ES2323571T3 - Proceso para aislar selectivamente an ticuerpos igy de yema de huevo de un ave anseriforme. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de yema de huevo de un ave anseriforme, comprendiendo dicho proceso: (a) absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenida a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua; y (b) hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema.
Description
Proceso para aislar selectivamente anticuerpos
IgY de yema de huevo de un ave anseriforme.
Proceso para aislar selectivamente anticuerpos
IgY de yema de huevo de un ave anseriforme y anticuerpos IgY
obtenidos de este modo.
La presente invención se refiere a un proceso
para el aislamiento y la purificación rápida de anticuerpos de
yema, en particular anticuerpo IgY, a partir de la yema de un ave
anseriforme, y los anticuerpos de yema obtenidos de este modo. Más
particularmente, la presente invención se refiere a un proceso para
el aislamiento y la purificación de anticuerpos de yema a partir de
la yema de un ave anseriforme mediante un procedimiento
cromatográfico de adsorción, usando un absorbente no cargado
insoluble en agua para conseguir una separación deseada de
anticuerpos de yema, y mediante un procedimiento de precipitación
salina, que precipita de forma diferencial los anticuerpos IgY.
Se usan muchos anticuerpos en muchas
investigaciones biológicas y aplicaciones clínicas. Los sueros
obtenidos de mamíferos hiperinmunizados son la fuente más común de
anticuerpos policlonales. Los anticuerpos procedentes de dichos
sueros inmunes pertenecen a un grupo de proteínas denominadas
"inmunoglobulinas", de entre las que la inmunoglobulina G
(IgG) es la más abundante. La molécula de IgG consiste en tres
dominios, en concreto dos regiones Fab y una región Fc. La porción
Fab está principalmente implicada en la unión a antígeno. La
porción Fc, aunque no tiene capacidad de unirse a un antígeno,
dirige varias actividades de un anticuerpo, tales como la fijación
del complemento y la unión a receptor de Fc.
Los patos y sus parientes filogenéticamente
cercanos y algunos reptiles, tales como tortugas, tienen tres
clases de inmunoglobulinas séricas: una inmunoglobulina
macromolecular IgM (de 800 kDa en el pato), y dos isoformas de IgG
de bajo peso molecular con coeficientes de sedimentación de 7,8 S
(en el pato, 180 kDa) y 5,7 S (en el pato, 1390 kDa),
respectivamente. (E. R. Unanue et al., J. Exp. Med. 121:
697-7124, 1965; H. M. Grey, J. Immunol 98:
811-819, 1967); y B. Zimmerman et al.,
Biochemistry 10: 482-448, 1971). La IgG aviar
se denomina muchas veces IgY debido a su existencia en la yema de
huevo aparte de en sueros. La IgY 5,7 S, constituida por cadenas
pesadas más cortas, es estructuralmente y antigénicamente similar al
fragmento F(ab')_{2} de la IgY 7,8 S (Figura 1), y este
hecho conduce a la nomenclatura de IgY (equivalente a IgY 7,8 S) e
IgY(\DeltaFc) (equivalente a IgY 5,7 S) para representar
ambas isoformas de IgY (K. E. Magor et al., J. Immunol. 149:
2627-2633, 1992).
Los estudios realizados en las aves infectadas o
inmunizadas experimentalmente mostraban que los anticuerpos de pato
carecen de varias funciones biológicas efectoras, incluyendo la
fijación del complemento y la unión a receptores de Fc, sin
sacrificar su actividad de unión a los antígenos correspondientes
(G. W. Litman et al., Immunochemistry 10: 323, 1973; y T. E.
Toth et al., Avian Dis. 25: 17-28, 1981).
Razonablemente, esto puede ser el resultado de la ausencia aparente
de la región equivalente a Fc del anticuerpo IgY(\DeltaFc),
que constituye el componente cuantitativamente más importante de la
respuesta de anticuerpos de aves anseriformes. Por lo tanto, se
piensa que el anticuerpo IgY(\DeltaFc), que parece ser un
análogo estructural y funcional del fragmento F(ab')_{2},
proporcionaría ventajas magníficas en usos inmunológicos si pudiera
encontrarse un proceso prometedor para fabricar el anticuerpo y
pudieran identificarse las necesidades físicas apropiadas para su
actividad.
Se ha descrito que los anticuerpos de yema de
ave presentan propiedades útiles tanto para aplicaciones de
investigación como clínicas, al igual que los anticuerpos de
mamífero (véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 5.340.293; U.S.
5.585.098; U.S. 5.601.823; y U.S. 5.976.519). Las yemas de huevo
obtenidas de una gallina ponedora son económicas y más convenientes
y seguras de manipular en comparación con los sueros de mamíferos
hiperinmunizados. Lo que es más importante, los anticuerpos de yema
son capaces de hacer frente al examen detallado bajo las normas de
protección animal modernas (A. Poison et al., Immunol.
Commun. 9: 475, 1980; y B. Gottstein et al.). Estos
hechos sugieren un uso potencial de la yema de huevo como una fuente
comercial de anticuerpos.
Sin embargo, los altos contenidos de sustancias
lipídicas, tales como ácidos grasos, colesterol y lecitina, en la
yema de huevo hacen del aislamiento de anticuerpos de yema una tarea
incómoda y laboriosa. Se han realizado muchos esfuerzos a este
respecto. Por ejemplo, se usaron agentes de precipitación solubles
en agua incluyendo agar, pectina (Patente Japonesa Kokai Nº
64-38098 publicada el 8 de febrero de 1989), sulfato
de dextrano (J. C. Jensenius et al., J. Immunol. Methods 46:
63, 1981), gomas naturales (H. Hatta et al., J. Food Science
53: 425, 1988) y polietilenglicol (PEG) (A. Poison et al.,
Immunol. Invest. 14: 323, 1985; véase también el documento U.S.
