ES2322378T3 - Uso de c3a y derivados del mismo como biomarcador para adenoma y/o carcinoma colorrectal; metodos de diagnostico y ensayos usando el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende las etapas de: a) proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un individuo, b) determinar el nivel de C3a o un derivado del mismo que tiene la misma función en dicho material de muestra aislado, c) comparar el nivel determinado de C3a o un derivado del mismo que tiene la misma función con uno o más valores de referencia.
Description
\global\parskip0.920000\baselineskip
Uso de C3a y derivados del mismo como
biomarcador para adenoma y/o carcinoma colorrectal; métodos de
diagnóstico y ensayos usando el mismo.
La presente invención se refiere al campo de
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
El carcinoma colorrectal es el tercer carcinoma
más frecuentemente diagnosticado (9,4%) en todo el mundo. En 2003
se diagnosticaron casi 945.000 nuevos casos de carcinoma colorrectal
en todo el mundo y aproximadamente 492.000 personas murieron de
esta enfermedad. La incidencia del carcinoma colorrectal está
aumentando, mientras que el índice de mortalidad de carcinoma
colorrectal está disminuyendo. La incidencia de carcinoma
colorrectal aumenta con la edad, comenzando aproximadamente a los
40 años de edad, y es mayor para hombres que para mujeres (40,6
para hombres frente a 30,6 para mujeres, por 100.000 pro año) (World
cancer report, 2003, Ed. BW. Stewart and P. Kleihues. IARC Press,
Lyon).
En la mayoría de los pacientes, el desarrollo de
carcinoma colorrectal sigue un progreso de múltiples etapas desde
adenoma premaligno hasta malignidades invasivas que tienen
propensión a metástasis. Existen evidencias de que puede
conseguirse una reducción en la morbilidad y mortalidad por
carcinoma colorrectal a través de la detección y tratamiento de
carcinomas colorrectales en fase temprana y la identificación y
retirada de los pólipos adenomatosos colorrectales, que son
precursores de carcinoma colorrectal.
Hasta ahora solamente los ensayos de exploración
colorrectal invasivos tales como colonoscopia han demostrado
conseguir una detección de carcinoma colorrectal en fase temprana y
sus precursores, es decir, pólipos adenomatosos y/o áreas
neoplásicas planas. Están disponibles varios ensayos como opciones
para la exploración de carcinoma colorrectal. Los ensayos de
exploración abarcan el ensayo de sangre oculta fecal (FOBT),
sigmoidoscopía flexible, FOBT combinado con sigmoidoscopía flexible
y colonoscopia. Los diversos ensayos de exploración difieren entre
sí con respecto al rendimiento, eficacia, frecuencia posible de
exploración, complicaciones del ensayo, costes y aceptación por los
pacientes.
La exploración por el ensayo de sangre oculta
fecal está actualmente considerada como la estrategia de exploración
óptima en términos de rentabilidad. La sangre oculta en la
deposición puede detectarse por agentes químicos tales como
guayaco, a través de hemoporfirina o métodos inmunológicos. El
ensayo del guayaco Hemoccult (II) disponible en SmithKline
Diagnostics es el más ampliamente usado.
Diversos factores técnicos afectan a su
rendimiento clínico. Hemoccult tiene una sensibilidad de
aproximadamente el 50% para carcinomas colorrectales y una
especificidad de aproximadamente el 98%, sin embargo, la
sensibilidad es baja para pólipos, a aproximadamente el 10% (Simon
JB. (1998) Gastroenterologist 6:66-78, Review). Otro
inconveniente importante de la exploración de sangre oculta es la
mala exactitud de predicción, solamente el 10% de las reacciones
positivas demuestran deberse a carcinoma colorrectal (Simon JB.
(1998) Gastroenterologist 6:66-78, Review; Mandel
JS et al. (1999) J. Natl. Cancer Inst.
91:434-437; Hardcastle JD et al. (1996)
Lancet 348: 1472-1477; Kronborg O et al.
(1996) Lancet 348:1467-71; Winawer SJ et al.
(1997) Gastroenterology 112:594-642; Fletcher RH
(1998) N. Engl. J. Med. 338:1153-1154).
Además, un ensayo de sangre oculta fecal
solamente proporciona resultados después del progreso de la
enfermedad hasta una cierta fase. Sería deseable tener un sistema
de ensayo que permita la detección de adenoma colorrectal y/o
carcinoma colorrectal en un momento anterior en el tiempo.
Ensayos inmunológicos desarrollados más
recientemente generalmente tienen elevada sensibilidad, sin embargo,
la mala especificidad sigue siendo un problema importante. Otros
métodos, tales como ensayos genéticos de muestras de deposición
para oncogenes KRAS y para la proteína p53, no son aún rentables y
tienen baja sensibilidad (Calistri D et al. (2003) Clin.
Gastroenterol. Hepatol. 1: 377-383; Schoen RE (2002)
Nat. Rev. Cancer 2:65-70).
La endoscopia (Kavanagh AM (1998) Cancer Causes
Control 9:455-462), usando el sigmoidoscopio
flexible o el colonoscopio (Lieberman DA (1997) Gastroenterol.
Clin. N. Am. 26:71-83), es el medio más definitivo
de detección, pero tiene limitaciones. Se ha reconocido el índice
de falso negativo para lesiones neoplásicas planas y sigue siendo
elevado (Kudo S (1997) Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am.
7:87-98.). La colonoscopia permite el examen del
colon con un bajo índice de falso negativo para lesiones polipoides
de al menos 10 mm de diámetro. Por esta razón, los intervalos
permitidos antes de un nuevo examen son relativamente largos después
de una evaluación negativa (hasta diez años) o hasta cinco años
después de polipectomía.
Sin embargo, la conformidad del paciente con
dicha recomendación para un nuevo examen después de colonoscopia es
escasa. Además, una colonoscopia es costosa y engorrosa. En vista de
los elevados costes de un examen generalizado y la aceptación
limitada de una colonoscopia por la población este método de examen
tiene una aplicación limitada.
Pueden ensayarse muestras tisulares aisladas,
que se recogen, para carcinoma colorrectal y su precursor, adenoma
colorrectal, por diversos métodos. El documento DE 197 11 111A
describe un método que usa una determinación in vitro de
bacterias intraepiteliales del colon, componentes y productos de
reacción de las mismas. Otro método que usa la expresión del gen
HERG en muestras tisulares se describe en el documento DE 102 24
534.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se han usado los niveles de CEA (Antígeno
carcinoembrionario) en muestras sanguíneas para detectar el
carcinoma de colon. Sin embargo, los niveles de CEA no están
específicamente elevados en carcinoma de colon y se ha demostrado
que están elevados también en pacientes con otras enfermedades
malignas (por ejemplo, cánceres del estómago, páncreas, mama, y
pulmón) y con diversas afecciones no malignas (por ejemplo,
enfermedad hepática alcohólica, enfermedad inflamatoria del
intestino, hábito de fumar, bronquitis crónica, y pancreatitis).
(Posner MR, Mayer RJ: The use of serologic tumor markers in gastro
intestinal malignancies. Hematol Oncol Clin North Am 8:533, 1994).
Además, los niveles de CEA no están elevados en adenomas de
colon.
Un objeto de la invención es proporcionar medios
que permitan una detección temprana de adenoma de colon y/o
carcinoma de colon.
Un objeto adicional es proporcionar medios que
permitan una detección selectiva y específica de adenoma de colon
y/o carcinoma de colon por un método no invasivo.
