ES2322679T3 - Equipo, kit y procedimiento de diagnostico microbiologico. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a la microbiología y forma parte de un sistema para una rápida diagnosis microbiológica. La invención permite detectar cambios turbidimétricos debidos al crecimiento microbiano empleando un equipo que comprende dos dispositivos principales: un mini-lector turbidimétrico estático y un sensor de microflujo que está alimentado mediante una bomba peristáltica, estando este equipo acoplado a un micro-ordenador con un programa de adquisición, procesamiento y creación de base de datos para ser usado en la generación de informes necesarios. El conjunto de diagnóstico tiene un vial de vidrio con un medio de cultivo y contiene un polímero con una actividad de-represiva y dos sustratos adicionales para identificación del E. coli, así como un conjunto de discos antibióticos organizados en una fila para determinación antibiograma a partir de colonias aisladas previamente de muestras obtenidas directamente de sus fuentes, permitiendo la detección de infecciones del tracto urinario a partir de muestras directas de orina, incluyendo la identificación simultánea del E. coli.
Description
Equipo, kit y procedimiento de diagnóstico
microbiológico.
La presente invención se refiere al campo de la
Microbiología, específicamente a un procedimiento y a un equipo
útiles para un diagnóstico microbiológico rápido, teniendo todos
ellos aplicaciones en la práctica clínica veterinaria y humana.
El diagnóstico microbiológico basado en
procedimientos físicos, químicos así como biológicos es un aspecto
que se ha abordado ampliamente en la técnica anterior.
La patente estadounidense 3.506.544 describe un
procedimiento electroquímico para detectar bacterias a través de la
medición de la disminución del contenido polarográfico del oxígeno
que circula a través de una celda electroanalítica que contiene dos
electrodos diferentes sumergidos en un medio de cultivo inoculado.
Este sistema usa para su análisis grandes cantidades de medio de
cultivo (15-18 ml), dificultando así el tratamiento
de las muestras a nivel de
rutina.
rutina.
Otro procedimiento que se ha usado para detectar
el crecimiento microbiano es el principio de celda voltaica, que se
basa en el uso de un recipiente apropiado con electrodos de metales
nobles y volúmenes predeterminados, que generan un potencial que
desciende en el momento del crecimiento de la bacteria. En la
bibliografía especializada, se han descrito otros equipos basados
en este principio. Por ejemplo, el equipo descrito por la patente GB
2142433 usa el mismo procedimiento, y usa un procedimiento de
detección a través de la variación del potencial entre electrodos
que están en contacto con muestras de fluido. Esto conlleva la
medición implícita de potenciales inferiores con implementaciones
de alta impedancia de la entrada que provocan un cambio en la señal
medible debido a ruidos indeseables e inevitables, que en la
mayoría de los casos además usa recipientes con metales nobles o
recipientes con capa de oro no recuperable.
Un procedimiento sencillo y eficaz para detectar
el crecimiento microbiano se basa en la medición de cambios
conductimétricos que se producen debido al crecimiento microbiano en
un medio de cultivo adecuado. Según la bibliografía relevante, los
movimientos iónicos producen una señal que indica el valor
conductimétrico en una disolución contenida en una celda de la
medición de la conductividad.
Se sabe que las celdas de conductividad no
tienen un comportamiento totalmente lineal en su escala de
referencia, y la medición depende en gran medida de la temperatura.
En la patente estadounidense 4.482.967, se describe un detector y
un procedimiento para medir la conductividad que corrige estos
defectos. Éste es un equipo de alta exactitud y complejidad y con
requisitos especiales para medir valores de conductividad absolutos
en una cromatografía de gases, con celdas convencionales y grandes
volúmenes.
Se sabe que el crecimiento microbiano puede
detectarse en muestras de fluido mediante diferentes procedimientos,
por ejemplo usando un procedimiento turbidimétrico en el que el
crecimiento bacteriano produce turbidez que el sistema lee y
compara con patrones bien conocidos.
Este sistema requiere sensores ópticos
convencionales, así como el recipiente receptor de la muestra de
calidad óptica, de diseño complejo para trabajar con muestras que
incluyen sólidos visibles que pueden observarse fácilmente (por
ejemplo, discos de antibióticos). Una gran desventaja de este
sistema es el hecho de que no puede funcionar con muestras
interferidas, es decir, requiere muestras ópticamente homogéneas,
además de la complejidad óptica que soporta. Las patentes
estadounidenses 3.852.532; 3.895.661 y 3.889.011 describen
procedimientos y aparatos para ese fin basados en estos
principios.
Las patentes estadounidenses 4.021.120 y
3.714.445 describen dispositivos basados en el principio
turbidimétrico para medir el crecimiento de microorganismos en
medios líquidos. La patente estadounidense 4.021.120 describe un
dispositivo para controlar el crecimiento de microorganismos en un
medio líquido que contiene gas. Se toman muestras del recipiente en
el que está el medio, con la ayuda de una bomba que las transporta
hasta una cámara de desgasificación con el fin de eliminar las
burbujas de gas. Tras esto, la muestra se introduce en una cámara
de medición en la que un rayo de luz pasa a través de la misma. El
rayo de luz incide sobre la celda fotoeléctrica, produciendo una
corriente que se aumenta mediante un amplificador. Esto es un
indicador del crecimiento de los microorganismos. La magnitud de
esta corriente dependerá de la intensidad del rayo de luz y estará
influida, al mismo tiempo, por la turbidez del medio. Entonces, se
devuelve de nuevo la muestra al recipiente cuando se analiza, con
la ayuda de otra bomba. Este procedimiento de medición, así como el
descrito en la patente estadounidense 3.714.445, es muy complejo
tanto óptica como mecánicamente, mientras que, además de la cámara
de medición, también las bombas y los conductos del transporte de
las muestras deben esterilizarse frecuentemente, dificultando esta
complejidad su uso en procedimientos de diagnóstico de rutina.
\newpage
La patente británica 2 221 986 y las patentes
estadounidenses 3.819.278 y 4.725.148 se refieren a turbidímetros
para medir directamente el crecimiento microbiano usando el mismo
principio de procedimientos anteriores. Presentan sistemas ópticos
y mecánicos complejos y requieren la esterilización de sus partes
entre cada lote de microorganismos.
Por otra parte, la patente estadounidense
3.832.532 también usa un dispositivo óptico convencional que incluye
una cubeta de calidad espectrofotométrica, que con el fin de
realizar mediciones usando discos de antibióticos, incluye en su
diseño una cámara interconectada bilobulada, de manera que una vez
que finaliza la incubación, el líquido debe pasar a la otra cámara
con el fin de realizar la medición, y evitar de ese modo la
presencia del disco de antibiótico durante la operación de lectura.
La solución propuesta de esta invención presenta una gran
complejidad no sólo operativa sino también técnica y tiene
implicaciones económicas.
Las presentes tendencias de la Microbiología se
dirigen hacia la búsqueda de procedimientos que permitan una rápida
identificación de los microorganismos (entre 2-4
horas) en muestras biológicas. Para lograr esto, se han usado
diferentes estrategias, entre ellas el uso de marcadores enzimáticos
específicos.
Según el estado de la técnica, la mayoría de las
muestras biológicas no pueden usarse directamente, necesitando el
aislamiento y crecimiento previos del microorganismo que va a
identificarse. Esto lleva mucho tiempo, y es imposible obtener
resultados antes de 24-48 horas tras recibir las
muestras en el laboratorio.
Las infecciones del tracto urinario se
consideran unas de las más frecuentes entre las enfermedades
infecciosas.
Las técnicas clásicas para detectar infecciones
bacterianas en la orina requieren un cultivo en placas, lo que
requiere al menos 24 horas para eliminar todas las muestras
negativas y seleccionar las positivas.
Se sabe que solamente el 20% de las muestras de
orina que llegan al laboratorio son positivas y de éstas, el 70%
corresponden a infecciones por E. coli. Es por esto que la
identificación de E. coli permite un considerable ahorro de
tiempo y recursos, debido a que solamente el 30% de las muestras
positivas se aislarían para su identificación posterior.
Según el estado de la técnica, la identificación
de E. coli se lleva a cabo principalmente mediante dos
marcadores enzimáticos específicos de esta bacteria, las enzimas
\beta-D-glucuronidasa y
triptofanasa, a través de la formación de indol (Kovacks, N. Eine
vereinfachte Methode zum der Nachweis der Indolbildung durch
Bakterien. Z. Immunitatsforsch., 55; 311-315, 1928).
