ES2322784T3 - Transformacion de hierba para cesped mediada por agrobacterium. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción de una planta de hierba para césped transgénica, que comprende las etapas de: a) proporcionar tejido calloso regenerable a partir de la planta de hierba para césped; b) inocular el tejido con Agrobacterium que transporta por lo menos un vector para la transformación, comprendiendo el vector una región de virulencia de un plásmido Ti de una cepa de A. tumefaciens que confiere a la cepa una virulencia tan fuerte como la expresada por la cepa 281 de A. tumefaciens, en cuyo vector se inserta una construcción de ADN heterólogo unido operativamente a un promotor de una especie de monocotiledónea, y un gen de marcador seleccionable que confiere resistencia a antibiótico a células transformadas unidas operativamente a un promotor de una especie monocotiledónea; (c) cultivar el tejido inoculado en condiciones que permiten que el vector de Agrobacterium transforme las células del tejido; (d) cultivar selectivamente el tejido inoculado en un medio de selección que comprende el antibiótico; y (e) regenerar una planta de hierba para césped transformada a partir del tejido cultivado de manera selectiva.
Description
Transformación de hierba para césped mediada por
Agrobacterium.
La presente invención se refiere al campo de los
procedimientos de transformación de plantas. Más específicamente,
se proporciona un procedimiento mediado por Agrobacterium
para transformar hierbas para césped, así como hierbas para césped
transgénicas producidas mediante el procedimiento.
Las hierbas para césped y el cultivo de hierbas
para césped tiene una importancia económica significativa mundial.
En los últimos años, han aumentado los programas de cultivo
tradicional mediante técnicas de biología molecular y recombinante.
Sin embargo, de manera similar a la mayoría de plantas
monocotiledóneas, las hierbas de césped han demostrado ser
recalcitrantes a los procesos de cultivo, transformación y
regeneración de tejido. Entre éstos, hasta ahora no se ha realizado
la transformación mediada por Agrobacterium de hierba para
césped.
La transformación de hierba para césped se ha
conseguido utilizando métodos directos de transferencia de ADN,
incluyendo la transformación de protoplastos y el bombardeo de
partículas. No obstante, la transformación mediada por
Agrobacterium ofrece diversas ventajas sobre el bombardeo de
partículas u otro medio de transferencia génica directa. Éstas
incluyen la integración de transgenes estables sin redisposición del
ADN huésped o ADN del transgén; integración preferencial del
transgén en regiones transcripcionalmente activas del genoma;
capacidad de transferir grandes piezas de ADN; e integración de
bajas cantidades de copias de genes en ADN nuclear de planta que es
particularmente importante para minimizar la cosupresión posible del
transgén en generaciones posteriores.
Hasta hace poco, se creía que la transformación
mediada por Agrobacterium se limitaba a plantas
dicotiledóneas. Sin embargo, Hiei et al. en 1994, describían
la transformación eficaz de arroz por Agrobacterium, y
posteriormente, ha habido informes convincentes para maíz, cebada y
trigo (Ishida et al., 1996; Tingay et al., 1997;
Cheng et al., 1997; véase también Patente de Estados Unidos
No. 5,591,616 para Hiei et al). Numerosos factores son de
crítica importancia en la transformación de monocotiledóneas,
incluyendo el tipo y la fase del tejido que está infectado, el
vector y las cepas bacterianas utilizadas, genotipo de la planta,
condiciones de cultivo de tejido, y el proceso de infección real.
Como resultado, los procedimientos que han demostrado ser
satisfactorios para la transformación mediada por
Agrobacterium de algunas monocotiledóneas, tales como arroz
y maíz, no han tenido éxito para la transformación de hierba para
césped.
Un objetivo de la presente invención es
desarrollar un sistema de transformación eficaz y fiable para la
hierba de césped mediada por Agrobacterium tumefaciens. Otro
objetivo de la presente invención es regenerar plantas transgénicas
que contienen uno o más genes exógenos introducidos mediante la
transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.
Según los objetivos de la presente invención, se
proporciona un sistema de transformación mediada por
Agrobacterium para la hierba de césped, que es eficaz y
fiable. La presente invención también proporciona el desarrollo de
plantas transgénicas que contienen uno o más transgenes de utilidad
práctica importante.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un procedimiento de producción de una planta de hierba
para césped transgénica. El procedimiento comprende: (a)
proporcionar tejido callosos regenerable de la planta de hierba
para césped; (b) inocular el tejido con Agrobacterium que
transporta por lo menos un vector para la transformación,
comprendiendo el vector genes de virulencia que confieren una fuerte
infectividad al Agrobacterium, en cuyo vector se inserta una
construcción de ADN heterólogo unido operativamente a un promotor
de una especie de monocotiledónea, y un gen de marcador
seleccionable que confiere resistencia a antibiótico a células
transformadas unidas operativamente a un promotor de una especie
monocotiledónea; (c) cultivar el tejido inoculado en condiciones
que permiten que el vector de Agrobacterium transforme las
células del tejido; (d) cultivar selectivamente el tejido inoculado
en un medio de selección que comprende el antibiótico; y (e)
regenerar una planta de hierba para césped transformada a partir del
tejido cultivado de manera selectiva.
Preferiblemente, la hierba para césped es una
especie seleccionada del grupo que consiste en agrostis
palustris, festuca arundinacea, agrostis canina, lilium perenne,
festuca longifolia, festuca rubra fallax, festuca rubra secunda,
agrostis capillaris y poa pratensis. En otra realización
preferida, el Agrobacterium comprende un sistema de vectores
binarios y los genes de virulencia en el mismo se obtienen de un
plásmido de la cepa 281 de Agrobacterium tumefaciens. El
promotor se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en
promotores del gen de ubiquitina del maíz, promotores del gen de
actina de arroz, promotores del gen de Adh 1 del maíz, promotores
del gen de tubulina de arroz o maíz (Tub A, B o C) y promotores del
gen de alfalfa His 3. El gen de marcador seleccionable
confiere preferiblemente resistencia a higromicina en el tejido
transformado. El callo utilizado para la transformación se obtiene
preferiblemente mediante el cultivo de semillas de las hierbas para
césped en un medio desdiferenciación.
Según otro aspecto de la presente invención
también se proporciona una planta de hierba para césped transgénica
preparada mediante el procedimiento anterior, de manera que la
planta de hierba para césped transgénica comprenda un transgén y un
gen de marcador seleccionable que confiere resistencia a antibiótico
integrados de manera estable en el genoma entre las secuencias de
los límites del ADN de transferencia, donde dicho transgén y dicho
gen de marcador seleccionable están unidos operativamente a un
promotor de una especie de monocotiledónea. También se proporcionan
las semillas de la planta transgénica. En realizaciones preferidas,
la planta de hierba para césped transgénica comprende un transgén
seleccionado del grupo que consiste en genes que codifican glucosa
oxidasa, citrato sintasa, \Delta-9 desaturasa de
Saccharomyces cerevisiae o Cryptococcus curvatus,
\Delta-11 desaturasa, un homólogo de planta
de la NADPH oxidasa de neutrófilo, una bacteriopsina de Halobacterium halobium, o proteína antiviral de fitolaca.
de la NADPH oxidasa de neutrófilo, una bacteriopsina de Halobacterium halobium, o proteína antiviral de fitolaca.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un vector superbinario para la transformación mediada
por Agrobacterium de hierba para césped. El vector comprende:
(a) una región de virulencia de un plásmido Ti de una cepa de A.
tumefaciens que confiere a la cepa una virulencia tan fuerte
como la expresada por la cepa 281 de A. tumefaciens; (b) un
gen de marcador seleccionable unido operativamente a un promotor
obtenido de un gen de una planta monocotiledónea; y (c) un sitio
para la inserción de por lo menos una secuencia codificante
adicional, unido operativamente a un promotor obtenido de un gen de
una planta monocotiledónea, siendo el promotor el mismo o diferente
del promotor unido operativamente al gen de marcador seleccionable.
