ES2323218T3 - Aislamiento y caracterizacion del receptor de la hormona que libera a la hormona del crecimiento. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la identificación de complejos receptor-ligando específicos para la hormona que libera la hormona del crecimiento que comprende: a) marcaje del ligando; b) incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento; c) medición del ligando total unido; d) incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento en presencia de ligando no marcado; e) medición del ligando total unido; y f) determinación de la unión específica, caracterizado porque las etapas de incubación b) y d) se llevan a cabo en presencia de un antibiótico formador de poros.

Description

Aislamiento y caracterización del receptor de la hormona que libera a la hormona del crecimiento.

Campo de la invención

Esta invención está dirigida al aislamiento de receptores hormonales y, más particularmente, está dirigida a métodos y composiciones útiles para purificar el receptor de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento, y al aislamiento del receptor de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento purificado.

Antecedentes de la invención

La hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH) es secretada por el hipotálamo y estimula la liberación de la hormona del crecimiento (GH) en la pituitaria anterior. La GHRH es un miembro de una familia de péptidos homólogos que incluye glucagón, secretina, VIP (péptido intestinal vasoactivo), PHI (péptido histidina isoleucina), PACAP (péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria), GIP (péptido inhibidor gástrico) y helodermina. La GHRH ha sido objeto de un estudio considerable, pero se sabe poco acerca del receptor de GHRH, GHRH-R, al cual se une la GHRH en la pituitaria anterior para inducir la liberación de GH.

La producción a gran escala del receptor de GHRH clonado permitiría la selección de un gran número de análogos de la GHRH y facilitaría el desarrollo de agonistas y antagonistas mejorados para la terapia clínica de trastornos del crecimiento. Más específicamente, la selección de un gran número de análogos y xenobióticos por su actividad GHRH conduciría al desarrollo de agonistas mejorados para ser utilizados en la terapia clínica de niños deficientes en hormona del crecimiento, y en la terapia clínica de adultos para mejorar su nutrición y para alterar la composición corporal (músculo frente a grasa). Tal selección, asistida posiblemente por modelado mediante ordenador basado en la estructura de los receptores, podría conducir también a agonistas no peptídicos de la GHRH oralmente activos que serían especialmente útiles en la práctica médica y veterinaria, por ejemplo, para desarrollar ganado con una producción de leche de mayor rendimiento y ganado más magro con mayor rendimiento.

La explotación comercial de fármacos que interaccionan con el GHRH-R requerirá una fuente de una forma purificada de GHRH-R y ensayos de unión adecuados.

El aislamiento y el clonaje del receptor de la GHRH y su expresión in vitro conducirían también a: (1) Estudios de hibridación in situ que mapeen la distribución de los receptores de la GHRH por todo el organismo y al examen de su papel fisiológico potencial fuera de la pituitaria; esto podría revelar funciones potenciales de la GHRH en el cerebro, las gónadas, el páncreas, la placenta y el intestino, donde se cree que se concentra el péptido. (2) Estudios de la estructura del receptor que implican a receptores mutados o quiméricos para explorar las relaciones estructura/función y las interacciones con el segundo mensajero en la búsqueda de moléculas agonistas/antagonistas diseñadas específicamente. (3) Una comprensión de la relación evolutiva de los GHRH-R con otros receptores unidos a proteína G, especialmente los de la familia glucagón/secretina/VIP. (4) El clonaje de otros miembros de esta subfamilia que se espera que tengan similitud de secuencias.

Existen varias rutas alternativas para obtener clones de receptores funcionales, tales como: A. Purificación de la proteína del receptor para obtener una secuencia parcial de la proteína; esta secuencia parcial de la proteína podría ser utilizada posteriormente para someter a selección al ADN apropiado por la secuencia de nucleótidos correspondiente. B. La selección de ADN por secuencias similares a receptores conocidos que se piensa que están relacionados con el receptor de la GHRH. C. La selección de ADN que, cuando se expresa como proteína, produce el receptor de GHRH, el cual sería detectado por su unión a la GHRH, por su actividad biológica o por un anticuerpo hacia el receptor de GHRH. Observar que cualquier método de clonaje concebible requiere ensayos de unión así como ensayos funcionales con la GHRH y péptidos relacionados para identificar el receptor de la GHRH y para caracterizar los clones expresados.

Existe por tanto la necesidad de ensayos de unión de la GHRH y composiciones para ser utilizadas en los mismos que ayudarán a caracterizar y a aislar el receptor de la GHRH. En particular, existe la necesidad de métodos que puedan caracterizar al receptor de la GHRH de la pituitaria en términos de tamaño, glicosilación, solubilidad y estabilidad del complejo receptor (GHRH-R)-ligando (GHRH o análogo de la GHRH), con el fin de que puedan desarrollarse métodos para purificar la proteína del receptor e identificar los clones del receptor. Existe también la necesidad de GHRH-R purificado o parcialmente purificado y de métodos para obtener el mismo. Por GHRH-R parcialmente purificado se indica que se ha formado un aislado de GHRH-R que tiene GHRH-R aislado de la mayoría de la matriz orgánica de las células de la pituitaria anterior. El aislado de GHRH-R tiene una pureza suficiente para permitir la determinación de la secuencia del GHRH-R, entendiéndose que esto puede requerir una purificación posterior para eliminar cualquier compuesto remanente que pudiera interferir con la secuenciación, tal como las proteínas G. No obstante, el aislado de GHRH-R de la presente invención, producido utilizando el método de extracción y aislamiento de la presente invención, contiene GHRH-R preferiblemente a una concentración mayor que a la que está presente el GHRH-R de manera natural en la pituitaria anterior, y el aislado de GHRH-R puede ser purificado posteriormente, si es necesario, utilizando SDS-PAGE para eliminar cualquier compuesto que pudiera interferir con la secuenciación del GHRH-R. Por tanto, la presente invención incluye también la producción de GHRH-R de pureza suficiente para llevar a cabo la secuenciación, o para ser utilizado en bioensayos de la actividad de unión del GHRH-R.

Históricamente ha sido difícil trabajar con el GHRH-R, debido a que la GHRH tiene una unión no específica muy elevada (haciendo difícil determinar si la GHRH o los análogos de la GHRH se están uniendo específicamente o no al GHRH-R), y el GHRH-R tiene una abundancia extremadamente baja. La unión no específica de los análogos de la GHRH al material de vidrio y de plástico ha sido un problema importante en el trabajo anterior, limitando la precisión y la reproducibilidad de los estudios de unión a receptores. Debido a la naturaleza "pegajosa" del péptido GHRH cargado negativamente, ha sido imposible la utilización de un ensayo de unión de tipo filtración simple. Las cuentas no específicas son tan elevadas que impiden la detección de la unión específica. Además, el agente bloqueante polietilenimina comúnmente utilizado, que se emplea para bloquear la unión no específica de proteínas sobre filtros de fibra de vidrio, está cargado positivamente, y se unirá de manera no específica a los análogos de GHRH (cargados negativamente). Además, no ha estado disponible una preparación de receptores solubles con afinidad de unión elevada que mejoraría enormemente los esfuerzos para purificar el GHRH-R.

