ES2322334T3

ES2322334T3 - Celulas pluripotentes somaticas.

Info

Publication number: ES2322334T3
Application number: ES02257930T
Authority: ES
Inventors: Shiaw-Min Hwang
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2009-06-19
Anticipated expiration: 2022-11-18
Also published as: AU2002302089A1; SG129236A1; KR100879079B1; CA2413275A1; ATE426661T1; KR20040010029A; EP1384775A1; CN1470633B; US20040018617A1; CN1470633A; JP4685322B2; EP1384775B1; US7422736B2; JP2004057198A; DE60231708D1; TW200401828A; AU2002302089B2; TWI316962B; CA2413275C

Abstract

Un procedimiento para producir células animales pluripotentes, comprendiendo el procedimiento: cultivar células madre mesenquimáticas aisladas de un tejido de un animal en condiciones de privación; y Identificar y enriquecer las células pluripotentes entre las células cultivadas, en el que las células pluripotentes, cuando se introducen en un ratón SCID, se desarrollan en un teratoma y en el que las células son negativas para el antígeno embrionario específico de fase-1.

Description

Células pluripotentes somáticas.

Antecedentes

Las células madre embrionarios pluripotentes (ES) se obtienen de embriones prematuros de mamífero. Pueden diferenciarse in vivo en todos los linajes celulares y, cuando se inducen in vitro, se diferencian en la mayoría de los tipos celulares. Debido a su pluripotencia, se cree que las células ES son muy prometedoras para tratar enfermedades degenerativas o hereditarias. Las consideraciones éticas han impedido el uso de células ES humanas en investigación y terapia. Las células pluripotentes de origen no embrionario (por ejemplo, células somáticas) sortearían este obstáculo.

Se ha informado de que algunas células somáticas pueden desarrollarse en células de tipos tisulares no relacionados. Sin embargo, su potencial de desarrollo está limitado.

El documento WO 02/34890 desvela células somáticas que se des-diferencian para dar lugar a células madre cromosómicamente normales (células ES soma-derivadas) que expresan Oct-4 y tienen la capacidad de formar células de los linajes mesodérmico, endodérmico y ectodérmico. Esto se consigue "maltratando" las células somáticas, usando condiciones desfavorables para su crecimiento (por ejemplo, el uso del Factor Inhibidor de Leucocitos).

El documento WO 01/21767 desvela que se aíslan células madre tipo embrionarias derivadas de tejido adulto congelando y descongelando, que es un procedimiento derivado de uno usado para el aislamiento de células madre mesenquimáticas. Estas células han mostrado diferenciarse en linajes mesenquimáticos (osteoblastos, condrocitos, adipocitos, músculo) así como endodérmicos (epitelio gastrointestinal) y ectodérmicos (neuronas, células de la glía, queratinocitos). Las células son SSEA-1 positivas.

Existe la necesidad de células somáticas que tengan potencial ilimitado de desarrollo.

Sumario

La presente invención produce una célula animal pluripotente que tiene un cariotipo normal y que es capaz, cuando se induce in vitro, de desarrollarse en un cuerpo embrioide, es decir, una masa celular que puede desarrollarse adicionalmente en estructuras que tienen características de un órgano. Los ejemplos de dichas estructuras incluyen un intestino primordial, que muestra contracción y relajación regular. La célula pluripotente cultivada es somática ya que es de un origen no embrionario o de línea no germinal.

La invención también es capaz de producir una célula animal que tiene un cariotipo normal que es capaz de, cuando se introduce en un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), desarrollarse en un teratoma. Un teratoma es un tumor que contiene tejidos derivados de las tres capas germinales embrionarias, es decir, el ectodermo, el mesodermo, y el endodermo. Los ejemplos de los tejidos incluyen la córnea, el cristalino y epidermis en desarrollo (ectodermo), cartílago y músculo estriado (mesodermo), y el hígado y tractos gastrointestinales (endodermo). En una realización, la célula pluripotente, cuando se induce in vitro, puede desarrollarse en un cuerpo embrioide. La célula cultivada no expresa el antígeno embrionario específico de fase-1 (SSEA-1), es decir, es SSEA-1 negativo.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención muestra un procedimiento para producir células animales pluripotentes, tales como las descritas anteriormente. El procedimiento incluye (1) cultivar células madre mesenquimáticas en condiciones de privación; y (2) identificar y enriquecer las células pluripotentes entre las células cultivadas. Las células pluripotentes enriquecidas, cuando se introducen en ratones SCID, se desarrollan en teratomas, y no expresan el antígeno embrionario específico de fase-1 (SSEA-1), es decir, son SSEA-1 negativas. Las células madre mesenquimáticas pueden aislarse de mamíferos, incluyendo un ser humano. Puede usarse cualquier tejido adecuado para aislar células madre mesenquimáticas para su uso en este procedimiento. Los ejemplos de dichos tejidos incluyen sangre de cordón umbilical, médula ósea, fluido amniótico, tejido adiposo, placenta, y sangre periférica.

