ES2322782T3 - Analisis espectroscopico de muestras con turbidez y alta absorbancia. - Google Patents

Analisis espectroscopico de muestras con turbidez y alta absorbancia. Download PDF

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Abstract

Un método para determinar estimaciones de la concentración de uno o más componentes de una muestra de sangre utilizando análisis espectroscópicos que comprende las etapas de: estimar una matriz de vectores que representa los espectros de absorción de los componentes individuales de dicha muestra de componentes múltiples y de los vectores que representan otros efectos; estimar las concentraciones de uno o más componentes de dicha muestra de componentes múltiples; usar las concentraciones de los componentes estimadas para refinar mejor uno de los vectores que representan otros efectos; y repetir el proceso hasta que un estimativo satisfactorio de las concentraciones de los componentes sea obtenido; Caracterizado porque: Dicho uno de los vectores que representa otros efectos representa una contribución no lineal y comprende el cuadrado de la absorbancia estimada para una muestra no turbia de dicha muestra de sangre.

Description

Análisis espectroscópico de muestras con turbidez y alta absorbancia.
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad bajo 35 U.S.C. \NAK 119(e) a la solicitud provisional de patente número de serie 60/060,018, presentada el 25 de Septiembre de 1997; cuya descripción se incorpora aquí como referencia.
Declaraciones relacionadas con la investigación o desarrollo patrocinadas federalmente
No es aplicable
Antecedentes de la invención
La estimación de las concentraciones de uno o más componentes de una muestra de componentes múltiples se lleva a cabo típicamente mediante análisis espectroscópico. Generalmente, la presencia de otros componentes dentro de una muestra hace difícil determinar la concentración de un componente simple dentro de una muestra a partir de una medición simple. Se requieren mediciones múltiples, y se usa una técnica multivariada para determinar la concentración de un componente específico a partir de las mediciones. Pueden hacerse ciertas suposiciones acerca de un espectro de medición de muestra. Cada componente de una muestra de componentes múltiples tiene un espectro de absorción individual, y el espectro de absorbancia de la muestra de componentes múltiples puede ser asumido como la combinación lineal de los espectros de absorbancia de cada componente de la muestra de componentes múltiples. Además, el espectro de absorbancia de cada componente de la muestra de componentes múltiples es linealmente proporcional a la concentración del componente dentro de la muestra de componentes múltiples.
El análisis de la absorbancia en muestras turbias y no homogéneas ha mostrado ser difícil, y es complicado adicionalmente si la muestra tiene alta absorbancia. Una fuente de radiación provee radiación, típicamente luz, a través de la muestra, con un detector que detecta la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra. Para muestras turbias y/o de alta absorbancia, una parte de la luz provista es dispersada, y puede no ser detectada por el detector. Además la luz dispersa detectada puede haber atravesado la muestra mediante alguna vía de circulación, dando lugar a múltiples longitudes de paso. Todos estos efectos causados por la dispersión llevan a lecturas erróneas de los factores de absorbancia de las muestras que están siendo analizadas. Adicionalmente, algunas muestras turbias pueden consistir de espacios interparticulares relativamente grandes donde no se presenta absorbancia, permitiendo así que pase alguna luz a través de ella sin ser disminuida. Esto también puede traducirse en lecturas erróneas de los factores de absorbancia de la muestra. Un ejemplo particular de esto se presenta en el análisis de sangre entera para
hemoglobina.
Tradicionalmente, cuando se analiza sangre entera para hemoglobina, la sangre debe ser reacondicionada para eliminar la turbidez y deben hacerse ajustes para asegurar que la medición toma lugar dentro del rango óptimo de absorbancia del instrumento de análisis. La turbidez de la sangre se reduce o elimina perturbando los glóbulos rojos en la muestra con el fin de liberar la hemoglobina. La absorbancia es ajustada por dilución de la sangre o por una escogencia apropiada de las dimensiones de la celda de muestra.