El 94% de todas las células de E. coli, algunas de
Salmonella y Shigella muestran una reacción positiva
hacia la \beta-D-glucuronidasa. La
formación de indol es positiva para el 99% de todas las células de
E. coli. Por tanto, la combinación de ambas pruebas permite
una identificación inequívoca de este microorganismo.
En la actualidad, están comercializándose
diferentes pruebas, como BACTIDENT-E. coli y diferentes
medios de cultivo como FLUOROCULT-MUG, (ambos de
MERCK DIAGNOSTICA). Se basan en el principio anterior. Sin embargo,
para su utilización, es necesario un aislamiento previo del
microorganismo para obtener una colonia aislada, para llevar a cabo
la identificación por BACTIDENT, o la muestra se inocula en el medio
de cultivo y se necesitan 24 horas para obtener las colonias
aisladas y para poder detectar los cambios asociados con la
transformación de los sustratos específicos
(FLUOROCULT-MUG).
En la solicitud de patente número WO 95/03424,
se notifica un medio de cultivo sólido para la detección simultánea
de bacterias coliformes y/o E. coli en muestras de agua y en
alimentos. Para esto, se requieren 24 horas de incubación tras
inocular la placa con la muestra que va a evaluarse. Se siguen
procedimientos similares en el kit de diagnóstico URILINE ID y el
medio de cultivo CPS ID, ambos de BIOMÉRIEUX, Francia. En ambos
casos es necesaria la incubación de las muestras en medio sólido
durante 24 horas antes de identificar el microorganismo.
La solicitud de patente número WO 80/02433 se
refiere a un procedimiento para identificar bacterias a través de
la combinación de diferentes pruebas para determinar 26 enzimas
bacterianas; entre ellas
\beta-D-glucuronidasa y
triptofanasa son útiles para identificar E. coli.
En esta invención, las bacterias deben aislarse
de las muestras clínicas antes de su identificación.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un sistema que permite detectar el crecimiento
microbiano de manera temprana, en muestras de orina obtenidas
directamente de animales en los que se requiere la detección del
crecimiento de microorganismos a través del uso de micromuestras.
Este sistema se basa en la detección de cambios turbidimétricos en
un medio de cultivo, producidos por el microorganismo en
crecimiento. Este sistema incluye un procedimiento y equipo
diseñados para este fin.
El procedimiento para el diagnóstico microbiano
en orina según la presente invención comprende las siguientes
etapas:
- a)
- se inocula una alícuota de una muestra de orina obtenida directamente de su fuente en un vial de vidrio que contiene medio de cultivo, un polímero y sustratos MU-\beta-D-glucurónido y L-triptófano, ambos solubilizados en fosfato de potasio 50 mM, pH de 7 a 7,5,
- b)
- se determina la turbidez de dicho vial a tiempo = 0;
- c)
- se incuba el vial entre 2 y 6 horas a una temperatura entre 35ºC y 37ºC;
- d)
- se determina el índice de crecimiento entre tiempo 0 y el tiempo de incubación seleccionado y se discriminan las muestras positivas de las negativas dependiendo del aumento de la turbidez, siendo positivas aquellas muestras con aumentos superiores a 0,08 unidades McFarland, de las que se toman alícuotas para etapas adicionales;
- e)
- se toma una alícuota de una muestra positiva de la etapa d) y se transfiere a un nuevo vial de vidrio que contiene medio de cultivo recién preparado, que se dispensa en un volumen de 200 \mul en cada micropocillo de una tira no transparente que contiene dos posiciones libres para controles negativo y positivo, que se llenan con medio de cultivo solo y medio de cultivo inoculado respectivamente, y de 10 a 22 posiciones en las que se organizan discos de antibióticos, y se incuba entre 3 y 4 horas a una temperatura entre 35ºC y 37ºC;
- f)
- se lee la tira colocando un lector turbidimétrico de microflujo, que se alimenta mediante una bomba peristáltica, en cada micropocillo siguiendo las instrucciones emitidas por un paquete de programas informáticos para la adquisición y el procesamiento de datos y la creación de bases de datos diseñadas para ese fin, en el que el lector turbidimétrico de microflujo comprende un fotoemisor, un fotodetector y una cámara de medición, en el que dicha cámara de medición está compuesta por un tubo de plástico introducido en un capilar de vidrio, estando iluminada la cámara de medición mediante una luz emitida desde dicho fotoemisor y que pasa a través de dicha cámara de medición;
- g)
- a partir de los valores de densidad obtenidos, se calcula el índice de crecimiento en los controles, y se calculan los porcentajes de inhibición para cada muestra para cada antibiótico;
- h)
- según el nivel de inhibición mostrado por las muestras, se adjudican los criterios de sensible, resistente o intermedio, entre valores de inhibición en un intervalo del 60% al 100%, en el que las muestras con un porcentaje de inhibición inferior al 60% pueden considerarse resistentes, las que muestran valores entre el 60% y el 80% pueden considerarse sensibles en un nivel intermedio y las que se inhiben entre el 80% y el 100% se consideran sensibles al antibiótico sometido a prueba;
- i)
- se somete una alícuota tomada de la etapa d) a una fuente de luz U.V., con el fin de detectar la fluorescencia generada debido a la liberación de 4-metilumbeliferona, y el desarrollo de la formación de indol usando un reactivo de Kovacks modificado, constituido por 2 g de paradimetilaminobenzaldehído diluido en etanol y 20 ml de ácido clorhídrico concentrado, para la detección de la actividad enzimática MU-beta-D-glucuronidasa y triptofanasa producida por E. coli;
- j)
- para aquellas muestras en las que no se identificó E. coli en la etapa i), se somete la alícuota anteriormente obtenida en la etapa d) al procedimiento de aislamiento e identificación tradicional.
El equipo de la presente invención adecuado para
llevar a cabo la determinación del antibiograma en las etapas f) a
h) del procedimiento según la presente invención comprende:
- (1)
- un lector turbidimétrico de microflujo (1) que comprende un fotoemisor (12), un fotodetector (13) y una cámara (9 y 10) de medición, en el que dicha cámara de medición está compuesta por un tubo (9) de plástico introducido en un capilar (10) de vidrio, estando iluminada la cámara de medición mediante una luz emitida desde dicho fotoemisor y que pasa a través de dicha cámara de medición;
- (2)
- una tira no transparente que contiene micropocillos;
- (3)
- una bomba (2) peristáltica para hacer circular una muestra a través de la cámara de medición del lector turbidimétrico de microflujo; y
- (4)
- un ordenador (5) que tiene un paquete de programas para la adquisición y el procesamiento de datos y la creación de bases de datos:
- \quad
- en el que
- \quad
- el lector turbidimétrico de microflujo está conectado al ordenador mediante una tarjeta de interfaz y
- \quad
- y dicho lector turbidimétrico de microflujo incluye una parte (8) de boca adecuada para la introducción en una muestra en un micropocillo de la tira no transparente que va a someterse a prueba haciendo circular una muestra a través de dicha cámara de medición mediante la acción de dicha bomba peristáltica.
La novedad de la presente solución técnica es
que permite detectar muestras infectadas, obtenidas directamente de
la especie que las produce.
\global\parskip0.940000\baselineskip
Adicionalmente, entre otras aplicaciones, la
presente invención permite obtener el esquema de sensibilidad a los
diferentes antibióticos de microorganismos usando colonias
previamente aisladas de muestras positivas de urocultivos, en este
caso ahorrando el tiempo requerido para los procedimientos de
aislamiento y purificación.
En el caso particular de infecciones del tracto
urinario, la presente invención permite discriminar las muestras
positivas de las negativas usando muestras de orina directas,
contaminadas o no con otros gérmenes. También puede incluir la
identificación simultánea de las muestras infectadas,
específicamente con la bacteria E. coli.
Con el sistema de la invención, los resultados
basados en más de 1000 muestras sometidas a prueba han mostrado un
95% de concordancia con el recuento total de células viables en el
medio de cultivo CLED. Este procedimiento se usa convencionalmente
para detectar infección en el tracto urinario.
En la determinación del antibiograma, la
correspondencia con el procedimiento de Bauer-Kirby
se ha establecido como del 92,4%, los errores graves del 1,3%, y
los errores muy graves del 0,4%.
La presente invención proporciona información
útil relacionada con el diagnóstico microbiológico clínico en un
corto periodo de tiempo. Esta información es muy importante para
prevenir el uso inadecuado de antibióticos, el desarrollo de
resistencia microbiana, largas hospitalizaciones y muerte en el caso
de infecciones graves.