Los estudios anteriores han caracterizado el receptor de GHRH con respecto a su afinidad por sondas, tales como GHRH y péptidos relacionados, y la unión a proteína G. Se han realizado también intentos para utilizar entrecruzadores químicos no específicos para marcar el receptor de GHRH. Ver, por ejemplo, Zysk y col., "Cross-Linking of a Growth Hormone Releasing Factor-Binding Protein in Anterior Pituitary Cells", J. Biol. Chem., 261:1678 (1986) y Velicelebi et al., "Covalent Cross-Linking of Growth Hormone-Releasing Factor to Pituitary Receptors", Endocrinology, 118:1278 (1986). Los resultados de estos dos estudios sugieren, respectivamente, la presencia de un receptor de GHRH de 26 kDa y de un receptor de 70 kDa en la pituitaria anterior. La discrepancia entre el peso molecular encontrado en estos dos estudios enfatiza las dificultades implicadas en el aislamiento y caracterización del GHRH-R, y la necesidad de métodos y composiciones mejorados útiles para el aislamiento y caracterización del GHRH-R.

Se cree que la unión de la GHRH a la pituitaria anterior de rata está influenciada por GTP, que hace que el receptor de GHRH reduzca su afinidad por la GHRH (se dice que GTP desacopla el complejo proteína G-receptor de GHRH). Se cree que el estado de alta afinidad del GHRH-R unido a GHRH está estabilizado por interacciones con una proteína reguladora de los nucleótidos de guanina para formar un complejo ternario hormona-receptor-proteína G. Se ha hipotetizado que GTP desestabiliza las interacciones proteína G-receptor, lo cual tiene como resultado la disociación del complejo GHRH/GHRH-R-proteína G y la reversión del receptor independiente a un estado de baja afinidad, mientras que la proteína G liberada continúa activando su sistema de segundo mensajero respectivo. Ver Struthers y col., "Nucleotide Regulation of Growth Hormone-Releasing Factor Binding to Rat Pituitary Receptors", Endocrinology, 124:24-29 (1989).

Se ha descubierto que, en tejidos de pituitaria anterior ovina y bovina, la GHRH y sus análogos son desplazados por concentraciones de GHRH_{a} de 500 a 1.000 veces menores que VIP o PACAP. Este hallazgo es complementario a las propiedades de unión observadas en el páncreas humano (una fuente de receptores de secretina y VIP), en el que la capacidad para estimular adenilato ciclasa en presencia de GTP muestra un orden de potencia de secretina > helodermina > PHI \geq VIP > GHRH(1-27)NH_{2}. De manera similar, utilizando ^{125}I-secretina, las Kds obtenidas fueron secretina 0,8 nM, helodermina 200 nM, PHI 250 nM. VIP y GHRH(1-29)-NH_{2} inducen solamente un 20% de inhibición a 10 \muM.

A dosis suprafisiológicas, se sabe que la GHRH actúa en los receptores de VIP, y a la inversa, el VIP es un débil agonista de GHRH.

Otros artículos que proporcionan información básica sobre el aislamiento y caracterización de receptores hormonales incluyen:

El resumen Nº 175248g del Chemical Abstracts, 1991, Vol. 115, Nº 17, página 135, describe la caracterización parcial del receptor de GHRH mediante entrecruzamiento de GHRH marcada con ^{125}I con células de timo de rata con el sustrato disuccinimidilo seguido por PAGE y autorradiografía.

El resumen Nº 35929f del Chemical Abstracts, 1988, Vol. 109, Nº 5, página 442, describe la caracterización de las propiedades de unión del receptor de GHRH de pituitaria humana, utilizando como ligando el análogo de GHRH radiomarcado ^{125}I-GHRH_{a}.

Christophe et al., "The VIP/PHI/secretin-helodermin/helospectin/GRH Family: Structure-Function Relationship Of The Natural Peptides, Their Precursors And Synthetic Analogs As Tested in vitro On Receptors And Adenylate Cyclase In A Panel Of Tissue Membranes", en Peptide Hormones As Prohormones: Processing. Biological Activity. Pharmacology, Ed. Jean Martinez, Pub. Ellis Horwood Lim. 1989, Chichester, Inglaterra. Baburthe y col., "Molecular Analysis of Vasoactive Intestinal Peptide Receptors: A Comparison With Receptors for VIP Related Peptides", Ann. NY Acad. Sci., 527:296-313 (1988). Frohm y col., "Growth Hormone-Releasing Hormone", Endocr. Rev., 7:223-253 (1986). Seifert y col., "Growth Hormone-Releasing Factor Binding Sites In Rat Anterior Pituitary Membrane Homogenates: Modulation By Glucocorticoids", Endocrinology, 117:424-426 (1985). Bilezikjian y col., "Desensitization To Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) Is Associated With Down-Regulation of GRF-Binding Sites", Endocrinology, 118:2045-2052 (1986). Ishihara y col., "Functional Expression and Tissue Distribution of a Novel Receptor for Vasoactive Intestinal Polypeptide", Neuron., 8:811-819 (1992). Ishihara y col., "Molecular Cloning and Expression of a cDNA Encoding the Secretin Receptor", EMBO J, 10:1635-1641 (1991). Lin y col., "Expression Cloning of an Adenylate Cyclase-Coupled Calcitonin Receptor", Science, 254:1022-1024 (1991). Juppner y col., "A G Protein-Linked Receptor For Parathyroid Hormone and Parathyroid Hormone-Related Peptide", Science, 254:1024-1026 (1991). Frohman y col., "Tissue Distribution and Molecular Heterogeneity of Human Growth Hormone-Releasing Factor in the Transgenic Mouse", Endocrinology, 127:2149-2156 (1990). Paul et al., "Characterization of Receptors for Vasoactive Intestinal Peptide Solubilized From the Lung", J. Biol. Chem., 262:158-162 (1987). Guijarro y col., "Solubilization of Active and Stable Receptors for Vasoactive Intestinal Peptide from Rat Liver", Regulatory Peptides, 25:37-50 (1989). Cronin y col., "Biological Activity of a Growth Hormone Releasing Factor Secreted By a Human Tumor", Am. J. Physiol., 244 (Endocrinol. Metab.) E346-E353 (1983). Leong y col., "Enumeration of Lactotropes and Somatotropes in Cultured Male and Female Pituitary Cells: Evidence in Favor of a Mammosomatotrope Subpopulation", Endocrinology, 116:1371-1378 (1985). Munson y col., "Ligand: a Versatile Computerized Approach For Characterization of Ligand-Binding Systems", Anal. Biochem., 107:220-239 (1980). Wessel y col., "A Method for the Quantitative Recovery of Protein in Dilute Solution in the Presence of Detergents and Lipids", Anal. Biochem., 138:141-143 (1984). Bagnato y col., "Gonadotropin-Induced Expression of Receptors for Growth Hormone Releasing Factor in Cultured Granulosa Cells*", Endocrinology, 128:2889-2894 (1991) (las composiciones estudiadas por Bagnato y col. muestran propiedades de unión de la GHRH que son diferentes de las propiedades de unión de los tejidos de pituitaria). Todos los artículos y otros documentos mencionados en la presente son incorporados por referencia como si fueran reproducidos íntegramente más adelante.

Aunque los estudios precedentes han sido útiles para desarrollar una comprensión preliminar del comportamiento del GHRH-R, persiste la necesidad de un ensayo sensible y reproducible para el GHRH-R que permitiría la caracterización adicional del GHRH-R, conduciendo a la purificación y clonaje del GHRH-R. Tal ensayo debe resolver los problemas de la unión no específica de la GHRH y de los análogos de GHRH, y de la escasa abundancia del receptor de GHRH. La yodación y la purificación de análogos de GHRH con una elevada actividad específica resultante, permite la mejora de la unión específica a membranas brutas de la pituitaria anterior.