Intentos anteriores para llevar a cabo el análisis de muestras turbias y/o de alta absorbancia han incluido la utilización de aparatos especializados que recojan la luz dispersa así como la luz transmitida directamente. Otros han utilizado una esfera integrada para llevar a cabo la recolección de la luz dispersa y de la luz directamente transmitida. Un intento adicional utilizó únicamente longitudes de onda monocromáticas preseleccionadas escogidas para una aplicación particular. Sería deseable llevar a cabo análisis de muestras turbias y/o de alta absorbancia sin tener que pre acondicionar la muestra y sin tener que utilizar dispositivos de recolección de luz especializados.
La WO-A-9408237 se relaciona con mediciones espectrofotométricas en sangre entera donde se hacen correcciones para los efectos de dispersión de la luz. Aquí se emplean n longitudes de onda de medición para medir los componentes constituyentes k, proporcionando las ecuaciones extra n-k medios por los cuales los factores de dispersión n-k pueden ser compensados. Se consideran los factores específicos y no específicos de dispersión de la luz y los factores de dispersión para cada uno de estos factores son descritos como funciones lineales de las concentraciones de las especies de hemoglobina presentes. En EP-A-0210417, las concentraciones de los componentes de la sangre son determinadas sobre la base de coeficientes predeterminados que representan las características de absorción de luz de cada componente sanguíneo y las longitudes de onda de medición. Los errores debidos a la turbidez son compensados tratándolos de una manera análoga a los componentes de la sangre, utilizando coeficientes predeterminados para representar la absorción característica de la turbidez a cada una de las longitudes de onda de medición. Se determina una "concentración" de la turbidez y se usa sucesivamente para la compensación.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un método para determinar estimativos de la concentración de uno o más componentes de una muestra de sangre de acuerdo con la reivindicación 1.
El análisis utiliza la información de factores múltiples que afectan la transmitancia o la absorbancia de la luz a través de la muestra. Estos factores incluyen: absorbancia tal como se mide en una muestra no turbia, pérdidas por dispersión debidas a partículas y limitaciones del dispositivo de medición tal como se mide en una muestra no absorbente, pérdidas por dispersión adicionales debidas a absorbancia de la muestra, efectos de longitud de paso variable debidos a la muestra (dispersión, burbujas, obstrucciones y similares), efectos variables de la longitud de paso debidos a los dispositivos de medición, y efectos no lineales adicionales.
Teniendo en cuenta los factores adicionales que afectan la transmitancia o la absorbancia, se alcanza un análisis más exacto.
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Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
La invención será entendida más completamente a partir de la descripción detallada siguiente tomada en conjunto con los dibujos acompañantes en los cuales:
La Fig. 1 es un gráfico de un espectro de absorbancia de una muestra normal y de una muestra obstruida;
La Fig. 2 es un diagrama de flujo del método presente descrito para determinar el análisis de las muestras;
La Fig. 3 es un diagrama de flujo del método presente descrito para determinar un vector residual para determinación del análisis de las muestras;
La Fig. 4 es un diagrama de bloques de un espectrómetro de la presente invención.
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Descripción detallada de la invención
El análisis del espectro de absorbancia de una muestra que es turbia y/o tiene alta absorbancia puede ser llevado a cabo usando equipos espectroscópicos convencionales. El análisis del espectro de absorción de una muestra es descrito en términos de absorbancia, en oposición a la transmitancia. La absorbancia se define como la capacidad de una capa de una sustancia para absorber radiación, mientras que la transmitancia para los propósitos de esta solicitud se define como la fracción de energía radiante que habiendo entrado a una capa de material absorbente alcanza su frontera más lejana. La relación entre absorbancia y transmitancia está definida por la ecuación:
a = -ln t
donde:
a es la absorbancia, y
t es la transmitancia
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El espectro medido de una muestra ideal puede ser descrito como:
a = E * c
donde:
a es el vector de columna que de0nota la absorbancia a longitudes de onda particulares,
E es una matriz de vectores de columna, denotando cada uno el espectro de un componente o factor a una longitud de onda particular, y
c es un vector de columna que describe las concentraciones particulares de los componentes o factores, los cuales pueden incluir términos de dispersión.
