevar a cabo mediante una diversidad de métodos que se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, anteriormente mencionado). Las células bacterianas, de levadura, vegetales o mamíferas se transforman o se transfectan con un vector de expresión, tal como un plásmido, un cósmido, o similares, en el que el vector de expresión comprende el ácido nucleico de interés. De manera alternativa, las células se pueden infectar mediante un vector de expresión viral que comprende el ácido nucleico de interés. Dependiendo de la célula hospedadora, el vector, y el método de transformación utilizado, la expresión transitoria o estable del ácido nucleico y de un polipéptido codificado, será constitutiva o inducible. Alguien que tenga experiencia habitual en la técnica será capaz de decidir si se expresa un polinucleótido o polipéptido de forma transitoria o estable, y si se expresa una proteína codificada de manera constitutiva o de una manera regulada (p.ej., de manera
inducible).
Es útil una amplia diversidad de hospedadores unicelulares para la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Estos hospedadores pueden incluir hospedadores eucarióticos y procarióticos muy conocidos, células animales tales como CHO, BHK, MDCK y diversas células murinas, p.ej., células 3T3 y WEHI, células de mono verde africano tales como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, y BMT 10, y células humanas tales como las células VERO, WI38, y HeLa. Las células neurales útiles incluyen, pero sin limitación, las líneas celulares de hipocampo de rata tales como H19-7, HT22; células de neuroblastoma humano tales como SH-SY5Y; y células de neuroblastoma de ratón tales como N2a y N18. No se prevé que la invención se limite de ninguna manera a la célula hospedadora particular seleccionada para la expresión de un agente modulador de arginasa.
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Los detalles particulares para la administración génica, la expresión génica y la purificación de las proteínas recombinantes están bien documentados, y los expertos en la técnica los entienden. Se pueden hallar detalles adicionales sobre los diversos aspectos técnicos de cada una de las etapas usadas en la producción recombinante de genes exógenos en sistemas de expresión celular heterólogos en varios libros de texto y manuales de laboratorio de la técnica. Véase, p.ej., Ausubel et al., anteriormente mencionado, y Sambrook et al., anteriormente mencionado, y Kieser et al., anteriormente mencionado, incorporados en el presente documento como referencias.
Ácidos nucleicos y polipéptidos que no son de arginasa (fuera del alcance de la presente invención)
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Inhibidores y Activadores de Arginasa
La ornitina es un retroinhibidor conocido de la arginasa I. Así, se prevé que las moléculas que inhiban o compitan parcialmente o completamente con la capacidad de la ornitina para retroinhibir la actividad de la arginasa I serán moduladores útiles de la función de la arginasa en una neurona. Tales moléculas moduladoras de la arginasa se pueden identificar fácilmente llevando a cabo estudios clásicos de inhibición y competición con sustratos enzimáticos, mediante el uso de ensayos de arginasa en presencia del inhibidor de la arginasa ornitina y concentraciones variables de uno o más compuestos de ensayo. Tales agentes moduladores de la arginasa pueden actuar, pero no necesariamente, de una manera dependiente de la concentración y el tiempo. Se pueden usar selecciones y análisis genéticos (p.ej., mediante la búsqueda de mutaciones que inhiben fenotipos particulares) en un modelo de organismo genético, tal como un modelo de levadura o de mosca de la fruta como alternativa o junto con los ensayos enzimáticos para identificar los agentes moduladores de la arginasa.
Finalmente, se han identificado varios inhibidores de la arginasa. El ácido 2(S)-amino-6-boronohexanóico, por ejemplo, un análogo de arginina basado en ácido borónico, puede inhibir la arginasa in vivo (Cox et al., Nature Struct. Biol., 6, págs. 1043-1047 (1999), incorporado en el presente documento como referencia). Estos investigadores han determinado la estructura cristalina mediante rayos X de la arginasa unida al inhibidor ácido 2(S)-amino-6-boronohexanóico (también conocido como ABH). Estos resultados estructurales indican que ABH imita la primera etapa de la reacción enzimática de la arginasa, y así ayuda a explicar por qué ABH es el inhibidor más potente de la arginasa identificado hasta ahora. N(omega)-hidroxi-l-arginina (LOHA) es otro ejemplo de un inhibidor de la arginasa (Iniesta et al., J. Exp. Med., 193, págs. 777-784 (2001)). Véase también Khangulov et al., Biochemistry, 37(23), págs. 8539-50 (1998). Cualquier inhibidor de la arginasa se puede usar como agente modulador de la arginasa, o se puede usar para identificar agentes tales como moléculas pequeñas que son capaces de aliviar la inhibición de la arginasa in vivo y que por lo tanto son agentes moduladores de la arginasa.
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Composiciones Farmacéuticas y Tratamientos Mediante el Uso de Moduladores de Poliaminas Neuronales y Arginasa
La putrescina y los agentes moduladores de arginasa proporcionados en el presente documento se pueden formular en composiciones farmacéuticas y administrarlos in vivo a una dosis eficaz para tratar la afección clínica particular que se aborda. La administración de una o más de las composiciones farmacéuticas según esta invención será útil para la regulación, p.ej., para la estimulación del crecimiento o la regeneración neural en el sistema nervioso, para el tratamiento de lesiones o daños del tejido nervioso o las neuronas, y para el tratamiento de la degeneración neural asociada a lesiones (tales como traumatismos) del sistema nervioso, trastornos o enfermedades, que incluyen aquellas asociadas con la apoptosis, necrosis u otras formas de muerte celular. Tales lesiones, enfermedades o trastornos incluyen la lesión de la médula espinal, lesión cerebral, accidente cerebrovascular, encefalitis (viral o no viral), enfermedad mitocondrial, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, kuru, atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, y parálisis supranuclear progresiva.
Las enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero sin limitación: esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig; "ALS"); enfermedad de Parkinson; síndromes parkinsonianos; complejo ALS-Parkinson-demencia; enfermedad de Huntington; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Pick; enfermedad de Wilson; degeneración hepatolenticular; toxinas ambientales, que incluyen el envenenamiento por manganeso y monóxido de carbono; epilepsias hereditarias; estados de deficiencia nutricional (p.ej., síndrome de Wernicke-Korsakoff, deficiencia de B12 y pelagra); hipoglucemia o hipoxia prolongadas; síndromes paraneoplásicos; exposición a metales pesados (p.ej., arsénico, bismuto, oro, manganeso y mercurio); demencia de diálisis; enfermedad de Schilder; enfermedades por almacenamiento de lípidos; degeneración cerebelar; demencia con paraplegia espástica; parálisis supranuclear progresiva; enfermedad de Binswanger; tumor o absceso cerebral; enfermedad de Marchiava-Bignami, hidrocefalia comunicante, normotensa u obstructiva; leucoencefalitis multifocal progresiva; enfermedad de Lewy-Body; algunos casos de SIDA; síndromes de afasia progresiva; y demencia del lóbulo frontal. Véase, Principles of Neurology (sexta edición), Adams, R.D., Victor, M., y Ropper, A.H. eds. 1997 (McGraw-Hill, Nueva York).
La determinación de una formulación farmacéutica preferida y de un régimen de dosis terapéuticamente eficaz para una aplicación dada está dentro de la experiencia en la técnica tomando en consideración, por ejemplo, la afección y el peso del paciente, el alcance del tratamiento deseado y la tolerancia del paciente al tratamiento. Véase, p.ej., Handbook of Pharmaceutical Additives: An International Guide to More than 6000 Products by Trade Name, Chemical, Function, and Manufacturer, Ashgate Publishing Co., eds., M. Ash e I. Ash, 1996; The Merck Index: An Encyclopaedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, ed. S. Budavari, anual; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, POLYAMINE; Martindale: The Complete Drug Reference, ed. K. Parfitt, 1999; y Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Nueva York, NY, ed. L. S. Goodman et al.