Por tanto, es un objeto primario de la presente invención desarrollar un ensayo sensible y reproducible para determinar la unión de GHRH.

Es un objeto adicional de la presente invención desarrollar reactivos para marcar específicamente e inequívocamente el receptor de GHRH.

Es otro objeto todavía más de la presente invención desarrollar un esquema de purificación del receptor de GHRH y obtener un aislado de GHRH-R de pureza suficiente, o capaz de ser purificado fácilmente hasta una pureza suficiente, para permitir al menos la secuenciación parcial del GHRH-R.

Por tanto, es un objeto más de la presente invención producir GHRH-R purificado.

Resumen de la invención

Estos y otros objetos de la presente invención se consiguen mediante un ensayo de unión de GHRH mejorado que conduce al aislamiento de un extracto bruto de GHRH-R (aislado). El GHRH-R es caracterizado mediante la utilización de sondas radioyodadas formadas a partir de análogos de la GHRH. Los análogos de la GHRH (GHRH_{a} o GHRH_{b}) y otros análogos son yodados utilizando yodoesferas en fase sólida, y el material monoyodado es purificado mediante HPLC de fase reversa con el fin de que esté esencialmente libre de transportador. La unión no específica de los análogos de GHRH al material de vidrio y plástico durante el suministro y la dilución ha sido sustancialmente eliminada mediante la utilización de solventes orgánicos. En una realización preferida, se utiliza acetonitrilo al cincuenta por ciento para la dilución y el suministro de los análogos de GHRH. La unión específica de GHRH y GHRH_{a} a pellas de membranas de la pituitaria anterior brutas es incrementada por la adición de un antibiótico formador de poros. En una realización preferida, el antibiótico alameticina (a 0,05 mg/ml aproximadamente) es combinado con pellas de membranas de la pituitaria anterior homogeneizadas para incrementar la unión específica de la GHRH.

Se han preparado análogos de la GHRH que contienen grupos de entrecruzamiento sensibles a UV (fotosondas o sondas de fotoafinidad) que muestran una elevada afinidad específica, sensibles a GTP, que se entrecruzan con el receptor de GHRH. Las sondas difieren en la posición del grupo fotosensible y en la longitud del brazo separador. Las fotosondas preferidas son formadas acoplando el análogo de GHRH [His^{1}, Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2} a N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS), o a hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino) (sulfo-SANPAH o SANPAH), seguido por yodación y purificación. Preferiblemente, el acoplamiento al reactivo ANB-NOS está dirigido a las lisinas en las posiciones 12 ó 21; el compuesto es yodado posteriormente en la tirosina de la posición 10, y el producto es purificado mediante HPLC de fase reversa para formar una fotosonda que será referida como ^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS. En una realización alternativa, la fotosonda ^{125}I-GHRH_{a}-SANPAH es formada en un sistema de solventes de dimetilformamida por acoplamiento de SANPAH dirigido hacia la histidina N-terminal de GHRH_{a}, purificación por HPLC de fase reversa, yodación de la tirosina en la posición 10 de la GHRH_{a} y repurificación por HPLC.

Se ha descubierto sorprendentemente que, mediante la utilización de las sondas de fotoafinidad anteriormente mencionadas, es posible producir un complejo soluble de GHRH_{a} unido a GHRH-R; el complejo entrecruzado covalentemente es fácilmente soluble en una solución de detergente suave, conteniendo preferiblemente un compuesto detergente zwitteriónico capaz de solubilizar proteínas, tal como 3-[(3-colamidopropil)-dimetil-amonio]-1-propano sulfonato (referido como CHAPS, disponible en Pierce o en ICN Biomedicals, de Irvine, California), y que la mayoría de los contaminantes entrecruzados de manera no específica no son solubles en la solución de detergente suave. Se descubrió posteriormente que los complejos no entrecruzados eran también solubilizados bajo estas condiciones. El fotoentrecruzamiento fue realizado después de la solubilización y demostró que el receptor (GHRH-R) y el ligando (GHRH-sonda) habían formado un complejo soluble estable. En una realización preferida, esto permite la eliminación de hasta un 90% aproximadamente de la GHRH unida de manera no específica mediante la extracción con una solución conteniendo CHAPS, y la eliminación del péptido libre con carbón vegetal/dextrano. Esto tiene como resultado un ensayo de unión de la GHRH enormemente mejorado.

En una realización más, se obtiene un aislado de GHRH-R parcialmente purificado mediante cromatografía de afinidad por la unión de una función a GHRH o a un análogo de GHRH, la cual tiene afinidad por un compuesto inmovilizado en un soporte. En una realización preferida, derivados biotinilados de GHRH_{a} son unidos a GHRH-R, solubilizados y luego inmovilizados en una columna de estreptavidina. Se ha descubierto que el complejo GHRH unida/GHRH-R se disocia a pH 5,0 en un tampón, formando así un aislado de GHRH-R parcialmente purificado capaz de ser utilizado para determinar la secuencia de residuos de aminoácidos del GHRH-R, lo cual en una realización preferida tiene lugar después de la purificación posterior del aislado de GHRH-R utilizando SDS-PAGE para eliminar compuestos, tales como las proteínas G, que interferirían con la secuenciación, y formando con ello GHRH-R purificado.

Descripción de las figuras

La figura 1 es un gráfico de barras que demuestra la unión de ^{125}I-GHRH_{a} a pellas de membranas brutas de pituitaria ovina. Las barras indican la fracción de las cuentas totales unida a las pellas después de la incubación con la sonda sola o en presencia de GHRH_{a} 10 nM o de GTP\gammaS 50 \muM. Se muestran cuatro cajas diferentes (grupos de barras). La primera caja (membrana) muestra la unión a una preparación de pellas de membranas brutas. El segundo grupo (congelada) muestra que existe poca unión específica en la misma preparación de membranas después de que ha sido congelada y descongelada. El tercer grupo (DTT) muestra la unión a esta misma preparación (no congelada), pero en presencia de DTT 1 mM. El cuarto grupo (ala-lavado) muestra un protocolo mejorado de la presente invención que incluye el antibiótico formador de poros alameticina y una etapa de lavado adicional. Las barras de error indican el error estándar de la media y N = 3 ó 4 replicados por punto.

La figura 2 es una gráfica utilizada para el análisis de la unión de saturación. Los puntos son datos procedentes de ensayos de unión realizados en presencia de niveles crecientes de GHRH_{a} no marcado. Las barras de error indican el error estándar de la media. La figura insertada muestra la representación gráfica de los mismos datos y la curva en el sistema de coordenadas de Scatchard (en la gráfica insertada no se muestran las barras de error).

La figura 3 es un radiografía de un gel de SDS que demuestra el entrecruzamiento del receptor con fotoafinidad. Se demuestra el entrecruzamiento con membranas brutas de pituitaria ovina con dos fotosondas diferentes (SANPAH y ANB-NOS), extraída cada una por dos métodos diferentes (SDS y CHAPS). Se muestra también en cada caso el efecto de enzimas desglicosiladores. Los extractos de CHAPS muestran una unión no específica enormemente reducida. Ambas fotosondas marcan una banda de 55 kDa que se desplaza hasta 45 kDa después de la desglicosilación.

La figura 4 es una radiografía de un gel de SDS igual que en la figura 3 que muestra el entrecruzamiento de ANB-NOS extraído con CHAPS, demostrando la competición por GHRH 10 nM, y que muestra también la desglicosilación.