4.550.019 expedido a A. Poison) para precipitar biomoléculas no
acuosas, principalmente lípidos y gránulos de yema, para recoger de
este modo una fase soluble en agua que contiene abundantes
anticuerpos de yema de la población total. A. Hassl et al.
desarrollaron un proceso cromatográfico de dos etapas, compuesto
por cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de
exclusión por tamaños para el aislamiento adicional de anticuerpos
de yema de la población total a partir de una fracción purificada
con PEG (A. Hassl y H Aspock, J. Immunol, Methods 110: 225,
1988). Akita et al. describieron un método mejorado para
aislar IgY, en el que se extrajeron anticuerpos de yema a partir de
huevos de pollos por dilución de las yemas de huevo con un gran
volumen de agua y sometiendo el sobrenadante resultante a
cromatografía de exclusión por tamaños y/o cromatografía de
intercambio iónico (E. M. akita et al., J. Immunol. Methods.
160: 207, 1993; y E. M. Akita y S. Nakai, J. Food Sci. 57:
629, 1993).
Sin embargo, todos estos estudios y patentes se
centran en el aislamiento de la población total de anticuerpos de
yema (que al menos incluye IgY con región Fc presente o ausente) de
huevos de ave, en lugar de sobre la purificación de anticuerpos
IgY(\DeltaFc) e IgY selectivamente. Además, puesto que los
anticuerpos IgY(\DeltaFc) están presentes solamente en
aves que pertenecen al Orden Anseriformes, incluyendo pato y
ganso, y puesto que se ha descrito que el contenido lipídico en la
yema de huevo de las aves anseriformes es superior que el de las
aves galliformes, tales como pollo y pavo, los métodos
convencionales descritos anteriormente no proporcionan ninguna
sugerencia de una purificación con éxito de anticuerpo
IgY(\DeltaFc). El anticuerpo IgY(\DeltaFc) se
purificó solamente por co-precipitación con IgY de
suero de pato (D. A. Higgins et al., Veterinary Immunology and
Immunopathology 41: 169-180, 1995) con
procedimientos complejos y costosos, pero aun así no se aisló
selectivamente el anticuerpo IgY(\DeltaFc) a partir de yema
de huevo.
Por lo tanto, existe la necesidad de un proceso
rápido, rentable y de alto rendimiento que proporcione un
aislamiento fácil del anticuerpo IgY deseado de la combinación de
anticuerpos de huevos de aves anseriformes, al tiempo que se
mantiene la actividad del anticuerpo IgY. El anticuerpo
IgY(\DeltaFc) sustancialmente purificado puede actuar como
un nuevo tipo de anticuerpo F(ab')_{2} para diversos usos
de inmunodiagnóstico e inmunoterapéuticos.
Se ha llevado a cabo una investigación amplia
para satisfacer las necesidades industriales de anticuerpos de yema
como se ha indicado anteriormente. Se descubre inesperadamente que
puede conseguirse fácilmente el aislamiento con éxito de
anticuerpos de yemas de huevos de un ave anseriforme mediante un
procedimiento cromatográfico de adsorción, usando un absorbente no
cargado insoluble en agua, y mediante un procedimiento sencillo de
precipitación salina que diferencia diferentes isoformas de los
anticuerpos de yema. De acuerdo con el proceso de la presente
invención, los anticuerpos de yema altamente purificados, en
particular la IgY(\DeltaFc) altamente purificada, puede
obtenerse fácilmente con alto rendimiento de una forma económica y
están listos para una amplia diversidad de usos inmunológicos. El
término "absorbente", como se usa en este documento, se refiere
al constituyente activo en la fase estacionaria usada en una
cromatografía de adsorción.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY a
partir de la yema de huevo de un ave anseriforme, comprendiendo
dicho proceso:
- (a)
- absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenida a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua; y
- (b)
- hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema.
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Otro aspecto más de la invención es proporcionar
un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de la yema de
huevo de un ave anseriforme, comprendiendo dicho proceso:
- (a)
- absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenidos a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua;
- (b)
- hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema;
- (c)
- realizar una precipitación salina de la fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema de la etapa (b) con (NH_{4})_{2}SO_{4} de una primera concentración que varía de aproximadamente el 15% (p/v) a aproximadamente el 24% (p/v), en base al volumen de la fracción acuosa; y
- (d)
- realizar una precipitación salina de la fracción acuosa que contiene anticuerpos de yema tratada en la etapa (c) con (NH_{4})_{2}SO_{4} de una segunda concentración que varía de aproximadamente el 25% (p/v) a aproximadamente el 40% (p/v), en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la etapa (c).
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Preferiblemente, la primera concentración de
(NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior a aproximadamente el
21% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa. Preferiblemente,
la segunda concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} no es
superior a aproximadamente el 31% (p/v) en base al volumen de la
fracción acuosa tratada en la primera precipitación salina.
De acuerdo con el proceso de esta invención,
puede obtenerse una abundante cantidad de una isoforma seleccionada
de anticuerpos de yema, en particular anticuerpo
IgY(\DeltaFc), disponible para diversas aplicaciones
industriales, de una forma económica, eficaz y que ahorre
tiempo.
Otro objeto más es proporcionar los usos
clínicos y de investigación del anticuerpo IgY producido de este
modo. Además de la rentabilidad y facilidad de preparación, el
anticuerpo IgY(\DeltaFc) de acuerdo con la presente
invención tiene las ventajas de ser inactivo para el sistema del
complemento y factores reumatoides en sueros de mamíferos, y de
tener una escasa reactividad cruzada con IgG de mamífero, y por lo
tanto es particularmente útil para el uso en ensayos inmunológicos
que implican sueros de mamíferos con una interferencia mínima.