El sistema se caracteriza por su rapidez. En un
periodo de cuatro horas, puede determinarse la infección de la
orina y en muestras positivas podrían obtenerse resultados de
antibiograma fiables.
Al mismo tiempo, este sistema es sumamente
preciso de manera distinguida. Los resultados obtenidos pueden
comprobarse tan a menudo como sea necesario.
Desde un punto de vista social, el sistema tiene
gran importancia debido a la posibilidad de proporcionar
antibióticos de un modo conveniente y racional, evitando largas
hospitalizaciones. Desde un punto de vista ecológico, la invención
restringe de manera similar el desarrollo de resistencia
bacteriana.
Es un sistema sumamente flexible que permite
adaptar la información del programa que usa a las necesidades o los
requisitos de los usuarios. El sistema ofrece la posibilidad de
cambiar el conjunto de antibióticos usados según las necesidades
particulares.
El sistema de la presente invención está
constituido por un equipo y un procedimiento diseñados para un
diagnóstico microbiológico rápido, que puede aplicarse en la
práctica clínica veterinaria y humana.
El equipo se ha diseñado para trabajar con una
gran cantidad de muestras y usa un programa operativo, y una
interfaz hombre-máquina que es muy funcional.
También proporciona una alarma audiovisual para ordenar la lectura
y evitar errores operacionales. El modulo de medición de este equipo
puede insertarse en la ranura libre de un ordenador.
El equipo de la presente invención puede
comprender los siguientes dispositivos:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
El ordenador personal debe tener las siguientes
propiedades:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
La bomba peristáltica se ha diseñado para
producir la circulación de las muestras a través del sensor. Tiene
un casete ajustable manualmente que permite un flujo regulado e
ininterrumpido, que puede usarse independientemente o incorporarse
en el sistema. La bomba usa un flujo de 2,0 - 2,6 ml/minuto y se
alimenta opcionalmente mediante 220 V de CA o 12 V de CC. Su
consumo de potencia es de 0,5 vatios.
El sensor está compuesto por un lector de
microflujo continuo que se usa para detectar cambios en la turbidez,
debidos al crecimiento microbiano en muestras previamente
preparadas procedentes de diferentes fuentes, en volúmenes muy
pequeños (de hasta 200 microlitros), en movimiento, es decir,
líquido en movimiento, en el que las muestras pueden estar o no
interferidas. Usando la presente invención, no es necesario
"limpiar" el lector de flujo durante las mediciones. Por
tanto, pueden medirse muestras diferenciadas o de un modo continuo.
Esta medición no está interferida por variaciones turbidimétricas
del medio de cultivo como consecuencia de los cambios de las
muestras. Sin embargo, permite detectar pequeñas variaciones de la
turbidez del medio debidas al crecimiento microbiano. No se
requiere el control de la temperatura para las mediciones, y es
posible realizar un número indeterminado de mediciones, de
diferentes muestras, de concentración de células microbianas y
fuentes diferentes.
Además, este sensor se distingue por su
calibración que es automática y a un flujo continuo de 2 - 2,6
ml/minuto. El intervalo óptico de medición es de 0,00 - 2,00
unidades McFarland.
En la presente invención, se usa un calibrador
que se basa en técnicas nefelométricas y que sigue la escala de
McFarland. Está compuesto por una fuente de luz directa y un
fotosensor y se ajusta a través de un programa. La función del
calibrador es medir la turbidez en medio líquido
Mueller-Hinton hasta 2,0 unidades McFarland. El
requisito de energía es de 5 V de CC y su consumo es de 50 mA.
La lámpara UV que está acoplada opcionalmente al
equipo permite la identificación de la bacteria E. coli en
muestras sometidas a prueba. El programa ofrece una interfaz
hombre-máquina fácil de usar, es fácil de manejar y
permite la selección de diferentes opciones mediante la barra de
menús o el teclado de funciones, combinado con el uso de iconos,
así como el almacenamiento automático de los datos.
Usa un lenguaje de consulta estructurado (SQL)
para obtener información y unas utilidades externas "BACKUP"
que realizan copias de seguridad.
El programa tiene un sistema de alarma que va a
usarse en el caso de infracción de la condición de entrada, una
alarma audiovisual para controlar el tiempo de lectura de cada
muestra, así como otras utilidades para el mantenimiento
técnico.
Las características esenciales distintivas del
equipo de esta invención son el minilector estático turbidimétrico,
el sensor de microflujo que se alimenta mediante la bomba
peristáltica y su conexión a un microordenador con un paquete de
programas para la adquisición, el procesamiento y la creación de
bases de datos, que van a usarse en la generación de los informes
necesarios.
La figura 1 muestra el esquema integral del
equipo de la presente invención, en una visión general. Tal como se
muestra, este equipo se basa en un lector turbidimétrico de
microflujo (1), que se alimenta mediante una bomba (2) peristáltica
y se ajusta a un equipo (3) electrónico de alta sensibilidad que
detecta cambios turbidimétricos de (1) a través de un procedimiento
de medición que permite usar un grupo de algoritmos para detectar
pequeñas variaciones turbidimétricas y procesar de manera apropiada
los datos obtenidos. Está formado por un circuito (4) de medición
turbidimétrico conectado a través de una tarjeta de interfaz a una
unidad (5) de procesamiento central. Esta unidad recibe todos los
comandos (6) de teclado y proporciona los resultados en un monitor
(7). Puede detectar pequeñas variaciones en la turbidez que se
producen en el medio de cultivo inoculado en la muestra que va a
someterse a prueba.
En la figura 2 se muestra un esquema detallado
de la estructura interna del lector (1) turbidimétrico en el que se
detectan las variaciones en la turbidez. El procedimiento para medir
es muy sencillo: la pequeña boca (8) del lector se introduce en la
muestra que va a someterse a prueba que entonces se hace circular a
través del mismo con ayuda de la bomba (2) peristáltica de la
figura 1. Esta bomba peristáltica funciona todo el tiempo requerido
para llevar a cabo las mediciones. En primer lugar, se detecta la
presencia de la muestra obteniendo un valor de voltaje que supera
un umbral predesignado y tras un periodo de tiempo determinado, se
realiza la medición y así sucesivamente. Cuando la bomba (2)
peristáltica de la figura 1 se mantiene funcionando, hay un periodo
de tiempo entre cada medición durante el que circula aire a través
del lector (1) turbidimétrico. Este periodo de tiempo se considera
como el momento en el que se limpia el lector (1) turbidimétrico, y
significa que no es necesario el proceso de lavado adicional con el
fin de esterilizar todas las partes del lector.
La cámara de medición está compuesta por un tubo
(9) de plástico introducido en un capilar (10) de vidrio. El paso
(11) de luz es el diámetro del orificio a través del que la luz
procedente del fotoemisor (12) debe cruzar para llegar a la cámara
(9 y 10) de medición. La intensidad de la radiación luminosa,
transmitida a través de la cámara (9 y 10) de medición, dependerá
del nivel de turbidez de la muestra y se mide mediante un
fotodetector (13). La radiación producida por el fotoemisor (12) se
estabiliza por medio de un bucle electrónico de control automático
convencional.
La figura 3 muestra el funcionamiento del lector
turbidimétrico a través de un diagrama de flujo. En primer lugar,
se verifica la presencia del lector turbidimétrico por medio de la
subrutina de detección y si está presente, se comprueba entonces la
existencia de la bomba peristáltica que es necesaria para el
funcionamiento del lector turbidimétrico y para la subrutina de
ejecución de la limpieza, estableciendo además el flujo de
funcionamiento requerido. La subrutina de limpieza es de importancia
significativa debido a que los parámetros del lector dependen de la
limpieza de la cámara de medición. Este aspecto influye en su vida
útil.
Una vez se han regulado todos los parámetros de
funcionamiento, el lector turbidimétrico estará listo. Cualquier
subrutina que se infrinja inhabilitará el funcionamiento del lector.
La aplicación principal de este dispositivo está orientada hacia la
determinación del antibiograma de la muestra (la sensibilidad de los
microorganismos a los antibióticos), que se consigue en un periodo
de tiempo entre 2 y 6 horas, ayudado por un kit de diagnóstico
diseñado para estos fines.