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Se presentan dificultades cuando se intenta medir muestras que son no lineales, tales como muestras que son no homogéneas o cuando la dispersión o la configuración del instrumento hacen que el paso de luz a través de la muestra tenga múltiples longitudes de paso. El promedio de la transmitancia a lo largo de los múltiples caminos de paso no se traduce en un promedio de las absorbancias, debido a la relación no lineal entre transmitancia y absorbancia, como se describió más arriba. En vez de ello, el promedio de la transmitancia en este caso puede estar caracterizado por una función no lineal de absorbancia, tal como cosh(\alpha), el cual puede ser incluido entonces en el análisis tratando el término no lineal como un componente adicional. Por ejemplo el cuadrado de la absorbancia es una excelente aproximación para este término no lineal. Para términos no lineales el espectro viene a ser:
a = E_{nl} * c_{nl}
donde:
E_{nl} = [E | f(a)]
c_{nl} = [c/c f(a)]
donde f(a) es el término (s) no lineal, y donde cf_{(a)} es la concentración asociada con el término no lineal(es).
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En una muestra específica, el uso de un componente no lineal para detectar y corregir la no homogeneidad de la muestra o los efectos del instrumento por células lisadas es mostrado. En este ejemplo, las obstrucciones de la cámara de la muestra producen una zona de medición no homogénea que interfiere con las mediciones ópticas normales. La naturaleza de muchas de estas obstrucciones es crear una zona en la cual se excluye la sangre. Esta exclusión se traduce en transmitancia óptica más alta para esa área. Un ejemplo de las dos muestras secuenciales de la misma muestra de sangre lisada se muestra en la Fig. 1. La muestra con la absorbancia más alta normalmente da el espectro esperado, según lo indica la forma de onda marcada como "normal". La muestra con la obstrucción tiene una absorbancia anormalmente baja, como se muestra en la forma de onda marcada como "Obstruida". La diferencia entre estos espectros es mostrada como la línea punteada marcada como "Diferencia". La diferencia es modelada por el cuadrado de la absorbancia normal multiplicado por una constante negativa marcada como "Normal^{2}" que casi exactamente se superpone con la forma de onda "Diferencia".
Las fracciones y los niveles de tHb predichos por un método conocido se muestran más abajo en la Tabla 1. Nótese que el nivel de tHb cae y que las fracciones cambian dramáticamente.
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TABLA 1 Método Previo
1
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Las fracciones y los niveles de tHb predichos para las mismas dos muestras utilizando el método presentemente descrito se muestran más abajo en la Tabla 2. En este caso el cambio en tHb es menor de 0.3 g/dL y el peor caso de cambio de fracción es sólo de aproximadamente 2%. Debe notarse que el estimado Lisado^{2} es un valor negativo relativamente grande para la muestra obstruida en comparación con la muestra normal. El valor negativo grande es típico para la mayoría de las obstrucciones, aunque algunas obstrucciones pueden causar valores positivos.
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TABLA 2 Método Descrito en la Presente
2
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El presente método opera primero estimando las fracciones (se asume 100% de O2Hb) y luego se utiliza el cuadrado de este espectro como un componente adicional en el análisis de mínimos cuadrados. El cuadrado del nuevo espectro estimado (con base en los factores resultantes obtenidos en la estimación de mínimos cuadrados) es incorporado entonces y el proceso es repetido en ese momento hasta que los valores de la fracción converjan. Típicamente solo se requieren dos o tres repeticiones si el primer estimativo es bueno.
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El proceso de convergencia es ilustrado más abajo con la Tabla 3 utilizando la muestra obstruida como un ejemplo.