La administración de los moduladores de poliaminas neuronales y de arginasa proporcionados en el presente documento, que incluyen las formas aisladas y purificadas, sus sales o los derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, se puede llevar a cabo mediante el uso de cualquiera de los modos de administración aceptados convencionalmente de los agentes que se usan para tratar lesiones o trastornos, especialmente los relacionados con el sistema nervioso central.
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Formulaciones
Las composiciones farmacéuticas aplicadas en los usos de esta invención pueden estar en una diversidad de formas, que se pueden seleccionar según los modos de administración preferidos. Estos incluyen, por ejemplo, las formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas, tales como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, cremas, soluciones o suspensiones líquidas, jarabes, supositorios, soluciones para inyección e infusión, aerosoles y similares. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Los modos de administración pueden incluir, pero sin limitación, el modo oral, parenteral, (que incluye la inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, cisternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal) tópico, rectal, nasal, bucal, vaginal, mediante inhalación, o mediante un depósito implantado, bomba externa o
catéter.
Los agentes moduladores de poliaminas y de arginasa proporcionados en el presente documento se pueden colocar, por ejemplo, en formulaciones isotónicas estériles, con o sin cofactores que estimulan la absorción o la estabilidad. La formulación es preferiblemente líquida, o puede ser un polvo liofilizado. Por ejemplo, un agente de la invención se puede diluir con un tampón de formulación que comprende 5,0 mg/ml de ácido cítrico monohidrato, 2,7 mg/ml de citrato trisódico, 41 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de glicina y 1 mg/ml de polisorbato 20. Esta disolución se puede liofilizar, almacenar con refrigeración y reconstituir antes de la administración con agua para inyección estéril
(USP).
Las composiciones también incluirán preferiblemente vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales bien conocidos en la técnica (véanse las referencias farmacéuticas, anteriormente mencionadas). Tales vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir otros agentes medicinales, vehículos, que incluyen los vehículos genéticos, adyuvantes, excipientes, etc., tales como albúmina de suero humano o preparaciones de plasma. Las composiciones están preferiblemente en forma de una dosis unitaria, y se administrarán habitualmente una o más veces por
día.
Las composiciones que comprenden un compuesto descrito en el presente documento contendrán de alrededor del 0,1% a alrededor del 90% en peso del compuesto activo, y más en general de alrededor del 10% a alrededor del 30%. Las composiciones pueden contener vehículos y excipientes habituales, tales como almidón de maíz o gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro sódico y ácido algínico. Las composiciones pueden contener croscarmelosa sódica, celulosa microcristalina, almidón de maíz, glicolato de almidón sódico y ácido algínico.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas están en forma, por ejemplo, de un comprimido, cápsula, suspensión o líquido. Las formulaciones sólidas tales como comprimidos y cápsulas son especialmente útiles. También se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida o con revestimiento entérico. Para las aplicaciones pediátricas y geriátricas, las suspensiones, jarabes y comprimidos masticables son especialmente adecuadas. La composición farmacéutica se hace preferiblemente en forma de una dosis unitaria que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del ingrediente activo. Los ejemplos de tales dosis unitarias son los comprimidos y las cápsulas.
Para fines terapéuticos, los comprimidos y las cápsulas pueden contener, además del ingrediente activo, vehículos convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo, goma arábiga, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, polivinilpirrolidona (Povidona), hidroxipropil metilcelulosa, sacarosa, almidón y etilcelulosa-sorbitol, o tragacanto; rellenos, por ejemplo, fosfato cálcico, glicocola, lactosa, almidón de maíz, sorbitol o sacarosa; lubricantes, por ejemplo, estearato magnésico, u otros estearatos metálicos, ácido esteárico, polietilenglicol, silicona líquida, talco, ceras, aceites y sílice, sílice coloidal o talco; desintegrantes, por ejemplo, almidón de patata, agentes aromatizantes o colorantes, o agentes humectantes adecuados.
Las preparaciones líquidas orales están en general en forma de soluciones acuosas o aceitosas, suspensiones, emulsiones, jarabes o elixires que pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes no acuosos, conservantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes. Las preparaciones líquidas orales pueden comprender micelas polipeptídicas o formas monoméricas del lipopéptido. Los ejemplos de aditivos para las preparaciones líquidas incluyen goma arábiga, aceite de almendra, alcohol etílico, aceite de coco fraccionado, gelatina, jarabe de glucosa, glicerina, grasas comestibles hidrogenadas, lecitina, metil celulosa, para-hidroxibenzoato de metilo o propilo, propilenglicol, sorbitol, o ácido sórbico.
Para el uso intravenoso (IV) se puede disolver una forma hidrosoluble del modulador de poliaminas o de arginasa en cualquier líquido intravenoso usado habitualmente y administrarlo mediante infusión. Las formulaciones intravenosas pueden incluir vehículos, excipientes o estabilizantes que incluyen, sin limitación, calcio, albúmina de suero humano, citrato, acetato, cloruro cálcico, carbonato, y otras sales. Los líquidos intravenosos incluyen, sin limitación, solución salina fisiológica o solución de Ringer. Los moduladores de poliaminas y de arginasa, opcionalmente acoplados a otras moléculas portadoras, se pueden colocar también en inyectores, cánulas, catéteres y tubos.
Las formulaciones para la administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones isotónicas para inyección estéril acuosas o no acuosas. Estas soluciones o suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles que tienen uno o más de los vehículos mencionados para el uso en las formulaciones para administración oral. Pueden ser especialmente deseables las micelas de lipopéptidos para la administración parenteral. Los compuestos se pueden disolver en polietilen glicol, propilen glicol, etanol, aceite de maíz, alcohol bencílico, cloruro sódico, y/o diversos tampones. Para las preparaciones intramusculares, se puede disolver y administrar una formulación estéril de un agente modulador de poliaminas o de arginasa, o una forma salina soluble adecuada del compuesto, por ejemplo una sal de hidrocloruro, en un disolvente farmacéutico tal como agua para inyección (WFI), solución salina o glucosa al 5%.
Las formas de liberación lenta inyectables se pueden hacer formando matrices microencapsuladas del compuesto en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de fármaco respecto del polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen los poli(ortoésteres) y los poli(anhídridos). También se preparan formulaciones inyectables de liberación lenta atrapando el fármaco en microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Para el uso tópico, los compuestos aplicados en los usos de la presente invención también se pueden preparar en formas adecuadas para ser aplicadas a la piel, o las membranas mucosas de la nariz y garganta, y pueden tomar la forma de cremas, pomadas, aerosoles líquidos o inhaladores, pastillas, o colutorios. Tales formulaciones tópicas pueden incluir además compuestos químicos tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO) para facilitar la penetración superficial del ingrediente activo. Para las preparaciones tópicas, se puede administrar una formulación estéril de un agente modulador de poliaminas o de arginasa, o las formas salinas adecuadas del mismo, en una crema, pomada, aerosol u otra forma tópica. Las preparaciones tópicas pueden estar también en forma de vendajes que se han impregnado con una composición terapéutica.
