ES2323744T3 - Sistema retroviral de suministro de genes y metodos de uso. - Google Patents
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Abstract
Un oncorretrovirus con capacidad de replicación recombinante que comprende: una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína GAG retroviral; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína POL retroviral; una secuencia de ácido nucleico que codifica una envuelta retroviral; una secuencia polinucleotídica retroviral que comprende secuencias de Repetición Terminal Larga (LTR) en el extremo 5'' y 3'' de la secuencia polinucleotídica retroviral, donde una secuencia de promotor específico de tejido está contenida dentro de las secuencias LTR en el extremo 5'' y/o 3'' de la secuencia polinucleotídica retroviral, siendo dicho promotor un promotor de un mamífero, un casete que comprende un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) unido operativamente a un gen heterólogo, donde el casete se coloca justo cadena abajo de la secuencia que codifica la envuelta retroviral pero cadena arriba de la LTR 3''; y secuencias de ácido nucleico que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, el empaquetamiento y la integración en una célula diana; donde la secuencia polinucleotídica retroviral se obtiene de virus de leucemia murina (MLV), virus de leucemia murina de Moloney (MoMLV) o virus de leucemia de gibón (GALV).
Description
Sistema retroviral de suministro de genes y
métodos de uso.
Esta solicitud reivindica prioridad de la
Solicitud Provisional Nº de Serie 60/102.933, presentada el 1 de
octubre de 1998, para cuya solicitud se realiza una reivindicación
de prioridad en relación al 35 U.S.C. \NAK 119(e).
La presente invención se refiere de forma
general al campo de vectores virales y específicamente a un
retrovirus con capacidad de replicación recombinante novedoso útil
para la transferencia y expresión de secuencias de ácido nucleico
en una célula convertida en diana.
El desarrollo de vectores genéticos ha sido el
precursor del campo de crecimiento rápido de la transferencia de
genes somáticos. (Anderson, W. F., Science, 1984, 226:
401-409). Los vectores basados en retrovirus
simples, tales como el Virus de Leucemia de Moloney (MoMLV), se
seleccionan a menudo debido a que se integran de forma eficaz en el
genoma de la célula diana. Se piensa que la integración es un
requisito previo para expresión a largo plazo del gen introducido
por transducción. Sin embargo, la transferencia eficaz de genes a
tejido tumoral ha sido un impedimento principal para el tratamiento
de trastornos proliferativos de células a pesar del uso de vectores
virales tales como retrovirus.
En las etapas tempranas de la infección, los
retrovirus suministran su centro vírico de nucleoproteína al
citoplasma de la célula diana. En este punto tiene lugar la
transcripción inversa del genoma viral mientras que el centro
vírico madura en un complejo de preintegración. El complejo tiene
que alcanzar el núcleo para conseguir la integración del ADN viral
en los cromosomas de la célula hospedadora. Para retrovirus simples
(oncorretrovirus), esta etapa requiere la disolución de la membrana
nuclear en la profase mitótica, muy probablemente debido a que el
tamaño voluminoso del complejo de preintegración evita su difusión
pasiva a través de los poros nucleares debido a que no existen
señales de localización nuclear para facilitar el transporte activo
al núcleo.
Actualmente, la mayoría de los vectores
retrovirales usados para terapia génica humana no tienen capacidad
de replicación y se tienen que producir en "células de
empaquetamiento", que contienen secuencias de genoma de virus de
tipo silvestre integrados y, por tanto, proporcionan todos los
elementos estructurales necesarios para ensamblar virus (es decir,
los productos génicos de gag, pol y env) pero no pueden
encapsidar sus propios genomas de virus de tipo silvestre debido a
una deleción de la secuencia señal de empaquetamiento (psi).
La técnica anterior también describe diversas construcciones
retrovirales con capacidad de replicación que se usaron con éxito
variable para la introducción y expresión de genes heterólogos
(Schmidt y Rethwilm, Virology 210, 167-178 (1995);
Terwilliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
3857-3861 (1989); Chang et al., J. Virol.
67(3), 743-752 (1993); Murakami et
al., Gene 202, 23-29 (1997)). Los vectores de
virus sin capacidad de replicación creados por la retirada de los
genes estructurales virales y sustitución con genes terapéuticos se
introducen en las células de empaquetamiento; siempre que esos
vectores contengan la señal psi, pueden aprovecharse de las
proteínas estructurales proporcionadas por las células y
encapsidarse en un virión. Sin embargo, después de la infección de
una célula diana, los vectores no tienen capacidad
de infecciones horizontales secundarias de células adyacentes debido a la deleción de los genes virales esenciales.
de infecciones horizontales secundarias de células adyacentes debido a la deleción de los genes virales esenciales.
El uso de vectores sin capacidad de replicación
ha sido una defensa importante contra la propagación incontrolada
del virus, ya que se ha demostrado que los retrovirus con capacidad
de replicación provocan neoplasias en primates (Donahue et
al., J. Exp. Med., 1992, 176: 1124-1135). Sin
embargo, los vectores retrovirales sin capacidad de replicación se
producen por las células de empaquetamiento con títulos del orden de
solamente 10^{6-7} unidades formadoras de
colonias (ufc) por ml, que apenas son adecuados para la transducción
in vivo. De hecho, los experimentos clínicos para terapia
génica de glioblastoma multiforme, un tumor cerebral altamente
maligno, han tropezado con problemas importantes para conseguir
niveles adecuados de transducción de célula tumoral y a pesar de
resultados iniciales prometedores en estudios con animales (Culver
et al., Science, 1992, 256: 1550-1552). Para
aumentar los niveles de transducción tanto como sea posible, en vez
del uso de una única dosis de sobrenadante que contiene virus, se
inyectó la propia línea celular PA317 de empaquetamiento de virus
en los tumores cerebrales para producir de forma constitutiva
vectores de retrovirus que portan el gen HSV-tk
(Oldfield et al., Human Gene Therapy, 1993, 4:
39-69). Posteriormente, el protocolo se modificó
adicionalmente para incluir un procedimiento de desvoluminización
seguido de múltiples sitios de inyección, ya que se observó que los
vectores de virus no difunden lo suficiente desde el sitio de la
inyección inicial. A pesar de estas modificaciones, se ha estimado
que la eficacia de transducción es inferior al 1% de la masa de
células tumorales y se supone que cualquier destrucción
significativa de tumor se debe al efecto "espectador" potente
del tratamiento con HSV-tk/ganciclovir. Por tanto,
la transducción eficaz de células cancerosas en una masa de tumor
sólido representa un problema importante para la terapia génica de
cáncer.
En consecuencia, existe una necesidad de un
vector de transferencia de genes con capacidad de un alto nivel de
transducción in vivo, aunque limitando la propagación
incontrolada de virus con capacidad de replicación, lo que podría
dar como resultado mutagénesis insercional y carcinogénesis.
La presente invención proporciona vectores
retrovirales con capacidad de replicación recombinantes para
suministro de genes. Los vectores proporcionan un alto nivel de
transducción in vivo. El uso de vectores con capacidad de
replicación de la invención permite la transducción in vivo
eficaz. La incorporación de secuencias polinucleotídicas dirigidas
a tipo celular en tales vectores reduce o elimina el potencial
patógeno nativo de retrovirus con capacidad de replicación mientras
que mejora su especificidad de célula diana.
En una realización, la presente invención
proporciona un oncorretrovirus con capacidad de replicación
recombinante que tiene un ácido nucleico que codifica una proteína
GAG retroviral; un ácido nucleico que codifica una proteína POL
retroviral; un ácido nucleico que codifica una envuelta retroviral;
una secuencia polinucleotídica retroviral que comprende secuencias
de Repetición Terminal Larga (LTR) en los extremos 5' y 3' del
genoma retroviral, donde una secuencia de promotor específico de
tejido está contenida dentro de las secuencias LTR en el extremo 5'
y/o 3' de la secuencia polinucleotídica retroviral, siendo dicho
promotor un promotor de mamífero, un casete que comprende un sitio
interno de entrada de ribosoma (IRES) unido operativamente a un gen
heterólogo donde el casete se coloca justo cadena abajo de la
secuencia que codifica la envuelta retroviral pero cadena arriba de
la LTR 3'; y secuencias de ácido nucleico que actúan en cis
necesarias para la transcripción inversa, el empaquetamiento y la
integración en una célula diana, donde la secuencia polinucleotídica
retroviral se obtiene de virus de leucemia murina (MLV), virus de
leucemia murina de moloney (MoMLV) o virus de leucemia de gibón
(GaLV). El promotor puede estar asociado con un gen regulador del
crecimiento, tal como, por ejemplo, probasina. Para dirigir el
retrovirus a una célula o tejido específico, la envuelta retroviral
puede comprender una proteína quimérica que comprende proteína ENV
y una secuencia de ligando específico de diana que codifica, por
ejemplo, un anticuerpo, receptor o ligando tal como heregulina.
En otra realización, la presente invención
proporciona un polinucleótido oncorretroviral con capacidad de
replicación recombinante, que tiene una secuencia de ácido nucleico
que codifica una proteína GAG retroviral; una secuencia de ácido
nucleico que codifica una proteína POL retroviral; una secuencia de
ácido nucleico que codifica una envuelta retroviral; una secuencia
polinucleotídica retroviral que comprende una Repetición Terminal
Larga (LTR) en el extremo 5' y 3' de la secuencia polinucleotídica
retroviral, donde una secuencia de promotor específico de tejido
está contenida dentro de la LTR en el extremo 5' y/o 3' de la
secuencia polinucleotídica retroviral; siendo dicho promotor un
promotor de mamífero, un casete que comprende un sitio interno de
entrada de ribosoma (IRES) unido operativamente a un gen
heterólogo, donde el casete se coloca justo cadena abajo de la
secuencia que codifica la envuelta retroviral pero cadena arriba de
la LTR 3'; y una secuencia polinucleotídica que actúa en cis
necesaria para la transcripción inversa, el empaquetamiento y la
integración en una célula diana. La secuencia de promotor
específico de tejido es, por ejemplo, una asociada con un gen
regulador del crecimiento o una asociada con un marcador de cáncer
(por ejemplo, probasina). La envuelta retroviral puede comprender
una proteína quimérica que comprende proteína ENV con una secuencia
polinucleotídica de ligando específico de diana, por ejemplo, una
secuencia que codifica un anticuerpo, un receptor (por ejemplo, un
receptor de hormona) o un ligando, tal como, por ejemplo,
heregulina.
Éstos y otros aspectos de la presente invención
como se definen en las reivindicaciones serán evidentes para los
especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas de este
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 (A) es una ilustración esquemática
de la estructura de retrovirus MoMLV (con capacidad de replicación)
de tipo silvestre; LTR = repetición terminal larga. (B) es una
representación esquemática de g1ZD-GFP y
gIZD-higro, que muestra los tamaños de los casetes
de transgén-IRES y el sitio de su inserción en el
genoma de MLV de tipo silvestre. Las flechas indican la ubicación
de los sitios NheI usados para digerir ADN para análisis de
hibridación de Southern y las líneas onduladas indican regiones de
los vectores sondadas en análisis de hibridación. También se
muestran las secuencias de g1ZD-GFP y
g1ZD-higro en ubicaciones entre el gen env e
IRES, IRES y GFP y GFP y LTR 3'. Las letras en negrita indican
codones de inicio o terminación presentes dentro de las
uniones.
La Figura 2 es una ilustración esquemática de la
estructura de los vectores basados en MoMLV modificados de la
presente invención. A) Un diagrama esquemático de la estructura de
vectores retrovirales con capacidad de replicación (RCR) basados en
MoMLV que contienen un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES).
B) Un diagrama esquemático de vectores retrovirales con capacidad
de replicación (RCRV) dirigidos.