En realizaciones preferidas, la región de virulencia se obtiene de
la cepa 281 de Agrobacterium. El promotor se selecciona del
grupo que consiste en promotores de gen de ubiquitina de maíz,
promotores del gen de actina de arroz, promotores del gen de Adh 1
del maíz, promotores del gen de tubulina de arroz o maíz (Tub A, B
o C) y promotores del gen de alfalfa His 3. El gen de
marcador seleccionable confiere preferiblemente resistencia a
higromicina en células transformadas. El sitio para la inserción de
la secuencia codificante adicional comprende preferiblemente una
secuencia codificante de un gen informador y/o comprende una
secuencia codificante de un gen que codifica las proteínas útiles
indicadas anteriormente.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una célula vegetal de hierba de césped transformada con
el vector de Agrobacterium mencionado anteriormente, de
manera que el genoma de dicha célula vegetal comprende por lo menos
una secuencia codificante y un gen de marcador seleccionable que
confiere resistencia a antibiótico integrados de manera estable
entre las secuencias de los límites del ADN de transferencia y
donde dicha secuencia codificante y dicho gen de marcador
seleccionable están unidos operativamente a un promotor de una
especie monocotiledónea. Preferiblemente, la hierba de césped es
agrostis palustris, festuca arundinacea, agrostis canina, lilium
perenne, festuca longifolia, festuca rubra fallax, festuca rubra
secunda, agrostis capillaris y poa pratensis. También se
describe en la presente invención una planta de hierba de césped
transgénica regenerada a partir de la célula transformada mencionada
anteriormente, ya que son semillas de la planta de hierba de césped
transgénica.
Otras características y ventajas de la presente
invención se comprenderán por referencia a la descripción detallada
y ejemplos que se indican a continuación.
Se utilizan diversos términos a lo largo de la
memoria y las reivindicaciones para describir la invención. A menos
que se especifique lo contrario, estos términos se definen tal como
se indica a continuación.
En referencia a las moléculas de ácido nucleico,
se utiliza algunas veces el término "ácido nucleico aislado".
Este término, cuando se aplica a ADN, se refiere a una molécula de
ADN que está separada de las secuencias con la que está
inmediatamente contigua (en las direcciones 5' y 3') en el genoma
natural del organismo del que derivaba. Por ejemplo, el "ácido
nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada
en un vector, tal como un vector plásmido o vector de virus, o
integrado en el ADN genómico de un organismo procariota o
eucariota. Una "molécula de ácido nucleico aislada" puede
comprender también una molécula de ADNc.
Con respecto a las moléculas de ARN, el término
"ácido nucleico aislado" se refiere principalmente a una
molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada tal como
se ha definido anteriormente. Alternativamente, el término puede
referirse a una molécula de ARN que se ha separado de manera
suficiente de moléculas de ARN con las que se asociaría en su
estado natural (es decir, en células o tejidos), de manera que
existe en una forma "sustancialmente pura" (el término
"sustancialmente pura" se define a continuación).
El término "sustancialmente pura" se
refiere a una preparación que comprende por lo menos un
50-60% en peso del compuesto de interés (por
ejemplo, ácido nucleico, oligonucleótido, proteína, etc.). Más
preferiblemente, la preparación comprende por lo menos un 75% en
peso, y lo más preferible un 90-99% en peso, el
compuesto de interés. La pureza se mide mediante métodos apropiado
para el compuesto de interés (por ejemplo, métodos cromatográficos,
electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, análisis por HPLC
y similares).
Cuando se utiliza en la presente invención en la
descripción de componentes del medio u otros resultados
experimentales, el término "aproximadamente" significa un
margen de error normalmente aceptable para la determinación que se
realiza utilizando procedimientos estándar. Para el medio de cultivo
de tejidos en particular, las personas expertas en la materia
entenderían que las concentraciones de varios componentes añadidos
inicialmente al medio de cultivo pueden cambiar algo durante el uso
del medio, por ejemplo, mediante la evaporación de líquido del
medio o mediante la condensación en el medio. Además, se entiende
que las concentraciones exactas de los macronutrientes, vitaminas y
fuentes de carbono son menos críticas para la eficacia del medio que
lo son las concentraciones de micronutrientes, hormonas y
antibióticos.
Las secuencias de ácidos nucleicos y las
secuencias de aminoácidos se pueden comparar utilizando programas
informáticos que alinean las secuencias similares de ácidos
nucleicos o aminoácidos definiendo así las diferencias. En las
comparaciones realizadas en la presente invención, se utilizaron el
programa CLUSTLW y los parámetros utilizados en el mismo (Thompson
et al., 1994, supra). Sin embargo, se pueden obtener
alineaciones equivalentes y valoraciones de similitud/identidad
mediante el uso de cualquier software estándar de alineación. Por
ejemplo, se pueden utilizar programas BLAST utilizados para obtener
la similitud de secuencia en GenBank y otras bases de datos
públicas. El Paquete GCG Wisconsin versión 9.1, disponible del
Genetics Computer Group en Madison, Wisconsin, y los parámetros por
defecto utilizados (penalización por creación de espacio = 12,
penalización por extensión de espacio = 4) por el programa también
se pueden utilizar para comparar la identidad y similitud de
secuencias.
El término "sustancialmente las mismas" se
refiere a las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que tienen
variaciones en la secuencia que no afectan materialmente a la
funcionalidad de secuencias reguladoras que actúan en cis (por
ejemplo, promotores, elementos de respuesta transcripcional), etc.)
o a la naturaleza del producto génico codificado (es decir, la
estructura, características de estabilidad, especificidad de
sustrato y/o actividad biológica de la proteína). Con particular
referencia a las secuencias de ácido nucleico, el término
"sustancialmente las mismas" pretende referirse a secuencias
conservadas que gobiernan la expresión y a la región codificante
(que se refiere principalmente a codones degenerados que codifican
el mismo aminoácido, o codones alternados que codifican aminoácidos
sustitutos conservativos en el polipéptido codificado).
Los términos "idéntico en porcentaje" y
"similar en porcentaje" también se utilizan en la presente
invención en comparaciones entre secuencias de ácidos nucleicos.