Para la aplicación a los ojos, nariz u oídos, los compuestos aplicados en los usos de la presente invención se pueden presentar en formas líquidas o semilíquidas, formulados opcionalmente en bases hidrófobas o hidrófilas tales como pomadas, cremas, lociones, pinturas o polvos. Para la administración rectal o vaginal, los compuestos de la presente invención se pueden administrar en forma de supositorios mezclados con vehículos convencionales tales como manteca de cacao, ceras u otros glicéridos. Para las preparaciones en aerosol, se puede usar una formulación estéril del péptido o lipopéptido o de la forma salina del compuesto en inhaladores, tales como inhaladores de dosis medidas, y nebulizadores.
De forma alternativa, los compuestos aplicados en la presente invención pueden estar en forma de polvo para la reconstitución en un vehículo apropiado farmacéuticamente aceptable en el momento de la administración. En una realización, la forma farmacéutica unitaria del compuesto puede ser una solución del compuesto o una sal del mismo, en un diluyente adecuado en ampollas estériles selladas herméticamente. La concentración del compuesto en la dosis unitaria puede variar, p.ej., de alrededor del 1 por ciento a alrededor del 50 por ciento, dependiendo del compuesto usado y de su solubilidad, y de la dosis deseada por el médico. Si las composiciones contienen dosis unitarias, cada dosis unitaria contiene preferiblemente 50-500 mg del material activo. Para el tratamiento de humanos adultos, la dosis empleada oscila preferiblemente de 100 mg a 3 g por día, dependiendo de la vía y de la frecuencia de
administración.
Las composiciones farmacéuticas aplicadas en la invención se pueden administrar también mediante el uso de microesferas, liposomas, u otros sistemas de administración microparticulados o formulaciones de liberación controlada o sostenida colocadas en, cerca, o de otra manera en comunicación con los tejidos afectados, el torrente sanguíneo, el líquido cefalorraquídeo, u otras localizaciones, que incluyen el músculo, que permiten que el agente actúe en una localización afectada del sistema nervioso. Las composiciones de la invención se pueden administrar mediante el uso de sistemas de administración de liberación controlada (p.ej., cápsulas) o sostenida (p.ej., matrices biodegradables). Los sistemas de administración de liberación retardada ejemplares para la administración de fármacos que son adecuados para la administración de las composiciones de la invención se describen en los nºs de patentes de EE.UU. 4.452.775 (expedida a Kent), 5.239.660 (expedida a Leonard), 3.854.480 (expedida a Zaffaroni).
Los ejemplos adecuados de vehículos de liberación sostenida incluyen las matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos con forma tales como supositorios o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen las polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.319; documento EP 58.481), los copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., Biopolymers, 22, págs. 547-56 (1985)); poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o acetato de etilenvinilo (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, págs. 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, págs. 98-105 (1982)).
Se pueden preparar liposomas que contienen agentes moduladores de poliaminas y de arginasa mediante métodos bien conocidos (véase, p.ej., el documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, págs. 3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, págs. 4030-34 (1980); nºs de patentes de EE.UU. 4.485.045 y 4.544.545). Habitualmente, los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (alrededor de 200-800 Angstroms), en los que el contenido de lípidos es mayor de alrededor del 30% mol. de colesterol. La proporción de colesterol se selecciona para controlar la velocidad óptima de liberación del agente.
Los agentes moduladores de poliaminas y de arginasa proporcionados en el presente documento pueden estar también unidos a liposomas, que pueden contener opcionalmente otros agentes para ayudar en el trasporte o en la administración de las composiciones hacia el sitio de tratamiento deseado. La unión de tales agentes a los liposomas se puede llevar a cabo mediante cualquier agente de entrecruzamiento conocido, tal como los agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales que se han usado ampliamente para acoplar toxinas o agentes quimioterápicos a anticuerpos para su administración dirigida. La conjugación a liposomas se puede llevar a cabo también mediante el uso del reactivo de entrecruzamiento dirigido a carbohidratos hidrazida del ácido 4-(4-maleimidofenil) butírico (MPBH) (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Abst. Supl. 16E 77 (1992)).
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Vías de Administración
Las células que se han modificado para que expresen uno o más agentes moduladores de poliaminas o de arginasa proporcionados en el presente documento se usan en los regímenes de tratamiento terapéutico. Tales células modificadas se pueden usar para sintetizar un agente terapéutico que se puede administrar después de manera independiente a un hospedador. De forma alternativa, las células transformadas, transfectadas, o infectadas con un ácido nucleico exógeno tal como ADN o ARN que activa la expresión de un agente modulador de poliaminas o de arginasa de la invención que se secreta o se libera desde la célula modificada se pueden usar directamente como un agente terapéutico, p.ej., mediante la implantación de tales células modificadas en un hospedador en una región que está en comunicación con el tejido o las células seleccionadas como objetivo que necesitan el tratamiento.
Se puede llevar a cabo la administración génica viral o no viral en células que después sobreexpresan un agente modulador de poliaminas o de arginasa según la invención in vitro o in vivo mediante cualquiera de varias técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. Se ha demostrado que varios de tales métodos de administración funcionan con las neuronas. Véase, p.ej., Cherksey et al., documento US 6.210.664 (Método para la transferencia génica al sistema nervioso central que implica un vector de expresión retroviral recombinante); Kaplitt et al., documento US 6.180.613 (Administración mediada por AAV de ADN a células del sistema nervioso); Hayes et al., documento US 6.096.716 (Transfección mediada por liposomas de células del sistema nervioso central); Kochanek et al, documento US 5.981.225 (Vector de transferencia génica, partículas de adenovirus recombinantes que contienen el mismo, método para la producción del mismo y método para el uso del mismo); Gage et al., documento US 5.762.926 (Método para injertar células modificadas genéticamente para tratar defectos, enfermedades o daños del sistema nervioso central); documento WO/008192 (Vectores virales de herpes para la administración génica); y documento CA2247912 (Oligodendrocitos primarios modificados genéticamente para la administración génica mediada por trasplante en el sistema nervioso central).
Como se demuestra en el presente documento, por ejemplo, las células neuronales se pueden infectar con un vector viral que provoca que las células hospedadoras infectadas expresen arginasa a niveles elevados. La arginasa I, que normalmente no es una proteína secretada, se puede modificar para que posea un péptido de señalización necesario para la secreción de una proteína desde una célula hospedadora. Tales péptidos de señalización se caracterizan por su longitud (alrededor de 16-30 aminoácidos) e hidrofobicidad, y porque no están muy conservados a nivel de la secuencia de aminoácidos (véase, p.ej., Lodish et al., Molecular Cell Biology, 3ª ed., Scientific American Books, W.H. Freeman y Compañía, Nueva York, 1995, capítulo 16). Los residuos de aminoácidos que funcionan como una secuencia de señalización para la secreción en una célula eucariótica se pueden modificar en el extremo N-terminal de una proteína heteróloga mediante cualquiera de varios métodos rutinarios de ingeniería genética muy conocidos para los expertos en la técnica. Véase, p.ej., Farrell et al., Proteins, 41, págs. 144-53 (2000) (véase también http://www.healthtech.com/2001/pex); Bomgraber et al., Protein Expr. Purif. 14, págs. 237-46 (1998); Collins-Racie et al., Biotechnology, 13, págs. 982-987 (1995); documentos US 5.747.662; WO00/50616; WO99/53059; y WO96/27016.
Se esperaría que las células hospedadoras que expresan una forma secretada de arginasa elevasen los niveles de arginasa en el líquido cefalorraquídeo (LCR) que baña el sistema nervioso. Tal arginasa convertiría después la arginina del LCR en ornitina, que sería absorbida por otras células tal como ocurre con la arginina, mediante transportadores de aminoácidos catiónicos. De forma alternativa, es posible proporcionar la arginasa, p.ej., mediante inyección, directamente al LCR. La ornitina estaría entonces disponible a niveles mayores para la síntesis de poliaminas por medio de la acción de la ornitina descarboxilasa (ODC) intracelular. Las células transfectadas, que secretan otras formas de agentes moduladores de arginasa, se pueden administrar en los usos de la invención en un sitio de lesión o de degeneración neuronal de una manera similar.