Para producir células pluripotentes, las células aisladas se cultivan en condiciones de privación desfavorables para que crezcan las células, por ejemplo, en un medio de privación que contiene suero del 0,5% al 2% durante 5-10 días, o en un medio habitual que contiene suero del 10% al 20% durante 7 a 21 días sin cambiar el medio. Un medio habitual contiene nutrientes y factores que promueven la proliferación celular. Un medio de privación es bajo en nutrientes y factores para la proliferación celular. Los nutrientes incluyen suero y reemplazos del suero, y los factores incluyen insulina, factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento de fibroblastos ácidos (aFGF), y factores de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF). Entre las células cultivadas en condiciones de privación, las células pluripotentes pueden identificarse y enriquecerse en base a, por ejemplo, su morfología y marcadores de superficie celular (por ejemplo, SSEA-1 negativas).

Fue inesperado que las células somáticas pluripotentes de la invención puedan producirse en condiciones de privación. Otras características o ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y también a partir de las reivindicaciones.

Descripción detallada

La presente invención se refiere al cultivo de células madre mesenquimáticas en condiciones de privación para producir células pluripotentes. Estas células son pluripotentes ya que se desarrollan en cuerpos embrioides cuando se inducen in vitro, o se desarrollan en teratomas cuando se introducen en ratones SCID. Las células tienen todos los cromosomas, que son característicos de los de células normales, y no tienen alteraciones apreciables. En otras palabras, tienen un cariotipo normal.

Las células tienen fenotipos característicos de células ES indiferenciadas. En un ejemplo, forman espontáneamente colonias esferoides aplanadas en cultivos. Se han hallado colonias similares en el cultivo de células ES indiferenciadas. Véase, por ejemplo, Thomson J. y col., Science, 282: 1145-1147, 1998. Las células también pueden mostrar propiedades antigénicas características de células ES indiferenciadas, por ejemplo, que no expresan antígeno embrionario específico de fase (SSEA)-1, pero que expresan SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, y Oct-4. Oct es una familia de factores de transcripción que son cruciales para el desarrollo de células pluripotentes. Oct-4, expresado específicamente en las células de la línea germinal y las células madre de mamíferos, es esencial para mantener su pluripotencia (véase, por ejemplo, Nichols J. y col., Cell, 95: 379-391, 1998).

Las células también pueden tener actividad telomerasa de elevado nivel. Una telomerasa es una ribonucleoproteína que añade repeticiones de los telómeros a los extremos de los cromosomas durante la duplicación celular, manteniendo de este modo las longitudes de los telómeros y cromosomas. La expresión de elevado nivel de telomerasa se ha hallado en células de la línea germinal, células ES, y tejidos embrionarios, pero no en células somáticas. Como resultado, los telómeros (y cromosomas) llegan a ser más cortos en células somáticas después de cada división celular. Finalmente, después de un periodo de vida finito, las células somáticas entran en senescencia debido a la pérdida de ADN cromosómico. Como la expresión restaurada de telomerasa en células somáticas amplía su periodo de vida, la actividad telomerasa de elevado nivel en células producidas por la invención sugiere que su periodo de vida es igual a la de células ES.