Cuando se hace referencia a moléculas de ácido nucleico,
"idéntico en porcentaje" se refiere al porcentaje de los
nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico objeto que se han
emparejado con nucleótidos idénticos mediante un programa de
análisis de secuencias. Cuando se hace referencia a secuencias de
aminoácidos, "idéntico en porcentaje" se refiere al porcentaje
de los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos objeto que se han
emparejado con aminoácidos idénticos en la secuencia de aminoácidos
comparada mediante un programa de análisis de secuencias. "Similar
en porcentaje" se refiere al porcentaje de aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos objeto que se han emparejado a aminoácidos
idénticos o conservados. Los aminoácidos conservados son aquellos
que difieren en la estructura, pero son similares en propiedades
físicas, de manera que el intercambio de uno por otro no cambiaría
de manera apreciable la estructura terciaria de la proteína
resultante. Las sustituciones conservativas se definen en Taylor
(1986, J. Theor. Biol. 119:205).
Con respecto a oligonucleótidos u otras
moléculas de ácido nucleico de cadena única, el término "que se
hibrida específicamente" se refiere a la asociación entre dos
moléculas de ácido nucleico de cadena única de secuencia
suficientemente complementaria para permitir dicha hibridación bajo
condiciones predeterminadas utilizadas generalmente en la técnica
(algunas veces "sustancialmente complementaria"). En
particular, el término se refiere a la hibridación de un
oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria
contenida en una molécula de ADN o ARN de cadena única, con la
exclusión sustancial de la hibridación del oligonucleótido con
ácidos nucleicos de cadena única de la secuencia no
complementaria.
Una "secuencia codificante" o "región
codificante" se refiere a una molécula de ácido nucleico que
tiene la información de secuencia necesaria para producir un
producto génico cuando se expresa la secuencia.
El término "unida operativamente" o
"insertada operativamente" significa que las secuencias
reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia
codificante se coloca en una molécula de ácido nucleico en las
posiciones apropiadas relativas a la secuencia codificante para
permitir la expresión de la secuencia codificante. Esta misma
definición se aplica algunas veces a la disposición de otros
elementos de control de la transcripción (por ejemplo,
potenciadores) en un vector de expresión.
Cuando se describe la organización de una
molécula de ácido nucleico, el término "en dirección
ascendente" se refiere a la dirección 5' y el término "en
dirección descendente" se refiere a la dirección 3'.
El término "gen informador" se refiere a
una secuencia codificante de ácido nucleico que codifica un
producto génico fácilmente detectable, que puede estar unido
operativamente a una región de promotor para formar un gen
quimérico, de manera que la expresión de la secuencia codificante es
regulada por el promotor y el producto de la secuencia codificante
se analiza fácilmente.
El término "gen de marcador seleccionable"
se refiere a un gen que cuando se expresa confiere un fenotipo
seleccionable, tal como resistencia a antibiótico, en una célula o
planta transformada.
Las secuencias de control transcripcional y
traduccional, algunas referidas en la presente invención como
"secuencias" o elementos de "control de la expresión", o
secuencias o elementos de "regulación de la expresión", son
elementos reguladores de ADN, tales como promotores, potenciadores,
sitios de unión a ribosoma, señales de poliadenilación,
terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una
secuencia codificante en una célula huésped. El término
"expresión" pretende incluir la transcripción de ADN y la
traducción del transcrito de ARNm.
El término "promotor", "región de
promotor" o "secuencia de promotor" se refieren en general a
regiones reguladoras transcripcionales de un gen, que se pueden
encontrar en la cara 5' ó 3' de la región codificante, en el
interior de la región codificante, o en los intrones. Habitualmente,
un promotor es una región reguladora de ADN capaz de unir la ARN
polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia
codificante en dirección descendente (dirección 3'). La secuencia
del promotor 5' habitual está unida a su extremo 3' por el sitio de
iniciación de la transcripción y se extiende en dirección ascendente
(dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos
necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por
encima del ruido de fondo. En la secuencia del promotor hay un
sitio de iniciación de la transcripción (definido convenientemente
mediante el mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión a
proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN
polimerasa.
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, fago, cósmido, o virus al que se puede insertar
operativamente otro segmento de ácido nucleico para provocar la
replicación o expresión del segmento.
El término "construcción de ácido nucleico"
o "construcción de ADN" se refiere a la secuencia genética
utilizada para transformar células vegetales y generar plantas
transgénicas de progenie. Como mínimo una construcción de ADN
comprende una región codificante para un producto génico
seleccionado unido operativamente a las secuencias reguladores en
5' y 3' para la expresión en plantas transformadas. En realizaciones
preferidas, dichas construcciones son quiméricas, es decir, la
secuencia codificante es de una o más secuencias reguladoras de
origen diferente (por ejemplo, secuencia codificante de tabaco y
promotor de maíz). Sin embargo, también se pueden utilizar
construcciones de ADN quiméricas. Además de los procedimientos
descritos específicamente en la presente invención, el ADN
transformantes se puede prepara según protocolos estándar, tales
como los descritos en Ausubel et al. (1999). Una especie o
cultivo vegetal se puede transformar con una construcción de ADN
(quimérica o no quimérica) que codifica un polipéptido de una
especie o cultivo vegetal, o una especie no vegetal.
Alternativamente, una especie o cultivo vegetal se puede
transformar con una construcción de ADN (quimérica o no quimérica)
que codifica un polipéptido de la misma especie o cultivo vegetal.
El término "transgén" se utiliza algunas veces para referirse
a la construcción de ADN en la célula o planta transformada.
Una célula que ha sido "transformada" o
"transfectada" por una construcción de ADN cuando dicho ADN ha
sido introducido en el interior de la célula. El ADN transformante
puede integrarse o no (unido covalentemente) en el genoma de la
célula. Por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener en un
elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a células
eucariotas, una célula transformada de manera estable es aquella en
que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma, de manera
que es heredado por células hijas mediante la replicación de los
cromosomas. Esta estabilidad se demuestra mediante la capacidad de
la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones
comprendidos de una población de células hijas que contienen el ADN
transformante. Un "clon" es una población de células derivada
de una única célula o un antecesor común mediante mitosis. Una
"línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz
de un crecimiento estable in vitro para muchas
generaciones.
La presente invención proporciona un sistema de
transformación eficaz y fiable para especies de hierba para césped.
Las especies elegidas para el desarrollo de este sistema utilizan
creeping bentgrass, Agrostis palustris Huds. Debido a la
similitud razonablemente próxima entre varias hierbas de césped (es
decir, en fisiología, la organización del genoma, etc.), este
sistema de transformación tendrá una amplia aplicabilidad a muchos
tipos diferentes de hierba para césped. Por ejemplo, el sistema
también se ha aplicado a velvet bentgrass, Agrostis canina
L. y tall fescue, Festuca arundinacea Scheb., y aunque la
eficacia de la transformación no es tan grande como para
agrostis palustres, es evidente que los transformantes se
pueden obtener a partir de varias especies. Otras hierbas para
césped contempladas para el sistema de transformación de la presente
invención incluyen pero sin limitación, lilium perenne, festuca
longifolia, festuca rubra fallax, festuca rubra secunda, agrostis
capillaris y poa pratensis.
Los vectores binarios se utilizan habitualmente
en la transformación mediada por Agrobacterium.