La figura 5 es una radiografía de un gel de SDS del entrecruzamiento de fotoafinidad igual que en la figura 4, que incluye los efectos de GTP\gammaS y también la desglicosilación parcial con neuraminidasa.

La figura 6 demuestra la solubilidad de los complejos GHRH_{a}-GHRH-R que fueron preparados permitiendo la unión de GHRH_{a} radioyodado a membranas brutas de pituitaria ovina, en presencia o ausencia de GHRH_{a} no marcado 10 nM.

La figura 7 demuestra el entrecruzamiento de fotoafinidad de los complejos solubles producidos siguiendo el experimento de la figura 6 con la fotosonda ANB-NOS-GHRH_{a}, y la fracción soluble en detergente fue entrecruzada con UV después de la extracción. Las dos calles más a la izquierda fueron extraídas con CHAPS y las dos calles de la derecha fueron extraídas con desoxicolato.

La figura 8 demuestra la estabilidad de los complejos GHRH_{a}-GHRH-R solubilizados con CHAPS, tratados con carbón vegetal/dextrano, que fueron expuestos a GTP\gammaS 50 \muM (\pm Mg^{++} 5 mM), DTT 10 nM o Triton X-100 al 1% durante 30 minutos y posteriormente tratados de nuevo con carbón vegetal/dextrano para cuantificar el nivel de disociación.

La figura 9 demuestra la disociación de los complejos GHRH-GHRH-R solubles a pH bajo, con la estabilidad de los complejos solubles específicos a pH variable evaluada como en la figura 8. Datos adicionales indican que se obtiene una disociación casi completa a pH 5 o inferior.

La figura 10 demuestra el análisis mediante SDS-PAGE del eluato, que contiene GHRH-R purificado, obtenido de la cromatografía de afinidad del complejo GHRH_{b}-GHRH-R con el receptor biotinilado en una columna de estreptavidina agarosa.

Descripción detallada de la invención

Una aproximación global al clonaje del receptor de GHRH implica (1) la caracterización del receptor de GHRH, (2) la utilización del conocimiento de las características del receptor de GHRH para aislar el receptor de GHRH, (3) la determinación de la secuencia peptídica del receptor de GHRH (o de una porción del receptor de GHRH), (4) la determinación de la secuencia de ADN que es responsable de la producción del receptor de GHRH mediante la utilización de secuencias oligonucleotídicas degeneradas para someter a selección a una biblioteca de ADNc y (5) el clonaje de la secuencia de ADN.

Caracterización del GHRH-R Ensayo de Unión de la GHRH

En un aspecto, la presente invención está dirigida a un ensayo sensible y reproducible para determinar la unión de GHRH al receptor de GHRH, que demuestra una unión reversible de alta afinidad específica de GHRH, dependiente de GTP. Debido a la elevada unión no específica del péptido GHRH cargado negativamente, ha sido imposible la utilización de un ensayo de unión simple de tipo filtración. Con el ensayo de la presente invención, la unión específica (definida como las cuentas de radiación gamma, \gamma, producidas por la unión de ^{125}I-GHRH_{a} que son eliminadas de las pellas de membranas homogeneizadas por GHRH_{a} 10 nM) es del 30 al 60% de las cuentas totales unidas en pellas de membranas brutas y hasta el 90% de las cuentas después de la extracción con un detergente suave (por ejemplo CHAPS) y del tratamiento con carbón vegetal/dextrano. Una realización preferida del ensayo de unión de la presente invención implica muchos factores, incluyendo un protocolo de yodación suave en fase sólida, purificación por HPLC del radioligando libre de transportador, un sistema de solventes orgánicos para el suministro cuantitativo de GHRH_{a}, ensayos en células plaqueadas y ensayos reversos de placas hemolíticas para confirmar la actividad biológica de la sonda, y la utilización de 0,05 mg/ml aproximadamente de alameticina, un antibiótico formador de poros, para incrementar la unión específica del radioligando a pellas de membranas de la pituitaria anterior. La alameticina incrementa la unión específica y disminuye las cuentas atrapadas. Un lavado disminuye la cuentas recuperadas pero mejora posteriormente la cantidad relativa de unión específica.

Un análogo de GHRH preferido para los estudios de unión a receptores es [His^{1}, Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2} (referido como GHRH_{a}). El análogo de GHRH es un péptido que tiene buena actividad de unión a GHRH-R y difiere de la secuencia humana en longitud, y tiene dos aminoácidos que son alterados para facilitar su utilización como sustrato para la yodación. Una fuente preferida de GHRH_{a} es Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

La preparación de análogos de GHRH yodados con actividad específica y actividad biológica óptimas se realiza yodando primeramente los análogos de GHRH (incluyendo las fotosondas) mediante la utilización de yodoesferas en fase sólida (tales como las disponibles en Pierce), y posteriormente el material monoyodado es purificado para que esté esencialmente libre de transportador mediante HPLC de fase reversa utilizando preferiblemente una columna Poly F de Bio-Series basada en fluorocarbono (disponible en Mac-Mod). La dilución cuantitativa y el suministro de los análogos de GHRH se obtiene utilizando solventes orgánicos; se emplea preferiblemente como vehículo una solución de acetonitrilo al 50% en agua. De este modo se evitan las diluciones inexactas y no reproducibles encontradas con los vehículos acuosos.

Se ha descubierto sorprendentemente que se obtiene un incremento de tres veces de la unión específica aproximadamente, en comparación con la metodología anterior, cuando se combina un antibiótico formador de poros con pellas de membranas de la pituitaria anterior brutas (ver Struthers y col., Endocrinology, 124:24 (1989)). En una realización preferida, se utiliza la adición de 50 \mug/ml aproximadamente del antibiótico alameticina para obtener una unión específica óptima.

Con referencia a la figura 1, se presenta la unión de la sonda ^{125}I-GHRH_{a} a pellas de membranas brutas que han sido tratadas bajo diferentes condiciones. Hay cuatro grupos de tres barras. Cada barra dentro de un grupo indica la fracción de cuentas totales unida después de la incubación con la sonda yodada. En cada grupo de tres barras, la barra de la izquierda indica las cuentas totales unidas después de la incubación con la sonda yodada sola, sin pre-exposición de las membranas a GHRH fría o a otro compuesto que sabe que compite con GHRH_{a} o que interfiere con la unión de GHRH_{a}. La barra del centro indica la fracción de las cuentas totales unida después de la incubación con la sonda yodada que ha sido añadida a la incubación junto con GHRH_{a} no marcada 10 nM (que compite por los sitios de unión específica). La diferencia entre la barra de la izquierda y la barra central de cada grupo de barras indica la unión específica de GHRH, que representa la cantidad de GHRH-R presente. La barra de la derecha indica la fracción de las cuentas totales unida después de la incubación con la ^{125}I-sonda en presencia de GTP\gammaS 50 \muM. Como se sabe que GTP\gammaS causa la disociación de la proteína G de algunos complejos de receptores resultando en una afinidad menor y una unión disminuida, la disminución de la unión específica cuando se utiliza GTP\gammaS es consistente con la presencia del complejo GHRH-R-proteína G.

Se define la unión específica como la diferencia entre la unión observada con análogo yodado 20 pM solo y la unión del análogo en presencia de GHRH_{a} no yodado 10 nM. La unión de saturación, el análisis de Scatchard, los estudios de competición y otros datos discutidos en la presente muestran que estos sitios de alta afinidad son sitios de unión específica.