El otro dispositivo que se incorpora en el
equipo de la presente invención es el minilector turbidimétrico
estático mencionado anteriormente. Detecta cambios de turbidez
debidos al crecimiento microbiano de la muestra que se usó en un
vial de vidrio que contiene medio de cultivo líquido, que es uno de
los componentes del kit de diagnóstico de esta invención. Este vial
está adaptado exactamente al árbol de lectura del equipo. El
dispositivo está ajustado para usar los viales mencionados para la
lectura directa de la muestra, lo que significa que no son
necesarias cubetas especiales para ejecutar la lectura, lo que
posibilita su uso en medios de diagnóstico de rutina. El
dispositivo mencionado se usa para calibrar el inóculo que se usa en
el kit de diagnóstico para detectar el antibiograma. Notifica la
turbidez en unidades McFarland, según los modelos de látex de
patrones de NCCLS en un intervalo de medición establecido (0 - 4,0
unidades McFarland).
El kit de diagnóstico descrito en el presente
documento está compuesto por un vial nefelométrico de 8 ml de
volumen que contiene 4,5 ml de medio de cultivo, que puede ser un
vial de vidrio de borosilicato que puede tratarse en autoclave con
una cubierta de plástico.
La figura 4 muestra los componentes del kit de
diagnóstico, constituido por un vial que contiene medio de cultivo
y el polímero, el soporte de la tira y la tira usada para la
determinación del antibiograma de la muestra que va a someterse a
prueba.
Se usa caldo Mueller-Hinton
OXOID modificado estéril, pH de 7,4 \pm 0,2 como medio de cultivo
con el fin de seguir el crecimiento microbiano, que incluye
adicionalmente un polímero.
El kit de diagnóstico usado para detectar un
antibiograma en una muestra se caracteriza por el uso de discos de
antibióticos comercialmente disponibles. Pueden usarse según
esquemas que pueden cambiar según cualquier requisito. Los discos
de antibióticos se organizan en tiras no transparentes que contienen
dos posiciones libres para controles negativo y positivo, que se
llenan con medio de cultivo solo y medio de cultivo inoculado
respectivamente. Se usan para calcular el índice de crecimiento en
las muestras que van a someterse a prueba. Además, hay otras de 10
a 22 posiciones en las que podrían colocarse discos de
antibióticos.
El programa creado para estos fines permite la
introducción de estos cambios en los procedimientos de adquisición
y edición. Significa que el kit tiene una alta flexibilidad y
permite adaptaciones según diferentes necesidades.
Un polímero; que podría ser cualquier
polisacárido lineal de fórmula estructural
CH3-CH3-Ch3-N o
similar a ésta, con peso molecular entre 50.000 y 150.000, se añade
al vial de vidrio mencionado anteriormente que contiene medio de
cultivo para la dilución, que forma parte del kit de diagnóstico de
la presente invención. La incorporación de este polímero al medio
de cultivo a la concentración en el intervalo entre el 0,05% y el
1%, permite eliminar el efecto inhibidor de productos catabólicos
que acompañan al inóculo de la muestra que va a someterse a prueba,
obteniéndose por tanto mayores índices de crecimiento de las
bacterias implicadas en la infección en un periodo de tiempo menor,
en comparación con el tiempo requerido cuando se usa el mismo medio
de cultivo sin dicho polímero. Este nuevo elemento en el kit de
diagnóstico reduce los resultados sensibles falsos obtenidos en
estudios de sensibilidad, y al mismo tiempo mejora la
correspondencia con el procedimiento de referencia de
Kirby-Bauer (Bauer, A. W.; Kirby, W. M. M.; Sherris,
J. C. y Turck, M. An. J. Clin. Pathol. 1966, 45, páginas
493-496).
Considerando que este polímero sólo puede
metabolizarse por un número limitado de microorganismos que no se
encuentran generalmente en los análisis en los que se aplica el
presente sistema, se deduce que el efecto de promoción del
crecimiento bacteriano está ocasionado por una inhibición de los
agentes inhibidores que están presentes en el medio de cultivo. Por
este motivo, dicho polímero debe actuar absorbiendo los catabolitos
que se incorporan involuntariamente junto con el inóculo que se
analiza. Además, se ha observado que una vez se neutralizan estos
catabolitos mediante el polímero mencionado durante procedimiento de
medición del crecimiento del microorganismo, la actividad
bactericida de los antibióticos sometidos a prueba es más
específica.
Una de las ventajas de la presente invención es
el hecho de que el sistema permite el diagnóstico no sólo de cepas
previamente aisladas sino también muestras de orina directas.
En primer lugar, se coloca la muestra referida
en el vial de vidrio que contiene el polímero y el medio de
cultivo, inmediatamente después de eso se determina la turbidez (t0)
y este valor, así como el tiempo de lectura según el número
adjudicado de cada muestra, se almacena mediante el programa
empleado. Después de eso, se incuba el vial mencionado entre 2 y 5
horas a una temperatura entre 35ºC y 37ºC. Al final de la
incubación, el sistema emite, según la rutina estructurada, un
sonido de alarma de pitido y un aviso de pantalla que indica que la
muestra debe leerse de nuevo. Las muestras que muestran aumentos
superiores a 0,08 unidades McFarland se consideran como muestras
positivas.
El sistema de la presente invención permite, en
muestras positivas una vez se detectan, la determinación de su
antibiograma de un modo muy rápido. Para ese fin, se toma una
alícuota de la muestra y se transfiere a un nuevo vial de dilución
que contiene medio de cultivo recién preparado, que se distribuye en
la tira en la que se encuentran dos controles (positivo y negativo)
y desde 10 hasta 22 discos de antibióticos. Tras un periodo de
incubación de 4 horas a una temperatura de 37ºC, se lee la tira,
poniendo el sensor de microflujo en cada micropocillo, siguiendo
las instrucciones facilitadas por el programa, que selecciona el
momento en el que se lleva a cabo cada medición en serie. Por
tanto, se elimina la interferencia de la lectura previa. A partir
de los valores de densidad obtenidos, se calculan los índices de
crecimiento (en los controles), así como el porcentaje de
inhibición para cada muestra por cada antibiótico. Según el nivel de
inhibición mostrado por las muestras, se adjudican los criterios de
sensible, resistente o intermedio, entre valores de inhibición en
un intervalo del 60% al 100%. Esto significa que las muestras con un
porcentaje de inhibición inferior al 60% pueden considerarse
resistentes, las que muestran valores entre el 60% y el 80% pueden
considerarse sensibles en un nivel intermedio y las que se inhiben
entre el 80% y el 100% se consideran sensibles al antibiótico
sometido a prueba.
Cada resultado se comprueba con el fin de
evaluar si está entre un crecimiento admisible mínimo o máximo
(antibiograma satisfactorio). Los resultados obtenidos y los datos
de edición de cada muestra pasan automáticamente a crear las bases
de datos correspondientes.
Tal como se explicó anteriormente, la invención
permite trabajar con muestras directas en medio líquido, leer en
viales comerciales y después de eso ejecutar un antibiograma en las
muestras positivas. Este procedimiento completo se lleva a cabo en
un periodo de tiempo de menos de 9 horas, evitando de ese modo
etapas previas de aislamiento y purificación de las muestran y
obteniendo niveles de sensibilidad superiores al 90%. y obteniendo
niveles de sensibilidad superiores al 90%.
El sistema propuesto también permite hacer
frente a las interferencias generadas debido a muestras contaminadas
así como infecciones provocadas por más de un germen. La
interferencia de la contaminación se ha vencido ajustando la fuerza
de la señal y el tiempo para detectar niveles de infección que son
aceptados internacionalmente (>100.000 ufc/ml), de este modo, no
se incluyen muestras contaminadas no infectadas para el
procesamiento adicional, que generalmente tienen un bajo nivel
bacteriano (< 1000 ufc/ml), lo que facilita la oportunidad de
detectar muestras contaminadas sólo cuando están infectadas. En este
caso particular, teniendo en cuenta el hecho de que las especies
contaminantes son generalmente saprofitos, que según la reacción de
gram son sensibles a todos los antibióticos, es evidente que no
pueden interferir en la detección del esquema de resistencia de
cepas infectadas. Éstas constituyen características distintivas de
esta invención.
En relación con infecciones producidas por más
de un germen, podrían presentarse dos situaciones: en el primer
caso, uno de los gérmenes infectantes podría predominar debido a una
mayor tasa de crecimiento específico, tras el tiempo mínimo de
incubación, en este caso se aceptará el antibiograma. En el segundo
caso, en el que ambos gérmenes crecen a la misma tasa, el
antibiograma podría mostrar un antibiótico eficaz para ambos, o
podría presentarse un esquema de resistencia absoluta. En este
último caso, podría someterse a prueba un nuevo antibiótico o la
muestra debe hacerse pasar a través de procedimientos de aislamiento
y purificación.