Debería apreciarse por los especialistas en la técnica que el
anticuerpo IgY puede presentarse en forma de un solo reactivo para
aplicaciones clínicas, de investigación y otras, o puede incluirse
en un kit comercial como componente
activo.
activo.
Los anteriores y otros objetos y características
de la presente invención se harán evidentes con referencia a la
siguiente descripción de las realizaciones preferidas tomadas junto
con los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 ilustra un análisis de
SDS-PAGE que compara las capacidades de captura de
anticuerpos de cuatro absorbentes: carril 1, el extracto de
anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, la solución que fluye
a través de sílice pirógena al 0,3%; carril 3, la solución que fluye
a través de dióxido de sílice al 3%; carril 4, la solución que
fluye a través de Celite diatomite al 3%; carril 5, la solución que
fluye a través de Celite diatomite hyflo-Cel al 3%;
y carril 6, la solución que fluye a través de Celite diatomite
hyflo-Cel al 5%;
la Figura 2 ilustra los resultados de
electroforesis de los anticuerpos de yema purificados usando sílice
pirógena como la realización absorbente en un gel de
SDS-poliacrilamida al 8%: carril 1, el extracto de
anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, la solución que fluye
a través de sílice pirógena al 2%; carril 3, el eluido a partir del
sedimento de sílice pirógena; carril 4, el producto de anticuerpo
precipitado con sulfato de amonio al 21% (p/v) en la primera etapa
de precipitación; y carril 5, el producto de anticuerpo precipitado
con sulfato de amonio al 31% (p/v) en la segunda etapa de
precipitación;
La Figura 3 ilustra los resultados de
electroforesis de los anticuerpos de yema purificados usando Celite
diatomite como la realización absorbente en un gel de
SDS-poliacrilamida al 8%: carril 1, el extracto de
anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, filtrado de Celite
diatomite; carril 3, el producto de anticuerpo precipitado con
sulfato de amonio al 21% (p/v) en la primera etapa de precipitación;
carril 4, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de
amonio al 31% (p/v) en la segunda etapa de precipitación; y carril
5, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de sodio al
16% (p/v) en la segunda etapa de precipitación; y
la Figura 4 ilustra los resultados de
electroforesis de los anticuerpos de yema purificados usando sílice
pirógena como la realización absorbente en un gel de
SDS-poliacrilamida al 8%: M, marcador de pesos
moleculares; carril 1, el extracto de anticuerpo parcialmente
purificado; carril 2, la solución que fluye a través de sílice
pirógena al 0,3%; carril 3, el eluido a partir del sedimento de
sílice pirógena; carril 4, el producto de anticuerpo precipitado
con sulfato de amonio al 21% (p/v); y carril 5, el producto de
anticuerpo purificado por cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos de yema son abundantes en el
suero de aves y los huevos puestos por el ave. Sin embargo, como se
ha descrito anteriormente, habitualmente se prefiere la recogida del
anticuerpo a partir del huevo debido al coste. La gallina ponedora
transfiere tanto las isoformas IgY como IgY(\DeltaFc) del
suero a la yema de huevo. En principio, cada huevo de pato contiene
de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 mg de IgY/ml y de
aproximadamente 3 a aproximadamente 12 mg de
IgY(\DeltaFc)/ml en la yema y, por lo tanto, se estima que
la cantidad total de los anticuerpos contenidos en un solo huevo es
de 15 a 80 mg de IgY y de 45 a 240 mg de IgY(\DeltaFc). El
gran volumen de yema de huevo producida supera enormemente el
volumen del suero que puede obtenerse con seguridad de las aves
durante cualquier periodo de tiempo dado. Además, la extracción de
anticuerpos de yema puede realizarse a gran escala sin una inversión
costosa. Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención
se obtienen a partir de huevos de un ave anseriforme inmunizada con
un antígeno específico.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un proceso para aislar eficazmente anticuerpos de yema
de huevo, en el que las denominadas "cromatografía de
adsorción" o "precipitación salina diferencial", que pueden
usarse en solitario o en combinación entre sí, actúan como etapas
críticas en el aislamiento.
Como se usa en este documento, la expresión
"cromatografía de adsorción" se refiere a un tipo de método de
separación que implica el uso de una fase estacionaria para recoger
y concentrar selectivamente los solutos deseados a partir de una
fase móvil. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un
absorbente no cargado insoluble en agua actúa como el constituyente
activo en la fase estacionaria para separar los anticuerpos de yema
por adsorción de los anticuerpos de yema en el absorbente no cargado
insoluble en agua acompañada de captura de impurezas lipídicas
miscibles en agua normalmente presentes en la yema de huevo.
En una realización preferida de la presente
invención, la yema se separa primero a partir de la clara del
huevo, y después se lava con agua destilada para eliminar todo el
albumen que sea posible. Se perfora la membrana vitelina que
encapsula la yema y la fracción de yema separada se diluye después
con una cantidad eficaz de un tampón acuoso o agua para formar una
suspensión de la yema de huevo. Preferiblemente, la yema de huevo
recogida se diluye con una solución tampón acuosa o agua destilada
que varía de aproximadamente 2 partes a aproximadamente 40 partes
en volumen, más preferiblemente de aproximadamente 5 partes a
aproximadamente 30 partes en volumen, por 1 parte de la yema de
huevo. Se describe que el valor de pH es un factor crítico durante
la fase de purificación parcial (E. M. Akita y S. Nakai, J. Food
Sci. 57: 629, 1993). Para la mejor recuperación de anticuerpos
de yema, el pH se ajusta preferiblemente en un intervalo de
aproximadamente 5 a aproximadamente 7. Idealmente, la temperatura
en esta etapa está en un intervalo de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 60ºC. La suspensión de la yema de huevo se agita
suavemente para formar una mezcla homogénea y después se deja
reposar durante un periodo de tiempo suficiente para formar las
fases acuosas y no acuosas. Los materiales insolubles en agua,
incluyendo biomoléculas no acuosas tales como lipoproteínas,
fosfolípidos, esteroles y similares, se eliminan después de la
suspensión de yema acuosa por centrifugación. Después, el
sobrenadante que contiene anticuerpo resultante puede separarse del
precipitado viscoso por decantación, succión u otros métodos
similares conocidos en la técnica.