Un objeto adicional es proporcionar un
biomarcador que pueda usarse en la detección de adenoma y/o
carcinoma colorrectal.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un sistema de ensayo para detectar adenoma o carcinoma
colorrectal que sea rentable y pueda usarse ampliamente.
Además, el sistema de ensayo debe ser fácil de
manipular y más cómodo para el individuo a examinar para adenoma
y/o carcinoma colorrectal.
Los objetos subyacentes de la presente invención
se resuelven por el uso de C3a o un derivado del mismo como
biomarcador para la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal en un individuo.
Los objetos se resuelven adicionalmente por un
método para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal
que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo en dicho material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de C3a o un
derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
Los objetos se resuelven adicionalmente por un
método para discriminar entre adenoma colorrectal y carcinoma
colorrectal que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo en dicho material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de C3a o un
derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
Los objetos también se resuelven por un método
para controlar el desarrollo y/o el transcurso y/o el tratamiento
de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal que comprende las
etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo en dicho material de muestra aislado,
c) comparar el nivel determinado de C3a o
derivado del mismo con uno o más valores de referencia.
En una realización preferida se controla la
eficacia de un procedimiento quirúrgico o terapéutico para decidir
si el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal se ha retirado
completamente. En otra realización se controla la terapia de un
paciente con adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal con una o
más sustancias químicas, anticuerpos, ARN antisentido, radiación,
por ejemplo rayos X o combinaciones de los mismos para controlar la
eficacia del
tratamiento.
tratamiento.
Los objetos se resuelven también proporcionando
un sistema de ensayo para detectar adenoma colorrectal y/o cáncer
colorrectal en una muestra de un individuo que comprende:
a) un anticuerpo o un receptor que se une a un
epítopo de C3a o un derivado del mismo,
b) un soporte sólido que soporta dicho
anticuerpo o receptor,
c) un reactivo para detectar la unión de dicho
epítopo de C3a o un derivado del mismo a dicho anticuerpo o
receptor.
Los objetos se resuelven además proporcionando
una serie que comprende moléculas de detección para detectar
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo que
comprende como molécula de detección:
a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada en
un soporte sólido para unir y detectar ARNm que codifica C3a o un
derivado del mismo y/o para unir y detectar proteínas C3a o
derivados de las mismas, o
b) un anticuerpo inmovilizado en un soporte
sólido para unir y detectar un epítopo de C3a o un derivado del
mismo, o
c) un receptor inmovilizado en un soporte sólido
para unir y detectar un epítopo de C3a o un derivado del mismo,
donde preferiblemente cada una de
las diferentes cantidades de moléculas de detección se inmoviliza en
el soporte sólido para aumentar la exactitud de la
cuantificación.
La sonda de ácido nucleico se selecciona, por
ejemplo, entre el grupo compuesto por ADN o ARN monocatenario o
bicatenario, aptámeros y combinaciones de los mismos. Los aptámeros
son oligonucleótidos monocatenarios que adoptan una forma
específica, dependiente de la secuencia y que se unen a dianas
proteicas con elevada especificidad y afinidad. Los aptámeros se
identifican usando el proceso SELEX (Tuerk C. and Gold L. (1990)
Science 249: 505-510; Ellington AD and Szostak JW.
(1990) Nature 346:818-822).
Las realizaciones preferidas se especifican en
las reivindicaciones dependientes.
De acuerdo con la presente invención la
expresión "material de muestra" también se indica como
"muestra".
Según la presente invención se entiende que el
término "biomarcador" indica una proteína o fragmento proteico
o un ácido nucleico que es indicativo de la incidencia del adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Eso significa que el
"biomarcador" se usa como un medio para detectar adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
Se entiende que el término "individuo" o
"individuos" indica un mamífero. Preferiblemente, el mamífero
es un ser humano tal como un paciente.
Se entiende que expresión "individuo sano"
o "individuos sanos" indica individuo(s) no
enfermo(s) de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
Es decir, la expresión "individuo(s) sano(s)" se
usa solamente con respecto al estado patológico de adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal y no excluye que el individuo
padezca otras enfermedades diferentes a adenoma colorrectal y/o
carcinoma colorrectal.
Se entiende que la expresión "derivado del
mismo" describe cualquier modificación a nivel ADN, ARNm o
proteico que comprende, por ejemplo, el gen truncado, fragmentos de
dicho gen, un gen mutado, o gen modificado. El término "gen"
incluye secuencias de ácido nucleico, tales como ADN, ARN, ARNm o
secuencias proteicas o secuencias oligopeptídicas o secuencias
peptídicas. El derivado puede ser una modificación que es el
resultado de una deleción, sustitución o inserción del gen. La
modificación génica puede ser el resultado de la variabilidad
génica de origen natural. La expresión "variabilidad génica de
origen natural" significa modificaciones que no son el resultado
de la ingeniería genética. La modificación génica puede ser el
resultado del procesamiento del gene o producto génico dentro del
cuerpo y/o un producto de degradación. La modificación a nivel
proteico puede deberse a modificación enzimática o química dentro
del cuerpo. Por ejemplo la modificación puede ser una glicosilación
o fosforilación o farnesilación. Preferiblemente, el derivado
codifica o comprende al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente 10
aminoácidos, mucho más preferiblemente 20 aminoácidos de la proteína
no modificada. En una realización el derivado codifica al menos un
epítopo de la proteína respectiva.
La expresión "C3a o un derivado del mismo"
como se usa en la presente invención también comprende C3a truncado,
fragmentos de C3a, C3a mutado, C3a modificado o el precursor C3
(Fig. 1, SEC ID Nº 1) o fragmentos de C3. En una realización el
derivado tiene una identidad de secuencia proteica del 80%,
preferiblemente el 90%, más preferiblemente el 98% con la secuencia
de la SEC ID Nº 2 (Fig. 2A, SEC ID Nº 2). La modificación de
"C3a" puede deberse a modificación enzimática o química. En
particular, la expresión "C3a o un derivado del mismo"
comprende especialmente una proteína C3a truncada que tiene
preferiblemente un peso molecular en el intervalo de 8.950 \pm 25
Da; más preferiblemente en el intervalo de 8.950 \pm 20 Da. En una
realización preferida la proteína C3a truncada tiene un peso
molecular de 8.939 Da. Preferiblemente, la proteína C3a no tiene
arginina C-terminal y opcionalmente tiene un peso
molecular en el intervalo de 8.950 \pm 20 Da. En una realización
el derivado de C3a es C3a-desArg (Fig. 2B, SEC ID Nº
3). En una realización el derivado de C3a se obtiene por escisión
de C3a por la quimasa de mastocitos. En otra realización C3a se
obtiene por escisión de C3 por la
C3-convertasa.
C3a pertenece al grupo de anafilotoxinas. C3a,
C4a y C5a son productos proteolíticos de serina proteasas del
sistema del complemento. C3a (SEC ID Nº 2) se obtiene del tercer
componente (C3) (SEC ID Nº 1) del sistema del complemento sanguíneo
durante la activación del complemento. C3a es una hormona con
eficacia local. Aproximadamente el 40% de los restos aminoacídicos
en C3a están implicados en una conformación helicoide. Las
anafilotoxinas séricas están implicadas en una diversidad de
respuestas inmunes celulares, y también son potentes agentes
proinflamatorios. C3a produce potentes efectos sobre las paredes de
los vasos sanguíneos, la contracción del músculo liso y un aumento
en la permeabilidad vascular. La arginina C-terminal
en C3a es de importancia fundamental para su actividad biológica.
