ES2322827B1 - Procedimiento para la deteccion e identificacion simultanea y especifica de bacterias lacticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion e identificacion simultanea y especifica de bacterias lacticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la detección e identificación
simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en
leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches
fermentadas.
El procedimiento permite la rápida y simultánea
detección e identificación de diferentes especies de bacterias
lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L.
acido- philus) en cultivos mixtos con B. lactis,
especies habitualmente presentes en yogur y leches fermentadas que
contienen probióticos. El procedimiento emplea cebadores de ADN
específicas diseñados a partir del gen 165 rRNA para las bacterias
lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias. El
procedimiento de identificación mediante amplificación específica
por PCR se complementa con la separación de los productos
amplificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
gradiente desnaturalizante (DGGE). La ventaja del método radica en
que es capaz de realizar en una sola reacción la identificación
conjunta de los cultivos mixtos presentes en leches
fermentadas.
Description
Procedimiento para la detección e identificación
simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en
leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches
fermentadas.
La técnica se encuadra dentro del Área
Agroalimentaria, en el Sector Lácteo, y desarrolla un procedimiento
para la detección e identificación de diferentes especies de
bacterias lácticas y bifidobacterias específicas de poblaciones
mixtas en yogures y leches fermentadas.
Dentro del sector lácteo, el consumo de
productos lácteos probióticos se encuentra en franca expansión,
creciendo durante los últimos años no sólo en ventas sino también
en la variedad de productos que se ofertan. Este hecho ha conducido
a que desde enero de 2004 se incluyan en las estadísticas del
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación los datos sobre
consumo de "yogur con bífidus" y "otras leches
fermentadas". El registro del volumen de consumo en España de
yogures y leches fermentadas comparativo entre mayo de 2004 y mayo
de 2005 indica un incremento medio del consumo de productos
probióticos en un 18%, los cuales representan casi un 10% del total
consumido de yogures y productos relacionados
[http://www.fenil.org/Documentos/Sector/Consumo/CompAcumUltimoAno/consumo_
comparativa_mayo05-04.pdf].
comparativa_mayo05-04.pdf].
La detección y correcta identificación de los
microorganismos empleados como probióticos comercialmente es de
gran importancia para garantizar la autenticidad de su etiquetado
y, en su caso, para apoyar las posibles alegaciones de salud de
estos alimentos. Los estudios de productos probióticos presentes en
el mercado han reflejado, en general, una falta de precisión en la
identificación/taxonomía de los microorganismos probióticos
empleados tanto en diferentes productos lácteos como en
concentrados liofilizados y en preparados
farmacéuticos/nutracéuticos [Fasoli, S., Marzotto, M., Rizzotti, L.,
Rossi, F., Dellaglio, F., Torriani, S. (2003) Int. J. Food
Microbiol. 82:59-70; Temmerman, R., Pot, B., Huys,
G., Swings, J. (2003) Int. J. Food Microbiol.
81:1-10]. Estudios recientes realizados sobre la
diversidad de especies de lactobacilos y bifidobacterias presentes
en leches fermentadas comercializadas en España indican una
creciente mejora en la equivalencia entre las especies etiquetadas
y las presentes en el producto detectadas por técnicas moleculares
[Gueimonde, M., Delgado, S., Mayo, B., Ruas-Madiedo,
P., Margolies, A., de los Reyes-Gavilán, C. G.
(2004) Food Res. Int. 37:839-850]. Aún así, ninguna
de las muestras analizadas en el estudio contenía más de una especie
de lactobacilos probióticos y en la mayoría de leches fermentadas
ni siquiera a Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus. La dificultad de estos estudios, por tanto,
aumenta cuando concurren un mayor número de especies en el mismo
producto.