Con referencia a la figura 2, los estudios de unión de saturación demuestran la unión del análogo de GHRH [His^{1}, Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2} (GHRH_{a}) a un único sitio de alta afinidad con una Kd de 160 pM aproximadamente. Algunas barras de error fueron demasiado pequeñas para poder ser mostradas (N = 6 replicados por punto). Este dato fue analizado con el programa de ordenador Lingand, que determina las constantes de unión sobre la base de un ajuste de mínimos cuadrados ponderado estadísticamente a la ecuación de unión del ligando en un sistema de coordenadas no transformadas. El programa informa de un único sitio de unión con una K_{d} = 150 \pm 10 pM y R = 1,5 \pm 0,09 pmoles/g de tejido (mejor valor de ajuste = ESM aproximado del ajuste). Los análisis estadísticos apoyan este modelo de un único sitio de unión. La línea discontinua es la curva teórica generada utilizando estas constantes en la ecuación de unión.

La unión específica del radioligando GHRH_{a} es reducida hasta el 65% por GTP\gammaS 50 \muM. Los péptidos relacionados VIP y PACAP no competían por este sitio de unión a concentraciones de 100 nanomolar. Esta unión representa un GHRH-R unido a proteína G de alta afinidad. Se sabe que la unión de VIP al receptor de VIP es sensible a los agentes reductores de sulfhidrilo. Tal unión específica en el ensayo de GHRH es eliminada completamente por la preincubación con ditiotreitol 1 mM (DTT, que se sabe que impide la unión de alta afinidad a receptores relacionados), apoyando así adicionalmente la conclusión de que el receptor GHRH-R es el sitio de unión.

Sondas de fotoafinidad

Se prepararon sondas de fotoafinidad utilizando agentes de entrecruzamiento fotorreactivos; estas sondas difieren en la posición del grupo fotosensible y en la longitud del brazo separador. Las sondas con capaces de unirse a GHRH-R en ausencia de radiación UV y de entrecruzarse con GHRH-R bajo el influjo de radiación UV. A continuación se citan ejemplos preferidos no limitantes de sondas de fotoafinidad y métodos para producir las mismas:

1)^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS

El análogo de GHRH de 32 aminoácidos [His^{1}, Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2} (GHRH_{a}), fue acoplado al reactivo N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS) dirigido a la lisina 12 o 21 para formar GHRH_{a}-ANB-NOS. La GHRH_{a}-ANB-NOS fue yodada utilizando yodoesferas para formar el radioligando ("fotosonda" ^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS, "GHRH_{a}-ANB-NOS caliente" o "fotosonda caliente") (las yodoesferas preferidas están disponibles en Pierce, Rockford, IL).

2)^{125}I-GHRH_{a}-SANPAH

En un sistema de solventes de dimetilformamida, el análogo de GHRH [His^{1}, Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2} en lugar de a N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS), fue acoplado a hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino) (sulfo-SANPAH o SANPAH) dirigido a la histidina N-terminal de GHRH_{a}. El material radioyodado fue luego purificado para que estuviera esencialmente libre de péptido de partida mediante HPLC de fase reversa en una columna Poly F de Bio Series basada en fluorocarbono (disponible en Mac-Mod Analytical, Chadds Ford, PA) utilizando un gradiente de acetonitrilo de poca pendiente.

La unión de la fotosonda en pellas de membranas de pituitaria ovina fue determinada mediante contaje \gamma y se examinó el entrecruzamiento inducido por UV por autorradiografía de geles de electroforesis en dodecilsulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE). La sonda ^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS se unía con una afinidad de un nanomol aproximadamente, nM (en comparación con 160 picomoles aproximadamente, pM, para GHRH_{a}). La SDS-PAGE reveló una banda a 55 kDa aproximadamente para la pituitaria ovina (57 kDa en pituitaria bovina), que fue completamente eliminada en presencia de GHRH_{a} 10 nM; esta banda fue reducida más de un 50% por GTP\gammaS 50 \muM, y no se vio afectada por VIP 100 nM. Por tanto, la banda de 55 kDa es debida al fotoentrecruzamiento del GHRH-R. La figura 3 muestra que esta banda de 55 kDa específica es separada de la mayoría del material entrecruzado de manera no específica mediante extracción con CHAPS. La figura 4 demuestra la competición con GHRH_{a} 10 nM. La figura 5 demuestra el efecto de GTP\gammaS sobre el entrecruzamiento.

El tratamiento con neuraminidasa del receptor de GHRH entrecruzado hizo que la banda de 55 kDa se desplazara hasta 50 kDa, lo cual es atribuido a la eliminación de grupos de ácido siálico terminales cargados que disminuyen la movilidad en el gel (figura 5). El tratamiento del receptor de GHRH entrecruzado con una mezcla libre de proteasas, purificada, de endoglicosidasa F y N-glicosidasa F (disponibles en Boehringer Mannheim de Indianapolis, Indiana) originó un desplazamiento de la movilidad en el gel para formar una banda a 45 kDa (mostrado en las figuras 3 y 4); esto indica que el receptor de GHRH es una glicoproteína unida a N (común entre los receptores unidos a proteína G) y sugiere el tamaño de la cadena proteica desglicosilada. Este tamaño es consistente con la estructura de los receptores de VIP y secretina.

Los ensayos con lectinas inmovilizadas no mostraron unión del receptor de GHRH entrecruzado a aglutinina de germen de trigo, ricina, aglutinina de Limulus o concanavalina A. Esto hace al receptor inusual y ofrece una aproximación para la purificación y el aislamiento de este receptor a partir de otros receptores que se unen a estas lectinas. Después del tratamiento con neuraminidasa y \beta-galactosidasa, el receptor se unió específicamente a aglutinina de cacahuete, proporcionando una aproximación adicional a la separación y purificación del receptor de GHRH.

Complejo GHRH-GHRH-R soluble y ensayo de unión mejorado

El entrecruzamiento de fotoafinidad mostró que los complejos receptor-ligando acoplados covalentemente son solubles en una solución de un detergente suave, preferiblemente una solución que contenga CHAPS. La preincubación de GHRH con el receptor, utilizando las condiciones del ensayo de unión de membranas mencionado anteriormente, permitió la extracción con CHAPS y la solubilización de un complejo receptor-ligando intacto incluso cuando no estaba entrecruzado. Este complejo fue detectado mediante contaje gamma después de la extracción con detergente de membranas incubadas con ^{125}I-GHRH_{a} (GHRH_{a} "caliente") sin entrecruzamiento.

La figura 6 muestra que la mayoría de las cuentas específicas observadas en la membrana bruta fueron extraídas con CHAPS como un complejo específico asociado con el receptor. Los datos para la figura 6 fueron obtenidos según sigue. Se permitió que GHRH_{a} radioyodado se uniera a membranas brutas de pituitaria ovina en presencia o ausencia de GHRH_{a} no marcado 10 nM. Esto fue seguido por extracción con detergente y centrifugación; los sobrenadantes fueron tratados posteriormente con carbón vegetal/dextrano para separar la proteína unida del GHRH_{a} libre, y se contó el radioyodo de cada fracción. El GHRH_{a} marcado unido a la membrana bruta pudo ser de esta forma seguido después del tratamiento con detergente y caracterizado como: (1) insoluble, (2) soluble y unido de manera no específica, (3) unido específicamente pero disociado por el detergente o (4) soluble y unido específicamente. Como se sabe del fotoentrecruzamiento, la mayoría de las cuentas unidas de manera no específica no eran solubles en CHAPS. La extracción con una mezcla de detergente desoxicolato solubilizó ligeramente más cuentas totales, pero muchas de ellas eran inestables y se disociaron, y predominaron las cuentas no específicas.