Además, es posible en principio seleccionar como objetivo genes endógenos directamente mediante técnicas de recombinación homóloga. Tales técnicas permiten que el experto sustituya o modifique genes endógenos en una célula de mamífero, para la activación, inactivación o alteración de secuencias que codifican genes, que incluyen las secuencias de transporte intracelular, y de secuencias que no codifican genes (reguladoras), tales como las secuencias de control de la transcripción y otras secuencias reguladoras que controlan los niveles de expresión de los genes seleccionados que modulan la putrescina, las poliaminas o la actividad de arginasa. Para las técnicas de recombinación homóloga, véase, p.ej., los documentos US 6.214.622 y 6.054.288, que se incorporan en el presente documento como referencia. Para las secuencias reguladoras de poliaminas, véanse, p.ej., Veress et al., Biochem. J., 346, págs. 185-191 (2000); Shantz y Pegg; Int. J. Biochem. Cell Biol., 31, págs. 107-122 (1999); Schantz et al., Cancer Res., 56, págs. 3265-3269 (1996a) y Cancer Res., 56, págs. 5136-5140 (1996b).
Los agentes moduladores de putrescina, de las poliaminas derivadas y de arginasa proporcionados en el presente documento se pueden administrar también mediante la implantación raquídea (p.ej., en el líquido cefalorraquídeo) de células u otros materiales biocompatibles modificados para liberar o secretar agentes moduladores de poliaminas y de arginasa según esta invención. Las velocidades de secreción celular o las velocidades de liberación de material del agente se miden in vitro (p.ej., en cultivos celulares cuando sea pertinente), y después se extrapolan basándose en los volúmenes relativos, las semividas in vivo, y otros parámetros entendidos por los expertos en la
técnica.
De forma opcional, las células transfectadas o los materiales de administración biocompatibles que liberan los agentes moduladores de poliaminas y de arginasa se pueden encapsular en cápsulas o cámaras inmunoaislantes, e implantarse en el cerebro o la región de la médula espinal mediante el uso de los métodos disponibles que son conocidos para los expertos en la técnica. Véanse, p.ej., los nºs de patentes de EE.UU. 6.179.826, 6.083.523; 5.676.943; 5.653.975 y 5.487.739; y los documentos WO 89/04655; WO 92/19195; WO93/00127; EP 127.989.
De forma alternativa, se puede implantar o insertar una bomba y un dispositivo similar a un catéter en el sitio de la lesión para administrar un agente de la invención de manera oportuna y a la concentración deseada, que un experto en la técnica puede seleccionar y modificar empíricamente. Los expertos en la técnica conocen bien tales sistemas de administración farmacéuticos. Véase, p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.578.057; para las bombas implantables, véase, p.ej., http://www.medtronic.com/).
En un aspecto adicional, esta invención proporciona una composición para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado a la degeneración neuronal o la carencia de crecimiento neuronal en los mamíferos, que incluyen humanos y otros animales. El término "tratamiento" se usa para indicar tanto la prevención de la muerte neuronal como el control del crecimiento axonal, la formación de brotes axonales, y la proliferación de las células progenitoras neurales después de que el animal hospedador se haya visto afectado. Una afección, enfermedad o trastorno establecido puede ser uno que es agudo o crónico. Las composiciones se deben administrar al humano u otro animal en una dosis eficaz. Una dosis eficaz de putrescina, por ejemplo, es generalmente de entre alrededor de 10^{-6} y alrededor de 10^{6} yM/kg de putrescina, o de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma. La putrescina se puede administrar sola o como parte de una terapia de combinación. Una dosis preferida es de alrededor de 0,5 a alrededor de 80 \muM/kg de putrescina, o de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma. Una dosis más preferida es de alrededor de 1 a 10 \muM/kg de putrescina, o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Un experto en la técnica puede usar estas dosis de putrescina como punto de partida para determinar y optimizar las dosis eficaces de otros agentes moduladores de putrescina y de arginasa de la invención.
En una realización, la invención proporciona una composición para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado a la degeneración neuronal o la carencia de crecimiento neuronal en un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente modulador de putrescina o de arginasa de la invención. Los procedimientos ejemplares para la administración de agentes al sistema nervioso se describen, p.ej., en Cherskey et al., documento US 6.210.664; Kaplitt et al., documento US 6.180.613; Hayes et al., documento US 6.096.716; Kochanek et al, documento US 5.981.225; Gage et al., documento US 5.762.926; documentos WO/008192; y CA2247912.
Como se usa en el presente documento, la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de agente modulador de putrescina o de arginasa proporcionado en el presente documento, de forma que el sujeto muestra una mejora detectable del crecimiento o la regeneración neuronal después de ser tratado con el régimen de administración seleccionado (p.ej., los niveles de dosis y tiempos de tratamiento seleccionados). El término "tratamiento" se define como la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención, para prevenir la existencia o para controlar o eliminar los síntomas asociados a una afección, enfermedad o trastorno asociado a la muerte neuronal o la carencia de crecimiento neuronal. El término "sujeto", como se describe en el presente documento, se define como un mamífero. En una realización preferida, el sujeto es un humano u otro paciente animal que necesita tratamiento.
Un compuesto aplicado en la invención se puede administrar solo, o en combinación con otros compuestos (p.ej., un "cóctel"), que incluye, pero sin limitación, otros compuestos de la invención. Un compuesto de la invención se puede administrar en forma de una única dosis diaria o en múltiples dosis por día. El régimen de tratamiento puede requerir la administración durante períodos de tiempo prolongados, p.ej., durante varios días o durante dos a cuatro semanas. La cantidad por dosis administrada o la cantidad total administrada dependerá de factores tales como la naturaleza y la gravedad de los síntomas, la edad y el estado de salud general del paciente, y la tolerancia del paciente al programa de tratamiento.
Utilidad de los Agentes que Bloquean los Efectos Inhibitorios de la Mielina sobre el Crecimiento y la Regeneración Neuronal
El descubrimiento de que el incremento de los niveles de putrescina (y de las poliaminas derivadas) en una neurona (por ejemplo, mediante el incremento de la actividad de arginasa neuronal) alivia la inhibición del crecimiento neuronal por mielina, y los inhibidores de mielina tales como MAG, tiene un uso clínico potencial en las situaciones de lesión del sistema nervioso central (lesión del SNC). El sistema nervioso central de los mamíferos no se regenera después de una lesión, aunque hay muchas moléculas presentes que estimulan y favorecen el crecimiento del nervio. El resultado de tal lesión puede ser parálisis o daño cerebral. En el SNC adulto hay presentes moléculas que evitarán activamente que un nervio se regenere. Se prevé que si se pueden bloquear estas moléculas inhibitorias, entonces se puede modificar el medio permisivo para la regeneración nerviosa y se puede tratar la lesión
neural.
De forma importante, el comportamiento de una neurona en presencia del inhibidor de mielina específico MAG in vitro es paralelo a su comportamiento en presencia de mielina tanto in vitro como in vivo. Sin pretender limitarse por la teoría, esto sugiere que se pueden usar mecanismos moleculares similares para superar una diversidad de inhibidores del crecimiento neuronal. Los sistemas de ensayo descritos en el presente documento son así extremadamente útiles para monitorizar el efecto de una diversidad de agentes, solos o en combinación, sobre los efectos inhibitorios de la mielina sobre el crecimiento neuronal. Se pueden diseñar estrategias para buscar agentes que alivien la inhibición y que permitan que las neuronas crezcan en presencia de los inhibidores de mielina en general o de MAG en particular. El agente (o combinación de agentes) se puede administrar después a nervios dañados, por lo que se invierten los efectos inhibitorios de la mielina o MAG in vivo y se permite que tenga lugar la regeneración
nerviosa.