Las anafilotoxinas están reguladas por la carboxipeptidasa N
(inactivado de anafilotoxinas), que retira en segundos la arginina
carboxi-terminal. Este mecanismo convierte la
anafilotoxina intacta en una forma C3a-desArg menos
activa (SEC ID Nº 3).
Se entiende que el término "epítopo" indica
cualquier elemento estructural de una proteína o péptido o cualquier
estructura proteica que permita la unión específica de un
anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína o estructura
peptídica o un receptor.
Los métodos de la presente invención se realizan
con materiales de muestra tales como fluido corporal o muestra
tisular que ya se ha aislado del cuerpo humano. Posteriormente el
material de muestra puede fraccionarse y/o purificarse. Es posible,
por ejemplo, almacenar el material de muestra a ensayar en un
congelador y realizar los métodos de la presente invención en un
momento apropiado desoyes de descongelar el material de muestra
respectivo.
Se ha descubierto sorprendentemente en la
presente invención que la proteína C3a o un derivado de la misma
puede usarse como un biomarcador para la detección de adenoma y/o
carcinoma colorrectal. Ahora se ha descubierto sorprendentemente en
la invención que el nivel de proteína C3a o un derivado de la misma
en un fluido corporal está elevado en individuos que tienen adenoma
y/o carcinoma colorrectal. Además, puede usarse el nivel de
proteína C3a o un derivado de la misma en un fluido corporal para
distinguir gente sana de gente que tiene adenoma y/o carcinoma así
como gente que tiene adenoma colorrectal de gente que tiene
carcinoma colorrectal.
Según la presente invención, el material de
muestra puede ser tejido, células o un fluido corporal.
Preferiblemente el material de muestra es un fluido corporal tal
como sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, médula ósea,
deposiciones, fluido sinovial, fluid linfático, fluido
cefalorraquídeo, esputo, orina, leche materna, esperma, exudado y
mezclas de los mismos. En una realización preferida los fluidos
corporales se fraccionan con cromatografía de intercambio aniónico.
La proteína C3a, por ejemplo, se eluye a pH 9,0. La proteína
transtiretina (p 13.776), por ejemplo, se eluye a pH 4,0.
Preferiblemente, el fluido corporal se ha
aislado antes de realizar los métodos de la presente invención. Los
métodos de la invención se realizan preferiblemente in vitro
por un técnico en un laboratorio.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, C3a se mide en plasma sanguíneo o suero sanguíneo. El
suero sanguíneo puede obtenerse fácilmente tomando sangre de un
individuo a examinar médicamente y separando el sobrenadante de la
sangre coagulada.
El nivel de C3a o un derivado del mismo en el
fluido corporal, preferiblemente suero sanguíneo, es mayor con la
formación progresiva de adenoma colorrectal. El adenoma colorrectal
es un neoplasma benigno que puede llegar a ser maligno. Cuando se
desarrolla cáncer colorrectal a partir de adenoma colorrectal
benigno, el nivel de C3a o un derivado del mismo en fluidos
corporales, preferiblemente suero sanguíneo, se eleva más.
Después de la transformación de adenoma
colorrectal en cáncer colorrectal, el estado patológico del
individuo afectado puede exacerbarse adicionalmente por la
formación de metástasis.
La presente invención proporciona un biomarcador
de fase temprana que permite detectar la enfermedad neoplásica en
fase temprana y aún benigna, la enfermedad neoplásica en fase
temprana o fase benigna y/o fases tumorales tempranas. La detección
temprana posibilita al médico retirar a tiempo el adenoma
colorrectal y aumentar drásticamente la posibilidad de
supervivencia del individuo.
Además, la presente invención permite controlar
el nivel de C3a o un derivado del mismo en un fluido corporal tal
como suero sanguíneo durante un periodo prolongado de tiempo, tal
como años.
El control a largo plazo permite diferenciar
entre individuos sanos y con adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal. El nivel de C3a o un derivado del mismo puede
comprobarse rutinariamente, por ejemplo, una o dos veces al año. Si
se detecta un aumento del nivel de C3a o un derivado del mismo éste
puede ser indicativo de adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal temprano. Un aumento adicional del nivel de C3a o un
derivado del mismo entonces puede ser indicativo de la
transformación en carcinoma colorrectal maligno.
Además, puede controlarse el transcurso de la
enfermedad y/o el tratamiento. Si el nivel de C3a o un derivado del
mismo aumenta adicionalmente, por ejemplo después de la retirada del
adenoma colorrectal, éste puede ser indicativo de exacerbación del
estado patológico.
Eso significa que el nivel de C3a o un derivado
del mismo es un parámetro clínico valioso para detectar y/o
controlar el adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. El nivel
de C3a o un derivado del mismo en fluidos corporales está más
elevado después de la incidencia de adenoma colorrectal. Por lo
tanto, el nivel de C3a o un derivado del mismo es un parámetro
clínico importante para permitir un diagnóstico temprano y, por
consiguiente, un tratamiento temprano de la enfermedad. En una
realización preferida los pacientes con niveles elevados de C3a o
derivados del mismo se examinan posteriormente por colonoscopia.
\newpage
El método de la invención para la detección de
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal comprende la etapa de
proporcionar un material de muestra aislado que se ha tomado de un
individuo, después determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo en el material de muestra aislado, y finalmente comparar el
nivel determinado de C3a o un derivado del mismo con uno o más
valores de referencia. En una realización, se detecta
adicionalmente uno o más biomarcadores adicionales en un material de
muestra aislado que se ha tomado de un individuo, se determina el
nivel del(de los) biomarcador(es) y se compara con uno
o más valores de referencia respectivos.
El valor de referencia puede calcularse como el
nivel promedio de C3a o un derivado del mismo determinado en una
pluralidad de muestras aisladas de individuos sanos o individuos que
padecen adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Este valor
de referencia puede establecerse como un intervalo a considerar como
normal que significa que la persona está sana o padece adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal. Un valor específico dentro
de un intervalo entonces puede ser indicativo de un estado sano o el
estado patológico de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
Este intervalo de valor de referencia puede establecerse tomando una
cantidad estadísticamente relevante de muestras de fluido corporal,
tales como muestras séricas, de individuos sanos como se hace para
cualquier otro intervalo de parámetros médicos tal como, por
ejemplo, azúcar en sangre. Preferiblemente, se calculan dos valores
de referencia que se denominan control negativo y control positivo
1. El valor de referencia del control negativo se calcula a partir
de individuos sanos y el control positivo se calcula a partir de
individuos que padecen adenoma colorrectal o carcinoma colorrectal.
Más preferiblemente, se calculan tres valores de referencia que se
denominan control negativo y control positivo 1 y control positivo
2. El control positivo 1 puede calcularse a partir de individuos
que padecen carcinoma colorrectal y el control positivo 2 puede
calcularse a partir de individuos que padecen adenoma
colorrectal.
colorrectal.
En otra realización de la presente invención,
los valores de referencia pueden ser valores de referencia
individuales calculados como el nivel promedio de C3a o un derivado
del mismo determinado en una pluralidad de muestras aisladas
tomadas del individuo durante un periodo de tiempo.