Recientemente se desarrolló un sistema de vectores
"superbinarios" (Komari et al., 1990; Saito et
al. 1992; Hiei et al., 1994; Patente de Estados Unidos
No. 5.731.139 de Komari et al.). En este sistema, el plásmido
que transporta el ADN de transferencia también contiene ciertos
genes de virulencia de la cepa A281, que se conoce por la elevada
eficacia de transformación.
Para llegar a la presente invención, se
utilizaron inicialmente las condiciones y vectores descritos para
la transformación del arroz (Hiei et al., 1994) y maíz
(Ishida et al., 1996), pero sin éxito en agrostis palustre.
Se sospechaba que un problema principal con estos vectores era el
promotor CaMV35S que dirigía la expresión del marcador
seleccionable en los sistemas de arroz y maíz. Por lo tanto, se
construyó un nuevo vector que tiene los componentes del "vector
superbinario" desarrollado por Hiei et al. (1994),
acoplado con un marcador seleccionable adecuado (Resistencia a
higromicina) y el gen informador de
\beta-glucuronidasa (GUS) fácilmente valorable.
De manera más significativa, en el nuevo vector, la expresión de
cada uno de los respectivos transgenes está dirigida por promotores
para una expresión constitutiva fuerte en monocotiledóneas, por
ejemplo, los promotores de actina de arroz y ubiquitina de maíz. Las
transformaciones independientes, realizadas durante el transcurso
de varios meses, demostró que una Agrobacterium tumefaciens
tal como ésta puede de hecho transferir ADN en los cromosomas de
varias hierbas para césped.
Se cree que ciertas características del sistema
de transformación de hierba para césped mediada por
Agrobacterium descrito en la presente invención son
particularmente importantes para la transformación exitosa y la
regeneración de hierba para césped transgénica. Una de éstas es el
uso de plásmidos Ti de cepas de Agrobacterium muy
infectivas. Para su uso se prefieren vectores de
Agrobacterium híbridos superbinarios, tales como pSB1 y
pSB11 (Komari et al., 1996). Éstos y otros vectores
superbinarios que se pueden modificar para su uso en la presente
invención se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.731.179
de Komari et al. Estos vectores contienen una región de ADN
que contiene un gen virB y el gen virG en la región
de virulencia de plásmido Ti pTiBo542 de Agrobacterium
tumefaciens, que es un plásmido Ti contenido en la cepa A281 de
A. tumefaciens (ATCC No. Acceso 37349), una cepa conocida por
su fuerte virulencia. Los genes virB y virG en la
región de virulencia de pTiBo542 están contenidos en un fragmento de
restricción KpnI de 15,2 kb, que por sí solo se puede utilizar en
la presente invención. Además, aunque los vectores que comprenden
las partes de pTiBo542 que confieren hipervirulencia se ejemplifican
en la presente invención, se entenderá por los expertos en la
materia que se pueden utilizar en cambio los genes correspondientes
de cualquier cepa de Agrobacterium altamente virulente.
Éstos incluyen cepas que están actualmente disponibles, así como
cepas que se puedan descubrir en el futuro.
Una característica particularmente importante de
la presente invención es la modificación de los vectores de
Agrobacterium para contener promotores y otras secuencias
reguladoras particularmente adecuadas para la expresión hierbas de
césped. Por lo tanto, los promotores fuertemente constitutivos del
gen de actina de arroz y el gen de ubiquitina de maíz se
ejemplifican en la presente invención. Sin embargo, en la presente
invención se puede utilizar cualquier promotor expresable o
inducible constitutivamente para la expresión en monocotiledóneas.
Algunos ejemplos de otros promotores constitutivos adecuados para su
uso en la presente invención son el promotor Adh 1 de maíz o
promotores de tubulina de arroz o maíz (Tub A, B o C) y el
promotor alfalfa His 3. También se pueden utilizar promotores
específicos de tejido de monocotiledónea. Por ejemplo, los
promotores específicos de semilla adecuados para su uso en la
presente invención incluyen promotores zein, tales como el promotor
zein de 27 kDa o el promotor zein de 10 kDa.
La elección del marcador seleccionable también
es importante. La higromicina se ejemplifica en la presente
invención como un marcador seleccionable. Sin embargo, otros
marcadores seleccionables también son adecuados para su uso en la
presente invención. Por ejemplo, la resistencia a los herbicidas de
fosfotricina es particularmente útil para seleccionar células
vegetales de monocotiledónea transformada. Además, la kanamicina se
utiliza habitualmente como medio de selección para la
transformación de plantas, aunque es menos preferido para su uso en
la presente invención que la higromicina.
Para la transformación mediada por
Agrobacterium, se incluye un antibiótico para eliminar
Agrobacterium en el medio de selección. La cefotaxima es el
antibiótico preferido para este objetivo. Sin embargo, también se
ha observado que la Augmentina (amoxicilina y clavulenato de litio)
y la carbenincilina son eficaces para eliminar
Agrobacterium.
Si se utiliza el gen informador, puede ser
cualquiera de los utilizados habitualmente en la técnica. Entre los
ejemplos de genes informadores adecuados se incluyen, pero sin
limitación, genes que codifican
\beta-glucuronidasa (GUS), luciferasa,
cloramfenicol acetil transferasa (CAT), proteína verde fluorescente
(GFP) y formas modificadas de GFP (por ejemplo, EGFP, EPFP y
GFPUV).
Además, la utilización de callo friable,
regenerable para el protocolo de transformación se considera
particularmente importante para una transformación y regeneración
satisfactoria y eficaz de las plantas intactas. En una realización
preferida, el callo se genera a partir de tejido embriogénico, lo
más preferible semillas maduras, aunque se puede generar de partes
de plantas o semillas inmaduras. También se pueden utilizar otros
tejidos organogénicos como material de partida para el crecimiento
de callo. Se ha observado según la presente invención que el medio
de cultivo descrito en la presente invención facilitará el
crecimiento de tejido de callo apropiado (es decir, friable,
regenerable), que se recoge mejor tan pronto como se genera una
cantidad suficiente del material de partida.
Para optimizar las condiciones para una
transformación eficaz de hierba de césped, se pueden alterar
sistemáticamente una serie de parámetros para determinar las mejores
condiciones para conseguir una transformación eficaz y fácilmente
reproducible. Entre las condiciones que se pueden alterar se
incluyen: 1) el medio de cultivo y agentes de inducción
inmediatamente antes y durante el cocultivo con
Agrobacterium; 2) los métodos de inoculación y cocultivo y
el periodo de tiempo; 3) la presencia y ausencia de tensoactivos en
el medio de inoculación; y 4) el uso de callo embriogénico frente a
cultivos de células en suspensión. Se han establecido las
condiciones óptimas para agrostis palustres. Las
modificaciones de estas condiciones han permitido la transformación
de callo obtenido de agrostis canina L. y festuca
arundinacea.
Por tanto, la presente invención proporciona un
procedimiento para generar hierba para césped transgénica
utilizando vectores de Agrobacterium que hasta la fecha no
estaban disponibles. Una realización preferida de la presente
invención comprende el siguiente protocolo de
transformación/regeneración basado en la transformación mediada por
Agrobacterium.