Este conjunto de análisis y soluciones rápidas
para cada situación particular es posible gracias a la aplicación
del concepto de lectura en muestras directas con un alto nivel de
interferencia, en un tiempo corto y fijo, aspectos que caracterizan
y distinguen el sistema de la presente invención.
Además del informe de detección de infección en
el tracto urinario y el modelo de sensibilidad a bacterias
infectantes, debe incorporarse la identificación bacteriana, con el
fin de producir un informe completo. Proponiéndose conseguir este
fin, al vial mencionado con medio de cultivo y polímero, usado para
la detección de la infección urinaria, podrían añadirse dos
sustratos que permiten una identificación rápida de bacterias E.
coli en la orina, tal como se ha declarado anteriormente, en el
mismo vial de detección.
En la presente invención, un medio de cultivo
diseñado que podría usarse en el sistema propuesto permite la
detección de E. coli en un tiempo de incubación de
4-6 horas, a partir de muestras de orina infectadas
sometidas a prueba.
El medio de cultivo propuesto usado en la
presente invención incluye por litro, además de las bases nutritivas
convencionales incluidas en el medio de cultivo Mueller Hinton de
Oxoid: (infusión de carne, 300 mg; hidrolizado de caseína, 17 g y
almidón, 1,5 g), los sustratos
MU-\beta-glucurónido (0,1 g),
L-triptófano (1 g) y el polímero usado como agente
de desrepresión (1 g). Todos los componentes se disuelven en tampón
fosfato de potasio 50 mM, y se ajusta el pH del medio entre
7-7,5. Tras eso se distribuye el medio en viales de
4,5 ml de volumen, que finalmente se esterilizan mediante autoclave
durante 20 minutos a 121ºC.
Los sustratos mencionados son útiles para la
detección de la actividad enzimática
MU-\beta-D-glucuronidasa
y triptofanasa, producida por E. coli. Para la última
enzima, se necesita la detección de indol, de modo que tras obtener
el crecimiento bacteriano en el medio, se añade un reactivo auxiliar
para desarrollar la actividad (reactivo químico de Kovacks
modificado); cuya fórmula es: paradimetilaminobenzaldehído (2 g),
etanol y ácido clorhídrico concentrado (20 ml).
Se detecta el producto de la interacción
enzimas-sustrato, como primera etapa exponiendo los
viales con un aumento de turbidez (positivos) a una fuente de luz
UV (artículo que podría incluirse opcionalmente en el equipo de la
presente invención), para la detección de la fluorescencia que se
genera a partir de la 4-metilumbeliferona liberada.
Como segunda etapa, se somete a prueba la producción de indol en el
mismo vial, mediante la adición de reactivo de Kovacks
modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se enciende el equipo justo 15 minutos antes de
comenzar las lecturas.
Una vez está activado el ordenador, el programa
de autoejecución dirige directamente al programa diseñado para la
ejecución de todo el proceso, de este modo, inicialmente, someterá a
prueba la existencia y la integridad de la base de datos y;
comprobará la capacidad de funcionamiento de cada uno de los
componentes del módulo de medición: sensor, calibrador de inóculos
y bomba peristáltica. También, comprobará la existencia de clave
electrónica, que está acoplada a un puerto paralelo del ordenador.
El programa informará sobre cualquier error detectado en cualquiera
de los elementos del sistema e inhabilitará las opciones
relacionadas. Si no se había creado una base de datos, se creará si
el usuario toma esta decisión. Si no hay ninguna base de datos, se
creará si el usuario lo decide.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El urocultivo es una prueba bien conocida usada
para detectar infección en muestras de orina. El procedimiento
comienza midiendo la densidad óptica inmediatamente tras haberse
inoculado los viales (T0h), seguido de una segunda medición 4 horas
tras la incubación (T4h).
La medición se realiza fotométricamente mediante
la utilización de un calibrador de inóculos. Las siguientes etapas
muestran el procedimiento completo:
- 1.
- Se inocula un vial con medio de cultivo estéril de 4,5 ml con 500 \mul de orina.
- 2.
- Se mide la turbidez inicial en unidades McFarland usando un calibrador de inóculos (T0h).
- 3.
- Se incuba la muestra a 37ºC durante 4 horas, una vez terminado, el equipo emite una alarma acústica para cada muestra.
- 4.
- Se realiza una medición de la turbidez del vial inoculado tras 4 horas de incubación (T4h) y, según el nivel de aumento detectado, se clasifican las muestras como positivas, negativas o dudosas. En el último caso, la muestra debe comprobarse tras una hora más de incubación para detectar un probable positivo. También en pacientes con antecedentes de enfermedad renal, se recomienda el mismo procedimiento que anteriormente (T5h).
Según las necesidades, cuando se hayan realizado
todas las mediciones, podría tener lugar la edición de cada caso, y
se almacenan en la base de datos del sistema. Si está activada la
opción de imprimir automáticamente y la impresora está lista, los
casos se imprimirán automáticamente. Las muestras clasificadas como
positivas están listas para la detección mediante antibiograma
(directamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Para el antibiograma se usan tiras de 12 a 24
micropocillos. Los dos primeros son para los controles positivo
(C+) y negativo (C-), respectivamente; se colocan discos de
antibióticos en los otros micropocillos.
La inoculación de las tiras se realiza mediante
distribución de la muestra en el primer micropocillo y en aquéllos
con discos de antibióticos. El segundo micropocillo se llena con
medio de cultivo estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
- \bullet
-
\vtcortauna
- \quad
- Si se prepara el inóculo a partir de una cepa pura, deben ejecutarse las siguientes etapas:
- 1.
- Se toman tres o cuatro colonias de un medio de cultivo recién preparado (18-24 h) y se añaden a 4,5 ml estériles de caldo Mueller Hinton reforzado con un polímero lineal, peso molecular de 50.000, hasta que se obtienen 0,5 unidades de la escala McFarland, mediante pruebas de mininefelómetro. Opción que aparece en el menú principal (McFarland).
- 2.
- De esta concentración celular se añaden 150 \mul a 4,5 ml de medio de cultivo estéril colocado en otro vial, y se homogeneiza mediante agitación.
- 3.
- De la última dilución se distribuyen 200 \mul en la tira para el antibiograma, en los micropocillos usados para el control positivo (C+) y en aquéllos con discos de antibióticos.
- 4.
- En el segundo micropocillo, usado para el control negativo (C-), se distribuyen 200 \mul de medio de cultivo estéril.
- 5.
- Una vez se ha acabado se sella la tira y se incuba a 37ºC durante 4 horas.
- 6.
- Se toma la tira del incubador y tras 10 minutos a temperatura ambiente, comienzan las lecturas. Se recomienda homogeneizar la tira mediante agitación manual o mecánica.
- 7.
- Se abre la tira y empieza la lectura.
- \quad
- Para leer el antibiograma es un requisito que la diferencia entre (C +) y (C -) alcance un valor dado definido por el crecimiento mínimo admisible. Si en presencia de los valores próximos a los diferenciales establecidos por este parámetro se detectan, en cada uno de los antibióticos probados, niveles de inhibición homogéneamente bajos (antibiograma no fiable), debe repetirse el antibiograma. En estos casos se recomienda reducir hasta alcanzar el 30% del volumen del inóculo usado anteriormente.
- \bullet
-
\vtcortauna
- 1.
- Baja carga de microorganismo no infectante.
- 2.
- Paciente bajo la acción de tratamiento antimicrobiano.
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La presente descripción proporciona un conjunto
de programas completamente interactivos para llevar a cabo las
pruebas de urocultivo y antibiograma. Los datos obtenidos en cada
prueba pueden almacenarse en la base de datos para un procesamiento
adicional. Se guía al usuario dentro de un entorno fácil de manejar
que no requiere experiencia previa en el manejo de ordenadores.
Cada prueba se trata en menús independientes que
constituyen un menú principal.
Para acceder a cualquiera de las opciones del
sistema:
- 1.
- Pulsar la tecla que corresponde a la letra subrayada en el icono deseado.
- \bullet
-
\vtcortauna
Para cancelar la opción seleccionada, pulsar la
tecla "ESC" o usar el ratón para seleccionar "Volver" o
"Cancelar" para volver a la opción anterior o cancelar la
operación.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez ha finalizado la inicialización del
sistema, el programa mostrará el menú principal, que es el punto de
partida para todas las operaciones que pueden realizarse. La ventana
principal del menú está compuesta por tres paneles básicos:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \quad
- Salir: Se usa para detener la ejecución del programa en cualquier momento, siempre que no esté ejecutándose un procedimiento de medición ni una operación crítica. Se recomienda usar siempre esta opción. NO APAGAR EL ORDENADOR mientras que está ejecutándose el programa para evitar posibles conflictos informáticos.