En general, el contenido lipídico de la fracción
miscible en agua obtenida de este modo todavía es tan alto que es
desfavorable para la manipulación posterior. De acuerdo con la
presente invención, una fase estacionaria que contiene un
absorbente no cargado insoluble en agua se incuba con la fracción
miscible en agua en una cantidad suficiente para absorber los
anticuerpos de yema y para absorber la mayoría de las sustancias
lipídicas miscibles en agua que quedan en la fracción miscible en
agua. Los absorbentes adecuados incluye, pero sin limitación,
silicato, compuesto de silicio, carbonato, sulfato, fosfato,
carbono, fibra de celulosa y sintética, cerámicos y óxido metálico,
y en el que el silicato incluye arcillas sintéticas o naturales,
caolín, talco y silicato de calcio; el compuesto de silicio incluye
sílice pirógena, sílice amorfa, dióxido de sílice, gel de sílice,
silicatos, tierra de diatomeas y tierra de Fuller; el carbonato
incluye carbonato de calcio y carbonato de bario; el sulfato
incluye sulfato de calcio; el fosfato incluye fosfato de calcio; el
carbono incluye carbono activado y fibra de carbono, la fibra de
celulosa y sintética incluye polvo de celulosa; los cerámicos
incluyen cerámicos porosos; y el óxido metálico incluye óxido de
aluminio y óxido de titanio. Son absorbentes particularmente
preferidos sílice pirógena, dióxido de sílice y tierra de diatomeas.
La relación de funcionamiento del absorbente con respecto a la
fracción miscible en agua puede variar a lo largo de un amplio
intervalo dependiendo de las propiedades del absorbente
seleccionado. Cuando se usa sílice pirógena en este proceso, se
añade preferiblemente a una concentración igual a o superior a
aproximadamente el 0,1% en peso, y más preferiblemente que varía
entre aproximadamente el 0,3 y aproximadamente el 5,0% en peso, en
base al volumen de la fracción miscible en agua a tratar. Cuando el
absorbente es dióxido de sílice o tierra de diatomeas, la
cromatografía de adsorción de acuerdo con esta invención se lleva a
cabo preferiblemente a más de aproximadamente el 1% en peso y, más
preferiblemente, en un intervalo de aproximadamente el 3 a
aproximadamente el 20% en peso, del absorbente basado en el volumen
de la fracción miscible en agua que se va a tratar.
La cromatografía de adsorción de acuerdo con
esta invención puede efectuarse por cualquier medio convencional,
tal como tratamiento en lote de la fracción miscible en agua con un
absorbente o haciendo fluir la fracción miscible en agua sobre una
columna de cromatografía empaquetada con el absorbente, siempre que
la cantidad de los anticuerpos de yema retenidos en las superficies
del absorbente sea satisfactoria. El tiempo de reacción y la
temperatura durante el tratamiento no son críticos para los
resultados y habitualmente son factibles una temperatura de
reacción de aproximadamente 4 a aproximadamente 30ºC y un tiempo de
reacción de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 minutos. Aunque
si es necesario el procedimiento de adsorción puede repetirse varias
veces, cada una con absorbente recién preparado, normalmente es
suficiente una sola operación. Por medio de este procedimiento, los
lípidos y la mayoría de las sustancias no lipídicas pueden separarse
con éxito en dos fases inmiscibles, mientras que también pueden
absorberse anticuerpos de yema.
Dependiendo de la capacidad del absorbente
seleccionado para capturar inmunoglobulinas, los anticuerpos de
yema pueden recuperarse a partir de un eluido obtenido por elución
de la fase estacionaria o la "solución de flujo continuo" que,
como se usa en este documento, pretende representar la solución que
pasa a través de la fase estacionaria. Como se muestra en las
realizaciones preferidas proporcionadas en el texto, los anticuerpos
de yema están principalmente presentes en la fase estacionaria
cuando se usa sílice pirógena o dióxido de sílice como el
absorbente, mientras que la tierra de diatomeas deja más de
aproximadamente el 60% de los anticuerpos en la solución de flujo
continuo.
La elección de un método particular para obtener
anticuerpos de yema puede determinarse por el especialista.
Típicamente, los anticuerpos de yema se obtienen en una fracción
acuosa haciendo fluir el absorbente no cargado insoluble en agua
con un tampón, y en la que el tampón está a un pH de menos de
aproximadamente 4 o superior a aproximadamente 8 o que contiene un
agente caótropo, que puede utilizarse en la presente invención para
obtener los anticuerpos de yema a partir de la fase estacionaria sin
disociar sustancialmente las sustancias lipídicas de la fase
estacionaria, de modo que se forma un eluido que contiene
anticuerpo. Como se usa en este documento, el término "eluido"
se refiere a una solución que contiene las sustancias deseadas no
unidas por el eluyente de la fase estacionaria. La expresión
"agente caótropo" o "caótropo" se refiere a un producto
químico capaz de inducir un cambio conformacional en una molécula
proteica, tal como una molécula de anticuerpo, que por lo tanto se
conoce con frecuencia como proteína desnaturalizante. De acuerdo con
la invención, la mayoría de los anticuerpos unidos pueden eluirse
con éxito con cualquier tampón neutro que contenga una concentración
moderada (>1 M) de un agente caótropo. En la mayoría de los
casos, la eliminación del caótropo después de la elución restituirá
la estructura de la proteína nativa.