1) El tejido de partida (por ejemplo, semillas
maduras en una realización particularmente preferida) de la hierba
para césped seleccionada está esterilizado en la superficie y se
coloca en un medio de cultivo de tejidos estándar para la
desdiferenciación (véase los ejemplos) durante aproximadamente
3-6 semanas, preferiblemente en la oscuridad a
temperatura ambiente.
2) Los callos proliferantes se seleccionan y
transfieren a un medio nuevo del mismo tipo sobre una base regular.
Sólo el callo que es friable y regenerable se selecciona para el
posterior cultivo.
3) Antes de la exposición a
Agrobacterium, el callo elegido se transfiere a un medio
nuevo para activar la división de células activas; el callo se
utiliza para la transformación en aproximadamente menos de una
semana de la transferencia final al medio nuevo.
4) La cepa de Agrobacterium que porta los
plásmidos transformantes se deja crecer, se induce con
acetosiringona (un compuesto fenólico que se ha demostrado que
induce la expresión del gen vir de Agrobacterium) y
se resuspende en un medio de inoculación que comprende
acetosiringona y, opcionalmente, un tensoactivo, tal como plurónico
F-68 u otro tensoactivo adecuado.
5) opcionalmente, el callo se puede tratar antes
de la inoculación con Agrobacterium mediante infiltración al
vacío con un medio de inoculación que contiene acetosiringona.
6) El tejido calloso se coloca a continuación en
presencia de la suspensión de Agrobacterium para permitir
que las bacterias se infiltren en el tejido calloso. Opcionalmente,
se puede extraer a continuación el exceso de Agrobacterium
de los callos mediante una filtración al vacío suave. Los callos, en
un filtro estéril, se colocan a continuación en medio sólido de
co-cultivo (medio estándar de desdiferenciación,
pero que contiene glucosa y acetosiringona). El
co-cultivo de los callos con las células de
Agrobacterium que permanecen asociadas con los callos se
deja actuar durante unos días (por ejemplo, tres), siendo el
objetivo dar un tiempo suficiente para la penetración del ADN de
transferencia en las células vegetales evitando el sobrecrecimiento
de los callos con Agrobacterium.
7) A continuación, los callos se transfieren al
medio de selección que contiene el antibiótico de selección (por
ejemplo, higromicina) y el antibiótico para la eliminación de
Agrobacterium. Los callos se mantienen en este medio durante
varias semanas (por ejemplo, 6-8 semanas) y se
comprueban periódicamente la proliferación de los callos en el
medio de selección.
8) El nuevo crecimiento que aparece en los
callos en el medio de selección se transfiere en primer lugar a un
medio de selección nuevo y se deja proliferar. Esta primera
selección se realiza mejor cuando el nuevo crecimiento es tan
pequeño como sea posible con el fin de asegurar que los
transformantes independientes se seleccionan y proliferan en
ausencia de otros transformantes independientes.
9) Después de una proliferación suficiente, se
analiza la expresión del gen de interés y/o la expresión de un gen
de marcador detectable (por ejemplo, actividad GUS) de una pequeña
parte de cada uno de los callos supuestamente transformados. Las
partes restantes de los callos que dieron resultado positivo se
retienen en el medio de selección para un subcultivo y
proliferación continuados. Posteriormente, los callos transformados
se transfieren a un medio de regeneración que contiene reguladores
del crecimiento para inducir la diferenciación de brotes.
10) Cuando se ha desarrollado suficientemente,
los brotes se transfieren a un segundo medio de regeneración
formulado para estimular posteriormente el crecimiento de las
raíces. Después de una fase de crecimiento suficiente, las
plántulas se transfieren a un medio de cultivo de tejido nuevo o a
tierra o medio de plantación equivalente.
La presente invención proporciona hierba para
césped transgénica producida por los procedimientos descritos
anteriormente y también pretende comprender células y tejidos de
estas plantas, incluyendo, sin limitación, hojas, tallos, brotes,
raíces, flores, frutas y semillas. En una realización preferida, se
proporcionan las semillas de las plantas transgénicas producidas
por los procedimientos de la presente invención.
Las plantas desarrolladas a partir de las
semillas mencionadas anteriormente, o las semillas de otras
especies o variedades de hierba para césped, o la progenie de las
mismas, todas ellas consideradas en el alcance de la presente
invención, se utilizan en los métodos de cruzamiento y de selección
para transferir genes de interés a otros genotipos de hierba para
césped, cultivos, variedades y similares.
Las plantas desarrolladas a partir de semillas
de hierba para césped transgénica también se pueden utilizar para
detectar la presencia del transgén insertado y las secuencias de
vector utilizando la extracción de ADN, la división por una o más
endonucleasas de restricción, y el análisis, por ejemplo,
transferencia Southern utilizando sondas derivadas del gen o genes
de interés. De esta manera, se puede hacer el seguimiento de la
transferencia de genes exógenos en la progenie de de cruzamientos de
cultivo.
El sistema de transformación de hierba para
césped mediado por Agrobacterium de la presente invención se
puede utilizar para introducir muchos genes de interés en diferentes
especies o variedades de hierba para césped. Por consiguiente, la
presente invención proporciona varios vectores híbridos específicos
para la transformación de hierba para césped mediada por
Agrobacterium. Existen una serie de construcciones génicas de
considerable utilidad práctica, ya que se utilizan para crear una o
más hierbas para césped transgénicas. Éstas incluyen: 1) el gen que
codifica la glucosa oxidasa de Aspergillus niger que cuando
se expresa en patatas proporciona resistencia a patógenos
bacterianos y fúngicos mediante su producción de H_{2}O_{2} en
el apoplasto fúngico (Wu et al., 1995); 2) el gen que
codifica la citrato sintasa de Pseudomonas aeruginosa que
cuando se expresa en el citoplasma del tabaco proporciona
tolerancia a niveles tóxicos de aluminio en la tierra (Manuel et
al., 1997); 3) los genes que codifican la
\Delta-9 desaturasa de Saccharomyces
cerevisiae (Stukey et al., 1990) y Cryptococcus
curvatus (Meesters et al., 1997) y
\Delta-11 desaturasa de Trichoplosia ni
(Knipple et al., 1998). Cuando el gen olel de levadura se
expresó en tomate y berenjena, proporcionó resistencia a patógenos
fúngicos; 4) el gen identificado recientemente que codifica un
homólogo de planta de la NADPH oxidasa de neutrófilo que se cree
que es responsable de la explosión oxidativa que es crítica la
defensa de la planta contra patógenos (Keller et al., 1998);
5) el gen que codifica bacteriopsina, una bomba de protones de la
bacteria, Halobacterium halobium, que se ha demostrado que
protege el tabaco transgénico que expresa la proteína frente a
patógenos de plantas (Mittler et al., 1995); y 6) el gen que
codifica la proteína antiviral de fitolaca, que es una proteína
inactivadora de ribosoma de la planta Phytolacca americana;
la expresión de este gen en el tabaco proporciona resistencia a
patógenos virales y fúngicos (Lodge et al., 1993; Zoubenko
et al., 1997).