Cuando se controla el nivel de C3a o un derivado
del mismo durante un periodo prolongado de tiempo, tal como meses o
años, es posible establecer un nivel promedio individual. El nivel
de C3a o un derivado del mismo puede medirse, por ejemplo, a partir
de la misma muestra de suero sanguíneo que cuando se mide el azúcar
en sangre y puede usarse para establecer una curva de calibrado
individual que permita detectar específicamente cualquier aumento
individual del nivel de C3a o un derivado del mismo.
El valor de referencia para biomarcadores
adicionales también puede calcularse del mismo modo que el descrito
para C3a. Los niveles promedio de C3a o biomarcadores adicionales
pueden ser la media o el nivel medio.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona adicionalmente un sistema de ensayo para detectar
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un material de
muestra aislado de un individuo. El sistema de ensayo se basa en la
especificidad de un anticuerpo o un receptor para unirse
específicamente a un epítopo o un elemento estructural adecuado de
C3a o un derivado del mismo o un fragmento del mismo. Un receptor
puede ser cualquier estructura capaz de unirse específicamente a
C3a o un derivado del mismo. El receptor puede ser, por ejemplo, un
fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab o
F(ab')_{2} o cualquier otra estructura proteica o
peptídica que sea capaz de unirse específicamente a C3a o un
derivado del mismo.
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o
receptor se une a un soporte sólido tal como, por ejemplo, una
superficie de plástico o perlas para permitir la unión y detección
de C3a o un derivado del mismo. Por ejemplo, puede usarse una placa
de microtitulación convencional como superficie de plástico. La
detección de la unión de C3a o un derivado del mismo puede
realizarse, por ejemplo, usando un anticuerpo secundario marcado con
un grupo detectable. El grupo detectable puede ser, por ejemplo, un
isótopo radiactivo o una enzima como peroxidasa de rábano rusticano
o fosfatase alcalina detectable añadiendo un sustrato adecuado para
producir, por ejemplo, un color o una señal fluorescente.
El sistema de ensayo puede ser un inmunoensayo
tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un
radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo de luminescencia (LIA). Sin
embargo, puede usarse cualquier otro sistema de ensayo inmunológico
que use la especificidad de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
tal como la transferencia de Western o la inmunoprecipitación.
La presente invención también proporciona una
serie que comprende moléculas de detección para detectar adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un individuo, donde la
molécula de detección puede ser una sonda de ácido nucleico
inmovilizada en un soporte sólido para unir y detectar el ARNm que
codifica C3a, fragmentos, mutaciones, variantes o derivados del
mismo, o un anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido para unir y
detectar un epítopo de C3a o un derivado del mismo, o un receptor
inmovilizado en un soporte sólido para unir y detectar un epítopo
de C3a o un derivado del mismo. Preferiblemente, la serie comprende
moléculas de detección adicionales que son biomarcadores para
detectar adenoma colorrectal y carcinoma colorrectal.
La sonda de ácido nucleico puede ser cualquier
oligonucleótido de origen natural o sintético u oligonucleótidos
modificados químicamente, así como ADNc, ARNc, aptámeros y
similares. Como alternativa, la presente invención también
comprende una serie inversa que comprende muestras del paciente
inmovilizadas en un soporte sólido que pueden detectarse por las
moléculas de detección definidas anteriormente.
Preferiblemente la serie comprende moléculas de
detección que se inmovilizan en una superficie sólida en posiciones
identificables.
El término "serie" como se usa en la
presente invención se refiere a un agrupamiento o una disposición,
sin ser necesariamente una disposición regular. Una serie comprende
preferiblemente al menos 2, más preferiblemente 5 diferentes
conjuntos de moléculas de detección o muestras del paciente.
Preferiblemente, la serie de la presente invención comprende al
menos 50 conjuntos de moléculas de detección o muestras del
paciente, adicionalmente se prefieren al menos 100 conjuntos de
moléculas de detección o muestras del paciente. Según otra
realización de la invención la serie de la presente invención
comprende al menos 500 conjuntos de moléculas de detección o
muestras del paciente. La molécula de detección puede ser, por
ejemplo, una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo o un
receptor.
La serie descrita puede usarse en un sistema de
ensayo de acuerdo con la invención. La serie puede ser una
microserie o una macroserie.
Las moléculas de detección se inmovilizan en una
superficie o soporte sólido o superficie de soporte sólido. Esta
serie o microserie después se explora por hibridación de las sondas
de ácido nucleico preparadas a partir de las muestras del paciente
o por contacto de la serie con sondas proteicas preparadas a partir
de las muestras del paciente.
El soporte puede ser un material polimérico tal
como nylon o plástico o un material inorgánico tal como silicio,
por ejemplo una oblea de silicio, o cerámica. Según una realización
preferida, se usa vidrio (SiO_{2}) como material de soporte
sólido. El vidrio puede ser un portaobjetos de vidrio o una
microplaca de vidrio. Según otra realización de la invención el
sustrato de vidrio tiene una superficie atómicamente plana.
Por ejemplo, la serie puede está compuesta por
sondas de ácido nucleico inmovilizadas capaces de unirse
específicamente al ARNm de C3a o un derivado del mismo o
anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína C3a o
derivados de la misma que están presentes en un fluido corporal tal
como suero. Otra realización preferida es producir ADNc por
transcripción inversa del ARNm que codifica C3a o del ARNm que
codifica un derivado de C3a y detectar específicamente la cantidad
del ADNc respectivo con dicha serie. La tecnología de series se
conocida para los especialistas en al técnica. Puede realizarse una
cuantificación del ARNm o ADNc o las proteínas medidos,
respectivamente, por comparación de los valores medidos con una
curva patrón o de calibrado de cantidades conocidas de ARNm o ADNc
o proteínas de C3a o un derivado de la misma.
Preferiblemente, se inmovilizan diferentes
cantidades de moléculas de detección cada una sobre el soporte
sólido para permitir una cuantificación exacta del nivel de C3a o un
derivado del mismo.
Según otra realización de la invención, el nivel
de C3a o un derivado del mismo se determina por espectroscopía de
masas.
La espectroscopía de masas permite detectar
específicamente C3a o un derivado del mismo mediante su peso
molecular y cuantificar la cantidad de C3a o un derivado del mismo
muy fácilmente.
Puede emplearse cualquier método de ionización
adecuado en el campo de la espectroscopía de masas conocido en la
técnica para ionizar una molécula C3a o un derivado de la misma,
fragmentos, mutaciones, variantes o derivados de la misma. Los
métodos de ionización comprenden impacto electrónico (EI),
ionización química (CI), ionización de campos (FDI), ionización por
electronebulización (ESI), ionización por desorción láser (LDI),
ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) e
ionización por desorción láser potenciada por superficie
(SELDI).
Puede emplearse cualquier método de detección
adecuado en el campo de espectroscopía de masas conocido en la
técnica para determinar la masa molecular de C3a o un derivado del
mismo. Los métodos de detección comprenden espectroscopía de masas
de cuadrupolo (QMS), espectroscopía de masas por transformada de
fourier (FT-MS) y espectroscopía de masas por
tiempo de vuelo (TOF-MS).
Preferiblemente, la espectroscopía de masas es
una espectroscopía de masas por tiempo de vuelo con ionización por
desorción láser potenciada por superficie
(SELDI-TOF-MS). Antes de realizar
una SELDI-TOF-MS, preferiblemente
se inmoviliza C3a o un derivado del mismo en la muestra aislada en
una microplaca o soporte sólido con una superficie activa. La
superficie activada comprende preferiblemente anticuerpos
inmovilizados anti-C3a o contra un derivado del
mismo tal como, por ejemplo, anticuerpos policlonales de conejo.