El tampón útil incluye, pero sin limitación,
glicina-HCl, 0,1 M, pH 2,3;
glicina-HCl 0,1 M, pH 10,0;
guanidina-HCl de 3 M a 6 M, pH 3,0; cloruro de
potasio 3,0 M; yoduro de potasio 5 M; cloruro de magnesio 3,5 M;
tiocinato de amonio/sodio/potasio 1-3 M y urea 6 M.
Con respecto a la actividad de los anticuerpos recuperados, sin
embargo, un tampón de fuerza iónica moderada que contiene un
caótropo y de pH neutro, tal como tiocinato de sodio 3 M tamponado
en tampón MES 20 mM (pH 5,8) o
Tris(hidroximetil)-aminometano 20 mM (pH
7,5), es más adecuado para practicar la invención. El estado activo
de los anticuerpos recogidos puede restaurarse fácilmente, por
ejemplo, por diálisis exhaustiva contra un tampón de baja fuerza
iónica, que no contiene caótropos y débilmente
ácido.
ácido.
De acuerdo con un aspecto de la invención, la
fracción acuosa que incluye el eluido o la solución de flujo
continuo, que está enriquecida con anticuerpos, puede someterse
posteriormente a un procedimiento de precipitación salina
diferencial para separar isoformas de anticuerpos de yema.
La expresión "precipitación salina", como
se usa en este documento, asume su significado común en la técnica
de la química de proteínas y se refiere a la adición de una sal o
sales no desnaturalizantes a una mezcla o lote de producción para
disminuir la solubilidad de proteínas, que conduce la precipitación
o coagulación de las proteínas. Mediante la expresión
"precipitación salina diferencial" se entiende un proceso de
precipitación salina que precipita o coagula de forma diferencial
dos o más proteínas de una mezcla variando la concentración de la
sal o sales añadidas. En la presente invención, las proteínas que se
pretende precipitar de forma diferencial son las isoformas de
anticuerpos de yema, es decir, IgY e IgY(\DeltaFc). Los
ejemplos de las sales no desnaturalizantes útiles para la
precipitación de los anticuerpos de yema, incluyen, pero sin
limitación, NaCl, Na_{2}SO_{4},
(NH_{4})_{2}SO_{4}, KCl, CaCl_{2} y MgSO_{4}.
Preferiblemente, la sal no desnaturalizante es Na_{2}SO_{4} o
(NH_{4})_{2}SO_{4} y la más preferida es
(NH_{4})_{2}SO_{4}. La concentración salina para
precipitar de forma diferencial isoformas de anticuerpos de yema
depende del tipo de la sal y puede determinarse por un especialista
mediante ensayos sencillos. De acuerdo con una realización preferida
de la presente invención, en la que se emplea
(NH_{4})_{2}SO_{4}, la IgY se precipita primero por
precipitación salina a una concentración que varía de
aproximadamente el 15% (p/v) a aproximadamente el 24% (p/v), y en la
que preferiblemente es igual a o inferior a aproximadamente el 21%
(p/v) de la sal en base al volumen tratado de la fracción acuosa,
mientras que la IgY(\DeltaFc) se precipita cuando la
concentración de la sal varía de aproximadamente el 25% (p/v) a
aproximadamente el 40% (p/v), y en la que preferiblemente es de
aproximadamente el 31% (p/v) en base al volumen tratado de la
fracción acuosa. Debería apreciarse que la secuencia de
precipitación de las dos isoformas de anticuerpos también podría
ser variable dependiendo de la sal seleccionada. El uso combinado de
dos o más sales en este procedimiento, por ejemplo, precipitando
primero una primera isoforma con una sal seguida de precipitación
de una segunda isoforma con otra sal, también es factible. El
procedimiento de precipitación salina diferencial de acuerdo con la
presente invención logra notablemente un objeto principal de la
presente invención, es decir, la separación selectiva esencial de
la IgY deseada que comprende anticuerpos IgY e
IgY(\DeltaFc) de la población total de anticuerpos de
yema, constituida tanto por IgY como por IgY(\DeltaFc).
Si se desea obtener los anticuerpos con una
mayor pureza, los anticuerpos precipitados pueden volver a
disolverse en un sistema tampón adecuado y someterse a
procedimientos de purificación adicionales, tales como cromatografía
de exclusión por tamaños, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de
inmunoafinidad.
Como se usa en este documento, las expresiones
"purificación por inmunoafinidad" o "cromatografía de
inmunoafinidad" se refieren a un tipo de método de separación
basado en las características de unión de anticuerpos para un
antígeno específico. Es decir, los anticuerpos que se unen a un
antígeno específico en una condición particular se separan de los
anticuerpos no unidos en esa condición. La presente invención
contempla el uso de purificación por inmunoafinidad para eliminar
proteínas irrelevantes, en particular, la inmunoglobulina que no se
une a antígeno.
De acuerdo con la presente invención, la
purificación por inmunoafinidad se realiza mediante el uso de una
"matriz antigénica" compuesta por antígeno inmovilizado sobre
un soporte insoluble. El tipo del soporte no es crítico para la
purificación por inmunoafinidad de la invención. Es útil cualquier
material de soporte convencional adecuado para la unión covalente
de un antígeno e inerte a la interacción entre el anticuerpo
deseado y el antígeno inmovilizado sobre el mismo. Habitualmente, el
soporte está hecho de agarosa reticulada o dextrano reticulado, tal
como la Sepharose 4B activada con CNBr disponible en el mercado en
Pharmacia.