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
describir la presente invención en mayor detalle. Se pretende que
ilustren, sin limitar, la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pTOK233 descrito por Hiei et
al. (1994) para la transformación de arroz no era útil para la
transformación de agrostis palustres a pesar de numerosos intentos.
Se sospechaba que el promotor del mosaico 35S de coliflor era el
origen del problema en que parece ser un promotor muy débil en la
hierba para césped. Por consiguiente, se obtuvo una pareja
alternativa de vectores plásmidos, concretamente pSB1 y pSB11 (Japan
Tobacco, Inc. Plant Breeding and Genetics Research Laboratory, 700
Higashibara, Toyoda, Iwata, Shizuoka, Japan). pSB11 es un plásmido
de 6,3 kb que contiene una región de multiclonación con un grupo de
sitios de restricción únicos entre las secuencias del límite
izquierdo y el límite derecho que definen la región del ADN de
transferencia que se transferirá desde Agrobacterium
tumefaciens al genoma de la planta. Los "casetes de expresión
de monocotiledóneas que expresan la fosfotransferasa de higromicina
B" (para conferir resistencia a higromicina) y
\beta-glucuronidasa (GUS, como informador
valorable) se insertaron en pSB11 en la región de clonación
múltiple entre las secuencias de los límites del ADN de
transferencia. Se utilizó la siguiente estrategia.
En primer lugar, el plásmido pAcH1
(proporcionado por el Dr. German Spangenberg) se digerió
parcialmente con SacI que produjo diversos fragmentos de
restricción, de los cuales el fragmento de 2645 pb se purificó con
gel. Este fragmento contiene una secuencia codificante hph
modificada en 3' (que confiere Resistencia a higromicina) clonado
en el marco y en dirección 3' desde la secuencia de promotor 5' Act
1, primer exón (no codificante), primer intrón y una parte del
segundo, exón que contiene ATG del gen. Las señales de terminación
de la transcripción son proporcionadas por el terminador CaMV35S.
Este fragmento de 2E45 pb se clonó en el único sitio de restricción
Sac I entre las secuencias del límite derecho e izquierdo del
plásmido pSB11. Este plásmido se denominó pSB11S. A continuación,
se separó un fragmento por HindIII de 4175 pb del plásmido
pAHC25, proporcionado amablemente por el Dr. Peter Quail. Este
fragmento contiene el promotor, exón no traducido 5', y un primer
intrón del gen de ubiquita de maíz (Ubi1) fusionado con la secuencia
codificante del gen informador GUS (derivado de pBI101.2). Este
fragmento de restricción por Hind III se clonó en el sitio
único Hind III de pSB11S, entre las secuencias del límite
derecho y el límite izquierdo del plásmido. El plásmido resultante
se denominó pSB11SH.
A continuación, este vector intermedio (pSB11SH)
se sometió a electroporación en LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens que contenía el "vector aceptor" pSB1. El
plásmido pSB1 es un "vector superbinario" que porta un
fragmento KPn I de 15,2 kb que contenía copias adicionales de los
genes de virulencia vir B, vir C y vir G para
permitir la transferencia eficaz del ADN de transferencia a
monocotiledóneas. Después de la recombinación homóloga entre el
"vector aceptor" y el "vector intermedio", se obtuvo un
"vector híbrido" co-integrado. Las bacterias
que expresan los marcadores de resistencia a fármacos derivados de
los vectores aceptores e intermedios se seleccionaron en placas AB
que contenían 10 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
espectinomicina, y se utilizaron las cepas resultantes que portan el
"vector híbrido" en las transformaciones de plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se describe un sistema de
transformación por Agrobacterium para creeping bentgrass,
Agrostis palustris, que utiliza el vector de prueba híbrido
superbinario descrito en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1. Preparar una solución madre de tampón AB a
20X y autoclave
2. Preparar una solución madre de sales AB a 20X
y autoclave
3. Para 1 litro de medio para placas.
- \quad
- Mezclar 5 g de glucosa, 15 g de agar y 900 ml de H_{2}O y autoclave.
- \quad
- Añadir 50 ml de la solución madre 20x de tampón AB y 50 ml de la solución madre 20x de sales AB.
- \quad
- Añadir 10 mg de tetraciclina y 50 mg de espectinomicina. Verter en placas de petri.
Producción de callo regenerable:
Semillas maduras de agrostis palustres (cultivo de Crenshaw)
se esterilizaron en la superficie y se pusieron en placas en medio
MMSG. Las placas se mantuvieron en la oscuridad a temperatura
ambiente durante 3-6 semanas. Los callos
proliferantes se seleccionaron y transfirieron a nuevo medio MMSG
en una base regular. Sólo el callo que era friable y regenerable se
utilizó para la transformación. El callo elegido se transfirió a un
nuevo medio MMSG antes del co-cultivo para inducir
la división de células activas y se utilizó para la transformación
en una semana después de la transferencia a nuevas placas. Se cree
que la naturaleza del callo (es decir, friabilidad, regenerabilidad
y crecimiento activo) juega un papel activo en la obtención de una
transformación eficaz.
Inducción de Agrobacterium
tumefaciens con acetosiringona: LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens, que alberga el vector pSB111SH, se estrió a partir
de una solución madre de glicerol almacenada a -80ºC y se dejó
desarrollar a 28ºC sobre placas que contenían medio AB,
complementado con 10 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
espectinomicina. Después de tres a seis días, las células se
rascaron de la placa y se suspendieron en medio AAM modificado que
contenía 100 \muM de acetosiringona hasta una DO660 de
aproximadamente 0,5. La suspensión bacteriana se dejó a 25ºC en la
oscuridad con agitación durante 3,5 horas antes de utilizarla para
el co-cultivo.
Co-cultivo: Se mezcló una
cantidad determinada de callo friable con la suspensión de
Agrobacterium inducida y se incubó a temperatura ambiente en
la oscuridad durante 1,5 horas. A continuación, el contenido se
vertió en un embudo Buchner estéril que contenía un papel de filtro
Whatman estéril. Se aplicó un vacío leve para drenar el exceso de
suspensión de Agrobacterium. A continuación, el trasladó el
filtro a una placa que contenía medio MMSG complementado con 100
\muM de acetosiringona y la placa se guardó en la oscuridad a
temperatura ambiente durante tres días.
Selección y regeneración de
transformantes: Después del co-cultivo de tres
días, se enjuagaron los callos co-cultivados con
250 \mug/ml de cefotaxima para detener el crecimiento bacteriano,
y los callos se colocaron sobre placas de agar que contenía medio
MMSG que contenía 200 \mug/ml de higromicina y 250 \mug/ml de
cefotaxima. Los callos se mantuvieron en la oscuridad a temperatura
ambiente durante 6-8 semanas y se comprobó
periódicamente la proliferación de los callos en higromicina.