- \quad
- SCR. S.: Permite al usuario activar, a su elección, el salvapantallas, cuando va a dejarse el instrumento en estado de espera para evitar daños en la pantalla que pueden producirse cuando se deja una imagen fija constantemente durante largos periodos de tiempo.
- \quad
- Nota: Esta opción se activará automáticamente si el sistema se deja inactivo durante un cierto tiempo. Para volver a la pantalla normal, mover el ratón o pulsar cualquier tecla.
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
El menú principal está integrado por un conjunto
de iconos que contienen dibujos relacionados con la operación que
se realiza cuando éstos se activan. Un triángulo negro que apunta
hacia la derecha en las opciones "URO y ATB" es un indicador
que notifica que tras activar uno de ellos se mostrará un submenú
con opciones adicionales.
Nueve iconos definen las opciones disponibles
dentro del menú principal, desde los que se controlan todas las
acciones del sistema. Éstos son:
- \quad
- URO: Activa el menú de iconos de urocultivo.
- \quad
- ATB: Activa el menú de iconos del antibiograma.
- \quad
- McFarland: Permite medir el contenido del vial en la unidad de calibración (escala McFarland).
- \quad
- Base de datos: Permite acceder a la base de datos de antibiogramas o urocultivos.
- \quad
- Opciones: Cambiar la configuración del sistema.
- \quad
- Información: Muestra información administrativa del sistema.
- \quad
- DIRAMIC: Ofrece la dirección de la producción del sistema.
- \quad
- Ayuda: Facilita información sobre la opción actual.
- \quad
- Salir: Abandonar el sistema.
- \quad
- Menú de Urocultivos
- \quad
- Uro: Menú de Urocultivos.
Tras seleccionar el icono URO del
menú principal, se proporcionará un submenú con un nuevo conjunto de
opciones para las mediciones de urocultivos. Dentro de este menú se
proporcionan las siguientes acciones.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Procedimiento para la lectura de los urocultivos. Tras activar esta opción, se visualiza una lista de los casos de urocultivo que están en espera para leerse, en la que se muestran el número de casos consecutivos, el tiempo que debe transcurrir entre lecturas y la fecha y la hora de la próxima lectura. Si la lista está vacía, no hay ningún caso pendiente.
- \quad
- Para seleccionar un caso específico de la lista, pulsar el botón izquierdo del ratón dos veces a una velocidad relativamente alta (o pulsar la barra espaciadora del teclado) mientras que se apunta al caso. Las selecciones aparecerán entonces con una marca a su lado y la mayoría de las operaciones se efectuarán solamente sobre los mismos.
- \quad
- La selección "LEER URO" proporcionará las siguientes opciones:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Mientras que se editan varios casos, la opción
"Siguiente" se hará disponible. Con esta opción se abandona la
edición del caso actual y la acción salta al siguiente caso. Si se
selecciona la opción "OK", se almacenarán los datos fijados y
se presentará automáticamente el siguiente caso para su edición.
Un campo marcado por un triángulo negro
apuntando hacia abajo indica que cuando se seleccione este campo,
aparecerá una lista editada previamente con el fin de seleccionar el
texto deseado. Es posible una búsqueda inteligente tecleando las
primeras letras de la palabra buscada. Este estilo de edición se usa
para estandarizar el texto correspondiente a campos importantes
evitando errores de ortografía que podrían confundir a un
procedimiento de "Buscar". En esta lista pueden borrarse,
modificarse o añadirse palabras, pero si se modifica un elemento de
texto de la lista, se modificará en consecuencia la base de datos
completa.
Para saltar de un campo a otro dentro del
procedimiento de edición, pulsar la tecla TAB o simplemente pulsar
el botón izquierdo del ratón sobre el campo deseado.
Si se seleccionan simultáneamente varios casos
para su edición, se hará disponible una opción "Siguiente".
Esta opción ignora los cambios realizados en el caso actual y salta
al siguiente. Por el contrario, si se selecciona la opción
"OK", se guardarán los datos actuales en la base de datos antes
de presentarse el siguiente caso para su edición.
- \bullet
-
\vtcortauna
- \quad
- Nota: Si el tiempo que se ha fijado es más corto que el tiempo que ya ha transcurrido, el sistema enviará un mensaje de error.
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \quad
- Los comandos disponibles dentro de esta opción son:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Genera un informe con los resultados de la
prueba de urocultivo. Este informe puede imprimirse.
\vskip1.000000\baselineskip
Permite la medición del crecimiento microbiano
en unidades McFarland según las normas de NCCLS, tomando como
referencia de crecimiento cero un medio de cultivo estéril no
inoculado. La lectura de salida se muestra en una escala gráfica y
un modo digital. La segunda cifra de los valores digitales debe
considerarse y entenderse solamente como una referencia de la
tendencia de la muestra. Adicionalmente, se proporciona también un
recuento de células aproximado, obtenido mediante cálculos
matemáticos según las normas de NCCLS.
Para realizar las mediciones, la superficie
exterior de los frascos usados en el calibrador debe estar limpia y
libre de rayones.
Con el fin de aumentar la precisión, los frascos
que se miden en el calibrador McFarland deben marcarse de un modo
tal que pueda repetirse fácilmente su posición cada vez que se lea
el frasco. La marca deber estar siempre visible para el
operador.
Dentro de esta ventana se encuentran disponibles
dos comandos:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Usando esta opción, es posible un estudio y una
impresión de los casos de urocultivo almacenados. Los datos
almacenados pueden modificarse también a elección del usuario. La
base de datos puede consultarse especificando el contenido de uno o
varios campos en una búsqueda.
En la parte superior de la ventana, se muestra
el número de caso de los datos actuales. También se notifican el
número total de casos en la base de datos (ejemplo: caso 1 de 100) y
el modo de visualización.
El modo de visualización se refiere al modo en
que se extraen los datos de la base de datos: si se usó la opción
"Examinar" se notificarán "Todos los casos", pero si se
ejecutó un procedimiento de búsqueda, se notificará "Buscar" y
solamente estarán disponibles los casos que coincidan con las
condiciones de búsqueda. El término "Ver" informa de si los
datos presentados corresponden a los "Datos generales" o a los
"Resultados" finales de la prueba.
Una vez se ha seleccionado "Base de datos",
estarán disponibles las siguientes opciones dentro de la
ventana:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Ahora se explican algunos de los criterios de
"Buscar" disponibles:
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Permite configurar las siguientes
posibilidades:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Elección del usuario de fijar la referencia 0 de
McFarland para mediciones del crecimiento microbiano. El
procedimiento se lleva a cabo usando un vial que contiene medio de
cultivo no inoculado.
\vskip1.000000\baselineskip
Permite configurar el número consecutivo para
los nuevos casos de urocultivo siempre que la configuración no
interfiera con un urocultivo existente no leído.
Esta opción se hace útil cuando se requiere
comenzar el recuento del urocultivo en un número diferente de 1,
por ejemplo, para comenzar desde 50, 100, etc.
Nota: El programa trata el número consecutivo
como el "consecutivo del día". Cuando se detecta un cambio de
fecha, el sistema, por defecto, fijará el número consecutivo a
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestra al usuario información sobre el sistema
y cada una de sus opciones y operaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Vuelve al MENÚ PRINCIPAL.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras seleccionar el icono ATB en el menú
principal, se proporcionará un submenú adicional con 12 operaciones
básicas requeridas para esta prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Permite la lectura de un antibiograma que
determinará el esquema de sensibilidad a antibióticos de un germen
dado.
Como primera etapa, el sistema comprobará
automáticamente si el sensor se ha aclarado y compensado y si la
bomba peristáltica está funcionado de manera apropiada. Este
procedimiento es transparente para el usuario si no se encuentran
problemas. Cualquier malfuncionamiento detectado se comunicará al
usuario.
Cuando va a ejecutarse el primer ATB de un día,
el sistema avanzará con el fin de compensar el punto de operación
electrónica del sensor de microflujo. Para cumplir este requisito,
un procedimiento paso a paso totalmente interactivo guiará al
operario a través del procedimiento.
Una vez se finaliza el ajuste, el sistema
enviará un informe con la "constante de compensación" que es un
valor numérico que se encontrará normalmente por debajo de 2,00.
Sin embargo, se aceptarán valores por encima de 2,00 pero menores
de 2,50 y se avisará al usuario sobre la conveniencia de instalar un
nuevo sensor.