La Figura 3 es un gráfico que ilustra un ensayo
de transcriptasa inversa de vectores RCR basados en MoMLV
propagados por células NIH3T3 en cultivo. Simulado = control
negativo no infectado; gIZAP = virus MoMLV con capacidad de
replicación de tipo silvestre; gIZD-gfp = virus
MoMLV con capacidad de replicación con sitio interno de entrada de
ribosoma IRES en el extremo 3' del gen de envuelta y transgén de
proteína verde fluorescente (GFP); gIZD-puro =
virus MoMLV con capacidad de replicación con IRES en el extremo 3'
de gen de envuelta y transgén de resistencia a puromicina (PURO®);
gIZD-higro = virus MoMLV con capacidad de
replicación con IRES en el extremo 3' del gen de envuelta y
transgén de resistencia a higromicina (HIGRO®). (B) muestra una
comparación de Cinéticas de Replicación de Vectores con Capacidad de
Replicación y MoMLV de Tipo silvestre en Células Cultivadas.
\newpage
La Figura 4 son gráficos que muestran análisis
de separador de células activadas por fluorescencia (FACS) de
expresión de GFP de vector RCR gIZD-gfp propagado en
diversos puntos de tiempo (Día 2, Día 4 y Día 7) después de
infección inicial.
La Figura 5 es un gráfico que ilustra la
estabilidad de la expresión del transgén de GFP del vector
gIZD-GFP con capacidad de replicación a lo largo de
múltiples pases seriados.
La Figura 6 es una fotografía de gel que muestra
la estabilidad del vector gIZD-GFP con capacidad de
replicación a lo largo de múltiples pases seriados. El carril P es
una muestra de control que contiene ADN plasmídico de
g1ZD-GFP (A) o g1ZD-higro (B)
digerido con NheI. Los demás números de carril indican el
número de pase seriado. (A) ADN de células infectadas con
g1ZD-GFP sondado con el ADNc de GFP (izquierda) y
con el fragmento LTR-gag (derecha). (B) ADN de
células infectadas con g1ZD-higro sondado con el gen
de resistencia a higromicina (izquierda) y con el fragmento
LTR-gag (derecha). Se observa
gIZD-GFP de longitud completa intacto hasta al
menos el pase Nº 11 (A, B). Un mutante de deleción más corto aparece
en los pases Nº 7-8 que después se convierte en la
forma dominante. N indica carriles que contienen ADN Hirt aislado de
células NIH3T3 no infectadas.
La Figura 7 es un esquema que muestra el
experimento y los resultados que demuestran la propagación
intra-tumoral altamente eficaz del vector
gIZD-GFP con capacidad de replicación con un modelo
de cáncer de mama establecido por vía subcutánea.
La Figura 8 es un esquema de un vector
retroviral recombinante de la invención que contiene una secuencia
de promotor de probasina.
La Figura 9 muestra la construcción de un
retrovirus con capacidad de replicación recombinante de la invención
dirigido a células de cáncer de próstata.
La Figura 10 ilustra una estrategia usada para
determinar la especificidad de células de próstata y capacidad de
inducción por andrógenos del promotor híbrido de
probasina-LTR.
La Figura 11 muestra los resultados del ensayo
ilustrado en la figura 10.
La Figura 12 ilustra una estrategia usada para
examinar la regulación de la transcripción de vectores RCR
dirigidos por el promotor híbrido de
probasina-LTR.
La Figura 13 muestra los resultados de la
expresión que responde a andrógenos dirigida por
probasina-LTR del transgén de GFP del vector RCR
después de la infección de células TRAMP-C.
La Figura 14 muestra la estructura de vectores
RCR con secuencias IRES más cortas.
La Figura 15 muestra una comparación de los
niveles de expresión de GFP en células infectadas con vectores que
utilizan tres secuencias IRES diferentes.
La Figura 16 es un análisis de Transferencia de
Southern de ADN proviral no integrado de células cultivadas
infectadas de forma seriada con ZB-GFP (A) o
ZV-GFP (B). Las sondas usadas eran para la región
LTR-gag de Mo-MLV.
La Figura 17 es un esquema de vectores RCR
dirigidos a dominio Z. Ambos vectores contienen 2 copias en tándem
del dominio Z de proteína A con la PRR del gen de envuelta. En
ZE-GFP, la traducción de GFP se dirige por el IRES
de EMCV y en ZV-A-GFP, por el IRES
de VEGF.
La Figura 18 es un esquema que muestra la
estructura de envuelta de vectores RCR que contienen scFv
anti-HER2. ss: secuencia señal; SU: proteína de
superficie; RBD: dominio de unión a receptor; PRR: región rica en
prolina; C-SU: extremo C de SU; TM: proteína
transmembrana; espaciador: un espaciador sintético de 6
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para facilitar la comprensión de la invención a
continuación se definen varios términos.
"Polinucleótido" o "secuencia de ácido
nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al
menos 9 bases de longitud. Con "secuencia de ácido nucleico
aislado" se quiere decir un polinucleótido que no es
inmediatamente contiguo a ninguna de las secuencias codificantes a
la que es inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y una en el
extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que se
obtiene. Por lo tanto, la expresión incluye, por ejemplo, un ADN o
ARN recombinante que se incorpora en un vector viral. Los
nucleótidos de la invención pueden ser ribonucleótidos,
desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquier
nucleótido. La expresión incluye formas monocatenarias y
bicatenarias de ADN. El término polinucleótido o polinucleótidos se
refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o
polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o
ARN o ADN modificado. Por tanto, por ejemplo, los polinucleótidos
como se usan en este documento se refieren, entre otras cosas, a
ADN mono- y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y
bicatenarias, ARN mono- y bicatenario y ARN que es una mezcla de
regiones mono- y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden
ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente,
bicatenarias o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias.
Además, el polinucleótido como se usa en este
documento también se puede referir a regiones tricatenarias que
comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales
regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes.
Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas,
pero más típicamente implican solamente una región de algunas de
las moléculas. Con frecuencia, una de las moléculas de una región
de triple hélice es un oligonucleótido.
Como se usa en este documento, el termino
polinucleótido incluye ADN o ARN como se han descrito anteriormente
que contienen uno o más bases modificadas. Por tanto, los ADN o ARN
con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otros
motivos son "polinucleótidos" como ese término se usa en este
documento. Además, los ADN o ARN que comprenden bases no
habituales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como
bases tritiladas, por nombrar solamente dos ejemplos, son
polinucleótidos como se usa el término en este documento.
Se entenderá que se tiene que realizar una gran
diversidad de modificaciones en ADN y ARN que sirven para muchos
propósitos útiles conocidos por los especialistas en la técnica. El
término polinucleótido como se emplea en este documento incluye
tales formas modificadas químicamente, enzimáticamente o
metabólicamente de polinucleótidos, así como las formas químicas de
ADN y ARN características de virus y células, que incluyen células
simples y complejas, entre otras cosas.
La presente invención proporciona un
oncorretrovirus con capacidad de replicación recombinante capaz de
infectar células convertidas en diana. El virus es útil para la
transferencia in vivo y ex vivo y expresión de genes
y secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, en células en
división). En particular, los presentes vectores oncorretrovirales
son útiles para dirigirse a tipos celulares específicos que
incluyen, pero sin limitación, células neoplásicas o células que
tienen trastornos proliferativos de células.
La presente invención tiene muchas utilidades.
Por ejemplo, el oncorretrovirus de la presente invención se puede
usar para proporcionar un producto terapéutico a un sujeto, para
proporcionar suministro de genes de una proteína no terapéutica o
una proteína terapéutica a un sujeto, así como en estudios in
vitro para proporcionar a una célula un gen para expresión de
un producto génico. Tales métodos in vitro son útiles, por
ejemplo, en producción de proteína y el estudio de regulación e
interacción de productos que actúan en cis y
polipéptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los retrovirus son virus ARN en los que el
genoma viral es ARN. Cuando una célula hospedadora se infecta con
un retrovirus, el ARN genómico se transcribe de forma inversa en un
intermedio de ADN que se integra de forma muy eficaz en el ADN
cromosómico de células infectadas. El intermedio de ADN integrado se
denomina un provirus. La familia Retroviridae son virus ARN
monocatenarios envueltos que infectan típicamente mamíferos, tales
como, por ejemplo, bovinos, monos, ovejas y seres humanos, así como
especies aviares. Los retrovirus son únicos entre los virus ARN por
que su multiplicación implica la síntesis de una copia de ADN del
ARN que se integra después en el genoma de la célula infectada.
La familia Retroviridae consiste en tres
grupos: los espumavirus (o virus espumosos) tales como los virus
espumosos humanos (HFV); los lentivirus, así como un virus visna de
oveja; y los oncovirus (aunque no todos los virus dentro de este
grupo son oncogénicos). El término "lentivirus" se usa en su
sentido convencional para describir un género de virus que
contienen transcriptasa inversa. Los lentivirus incluyen los
"virus de inmunodeficiencia" que incluyen virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) de tipo 1 y tipo 2
(VIH-1 y VIH-2) y virus de
inmunodeficiencia de simio (VIS). Los oncovirus se subdividen
adicionalmente en grupos A, B, C y D basándose en la morfología de
partículas, como se observa bajo el microscopio electrónico durante
la maduración viral. Las partículas de tipo A representan las
partículas inmaduras de los virus de tipo B y D observadas en el
citoplasma de células infectadas. Estas partículas no son
infecciosas. Las partículas de tipo B realizan gemación como virión
maduro desde la membrana plasmática por la envuelta de partículas de
tipo A intracitoplasmáticas. En la membrana poseen un centro vírico
toroidal de \sim75 nm, del que sobresalen espículas de
glucoproteína largas. Después de la gemación, las partículas de
tipo B contienen un centro vírico electrodenso localizado
excéntricamente. El prototipo del virus de tipo B es el virus de
tumor mamario de ratón (MMTV). No se pueden observar partículas
intracitoplasmáticas en células infectadas por virus de tipo C. En
su lugar, las partículas maduras realizan gemación directamente
desde la superficie celular por una condensación con forma de
"C" a modo de semicírculo que después se cierra sobre sí misma
y queda rodeada por la membrana plasmática. Las espículas de
glucoproteína de envuelta pueden ser visibles, junto con un centro
vírico uniformemente electrodenso. La gemación puede tener lugar
desde la membrana plasmática superficial o directamente en vacuolas
intracelulares. Los virus de tipo C son los estudiados más
comúnmente e incluyen muchos de los virus de leucemia aviar y murina
(MLV). El virus de leucemia bovina (BLV) y los virus de leucemia de
células T humanos de los tipos I y II (HTLV-I/II)
se clasifican de forma similar a las partículas de tipo C debido a
la morfología de su gemación desde la superficie celular. Sin
embargo, también tienen una morfología hexagonal regular y
estructuras genómicas más complejas que los virus de tipo C
prototípicos tales como los virus de leucemia murina (MLV). Las
partículas de tipo D se parecen a las partículas de tipo B porque
muestran estructuras a modo de anillo en el citoplasma de la célula
infectada, que realizan gemación desde la superficie celular, pero
el virión incorpora espículas de glucoproteína superficial cortas.
Los centros víricos electrodensos también se ubican excéntricamente
dentro de las partículas. El virus de mono Mason Pfizer (MPVM) es
el prototipo de virus de tipo D.
Los retrovirus se definen por el modo en el que
replican su material genético. Durante la replicación, el ARN se
convierte en ADN. Después de la infección de la célula se genera una
molécula bicatenaria de ADN a partir de las dos moléculas de ARN
que se llevan en la partícula viral por el proceso molecular
conocido como transcripción inversa. La forma de ADN se integra
covalentemente en el genoma de la célula hospedadora como un
provirus, del que se expresan ARN virales con la ayuda de factores
celulares y/o virales. Los ARN virales expresados se empaquetan en
partículas y se liberan como virión infeccioso.