Posteriormente, los callos resistentes a
higromicina se colocaron en un medio de regeneración que contenía
higromicina y cefotaxima. Los callos proliferantes en primer lugar
se trasladaron a un Medio de Regeneración I (MSO I) que contenía
cefotaxima e higromicina. Estos callos se mantuvieron en la
oscuridad a temperatura ambiente durante una semana y a
continuación se movieron hacia la luz durante aproximadamente dos
semanas. Las plantas muy pequeñas se separaron y transfirieron a
placas de petri profundas que contenían Medio de Regeneración II
(MSO II) para inducir el crecimiento de las raíces. Se incluyeron
higromicina y cefatoxima en el medio para mantener respectivamente
la presión de selección y matar cualquier célula de
Agrobacterium restante. Después de 2-3
semanas, o cuando las plantas tenían 1,5-2 cm de
alto, se trasladaron a "plantcons" que contenían MSO II sin
antibióticos. Cuando las plantas tenían \sim10 cm de alto y habían
desarrollado ricos sistemas de raíces, se transfirieron a tierra y
se desarrollaron en el laboratorio durante 3-4
semanas con 12 horas de luz/día. Las plantas se transfirieron a
recipientes de 6'' en el invernadero, donde la temperatura se
mantuvo entre 21º y 25ºC. Se añadió luz complementaria de
aproximadamente 50 \muE m^{-2} s^{-1}
a nivel del dosel vegetal cuando la luz natural era baja y proporcionó un periodo de luz mínimo de 14 horas.
a nivel del dosel vegetal cuando la luz natural era baja y proporcionó un periodo de luz mínimo de 14 horas.
En relación con la transformación de agrostis
palustres, debe indicarse que los medios y protocolos descritos a
continuación en los Ejemplos 3 y 4 se pueden utilizar también para
transformar y regenerar de manera satisfactoria agrostis
palustres.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se describe un sistema de
transformación por Agrobacterium para tall fescue, Festuca
arundinacea Scheb., que utiliza el vector de prueba híbrido
superbinario descrito en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Este medio se formuló tal como se ha descrito en
el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Este medio se formuló y preparó tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Este medio se formuló y preparó tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Este medio se formuló y preparó tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2.
Producción de callo regenerable: Semillas
maduras de festuca arundinacea se esterilizaron en la
superficie y se pusieron en placas en medio MMSG. Las placas se
mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante
3-6 semanas. Los callos proliferantes se
seleccionaron y transfirieron a nuevo medio MMSG en una base
regular. El callo elegido para la transformación se transfirió a un
nuevo medio MMSG antes del co-cultivo para inducir
la división de células activas. Se cree que la naturaleza del callo
(es decir, friabilidad, regenerabilidad y crecimiento activo) juega
un papel activo en la obtención de una transformación eficaz.
Preparación de la suspensión de
Agrobacterium tumefaciens: LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens, que alberga el vector pSB111SH, se estrió a partir
de una solución madre de glicerol almacenada a -80ºC y se dejó
desarrollar a 28ºC sobre placas que contenían medio AB,
complementado con 10 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
espectinomicina. Después de tres a seis días, las células se
rascaron de la placa y se suspendieron en medio de inoculación que
contenía 200 \muM de acetosiringona y plurónico
F-68 al 0,02% hasta una Do660 entre 0,5 y 0,8.
Co-cultivo de callo con
Agrobacterium: el callo elegido para la transformación se
colocó en un tubo estéril y se mezcló con 30 ml de una suspensión
de Agrobacterium. El tubo se bloqueó y se cubrió con papel
de aluminio, y el contenido se mezcló mediante inversión y se agitó
de manera suave durante 1,5 horas. El contenido del tubo se vertió
en un embudo Buchner, ajustado con un filtro Whatman. Se aplicó un
vacío leve al matraz. Los discos del filtro que contenían el callo
con Agrobacterium se trasladaron a palcas de
co-cultivo que contenían acetosiringona (200 \muM)
y glucosa a 10 g/l. Las placas se sellaron con parafilm y se
colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante tres
días.
Selección y regeneración de
transformantes: Después del co-cultivo de tres
días, se enjuagaron los callos co-cultivados con
250 \mug/ml de solución de cefotaxima para detener el crecimiento
bacteriano, y los callos se colocaron en un medio MMSG que contenía
200 \mug/ml de higromicina y 250 \mug/ml de cefotaxima. Los
callos se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante
6-8 semanas y se comprobó periódicamente la
proliferación de los callos en higromicina. Los callos resistentes a
higromicina se trasladaron a nuevas placas de MMSG con higromicina
y se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que
proliferaron suficientemente. A continuación, se analizó la
actividad GUS de una parte del callo resistente a higromicina para
asegurar que la transformación había tenido lugar.
Las partes de los callos supuestamente
transformados se trasladaron a continuación a un Medio de
Regeneración I (MSO I) que contenía cefotaxima e higromicina y se
mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante una
semana y posteriormente se trasladaron a la luz para la
regeneración. Los brotes muy pequeños se separaron y transfirieron
a placas de petri profundas que contenían Medio de Regeneración II
(MSO II) para inducir el crecimiento de las raíces e higromicina y
cefatoxima para mantener respectivamente la selección de los
transformantes y matar cualquier resto de Agrobacterium.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se describe un sistema de
transformación por Agrobacterium para velvet bentgrass,
Agrostis canina L., que utiliza el vector de prueba híbrido
superbinario descrito en el Ejemplo 1.
Medios: Todos los medios se formularon y
prepararon tal como se han descrito en el Ejemplo 3.
Producción de callo regenerable: Semillas
maduras de Agrostis canina L. se esterilizaron en la
superficie y se pusieron en placas en medio MMSG. Las placas se
mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante
3-6 semanas. Los callos proliferantes se
seleccionaron y transfirieron a nuevo medio MMSG en una base
regular. El callo elegido para la transformación se transfirió a un
nuevo medio MMSG antes del co-cultivo para inducir
la división de células activas. Se cree que la naturaleza del callo
(es decir, friabilidad, regenerabilidad y crecimiento activo) juega
un papel activo en la obtención de una transformación eficaz.
Preparación de la suspensión de
Agrobacterium tumefaciens: LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens, que alberga el vector pSB111SH, se estrió a partir
de una solución madre de glicerol almacenada a -80ºC y se dejó
desarrollar a 28ºC sobre placas que contenían medio AB,
complementado con 10 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
espectinomicina. Después de tres a seis días, el césped bacteriano
se rascó de una placa (diámetro de 82 mm) y se suspendió en 6 ml de
medio de inoculación que contenía 200 \muM de acetosiringona. La
suspensión bacteriana se dejó a 28ºC en la oscuridad con agitación
durante toda la noche. Por la mañana, se añadió acetosiringona
hasta una concentración final de 400 \muM y plurónico
F-68 hasta el 0,02%.
Co-cultivo: Se colocó un
tubo estéril sobre una placa de co-cultivo que
contenía acetosiringona (200 \muM) y glucosa (10 g/l). Sobre este
filtro se colocó un grupo amplio de callos friables que a
continuación se rompieron suavemente y se dispensaron de manera
uniforme sobre el filtro. Se pipetearon de manera uniforme
aproximadamente 500 \mul de suspensión de Agrobacterium
sobre los callos. Las placas se sellaron con parafilm y se
colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante tres
días.