Mediante el uso de los sistemas de ensayo descritos en el presente documento, se demostró que los efectos inhibitorios de la mielina y de MAG se bloquean o se alivian parcialmente o totalmente mediante los agentes que incrementan los niveles de putrescina y de poliaminas derivadas, lo que incluye los agentes que incrementan la actividad de la arginasa en una neurona. Estos agentes que pueden modular la putrescina, las poliaminas derivadas o la actividad de la arginasa en una neurona se pueden administrar, solos o en combinación, a nervios dañados para invertir los efectos inhibitorios de la mielina o de MAG in vivo y para permitir que tenga lugar la regeneración.
Además, se pueden usar las propiedades de MAG como señal de guiado axonal negativa para guiar los axones en regeneración a sus destinos correctos y mantenerlos en la vía correcta. Para este fin, los agentes moduladores de putrescina o de arginasa que pueden alterar (p.ej., incrementar) los niveles de poliaminas en una neurona se pueden administrar a las regiones precisas del tejido nervioso en regeneración para favorecer o contener el crecimiento a lo largo de vías exactas.
Los agentes que incrementan los niveles de putrescina y de poliaminas derivadas en una neurona, que incluyen los agentes que incrementan la actividad de arginasa, y las composiciones que comprenden tales agentes serán útiles así para la regulación del crecimiento o la regeneración neural en el sistema nervioso, y para el tratamiento de lesiones o daños del tejido nervioso o las neuronas. Las composiciones serán útiles también para el tratamiento de la degeneración neural asociada a trastornos o enfermedades y para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociada a la apoptosis, necrosis u otras formas de muerte celular, tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, kuru, atrofia sistémica múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), y parálisis supranuclear progresiva. Las composiciones descritas en el presente documento pueden ser útiles también para el tratamiento de una lesión o anormalidad neural asociada a una lesión de la médula espinal, lesión cerebral, accidente cerebrovascular, encefalitis (viral o no viral), enfermedad mitocondrial y
kuru.
Se prevé también que los agentes que incrementan los niveles de putrescina y de poliaminas derivadas, que incluyen los agentes que incrementan la actividad de arginasa en una neurona, serán útiles para el tratamiento de los defectos y trastornos de la memoria y del aprendizaje asociados a la muerte neuronal o a la carencia de crecimiento neuronal. Existen muchas similitudes moleculares y morfológicas entre la capacidad dependiente del cAMP de las neurotrofinas y de dbcAMP para superar la inhibición por MAG y mielina y los cambios asociados a la memoria y el aprendizaje (Bach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, págs. 5280-85 (1999)). El modelo animal de adquisición de memoria se denomina "potenciación a largo plazo". La potenciación a largo plazo es dependiente del cAMP, dependiente de la transcripción y es el resultado del brote de axones (Ma et al., Nat. Neurosci., 2, págs. 24-30 (1999)). Por lo tanto es probable que la arginasa, la putrescina y las poliaminas derivadas de putrescina estén implicadas en los aspectos moleculares de la memoria y el aprendizaje, tal como lo están en la regeneración neuronal mediante la superación de la inhibición por los inhibidores de mielina tales como MAG.
Se prevé que la aplicación in vivo, después de la lesión, de inhibidores de la mielina o de MAG tales como los agentes moduladores de putrescina y de arginasa de forma individual o en diversas combinaciones bloqueará los efectos inhibitorios de la mielina, de MAG y/o de otras moléculas inhibitorias, y favorecerá que tenga lugar la regeneración axonal, y en particular aliviará o bloqueará la inhibición de la mielina o MAG endógena sobre el crecimiento neuronal, y por lo tanto permitirá la regeneración nerviosa.
Los siguientes son ejemplos que ilustran la invención. Se usan métodos para identificar los agentes moduladores de putrescina y de arginasa (y de otras poliaminas derivadas) que inhiben el efecto regulado en el desarrollo de la mielina y de MAG sobre el crecimiento de las neuritas. Estos ejemplos no se deberían considerar limitantes: los ejemplos se incluyen con fines ilustrativos solamente, y la presente invención está limitada solamente por las reivindicaciones.
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Ejemplo 1
Ensayos de Crecimiento de Neuritas en Presencia de MAG o Mielina Aislamiento de Neuronas
Se aislaron neuronas básicamente como se describe en Doherty et al., Nature, 343, págs. 464-66 (1990); Neuron, 5, págs. 209-19 (1990); y Kleitman et al., Culturing Nerve Cells, págs. 337-78, MIT Press, Cambridge, MA/Londres, Inglaterra (G. Banker y K. Goslin, Eds.) (1991). Brevemente, para animales de hasta nueve días de edad, se extrajo el cerebelo de dos animales y se combinaron en 5 ml de tripsina del 0,025% en PBS, se trituraron, y se incubaron durante 10 minutos (min) a 37ºC. La tripsinización se paró mediante la adición de 5 ml de DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal (FCS), y las células se centrifugaron a 800 rpm durante 6 min. Las células tripsinizadas se resuspendieron hasta una suspensión de células individuales en 2 ml de SAT que contenía un 2% de FCS (progesterona, 20 nM; selenio, 30 nM; putrescina, 100 \muM; insulina, 5 \mug/ml; BSA 4 mg/ml; L-tiroxina, 0,1 \mug/ml; triyodotironina, 0,08 \mug/ml) (Doherty et al., 1990). Para las neuronas DRG más viejas, se extrajeron los ganglios de dos animales y se incubaron en 5 ml de medio Sat que contenía tripsina del 0,025% y colagenasa de tipo I del 0,15% (Worthington) durante 30 min a 37ºC. Los ganglios se trituraron con una pipeta Pasteur pulida al fuego. La tripsinización se paró mediante la adición de 5 ml de DMEM que contenía un 10% de FCS, se centrifugó a 800 rpm durante 6 min, y se resuspendió en 2 ml de SAT (DeBellard et al., 1996). Las células se contaron con un contador
Coulter.
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Expresión de MAG Mediante Células CHO Transfectadas
Se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes del gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, págs. 4216-20 (1980)) con un plásmido de expresión de cADN de MAG con el gen dhfr y el cADN de L-MAG, las células con múltiples copias de dhfr se seleccionaron cultivándolas en concentraciones crecientes de metotrexato, y se caracterizó la expresión de MAG por las líneas de células CHO transfectadas individuales como se describe en Mukhopadhyay et al., Neuron, 13, págs. 757-67 (1994), que se incorpora en el presente documento como referencia. La línea de células CHO transfectada que expresaba MAG ("CHO-MAG2") en esa publicación se depositó el 27 de junio de 1996 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según las estipulaciones del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso de la ATCC designado: ATCC CRL-12145. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del depósito de la ATCC anterior se eliminarán de manera irrevocable tras la concesión de una patente sobre esta
solicitud.