La partícula de retrovirus está compuesta por
dos moléculas idénticas de ARN. Cada genoma de tipo silvestre tiene
una molécula de ARN monocatenaria de sentido positivo, que tiene una
caperuza en el extremo 5' y está poliadenilada en la cola 3'. La
partícula de virus diploide contiene las dos cadenas de ARN que
forman complejos con proteínas gag, enzimas virales (productos
génicos de pol) y moléculas de ARNt hospedador dentro de una
estructura de "centro vírico" de proteínas gag. Rodeando y
protegiendo esta cápsida hay una bicapa lipídica, obtenida de
membranas de la célula hospedadora y que contiene proteínas de
envuelta (env) virales. Las proteínas env se unen a un receptor
celular para el virus y la partícula entra típicamente en la célula
hospedadora por endocitosis mediada por receptor y/o fusión de
membranas.
Después de despojarse de la envuelta externa, el
ARN viral se copia en ADN por transcripción inversa. Esto se
cataliza por la enzima transcriptasa inversa codificada por la
región pol y usa el ARNt de la célula hospedadora empaquetado en el
virión como un cebador para la síntesis de ADN. De este modo, el
genoma de ARN se convierte en el genoma de ADN más complejo.
El ADN lineal bicatenario producido por
transcripción inversa se tiene, o no se tiene, que circularizar en
el núcleo. Ahora, el provirus tiene dos repeticiones idénticas en
cada extremo, conocidas como las repeticiones terminales largas
(LTR). Los extremos de las dos secuencias de LTR producen el sitio
reconocido por un producto de pol -la proteína integrasa- que
cataliza la integración, de tal forma que el provirus siempre está
unido al ADN hospedador a dos pares de bases (pb) de los extremos
de las LTR. Se observa una duplicación de secuencias celulares en
los extremos de ambas LTR, una reminiscencia del patrón de
integración de elementos genéticos de transposición. Se piensa que
la integración tiene lugar esencialmente de forma aleatoria dentro
del genoma de la célula diana. Sin embargo, mediante modificación
de las repeticiones terminales largas es posible controlar la
integración de un genoma retroviral.
La transcripción, el corte y empalme de ARN y la
traducción del ADN viral integrado están mediados por proteínas de
la célula hospedadora. Se generan transcritos de corte y empalme
diverso. En el caso de los retrovirus humanos
VIH-1/2 y HTLV-1/2, las proteínas
virales también se usan para regular la expresión génica. La
interacción entre factores celulares y virales es importante para
el control de la latencia del virus y la secuencia temporal en la
que se expresan los genes virales.
Los retrovirus se pueden transmitir
horizontalmente y verticalmente. La transmisión infecciosa eficaz de
retrovirus requiere la expresión en la célula diana de receptores
que reconocen específicamente las proteínas de envuelta viral,
aunque los virus pueden usar vías de entrada no específicas
independientes de receptor con baja eficacia. Además, el tipo de
célula diana tiene que ser capaz de soportar todas las etapas del
ciclo de replicación después de que se haya unido y penetrado el
virus. La transmisión vertical tiene lugar cuando el genoma viral
se integra en la línea germinal del hospedador. Después, el provirus
se pasará de generación a generación como si fuera un gen celular.
Por lo tanto, se establecen provirus endógenos que frecuentemente
existen de forma latente, pero que se pueden activar cuando el
hospedador se expone a agentes apropiados.
Como se ha mencionado anteriormente, el
intermedio de ADN integrado se denomina un provirus. La terapia
génica o los sistemas de suministro de genes anteriores usan
métodos y retrovirus que requieren la transcripción del provirus y
el ensamblaje en virus infeccioso mientras que está en presencia de
un virus auxiliar apropiado o en una línea celular que contiene
secuencias apropiadas que permiten la encapsidación sin producción
coincidente de un virus auxiliar contaminante. Como se describe más
adelante, no se requiere un virus auxiliar para la producción del
oncorretrovirus recombinante de la presente invención, ya que las
secuencias para encapsidación se proporcionan en el genoma,
proporcionando de este modo un vector oncorretroviral con capacidad
de replicación para suministro o terapia génica.
El genoma oncorretroviral y el ADN proviral de
la presente invención tienen al menos tres genes: el gag, el
pol y el env, que están flanqueados por dos secuencias de
repetición terminal larga (LTR) que contienen secuencias que actúan
en cis tales como psi. El gen gag codifica las
proteínas estructurales internas (matriz, cápsida y nucleocápsida);
el gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida por ARN
(transcriptasa inversa), proteasa e integrasa; y el gen env
codifica glucoproteínas de envuelta viral. Las LTR 5' y 3' sirven
para promover la transcripción y poliadenilación de los ARN de
virión. Las LTR contienen todas las demás secuencias que actúan en
cis necesarias para la replicación viral.
\newpage
De forma adyacente a la LTR 5' hay secuencias
necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de
unión a cebador de ARNt) y para encapsidación eficaz de ARN viral en
partículas (el sitio Psi). Si las secuencias necesarias para la
encapsidación (o el empaquetamiento de ARN retroviral en virión
infeccioso) están ausentes en el genoma viral, el resultado es un
defecto cis que evita la encapsidación de ARN viral
genómico. Este tipo de vector modificado es el que se ha usado
típicamente en sistemas de suministro de genes anteriores (es
decir, sistemas que carecen de elementos que se requieren para la
encapsidación del virión).
En una primera realización, la invención
proporciona un oncorretrovirus con capacidad de replicación
recombinante capaz de infectar una célula en división o una célula
que tiene un trastorno proliferativo de células. El oncorretrovirus
con capacidad de replicación recombinante de la presente invención
comprende una secuencia polinucleotídica que tiene un GAG viral, un
POL viral, un ENV viral, un polinucleótido heterólogo y una o más
secuencias polinucleotídicas dirigidas para la dirección específica
de célula o tejido del retrovirus a un tejido, célula o tipo
celular particular, como se describe en este documento.
La secuencia de ácido nucleico heteróloga se une
operativamente a un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES).
Como se usa en este documento, el término secuencia de ácido
nucleico "heteróloga" o "transgén" se refiere a una
secuencia que no existe normalmente en la naturaleza (por ejemplo,
en el retrovirus de tipo silvestre) o una secuencia que se origina
a partir de una especie extraña o, si es de la misma especie, puede
estar sustancialmente modificada desde su forma original.
Alternativamente, una secuencia de ácido nucleico no modificada que
no se expresa normalmente en una célula es una secuencia de ácido
nucleico heteróloga.
Dependiendo del uso pretendido del vector
oncorretroviral de la presente invención se puede insertar cualquier
número de secuencias polinucleotídicas o de ácido nucleico
heterólogas en el vector oncorretroviral. Por ejemplo, para
estudios in vitro usados comúnmente, se pueden usar genes
marcadores o genes indicadores, que incluyen resistencia a
antibióticos y moléculas fluorescentes (por ejemplo, GFP). También
se pueden insertar secuencias polinucleotídicas adicionales que
codifican cualquier secuencia polipeptídica deseada en el vector de
la presente invención. Cuando se busca el suministro in vivo
de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, se pueden usar
secuencias tanto terapéuticas como no terapéuticos. Por ejemplo, la
secuencia heteróloga puede codificar una molécula terapéutica que
incluye moléculas antisentido o ribozimas dirigidas a un gen
particular asociado con un trastorno proliferativo de células, la
secuencia heteróloga puede ser un gen suicida (por ejemplo,
HSV-tk o PNP) o una proteína terapéutica (por
ejemplo, Factor IX). Otras proteínas terapéuticas aplicables a la
presente invención se identifican de forma sencilla en la técnica
(véase, por ejemplo, R. Crystal, Science 270:
404-410 (1995)).
Por tanto, el oncorretrovirus con capacidad de
replicación recombinante de la invención es capaz de transferir una
secuencia de ácido nucleico a una célula diana.
La expresión secuencia de ácido nucleico se
refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, que incluye ADN,
ARN o secuencias de ácido nucleico modificadas. La molécula de ácido
nucleico se puede obtener de una diversidad de fuentes, que
incluyen ADN, ADNc, ADN sintético, ARN o combinaciones de los
mismos. Tales secuencias de ácido nucleico pueden comprender ADN
genómico que puede incluir o no intrones de origen natural. Además,
tal ADN genómico se puede obtener en asociación con regiones de
promotor, intrones o secuencias poli A. Se puede extraer el ADN
genómico y purificar a partir de células adecuadas mediante medios
bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el ARN mensajero
(ARNm) se puede aislar de células y usar para producir ADNc mediante
transcripción inversa u otros medios. El especialista en la técnica
puede identificar un IRES que es aplicable para el uso pretendido,
por ejemplo, in vivo, ex vivo o in vitro.
La expresión "región de promotor" se usa en
este documento en su sentido normal para referirse a una región de
nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, donde la
secuencia reguladora se obtiene de un gen que es capaz de unirse a
ARN polimerasa e iniciar transcripción de una secuencia codificante
cadena abajo (dirección 3'). La secuencia reguladora puede ser
homóloga o heteróloga a la secuencia génica deseada. Por ejemplo,
se puede utilizar una amplia variedad de promotores, que incluyen
promotor viral o de mamífero.
La expresión "unido operativamente" se
refiere a una unión funcional entre el IRES y la secuencia de ácido
nucleico heteróloga. La secuencia heteróloga puede estar unida a un
promotor, dando como resultado un gen quimérico. La secuencia de
ácido nucleico heteróloga preferiblemente está bajo el control de
señales de promotor-potenciador de LTR viral o de
un promotor interno y las señales retenidas dentro de la LTR
retroviral todavía pueden provocar la integración eficaz del vector
en el genoma de la célula hospedadora.
Un ejemplo de secuencia polinucleotídica que
puede estar unida operativamente al IRES incluye proteína verde
fluorescente (GFP) o un gen marcador de selección. Los genes
marcadores se utilizan para ensayar la presencia del vector y, por
tanto, para confirmar la infección e integración. Los genes de
selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a
antibióticos y otras sustancias tóxicas como, por ejemplo,
histidinol, puromicina, higromicina, neomicina, metotrexato y otros
genes indicadores conocidos en la técnica. Otra secuencia
polinucleotídica que puede estar unida al IRES incluye, por ejemplo,
genes suicidas, tales como PNP y HSV-timidina
quinasa (Figura 2), secuencias polinucleotídicas que codifican una
molécula antisentido o secuencias polinucleotídicas que codifican
un ribosoma.
\newpage
Puede ser ventajoso tener en una disposición
vectores de terapia génica más eficaces capaces, en particular, de
producir varias proteínas de interés de forma eficaz. Sin embargo,
la presencia de varios promotores dentro del mismo vector se
manifiesta frecuentemente por sí misma en una reducción o incluso
una pérdida de expresión a lo largo del tiempo. Esto se debe a un
fenómeno bien conocido de interferencia entre secuencias de
promotor. En este contexto, la publicación de la Solicitud
Internacional WO93/03143 propone una solución para este problema
que consiste en emplear un IRES. Describe un vector retroviral
dicistrónico para la expresión de dos genes de interés puestos bajo
el control del mismo promotor. Por ejemplo, la presencia de un sitio
IRES de picornavirus entre estos genes permite la producción del
producto de expresión que se origina del segundo gen de interés por
inicio interno de la traducción del ARNm dicistrónico (véase Morgan
et al., Nucleic Acids Research, 20: (6)
1293-1299 (1992)).