La figura 7 muestra los resultados de este fotoentrecruzamiento para confirmar que este complejo contenía el receptor. Las membranas fueron preunidas con la fotosonda (^{125}I-ANB-NOS-GHRH_{a}) en la oscuridad, extraídas con CHAPS y luego entrecruzadas con UV. Esto demuestra que la GHRH estaba todavía unida al receptor solubilizado. En el extracto de CHAPS, la mayoría de la unión estaba en la banda del receptor de 55 kDa mientras que en el caso del desoxicolato la mayoría de las bandas eran inespecíficas. Esto concuerda bien con los estudios de unión mostrados en la figura 6 (aunque las fotosondas tienen una unión no específica más elevada), y demuestra que la unión específica del análogo de GHRH en los complejos solubles es al receptor de 55 kDa. Consistente con la figura 6, el complejo era mucho más estable en CHAPS que en desoxicolato. Había también pocas bandas no específicas (una está justo por debajo de la banda del receptor de 55 kDa) después del fotoentrecruzamiento del extracto de CHAPS.

La figura 8 demuestra que la extracción con CHAPS da lugar a un ensayo de unión mejorado con cuentas no específicas enormemente reducidas y una sensibilidad incrementada (comparar con la figura 1). Esta figura muestra también que el complejo es parcialmente disociado por GTP\gammaS 50 \muM, sugiriendo que las proteínas G están todavía asociadas con el complejo solubilizado en una solución de detergente conteniendo CHAPS. La figura 1 muestra que DTT 1 mM impedía la unión específica antes de que fuera añadida la GHRH. La figura 8 muestra solamente un efecto parcial de DTT 20 mM después de que hubiera tenido lugar la preunión. Este complejo era también bastante estable en NaCl hasta 1 M durante una noche a 4ºC, pero fue disociado completamente por Triton X-100 al 1% (surfactante). Observar el bajo fondo obtenido cuando se utilizan muestras solubles en CHAPS, tratadas con carbón vegetal/dextrano para un ensayo de unión.

La estabilidad respecto al pH del complejo soluble receptor-ligando se muestra en la figura 9. Hay una transición brusca con el complejo inestable a pH 5,5 e inferior, estable y capaz de intercambiar la GHRH unida con GHRH libre entre pH 5,5 y 6, y muy estable y no intercambiable a pH 7. La estabilidad de este complejo nos proporciona un ensayo de unión de GHRH-R mejorado y la base para una nueva metodología de purificación del receptor.

Aislamiento y purificación de GHRH-R

Se desarrollaron análogos de GHRH biotinilados con el objetivo de purificar el receptor de GHRH como un complejo receptor-ligando que puede ser retenido en estreptavidina inmovilizada. El primer análogo ensayado fue [His^{1}, Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2} (GHRH_{a}) biotinilado en las lisinas de las posiciones 12 y/o 21 utilizando el reactivo con N-hidroxisuccinimida NHS-LC-Biotina (disponible en Pierce). Este análogo fue yodado en la tirosina de la posición 10 y resuelto como formas mono y dibiotiniladas en HPLC. Más de un 90% de estos productos se unieron a la estreptavidina inmovilizada en 30 minutos. El GHRH_{a} monobiotinilado tenía una afinidad de unión al receptor reducida dos veces en comparación con GHRH_{a}, mientras que el dibiotinilado tenía una actividad próxima a cero. El grupo biotina parece estar en la cavidad de unión del receptor, ya que la unión a estreptavidina bloqueaba la unión al receptor. El siguiente análogo ensayado fue [His^{1}, Nle^{27}, Cys^{33}]-GHRH-(1-33)-NH_{2}. Tiene una fuerte tendencia a dimerizarse y ninguna de las especies que podían desplazar a GHRH_{a} en un ensayo de unión de competición estaba biotinilada.

Se descubrió sorprendentemente que [His^{1}, Nle^{27}, Biotina-Lys^{41}]-GHRH-(1-41)-NH_{2} (referido en la presente como GHRH_{b}) se une al receptor con una afinidad comparable a la de GHRH_{a} (una fuente preferida para preparar GHRH_{b} es Nuros Corporation de San Jose, California). Para demostrar que este análogo podía ser utilizado en la purificación del receptor, fue yodado, se le incorporó un grupo de entrecruzamiento fotosensible (ANB-NOS) y se purificó el compuesto mediante HPLC. Esta yodo-biotinil-fotoactivable GHRH, ^{125}I-GHRH_{b}-ANB-NOS, fue unida a receptores de membranas brutas de pituitaria bovina. Los complejos receptor-ligando fueron solubilizados en CHAPS, tratados con carbón vegetal/dextrano para eliminar la GHRH libre y unidos a estreptavidina inmovilizada.

\newpage

Con el fin de comprobar si la estreptavidina separaba el receptor del complejo, las muestras fueron entrecruzadas con UV antes y después de la unión a estreptavina y analizadas mediante autorradiografía. Esto demostró que una fracción significativa (30%) del receptor que estaba disponible para la unión pudo ser retenida sobre las esferas de estreptavidina. Los estudios de estabilidad del complejo soluble receptor-ligando (ver la figura 9) indican que un lavado con una concentración elevada de sal (NaCl 0,5 M) de las esferas de estreptavidina seguido por una elución a pH bajo (pH 5) (utilizando preferiblemente una solución de tampón fosfato, acetato, citrato u otro tampón adecuado) tiene como resultado una purificación significativa del receptor para producir un aislado de GHRH-R. El aislado de GHRH-R obtenido es de pureza suficiente para permitir la secuenciación del GHRH-R; las proteínas G y otros contaminantes que interfieren son eliminados mediante métodos tales como, pero no limitándose a, electroforesis en gel para obtener GHRH-R de una pureza al menos suficiente para realizar la secuenciación.

La figura 10 demuestra los resultados de la purificación por afinidad del complejo del receptor biotinilado (GHRH_{b}-GHRH-R) en una columna de agarosa estreptavidina. Las esferas de agarosa, que tenían unido el complejo, fueron lavadas en NaCl 0,5 M para minimizar la unión no específica y posteriormente el receptor fue disociado del ligando biotinilado a pH 5,0 y eluido de la columna. El eluato fue concentrado por ultrafiltración llevada a cabo en una centrífuga y analizado por SDS-PAGE. Se procesó una columna control en paralelo y se trató de manera idéntica excepto en que los complejos solubles del receptor fueron preunidos al análogo GHRH_{a} no biotinilado. La calle de GHRH_{b} de este gel teñido con plata muestra bandas a 52 y 45 kDa que no se ven en la calle de GHRH_{a}. La banda de 52 kDa corresponde al tamaño esperado para el receptor, ya que la banda de 55 kDa observada en los estudios de entrecruzamiento incluye el péptido GHRH_{a} de 3,6 kDa unido covalentemente. La banda de 45 kDa es el tamaño descrito para la proteína G estimulante G_{g}, que se cree que es una subunidad del complejo del receptor de GHRH. La coelución de estas dos bandas y su ausencia en la columna control confirma que se ha preparado GHRH-R altamente purificado.

Métodos experimentales y ejemplos

Los ejemplos no limitantes siguientes demuestran adicionalmente el ensayo de unión de GHRH mejorado de la presente invención y el método para purificar el receptor de GHRH basado en la solubilización de un complejo GHRH/receptor de GHRH intacto. Debe comprenderse que puede utilizarse una amplia variedad de otros materiales distintos de los mencionados específicamente en la presente para practicar la invención sin una experimentación excesiva.