La identificación tradicional de microorganismos
basada en características fenotípicas es bastante lenta y no
siempre adecuada para la correcta identificación o diferenciación
entre especies muy próximas taxonómicamente. El reemplazo lógico
sucedido en este aspecto ha sido el empleo de técnicas moleculares
para complementar o sustentar la identificación de especies
bacterianas. La mayoría de estas técnicas se han basado en el
análisis de secuencias específicas presentes en genes integrantes
del operón del ARN ribosómico y en las regiones intergénicas
espaciadoras [Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. (1995)
Microbiol. Rev. 59:143-169]. Este hecho se basa en
el carácter universal del funcionamiento de estos genes que conduce
a la presencia de regiones conservadas, amplificadas por cebadores
universales, y de regiones variables que permiten establecer
agrupaciones filogenéticas según el grado de homología de las
secuencias nucleotídicas y, por tanto, la identificación de
especies bacterianas. Sin embargo, la comparación de secuencias del
gen 16S rRNA de bifidobacterias refleja una elevada analogía entre
las especies (similitud que oscila entre 92 y 99%) que dificulta su
diferenciación basada en el análisis de dicha secuencia, por lo que
se han buscado otros genes polimórficos para la identificación de
estas especies, como es el que codifica para la enzima
transaldolasa [Requena, T., Burton, J., Matsuki, T., Munro, K.,
Simon, M.A., Tanaka, R., Tannock, G.W. (2002) Appl. Environ.
Microbiol. 68:2420-2427].
La combinación de técnicas específicas para la
detección e identificación bacteriana basada en técnicas
moleculares como amplificación por PCR y separación de los
fragmentos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
gradiente desnaturalizante (DGGE), constituye una herramienta de
gran utilidad para el estudio de poblaciones microbiológicas
complejas en ecosistemas naturales sin necesidad de realizar una
separación previa de los diferentes componentes en la mezcla. El
empleo de PCR-DGGE se ha aplicado a numerosas y
complejas comunidades microbiológicas [Muyzer, G., Smalla, K.
(1998) Antonie Van Leeuwenhoek 73:127-141;
Zoetendal, E. G., Collier, C. T., Koike, S., Mackie, R. I.,
Gaskins, H. R. (2004) J. Nutr. 134:465-472],
mientras que se ha incorporado sólo recientemente en el estudio de
comunidades microbiológicas presentes en alimentos fermentados
[Ercolini, D. (2004) J. Microbiol. Meth.
56:297-314] y más concretamente en quesos [Randazzo,
C.L., Torriani, S., Akkermans, A.D.L., de Vos, W.M., Vaughan, E.E.
(2002) Appl. Environ. Microbiol. 68:1882-1892].
El objeto de la presente invención consiste en
la aplicación de un procedimiento de detección e identificación
rápida y específica de diferentes especies de bacterias lácticas y
bifidobacterias presentes en poblaciones mixtas en leches
fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas,
basado en el diseño de cebadores inéditos y específicos de especie
para la amplificación por PCR de secuencias identificadas en
regiones variables del 16S rRNA de S. thermophilus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus y L. casei
subsp. casei y del gen de la transaldolasa en B. lactis y se
complementa con la diferenciación de los fragmentos obtenidos
mediante separación por DGGE. Las especies objeto del estudio son
añadidas habitualmente como cultivos iniciadores en leches
fermentadas probióticas comercializadas en España. Las ventajas del
procedimiento son la rapidez y el análisis específico y simultaneo
de todas las especies presentes en una misma muestra en
estudio.
En relación a las patentes internacionales
existentes relacionadas con el tema objeto de la presente
invención, se destacan: (i) la patente W09709448 publicada en 1997,
solicitada por los inventores Alatossava, T. y
Tilsala-Timisjaervi, A. (Finlandia), que se
caracteriza por emplear la secuencia de la región espaciadora entre
los genes 16S y 23S rRNA para la identificación específica de
lactobacilos y S. thermophilus; (ii) las patentes JP11151097
y JP11123093, publicadas en 1999 y solicitadas por la empresa
Yakult Honska KK, que se caracterizan por la descripción de
oligonucleótidos utilizables para la identificación genérica de
bacterias lácticas y bifidobacterias, respectivamente; y (iii) la
patente W02005103294 publicada en 2005, solicitada por los
inventores Park, Y.-H., Bae, J.-W., Rhee, S.-K., Park, J. R., Kim,
B.-C. (Corea) que se caracteriza por emplear la tecnología de
"microarrays" para la detección e identificación de bacterias
lácticas, bifidobacterias y propionibacterias. No obstante, no
existe ningún procedimiento patentado para la detección e
identificación de bacterias lácticas y bifidobacterias en cultivos
mixtos en leches fermentadas empleando la tecnología
PCR-DGGE.