Normalmente, la entrada de ribosomas en ARN
mensajero tiene lugar por el capuchón ubicado en el extremo 5' de
todos los ARNm eucariotas. Sin embargo, existen excepciones a esta
regla universal. La ausencia de un capuchón en algunos ARNm virales
sugiere la existencia de estructuras alternativas que permiten la
entrada de ribosomas en un sitio interno de estos ARN. Hasta la
fecha se han identificado varias de estas estructuras, denominadas
IRES debido a su función, en la región no codificante 5' de ARNm
virales sin capuchón, tales como las de, en particular,
picornavirus tales como el virus de poliomielitis (Pelletier et
al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1103-1112) y el
virus EMCV (virus de encefalomiocarditis (Jang et al., 1988,
62, 2636-2643)). La presente invención proporciona
el uso de un IRES en el contexto de un vector oncorretroviral con
capacidad de replicación.
En otra realización se incluye una secuencia
polionucleotídica de dirección como parte del vector retroviral
recombinante de la presente invención. La secuencia polinucleotídica
de dirección es un ligando de dirección (por ejemplo, hormonas
peptídicas tales como heregulina, anticuerpos de cadena única, un
receptor o un ligando para un receptor), un elemento regulador
específico de tejido o específico de tipo celular (por ejemplo, un
promotor o potenciador específico de tejido o específico de tipo
celular) o una combinación de un ligando de dirección y un elemento
regulador específico de tejido/específico de tipo celular.
El ligando de dirección está unido
operativamente a la proteína env del retrovirus, creando una
proteína env retroviral quimérica. Las proteínas GAG viral, POL
viral y ENV viral se pueden obtener de cualquier retrovirus
adecuado (por ejemplo, obtenidos de MLV o de lentivirus). En otra
realización, la proteína ENV viral no se obtiene de retrovirus (por
ejemplo, CMV o VSV).
El oncorretrovirus recombinante de la invención,
por lo tanto, está modificado genéticamente de tal modo que el
virus se dirige a un tipo celular particular (por ejemplo, células
de músculo liso, células hepáticas, células renales, fibroblastos,
queratinocitos, células madre mesenquimales, células de de médula
ósea, condrocitos, células epiteliales, células intestinales,
células neoplásicas y otras conocidas en la técnica) de tal forma
que el genoma de ácido nucleico se suministra a una célula diana en
división, que incluye una célula diana que tiene un trastorno
proliferativo de células. La dirección se puede conseguir de dos
modos. El primer modo dirige el retrovirus a una célula diana
uniéndose preferentemente a células que tienen una molécula sobre
la superficie externa de la célula. Este método de dirigir el
retrovirus utiliza la expresión de un ligando de dirección sobre la
cubierta del retrovirus para ayudar a la dirección del virus a
células o tejidos que tienen un receptor o molécula de unión que
interacciona con el ligando de dirección sobre la superficie del
retrovirus. Después de la infección de una célula por el virus, el
virus inyecta su ácido nucleico en la célula y el material genético
del retrovirus puede integrarse en el genoma de la célula
hospedadora. El segundo método para dirección usa elementos
reguladores específicos de células o tejidos para promover
preferentemente la expresión y la transcripción del genoma viral en
una célula dirigida que utiliza activamente los elementos
reguladores, como se describe con más detalle más adelante. El
material genético de retrovirus transferido después se transcribe y
produce en proteínas dentro de la célula hospedadora. El elemento
regulador de dirección está unido preferiblemente a la LTR 5' y/o
3', creando una LTR quimérica.
Insertando una secuencia de interés de ácido
nucleico heteróloga en el vector viral de la invención, junto con
otro gen que codifica, por ejemplo, el ligando para un receptor en
una célula diana específica, el vector ahora es específico de
diana. Los vectores virales se pueden convertir en específicos de
diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glucolípido o una
proteína. La dirección se puede conseguir mediante el uso de un
anticuerpo para dirigir el vector viral. Los especialistas en la
técnica conocerán, o podrán determinar fácilmente, secuencias
polinucleotídicas específicas que se pueden insertar en el genoma
viral o proteínas que se pueden unir a una envuelta viral para
permitir el suministro específico de diana del vector viral que
contiene la secuencia de ácido nucleico de interés.
Por tanto, la presente invención incluye en una
realización una proteína env quimérica que comprende una proteína
env retroviral unida operativamente a un polipéptido de dirección.
El polipéptido de dirección puede ser una molécula receptora
específica de célula, un ligando para un receptor específico de
célula, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para un epítopo
antigénico específico de célula o cualquier otro ligando
identificado de forma sencilla en la técnica que sea capaz de
unirse o interaccionar con una célula diana. Los ejemplos de
polipéptidos o moléculas de dirección incluyen anticuerpos
bivalentes que usan biotina-estreptavidina como
enlazadores (Etienne-Julan et al., J. Of
General Virol., 73, 3251-3255 (1992); Roux et
al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 9079-9083
(1989)), virus recombinante que contiene en su envuelta una
secuencia que codifica una región variable de anticuerpo de cadena
única frente a un hapteno (Russell et al., Nucleic Acids
Research, 21, 1081-1085 (1993)), clonación de
ligandos de hormona peptídica en la envuelta del retrovirus
(Kasahara et al., Science, 266, 1373-1376
(1994)), construcciones EPO/env quiméricas (Kasahara et al.,
1994), anticuerpo de cadena única frente al receptor de lipoproteína
de baja densidad (LDL) en la envuelta de MLV ecotrópica, dando como
resultado infección específica de células HeLA que expresan receptor
LDL (Somia et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92,
7570-7574 (1995)), de forma similar, el espectro de
hospedador de ALV se puede alterar por incorporación de un ligando
de integrina, permitiendo que el virus cruce especies para infectar
específicamente células de glioblastoma de rata
(Valsesia-Wittmann et al., J. Virol. 68,
4609-4619 (1994)) y Dornberg y colaboradores (Chu y
Dornburg, J. Virol 60, 2659-2663 (1995)) han
descrito la dirección específica de tejido de virus de necrosis
esplénica (SNV), un retrovirus aviar, que usa envueltas que
contienen anticuerpos de cadena única dirigidos contra marcadores
tumorales.
Un método para producir un oncorretrovirus con
capacidad de replicación recombinante capaz de infectar una célula
diana comprende transfectar una célula hospedadora adecuada con lo
siguiente: un vector que comprende una secuencia polinucleotídica
que codifica un gag viral, un pol viral y un env
viral, donde el vector contiene un sitio de clonación para la
introducción de un gen heterólogo, unido operativamente a un IRES
como se especifica en las reivindicaciones y recuperar el virus
recombinante. Una ilustración de los vectores individuales usados
se muestra en las Figuras 1 y 2.
El retrovirus de la invención proporciona un
oncorretrovirus con capacidad de replicación que no requiere virus
auxiliar o secuencia de ácido nucleico adicional o proteínas para
propagarse y producir viriones. Por ejemplo, las secuencias de
ácido nucleico del oncorretrovirus de la presente invención
codifican, por ejemplo, un antígeno específico de grupo y
transcriptasa inversa (y enzimas integrasa y proteasa necesarias
para la maduración y transcripción inversa), respectivamente, como
se ha discutido anteriormente. Además, el genoma de ácido nucleico
del retrovirus de la presente invención incluye una secuencia que
codifica una proteína de envuelta viral (ENV). El gen env se
puede obtener de cualquier retrovirus. El env puede ser una proteína
de envuelta anfotrópica que permite la transducción de células de
especie humana u otras o puede ser una proteína de envuelta
ecotrópica que es capaz de transducir solamente células de ratón y
de rata. Adicionalmente, puede ser deseable dirigir el virus
recombinante por unión de la proteína de envuelta con un anticuerpo
o un ligando particular para la dirección a un receptor de un tipo
celular particular. Como se ha mencionado anteriormente, los
vectores retrovirales se pueden convertir en específicos de diana
insertando, por ejemplo, un glucolípido o una proteína. La
dirección se consigue frecuentemente mediante el uso de un
anticuerpo para dirigir el vector retroviral a un antígeno o un
tipo celular particular (por ejemplo, un tipo celular observado en
un cierto tejido o un tipo de célula cancerosa). Los especialistas
en la técnica conocerán, o pueden determinar fácilmente sin
experimentación innecesaria, métodos específicos para conseguir el
suministro de un vector retroviral a una diana específica. Los
ejemplos de genes env obtenidos de retrovirus, incluyen, pero sin
limitación: virus de leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus de
sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino
(MuMTV), virus de leucemia de gibón (GaLV), virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) y Virus de Sarcoma de Rous
(RSV).
A diferencia de retrovirus recombinantes
producidos por métodos convencionales en la técnica que son
defectuosos y requiere ayuda para producir partículas de vector
infecciosas, la presente invención proporciona un retrovirus que
tiene capacidad de replicación.
En otra realización, la presente invención
proporciona vectores retrovirales que se dirigen usando secuencias
reguladoras. Se pueden usar secuencias reguladoras específicas de
células o tejidos (por ejemplo, promotores) para dirigir la
expresión de secuencias génicas en poblaciones de células
específicas. En la técnica están disponibles promotores de mamífero
y virales adecuados para la presente invención. En consecuencia, en
una realización, la presente invención proporciona un
oncorretrovirus que tiene elementos de promotor específicos de
tejido en los extremos 5' y 3' del genoma retroviral.
Preferiblemente, los elementos/secuencias reguladores específicos
de tejido están en la región U3 de la LTR del genoma retroviral, que
incluyen, por ejemplo, promotores y potenciadores específicos de
células o tejidos para células neoplásicas (por ejemplo,
potenciadores y promotores específicos de célula tumoral) y
promotores inducibles (por ejemplo, tetraciclina). Las secuencias de
control de la transcripción de la presente invención también pueden
incluir secuencias de control de la transcripción de origen natural
asociadas de forma natural con un gen que codifica un superantígeno,
una citoquina o una quimioquina de la presente invención.
Los "elementos reguladores específicos de
tejido" son elementos reguladores (por ejemplo, promotores) que
son capaces de dirigir la transcripción de un gen en un tejido
mientras que permanecen en gran medida "silenciosos" en otros
tipos tisulares. Sin embargo, se entenderá que los promotores
específicos de tejido pueden tener una cantidad detectable de
actividad de "fondo" o "base" en esos tejidos cuando son
silenciosos. El grado hasta el que se activa selectivamente un
promotor en un tejido diana se puede expresar como una proporción
de selectividad (actividad en un tejido diana/actividad en un tejido
de control). A este respecto, un promotor específico de tejido útil
en la práctica de la presente invención tiene típicamente una
proporción de selectividad mayor de 5. Preferiblemente, la
proporción de selectividad es mayor de aproximadamente 15.
Se entenderá adicionalmente que ciertos
promotores, aunque no restringidos en actividad a un único tipo
tisular, pueden, sin embargo, mostrar selectividad porque pueden
ser activos en un grupo de tejidos y menos activos o silenciosos en
otro grupo. Tales promotores también se denominan "específicos de
tejido" y se consideran para el uso con la presente invención.
Por ejemplo, los promotores que son activos en una diversidad de
neuronas del sistema nervioso central (SNC) pueden ser útiles
terapéuticamente para proteger contra lesión debido a apoplejía,
que puede afectar a cualquiera de varias regiones diferentes del
cerebro. En consecuencia, los elementos reguladores específicos de
tejidos usados en la presente invención tienen aplicabilidad para la
regulación de las proteínas heterólogas, así como aplicabilidad
como una secuencia polinucleotídica de dirección en los presentes
vectores retrovirales.