El procedimiento comprende cultivar células madre mesenquimáticas en condiciones de privación, e identificar y enriquecer las células cultivadas. Las células pluripotentes se producen, por lo tanto, a partir de células madre mesenquimáticas que pueden aislarse de, por ejemplo, sangre de cordón umbilical, médula ósea, fluid amniótico, tejido adiposo, placenta, o células sanguíneas periféricas usando el procedimiento descrito en el siguiente Ejemplo 2 o procedimientos análogos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Erices A. y col., British J. Haematol., 109: 235-242, 2000, Pittenger M. y col., Science, 284:143-147, 1999, Safford K. y col., Biochem. Biophy. Research Comm., 294:371-379, 2002, y Erickson G. y col., Biochem. Biophy. Research Comm., 290:763-769, 2002. Las células madre mesenquimáticas pueden mantenerse en un medio MEM alfa-modificado que contiene suero bovino fetal (FBS) ES-seleccionado al 10-20% y bFGF, o cultivarse en las condiciones de privación descritas anteriormente. No se requiere ni fusión celular ni transferencia de núcleo para convertir las células madre mesenquimáticas en células pluripotentes en condiciones de privación. Después del procedimiento de privación, pueden identificarse células somáticas pluripotentes de acuerdo con su morfología (por ejemplo, tamaño y forma celular), actividad enzimática (por ejemplo, fosfatasa alcalina y telomerasa), y marcadores superficiales (por ejemplo, SSEA-1 negativas, SSEA-3 positivas, y SSEA-4 positivas). Las células identificadas pueden enriquecerse usando cualquier técnica de separación celular adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, como las células tienden a formar colonias, se pueden coger directamente las colonias usando una micropipeta bajo un microscopio. Para enriquecer más rápidamente una gran cantidad de células, pueden usarse las técnicas de separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Por ejemplo, se usan anticuerpos monoclonales anti-SSEA-3, anticuerpos monoclonales anti-SSEA-4, y anticuerpos monoclonales anti-SSEA-1 unidos con diferentes marcadores fluorescentes para enriquecer células que sean SSEA-3 positivas, SSEA-4 positivas, y SSEA-1 negativas. Estas células pueden examinarse adicionalmente para su pluripotencia.

Se puede ensayar la pluripotencia de las células usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se usa el ensayo de formación de teratomas in vivo como se describe en el siguiente Ejemplo 5. Como un teratoma contiene los derivados de las tres capas germinales embrionarias, la capacidad de una célula de formar un teratoma indica que la célula es pluripotente. Como alternativa, puede usarse el ensayo de formación de cuerpo embrioides in vitro como se describe en el siguiente Ejemplo 6. La formación de un cuerpo embrioide indica que la célula es pluripotente.

Las células producidas por el procedimiento de la presente invención pueden usarse de una diversidad de maneras. Pueden usarse las células para tratar enfermedades degenerativas o hereditarias, evitando las consideraciones éticas de la manipulación de embriones humanos. Para hacerlo, pueden aislarse células madre mesenquimáticas de un paciente, por ejemplo, que carece de un gen funcional esencial para el desarrollo apropiado de un tejido u órgano. Después de producir células pluripotentes, se puede introducir en las células un vector de expresión de ácido nucleico que codifique una versión funcional del gen. El vector puede introducirse en las células mediante una diversidad de técnicas, incluyendo co-precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación, microinyección, o técnicas mediadas por virus. Se prefieren procedimientos que no afecten a la pluripotencia de las células. Puede encontrarse una descripción de dichas técnicas en, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 5.591.625 y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 20020127715. Después de suministrar el gen funcional a las células, las células pueden transplantarse de nuevo en el paciente usando procedimientos conocidos en la técnica. Como las células se producen a partir del paciente, el tratamiento no causa rechazo inmune. En condiciones apropiadas, las células transplantadas pueden desarrollarse en un tejido u órgano funcional. Para facilitar este desarrollo, pueden administrarse al paciente factores para inducir el desarrollo de las células. Dichos factores pueden ser compuestos de molécula pequeña, péptidos, y ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, el factor de crecimiento transformante \beta, proteínas morfogénicas óseas, y el factor de crecimiento nervioso.