Los anticuerpos purificados por precipitación
salina diferencial se disuelven en un "tampón de unión" y se
aplican sobre la matriz antigénica, de modo que se forman los
inmunocomplejos del antígeno inmovilizado y los anticuerpos de
yema. Cualquier sistema tampón inerte para la interacción
antígeno-anticuerpo y eficaz para mantener la
condición de unión deseada es útil en la presente invención.
Preferiblemente, el tampón de unión se selecciona del grupo que
consiste en un tampón fosfato, un tampón MES (ácido
2[N-morfolino]etanosulfónico) y un
tampón bis-Tris, entre los que el más preferido es
un tampón MES a una concentración de 20 mM.
Preferiblemente, la purificación por
inmunoafinidad se realiza en un entorno de ácido débil y fuerza
iónica reducida, es decir, a un pH en un intervalo de
aproximadamente 4 a aproximadamente 7 y en una fuerza iónica de
menos de aproximadamente 50 mM. Más preferiblemente, los anticuerpos
se dejaron interaccionar con el antígeno inmovilizado a un pH en un
intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 y, más
preferiblemente, en un intervalo de aproximadamente 5,6 a
aproximadamente 5,8. Los anticuerpos de yema pueden disociarse de la
matriz antigénica por una sal caotrópica o a un pH de menos de
aproximadamente 4 o superior a aproximadamente 8. La actividad de
los anticuerpos recogidos puede restituirse, por ejemplo, mediante
diálisis exhaustiva contra un tampón de baja fuerza iónica que no
contiene caótropos y débilmente ácido.
La IgY(\DeltaFc) purificada de acuerdo
con el proceso de la invención ni activa el sistema del complemento
ni se une al factor reumatoide de sueros de mamíferos. La
reactividad cruzada inmunológica entre IgY(\DeltaFc) y la
IgG de mamíferos no es significativa. Por lo tanto, la invención
también proporciona un nuevo tipo de anticuerpo adecuado para usos
clínicos y de investigación.
La descripción también proporciona una amplia
diversidad de usos clínicos y de investigación del anticuerpo IgY
preparado de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la presente
descripción proporciona una composición farmacéutica para el
tratamiento o la profilaxis de un animal (que incluye aves
domésticas, animales de granja y de compañía) o pacientes humanos
que comprenden una cantidad terapéutica del anticuerpo IgY de la
presente invención para la protección o profilaxis de los mismos de
diversos agentes etiológicos, incluyendo microorganismos tales como
bacterias, virus nativos, recombinantes o peptídicos sintéticos,
hongos, protozoos, nematodos y similares y sustancias proteicas y
no proteicas, tales como alergenos, nativos, recombinantes o
peptídicos sintéticos, toxinas, venenos, hormonas y cualquier otro
inmunógeno capaz de provocar una respuesta inmune. Preferiblemente,
el anticuerpo IgY purificado se aplica en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua, solución salina
y similares. La composición farmacéutica puede administrarse por
medios que comprenden administración oral, inyección,
administración externa y tratamiento inmunizante.
El anticuerpo IgY también es útil para detectar
un agente etiológico de interés, incluyendo, por ejemplo, un
organismo patógeno o no patógeno, tal como Escherichia coli,
Salmonella enteritidis y otros organismos bacterianos; una
hormona nativa, recombinante o peptídico sintética, tal como
estrógeno, progesterona, tiroxina y similares; un antígeno de
complejo mayor de histocompatibilidad y similares; un marcador
tumoral nativo, recombinante o peptídico sintético tal como
alfa-fetoproteína, antígeno prostático específico y
similares; un marcador patológico tal como proteína
C-reactiva, ferritina y similares; una acumulación o
un residuo de materiales extraños tales como fármacos de Teofilina
y digoxina; en una muestra corporal tal como un fluido, tejido,
extracto celular y similares, que procede del ser humano o animal.
Para obtener anticuerpos específicos solamente contra los agentes
etiológicos, el agente etiológico puede inyectarse en los patos como
antígenos para inducir la producción de anticuerpos deseados, y los
que los antígenos comprenden antígenos naturalmente purificados,
antígenos recombinantes, antígenos peptídicos sintéticos y ADN
plasmídico. Usando el anticuerpo IgY obtenido, puede detectarse
cuantitativamente o cualitativamente un agente etiológico de interés
por cualquier método convencional conocido en la técnica, tal como
los métodos de Ouchternoly (MO), el método de inmunodifusión radial
simple (SRID), el método de inmunoelectroforesis (EP), el método de
radioinmunoensayo (RIA), el método de ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA), el método de transferencia de Western
(WB), el método de inmunoensayo turbidimétrico, el método de ensayo
turbidimétrico potenciado con partículas, un inmunoensayo
enzimático, un inmunoensayo nefelométrico, un inmunoensayo
quimioluminiscente, un inmunoensayo con nanopartículas de oro o un
ensayo de inmunocromatografía.
El anticuerpo IgY también está adaptado al uso
en biochips y biosensores.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan
solamente con el fin de una ilustración y no pretenden limitar el
alcance de la presente invención.