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TABLA 3 Convergencia del Método Descrito en la Presente con una Muestra Obstruida
3
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La definición del término Lisado^{2} se ilustra como sigue. Cuando la muestra es no homogénea o cuando el paso de luz a través de una muestra no tiene un valor sencillo, tal como sucede cuando la luz es altamente divergente o convergente, o cuando la muestra incluye burbujas u otras obstrucciones, la transmitancia es definida como el promedio de las transmitancias de todos los rayos de luz. La absorbancia, como se describió anteriormente, es el logaritmo negativo de la transmitancia. Por simplicidad y sin pérdida de generalidad, se consideran solamente dos de tales rayos de luz que atraviesan la muestra con diferentes longitudes de paso. Las absorbancias de los dos rayos pueden ser escritas como \alpha + \delta y \alpha - \delta respectivamente, donde 2\delta representa la diferencia de absorbancia entre los dos caminos tomados por los rayos. La absorbancia total medida es dada entonces por
Abs = -ln (e^{-\alpha+\delta} + e^{-\alpha-\delta})/2 [WSGH1]
Esta expresión puede ser simplificada removiendo el factor común e^{-\alpha}
Abs = -ln e^{-\alpha} -ln (e^{+\delta} + e^{-\delta})/2
Simplificando adicionalmente la expresión y reconociendo que el segundo término contiene el coseno hiperbólico:
Abs = \alpha -ln [cosh \delta]
El logaritmo natural y el coseno hiperbólico pueden ser expandidos en una serie como sigue:
cosh \delta = 1 + \delta^{2}/2! + \delta^{4}/4! + ...
ln 1+x = x - x^{2}/2 + x^{3}/3 - ...
Utilizando estas expansiones en la expresión para absorbancia da:
Abs = \alpha - \delta^{2}/2 (1 + \delta^{2}/12 + \delta^{4}/360 + ...) + \delta^{4}/8 (1 + \delta^{2}/12 + \delta^{4}/360 + ...)^{2} + ...
Para valores razonablemente pequeños de la expresión \delta de más arriba puede simplificarse a:
Abs = \alpha - \delta^{2}/2
Utilizando la suposición de que la desviación \delta de la absorbancia promedio \alpha es típicamente proporcional a \alpha, la anterior expresión se convierte en:
Abs = \alpha - k * \alpha^{2}
Donde k es una constante de proporcionalidad.
Debe notarse que esta expresión está en la forma de la aproximación utilizada para el modelo de la absorbancia \alpha medida. La constante k es determinada durante el análisis de mínimos cuadrados. Aunque el proceso tiene un término no lineal \alpha^{2}, el método presente utiliza un proceso de mínimos cuadrados lineales repetitivo en el cual el término no lineal es tratado como un término lineal adicional el cual es fijado por la etapa de repetición. También debe notarse que términos de orden más alto en la expansión anterior pueden ser incluidos en el análisis descrito aquí según sea necesario.
El método descrito en la presente se muestra de manera general en la Fig. 2. El método incluye una primera etapa 20 en la cual se establece una matriz de vectores de columna. Cada vector de columna de la matriz denota un espectro de un componente de la muestra a longitudes de onda particulares e incluye adicionalmente un término no lineal como parte de la matriz de vectores de columna. El término no lineal tiene en cuenta los efectos de la absorbancia según se mide en una muestra no turbia, con pérdidas de dispersión debidas a partículas y limitaciones de los aparatos de medición, pérdidas por dispersión adicionales debidas a la absorbancia, efectos del camino de paso variable debidos a la muestra, efectos del camino de paso variable debidos a los aparatos de medición y efectos no lineales
adicionales.
En la siguiente etapa 30 un vector de columna de componentes múltiples que denota la absorbancia de la muestra de componentes múltiples a longitudes de ondas particulares es establecido.
En la etapa 40 se determina un vector de columna que denota las concentraciones estimadas de uno o más componentes, dividiendo por ejemplo la matriz de los vectores de columna por el primer vector de columna. El segundo vector de columna resultante de concentraciones estimadas es más exacto que los métodos de la técnica anterior puesto que el efecto de los factores no lineales ha sido integrado en la determinación de la matriz de vectores de columna a partir de la cual se determina el segundo vector de columna.
En ciertos casos los efectos del instrumento o la muestra son difíciles de determinar simplemente mediante un análisis a priori. Por ejemplo, las variaciones en el índice de refracción de la muestra, también conocidas como dispersión anómala, causan una dispersión que varía con la concentración de los componentes de la muestra. Esta dispersión puede ser caracterizada por un método que incorpora información conocida acerca de la muestra mediante un método híbrido de análisis. Los componentes no conocidos de la muestra o los efectos del instrumento también pueden ser considerados utilizando este método.