\newpage
Los promotores específicos de tejidos se pueden
obtener, por ejemplo, de regiones de promotor de genes que se
expresan de forma diferencial en diferentes tejidos. Por ejemplo, se
ha identificado una diversidad de promotores que son adecuados para
regular positivamente la expresión en tejido cardiaco. Se incluyen,
por ejemplo, el promotor de cadena pesada de
\alpha-miosina cardiaca (AMHC) y el promotor de
\alpha-actina cardiaca. Otros ejemplos de
elementos reguladores específicos de tejido incluyen promotores
específicos de tejido tales como promotor de actina específico de
leche (suero), pancreático (insulina o elastasa) en células de
músculo liso o promotores neuronales (proteína básica de mielina).
Mediante el uso de promotores, tales como promotores específicos de
leche, los retrovirus recombinantes se pueden aislar directamente
del fluido biológico de la progenie.
Adicionalmente, numerosos métodos de terapia
génica, que se aprovechan de vectores retrovirales para tratar una
amplia diversidad de enfermedades, se conocen bien en la técnica
(véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.405.712 y
4.650.764; Friedmann, 1989, Science, 244: 1275-1281;
Mulligan, 1993, Science, 260: 926-932, R. Crystal,
1995, Science 270: 404-410). Un número creciente de
estos métodos se está aplicando actualmente en experimentos
clínicos con seres humanos (Morgan, R., 1993, BioPharm, 6 (1):
32-35; véase también The Development of Human Gene
Therapy, Theodore Friedmann, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. ISBN
0-87969-528-5). La
seguridad de estos protocolos de terapia génica disponibles
actualmente se puede aumentar sustancialmente mediante el uso de
vectores retrovirales de la presente invención. Por ejemplo, cuando
el vector retroviral infecta una célula no convertida en diana, el
genoma retroviral se integrará pero no se transcribirá. Sin
embargo, cuando el vector retroviral que contiene un elemento
regulador específico de tejido infecta una célula convertida en
diana, el promotor específico de tejido activo dará como resultado
la transcripción y traducción del genoma viral. Para células en
división se usan vectores oncorretrovirales.
Con célula en "división" se quiere decir
una célula que se somete a mitosis activa o meiosis. Tales células
en división incluyen células madre, células cutáneas (por ejemplo,
fibroblastos y queratinocitos), gametos y otras células en división
conocidas en la técnica. Son de interés particular y están incluidas
por la expresión células en división las células que tienen
trastornos proliferativos de células, tales como células
neoplásicas. La expresión "trastorno proliferativo de células"
se refiere a una afección caracterizada por un número anormal de
células. La afección puede incluir crecimiento celular tanto
hipertrófico (dando como resultado la multiplicación continua de
células una proliferación de una población celular dentro de un
tejido) como hipotrófico (una ausencia o deficiencia de células
dentro de un tejido) o un flujo de entrada o migración excesiva de
células a un área del cuerpo. Las poblaciones celulares no son
necesariamente células transformadas, tumorigénicas o malignas,
pero pueden incluir asimismo células normales. Los trastornos
proliferativos de células incluyen trastornos asociados con un
crecimiento excesivo de tejidos conectivos, tales como diversas
afecciones fibróticas, que incluyen esclerodermia, artritis y
cirrosis hepática. Los trastornos proliferativos de células incluyen
trastornos neoplásicos tales como carcinomas de cabeza y cuello.
Los carcinomas de cabeza y cuello incluirían, por ejemplo,
carcinoma de la boca, esófago, garganta, laringe, glándula tiroides,
lengua, labios, glándulas salivales, nariz, senos paranasales,
nasofaringe, tumores de cornete nasal superior y de seno,
estesioneuroblastoma, cáncer de células escamosas, melanoma
maligno, carcinoma senonasal no diferenciado (SNUC) o neoplasia
sanguínea. También se incluyen carcinomas de los ganglios
linfáticos regionales que incluyen ganglios linfáticos cervicales,
ganglios linfáticos prelaríngeos, ganglios linfáticos
yuxtaesofágicos pulmonares y ganglios linfáticos submandibulares
(Harrison's Principles of Internal Medicine (eds. Isselbacher, et
al., McGraw-Hill, Inc. 13ª Edición, págs.
1850-1853, 1994). Otros tipos de cáncer incluyen,
pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer
de mama, cáncer de próstata, cáncer de tracto urinario, linfoma de
cáncer uterino, cáncer oral, cáncer pancreático, leucemia,
melanoma, cáncer de estómago y cáncer ovárico.
La presente invención también se puede usar en
terapia génica para el tratamiento de trastornos proliferativos de
células. Tal terapia conseguiría su efecto terapéutico por
introducción de una secuencia polinucleotídica terapéutica
apropiada (por ejemplo, antisentido, ribozimas, genes suicidas) en
células del sujeto que tiene el trastorno proliferativo. El
suministro de construcciones polinucleotídicas se puede conseguir
mediante el uso del vector oncorretroviral con capacidad de
replicación recombinante de la presente invención, que es capaz de
infectar células en división.
Adicionalmente, los métodos terapéuticos (por
ejemplo, los métodos de terapia génica o de suministro de genes)
como se describen en este documento se pueden realizar in
vivo o ex vivo. Puede ser preferible eliminar la mayoría
de un tumor antes de la terapia génica, por ejemplo, quirúrgicamente
o mediante radiación.
Un método para la introducción y expresión de
una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula diana
comprende infectar la célula diana con el oncorretrovirus con
capacidad de replicación recombinante de la invención y expresar la
secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula diana. Como se
ha mencionado anteriormente, la célula diana puede ser cualquier
tipo celular que incluye tipos celulares en división, neoplásicas,
inmortalizadas, modificadas y otros reconocidos por los
especialistas en la técnica, siempre que tengan capacidad de
infección por un oncorretrovirus.
Puede ser deseable modular la expresión de un
gen en una célula mediante la introducción de una secuencia de
ácido nucleico (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico
heteróloga) usando la construcción de la invención, donde la
secuencia de ácido nucleico da lugar, por ejemplo, a una molécula
antisentido o ribozima. El término "modula" incluye la
supresión de expresión de un gen cuando se
sobre-expresa o aumento de la expresión cuando está
subexpresado. Cuando un trastorno proliferativo de células está
asociado con la expresión de un gen, se pueden usar las secuencias
de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen a nivel
de la traducción. Esta estrategia utiliza, por ejemplo, ácido
nucleico antisentido, ribozimas o agentes tríplex para bloquear la
transcripción o traducción de un ARNm específico, enmascarando este
ARNm con un ácido nucleico antisentido o agente tríplex o
escindiendo el mismo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas
de ADN o ARN que son complementarias a al menos una porción de una
molécula de ARNm específica (Weintraub, Scientific American, 262:
40, 1990).
En la célula, los ácidos nucleicos antisentido
hibridan con el ARNm correspondiente, formando una molécula
bicatenaria. Los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la
traducción del ARNm, ya que la célula no traducirá un ARN que es
bicatenario. Se prefieren los oligómeros antisentido de
aproximadamente 15 nucleótidos, ya que se sintetizan fácilmente y
probablemente causarán menos problemas que moléculas de mayor tamaño
cuando se introducen en la célula diana. El uso de métodos
antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes se
conoce bien en la técnica (Marcus-Sakura, Anal.
Biochem., 172: 289, 1988).
El ácido nucleico antisentido se puede usar para
bloquear la expresión de una proteína mutante o un producto génico
dominantemente activo, tal como proteína precursora de amiloide que
se acumula en la enfermedad de Alzheimer. Tales métodos también son
útiles para el tratamiento de la enfermedad de Huntington,
Parkinsonismo hereditario y otras enfermedades. Es de interés
particular el bloqueo de genes asociados con trastornos
proliferativos de células. Los ácidos nucleicos antisentido también
son útiles para la inhibición de expresión de proteínas asociadas
con
toxicidad.
toxicidad.
El uso de un oligonucleótido para parar la
transcripción se conoce como la estrategia tríplex ya que el
oligómero se coloca alrededor del ADN de doble hélice, formando una
hélice de tres cadenas.
Por lo tanto, estos compuestos tríplex se pueden
diseñar para reconocer un sitio único en un gen seleccionado
(Maher, et al., Antisense Res. and Dev., 1(3): 227,
1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6 (6): 569, 1991).
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad de escindir específicamente otros ARN monocatenarios de
un modo análogo a las endonucleasas de restricción de ADN. Mediante
la modificación de secuencias de nucleótidos que codifican estos
ARN es posible crear por ingeniería genética moléculas que reconocen
secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ARN y
escindir las mismas (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260: 3030, 1988).
Una ventaja principal de esta estrategia es que, debido a que son
específicas de secuencia, solamente se inactivan los ARNm con
secuencias particulares.
Puede ser deseable transferir un ácido nucleico
que codifica un modificador de respuesta biológica. En esta
categoría se incluyen agentes inmunopotenciantes que incluyen ácidos
nucleicos que codifican varias de las citoquinas clasificadas como
"interleuquinas". Las mismas incluyen, por ejemplo, las
interleuquinas 1 a 12. También se incluyen en esta categoría,
aunque no trabajando necesariamente de acuerdo con los mismos
mecanismos, los interferones y, en particular, interferón gamma
(\gamma-IFN), factor de necrosis tumoral (TNF) y
factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
Otros polipéptidos incluyen, por ejemplo, factores angiogénicos y
factores anti-angiogénicos. Puede ser deseable
suministrar tales ácidos nucleicos a células de médula ósea o
macrófagos para tratar deficiencias enzimáticas o defectos inmunes.
Los ácidos nucleicos que codifican factores de crecimiento,
péptidos tóxicos, ligandos, receptores u otras proteínas
fisiológicamente importantes también se pueden introducir en
células diana específicas.
Para enfermedades debidas a una deficiencia de
un producto proteico, la transferencia génica podría introducir un
gen normal en los tejidos afectados para terapia de sustitución, así
como para crear modelos animales para la enfermedad usando
mutaciones antisentido.
La presente invención también encuentra
aplicación en terapia génica para el tratamiento de trastornos
proliferativos de células o inmunológicos. Tal terapia conseguiría
su efecto terapéutico por introducción de un polinucleótido
antisentido o que codifica de manera negativa dominante en células
que tienen el trastorno proliferativo, donde el polinucleótido se
une a y evita la traducción o expresión de un gen asociado con un
trastorno proliferativo de células. El suministro de ácidos
nucleicos heterólogos útiles para tratar o modular un trastorno
proliferativo de células (por ejemplo, polinucleótidos antisentido)
se puede conseguir usando un vector oncorretroviral recombinante de
la presente invención.
Además, la presente invención proporciona una
secuencia polinucleotídica que codifica un vector oncorretroviral
recombinante de la presente invención. Todos estos vectores pueden
transferir o incorporar un gen para un marcador de selección de tal
forma que se pueden identificar y generar células transducidas.
Insertando una secuencia heteróloga de interés en el vector viral,
junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una
célula diana específica, por ejemplo, el vector ahora es específico
de diana. Los vectores retrovirales se pueden convertir en
específicos de diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glucolípido
o una proteína. La dirección se consigue mediante el uso de un
anticuerpo o ligando para dirigir el vector retroviral. Los
especialistas en la técnica conocerán, o pueden entender de forma
sencilla sin experimentación innecesaria, secuencias
polinucleotídicas específicas que se pueden insertar en el genoma
retroviral o unirse a una envuelta viral para permitir el
suministro específico de diana de vector retroviral que contiene el
polinucleótido heterólogo. Además, el vector retroviral se puede
dirigir a una célula utilizando un elemento regulador específico de
célula o tejido contenido en la LTR del genoma retroviral.
Preferiblemente, el elemento regulador específico de célula o
tejido está en la región U3 de las LTR. De este modo, después de la
integración en una célula, el genoma retroviral se expresará
solamente en células en las que el promotor específico de célula o
tejido está activo.