Ejemplo
1
Doce patos domésticos (Anas platyrhynchos
var. domestica) de 16 semanas de edad se alojaron
individualmente para producción de anticuerpos y huevos. Los patos
recibieron una inyección subcutánea inicial de 1-5
mg/ml de proteína C-reactiva humana (CRP;
purificada a partir de líquido ascítico humano) en tampón fosfato a
pH 7,5 emulsionada con un volumen equivalente de adyuvante completo
de Freund. Generalmente, la concentración del antígeno usado estaba
en el intervalo de 1 a 5 mg/ml. Después de la inyección inicial,
hembras jóvenes recibieron tres inyecciones adicionales de
1-5 mg de antígeno cada dos semanas. Una semana
después, los huevos comenzaron a recogerse, marcarse y almacenarse
a 4ºC hasta procesarse para la extracción y purificación de
anticuerpo. El procedimiento de refuerzo se repitió cada cuatro
semanas durante el experimento. Se extrajeron muestras de sangre el
séptimo día después de cada inyección de refuerzo. Cada muestra de
sangre se centrifugó y se recogió el suero resultante.
Ejemplo
2
Las yemas recogidas de los huevos puestos por
los patos hiperinmunizados del Ejemplo 1 se lavaron minuciosamente
mediante un chorro débil de agua destilada, para eliminar de este
modo el albumen. El volumen de yema se midió y después se mezcló
minuciosamente con agua destilada en una cantidad de diez veces la
cantidad medida de yema. Después, la mezcla se mantuvo durante al
menos dos horas a 4ºC y posteriormente se centrifugó a 10.000 rpm
en una centrífuga Hitachi CR-22F durante una hora.
Se formó una capa de sobrenadante clara y una capa flexible
semisólida en los tubos de centrífuga.
Ejemplo
3
Al extracto bruto preparado en el Ejemplo 2 se
añadió uno de los absorbentes: sílice pirógena al 2% (p/v)
(adquirida en Sigma), dióxido de silicio al 3% (p/v) (sigma), Celite
diatomite al 3% (p/v) (adquirido en Celite Corporation) y Celite
diatomite hyflo-Cel al 3 ó 5% (p/v) (Celite
Corporation). Las suspensiones resultantes se incubaron a 4ºC
durante 60 minutos con agitación suave. Después de la finalización
de la incubación, los absorbentes se precipitaron a 4ºC a 20.000
rpm en una centrífuga Hitachi CR-22F y los
sobrenadantes y sedimentos se recogieron por separado. Se
sometieron muestras de diez \mul tomadas de cada sobrenadante a
una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato
sódico (SDS-PAGE) no reductor.
Como se muestra en la Figura 1, en términos de
la cantidad de los anticuerpos adsorbidos por los absorbentes, la
sílice pirógena tiene la mejor actividad de adsorción y no quedaba
casi ningún anticuerpo en la solución de flujo continuo.
El dióxido de sílice presenta una afinidad
ligeramente inferior por inmunoglobulinas, que quizá es un resultado
de su menor porosidad (y que, por lo tanto, comprende un área
superficial menos amplia), que la sílice pirógena. Por otro lado,
se capturaron menos del 10% de los anticuerpos de yema por
cualquiera de los tipos de las tierras de
diatomeas.
diatomeas.
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Ejemplo
4
El sedimento de sílice pirógena obtenido en el
Ejemplo 3 se trató con tiocianato de sodio 2,5 M (pH 7,4) para
eluir los anticuerpos unidos sobre el mismo. El eluido resultante se
precipitó primero con sulfato de amonio a una concentración de
aproximadamente el 21% (p/v) en base al volumen del eluido, seguido
de una segunda precipitación con adición de sulfato de amonio a
aproximadamente el 31% (p/v). Los productos de anticuerpos
precipitados se volvieron a disolver en solución salina tamponada
con fosfato (PBS). Se realizó una SDS-PAGE
analítica en un gel de acrilamida no reductor al 8%, en el que se
cargaron 2237 \mug del extracto bruto del ejemplo 2 (carril 1),
10 \mul del flujo continuo recogido en el Ejemplo 3 (carril 2),
1122,25 \mug del eluido del sedimento de sílice pirógena (carril
3) y 153 \mug y 372,85 \mug de los productos de anticuerpos
obtenidos en la primera y segunda etapas de precipitación (carril 4
y carril 5, respectivamente). El resultado se muestra en la Figura
2. Los porcentajes de recuperación y pureza se determinaron por
densitometría de barrido del gel y se resumen en la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se ilustra en la Tabla 1, los anticuerpos
IgY(\DeltaFc) resultantes se recuperaron en un rendimiento
de aproximadamente el 76% (72,05 mg/119,86 mg x 100%) en una pureza
superior al 96%. Lo que es más importante, este esquema de
purificación conduce ventajosamente a la separación esencial de los
anticuerpos IgY(\DeltaFc) deseados a partir de la
población total de anticuerpos de yema constituida principalmente
tanto por IgY como por IgY(\DeltaFc).
Beneficiándose de la capacidad de la tierra de
diatomeas para atraer lípidos y repeler anticuerpos, el extracto
bruto preparado en el Ejemplo 2, se vertió sobre una columna de
filtración empaquetada con el 10% en peso de Celite diatomite en
base al volumen vertido del extracto. La solución que fluye a través
de la columna se recogió y se sometió a una primera precipitación
con sulfato de amonio al 21% (p/v) en base al volumen de la
solución de flujo continuo. Los anticuerpos precipitados se
recogieron y el sobrenadante se dividió en dos partes. Una parte
del sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio a una
concentración de aproximadamente el 31% (p/v) mientras que la otra
parte se precipitó con sulfato de sodio al 16% (p/v). Los productos
de anticuerpos precipitados se volvieron a disolver en PBS. Se
realizó una SDS-PAGE analítica en un gel de
acrilamida no reductor al 8% en el que se cargaron 2012,5 \mug
del extracto bruto del Ejemplo 2 (carril 1), 1678 \mug del flujo
continuo recogido por filtración en Celite diatomite (carril 2),
94,9 \mug del eluido obtenido en la primera etapa de
precipitación (carril 3) y 169,65 \mug y 357,75 \mug de los
productos de anticuerpos obtenidos en la segunda etapa de
precipitación por sulfato de amonio al 31% y sulfato de sodio al 16%
(carriles 4-5). El resultado se muestra en la
Figura 3. Los porcentajes de recuperación y pureza se determinaron
por densitometría de barrido del gel y se resumen en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ilustra en la Tabla 2, los anticuerpos
IgY(\DeltaFc) resultantes se recuperaron en una pureza de
aproximadamente el 77% (cuando se usó sulfato de sodio en la segunda
etapa de precipitación) y del 69% (cuando se usó sulfato de amonio
en la segunda etapa de precipitación), respectivamente, con altos
rendimientos.