Después de la unión de C3a o un derivado del mismo a los
anticuerpos, se realiza un análisis de tiempo de vuelo en un
espectrómetro de masas SELDI-TOF, que emite señales
de intensidad para la determinación del nivel de C3a o un derivado
del mismo.
Además, la espectroscopía de masas permite
detectar simultáneamente otras proteínas que pueden tener relevancia
con respecto a la detección de adenoma colorrectal y/o cáncer
colorrectal.
En una realización de la presente invención se
potencia la sensibilidad y/o especificidad de la detección de
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal por detección
adicional de un biomarcador adicional. En particular, en una
realización se potencia la sensibilidad y/o especificidad de la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal por
detección de otra proteína o ácido nucleico en combinación con C3a o
un derivado del mismo.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Preferiblemente, se aumenta la sensibilidad y
especificidad de los métodos, series, sistemas de ensayo y usos de
acuerdo con la presente invención por la combinación de la detección
de C3a y derivados del mismo con transtiretina y derivados de la
misma.
La expresión "transtiretina o un derivado de
la misma" como se usa en la presente invención también comprende
transtiretina truncada, fragmentos de transtiretina, transtiretina
mutada, o transtiretina modificada. La modificación de
"transtiretina" puede deberse a modificación enzimática o
química. Además, el término "transtiretina" también se usa
para denominar formas monoméricas o multiméricas de transtiretina.
Por ejemplo, el término "transtiretina" cubre especialmente la
cadena proteica monomérica que habitualmente es parte de la proteína
homotetramérica transtiretina.
La transtiretina también se denomina
prealbúmina. La transtiretina es una proteína tetramérica que tiene
un peso molecular de aproximadamente 54.000 Da que se sintetiza
principalmente en el hígado. La transtiretina normalmente es un
homotetrámero que comprende cuatro cadenas proteicas que tienen cada
una un peso molecular de aproximadamente 14.000 Da. Usando
espectroscopía de masas se han detectado varias variantes de las
cadenas proteicas de transtiretina que tienen un peso molecular de,
entre otros, 13.776 Da, 13.884 Da o 14.103 Da. Se ha descubierto
que está disminuido especialmente el nivel de las variantes
moleculares de transtiretina que tienen un peso molecular de 13.776
Da y 13.884 Da en un fluido corporal tal como suero en caso de
incidencia de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
En una realización adicional de la presente
invención se potencia ka sensibilidad y/o especificidad de la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal por
detección adicional de p53, CEA (antígeno carcinoembrionario) y/o
CA 19-9, CA 15-3, Kras, cadherina E
mutada, \beta-Catenina o derivados de los mismos
en combinación con C3a o un derivado del mismo.
En una realización adicional de la presente
invención puede potenciarse la sensibilidad y/o especificidad de la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal por
detección adicional de mutaciones en genes con desapareamiento en
el ADN, por ejemplo, MSH2, MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6,
inestabilidad de microsatélites de, por ejemplo, MHL1 o MSH2, SNP
(polimorfismo de un único nucleótido) o concentraciones plasmáticas
de proteína C-reactiva.
En una realización adicional de la presente
invención se potencia opcionalmente la sensibilidad y/o
especificidad de la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal por detección de CA15-3,
CA-125 y/o Her-2/neu en combinación
con C3a o un derivado del mismo. CA15-3 es un
antígeno oncofetal, que se expresa por varios carcinomas, y a
menudo se mide con otros marcadores tumorales. Tanto
CA15-3 como CA-125 son indicadores
pronósticos, principalmente para cáncer de mama, pero también
además de metástasis visceral. La amplificación de
Her-2/neu en carcinoma de mama está asociada con un
mal pronóstico, un corto intervalo sin enfermedad y un corto tiempo
de supervivencia. Se sabe poco hasta
\hbox{ahora acerca del
punto de inicio de la amplificación y el progreso de
Her-2/neu.}
En una realización preferida se detecta adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal por la combinación de los
biomarcadores C3a y transtiretina o derivados de la misma. Esto
permite la detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal con una sensibilidad y/o especificidad aumentadas.
Además, el método de detección está bien aceptado por los
pacientes, ya que el método de detección es no invasivo.
La sensibilidad y especificidad se definen del
siguiente modo:
La sensibilidad es la cantidad de pacientes
positivos verdaderos (%) con respecto a la cantidad de todos los
pacientes (100%). Los pacientes son individuos que tienen adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
La especificidad es la cantidad de individuos
negativos verdaderos (%) con respecto a la cantidad de todos los
individuos sanos (100%).
La sensibilidad y especificidad como alternativa
pueden definirse por las siguientes fórmulas:
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
La sensibilidad se calcula por la siguiente
fórmula:
TP/(TP +
FN)
y la especificidad se calcula por
la siguiente
fórmula:
TN/(TN +
FP)
El resultado de cada grupo de análisis, que se
selecciona entre TP, FP, TN, FN, se calcula para una pluralidad de
muestras aisladas seleccionadas entre el grupo compuesto por
individuos sanos, pacientes con adenoma colorrectal y/o pacientes
con carcinoma colorrectal. TP, FP, TN, FN se refiere a la cantidad
de individuos que se correlacionan con el estado verdadero
positivo, falso positivo, verdadero negativo, falso negativo,
respectivamente.
Los métodos de la presente invención pueden
realizarse en combinación con otros métodos de diagnóstico para la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para
aumentar la sensibilidad y/o especificidad global. La detección de
C3a permite una detección muy temprana de adenoma colorrectal y por
lo tanto puede usarse como un marcador muy temprano.
Preferiblemente, los métodos de la presente
invención se realizan como un método de detección temprana y/o
control. Si los resultados de los métodos de la presente invención
indican la incidencia de adenoma colorrectal y/o adenoma
colorrectal, deben realizarse exámenes adicionales tales como
colonoscopia.
Pueden usarse los siguientes anticuerpos
policlonales anti-transtiretina y anticuerpos contra
C3a cuando se practica la invención:
\bullet Anti-transtiretina: PC
066 disponible en The Binding Site Ltd., Birmingham, Inglaterra y A
0002, disponible en DAKO, Hamburg, Alemania.
\bullet
Anti-C3a-desArg: disponible con el
inmunoensayo Quidel (Quidel Corporation, 10165 McKellar Court, San
Diego, CA92121, EEUU).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1 muestra la secuencia proteica de C3.
Fig. 2 muestra (A) la secuencia proteica de C3a
y (B) la secuencia proteica de C3a-desArg.
Fig. 3 muestra un diagrama esquemático para
fraccionar y perfilar muestras séricas.
Fig. 4 muestra la cuantificación de
C3a-desArg usando un ELISA. Se ensayaron muestras
séricas de pacientes sin cáncer (n=28), con adenoma (n=28) y con
cáncer colorrectal (n=28) por duplicado en el Inmunoensayo
Enzimático de C3a Quidel. (A = grupo con adenoma, N = grupo de
control sano, T = grupo con cáncer).
Fig. 5 muestra el análisis de
C3a-desArg por A) ELISA y B)
SELDI-TOF MS. Las concentraciones medias de
C3a-desArg son significativamente más elevadas en
el grupo con adenoma y con cáncer en comparación con el grupo de
control sin cáncer. (A = grupo con adenoma, N = grupo de control
sano, T = grupo con cáncer).