Las células producidas por el procedimiento de la presente invención también son útiles para estudiar los mecanismos de desarrollo/diferenciación de los embriones. Se pueden identificar las condiciones para inducir el desarrollo de células pluripotentes en un tejido u órgano específico usando dichas células como sistema modelo. Además, pueden aislarse genes que desempeñan tareas durante el desarrollo de los embriones usando selección de ADNc diferencial como se describe en, por ejemplo, Shen M. y col., Development, 124:429-42, 1997. Puede prepararse una biblioteca de ADNc a partir de las células pluripotentes que se han inducido al desarrollo, por ejemplo, en los cuerpos embrioides descritos anteriormente. La biblioteca se siembra en dos series de filtros de replicación. Una serie de filtros (serie A) se explora con ADNc preparado a partir de células no inducidas. La otra serie de filtros (serie B) se explora con una cantidad comparable de ADNc preparado a partir de células inducidas. El ADNc usado para explorar la biblioteca puede marcarse y visualizarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Entonces se pueden seleccionar, a partir de la biblioteca, clones de ADNc que presenten señales de hibridación más fuertes en la serie B que en la serie A. Estos ADNc codifican genes que se sobre-expresan en las células inducidas. Viceversa, pueden aislarse los genes sobre-expresados en las células pluripotentes no inducidas. De igual modo, también se pueden aislar genes sobre-expresados en células antes y después del procedimiento de privación descrito anteriormente. Todos estos genes aislados pueden estudiarse adicionalmente para definir sus tareas en los procesos respectivos.

Las células pluripotentes producidas a partir de animales no humanos pueden usarse para desarrollar órganos o clones de los animales usando los procedimientos descritos en, por ejemplo, Campbell K. y col., Nature, 380: 64-66, 1996. Por consiguiente, estas células son valiosas para las industrias de las mascotas y ganadera, y pueden usarse para conservar animales en vías de extinción.

Los siguientes ejemplos específicos deben entenderse simplemente como ilustrativos, y no limitantes del resto de la descripción de ningún modo en absoluto. Sin elaboración adicional, se creer que un especialista en la técnica puede, en base a la descripción de este documento, utilizar la presente invención en su alcance más completo.

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Ejemplo 1

Se realizó tinción inmunocitoquímica para examinar los marcadores celulares.

Para teñir marcadores de superficie celular, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% a 20ºC durante 10 minutos. Para teñir las proteínas citoesqueléticas, las células se fijaron con metanol a -20ºC durante 2 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos. Para teñir otras moléculas intracelulares, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% a 20ºC durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos.

Las células fijadas se incubaron durante 30 minutos en una solución de bloqueo que contenía solución salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, y suero al 1% (Sigma, St. Louis, MO) de la misma especie en que se produjo el anticuerpo primario. Las células después se incubaron secuencialmente durante 60 minutos cada vez con anticuerpos primarios diluidos apropiadamente en la solución de bloqueo, anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado, y peroxidasa de rábano rusticano conjugada con estreptavidina. Entre cada etapa, las células se lavaron con PBS que contenía BSA al 0,3% durante 10 minutos. La actividad peroxidasa de rábano rusticano se visualizó incubando con el cromógeno diaminobenzidina (Vector Laboratories Inc., CA). Después de la visualización, las células se examinaron en un microscopio, y se tomaron fotos.

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Ejemplo 2

Se aislaron células madre mesenquimáticas de médula ósea y sangre de cordón umbilical.

La médula ósea humana se adquirió de BioWhittaker, Inc. (Walkersville, MD). La sangre de cordón umbilical se obtuvo de sujetos con consentimiento informado. Para aislar las células madre mesenquimáticas, se prepararon células mononucleares a partir de la médula ósea humana o de la sangre de codón umbilical usando el procedimiento de gradiente de densidad de Ficoll-paque (d = 1,077 g/ml, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) descrito en, por ejemplo, Erices A. y col., British J. Haematol., 109:235-242, 2000 o Pittenger M. y col., Science, 284: 143-147, 1999.

Las células mononucleares aisladas se sembraron a una concentración de 1 x 10^{6} células/cm^{2} en placas de cultivo tisular que contenían un medio habitual, un medio esencial mínimo alfa-modificado (MEM) con FBS seleccionado para células ES al 20% (Hyclone, Logan, UT), 4 ng/ml de b-FGF, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de dos semanas de cultivo, muchas células se adhirieron a las placas de cultivo. Estas células morfológicamente homogéneas se estaban auto-renovando con un tiempo de duplicación de 32-36 horas.