Alternativamente, células NIH3T3 u otras de
cultivo tisular se pueden transfectar directamente con plásmidos
que codifican el genoma retroviral, mediante transfección
convencional con fosfato cálcico. Las células resultantes liberan
el vector retroviral al medio de cultivo.
Cuando se trata un sujeto que tiene un trastorno
proliferativo de células usando las construcciones de la invención,
el sujeto puede ser cualquier mamífero y preferiblemente es un ser
humano. El sujeto se pone en contacto con un vector oncorretroviral
con capacidad de replicación recombinante de la presente invención.
La puesta en contacto puede ser in vivo o ex vivo. Los
métodos para administrar el vector de la invención se conocen en la
técnica e incluyen, por ejemplo, administración sistémica,
administración tópica, administración intraperitoneal,
administración intramuscular, así como administración directamente
en el sitio de un tumor o trastorno proliferativo de células y
otras vías de administración conocidas en la técnica.
Por tanto, las aplicaciones de la invención
incluyen diversas composiciones farmacéuticas útiles para tratar un
trastorno proliferativo de células. Las composiciones farmacéuticas
se prepararon llevando un vector retroviral que contiene una
secuencia polinucleotídica heteróloga útil para tratar o modular un
trastorno proliferativo de células de acuerdo con la presente
invención hasta una forma adecuada para administración a un sujeto
usando vehículos, excipientes y aditivos o auxiliares. Los
vehículos o auxiliares usados frecuentemente incluyen carbonato de
magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares,
talco, proteína láctea, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y
sus derivados, aceites animales y vegetales, polietilenglicoles y
disolventes, tales como agua estéril, alcoholes, glicerol y
alcoholes polihídricos. Los vehículos intravenosos incluyen
soluciones de reemplazo de fluido y nutrientes. Los conservantes
incluyen antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases
inertes. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen
soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, que incluyen sales,
conservantes, tampones y similares como se describe, por ejemplo,
en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª ed. Easton: Mack
Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487
(1975) y The National Formulary XIV., 14ª ed. Washington: American
Pharmaceutical Association (1975), cuyos contenidos se incorporan
en este documento como referencia. El pH y la concentración exacta
de los diversos componentes de la composición farmacéutica se
ajustan de acuerdo con la especialidad rutinaria en la técnica.
Véase Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics
(7ª ed.).
Por ejemplo, y no a modo de limitación, un
vector retroviral útil para tratar un trastorno proliferativo de
células incluirá una proteína ENV específica de diana quimérica
dirigida a un tipo celular de interés (por ejemplo, uno que tenga
un trastorno proliferativo de células), proteínas GAG y POL, una
secuencia de promotor específico de células en la región U3 de la
LTR del genoma retroviral asociado con un gen regulador del
crecimiento (por ejemplo, probasina o HER2) y una secuencia que
actúa en cis necesaria para la replicación, el
empaquetamiento y la integración del genoma retroviral en la célula
diana. La secuencia heteróloga puede ser, por ejemplo, una molécula
antisentido o una proteína suicida que da como resultado la muerte
de una célula en la que se transcribe activamente el genoma
retroviral.
Los siguientes Ejemplos tienen por objeto
ilustrar, pero no limitar la invención. Aunque tales Ejemplos son
típicos de los que se pueden usar, alternativamente se pueden
utilizar otros procedimientos conocidos por los especialistas en la
técnica.
Ejemplo
1
Existen pocas publicaciones en la bibliografía
con respecto a la estabilidad de inserciones en el contexto de
MoMLV con capacidad de replicación y todas han usado posiciones de
inserción dentro de la secuencia de repetición larga (LTR) 3'. La
mayoría de estas inserciones se delecionaron en el intervalo de uno
o dos pases seriados del virus. En este caso, el tamaño y la
naturaleza de las secuencias insertadas parecía tener poca
correlación con la estabilidad del vector, ya que insertos pequeños
frecuentemente se delecionaron tan rápidamente como insertos de
mayor tamaño. Una consideración importante puede ser la colocación
de la inserción; ya que el proceso de transcripción inversa incluye
la duplicación de la región U3 de la LTR 3' (Figura 1), esto puede
dar como resultado estabilidad disminuida de secuencias no
esenciales insertadas en esta posición.
Un clon proviral de Mo-MLV
infeccioso se escindió con NheI del plásmido pZAP y se ligó
en la cadena principal plasmídica del vector retroviral gIZIN. El
IRES del virus de encefalomiocarditis se amplificó por PCR a partir
del plásmido pEMCF y se unió en su extremo 3' a un polienlazador por
PCR de extensión por solapamiento. Los plásmidos gIZIN y
pEMC-F se proporcionaron amablemente por J. J.
Hwang, Universidad de California del Sur. Todas las reacciones de
PCR se realizaron con ADN polimerasa de Pfu (Stratagene).
Después se introdujo el polienlazador de IRES en el clon de
Mo-MLV en el extremo 3' del gen env por PCR de
extensión por solapamiento. El plásmido resultante se denominó
gIZD. El gen de GFP del plásmido pEGFP-N1 (Clontech)
se amplificó por PCR y se insertó en el sitio de clonación múltiple
de gIZD, produciendo gIZD-GFP. El gen de higromicina
fosfotransferasa del plásmido pTK-higro (Clontech)
se introdujo de forma similar en gIZD para producir
gIZD-higro. El prefijo p se omite en la
denominación de los virus obtenidos de estos plásmidos.
La inserción de un transgén en una posición
menos sensible, y de hecho, uniendo la expresión del transgén
insertado a secuencias codificantes virales, puede mejorar la
estabilidad del vector. En consecuencia, una secuencia IRES se
insertó justo cadena abajo del mensaje de envuelta pero cadena
arriba de la LTR 3' (Figura 2). Un IRES obtenido de virus de
encefalomiocarditis (EMCV) y un sitio de clonación múltiple se
insertaron justo a 3' del gen de envuelta en un clon de provirus de
MoMLV con capacidad de replicación, gIZD (MoMLV de tipo silvestre,
véase la Figura 1). La cepa gIZD del virus MoMLV es ecotrópica (es
decir, recubierta por una envuelta con tropismo de unión específico
murino). Esta posición de inserción particular se seleccionó debido
a que 1) se conoce que la señal de empaquetamiento se extiende más
allá del ATG del gen gag, por tanto, la colocación de un transgén
justo cadena arriba del gen gag mejoraría en gran medida la eficacia
de empaquetamiento, 2) las secuencias codificantes de gag y pol se
traducen inicialmente como un único polipéptido que después se
escinde, la colocación de un transgén entre estas posiciones
mejoraría por tanto en gran medida el procesamiento proteolítico,
3) el extremo 3' del gen pol de hecho se solapa con el extremo 5'
del gen env y esta región de solapamiento contiene un aceptor de
corte y empalme para el transcrito de env, por tanto, las
inserciones de transgén en esta región serían problemáticas y 4) la
colocación del inserto en el exterior del intrón principal
garantiza la presencia del inserto en ARN virales tanto empalmados
como no empalmados y, por lo tanto, la traducción del inserto de
ARN.
La construcción resultante se denominó g1ZD. El
sitio de clonación múltiple en g1ZD se usó después para insertar
secuencias codificantes de transgén. El sitio de clonación múltiple
en el gIZD se usó después para insertar secuencias que codifican
transgén. En este sitio se insertaron genes marcadores inicialmente
tales como el gen de proteína verde fluorescente (GFP), gen de
resistencia a puromicina (puro®) y gen de resistencia de
higromicina (higro®). Los genes suicidas, tales como el gen de
timidina quinasa de virus de Herpes simples
(HSV-tk) y el gen de nucleótido purina fosforilasa
de E. coli (PNP) se pueden insertar en lugar de los genes
marcadores. Ya que los transgenes tienen diversos tamaños, dando
como resultado inserciones de casete de IRES+transgén que varían de
1170 pb a 1700 pb de tamaño, se puede determinar si el tamaño del
inserto tiene un efecto sobre la estabilidad del genoma del virus
(normalmente de 8,3 kb de tamaño) y cuál podría ser el límite de
empaquetamiento para MoMLV en este contexto. Ha habido pocas
publicaciones en la bibliografía con respecto a la estabilidad de
inserciones en el contexto de MoMLV con capacidad de replicación y
ninguna, de la que sean conscientes los inventores, que use una
secuencia IRES para dirigir la expresión de transgén en vectores
con capacidad de replicación. Este diseño de construcción mejora en
gran medida la estabilidad funcional y genética del transgén.
Los vectores de retrovirus con capacidad de
replicación (RCR) obtenidos de gIZD se ensayaron en primer lugar
para determinar su capacidad para replicarse de forma eficaz y
propagarse en cultivo. Se cultivaron células NIH3T3 y 293T en medio
de Eagle Modificado por Dulbecco con suero fetal bobino al 10%. Se
produjo solución madre de vector por introducción por transfección
de los plásmidos que codifican el vector en células 293T usando
precipitación con fosfato cálcico como se ha descrito previamente.
Veinticuatro horas post-transfección, el medio se
sustituyó con medio recién preparado y un día después se recogió el
sobrenadante que contenía vector, se filtró a través de un filtro
de 0,45 \mum y se usó inmediatamente o se congeló para uso
posterior. Después de la introducción inicial por transfección de
los plásmidos de vector RCR en células 293 para producir una
solución madre viral se usó una dilución de factor 1000 de la
preparación de virus para infectar placas frescas de células
NIH3T3. Las células se cultivaron hasta confluencia, el sobrenadante
del cultivo celular que contenía RCR se recogió para ensayar
actividad de transcriptasa inversa (RT) y después se sometieron a
pases las células. Este ciclo se repitió varias veces hasta que cada
conjunto de células sometidas a pases consiguiera de nuevo la
confluencia.
Se usaron diluciones de las soluciones madre de
vector para infectar células NIH3T3 confluentes al 20%. Cada 3 días
durante las siguientes 2 semanas, se recogió el sobrenadante y las
células se dividieron 1:4. Para cuantificar la actividad de
transcriptasa inversa se incubó una alícuota de cada sobrenadante a
37ºC durante una hora en un combinado que contenía
(^{32}p)dTTP, molde poli(rA) y cebadores
oligo-dT. La actividad de RT se cuantificó usando
molde poli-riboA y un cebador
oligo-dT para incorporación de dTTP radiomarcados y
los productos de reacción se aplicaron puntualmente sobre
nitrocelulosa y se midió la radiactividad por Phospholmager. El
desarrollo en el tiempo de actividades de RT a lo largo de varios
pases muestra un patrón clásico de pico y meseta, indicando de este
modo que todos los vectores RCR obtenidos de gIZD que llevan genes
marcadores son capaces de replicación eficaz y propagación a lo
largo de un cultivo celular a niveles comparables con el virus de
tipo silvestre (Figura 3). Por tanto, incluso inserciones
relativamente grandes, que extienden la capacidad de
empaquetamiento de MoMLV hasta su límite, no parecen alterar la
capacidad de replicación del virus.