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Ensayos de Crecimiento de Neuritas con Células CHO que Expresan MAG y Mielina
El crecimiento de neuritas con mielina o con células CHO transfectadas fue como se describió (Mukhopadhyay et al., 1994; Cai et al., 1999) con las siguientes modificaciones. El ensayo de crecimiento de neuritas se llevó a cabo mediante la adición de 5 x 10^{4} neuronas al sustrato de mielina inmovilizada, o 2 x 10^{4} neuronas a las monocapas de células CHO. Brevemente, se establecieron monocapas confluentes de células de control y de células CHO que expresaban MAG durante un período de 24 horas (h) en cámaras individuales de una placa de cultivo de tejidos de 8 pocillos (Lab-Tek). Se establecieron co-cultivos como se describió previamente (Doherty et al., Nature, 343, págs. 464-66 (1990); Neuron, 5, págs. 209-19 (1990); Mukhopadhyay et al., Neuron, 13, págs. 757-67 (1994)) mediante la adición de aproximadamente 5000 neuronas cereberales y de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) a las monocapas de CHO. El medio de cultivo fue SATO que contenía un 2% de FCS.
Donde se indica, se añadieron los agentes de ensayo dibutiril cAMP (dbcAMP) 1 mM en presencia o ausencia del inhibidor de la transcripción, 5,6-dicloro-1-b-D-ribofuranosilbencimidazol (DRB) a 5 \muM (Zandomeni et al., 1983), a un cultivo durante todo el período de co-cultivo, o las monocapas se incubaron con los agentes durante una hora antes de añadir la suspensión de células neuronales y se incluyeron durante todo el período de co-cultivo. Donde se indica, se incluyó un inhibidor específico de la ornitina descarboxilasa, hidrocloruro de DL-a-difluorometil-ornitina (DFMO) (Danzin et al., Life Sci., 24, págs. 519-524 (1979)) (1 mM) con BDNF, GDNF o dbcAMP en los ensayos de cultivo de neuronas.
Todos los tipos de cultivos de neuronas se inmunotiñeron para GAP43 como se describe más adelante (véase también Mukhopadhyay et al., 1994). El anticuerpo hacia GAP43 se detectó mediante tinción con rojo Texas y el anticuerpo hacia la arginasa se detectó con un anticuerpo secundario anti-biotina seguido de estreptavidina conjugada a rojo Texas. Alrededor del 98% de los cultivos fueron positivos para GAP43.
Después de los períodos de tiempo indicados, los co-cultivos se fijaron durante 30 min con un 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con metanol helado durante 2 min. Las células se bloquearon después durante 30 min con DMEM que contenía un 10% de FCS, y se incubaron durante 2 hrs con un anticuerpo policlonal de conejo hacia el marcador neuronal GAP43 (1:4000) (proporcionado por G.P. Wilkin; véase Curtis et al., J. Neurocytology, 22, págs. 39-50 (1993); los anticuerpos monoclonales específicos de GAP 43 están disponibles de Boehringher Mannheim, nº de cat. 1379 011, clon 91E12. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía un 2% de BSA y después se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con Ig anti- conejo de burro biotinilada (1:300, Amersham), se lavaron tres veces, y se incubaron con rojo Texas conjugado a estreptavidina (1:300, Amersham) durante 30 min. Después de tres lavados más, los portaobjetos se montaron con Permfluor (Baxter) y se observaron con un microscopio fluorescente Zeiss. Se determinó la longitud de la neurita más larga para cada neurona positiva para GAP43 mediante el uso del programa de análisis de imágenes Biological Detection System
(Pittsburgh).
Para las neuronas DRG, se determinó la longitud de la neurita más larga para cada neurona positiva para GAP43 para las primeras 180-200 neuronas encontradas al examinar el portaobjetos de una manera sistemática mediante un programa de análisis de imágenes de Oncor. Se obtuvieron los mismos efectos cuando se midieron las prolongaciones totales en vez de la neurita más larga. Para las neuronas infectadas con adenovirus, solamente se midieron las neuronas que fueron positivas tanto para GAP43 como para GFP. Las medidas de las neuritas se compararon entre grupos mediante el uso de un análisis unívoco de la varianza (ANOVA).
De forma alternativa, se pueden usar otros anticuerpos específicos de neuronas tales como los anticuerpos monoclonales anti-neurofilamentos, que están disponibles comercialmente (p.ej., Boehringher Mannheim, Sigma Immunochemicals), comenzando con las diluciones recomendadas por el fabricante. Después se selecciona el anticuerpo secundario anti-Ig biotinilado específico de especie apropiado según la especie en la que se generó el anticuerpo anti-neural primario. Además, se pueden usar diversas tinciones vitales (p.ej., Molecular Probes, Oregon) que tiñen las neuritas en este ensayo en lugar de un anticuerpo específico neural fluorescente.
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Ejemplo 2
Análisis de la Expresión de Arginasa en las Neuronas Extracción de ARN, Transcripción Inversa y Análisis Mediante PCR
Se sensibilizaron neuronas cerebelares con neurotrofinas (BDNF, GDNF) o dbcAMP según los procedimientos del Ejemplo 1. Se extrajo el ARN y las proteínas de las neuronas sensibilizadas. El ARN extraído se usó como molde para la transcripción inversa y la amplificación mediante PCR, con el uso de cebadores específicos para el gen que codifica la enzima arginasa I ("Arg I"), una isoforma de la arginasa abundante en el tejido hepático, pero apenas detectable en otros tejidos.
Se aisló el ARN total de 2x10^{6} neuronas, (algunas de las cuales se trataron con BDNF a 200 ng/ml o dbcAMP 1 mM durante la noche) mediante el uso del equipo RNeasy^{TM} (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se sintetizó el cADN a partir del ARN total cebando con hexámeros aleatorios y añadiendo una enzima de transcripción inversa (Stratagene) a 37ºC durante 2 hr. Después de ello, se amplificó el cADN de ArgI con cebadores específicos de Arg I (véase más adelante) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores se obtuvieron de GibcoBRL.
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Cebador: Arg-197F (nº de cta. N5682H09)
5' GTC CCC AAT GAC AGC CCC 3'
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Cebador: Arg-700R (nº de cta. N5682H10)
5' CTT TTC TTC CTT CCC AGC AG 3'
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Las reacciones de la PCR se programaron como sigue: Un ciclo a 94ºC durante 4 min, seguido de 30 ciclos, en los que cada ciclo consiste en 94ºC durante 30 seg, seguido de 58ºC durante 30 seg, seguido de 72ºC durante 1,5 min. El último ciclo fue a 72ºC durante 5 min.
Finalmente, las muestras de cADN de ArgI amplificadas se detectaron mediante separación electroforética en un gel de agarosa del 1% y tinción con bromuro de etidio. Los resultados de la amplificación mediante PCR se muestran en la Figura 4.
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Extracción de Proteínas y Análisis de Transferencia de Western de la Expresión de Arginasa
Las neuronas se lisaron, se extrajeron las proteínas y las proteínas extraídas (23 \mug de proteína total por carril) se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (12%) (SDS-PAGE) según procedimientos bien conocidos (véase Ausubel et al., anteriormente mencionado). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se inmunotiñeron con un anticuerpo hacia Arg I. Los resultados se muestran en la Figura 5, en la que las flechas indican la posición del polipéptido ArgI. Se generaron anticuerpos policlonales hacia la arginasa recombinante de Cavalli et al., Biochemistry, 33, págs. 10652-657 (1994), que describió la expresión recombinante y la purificación de arginasa I de hígado de rata en E. coli. Los anticuerpos policlonales se generaron básicamente según los procedimientos de Hanly et al., ILAR Journal, 37, págs. 141-152 (1995).