Las células adherentes se caracterizaron adicionalmente usando tinción inmunocitoquímica como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos contra CD34 o CD45 (antígenos de superficie celular de linaje hematopoyético) se adquirieron de Bacton Dickinson (Mountain View, CA). Los resultados de tinción revelaron que las células eran negativas para CD34 y CD45, lo que sugiere que las células no pertenecían al linaje hematopoyético. Además, las células podían inducirse a diferenciarse en osteocitos, condrocitos y adipocitos usando medios apropiados de acuerdo con los procedimientos descritos en, por ejemplo, Pittenger M. y col., Science, 284: 143-147, 1999. Se analizaron osteocitos diferenciados usando el procedimiento de tinción de von Kossa. Los condrocitos diferenciados se tiñeron por Safranina O. Los adipocitos se tiñeron por Rojo O. Los procedimientos anteriores pueden encontrarse en, por ejemplo, Colter D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 7841-7845, 2001. Estos resultados indicaban que las células aisladas eran las células madre mesenquimáticas (Prockop D. y col., Nature, 276: 71-74, 1997). No obstante, el potencial de desarrollo de estas células es limitado ya que podrían no desarrollarse en teratomas cuando se introducen en ratones SCID o en cuerpos embrioides cuando se inducen. Véanse los siguientes Ejemplos 5 y 6.

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Ejemplo 3

Las células madre mesenquimáticas aisladas descritas anteriormente se cultivaron en condiciones de privación para generar células pluripotentes.

Las células madre mesenquimáticas se cultivaron en el medio habitual descrito en el Ejemplo 2 durante tres a cinco pases. Las células después se pusieron en un medio MEM alfa-modificado que contenía FBS al 0,5% en ausencia de b-FGF (un medio de privación) durante 5-7 días. Como alternativa, las células se mantuvieron en el medio habitual sin cambiar el medio durante dos semanas. Durante los procedimientos de privación anteriores, las células se controlaron diariamente en un microscopio, y no se halló fusión celular. Al final del procedimiento de privación, aparecieron colonias redondas y aplanadas en los cultivos. Cada una de las colonias se cogió usando una micropipeta y se mantuvo en un estado indiferenciado en células de soporte de ratón, por ejemplo, células STO de ratón tratadas con mitomicina (ATCC CRL-1503) o células fibroblásticas embrionarias de ratón, en un medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) con FBS seleccionado para células ES al 20%, 4 ng/ml de bFGF, y 2-mercaptoetanol 0,1 mM. Las células de cada colonia podían mantenerse en el estado indiferenciado y podía continuar proliferando durante cuatro meses (o más de 15 pases).

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Ejemplo 4

Se examinó la morfología, expresión de marcadores celulares, actividad enzimática, y cariotipos de las células de las colonias.

Las células se examinaron en un microscopio óptico o un microscopio electrónico de barrido. Para un examen en microscopio electrónico de barrido, las células se cultivaron en una película Melinex (DuPont, Hopewell, VA), se fijaron en tetróxido de osmio al 2% (p/v), tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 16 horas a 4ºC y se deshidrataron a través de una serie en etanol graduado. Después del secado de punto crítico usando dióxido de carbono líquido y del revestimiento por metalizado por bombardeo atómico con cromo, las células se examinaron en la emisión de campo de un microscopio electrónico de barrido (SEM) Leo 982 (LEO Elektronenmikroskopie GmbH, Alemania) manejado a 2 kV. Véase, por ejemplo, Bozzola J. y col., 1992, Specimen preparation for scanning electron microscopy. En: Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. pág. 40-62. Jones and Bartlett Publishers, Boston. Como las fotografías microscópicas indicaban, la morfología de las células era similar a la de células ES indiferenciadas, tal como las descritas en Thomson J. y col., Science, 282: 1145-1147, 1998.

Las células también se caracterizaron usando tinción inmunocitoquímica como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos contra SSEA-1 (MC-480, 1:50), SSEA-3 (MC-631, 1:50) y SSEA-4 (MC-813-70, 1:50) se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa (Iowa city, IA). Los anticuerpos anti-TRA-1-60 y anti-TRA-1-81 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA.). Los resultados indicaron que las células eran negativas para SSEA-1 y positivas para SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, y TRA-1-81. También se detectó la expresión del factor de transcripción Oct-4 por PCR de transcripción inversa como se describe en Reubinoff B. y col., Nature Biotechnol., 18: 399-404, 2000.

La actividad fosfatasa alcalina de las células se detectó usando un kit Sigma 86-R siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma, St. Louis, MO). Las células mostraban un elevado nivel de actividad fosfatasa alcalina. Las células también se examinaron para su actividad telomerasa usando la detección de telomerasa TRAPeze ELSIA como se describe en Kim N. y col., Science, 266: 2011-2015, 1994. Los resultados revelaron una actividad telomerasa de elevado nivel en las células.