Ejemplo
6
Se preparó una solución de proteína C reactiva
(CRP) en tampón carbonato 0,1 M a pH 8,5 a una concentración de 5
mg/ml. Sepharose 4B activada con CNBr adquirida en Pharmacia se lavó
inicialmente con HCl frío 1 mM en una cantidad de diez veces el
volumen de matriz y se dejó reaccionar con la solución de CRP en una
cantidad de dos veces el volumen de matriz a 4ºC durante una noche.
La matriz antigénica se suspendió en una solución de etanolamina
0,5 M en Tris-HCl 20 mM (pH 8,5) en una proporción
de 1:1 (v/v) durante 2 horas a 4ºC para bloquear los sitios
reactivos con proteína restantes. La matriz antigénica se lavó
después con PBS que contenía azida sódica al 0,02% y se almacenó a
4ºC.
Se usaron los anticuerpos de pato precipitados
con sulfato de amonio al 21% (p/v) en el Ejemplo 4 y la matriz
antigénica preparada anteriormente. Se empaquetó un ml de la matriz
antigénica en una columna convencional y se empapó en 20 mM de
tampón MES (ácido
2[N-morfolino]etanosulfónico) (pH
5,8). La matriz antigénica se dejó reaccionar con 0,25 ml de los
anticuerpos formulados en el mismo tampón de unión. La matriz
antigénica se lavó con el tampón de unión hasta que el efluente
estaba sustancialmente libre de proteína. Los anticuerpos unidos se
eluyeron inmediatamente con guanidina-HCl 6 M y se
midió la densidad óptica de los mismos a 280 nm después de una
diálisis completa. El análisis de SDS-PAGE que se
muestra en la Figura 4 indica que los anticuerpos purificados por
afinidad están constituidos principalmente por anticuerpo
IgY(\DeltaFc), que está representado por una sola banda en
el gel.
Aunque se han ilustrado y descrito realizaciones
de la presente invención, pueden realizarse diversas modificaciones
y mejoras por especialistas en la técnica. Las realizaciones de la
presente invención se escriben por lo tanto en un sentido
ilustrativo pero no restrictivo. Se pretende que la presente
invención no esté limitada a las formas particulares que se
ilustran.
Claims (14)
1. Un proceso para aislar selectivamente
anticuerpos IgY de yema de huevo de un ave anseriforme,
comprendiendo dicho proceso:
(a) absorber anticuerpos de yema en una fracción
miscible en agua obtenida a partir de la yema de huevo de un ave
anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua
en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de
silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el
constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase
estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los
anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua; y
(b) hacer fluir el constituyente activo no
cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón
para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de
yema.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el silicato comprende arcilla sintética o natural,
caolín, talco o silicato de calcio; el compuesto de silicio
comprende sílice pirógena, sílice amorfa, dióxido de sílice, gel de
sílice, silicatos, tierra de diatomeas o tierra de Fuller; el
carbono comprende carbono activado o fibra de carbono; y la fibra
de celulosa o sintética polvo de celulosa.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que el tampón para hacer fluir el constituyente activo
no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria en la etapa (b)
comprende una sal caotrópica, y en el que la sal caotrópica
comprende guanidina-HCl de 3 M a 6 M o tiocianato de
sodio de 1 M a 3 M.
4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la fracción acuosa que
contiene los anticuerpos de yema en la etapa (b) es una solución de
flujo continuo que ha fluido a través del constituyente activo no
cargado insoluble en agua en la fase estacionaria.
5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fracción acuosa que
contiene los anticuerpos de yema en la etapa (b) es un eluido
obtenido por elución del constituyente activo no cargado insoluble
en agua en la fase estacionaria.
6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
(c) precipitación salina de la fracción acuosa
que contiene anticuerpos de yema en la etapa (b) con
(NH4)_{2}SO_{4} de una primera concentración que varía
del 15% (p/v) al 24% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa;
y
(d) precipitación salina de la fracción acuosa
que contiene anticuerpos de yema tratada en la etapa (c) con
(NH_{4})_{2}
SO_{4} de una segunda concentración que varía del 25% (p/v) al 40% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la etapa (c).
SO_{4} de una segunda concentración que varía del 25% (p/v) al 40% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la etapa (c).
7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
6, en el que la primera concentración de
(NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior al 21% (p/v) en base
al volumen de la fracción acuosa.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6
ó 7, en el que la segunda concentración de
(NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior al 31% (p/v) en base
al volumen de la fracción acuosa tratada en la primera precipitación
salina.
9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el ave anseriforme es un
pato o un ganso.
10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos de yema
se recuperan a partir de la fracción acuosa.
11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de
purificación mediante una cromatografía de inmunoafinidad a un valor
de pH que varía de 4 a 7 en una fuerza iónica de menos de 50
mM.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el valor de pH varía de 5 a 6 en una fuerza iónica de
menos de 50 mM.
13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el valor de pH varía de 5, 6 a 5,8 en una fuerza
iónica de menos de 50 mM.
14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos IgY
comprenden anticuerpos con regiones Fc y anticuerpos sin regiones
Fc.
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