Se ha desarrollado un procedimiento que permite
la rápida detección e identificación de diferentes especies de
bacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L.
acidophilus) en cultivos mixtos con B. lactis, especies
habitualmente presentes en yogur y leches fermentadas que contienen
probióticos. El procedimiento emplea secuencias de ADN específicas
(cebadores) diseñadas a partir del gen 16S rRNA para las especies de
bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para
bifidobacterias y que se utilizan para la identificación del ADN
procedente de las mencionadas especies mediante amplificación
específica por PCR. El procedimiento de identificación se
complementa con la separación de los productos amplificados mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente
desnaturalizante (DGGE).
El procedimiento de detección e identificación
de diferentes especies de bacterias lácticas (S. thermophilus,
L. bulgaricus, L. casei, L. acidophilus) y de B. lactis
presentes en cultivos mixtos en leches fermentadas se caracteriza
por el empleo de cebadores específicos diseñados a partir de
secuencias presentes en regiones variables del gen 16S rRNA para
las especies de bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa
para bifidobacterias y que el método que emplea es la amplificación
específica mediante PCR. La semejanza en la longitud de los
fragmentos amplificados no permite una diferenciación de los
productos de PCR en geles convencionales de agarosa, por lo que en
la presente invención la aplicación del procedimiento en la
identificación simultanea de las especies cuando se encuentran en
cultivos mixtos se completa mediante la separación de los productos
amplificados en geles de poliacrilamida con gradiente
desnaturalizante (DGGE).
Los cebadores seleccionados se derivan de la
secuencia nucleotídica presente en las regiones variables V1 y V2
identificadas en el gen 16S rRNA para cada una de las especies de
bacterias lácticas en estudio; para ello se ha obtenido mediante
secuenciación automatizada la secuencia nucleotídica completa de
dicho gen a partir de una cepa representativa de cada una de las
especies. La secuencia del gen de la transaldolasa se ha obtenido a
partir de trabajos anteriores [Requena, T., Burton, J., Matsuki,
T., Munro, K., Simon, M.A., Tanaka, R., Tannock, G.W. (2002) Appl.
Environ. Microbiol. 68:2420-2427]]. Los cebadores
seleccionados se caracterizan porque cada pareja específica de
oligonucleótidos diseñados, o de los derivados de la cadena
complementaria, solamente generan un producto de amplificación a
partir del ADN genómico procedente de la especie para la que fueron
diseñados (Fig. 1). La secuencia objeto de la amplificación con los
cebadores específicos puede estar representada también por ARN,
dependiendo del método de preparación de la muestra. Las parejas de
cebadores para cada una de las especies objeto de la invención se
describen a continuación:
- \bullet
- S. thermophilus: Se utilizan los cebadores específicos Thermfor; SEQ ID N01 y Thermrev: SEQ ID N02 que generan un producto de PCR de 157 pb.
- \bullet
- L. bulgaricus: Se utilizan los cebadores específicos Bulgfor: SEQ ID N03 y Bulgrev: SEQ ID N04 que generan un producto de PCR de 232 pb.
- \bullet
- L. acidophilus: Se utilizan los cebadores específicos Acidfor: SEQ ID N05 y Acidrev: SEQ ID N06 que generan un producto de PCR de 227 pb.
- \bullet
- L. casei: Se utilizan los cebadores específicos Casfor: SEQ ID N07 y Casrev: SEQ ID N08 que generan un producto de PCR de 142 pb.
- \bullet
- B. lactis: Se utilizan los cebadores específicos Forlac: SEQ ID N09 y Revlac: SEQ ID N010 que generan un producto de PCR de 116 pb.
Cuando los productos de PCR se van a separar
mediante DGGE, se añade a uno de los cebadores la abrazadera GC, es
decir, una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por
la secuencia SEQ ID N011. La selección del cebador óptimo para
contener la abrazadera GC se realiza experimentalmente a partir de
cada una de las especies con el objeto de obtener una escalera de
productos amplificados perfectamente separados, de manera que
mezclados constituyan un estándar de productos específicos
("ladder") de referencia para la identificación de las
especies en las muestras problema (Fig. 2).