Fig. 6 muestra la cuantificación de
transtiretina por A) inmunodifusión radial y B) análisis
SELDI-TOF MS. Las concentraciones medias de
transtiretina son significativamente inferiores en el grupo con
adenoma y con cáncer en comparación con el grupo de control sin
cáncer. Además, las concentraciones medias de transtiretina son
significativamente inferiores en el grupo con cáncer en comparación
con el grupo con adenoma medidas por inmunodifusión radial. (A =
grupo con adenoma, N = grupo de control sano, T = grupo con
cáncer).
Fig. 7 muestra la correlación entre los datos de
SELDI-TOF MS e inmunoensayo. Se analizó
C3a-desArg (A) por ELISA, transtiretina (B) por
inmunodifusión radial.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique otra cosa todos los
métodos se realizaron siguiendo el protocolo del fabricante de los
sistemas analíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió e investigó el suero de tres grupos
de pacientes humanos.
El grupo 1 constaba de 28 pacientes que eran
pacientes quirúrgicos tratados para enfermedades no cancerosas
tales como hernia inguinal, piedras en la vesícula biliar o
diverticulitis. Estos individuos del grupo 1 se tomaron como el
grupo de individuos sanos, es decir, aquellos que no padecían
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal.
El grupo 2 constaba de 28 pacientes, que eran
todos pacientes quirúrgicos tratados para tumores indefinidos, que
resultaron ser adenoma colorrectal benigno.
El grupo 3 constaba de 28 pacientes, que eran
pacientes que tenían carcinoma colorrectal. Estos 28 pacientes
padecían carcinoma colorrectal TNM en fase III (Tumor,
Nódulos, Metástasis en fase III).
Las directrices éticas y la confidencialidad de
los pacientes se han asegurado estrictamente y todos los pacientes
dieron su consentimiento por escrito para participar en este
estudio. Todos los pacientes tenían preparaciones preoperatorias
comparables tales como tiempo en ayunas y medicación en el momento
de la cirugía.
Se fraccionó el suero de cada paciente por
cromatografía de intercambio aniónico (Kit de Fraccionamiento de
Suero/resina Q HyperD, Ciphergen Biosystems, Inc.) usando un enfoque
de automatización en formato de 96 pocillos (Biomek2000,
Ciphergen), de acuerdo con el protocolo del fabricante, para reducir
algo de la interferencia por las proteínas más abundantes. Como se
muestra en la Fig. 3, el fraccionamiento produjo 6 fracciones que
contenían proteínas separadas aproximadamente en base al valor pI de
la proteína.
La proteína C3A-desArg (p 8.960
Da) se eluyó con la fracción 1 en la solución de lavado de pH 9,0
(Tris-HCl 50 mM con OGP al 0,1%
(Octil-\beta-D-glucopiranósido,
pH 9,0) (de acuerdo con las condiciones definidas por el kit de
fraccionamiento de suero para el mapeo de diferencias de expresión
nº cat. K100-0007 de Ciphergen Biosystems Inc.). La
proteína transtiretina (p 13.776 Da) se eluyó con la fracción 4 a pH
4,0 (acetato sódico 100 mM con OGP al 0,1%, condiciones de pH 4,0
(de acuerdo con las condiciones definidas por el kit de
fraccionamiento de suero para el mapeo de diferencias de expresión
nº cat. K100-0007 de Ciphergen Biosystems Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Se procesaron las series proteicas CM10 en un
bioprocesador (Ciphergen Biosystems, Inc.) de acuerdo con el
protocolo del fabricante. Se equilibraron las microplacas con tampón
de unión CM10 (Ciphergen Biosystems, Inc.) durante 2 x 5 minutos y
posteriormente se incubaron con las fracciones séricas (que se
habían diluido 1:10 en tampón de unión CM10). Después de 45 minutos
se retiró el material no unido y se lavaron las microplacas 3 veces
con tampón de unión CM10 y 2 veces con agua. Después de secar a
temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadieron 2
aplicaciones de ácido sinapínico 0,05 M (1,0 \mul) y se analizaron
las microplacas con el Ciphergen Protein ChipReader (modelo
PBSII).
El Protein ChipReader es un espectrómetro de
masas de tiempo de vuelo. Los valores de masa y las intensidades de
señal para las proteínas detectadas se transfirieron a un software,
que se suministró por Ciphergen para un análisis en profundidad
adicional por el Programa de Análisis de Datos ProteinChip y el
Programa Biomarker Wizard.
Para minimizar la variabilidad de datos, la
medición se realizó en dos días usando muestras de todos los grupos
de pacientes distribuidas aleatoriamente sobre las microplacas. Como
control patrón para la normalización, se usó suero normal combinado
en paralelo a todas las mediciones.
Se generaron espectros de masas de las proteínas
usando un promedio de 195 disparos del láser a una intensidad de
láser de 185. El detector se hizo funcionar a una sensibilidad de 7.
Para la adquisición de datos, el intervalo de tamaño de detección
se estableció entre 2.000 y 40.000 Da. El láser se centró a 10.000
Da. Los datos se analizaron con el Programa de Análisis de Datos
ProteinChip (versión 3.1, Ciphergen Biosystems) y con el Programa
Biomarker Wizard (versión 3.1, Ciphergen Biosystems). Las
intensidades de los picos se normalizaron a la corriente de iones
total. Debe apreciarse que los pesos moleculares medidos pueden
variar de una medición a otra y pueden depender de la precisión del
espectroscopio de masas usado. El peso molecular medido de C3desArg
puede estar dentro del intervalo de 8.950 \pm 25 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la cuantificación del fragmento
C3a-desArg en suero se usó un inmunoensayo
enzimático de Quidel (Quidel Corporation, 10165 McKellar Court, San
Diego, CA 92121, EEUU). El ELISA se realizó de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Las bandas de microtitulación incluidas en el
kit están recubiertas con un anticuerpo monoclonal (incluido en el
inmunoensayo de Quidel) específico para C3a-desArg
humano. Las muestras se diluyeron 1:500 y se incubaron durante una
hora a 18-25ºC. Durante esta incubación, se unirá
C3a-desArg de la muestra al anticuerpo monoclonal.
Después de retirar por aclarado C3 nativo no unido, se usó
anticuerpo de conejo anti-C3a conjugado con
peroxidasa para la detección de C3a-desArg unido.
El exceso de conjugado se retira a través de una etapa de lavado, y
se cuantificó la cantidad de C3a-desArg en la
muestra sérica usando la reacción de peroxidasa y una curva
patrón.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de inmunodifusión radial (ensayo de
Prealbúmina Tina-Quant, ensayo Inmunoturbidométrico
para la determinación de prealbúmina, Roche diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania, Nº Cat. 11660519) se realizó en un laboratorio
de servicios clínicos. Se aplicó el suero a un pocillo cilíndrico
cortado en una matriz de gel que contenía una concentración
uniforme de anticuerpos monospecíficos. El antígeno colocado en el
pocillo difunde radialmente, produciendo un anillo de precipitina.