En caso de cumplirse todos los requisitos
técnicos, se presentará un formulario de edición, en el que pueden
teclearse los datos generales del caso.
Se harán disponibles los siguientes campos:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Ahora se encuentran disponibles dos
comandos:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
El ciclo de lectura se ilustra en el siguiente
diagrama:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Mensaje: Insertar sensor + tono bajo => sensor dentro del pocillo + leer el resultado.
- \quad
- Mensaje: Retirar sensor + tono alto => retirar sensor del pocillo actual y saltar al siguiente pocillo.
Durante las mediciones, se encuentran
disponibles las siguientes acciones:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Cuando se ha leído el conjunto completo, se
mostrará una nueva ventana con los resultados del antibiograma, en
la que se clasifica la tolerancia del germen a cada antibiótico como
SENSIBLE, INTERMEDIA o RESISTENTE. Para cada
antibiótico sometido a prueba, se muestra en unidades el porcentaje
de inhibición. El algoritmo de normalización fijará en 1000
unidades el valor patrón del pocillo control negativo.
Se tendrán en cuenta tres parámetros
adicionales, el crecimiento mínimo permitido, el índice de
crecimiento y el factor de inhibición con el fin de clasificar los
resultados de los antibiogramas según tres posibilidades:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Vincula un urocultivo a un antibiograma. Esta
opción se usa cuando se realiza un antibiograma de una muestra de
orina positiva con el fin de recibir los datos del paciente. Para
seleccionar el caso al que se le va a realizar la prueba, solamente
se requieren el número consecutivo y la fecha de la prueba. Estos
casos se identifican entonces mediante la designación
URO-ATB y el correspondiente número consecutivo en
la base de datos de urocultivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Activa el calibrador McFarland para el control
del crecimiento microbiano.
\vskip1.000000\baselineskip
Permite presentar y procesar los datos
almacenados de los casos de antibiograma. El procedimiento es
similar al descrito en el "MENÚ DE UROCULTIVOS" (base de
datos).
\vskip1.000000\baselineskip
Las mismas que en el menú URO. Permite
configurar las siguientes posibilidades:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Permite al operador borrar, modificar o usar un
conjunto ya existente de antibióticos o crear uno nuevo. El esquema
de antibióticos definido por el cliente debe coincidir exactamente
con los discos de antibióticos existentes en la placa o tira.
Seleccionar la opción "Antibióticos", traerá las siguientes
posibilidades:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa este procedimiento para someter a prueba
el rendimiento del sensor. Se calculan parámetros estadísticos
tales como el valor medio, la desviación estándar y el coeficiente
de varianza de un conjunto de 16 muestras idénticas. Se almacenan
los resultados en una base de datos específica de la que pueden
recuperarse para visualización o impresión a elección del
usuario.
Para realizar esta prueba, se usa agua destilada
para cada una de las 16 mediciones.
Los valores esperados para estos parámetros
estadísticos son:
- 2000 < Valor medio: < 3000
- Desviación estándar < 20
- Coeficiente de varianza < 2,00
\vskip1.000000\baselineskip
Además de los procedimientos de limpieza
sistemáticos diarios indicados automáticamente por el programa del
sistema, puede llevarse a cabo un procedimiento de limpieza del
sensor a elección del usuario en el que la duración de cada etapa
puede programarse manualmente. El ciclo de limpieza completo está
compuesto por tres etapas
básicas.
básicas.
- 1)
- Se suministra una dilución de detergente biológico al sensor de flujo usando la bomba peristáltica.
- 2)
- Agua destilada sustituye al detergente biológico para aclarar el sensor.
- 3)
- Se deja pasar un periodo de tiempo con el fin de lavar el sistema completo.
\newpage
Ejecuta el procedimiento de calibración para el
sensor de microflujo. Con el fin de actualizar el rendimiento del
sistema, debe realizarse una calibración cada vez que se instale un
nuevo sensor o con la periodicidad indicada por el programa.
La calibración es un procedimiento por medio del
que se establece el nivel de respuesta de cada sensor a un
crecimiento bacteriano predeterminado (0,5 de McFarland). No es una
rutina diaria y se recomienda realizar la calibración cada una y
todas las veces que el programa recomiende esta acción con el fin de
mantener una sensibilidad y respuesta estandarizadas.
Para realizar la calibración, inocular un frasco
con Staphylococcus aureus con un índice de crecimiento de
0,5 de McFarland (C+) según el calibrador McFarland del sistema.
Usar un segundo frasco con medio de cultivo estéril con el fin de
obtener un índice 0 de McFarland (C-).
Seleccionar "calibrar" del menú ATB y
seguir el procedimiento interactivo con el fin de realizar tres
lecturas alternas de un (C+) seguido de un (C-).
El sistema calculará un valor medio para las
tres mediciones y se almacenará el resultado final tras seleccionar
"OK".
\vskip1.000000\baselineskip
Este procedimiento auxiliar ayuda al operador
mientras que comprueba la cantidad y estabilidad del flujo
proporcionado por la bomba peristáltica, puesto que una falta de
continuidad o un flujo incorrecto puede provocar errores durante
las mediciones.
Se comprueba el flujo usando una probeta
graduada de 10 mililitros y un recipiente con agua destilada.
Para realizar la comprobación, insertar ambos
extremos del tubo flexible en un recipiente lleno de agua destilada.
Seleccionar el comando "Avanzar", disponible dentro de la
opción "Comprobar el flujo" del menú ATB. El procedimiento
interactivo le guiará a través de todo el procedimiento. Una vez
finalizado, verificar que el flujo obtenido es aproximadamente de
2,4 ml/min.
Si no se alcanza el volumen esperado, comprobar
el tensor del casete y la tensión del tubo flexible de silicona
dentro del casete. Comprobar también las condiciones técnicas del
tubo flexible de silicona, especialmente de la sección dentro del
casete que está en contacto mecánico con los rodillos de la bomba.
Si el tubo flexible está extremadamente dañado o atascado, instalar
uno nuevo.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestra información sobre el sistema y cada
opción.
\vskip1.000000\baselineskip
Vuelve al menú principal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se analizó un total de 567 muestras de orina
para determinar la presencia de un número significativo de
uropatógenos, usando el sistema de la presente invención, y
apareando los resultados con los obtenidos mediante el procedimiento
de referencia CLED (procedimiento de placa de cultivo
semicuantitativo de Claridge). Según el análisis, 126 eran
positivas mediante CLED, mientras que 108 eran positivas usando el
presente sistema en sólo 4 horas, mientras que los resultados del
procedimiento CLED estuvieron listos tras 24-48
horas tras la inoculación del medio de cultivo. El presente sistema
era eficaz en un 86,1% para la detección de muestras positivas en
sólo 4 horas tras la inoculación de las muestras.
De 441 muestras que se encontró que eran
negativas mediante el procedimiento CLED, el presente sistema pudo
detectar 440 negativos en un periodo de 4 horas, para una eficacia
del 99,8%. La correlación general entre el presente sistema y el
procedimiento CLED tradicional era del 89,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
En total, se han investigado 1.016 muestras de
orina de una manera prospectiva. Se compararon los resultados
obtenidos con el sistema con el procedimiento de placa de cultivo
semicuantitativo de Claridge, usado como procedimiento de
referencia para la detección de bacteriuria. Para el cultivo de
rutina, se suministraron 0,0001 ml de orina a una placa de agar
CLED usando un asa de siembra desechable calibrada. Este
procedimiento detecta \geq 1000 unidades formadoras de
colonias/ml (ufc/ml).
Se realizaron lecturas de turbidez a las 2, 3, 4
y 5 horas tras la inoculación. En total, hubo 184 muestras
positivas (\geq0,4 unidades McFarland). La distribución del tiempo
y la correlación con el cultivo de rutina de estas muestras se
muestra en la tabla 1.
Por tanto, la sensibilidad global del presente
sistema era del 86,4%, y la especificidad (es decir, la capacidad
de detectar muestras realmente negativas tal como se define mediante
el cultivo de rutina) era del 98,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra el esquema integral del
equipo de la presente invención, en una visión general. Tal como se
muestra, este equipo se basa en un lector turbidimétrico de
microflujo (1), que se alimenta mediante una bomba (2) peristáltica
y se ajusta a un equipo (3) electrónico de alta sensibilidad que
detecta cambios turbidimétricos de (1) a través de un procedimiento
de medición que permite usar un grupo de algoritmos para detectar
pequeñas variaciones turbidimétricas y procesar de manera apropiada
los datos obtenidos. Está formado por un circuito (4) de medición
turbidimétrico conectado a través de una tarjeta de interfaz a una
unidad (5) de procesamiento central. Esta unidad recibe todos los
comandos (6) de teclado y proporciona los resultados en un monitor
(7). Puede detectar las variaciones más pequeñas de turbidez que se
producen en el medio de cultivo inoculado en la muestra que se
someterá a prueba.