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Ejemplo 3
Corte Transversal del Nervio Ciático y Aislamiento de los Ganglios de la Raíz Dorsal de Ratas
Se llevó a cabo el corte transversal y el aislamiento de nervios periféricos (ciáticos) de DRG de ratas básicamente como describió previamente Zhou, XF et al., J. Neurosci. 16, págs. 2901-2911 (1996). Se cortó transversalmente el nervio ciático del lado izquierdo a nivel de la mitad del muslo en ratas P18 (Harlan Sprague Dawley). En diferentes momentos (0,5 hr, 1 hr, 4 hr, 8 hr, 18 hr, 2 días (d), 3 d y 7 d) después de la lesión, se extrajeron los DRG del lado lesionado (I) así como del lado contralateral sin lesionar (C), y las proteínas se extrajeron y se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotinción (transferencia de Western) mediante el uso del anticuerpo policlonal anti-arginasa I descrito en el Ejemplo 4. (Figura 10). Las neuronas DRG sin operar se analizaron en paralelo como control (U).
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Ejemplo 4
Expresión Ectópica de Arginasa en las Neuronas Cereberales
El sistema de adenovirus ejemplificado en el presente documento implica una nueva generación de adenovirus en la que las regiones tempranas E1 y E3 se han eliminado. Esto proporciona espacio para la inserción de un casete de expresión de un gen o genes de hasta 7,5 kB de longitud. (Berkner, K.L, Biotechniques, 6, págs. 616-629 (1988); Massie, B et al., Cytotechnology, 28, págs. 53-64 (1998b). El adenovirus tiene un gran uso potencial en las neuronas. El virus entra en la célula, pero no puede replicarse porque los genes tempranos E1 esenciales están ausentes. El adenovirus permanece epicromosómico en todas las células conocidas excepto en los óvulos, y por lo tanto las diferencias de expresión y otros efectos biológicos debido a una integración aleatoria en el cromosoma hospedador no son preocupantes.
Se subclonó el fragmento EcoR1/Pst1 del cADN de arginasa de hígado de rata en el vector de transferencia de adenovirus pAdCMV-GFP (Berkner, anteriormente mencionado, y Massie et al., anteriormente mencionado). Este vector de transferencia tiene un promotor de CMV5 y GFP como gen indicador en un casete de expresión IRES, para proporcionar niveles de expresión muy elevados y un cribado sencillo de la visualización de la eficacia de recombinación y de transducción (disponible de Qbiogene, Montreal, Canadá). Se verificó mediante transfección transitoria e inmunotransferencia con un anticuerpo hacia arginasa I (Ejemplo 2) que el cADN de la arginasa I subclonado en el vector de transferencia pudo dirigir la síntesis de la proteína arginasa I. Estos estudios confirmaron que el inserto subclonado estuvo en la orientación apropiada. Los recombinantes adenovirales se generaron mediante recombinación homóloga in vivo en células QBI-293A (Qbiogene, Montreal, Canadá). La inserción del ADN mediante recombinación homóloga es la manera más eficaz de introducir un gen en AdV, porque el genoma es demasiado grande (36 kb) para manipularlo fácilmente. La recombinación in vivo entre las dos moléculas de ADN produce virus infecciosos recombinantes. El virus purificado de placas se amplifica en células 293, seguido de purificación en gradiente de CsCl_{2} doble y titulación de las partículas virales. Se hizo un adenovirus que carecía de arginasa I y que incluía un cADN de GFP para usarlo como control. Para los detalles sobre la construcción del vector, véase Berkner, K.L., Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes, Biotechniques, 6, págs. 616-629 (1988)); y Massie, B. et al., New adenovirus vectors for protein production and gene transfer, Cytotechnology, 28, págs. 53-64
(1998B)).
Las neuronas cerebelares se infectaron con el Ad-GFP o Ad-GFP/ArgI. Las neuronas se colocaron en placas a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10^{6} células por placa de cultivo de 6 cm (Corning Glass Works, Corning, NY, EE.UU.). Las células subconfluentes se expusieron a diversas multiplicidades de infección (MOIs) de vectores adenovirales en medio exento de suero. Después de 4 horas, se añadió suero bovino fetal (concentración final, 10%; GIBCO), y la incubación continuó durante 18 horas adicionales antes de llevar a cabo los ensayos de crecimiento de neuritas.
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Preparación de Lisados y Análisis Mediante Inmunotransferencia
Para la medida de los niveles de la proteína arginasa I mediante inmunotransferencia, las células se recogieron y se lavaron con PBS helado y después se resuspendieron (100 \mul/10^{7} células) en tampón de extracción helado que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, EDTA 2 mM, 1% de Triton-X 100, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, 10 microgramos/ml de leupeptina, pepstatina 1 micromolar, N-etilmaleimida (NEM) 1 mM, Na_{3}VO_{4} 2 mM, pirofosfato sódico 20 mM, y NaF 50 mM). Los lisados se centrifugaron a 15.000 RPM a 4 grados centígrados durante 30 minutos. El citosol claro se separó de la fracción de sedimento insoluble y se usó inmediatamente para la inmunotransferencia. Los sobrenadantes se extrajeron cuidadosamente y se cuantificó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. Los lisados se mezclaron con tampón de Laemmli en ebullición (1x es Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, 4% de SDS, ditiotreitol 200 mM, 20% de glicerol, 2% de SDS, 0,2% de azul de bromofenol, 10 microgramos/ml de aprotinina, 10 microgramos/ml de leupeptina). Las muestras se hicieron hervir durante 10 minutos a 100ºC y se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 segundos. Aproximadamente 30 microgramos de proteína se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras en geles del 10% de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada en TBST (Tris, pH 7,4; NaCl 150 mM; 0,05% de Tween 20) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las transferencias se expusieron a una sonda de anticuerpos primarios durante la noche a 4ºC, seguido de incubación con IgG anti-conejo o anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 1 hora. Las señales se detectaron mediante el uso del sistema ECL (Amersham Corp, Arlington Heights,
Illinois).
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Determinación de la Actividad de Arginasa
Se llevó a cabo la determinación de la actividad de arginasa en los lisados de células que se habían infectado con el vector adenovirus-arginasa I durante 24 horas. Las células cultivadas se lisaron en un 0,1% de Triton X-100 que contenía Pefabloc 2 mM, 2 microgramos/ml de pepstatina A, y 10 microgramos/ml de leupeptina. Los lisados se centrifugaron a 12.000 x g durante 10 min, y los sobrenadantes se recogieron para los ensayos de actividad de arginasa. La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de ácido bicinconínico (Pierce).
La actividad de arginasa en los lisados celulares se determinó monitorizando la conversión de [guanidino-^{14}C]arginina a [^{14}C]urea, mediante el uso de una combinación de los métodos de Ruegg y Russel (Ruegg, UT y Russell, AS. A rapid and sensitive assay for arginase. Anal. Biochem., 102, págs. 206-212 (1980)); y Cederbaum y Spector (Cederbaum, SD, y Spector, EB Arginase activity in fibroblasts. Am. J. Hum. Genet., Enero 30(1), págs. 91-92
(1978)).
Brevemente, se añadió [guanidino-^{14}C]arginina a los lisados durante 30 minutos a 37ºC, y la reacción se finalizó calentando a 100ºC durante 3 minutos. Después se añadió ureasa de Canavalia ensiformis al lisado y la reacción de la ureasa se finalizó después de 45 minutos mediante la adición de HCl 2 N. El ^{14}CO_{2} liberado, atrapado en forma de Na_{2}^{14}CO_{3}, se cuantificó mediante recuento de centelleo. Una unidad de arginasa se define como la cantidad de enzima que produce un micromol de urea por minuto a 37ºC. (Véanse también los ensayos de actividad de arginasa en, p.ej., Esch et al., J. Neurosci., 18, págs. 4083-4095 (1998); Wu y Meninger, Am. J. Physiol., Heart Circ. Physiol., 265, págs. H1965-H1971 (1993)).