La principal aplicación industrial del
procedimiento desarrollado es la detección e identificación de
diferentes especies de bacterias lácticas y bifidobacterias en
yogures y leches fermentadas que contienen cultivos mixtos de estas
bacterias, con el objeto de determinar la autenticidad de la
composición microbiológica mostrada en el etiquetado del producto.
El procedimiento descrito tiene aplicación tanto en investigación
como en el desarrollo industrial de productos y en el control de
calidad de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 Productos PCR: muestra un
electroforegrama de un gel de agarosa al 2% con los productos de
PCR obtenidos por amplificación de ADN de S. thermophilus y
de dos colonias cuantificadas como pertenecientes a esta especie
(carriles 2, 3 y 4). De forma similar se muestran los productos
equivalentes a partir de ADN y colonias de L. bulgaricus
(carriles 5, 6 y 7), L. acidophilus (carriles 8, 9 y 10),
L. casei (carriles 12,13 y 14) y B. lactis (carriles
15, 16 y 17). Los carriles 1, 11 y 18, son estándares de tamaño
molecular de fragmentos de ADN.
La Fig. 2 Separación DGGE mezcla productos
PCR: muestra un electroforegrama de un gel de poliacrilamida al
9% con un gradiente entre 40 y 60% de urea 7 M y formamida al 40%
con la mezcla de los productos de PCR específicos obtenidos del ADN
puro de cada especie ("ladder"; carriles 1 y 7) y de los
obtenidos a partir del ADN total extraído de leches fermentadas
empleando los cebadores específicos para S. thermophilus
(carril 2), L. bulgaricus (carril 3), L. casei
(carril 4), L. acidophilus (carril 5) y B. lactis
(carril 6).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento para la identificación de las
cinco especies mencionadas se aplicó para confirmar la enumeración
realizada en medios selectivos y diferenciales a partir de muestras
de leche fermentada comercial que indicaba en la etiqueta que
contenía dichas especies. La comprobación de la conformidad de los
recuentos se realizó en un 10% de las colonias crecidas en los
diferentes medios diferenciales o selectivos que se describen en la
Patente de invención Procedimiento para diferenciar y
cuantificar bacterias lácticas y bifidobacterias en leches
fermentadas que emplea medios de cultivo selectivos libres de
antibióticos Para ello se utilizaron los cebadores descritos en
la Tabla 1 y diseñados a partir del procedimiento descrito en la
presente invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las colonias en estudio crecidas en los medios
diferenciales y selectivos se suspendieron en 20 \muL de agua
milliQ estéril y se calentaron a 100ºC durante 5 min; a
continuación, la suspensión celular se congeló a -20ºC durante 24 h.
Para la PCR se emplearon 2 \muL de la suspensión descongelada y
se mezclaron con la pareja de cebadores correspondiente a la
especie objeto de identificación (Tabla 1), a la concentración
final en la reacción de 0,4 \muM para cada cebador. A la reacción
se añadieron los componentes estándar: dNTP (200 \muM), MgCl_{2}
(1,5 mM) y el tampón específico para la reacción con TaqPolimerasa
(Roche). La PCR es común para todas las parejas de cebadores: 35
ciclos con temperatura de desnaturalización a 94ºC, hibridación a
60ºC y elongación a 72ºC. Previo al primer ciclo de reacción las
muestras se incubaron a 94ºC durante 3 minutos y después de
finalizar el último ciclo se prolongó 5 minutos la elongación de
fragmentos a 72ºC, seguido de refrigeración a 4ºC. Los productos de
la reacción (5 \muL) se analizaron mediante electroforesis en gel
de agarosa al 2% para lo que previamente se centrifugaron las
muestras a 10.000 rpm durante 3 minutos con el objeto de sedimentar
los restos celulares presentes en la reacción.
La identificación de las colonias se realizó
mediante comparación de los productos amplificados procedentes de
las colonias problema con los del ADN procedente de cada una de las
especies puras (Fig. 1). La separación obtenida no es suficiente en
el caso de contar con cultivos mixtos en los que no se tengan
identificadas previamente las
cepas.
cepas.