Los espectros de absorbancia de una muestra (tal como se miden en una muestra no turbia) pueden ser estimados utilizando métodos de referencia para determinar las concentraciones de los componentes de la muestra y combinar esta información con espectros de absorbancia conocidos de los componentes tal como lo muestra:
a_{ref} \approx E * c_{ref}
donde:
a_{ref} es la absorbancia estimada,
E es una matriz de vectores de columna, cada uno denotando el espectro de un componente o factor en una longitud de onda particular, y
c_{ref} es la concentración estimada a partir de los métodos de referencia.
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El espectro de absorbancia estimado es combinado con otros espectros estimados de componentes conocidos con concentraciones desconocidas (por ejemplo dispersión y/o el cuadrado de la absorbancia (y los espectros combinados usados para aproximar la absorbancia medida utilizando técnicas conocidas tales como la Estimación por Mínimos Cuadrados (LSE).
c_{ensayo}\approx (E'_{ensayo} * E_{ensayo})^{-1} * E'_{ensayo}. a_{medido}
donde:
E_{ensayo} es la matriz de espectros combinada, y
c_{ensayo} es el vector de concentraciones estimadas.
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La diferencia o residual entre el espectro estimado y el espectro medido es la aproximación del componente no conocido(s). Esta diferencia entre el espectro estimado y el espectro medido se utiliza como un vector o vectores en el análisis de muestras futuras. Técnicas tales como Mínimos Cuadrados Parciales (PLS), Componentes de Regresión Principales (PCR) y Mínimos Cuadrados Clásicos (CLS) pueden ser utilizados para determinar los vectores a partir de los espectros residuales. Se usa entonces CLS para obtener las concentraciones de los vectores en una muestra. Si solamente se conoce un componente sencillo, entonces el vector para ese componente sencillo puede ser determinado a través de técnicas de regresión de PLS o de Análisis de Componentes Principales (PCA) seguido por la prueba de regresión.
r_{exp} \approx E_{ensayo} * c_{ensayo} - a_{medido}
donde r_{rxp} es el espectro residual.
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El análisis utilizando un vector residual simple se muestra por:
c_{nuevo} \approx (E'_{nuevo} * E_{nuevo})^{-1} * E'_{nuevo} * a_{medido}
donde:
E_{nuevo} \equiv [E | v_{res}]
v_{res} es (son) el vector(es) a partir del término residual(es), y c_{nuevo} es el vector de las concentraciones estimadas.
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Con referencia ahora a la Fig. 3, se muestra un diagrama de flujo del método 50 para determinar un vector residual para un componente desconocido de una muestra o su efecto. En la primera etapa 60 se lleva a cabo una determinación de una primera matriz para una primera columna de vectores de absorbancias a longitudes de onda particulares. En la siguiente etapa 70 se determina una segunda matriz combinando la primera matriz con un espectro estimado para una concentración desconocida o efecto. A continuación, en la etapa 80, se determina una tercera matriz que representa un espectro de absorbancia medido para la muestra. En la etapa 90 se determina un vector residual a partir de la segunda matriz y la tercera matriz. El vector residual es utilizado entonces como parte de la determinación de las concentraciones en la muestra en muestras medidas más adelante.
Un ejemplo específico de esto está en la medición de hemoglobina en sangre lisada. Los vectores utilizados en el análisis son típicamente los principales componentes de hemoglobina de interés (por ejemplo O2Hb, Hhb, COHb, MetHb), componentes de hemoglobina de menor interés (SulfHb and CNMetHb), y un término para la dispersión o la interferencia. Este análisis por métodos anteriores ha demostrado ser inadecuado para la medición exacta de la hemoglobina en sangre entera.
Una ley de potencia de la longitud de onda puede aproximarse a las pérdidas debidas a la dispersión por partículas simples. Puesto que la forma espectral de la dispersión simple así como su magnitud varía con los componentes y química de la sangre, se requieren parámetros múltiples para una caracterización adecuada.