Los anillos de precipitina pueden leerse en cualquier momento
después de incubación durante una noche, o el criterio de
valoración. Los resultados se cuantificaron comprando el diámetro
del anillo de precipitina producido por las muestra con los anillos
de precipitina producidos por patrones de concentraciones
conocidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los tres grupos de pacientes se calcularon
valores de corte por los algoritmos C&RT (CART) en base al
análisis de árboles de decisión (Breiman, L, Friedman, J. H.,
Olshen, R. A., & Stone, C. J. (1984). Classification and
regression trees. Monterey, CA: Wadsworth & Brooks/Cole Advanced
Books & Software). Los valores de corte se han calculado para
seleccionar y especificar los valores limitantes entre los
diferentes grupos de análisis. La evaluación se ha realizado con el
Software STATISTICA Vs 7.1 de STATSOFT INC, el análisis de árboles
de decisión se realiza con el subprograma de Árboles de
Clasificación Convencionales Data-Miner Modul
(CAndRT) (StatSoft, Inc. (2005). STATISTICA (sistema de software de
análisis de datos), versión 7.1. www.statsoft.com).
Los datos estadísticos se evalúan en base al
valor medio y la desviación típica. Además, las Figuras muestran un
intervalo de confianza de la media \pm 95, lo que indica que los
valores medios verdaderos de posibles grupos de pacientes con una
probabilidad del 95% se encuentran dentro de este intervalo. La
evaluación estadística se realiza por el Ensayo T. Los ensayos se
consideraron significativos a valores p de p< 0,05. Las líneas
del diagrama de caja muestran la desviación típica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En este experimento, se identificó por duplicado
la expresión de C3a-desArg entre suero de pacientes
son carcinoma (Grupo 1, n=28 pacientes) y suero de pacientes con
adenoma colorrectal (Grupo 2, n=28 pacientes) y carcinoma
colorrectal (Grupo 3, n=28 pacientes) por ELISA (inmunoensayo
enzimático de C3a Quidel) y por análisis SELDI-TOF
MS como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se cuantificó la expresión de transtiretina por
inmunodifusión radial y por análisis SELDI-TOF MS
como se ha descrito anteriormente con el mismo colectivo de
pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Figura 4, la intensidad de
la concentración de C3a-desArg [ng/ml] difiere
significativamente entre los tres grupos. El nivel de
C3a-desArg aumenta desde individuos sanos sobre
pacientes con adenoma colorrectal hasta pacientes con carcinoma
colorrectal.
La Tabla 1 muestra la distribución de los
niveles séricos de C3a-desArg [ng/ml], y
transtiretina [g/l] entre 84 muestras séricas usando
SELDI-TOF MS e inmunoensayos (ELISA de
C3a-desArg, inmunodifusión de transtiretina) para
la validación. Se midieron 28 muestras séricas en cada grupo.
\newpage
Las concentraciones séricas de
C3a-desArg medidas por ELISA eran significativamente
más elevadas en pacientes con adenoma y carcinoma en comparación
con el grupo de control sin cáncer (Figura 5A). De acuerdo con estos
datos, era posible una discriminación de los individuos sanos entre
los pacientes con cáncer. Además, también era posible una
discriminación entre los individuos sanos y los pacientes con
adenoma. Los resultados eran muy similares a los datos conseguidos
por análisis SELDI-TOF MS (Figura 5B). En la Figura
7 se muestra el diagrama de dispersión de ambos métodos
(SELDI-TOF MS y ELISA), que demuestra una buena
correlación (Fig. 7A; r = 0,7) entre la intensidad de p 8.960
medida por SELDI-TOF MS y la concentración de
C3a-desArg medida por ELISA de cada paciente así
como una buena correlación (Fig. 7B, r = 0,81) entre la intensidad
de p 13.776 medida por SELDI-TOF MS y la
concentración de transtiretina medida por ELISA de cada paciente.
Esto indica que los resultados son independientes del método de
análisis.
Se generaron datos de transtiretina por análisis
SELDI-TOF MS (Figura 6B) y se confirmaron por
inmunodifusión radial (Figura 6A). Entro los pacientes con cáncer
colorrectal, la transtiretina era significativamente inferior en
comparación con pacientes sin cáncer. Además, las concentraciones de
transtiretina en suero de pacientes con adenoma aún es
significativamente inferior que en suero normal.
La Tabla 2 muestra la comparación de
sensibilidad y especificidad de C3a-desArg, medido
por SELDI-TOF MS y ELISA, respectivamente, para la
discriminación entre controles sanos y pacientes con
adenoma/tumor.
La Tabla 3 muestra la comparación de
sensibilidad y especificidad de transtiretina, medida por
SELDI-TOF MS e inmunodifusión radial,
respectivamente, para la discriminación entre controles sanos y
pacientes con adenoma/tumor.
La Tabla 4 muestra la comparación de
sensibilidad y especificidad de ambos biomarcadores
(C3a-desArg/transtire-
tina) en combinación. Se midieron C3a-desArg y transtiretina por inmunoensayo para la discriminación entre controles sanos y pacientes con Adenoma/Tumor. Los valores de corte para transtiretina (TTR) y C3a-desArg se muestran entre paréntesis.
tina) en combinación. Se midieron C3a-desArg y transtiretina por inmunoensayo para la discriminación entre controles sanos y pacientes con Adenoma/Tumor. Los valores de corte para transtiretina (TTR) y C3a-desArg se muestran entre paréntesis.
La Tabla 5 muestra la sensibilidad y
especificidad de C3a-desArg como biomarcador único.
Los niveles de C3a-desArg se midieron por ELISA
para la discriminación entre controles sanos y pacientes con adenoma
y/o tumor. Los valores de corte se muestran entre paréntesis.
La Tabla 6 muestra la sensibilidad y
especificidad de transtiretina como biomarcador único. Los niveles
de transtiretina se midieron por inmunodifusión radial para la
discriminación entre controles sanos y pacientes con adenoma y/o
tumor. Los valores de corte se muestran entre paréntesis.
La Tabla 7 muestra la sensibilidad y
especificidad de C3a-desArg y transtiretina (TTR) en
combinación. Los niveles de transtiretina y
C3a-desArg se midieron por ELISA e inmunodifusión
radial, respectivamente. Los valores de corte se muestran entre
paréntesis.
Estos datos muestras que C3a, opcionalmente en
combinación con transtiretina, es un excelente biomarcador para la
detección de adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal. En
contraste con los biomarcadores CEA y CA 19-9 ya
conocidos es posible discriminar entre individuos sanos y pacientes
con adenoma. La sensibilidad y especificidad del ensayo de C3a es
elevada y permite una detección específica temprana de adenomas sin
colonoscopia. En particular, la combinación de los biomarcadores
C3a y transtiretina permite la detección de adenomas con una
excelente sensibilidad y elevada especificidad.
Claims (21)
1. Un método para detectar adenoma colorrectal
y/o carcinoma colorrectal que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo que tiene la misma función en dicho material de muestra
aislado,
c) comparar el nivel determinado de C3a o un
derivado del mismo que tiene la misma función con uno o más valores
de referencia.
2. Un método para discriminar entre adenoma
colorrectal y carcinoma colorrectal que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo que tiene la misma función en dicho material de muestra
aislado,
c) comparar el nivel determinado de C3a o un
derivado del mismo que tiene la misma función con uno o más valores
de referencia.