Selección y regeneración de
transformantes: Después del co-cultivo de tres
días, se enjuagaron los callos co-cultivados con
250 \mug/ml de solución de cefotaxima para detener el crecimiento
bacteriano, y los callos se colocaron en un medio MMSG que contenía
200 \mug/ml de higromicina y 250 \mug/ml de cefotaxima. Los
callos se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante
6-8 semanas y se comprobó periódicamente la
proliferación de los callos en higromicina. Los callos resistentes a
higromicina se trasladaron a nuevas placas de MMSG con higromicina
y se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que
proliferaron suficientemente. A continuación, se analizó la
actividad GUS de una parte del callo resistente a higromicina para
asegurar que la transformación había tenido lugar.
Las partes de los callos supuestamente
transformados se trasladaron a continuación a un Medio de
Regeneración I (MSO I) que contenía cefotaxima e higromicina y se
mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de una
semana se trasladaron a la luz para la regeneración. Los brotes muy
pequeños se separaron y transfirieron a placas de petri profundas
que contenían Medio de Regeneración II (MSO II) para inducir el
crecimiento de las raíces e higromicina y cefatoxima para mantener
respectivamente la presión de selección y matar cualquier célula de
Agrobacterium restante.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (17)
1. Procedimiento de producción de una planta
de hierba para césped transgénica, que comprende las etapas de:
a) proporcionar tejido calloso regenerable a
partir de la planta de hierba para césped;
b) inocular el tejido con Agrobacterium
que transporta por lo menos un vector para la transformación,
comprendiendo el vector una región de virulencia de un plásmido Ti
de una cepa de A. tumefaciens que confiere a la cepa una
virulencia tan fuerte como la expresada por la cepa 281 de A.
tumefaciens, en cuyo vector se inserta una construcción de ADN
heterólogo unido operativamente a un promotor de una especie de
monocotiledónea, y un gen de marcador seleccionable que confiere
resistencia a antibiótico a células transformadas unidas
operativamente a un promotor de una especie monocotiledónea;
(c) cultivar el tejido inoculado en condiciones
que permiten que el vector de Agrobacterium transforme las
células del tejido;
(d) cultivar selectivamente el tejido inoculado
en un medio de selección que comprende el antibiótico; y
(e) regenerar una planta de hierba para césped
transformada a partir del tejido cultivado de manera selectiva.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la hierba para césped es una especie seleccionada del grupo
que consiste en agrostis palustris, festuca arundinacea, agrostis
canina, lilium perenne, festuca longifolia, festuca rubra fallax,
festuca rubra secunda, agrostis capillaris y poa
pratensis.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el Agrobacterium comprende un sistema de vectores
binarios y los genes de virulencia en el mismo se obtienen de un
plásmido en la cepa 281 de Agrobacterium tumefaciens.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en
promotores del gen de ubiquitina del maíz, promotores del gen de
actina de arroz, promotores del gen de Adh 1 del maíz y promotores
del gen de tubulina de arroz o maíz (Tub A, B o C).
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el gen del marcador seleccionable confiere resistencia a
higromicina en el tejido transformado.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el callo se obtiene mediante el cultivo de semillas de la
hierba para césped en un medio que induce la desdiferenciación del
tejido vegetal.
7. Planta de hierba para césped transgénica que
comprende un transgén y un gen del marcador seleccionable que
confiere resistencia a antibiótico integrados de manera estable en
el genoma entre las secuencias de los límites del ADN de
transferencia, donde dicho transgén y dicho gen de marcador
seleccionable están unidos operativamente a un promotor de una
especie de monocotiledónea.
8. Planta de hierba para césped transgénica
según la reivindicación 7, en la que el transgén se selecciona del
grupo que consiste en:
a) un gen que codifica glucosa oxidasa;
b) un gen que codifica citrato sintasa;
c) genes que codifican
\Delta-9 desaturasa de saccharomyces
cerevisiae o Cryptococcus curvatus;
d) un gen que codifica
\Delta-11 desaturasa;
e) un gen que codifica un homólogo de planta de
la NADPH oxidasa de neutrófilo;
f) un gen que codifica bacteriopsina de
Halobacterium halobium; y
g) un gen que codifica una proteína antiviral de
fitolaca.
9. Sistema de vectores superbinarios para su uso
en un procedimiento de transformación de hierba para césped mediada
por Agrobacterium según la reivindicación 1, que
comprende:
a) una región de virulencia de un plásmido Ti de
una cepa de A. tumefaciens que confiere a la cepa una
virulencia tan fuerte como la expresada por la cepa 281 de A.
tumefaciens;
b) un gen del marcador seleccionable unido
operativamente a un promotor obtenido de un gen de una planta
monocotiledónea; y
c) un sitio para la inserción de por lo menos
una secuencia codificante adicional entre las secuencias de los
límites del ADN de transferencia unida operativamente a un promotor
obtenido de un gen de una planta monocotiledónea, siendo el
promotor el mismo o diferente del promotor unido operativamente al
gen del marcador seleccionable.
10. Sistema de vectores según la reivindicación
9, en el que la región de virulencia se obtiene de la cepa 281 de
Agrobacterium.
11. Sistema de vectores según la reivindicación
9, en el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en
promotores del gen de ubiquitina del maíz, promotores del gen de
actina de arroz, promotores del gen de Adh 1 del maíz y promotores
del gen de tubulina de arroz o maíz (Tub A, B o C).
12. Sistema de vectores según la reivindicación
9, en el que el gen del marcador seleccionable confiere resistencia
a higromicina en las células transformadas.
13. Sistema de vectores según la reivindicación
9, en el que el sitio para la inserción de la secuencia codificante
adicional comprende una secuencia codificante de un gen
informador.
14. Sistema de vectores según la reivindicación
9, en el que el sitio para la inserción de la secuencia codificante
adicional comprende una secuencia codificante de un gen seleccionado
del grupo que consiste en:
a) un gen que codifica glucosa oxidasa;
b) un gen que codifica citrato sintasa;
c) genes que codifican
\Delta-9 desaturasa de saccharomyces
cerevisiae o Cryptococcus curvatus;
d) un gen que codifica
\Delta-11 desaturasa;
e) un gen que codifica un homólogo de planta de
la NADPH oxidasa de neutrófilo;
f) un gen que codifica bacteriopsina de
Halobacterium halobium; y
g) un gen que codifica una proteína antiviral de
fitolaca.
15. Célula vegetal de hierba para césped
transformada con el sistema de vectores según la reivindicación 9,
en la que el genoma de dicha célula vegetal comprende por lo menos
una secuencia codificante y un gen del marcador seleccionable que
confiere resistencia a antibiótico integrados de manera estable
entre las secuencias de los límites del ADN de transferencia y
donde dicha secuencia codificante y dicho gen del marcador
seleccionable están unidos operativamente a un promotor de una
especie de monocotiledónea.
16. Célula vegetal de hierba para césped según
la reivindicación 15, en la que la célula es una hierba para césped
seleccionada del grupo que consiste en agrostis palustris,
festuca arundinacea, agrostis canina, lilium perenne, festuca
longifolia, festuca rubra fallax, festuca rubra secunda, agrostis
capillaris y poa pratensis.
17. Planta de hierba para césped transgénica
regenerada a partir de la célula transformada según la
reivindicación 15.
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