Los efectos adicionales de la medición deben ser incluidos para mediciones exactas. Como se estableció anteriormente, la hemoglobina se concentra en los glóbulos rojos y los cortos caminos de paso requeridos para mediciones ópticas razonables se traducen en sólo un pequeño número de células medidas por la luz. Este pequeño número lleva a resultados que tienen variaciones significativas en el número de células a través de las mediciones. Estas variaciones se traducen en variaciones de absorbancia no lineales. Como se describió más arriba estas variaciones pueden ser aproximadas por el cuadrado de la absorbancia. El cuadrado de la absorbancia de la sangre lisada se traduce en mejores estimativos que el cuadrado de la absorbancia medida.
Puesto que la hemoglobina es un absorbente fuerte, su absorbancia causa variaciones en el índice de refracción de los glóbulos rojos. La variación en el índice de refracción se traduce en una dispersión adicional que no es bien caracterizada por una dispersión de partícula simple. Puesto que cada componente de la hemoglobina tiene un espectro único, la dispersión causada por la absorbancia depende de la composición de hemoglobina de la sangre entera. En el método descrito en la presente, esta dispersión total de hemoglobina es tratada como una combinación lineal de la dispersión de hemoglobina de los diferentes componentes de hemoglobina,
En un ejemplo adicional, se muestra un análisis de hemoglobina en sangre entera.
La primera etapa es para determinar los vectores que representan la dispersión de hemoglobina.
r_{exp} \approx E_{ensayo} * c_{ensayo} - a_{medido}
Los valores de referencia para las muestras son utilizados entonces para determinar los vectores residuales individuales mediante lo siguiente:
v_{res} \approx R_{exp} * c'_{ref} * (c_{ref} * c'_{ref})^{-1}
Con referencia ahora a la Fig. 4 se muestra un aparato de medición 100 para llevar a cabo análisis espectroscópicos para determinar concentraciones estimadas de uno o más componentes de una muestra de componentes múltiples. El aparato de medición 100 comprende una fuente de excitación 110 que provee una señal de excitación a una cámara de muestra 120. La cámara de muestra 120 incluye una muestra de componentes múltiples dentro de sí. Un detector 130 recibe la señal de excitación que puede ser modificada por la muestra dentro de la cámara de muestra 120. El elemento de procesamiento 140 está acoplado a, o puede ser integrado con, el detector 130 y determina las concentraciones de los componentes de la muestra de componentes múltiples. Esta determinación incluye el método descrito más arriba en que los efectos no lineales son tomados en cuenta como parte de la determinación y proporciona así una estimación más exacta de la concentración del componente de una muestra de componentes múltiples.
Como se muestra más arriba el método y el aparato descritos en la presente proporcionan un análisis más exacto de muestras que tienen turbidez y/o alta absorbancia teniendo en cuenta el efecto de los parámetros no lineales sobre la medición. El término no lineal es incorporado en el análisis mutivariado que resulta en una exactitud incrementada del análisis.
Habiendo descritos las modalidades preferidas de la invención será ahora más evidente para los de experiencia ordinaria en la técnica que pueden hacerse varias modificaciones a la invención descrita en la presente. Se considera entonces que la invención no debe ser limitada a las modalidades descritas, sino únicamente por el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (2)

1. Un método para determinar estimaciones de la concentración de uno o más componentes de una muestra de sangre utilizando análisis espectroscópicos que comprende las etapas de:
estimar una matriz de vectores que representa los espectros de absorción de los componentes individuales de dicha muestra de componentes múltiples y de los vectores que representan otros efectos;
estimar las concentraciones de uno o más componentes de dicha muestra de componentes múltiples;
usar las concentraciones de los componentes estimadas para refinar mejor uno de los vectores que representan otros efectos; y
repetir el proceso hasta que un estimativo satisfactorio de las concentraciones de los componentes sea obtenido;
Caracterizado porque:
Dicho uno de los vectores que representa otros efectos representa una contribución no lineal y comprende el cuadrado de la absorbancia estimada para una muestra no turbia de dicha muestra de sangre.
2. El método de la reivindicación 1 donde dicha muestra de sangre comprende sangre lisada.
ES98944143T 1997-09-25 1998-09-24 Analisis espectroscopico de muestras con turbidez y alta absorbancia. Expired - Lifetime ES2322782T3 (es)

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