El vector RCR obtenido de gIZD que contiene GFP
como el gen marcador (gIZD-GF) se usó para seguir la
expresión del transgén a lo largo del tiempo cuando el virus se
propagó a lo largo del cultivo de células NIH3T3. El marcador de
GFP se puede detectar por análisis de separador de células activadas
por fluorescencia (FACS) usando la misma longitud de onda que la
usada para la detección de fluoresceína (FITC; canal FL1). Las
células NIH3T3 se lavaron con solución salina tamponada con fosfato
(PBS), se tripsinizaron y recogieron por centrifugación a baja
velocidad. Las células se resuspendieron en PBS a aproximadamente
10^{5} células/ml y se analizaron para determinar la
fluorescencia con un Becton Dickinson FACScan usando un conjunto de
filtros de isotiocianato-fluoresceína. Estos
resultados muestran que los niveles de transducción iniciales a una
dilución alta de la solución madre de virus son extremadamente
bajos (aproximadamente el 3%) el Día 2, pero la expresión en el
cultivo aumentó rápidamente a lo largo del tiempo, como se observa
por el pico desplazado de fluorescencia media, de tal forma de que
el Día 7, prácticamente el 100% del cultivo está expresando GFP
(Figura 4). Por tanto, esto indica que la expresión de transgén no
se pierde cuando el vector RCR se propaga a lo largo del cultivo
celular y, de hecho, el transgén se suministra de forma eficaz a
prácticamente todas las células incluso con niveles de transducción
iniciales bajos (Figuras 5 y 6).
Ejemplo
2
Se utilizaron secuencias env de MoMLV y
SNV quiméricas que contenían restos de dirección dirigidos contra
células de cáncer de mama humano y que se ha demostrado que son
exitosas para la dirección en estudios previos. El resto de
dirección para env de MoMLV fue la hormona peptídica
heregulina y el resto de dirección para env de SNV fue el
anticuerpo de cadena única B6.2, obtenido originalmente inmunizando
ratones con una fracción enriquecida en membrana de un tumor de
mama humano. Usando una secuencia IRES, un gen marcador (tal como
GFP) o un gen suicida (tal como HSV-tk o PNP) se
une a la construcción de envuelta quimérica en el extremo 3'. Estas
construcciones quiméricas de envuelta/IRES/transgén se vuelven a
re-clonar después en las formas de tipo silvestre
con capacidad de replicación de MoMLV o SNV, sustituyendo el gen env
original (Figura 2b). Esto da como resultado vectores de retrovirus
con capacidad de replicación que se dirigen específicamente a
células cancerosas.
Los tumores se establecieron mediante la
inyección de 1,5 x 10^{6} células de adenocarcinoma de mama de
rata NMU por vía subcutánea en los flancos anteriores de ratones de
6 semanas de edad nu/nu BALB/c (Simonsen Laboratories). Cuatro
semanas después, los tumores habían crecido hasta
100-150 mm^{3}, en cuyo momento se les inyectó 80
\mul de sobrenadante de células NIH3T3 infectadas con
g1ZD-GFP que contenían 1 x 10^{4} de vector PFU.
A intervalos regulares después de esto se eutanasiaron subconjuntos
de los ratones y sus tumores se retiraron quirúrgicamente. Para
producir suspensiones de célula única, toda la masa de cada tumor se
trituró finamente y se incubó durante una hora a 37ºC en cinco
volúmenes de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que
contenía 100 U/ml de colagenasa IV. Después, las células propagadas
se lavaron y resuspendieron en PBS para análisis por citometría de
flujo.
Aunque Kasahara et al. (Science, 266:
1373-1376 (1994)) y Chu et al. (Journal of
Virology, 69: 2659-2663 (1995)) han observado que
la co-expresión de envuelta de MoMLV de tipo
silvestre se requiere habitualmente para procesar y transportar de
forma apropiada las construcciones de envuelta de MoMLV quiméricas
hasta la superficie de las células productoras y, posiblemente,
también para la función apropiada durante la entrada, algunos
grupos han sido capaces de recubrir viriones solamente con envuelta
quimérica insertando la secuencia de ligando en el extremo
amino-terminal de la envuelta de MoMLV. La
estrategia se usó para construcción de la envuelta de
heregulina/MoMLV a usar en los vectores con capacidad de
replicación. Además, aunque MoMLV es el retrovirus convencional
usado en la mayoría de los protocolos de terapia génica, SNV es
ventajoso para la dirección debido a las siguientes
características: 1) su capacidad de empaquetamiento máxima es mayor
que la de MoMLV y, por tanto, puede tolerar las secuencias
adicionales y genes sin pérdida espectacular de título, 2) se ha
observado que la envuelta de SNV es extremadamente estable,
tolerando truncamientos principales sin pérdida de la capacidad de
ensamblarse de forma apropiada en la superficie de la célula de
empaquetamiento y se ha demostrado que las construcciones de
envuelta de SNV quimérica contienen secuencias de ligando exógenas
que se pueden expresar sin necesidad de envuelta de SNV de tipo
silvestre y 3) se considera que SNV de tipo silvestre es
completamente no patógeno para seres humanos (Bacus et al.,
Am. J. Clin. Pathol., 102: S13-24 (1994)).
Ejemplo
3
Las anteriores construcciones genómicas de MoMLV
y SNV se introducen por transfección en la línea celular de cáncer
de mama humano MD-MB-453 (número de
acceso de la ATCC HTB 131), que expresa altos niveles de
HER-2 y HER-4 (Krause et
al., EMBO Journal, 6: 605-610 (1987)). Las
construcciones que contienen el gen marcador de GFP se transfectan
en primer lugar, ya que la presencia del gen marcador permite
controlar la eficacia de transfección por análisis FACS. Después de
la transfección, los vectores RCR dirigidos producidos por los
transfectantes primarios son capaces de infección horizontal de
células adyacentes no transfectadas inicialmente, por unión por la
heregulina o los restos de anticuerpo de cadena única B6.2. Esto se
puede detectar como un porcentaje creciente de células positivas a
GFP a lo largo del tiempo. Además, el medio de cultivo celular debe
contener virus sobrenadante, que puede infectar y transducir
cultivos recién preparados de células
MDA-MB-453. Los vectores que
contienen GFP, por tanto, permiten determinar el curso temporal de
acontecimientos de transfección e infección y la velocidad de la
propagación del virus a lo largo del cultivo celular de cáncer de
mama humano. Basándose en esta información se realicen estudios
similares con los vectores que contienen HSV-tk y
PNP y, en este caso, la transducción se controla por transferencia
de Southern o PCR cuantitativa para secuencias de vector integrado.
Los transgenes de HSV-tk y PNP también se ensayan
funcionalmente determinando si se ha conferido sensibilidad a los
profármacos ganciclovir y
6-metil-purina-desoxirribósido,
respectivamente.
Ejemplo
4
Se usa el medio de cultivo celular de células
MDA-MB-453 que producen virus para
infectar una diversidad de células diana humanas, para determinar
la especificidad tisular de los vectores de virus. Como un virus de
control negativo, las células diana se exponen a vectores MoMLV y
SNC ecotrópicos de tipo silvestre que contienen el gen marcador de
GFP y, como virus de control positivo, las células diana se infectan
con un vector de MoMLV anfotrópico que contiene GFP.
Las células diana de nuevo son la línea celular
de cáncer de mama humano MDA-MB-453
que, como se ha indicado anteriormente,
sobre-expresa tanto HER-2 como
HER-4 y, como una línea celular de control negativo,
la línea celular de cáncer de mama humano
MDA-MB-231 (número de acceso de la
ATCC HTB26), que no expresa ningún HER-2 o
HER-4 detectable. No se observa infectividad de
fondo con los controles de vector de MoMLV o SNV ecotrópicos de
tipo silvestre; por tanto, la infección exitosa por los vectores
quiméricos depende de la interacción específica entre la heregulina
o los restos de dirección de anticuerpo de cadena única B6.2 en la
envuelta del virus y su receptor o antígeno correspondiente sobre
las células diana. Otras líneas celulares de cáncer de mama humano
que se usan como dianas incluyen BT474 (que
sobre-expresa tanto HER-2 como
HER-4) y MCF7 (que solamente expresa
HER-4). Además se usan líneas celulares de control
negativo que son de origen humano pero que no se obtienen de
epitelio mamario para ensayar adicionalmente la especificidad
tisular de la invención.
Como se ha señalado anteriormente, las células
infectadas se examinan por análisis FACS para expresión de GFP o se
ensayan para transducción de HSV-tk o PNP por
transferencia de Southern o PCR cuantitativa y por exposición a
ganciclovir o 6-metil
purina-desoxirribósido.
Ejemplo
5
El tropismo retroviral se puede
re-dirigir alterando la actividad de la
transcripción del virus mediante sustitución de regiones de la
repetición terminal larga (LTR) viral con elementos de promotor
específico de células. Esta estrategia se ha usado por otros grupos
para dirigir la transcripción retroviral a tipos de células
tumorales particulares.
Las secuencias LTR provirales de MoMLV consisten
en 3 regiones distintas, denominadas U3, R y U4 que se repiten en
cada extremo del genoma. Los elementos de promotor que controlan la
transcripción del genoma de ARN y, por lo tanto, la replicación del
virus, permanecen en la región U3. La región R contiene el sitio de
inicio de la transcripción y, por tanto, la región U3 cadena arriba
no está incluida en el transcrito de ARN genómico. Sin embargo, el
transcrito se lee a través de la secuencia U3 en la LTR 3', que
también contiene señales de poliadenilación y la región U3 de LTR
3' se re-duplica en el extremo 5' durante el proceso
de la transcripción inversa. Por tanto, para que las alteraciones
en el promotor de LTR sean permanentes a lo largo de ciclos de
replicación seriados, las alteraciones se incorporan en la región U3
de la LTR 3'.
En la presente invención se incorporan elementos
con especificidad tisular en la región U3 de LTR 3' para dirigir la
replicación del vector RCR. Como un ejemplo práctico se muestra la
transcripción dirigida a células de cáncer de próstata. Usando la
especificidad de elementos específicos de próstata que se activan en
trans que interaccionan con secuencias de promotor que
actúan en cis (elementos de respuesta a andrógenos), los
investigadores han sido capaces de conseguir la dirección
transgénica específica de tejido de proteínas oncogénicas
(Greenberg et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 92:
3439-43 (1995); y Garabedian et al., Proc.
Natal. Acad. Sci USA, 95: 35382-7 (1998)). Una de
las proteínas mejor caracterizadas producida de forma única por la
próstata y regulada por secuencias de promotor que responden a
señales específicas de próstata es la proteína probasina de rata.
El estudio de la región de promotor de probasina ha identificado
sitios de regulación de la transcripción específicos de tejido y ha
conseguido una secuencia de promotor útil para la expresión génica
específica de tejido. La secuencia de promotor de probasina que
contiene las bases -426 a +28 de la región no traducida 5' se ha
estudiado exhaustivamente en ensayos de gen indicador CANT (Rennie
et al., Mol Endo, 7: 23-36 (1993)). Se ha
publicado la expresión específica de próstata en modelos de ratón
transgénico usando el promotor de probasina (Greenberg et
al., Mol Endo. 8: 230-9 (1994)). Los niveles de
expresión génica en estos modelos son paralelos a la maduración
sexual de los animales con una expresión génica aumentada 70 veces
observada en el momento de la pubertad (2-6
semanas). La castración de los animales disminuirá la expresión
génica prácticamente hasta cero, que se puede aumentar hasta niveles
pre-castración después de la administración
parenteral de testosterona. El promotor de probasina (-426 a +28) se
ha usado para establecer el modelo de ratón transgénico de cáncer
de próstata que usa el gen fusionado de promotor de
probasina-antígeno T grande de virus de simio 40
para sobre-expresión dirigida en la próstata de
líneas transgénicas estables (Greenberg et al., Proc Natl.
Acad. Sci. USA, 92: 3439-43 (1995)). Por tanto, esta
región del promotor de probasina se incorpora en la región U3 de
LTR 3' de los vectores RCR. Por tanto, se proporciona un vector
MoMLV con capacidad de replicación dirigido por elementos de
promotor específicos de tejido.