1. Ensayo de unión en pellas de membranas brutas Preparación del tejido

Todas las etapas fueron realizadas a 4ºC. Pituitarias anteriores ovinas o bovinas congeladas (ovina: 1 g/pituitaria aproximadamente obtenida del Dr. Iain Clarke, Melbourne, Australia; bovina: 2,5 g/pituitaria aproximadamente de manipulación especial procedente de Pel-Freez, de Rogers, Arkansas) fueron lavadas de sangre, limpiadas de tejido conectivo y homogeneizadas (utilizando un homogenizador Dounce) en tampón HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, EGTA 0,1 \muM, pH 7,4 con PMSF 0,5 mM (fluoruro de fenil metil sulfonilo), leupeptina 10 \mug/ml, pepstatina A 10 \mug/ml y 200 U/ml (unidades/ml) de aprotinina. Este tampón es utilizado para eliminar el GTP endógeno que podría estar unido a las proteínas G y para restaurar la unión de alta afinidad. El homogenado fue centrifugado a velocidad máxima en una microfuga y se desechó el sobrenadante. La capa superior (membranas) de la pella fue luego resuspendida suavemente en tampón de unión que contenía tampón Tris 50 mM, EGTA 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, alameticina 50 \mug/ml, bacitracina 30 \mug/ml y otros inhibidores de proteasas igual que anteriormente.

Condiciones de unión y análisis

Se incubaron 1/50 equivalentes de pituitaria por tubo en tampón de unión con 100.000 cuentas aproximadamente de sonda yodada en un volumen de 500 \mul a temperatura ambiente durante 1 hora. Se determinó el total de cuentas suministrado y el porcentaje de cuentas unido para cada tubo con 3 a 6 replicados por condición experimental. Se analizaron los perfiles de la unión de saturación con el programa de ordenador Ligand que realiza un ajuste de mínimos cuadrados ponderado estadísticamente a la ecuación de unión del ligando exacta en coordenadas no transformadas. Las medidas estadísticas (test F y test de rachas) indicaban un ajuste convincentemente bueno a un modelo de un único sitio de unión. Un análisis representativo de la unión de saturación se presenta en la figura 2.

Resultados

El tratamiento del tejido con EDTA 10 mM fue esencial para permitir la eliminación de GTP endógeno y para revelar la alta afinidad de los sitios dependientes de GTP. Inicialmente, la unión no específica fue abrumadora y una amplia variedad de agentes bloqueantes no produjeron ninguna mejora. Se observaron señales de unión ligeramente mejores en las fracciones de membrana purificadas mediante centrifugación en gradiante de densidad de sacarosa. Con el fin de obtener resultados consistentes, se prepararon muestras abundantes de membranas brutas a partir de pituitarias congeladas y se congelaron alícuotas de esta membrana para un ensayo posterior. Con referencia a la figura 1, se observó un gran incremento de la unión específica cuando se ensayaban las membranas directamente después de la homogeneización. Un posible mecanismo de este efecto congelación-descongelación es la formación de vesículas que interfieren con el ensayo. Al analizar esta posibilidad, se encontró que el antibiótico formador de poros alameticina (50 \mug/ml) incrementaba 3 veces la relación unión específica/unión total, según se ilustra gráficamente en la figura 1. La mayor parte de este incremento era debido a una disminución de la unión no específica, debido probablemente a la liberación de sonda atrapada en las vesículas. Se incluyó un lavado adicional de las pellas de membranas mediante centrifugación para maximizar el incremento de la unión específica sobre la unión no específica a pesar de la pérdida de cuentas totales recuperadas.

El análisis mediante ordenador de los estudios de unión de saturación con el programa Ligand, indica un único sitio de unión con una Kd = 158 \pm 13 pM y que el número total de sitios de unión específica (RT) es 1,5 \pm 0,09 pmoles/g de tejido (mejor valor de ajuste \pm error estándar aproximado de las medias (ESM)). Debido a que la afinidad por GHRH_{a} se corresponde con la potencia biológica de GHRH_{a} y debido a que la especificidad para GHRH sobre los péptidos relacionados (no hay competición con VIP o PACAP 100 nM) y la sensibilidad a GTP\gammaS 50 \muM y a DTT 1,0 mM, esta unión indica la presencia de GHRH-R.

La comparación de ^{125}I-GHRH_{a} con una GHRH humana yodada comercialmente disponible (Amersham, Arlington Heights, IL) mostró una elevada similitud; ^{125}I-GHRH_{a} mostró una unión específica ligeramente mejor y un efecto de GTP algo más potente.

Evaluación de la unión de las sondas de fotoafinidad

Se prepararon dos sondas de fotoafinidad diferentes utilizando agentes de entrecruzamiento fotorreactivos heterobifuncionales disponibles en Pierce según se discutió anteriormente (Rockford, IL). SANPAH fue acoplado a GHRH_{a} dirigido a la histidina N-terminal utilizando un sistema de solventes de DMF. ANB-NOS fue acoplada a GHRH_{a} dirigida a las lisinas 12 ó 21. Cada producto grupo de acoplamiento-GHRH_{a} fue purificado por HPLC, yodado y repurificado.

La unión de las fotosondas a las membranas fue evaluada con un ensayo de unión a membranas brutas y luego analizada posteriormente mediante electroforesis en SDS-PAGE para identificar los sitios de unión. Las fotosondas fueron incubadas en la oscuridad, fotolisadas durante 10 minutos con una lámpara UV de onda larga (366 nm), y las muestras fueron luego aglutinadas. Las pellas fueron contadas y luego extraídas mediante ebullición directamente en tampón de muestra SDS (extractos totales en SDS). Alternativamente, las pellas marcadas fueron extraídas en una solución de detergente suave (CHAPS 5 mM), centrifugadas y los sobrenadantes concentrados en cloroformo/metanol desnaturalizados con tampón SDS (extractos en CHAPS). Estas muestras fueron luego sometidas a electroforesis en geles de SDS y autorradiografiadas.

Resultados

El ensayo de unión reveló que ambas fotosondas se unían a las pellas de membranas, y podían ser desplazadas totalmente por GHRH_{a} 10 nM, o parcialmente desplazadas por GTP\gammaS 50 \muM. Ambas daban una unión no específica mayor que ^{125}I-GHRH_{a}. Los geles de los extractos totales en SDS de las pellas entrecruzadas por afinidad mostraban esta unión no específica como bandas no afectadas por GHRH_{a} ni por GTP\gammaS. Estas bandas no específicas diferían algo de proceso a proceso y entre las dos sondas (figura 3). El detergente no iónico CHAPS es un débil solubilizador de proteínas; el trabajo de purificación de los receptores demostró la capacidad de las soluciones que contenían CHAPS para solubilizar la actividad de unión a GHRH. Cuando se examinaron los extractos de las pellas entrecruzadas obtenidos mediante la utilización de una solución que contenía CHAPS 5 mM en geles de SDS, la visualización del entrecruzamiento del receptor mejoró mucho, ya que la mayoría de las proteínas marcadas de manera no específica no estaban solubilizadas. Con referencia las figuras 3 y 4, una banda de 55 kDa cuyo marcaje está enormemente afectado por GHRH_{a} o GTP\gammaS, es claramente visible con ambas sondas y representa el GHRH-R. Estas fotosondas son inestimables para la caracterización, purificación y clonaje posteriores del receptor de GHRH.