3. Un método para controlar el desarrollo y/o el
transcurso y/o el tratamiento de adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal que comprende las etapas de:
a) proporcionar un material de muestra aislado
que se ha tomado de un individuo,
b) determinar el nivel de C3a o un derivado del
mismo que tiene la misma función en dicho material de muestra
aislado,
c) comparar el nivel determinado de C3a o un
derivado del mismo que tiene la misma función con uno o más valores
de referencia.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde el nivel de C3a o un derivado del
mismo en dicho material de muestra tomado de un paciente con adenoma
colorrectal o carcinoma colorrectal está más elevado en comparación
con un material de muestra de un individuo sano.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde un primer aumento del nivel de
C3a o un derivado del mismo en un primer material de muestra es
indicativo de adenoma colorrectal y donde un segundo aumento del
nivel de C3a o un derivado del mismo en un segundo material de
muestra, aislado de dicho individual en un momento posterior a
dicho primer material de muestra, es indicativo de carcinoma
colorrectal, con la condición de que dicho segundo aumento sea más
fuerte que dicho primer aumento.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, donde en la etapa (b) se determina uno
o más biomarcadores adicionales para detectar adenoma colorrectal
y/o carcinoma colorrectal en dicho material de muestra aislado y
donde en la etapa (c) se compara el nivel determinado de
dicho(s) biomarcador(es) con uno o más valores de
referencia respectivos.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, donde se selecciona opcionalmente al
menos un biomarcador adicional para detectar adenoma colorrectal y/o
carcinoma entre el grupo compuesto por transtiretina, p53, CEA, CA
19-9, CA 15-3,
CA-125, Kras, \beta-Catenina,
Her-2/neu, proteína C-reactiva
plasmática y derivados de los mismos y
mutaciones en los genes de cadherina E, MSH2,
MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6 y
inestabilidad en microsatélites de MHL1 o MSH2
y
SNP y combinaciones de los mismos.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, donde el(los) valor(es) de
referencia de C3a y/o derivado(s) del mismo y opcionalmente
el(los) valor(es) de referencia del(de los)
biomarcador(es)
adicional(es) y/o derivado(s) del(de los) mismo(s) se calcula(n) como el nivel promedio de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente el(los) biomarcador(es) adicional(es) y/o derivado(s) del(de los) mismos en una pluralidad de muestras aisladas de un grupo respectivo de individuos, donde el grupo de individuos son individuos sanos, pacientes con adenoma colorrectal y/o pacientes con carcinoma colorrectal.
adicional(es) y/o derivado(s) del(de los) mismo(s) se calcula(n) como el nivel promedio de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente el(los) biomarcador(es) adicional(es) y/o derivado(s) del(de los) mismos en una pluralidad de muestras aisladas de un grupo respectivo de individuos, donde el grupo de individuos son individuos sanos, pacientes con adenoma colorrectal y/o pacientes con carcinoma colorrectal.
\newpage
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, donde el(los) valor(es) de
referencia
es(son) valor(es) de referencia individual(es) calculado(s) como el nivel promedio de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente de biomarcador(es) adicional(es) y/o derivado(s) del(de los) mismo(s) determinado(s) en una pluralidad de materiales de muestra aislados tomados de dicho individuo durante un periodo de tiempo.
es(son) valor(es) de referencia individual(es) calculado(s) como el nivel promedio de C3a y/o un derivado del mismo y opcionalmente de biomarcador(es) adicional(es) y/o derivado(s) del(de los) mismo(s) determinado(s) en una pluralidad de materiales de muestra aislados tomados de dicho individuo durante un periodo de tiempo.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde el material de muestra
aislado es un fluido corporal y se selecciona opcionalmente entre el
grupo compuesto por sangre, plasma sanguíneo, suero, médula ósea,
deposiciones, fluido sinovial, fluid linfático, fluido
cefalorraquídeo, esputo, orina, leche materna, esperma, exudado y
mezclas de los mismos.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde el nivel de C3a y/o un
derivado del mismo y opcionalmente de biomarcador(es)
adicional(es) en dicho material de muestra se determina a
nivel ADN, ARNm y/o proteico.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde el nivel de C3a y/o un
derivado del mismo y opcionalmente de biomarcador(es)
adicional(es) en dicho material de muestra se determina por
una técnica de hibridación de ácido nucleico, métodos inmunológicos
o técnica de proteómica, y/o espectroscopía de masas.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde el método se realiza en
combinación con otros métodos de diagnóstico para adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal para aumentar la sensibilidad
y/o especificidad.
14. Un uso de C3a o un derivado del mismo que
tiene la misma función como biomarcador para la detección de
adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal en una muestra aislada
de un individuo.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14
para la detección temprana de adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal en una muestra aislada de un individuo.
16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15, en combinación con uno o más biomarcadores
adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma colorrectal para
aumentar la sensibilidad y/o especifi-
cidad.
cidad.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
donde el al menos un biomarcador adicional se selecciona
opcionalmente entre el grupo compuesto por transtiretina, p53, CEA,
CA 19-9, CA 15-3,
CA-125, Kras, \beta-Catenina,
Her-2/neu, proteína C-reactiva
plasmática y derivados de los mismos y
mutaciones en los genes de cadherina E, MSH2,
MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6 y
inestabilidad de microsatélites de MHL1 o MSH2
y
SNP y combinaciones de los mismos.
18. Un inmunoensayo para detectar adenoma
colorrectal y/o carcinoma colorrectal en un material de muestra
aislado de un individuo que comprende:
a) un anticuerpo o un receptor que se une a un
epítopo de C3a o un derivado del mismo que tiene la misma
función,
b) un soporte sólido que soporta dicho
anticuerpo o receptor,
c) un reactivo para detectar la unión de dicho
epítopo de C3a o un derivado del mismo que tiene la misma función a
dicho anticuerpo o receptor,
donde dicho inmunoensayo comprende
uno o más anticuerpos o receptores para la detección de uno o más
biomarcadores adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal.
19. El inmunoensayo de acuerdo con la
reivindicación 18, donde se selecciona opcionalmente al menos un
biomarcador adicional entre el grupo compuesto por transtiretina,
p53, CEA, CA 19-9, CA 15-3,
CA-125, Kras, \beta-Catenina,
Her-2/neu, proteína C-reactiva
plasmática y derivados de los mismos y
mutaciones en los genes de cadherina E, MSH2,
MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6 y
inestabilidad de microsatélites de MHL1 o MSH2
y
SNP y combinaciones de los mismos.
\newpage
20. Una serie que comprende moléculas de
detección para detectar adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal en un individuo que comprende como molécula de
detección:
a) una sonda de ácido nucleico inmovilizada en
un soporte sólido para unir y detectar ARNm que codifica C3a o un
derivado del mismo que tiene la misma función, o
b) un anticuerpo inmovilizado en un soporte
sólido para unir y detectar un epítopo de C3a o un derivado del
mismo que tiene la misma función, o
c) un receptor inmovilizado en un soporte sólido
para unir y detectar un epítopo de C3a o un derivado del mismo que
tiene la misma función,
donde preferiblemente cada una de las diferentes
cantidades de moléculas de detección están inmovilizadas a dicho
soporte sólido para aumentar la exactitud de la cuantificación,
donde dicha serie comprende uno o más
anticuerpos o receptores para la detección de uno o más
biomarcadores adicionales para adenoma colorrectal y/o carcinoma
colorrectal.
21. La serie de acuerdo con la reivindicación
20, donde el al menos un biomarcador adicional se selecciona
opcionalmente entre el grupo compuesto por transtiretina, p53, CEA,
CA 19-9, CA 15-3,
CA-125, Kras, \beta-Catenina,
Her-2/neu, proteína C-reactiva
plasmática y derivados de los mismos y
mutaciones en genes de cadherina E, MSH2, MSH3,
MLH1, PMS1, PMS2, MSH6 e inestabilidad de microsatélites de MHL1 o
MSH2 y SNP y combinaciones de los mismos.
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