La figura 2 representa un esquema detallado de
la estructura interna que pertenece al lector (1) turbidimétrico de
la figura 1. La pequeña boca (8) del lector se introduce en la
muestra que va a someterse a prueba que entonces se hace circular a
través del mismo con ayuda de la bomba (2) peristáltica de la figura
1. La cámara de medición está compuesta por un tubo (9) de plástico
introducido en un capilar (10) de vidrio. El paso (11) de luz es el
diámetro del orificio a través del que la luz procedente del
fotoemisor (12) debe cruzar para llegar a la cámara (9 y 10) de
medición. La intensidad de la radiación luminosa, transmitida a
través de la cámara (9 y 10) de medición, dependerá del grado de
turbidez de la muestra y se mide mediante un fotodetector (13). La
radiación producida por el fotoemisor (12) se estabiliza por medio
de un bucle electrónico de control automático convencional.
La figura 3 muestra el funcionamiento del lector
turbidimétrico a través de un diagrama de flujo. En primer lugar,
se verifica la presencia del lector turbidimétrico por medio de la
subrutina de detección y si está presente, se comprueba entonces la
existencia de la bomba peristáltica que es necesaria para el
funcionamiento del lector turbidimétrico y para la subrutina de
ejecución de la limpieza, estableciendo además el flujo de
funcionamiento requerido. Una vez se han regulado todos los
parámetros de funcionamiento, el lector turbidimétrico estará
listo. Cualquier subrutina que se infrinja impedirá que el lector
funcione.
La figura 4 muestra los componentes del kit de
diagnóstico, constituido por un vial que contiene medio de cultivo
y el polímero, el soporte de la tira y la tira usados para la
determinación del antibiograma de la muestra que va a someterse a
prueba.
La figura 5 muestra dos pantallas relacionadas
con el programa que sigue los procedimientos principales para la
ejecución del procedimiento objeto de la presente invención.
Pantalla de menú principal (5A):
Constituye el punto de partida para todas las operaciones que se
realizan cuando éstas se activan.
Nueve iconos definen las opciones disponibles
dentro del menú principal, desde los que se controlan todas las
acciones del sistema. Éstos son:
- \quad
- URO: Activa el menú de iconos de urocultivos.
- \quad
- ATB: Activa el menú de iconos del antibiograma.
- \quad
- McFarland: Permite medir el contenido del vial en la unidad de calibración (escala de McFarland).
- \quad
- Base de datos: Permite acceder a la base de datos de antibiogramas o urocultivos.
- \quad
- Opciones: Cambiar la configuración del sistema.
- \quad
- Información: Muestra información administrativa del sistema.
- \quad
- DIRAMIC: Ofrece la dirección de la producción del sistema.
- \quad
- Ayuda: Facilita información de la opción actual.
- \quad
- Salir: Abandonar el sistema.
Pantalla de menú de urocultivos (5B):
Representa un menú específico para el tratamiento particular de los
urocultivos, que contiene las operaciones que van a realizarse
durante estas pruebas, como representación de las opciones
principales facilitadas por el menú principal.
Claims (5)
1. Procedimiento para el diagnóstico microbiano
en orina, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- se inocula una alícuota de una muestra de orina obtenida directamente de su fuente en un vial de vidrio que contiene medio de cultivo, un polímero y sustratos MU-\beta-D-glucurónido y L-triptófano, ambos solubilizados en fosfato de potasio 50 mM, pH de 7 a 7,5,
- b)
- se determina la turbidez de dicho vial a tiempo = 0;
- c)
- se incuba el vial entre 2 y 6 horas a una temperatura entre 35ºC y 37ºC;
- d)
- se determina el índice de crecimiento entre tiempo 0 y el tiempo de incubación seleccionado y se discriminan las muestras positivas de las negativas dependiendo del aumento de la turbidez, siendo positivas aquellas muestras con aumentos superiores a 0,08 unidades McFarland, de las que se toman alícuotas para etapas adicionales;
- e)
- se toma una alícuota de una muestra positiva de la etapa d) y se transfiere a un nuevo vial de vidrio que contiene medio de cultivo recién preparado, que se dispensa en un volumen de 200 \mul en cada micropocillo de una tira no transparente que contiene dos posiciones libres para controles negativo y positivo, que se llenan con medio de cultivo solo y medio de cultivo inoculado respectivamente, y de 10 a 22 posiciones en las que se organizan discos de antibióticos, y se incuba entre 3 y 4 horas a una temperatura entre 35ºC y 37ºC;
- f)
- se lee la tira colocando un lector turbidimétrico de microflujo, que se alimenta mediante una bomba peristáltica, en cada micropocillo siguiendo las instrucciones emitidas por un paquete de programas informáticos para la adquisición y el procesamiento de datos y la creación de bases de datos diseñadas para ese fin, en el que el lector turbidimétrico de microflujo comprende un fotoemisor, un fotodetector y una cámara de medición, en el que dicha cámara de medición está compuesta por un tubo de plástico introducido en un capilar de vidrio, estando iluminada la cámara de medición mediante una luz emitida desde dicho fotoemisor y que pasa a través de dicha cámara de medición;
- g)
- a partir de los valores de densidad obtenidos, se calcula el índice de crecimiento en los controles, y se calculan los porcentajes de inhibición para cada muestra para cada antibiótico;
- h)
- según el nivel de inhibición mostrado por las muestras, se adjudican los criterios de sensible, resistente o intermedio, entre valores de inhibición en un intervalo del 60% al 100%, en el que las muestras con un porcentaje de inhibición inferior al 60% pueden considerarse resistentes, las que muestran valores entre el 60% y el 80% pueden considerarse sensibles en un nivel intermedio y las que se inhiben entre el 80% y el 100% se consideran sensibles al antibiótico sometido a prueba;
- i)
- se somete una alícuota tomada de la etapa d) a una fuente de luz U.V., con el fin de detectar la fluorescencia generada debido a la liberación de 4-metilumbeliferona, y el desarrollo de la formación de indol usando un reactivo de Kovacks modificado, constituido por 2 g de paradimetilaminobenzaldehído diluido en etanol y 20 ml de ácido clorhídrico concentrado, para la detección de la actividad enzimática MU-beta-D-glucuronidasa y triptofanasa producida por E. coli;
- j)
- para aquellas muestras en las que no se identificó E. coli en la etapa i), se somete la alícuota anteriormente obtenida en la etapa d) al procedimiento de aislamiento e identificación tradicional.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el medio de cultivo es caldo
Mueller-Hinton OXOID modificado.
3. Equipo adecuado para llevar a cabo la
determinación del antibiograma en las etapas f) a h) del
procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 que comprende:
- (1)
- un lector turbidimétrico de microflujo (1) que comprende un fotoemisor (12), un fotodetector (13) y una cámara (9 y 10) de medición, en el que dicha cámara de medición está compuesta por un tubo (9) de plástico introducido en un capilar (10) de vidrio, estando iluminada la cámara de medición mediante una luz emitida desde dicho fotoemisor y que pasa a través de dicha cámara de medición;
- (2)
- una tira no transparente que contiene micropocillos;
- (3)
- una bomba (2) peristáltica para hacer circular una muestra a través de la cámara de medición del lector turbidimétrico de microflujo; y un ordenador (5) que tiene un paquete de programas para la adquisición y el procesamiento de datos y la creación de bases de datos;
en el
que
el lector turbidimétrico de microflujo está
conectado al ordenador mediante una tarjeta de interfaz y
dicho lector turbidimétrico de microflujo
incluye una parte (8) de boca adecuada para la introducción en una
muestra en un micropocillo de la tira no transparente que va a
someterse a prueba haciendo circular una muestra a través de dicha
cámara de medición mediante la acción de dicha bomba
peristáltica.
4. El equipo según la reivindicación 3, en el
que las tiras no transparentes incluyen dos posiciones libres para
controles positivo y negativo, y también otras de 10 a 22 posiciones
en las que pueden colocarse discos de antibióticos según la opción
del usuario.
5. El equipo según la reivindicación 4, en el
que las tiras no transparentes incluyen discos de antibióticos.
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| CU48/97 | 1997-04-29 | ||
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| CU1997065 | 1997-06-06 | ||
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| EP (1) | EP0976821B1 (es) |
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