Las neuronas infectadas con adenovirus se pudieron distinguir por la expresión del marcador de proteína fluorescente verde (GFP). El marcador GFP se visualiza mediante el uso de técnicas de microscopía de fluorescencia habituales. La GFP emite fluorescencia verde cuando se ilumina con luz de 488 nm. La fluorescencia emitida se detecta mediante el uso de un filtro de emisión de paso de banda largo de 505 nm. La fluorescencia se puede detectar ocularmente o mediante el uso de una cámara de intensificación de imágenes, un conversor analógico a digital y un soporte informático de procesamiento de imágenes habitual. (Current Protocols in Neuroscience, volumen 1, Crawley et al., eds, John Wiley and Sons, editorial, 1997). Se observaron las células por medio de un microscopio de fluorescencia con un filtro de fluorescencia de 510 nm. Después de 1 hora de infección, las neuronas se lavaron y se incubaron con medios Sat durante otras 24-48 hrs para que se recuperasen (Doherty et al., Neuron, 5, págs. 209-19 (1990)). Las neuronas se transfirieron después a células CHO que expresaban MAG o de control para el crecimiento de las neuritas y la inmunotinción con GAP43 (Ejemplo 1). Las neuronas positivas para GFP se distinguieron de las células gliales, que también se infectan con adenovirus, mediante la inmunotinción con GAP43 (véase la
Figura 9).
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Ejemplo 5
Ensayos de Crecimiento de Neuritas con Células CHO para Ensayar Agentes Moduladores Putativos de Poliaminas y Arginasa que Afectan a la Regulación del Crecimiento de las Neuritas por Mielina o MAG
Se puede usar el ensayo con células CHO transfectadas descrito en el Ejemplo 1 para cribar e identificar agentes que alteran las propiedades de crecimiento de las neuritas de un tipo y edad particular de células neuronales de una manera dependiente de la mielina o MAG. Este ensayo se puede usar para analizar otros agentes moduladores putativos de arginasa, putrescina y poliaminas derivadas de putrescina, incluyéndolos en el co-cultivo y midiendo su efecto en presencia y ausencia de MAG o mielina en la superficie celular, como se describió anteriormente
(Ejemplo 1).
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Ejemplo 6
Modulación Experimental de la Putrescina, las Poliaminas Derivadas de Putrescina y la Actividad de Arginasa
También se prevé en principio que otras aproximaciones para la regulación de la putrescina, las poliaminas derivadas de putrescina y la actividad de arginasa sean eficaces para aliviar la inhibición de la regeneración y la reparación en el sistema nervioso. La activación o la potenciación de la actividad de arginasa en las neuronas, por ejemplo, se puede llevar a cabo en una diversidad de maneras que serán evidentes para los expertos en la técnica. Los activadores en forma de moléculas pequeñas de la arginasa serán útiles, y los expertos en la técnica los conocen. Se pueden identificar fácilmente inhibidores nuevos de la arginasa mediante el uso de ensayos enzimáticos rutinarios o de otro tipo para la actividad biológica de la arginasa. Además, la activación o la potenciación de la actividad de la arginasa en las neuronas, por ejemplo, se puede llevar a cabo mediante técnicas de transferencia génica.
Los expertos en la técnica conocen la transferencia génica mediada por virus o sin virus en neuronas y células gliales del sistema nervioso. Los polinucleótidos de arginasa que son capaces, tras la expresión, de elevar la actividad de arginasa en una célula del sistema nervioso se pueden transferir a tal célula directamente. La sobreexpresión de arginasa elevará los niveles de ornitina, y de la misma forma los niveles de putrescina y de poliaminas derivadas de putrescina en los líquidos que bañan las células del sistema nervioso, p.ej., el LCR, que después se pueden transportar a las células en comunicación con esos líquidos. De forma alternativa, los genes que regulan la expresión de la arginasa en las células del sistema nervioso, y preferiblemente en las células neuronales, se pueden usar para modular la actividad transcripcional del gen de arginasa. Se considera que la expresión inducible y regulada de otra forma de los polinucleótidos de arginasa está dentro del alcance de esta invención mediante el uso de secuencias de control de la transcripción y sistemas de expresión conocidos y disponibles para la regulación de genes heterólogos.
Aunque no es parte de la presente invención, los efectos biológicos opuestos a los demostrados en el presente documento (p.ej., el bloqueo del crecimiento o la regeneración neuronal) pueden ser deseables en ciertas situaciones, tales como el guiado del crecimiento neuronal o axonal controlado en presencia de activadores del crecimiento neuronal. Tales efectos se pueden llevar a cabo en una neurona mediante el bloqueo de la señalización del cAMP, la actividad de la arginasa I o la formación de putrescina y poliaminas derivadas de putrescina. Una manera de llevar a cabo esto es inhibir las subunidades catalíticas de la proteína quinasa A (PKA) con moléculas que se pueden unir a los sitios de unión del ATP en PKA. Se han descrito los inhibidores que compiten con la unión del ATP, y serán útiles para tales fines. Estos incluyen H89 (5 \muM) (Chijiwa et al., J. Biol. Chem., 265, págs. 5267-72 (1990)) y KT5720 (200 nM) (Kase et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 142, págs. 436-440 (1987)). También se conocen los inhibidores de la subunidad reguladora de PKA que compiten con el sitio de unión de cAMP. Tales inhibidores de la subunidad reguladora de PKA (p.ej., Rp-cAMP (20 \muM)) serán útiles para bloquear la señalización mediante cAMP, la actividad de la arginasa I y la formación de putrescina y de poliaminas derivadas de putrescina en una neurona (Rothermel et al., Biochem. J., 251, págs. 757-62 (1988)).
Además, como se describe en el presente documento, DFMO (1 mM) es un inhibidor atóxico, específico e irreversible de la ornitina descarboxilasa (ODC) que libera una imina conjugada que se une a ODC y que por lo tanto inhibe su actividad catalítica. (Danzin et al., Life Sci., 24, págs. 519-524 (1979)). Se prevé que será posible dirigir el DFMO a neuronas específicas seleccionadas como objetivo de una manera que bloquee la acción de la ODC, y así la ruta mediante la cual los inhibidores de la mielina afectan al crecimiento neuronal.

Claims (10)

1. El uso de una composición que comprende arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para la preparación de una composición farmacéutica para la estimulación de la regeneración neural en una enfermedad neurodegenerativa.
2. El uso de una composición que comprende putrescina para la preparación de una composición farmacéutica para la estimulación de la regeneración neural en el sistema nervioso central (SNC) asociada a una enfermedad neurodegenerativa.
3. El uso de una composición que comprende arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
4. El uso de una composición que comprende putrescina para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa asociada al SNC.
5. El uso de una composición que comprende putrescina, arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una lesión de la médula espinal, lesión cerebral, encefalitis o accidente cerebrovascular.
6. Una composición que comprende arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para la estimulación de la regeneración neural en una enfermedad neurodegenerativa.
7. Una composición que comprende putrescina para la estimulación de la regeneración neural en el sistema nervioso central (SNC) asociada a una enfermedad neurodegenerativa.
8. Una composición que comprende arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
9. Una composición que comprende putrescina para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa asociada al SNC.
10. Una composición que comprende putrescina, arginasa, un ácido nucleico que codifica arginasa o una célula que expresa arginasa para el tratamiento de una lesión de la médula espinal, lesión cerebral, encefalitis o accidente cerebrovascular.
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