Desglicosilación

Como se sabe que la porción extracelular de la mayoría de los receptores de membrana unidos a proteína G contiene múltiples grupos carbohidrato unidos covalentemente a residuos de arginina (unidos a N), se realizaron experimentos para confirmar que la banda fotomarcada específicamente en las figuras 3 y 4 es una glicoproteína unida a N. Las muestras fueron tratadas con una mezcla de endoglicosidasa F y N-glicosidasa F purificada, libre de proteasas.

Las pellas fotomarcadas (extraídas utilizando SDS o CHAPS) fueron hervidas en tampón de muestra SDS, diluidas e incubadas durante una noche a 37ºC con Nonidet P-40 al 1,25% (un detergente no iónico conocido también como NP-40) en 0,5 unidades de glicosidasa o en blanco. Estas muestras fueron luego concentradas mediante un protocolo de precipitación en cloroformo-metanol (ver Wessel y col., Anal. Biochem., 138:141-143 (1984)) y sometidas a electroforesis en geles de SDS.

Con referencia las figuras 3 y 4, puede observarse que la movilidad de la banda fotomarcada específicamente se desplaza desde 55 kDa aproximadamente hasta 45 kDa aproximadamente sólo en presencia de glicosidasa. Otras bandas, visibles en las muestras extraídas con SDS, y que se consideró que no estaban marcadas específicamente por la falta de respuesta a GHRH_{a} o GTP\gammaS, no están desglicosiladas. Ésta es la primera prueba de que el GHRH-R es una glicoproteína, y proporciona la mejor estimación del tamaño verdadero de la cadena proteica. Según se muestra en la figura 5, el tratamiento del receptor fotomarcado con neuraminidasa produjo un desplazamiento de la movilidad del gel hasta 52 kDa aproximadamente. Esto demuestra que el receptor tiene varios grupos de ácido siálico terminales en sus cadenas oligosacarídicas. Estos grupos de ácido siálico afectan también al pI del receptor, según se observa en los geles de enfoque isoeléctrico, en la hidrofobicidad en HPLC y también en sus propiedades de unión a lectinas. La desglicosilación es útil en las estrategias de purificación y para facilitar el corte proteolítico del receptor para su secuenciación.

Solubilización de los complejos receptor-GHRH

Las preparaciones de membranas de pituitaria solubilizadas en soluciones que contenían CHAPS mostraron solamente sitios de baja afinidad insensibles a GTP (Kd 500 nM aproximadamente), según se midió con un ensayo de unión a carbón vegetal/dextrano (adaptado del desarrollado para VIP por Paul y col., J. Biol. Chem., 262:158-162 (1987)). Otros detergentes conservaban incluso menos unión, lo cual indica que el GHRH-R no era estable a estos tratamientos. Los resultados del entrecruzamiento de fotoafinidad revelaron que el complejo receptor-ligando acoplado covalentemente es soluble en una solución que contenga CHAPS. La preincubación de GHRH con el receptor utilizando las condiciones del ensayo de unión en membranas de la presente invención, seguido por extracción con una solución de detergente suave, conteniendo preferiblemente CHAPS, reveló la solubilización de un complejo receptor-ligando intacto. Este complejo soluble fue detectado mediante la extracción con detergente de membranas incubadas con el análogo de GHRH marcado con ^{125}I, o con el análogo de GHRH marcado con ^{125}I después del tratamiento con GHRH fría 10 nM.

GHRH-R purificado

El análogo de GHRH biotinilado fue utilizado posteriormente para formar un complejo soluble GHRH_{b}-GHRH-R, y este complejo soluble, después de la extracción utilizando CHAPS y de purificación con carbón vegetal/dextrano, fue procesado sobre una columna de estreptavidina. La columna de estreptavidina fue luego lavada con una solución de NaCl y posteriormente se corrió por la columna una solución tampón que tenía un pH de 5,0 con el fin de producir un aislado de GHRH-R.

El aislado de GHRH-R puede ser luego purificado adicionalmente mediante SDS-PAGE. Una banda que aparecía a 52 kDa aproximadamente (correspondiente a GHRH-R puro) puede ser transferida a una membrana estándar de PVDF. La membrana de PVDF que tiene sobre ella GHRH-R purificado puede ser luego digerida sobre la membrana y secuenciada para obtener la secuencia de residuos de aminoácidos completa o parcial del GHRH-R siguiendo métodos de secuenciación convencionales.

La secuencia o secuencias de residuos de aminoácidos obtenidas de la etapa de secuenciación pueden ser luego utilizadas como base para producir sondas degeneradas para ser utilizadas en el clonaje del gen responsable de la producción de GHRH-R.

Por tanto, se ha descrito una metodología mejorada para medir la unión de análogos de GHRH al receptor de GHRH en membranas de pituitaria ovina y bovina (incluyendo métodos de yodación, purificación y suministro de análogos de GHRH y la utilización de antibióticos formadores de poros). Esto condujo al desarrollo de métodos para el fotomarcaje de alta afinidad, específico de GHRH, sensible a GTP, del receptor de GHRH. Tal marcaje de este receptor no se había realizado previamente. Esto permitió la caracterización del tamaño, de la glicosilación, de la solubilidad y de otras propiedades del receptor. Esto condujo al descubrimiento de que una solución de detergente suave, incluyendo compuestos tales como CHAPS, podía extraer el complejo GHRH-receptor de GHRH unido en una forma estable, soluble. La extracción con CHAPS y el tratamiento con carbón vegetal/dextrano (para unir la GHRH libre) produce un complejo soluble receptor-ligando que es purificado a partir de la mayoría de la unión de GHRH no específica, y es por tanto muy útil como un nuevo ensayo de unión de GHRH con bajo fondo y con mejor sensibilidad de la que había sido posible previamente, y también como un punto de partida para la purificación del receptor. Este complejo receptor-ligando es relativamente estable a los lavados con sal, al intercambio con GHRH y al tratamiento con GTP o DTT, pero no a la disminución del pH. Se ha inventado un análogo de GHRH biotinilado en C-terminal que, cuando está unido en un complejo de GHRH-R soluble, permite la purificación del receptor de GHRH por retención en una columna de estreptavidina inmovilizada, seguido por un lavado con sal y elución a pH 5. Esta proteína del receptor purificada es adecuada para la secuenciación parcial de los péptidos del receptor y esta información de la secuencia es valiosa para el clonaje del ADNc del receptor de GHRH.

De las descripciones anteriores, es obvio que son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención. A manera de ejemplo no limitante, se contempla que otros complejos de GHRH-R en muestras de pituitaria bruta pueden ser unidos a columnas de afinidad con el fin de producir GHRH-R purificado. Debe entenderse, por tanto, que la invención puede ser practicada de otro modo que el específicamente descrito.

Claims (4)

1. Procedimiento para la identificación de complejos receptor-ligando específicos para la hormona que libera la hormona del crecimiento que comprende:

a)

marcaje del ligando;

b)

incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento;

c)

medición del ligando total unido;

d)

incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento en presencia de ligando no marcado;

e)

medición del ligando total unido; y

f)

determinación de la unión específica,

caracterizado porque las etapas de incubación b) y d) se llevan a cabo en presencia de un antibiótico formador de poros.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el ligando es un análogo o fotosonda de la hormona que libera la hormona del crecimiento.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el ligando está yodado.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el antibiótico formador de poros es alameticina.