Los cariotipos de las células se determinaron usando el procedimiento descrito en, por ejemplo, ISCN 1995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (F. Mitelman, ed.) Karger, Basel (1995). En resumen, las células se subcultivaron a una dilución 1:4 12 horas antes de la recolección. Las células se recogieron con tripsina-EDTA y se incubaron con colcemid durante 1,5 horas seguido de lisis con KCl hipotónico y fijación en ácido/alcohol. Se analizaron las metafases usando procedimientos descritos por, por ejemplo, Freshney, R en "Culture of animal cells-A manual of basic technique" 3a edición. A John Wiley & Sons, Inc. Nueva York (1994), pág. 205-209. El resultado reveló que las células tenían los 46 cromosomas de los seres humanos. Los cromosomas no tenían alteraciones apreciables en comparación con los cromosomas humanos normales.

Ejemplo 5

Para ensayar la pluripotencia de las células preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 3, se realizó el ensayo de formación de teratomas.

Se implantaron aproximadamente 1 x 10^{5} células en la musculatura de la pata trasera de ratones SCID. Se observaron teratomas 6-8 semanas después de la inyección. Los teratomas se recogieron y se sometieron a examen histológico usando el procedimiento descrito en Thomson J. y col., Science, 282: 1145-1147, 1998. Todos los tumores examinados contenían tejidos derivados de las tres capas germinales embrionarias: tracto gastrointestinal en desarrollo (endodermo); cartílago, hueso, y músculo estriado (mesodermo); y la córnea, el cristalino, queratina fragmentada y epidermis en desarrollo (ectodermo). Como control, las células madre mesenquimáticas descritas en el Ejemplo 2 no se desarrollaron en teratomas en ratones SCID.

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Ejemplo 6

Se realizó el ensayo de formación de cuerpos embrioides para ensayar la pluripotencia de las células preparadas en el Ejemplo 3.

Las células se cultivaron en placas Petri bacteriológicas no revestidas durante 4-6 días. Las células se multiplicaron y formaron esferoides (cuerpos embrioides) en suspensión. Los cuerpos embrioides se transfirieron y sembraron en cámaras montadas en portaobjetos revestidas con gelatina al 0,1%. Después de una semana en cultivo, surgieron múltiples grupos a partir de la extensión de los esferoides. Cada uno de los grupos presentaba contracción y relajación regular a 5-7 segundos por ciclo durante más de 12 horas. Esta actividad mecánica era similar a la de un órgano tipo intestino (intestino primordial) desarrollado a partir de células ES como se describe en Yamada T, y col., Stem Cells, 20: 41-49, 2002. En contraste, las células madre mesenquimáticas no podían desarrollarse en cuerpos embrioides cuando se inducían en las mismas condiciones.

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Otras realizaciones

Todas las características descritas en esta memoria descriptiva pueden combinarse en cualquier combinación. Cada característica descrita en esta memoria descriptiva puede reemplazarse por una característica alternativa que sirva para un propósito igual, equivalente, o similar. Por tanto, salvo que se indique expresamente de otro modo, cada característica descrita es solamente un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares.

Claims

1. Un procedimiento para producir células animales pluripotentes, comprendiendo el procedimiento: cultivar células madre mesenquimáticas aisladas de un tejido de un animal en condiciones de privación; y

Identificar y enriquecer las células pluripotentes entre las células cultivadas,

en el que las células pluripotentes, cuando se introducen en un ratón SCID, se desarrollan en un teratoma y en el que las células son negativas para el antígeno embrionario específico de fase-1.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el animal es un mamífero.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el mamífero es un ser humano.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tejido es sangre de cordón umbilical, médula ósea, fluido amniótico, tejido adiposo, placenta, o sangre periférica.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el tejido es sangre de codón umbilical, médula ósea, o fluido amniótico.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de cultivo se realiza poniendo las células en un medio que contiene suero del 0,5% al 2% durante 5 a 10 días o en un medio que contiene suero del 10% al 20% durante 7 a 21 días sin cambiar el medio.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la etapa de cultivo se realiza poniendo las células en un medio que contiene suero al 0,5% durante 5-7 días o en un medio que contiene suero al 20% durante 2 semanas sin cambiar el medio.