El procedimiento descrito en la presente
invención también puede emplearse para la detección e
identificación específica de bacterias lácticas y bifidobacterias
sin necesidad de realizar la separación previa de las especies
mediante cultivo selectivo o diferencial. La detección e
identificación de las cinco especies se aplicó en el análisis de
muestras de leche fermentada comercial que indicaba en la etiqueta
que contenía dichas especies.
La obtención del ADN total de las muestras
(mezcla de ADN procedente de todas las especies) se realizó a
partir de 3 ml de leche fermentada, que se neutralizó a pH 6 con
NaOH 1M, a los que se añadieron 10 ml de EDTA al 0,2%, pH 12, para
dispersar las caseínas. Las células de sedimentaron mediante
centrifugación durante 15 minutos a 6.000 rpm. Para la extracción de
ADN, las células se rompieron con bolas de vidrio (diámetro de
150-212 \mum) y el ADN se precipitó con
isopropanol, previa eliminación de restos de material celular con
acetato amónico 10 M y una mezcla 24:1 de cloroformo:alcohol
isoamílico. El ADN total se purificó finalmente mediante
precipitación con etanol y se resuspendió en tampón
Tris-HCl 10 M, pH 8, y EDTA 1 M.
Para la PCR se utilizaron 500 ng de ADN total y
se siguieron las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo 1,
empleando los cebadores que se muestran en la Tabla 1, pero con la
diferencia de que se añadió la abrazadera GC en los cebadores SEQ
ID N01,4,5,7,10 ThermforGC, BulgrevGC, AcidforGC, CasforGC y
RevlacGC.
Los productos de PCR obtenidos se añadieron (1
\muL) a un gel de poliacrilamida al 9% con un gradiente entre 40
y 60% de urea 7 M y formamida al 40% y se separaron mediante
electroforesis a 130 V durante 4,5 horas.
Para la detección e identificación de las cinco
especies que se mencionan en la invención se preparó un estándar de
productos específicos ("ladder") obtenido de la mezcla de 0,5
\muL de cada uno de los fragmentos procedentes de la
amplificación del ADN puro de cada especie (Fig. 2, carriles 1 y 7).
La amplificación del ADN total obtenido de las leches fermentadas
con las parejas de cebadores específicos permite la detección e
identificación de las especies de bacterias lácticas y
bifidobacterias presentes en la muestra (Fig. 2, carriles 2 a
6).
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
\hskip1cmTabasco Rentero, Raquel
\hskip1cmPaarup, Torsten
\hskip1cmJaner Otero, Carolina
\hskip1cmPeláez Martínez, Carmen
\hskip1cmRequena Rolanía, Teresa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores
para leches fermentadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCRLACBIF
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipacgctgaaga gaggagcttg
\hfill20
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<212> DNA
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<213> Streptococcus
thermophilus
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<212> DNA
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<213> Lactobacillus bulgaricus
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskiptcaaagattc cttcgggatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus bulgaricus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacgcatcat tgccttggta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgagctga accaacagat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggccgttac cctaccaact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus casei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaccgagat tcaacatgga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus casei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccatctttc agccaagaac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgctgggct gctctggaag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcgacgag ctcatcgaca tact
\hfill24
Claims (30)
1. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas caracterizado por el uso de la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa mediante una única reacción con
cebadores que comprenden oligonucleótidos específicos de regiones
variables del gen 16S rRNA para las bacterias lácticas y del gen de
la transaldolasa para bifidobacterias.
2. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 1, caracterizado
porque se realiza la detección e identificación de diferentes
especies de bacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus,
L. casei, L. acidophilus) en cultivos mixtos con B.
lactis, especies habitualmente presentes en yogur y leches
fermentadas que contienen probióticos en mezcla de las cinco
especies o en las diferentes combinaciones binarias, ternarias o
cuaternarias obtenidas a partir de las cinco especies.
3. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 2,
caracterizado porque los cebadores seleccionados para las
bacterias lácticas se derivan de la secuencia nucleotídica presente
entre las regiones variables V1 y V2 del gen 16S rRNA y los
cebadores seleccionados para B. lactis se derivan de
regiones variables presentes en la secuencia nucleotídica del gen
de la transaldolasa.
4. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos
específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 y SEQ ID N02 que
generan un producto de PCR de 157 pb.
5. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos
específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 que
generan un producto de PCR de 232 pb.
6. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos
específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 y SEQ ID N06 que
generan un producto de PCR de 227 pb.
7. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos
específicos de L. casei, SEQ ID N07 y SEQ ID N08 que generan
un producto de PCR de 142 pb.
8. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizado por utilizar la pareja de oligonucleótidos
específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 que
generan un producto de PCR de 116 pb.
9. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado porque la identificación mediante
amplificación específica por PCR se complementa con la separación
de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida con gradiente desnaturalizante (DGGE) para lo que en
la reacción de PCR se añade a uno de los cebadores la abrazadera
GC, es decir, una extensión de nucleótidos en posición 5'
constituida por la secuencia SEQ ID N011.
10. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado
porque la identificación de S. thermophilus, se hace
añadiendo a SEQ ID N01 una extensión de nucleótidos en posición 5'
constituida por la secuencia SEQ ID N011.
11. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado
porque la identificación de L. bulgaricus, se hace añadiendo
a SEQ ID N04 una extensión de nucleótidos en posición 5'
constituida por la secuencia SEQ ID N011.
12. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado
porque la identificación de L. acidophilus, se hace
añadiendo a SEQ ID N05 una extensión de nucleótidos en posición 5'
constituida por la secuencia SEQ ID N011.
13. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado
porque la identificación de L. casei, se hace añadiendo a
SEQ ID N07 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida
por la secuencia SEQ ID N011.
14. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado
porque la identificación de B. lacti, se hace añadiendo a
SEQ ID N010 una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida
por la secuencia SEQ ID N011.
15. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado porque la amplificación de los fragmentos de
doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos
cebadores indicados en las reivindicaciones 1 a 8 correspondientes
a las cinco especies, a partir de una suspensión de las colonias,
calentada a 100ºC y congelada a -20ºC y bajo las siguientes
condiciones preferentes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos.
- \ding{51}
- 35 ciclos:
- \bullet Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
- \bullet Anillamiento a 60ºC
- \bullet Extensión a 72ºC
- \ding{51}
- Incubación a 72ºC durante 5 minutos seguidos de refrigeración a 4ºC y los productos de la PCR centrifugados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa.
16. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado porque la amplificación de los fragmentos de
doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos
cebadores indicados en las reivindicaciones 1 a 8 correspondientes
a las cinco especies, a partir de ADN total y bajo las siguientes
condiciones preferentes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos.
- \ding{51}
- 35 ciclos:
- \bullet Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
- \bullet Anillamiento a 60ºC
- \bullet Extensión a 72ºC
- \ding{51}
- Incubación a 72ºC durante 5 minutos seguidos de refrigeración a 4ºC y los productos de la PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa.
17. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 14,
caracterizado porque la amplificación de los fragmentos de
doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos
cebadores indicados en las reivindicaciones 9 a 14 correspondientes
a las cinco especies, a partir de ADN total y bajo las siguientes
condiciones preferentes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos.
- \ding{51}
- 35 ciclos:
- \bullet Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
- \bullet Anillamiento a 60ºC
- \bullet Extensión a 72ºC
- \ding{51}
- Incubación a 72ºC durante 5 minutos seguidos de refrigeración a 4ºC y 1 \muL de los productos de PCR se separan en un gel de poliacrilamida al 9% con un gradiente entre 40 y 60% de urea 7 M y formamida al 40%.
18. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según las reivindicaciones 15 y 16,
caracterizado porque utiliza como material de partida
colonias y cultivos de las especies bacterianas,
respectivamente.
19. Procedimiento para la detección e
identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas según la reivindicación 17, caracterizado
porque utiliza como material de partida leches fermentadas,
yogures, derivados lácteos o alimentos que los contengan o los
utilicen como ingredientes.
20. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 y SEQ ID N02 que
generan un producto de PCR de 157 pb que permite la detección e
identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches
fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 15 y 16.
21. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 que
generan un producto de PCR de 232 pb que permite la detección e
identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches
fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 5, 15 y 16.
22. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 y SEQ ID N06 que
generan un producto de PCR de 227 pb que permite la detección e
identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches
fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 15 y 16.
23. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de L. casei, SEQ ID N07 y SEQ ID N08 que generan
un producto de PCR de 142 pb que permite la detección e
identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches
fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR
según las reivindicaciones 1, 2, 3, 7, 15 y 16.
24. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 que
generan un producto de PCR de 116 pb que permite la detección e
identificación simultánea de esta bacteria en leches fermentadas y
cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las
reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 15 y 16.
25. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 con una extensión
de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID
N011 y SEQ ID N02 que generan un producto de PCR de 197 pb que
permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria
láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches
fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 10 y
17.
26. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 con
una extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la
secuencia SEQ ID N011 que generan un producto de PCR de 272 pb que
permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria
láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches
fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 11 y
17.
27. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 con una extensión
de nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID
N011 y SEQ ID N06 que generan un producto de PCR de 267 pb que
permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria
láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches
fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 12 y
17.
28. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de L. casei, SEQ ID N07 con una extensión de
nucleótidos en posición 5' constituida por la secuencia SEQ ID N011
y SEQ ID N08 que generan un producto de PCR de 182 pb que permite
la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica
en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas
por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 13 y 17
29. Pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 con una
extensión de nucleótidos en posición 5' constituida por la
secuencia SEQ ID N011 que generan un producto de PCR de 156 pb que
permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria
en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas
por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 14 y 17.
30. Kit de diagnóstico por PCR para la detección
e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y
bifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de
leches fermentadas caracterizado por amplificar un fragmento
del gen 16S rRNA para las bacterias lácticas y del gen de la
transaldolasa para bifidobacterias según los procedimientos
descritos en las reivindicaciones 1 a 17 y por emplear los
cebadores descritos en las reivindicaciones 18 a 29.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601788A ES2322827B1 (es) | 2006-07-03 | 2006-07-03 | Procedimiento para la deteccion e identificacion simultanea y especifica de bacterias lacticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas. |
| PCT/ES2007/070124 WO2008003811A1 (es) | 2006-07-03 | 2007-07-02 | Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601788A ES2322827B1 (es) | 2006-07-03 | 2006-07-03 | Procedimiento para la deteccion e identificacion simultanea y especifica de bacterias lacticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas. |
Publications (2)
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|---|---|
| ES2322827A1 ES2322827A1 (es) | 2009-06-29 |
| ES2322827B1 true ES2322827B1 (es) | 2010-04-23 |
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ID=38894230
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200601788A Expired - Fee Related ES2322827B1 (es) | 2006-07-03 | 2006-07-03 | Procedimiento para la deteccion e identificacion simultanea y especifica de bacterias lacticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas. |
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2006
- 2006-07-03 ES ES200601788A patent/ES2322827B1/es not_active Expired - Fee Related
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2007
- 2007-07-02 WO PCT/ES2007/070124 patent/WO2008003811A1/es not_active Ceased
Non-Patent Citations (4)
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| GUEIMONDE M. et al. Viability and diversity of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium populations included in commercial fermented milks. Food Research International. 2004, Vol. 37, páginas 839-850. ISSN 0963-9969. * |
| RANDAZZO C. et al. Diversity, dynamics and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysis. Applied and Environmental Microbiology. Abril 2002, Vol. 68, N$^{o}$ 4, páginas 1882-1892. ISSN 0099-2240. * |
| REQUENA T. et al. Identification, detection and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the Transaldolase Gene. Applied and Environmental Microbiology. Mayo 2002, Vol. 68, N$^{o}$ 5, páginas 2420-2427. ISSN 0099-2240. * |
| SATOKARI R. M. et al. Molecular approaches for the detection and 4,5,7(en\\ identification of bifidobacteria and lactobacilli in the human parte),13,\\ gastrointestinal tractSystematic and Applied Microbiology. 2003, Vol. 26, páginas 572-584. ISSN 0723-2020. 21(en\\ parte) * |
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