Ejemplo
6
Un fragmento del promotor sensible a andrógeno
de probasina de rata (de -426 a +28) que se ha demostrado que
especifica la expresión génica específica de próstata se ha
introducido por ingeniería genética en la región U3 de la LTR 3'
retroviral en vectores RCR tanto ecotrópicos como anfotrópicos. El
extremo 5' de la región U3 se reconoce por la proteína integrasa
viral y, de este modo, se usó PCR de extensión por solapamiento para
poder colocar de forma precisa el promotor de probasina justo
cadena abajo del comienzo de la región U3 en la LTR 3',
sustituyendo el resto de la secuencia U3 hasta la región R. Ya que
se pone inicialmente cadena abajo, esta región U3 modificada no
será funcional después de la introducción por transfección de la
construcción del provirus en células 293 y la producción del
transcrito del vector tendrá lugar de forma normal, pero después de
un único ciclo de replicación, la secuencia de probasina se
re-duplicará en la región U3 de la LTR 5' (Figura
8) y, después, debe especificar la replicación específica de células
de próstata del virus. Se han construido vectores RCR dirigidos por
probasina que contienen el casete de gen marcador
IRES-GFP de EMCV; en este caso, la región U3 en la
LTR 5' de gIZD-GFP se sustituyó en primer lugar con
un promotor de CMV (cIZD-GFP) para eliminar el
sitio The I en la LTR 5' (y también para mejorar la expresión y los
títulos después de la transfección inicial en células 293), de tal
forma que ahora, el sitio Nhe I en la LTR 3' es único y se puede
usar para insertar el fragmento de promotor de probasina (Figura 9,
panel superior: sustitución de la región U3 3' con el promotor de
probasina por PCR de extensión por solapamiento; panel inferior:
secuencia de la LTR 3' en pIZD-GFP, que muestra la
unión de promotor de probasina/región R). En este contexto se debe
señalar que, aunque las inserciones de transgenes no esenciales en
la región U3, de hecho, tienden a deleción, el promotor de
probasina sustituirá completamente en este caso los elementos de
promotor de tipo silvestre en la LTR viral, por lo tanto, las
deleciones del promotor de probasina darían como resultado
simplemente un virus que no tiene capacidad de replicación, por
tanto, habría presión de selección frente a tales deleciones. Hasta
lo que conocen los inventores, esto representaría el primer ejemplo
de un vector retroviral de replicación controlado por regulación de
la transcripción.
Un fragmento del promotor sensible a andrógenos
de probasina de rata se construyó por amplificación por la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN genómico usando los
cebadores ATCCACAGTTCAGGTT
CAATGGCG y CTGCTACCTTCTTTTTGAGATTCTTGTCTGTCATCATACTGG. Como se ha discutido anteriormente, éste es el mismo fragmento de promotor (de -426 a +28) que especifica la expresión de oncogén específica de próstata en el ratón transgénico con antígeno T de SV-40-probasina. Se añadió una secuencia enlazadora NheI-SfiI al cebador 5' mientras que se añadió un sitio AflII al extremo 3' del cebador 3'. Este producto de PCR se insertó en el plásmido de expresión pcDNA3.1+ (Invitrogen) después de una digestión con NheI-AflII. La presencia del inserto de probasina se confirmó por digestión por restricción con NheI-AflII para aislar el fragmento de 550 pb.
CAATGGCG y CTGCTACCTTCTTTTTGAGATTCTTGTCTGTCATCATACTGG. Como se ha discutido anteriormente, éste es el mismo fragmento de promotor (de -426 a +28) que especifica la expresión de oncogén específica de próstata en el ratón transgénico con antígeno T de SV-40-probasina. Se añadió una secuencia enlazadora NheI-SfiI al cebador 5' mientras que se añadió un sitio AflII al extremo 3' del cebador 3'. Este producto de PCR se insertó en el plásmido de expresión pcDNA3.1+ (Invitrogen) después de una digestión con NheI-AflII. La presencia del inserto de probasina se confirmó por digestión por restricción con NheI-AflII para aislar el fragmento de 550 pb.
Esta secuencia de promotor de probasina se
introduce por ingeniería genética en la región U3 de la LTR 3'
retroviral por PCR de extensión por solapamiento tanto en
gIZD-GFP como en gIZA-GFP y también
en las construcciones de vector GIZD y gIZA que contienen los genes
terapéuticos de PNP o HSV-tk. El extremo 5' de la
región U3 se reconoce por la proteína integrasa viral y, de este
modo, se usará la PCR de extensión por solapamiento para poner de
forma precisa el promotor de probasina justo cadena abajo del
comienzo de la región U3 en la LTR 3', sustituyendo el resto de la
secuencia U3 hasta la región R. Esta U3 modificada no será funcional
después de la transfección inicial de la construcción de vector RCR
en células 293, pero después de un ciclo de replicación, la
secuencia de probasina se re-duplicará en la región
U3 de la LTR 5' y, por lo tanto, debe especificar replicación
específica de célula de próstata del virus. La construcción se
introduce por transfección en células 293 y se recoge el
sobrenadante para ensayar la especificidad de tipo celular de la
replicación viral, como se describe más adelante.
Ejemplo
7
Para confirmar que el promotor de probasina de
430 pb todavía tendría capacidad de expresión específica de
próstata, inducible por andrógenos después de incorporarse en la
repetición terminal larga (LTR) retroviral, se construyó este
promotor híbrido y se usó para dirigir la expresión de un gen
indicador de luciferasa. Como se indica en la Figura 10, esta
construcción se ensayó en líneas celulares tanto prostáticas como no
prostáticas en presencia y ausencia de estimulación con andrógenos.
En la Figura 11 se muestra un conjunto representativo de
resultados; los resultados confirman que el promotor híbrido de
LTR-probasina es activo con estimulación con
andrógenos solamente en líneas celulares de próstata, mientras que
las líneas celulares no prostáticas muestran poca activación
incluso en presencia de estimulación con andrógenos. Se obtuvieron
resultados similares con las demás líneas celulares ensayadas.
Después, el promotor híbrido de
probasina-LTR se incorporó en vectores RCR que
llevan el gen marcador de proteína verde fluorescente (GFP), por
sustitución de la LTR 3', de tal forma que tendría lugar la
expresión dirigida por probasina solamente después de un ciclo de
transcripción inversa y la re-duplicación de la LTR
3' en el extremo 5'. Como se muestra en la Figura 12 se generaron
preparaciones de virus a partir de estas construcciones recogiendo
el medio sobrenadante 48-72 horas después de la
transfección transitoria de células 293T. Estas preparaciones de
virus se filtraron para excluir restos celulares y después se usaron
para infectar líneas celulares de cáncer de próstata murino
(TRAMP-C). La expresión de GFP en las células
TRAMP-C infectadas se examinó por análisis de
separador de células activadas por fluorescencia (FACS) en presencia
y ausencia de estimulación con andrógenos. Como se muestra en la
Figura 13, tuvo lugar un desplazamiento en la fluorescencia que
indica expresión del gen marcador de GFP en las células de próstata
infectadas solamente después de la estimulación con andrógenos.
Además, las construcciones genómicas se usaron
para la infección de la línea celular de cáncer de próstata humano
LnCaP, que expresa altos niveles del antígeno de membrana específico
de próstata (PSMA) y soporta un alto nivel de expresión del
promotor de probasina. Los vectores RCR que contienen el gen
marcador de GFP se usaron en primer lugar para la infección, ya que
la presencia del gen marcador permitirá controlar la eficacia de
transducción por análisis FACS. Después de transducción inicial, los
vectores RCR dirigidos producidos por los transfectantes primarios
tienen capacidad de infección horizontal de células adyacentes no
transfectadas inicialmente. Esto se detecta como un porcentaje
creciente de células positivas a GFP a lo largo del tiempo. Además,
el medio de cultivo celular contendrá virus sobrenadante, que puede
infectar y transducir cultivos frescos de células LnCaP. Por tanto,
los vectores que contienen GFP permitieron la determinación del
ciclo temporal de los acontecimientos de transfección e infección y
la velocidad de propagación de virus a lo largo del cultivo celular
de cáncer de próstata. Basándose en esta información se realizan
estudios similares con los vectores de gen suicida que contienen
HSV-tk y PNP y, en este caso, la transducción se
controla por transferencia de Southern o PCR cuantitativa para
secuencias de vector integrado. Los transgenes de
HSV-tk y PNP también se ensayan funcionalmente
determinando si se confiere sensibilidad a los profármacos
ganciclovir y
6-metilpurina-desoxirribósido,
respectivamente.
Los vectores RCR dirigidos también se usan para
infectar una diversidad de células diana no prostáticas, para
confirmar la especificidad tisular de los vectores de virus. Como un
virus de control, las células diana se exponen a vectores MoMLV
ecotrópicos o anfotrópicos de tipo silvestre que contienen el gen
marcador de GFP.
Ejemplo
8
Para estudiar la transducción in vivo,
están disponibles varios modelos que imitan los diversos aspectos
clínicos de cáncer de próstata e incluyen modelos espontáneos de
roedores, sistemas de xenoinjerto humanos que usan hospedadores
murinos inmunocomprometidos y modelos transgénicos murinos. El
modelo de roedor de Dunning R-3327 para
adenocarcinoma de la próstata implica el uso de tumores implantados
por vía subcutánea en ratas Copenhagen (Dunning, W., Natl. Cancer
Inst., 12: pág. 351 (1963)). Este modelo permite el estudio de
progresión independiente de andrógenos y el proceso de formación de
metástasis usando las sublíneas MAT-Lylu o
MAT-lu (Smolev et al., Cancer Treat. Rep.,
61, 273 (1977)).
Además, el desarrollo exitoso de modelos de
animales transgénicos que tienen capacidad de desarrollo espontáneo
de cánceres de próstata que se parecen a adenocarcinomas humanos ha
dependido de la expresión de transgén específica de tejido. En
particular, el promotor de probasina que dirige el antígeno T de
SV40 se ha usado para establecer un modelo de ratón transgénico de
cáncer de próstata. Este modelo bien estudiado demuestra tumores de
próstata espontáneos histológicamente similares a los desarrollados
en seres humanos, aunque carece de la base hormonal subyacente o
desempeña un papel central en los inicios de tumor de próstata. La
eficacia in vivo de los RCRV dirigidos por transcripción se
puede demostrar usando este modelo.
Los ratones transgénicos macho en la pubertad se
controlan para el desarrollo de tumores de próstata. A los tumores
se inyectan vectores MoMLV o SNV con capacidad de replicación
dirigidos que llevan GFP o preparaciones de virus de control
negativo y positivo y la transducción se ensaya después de otras dos
semanas. En ese momento, los animales se eutanasian y se recogen
los tumores. Las muestras tisulares de tumores expuestos a vectores
virales que llevan el gen de GFP se congelan instantáneamente en
nitrógeno líquido y las secciones congeladas se examinan
histológicamente con microscopía de fluorescencia con UV. Basándose
en estos resultados se realizan experimentos similares usando los
vectores RCR dirigidos que llevan HSV-tk o PNP. En
este caso, dos semanas después, los xenoinjertos se exponen a
vectores virales que llevan el gen de HSV-tk o PNP,
se administra ganciclovir o 6-metil
purina-desoxirribósido a los animales y se evalúa el
alcance de reducción de los tumores. Los grupos de control se dejan
sin tratar como un control para el crecimiento del tumor.
La eficacia de transducción aumentada mediante
el uso de vectores restringidos por diana, retrovirales, con
capacidad de replicación representaría una mejora significativa en
el diseño de vectores. Ya que las células tumorales infectadas
inicialmente, a su vez, producen más virus, esta estrategia se
aprovecha del proceso de amplificación inherente al ciclo de vida
de virus de tipo silvestre. La dirección del retrovirus
específicamente y exclusivamente a células tumorales limita y
controla el proceso de replicación y el uso de virus normalmente no
patógenos como la base para esos vectores, así como la incorporación
de genes suicidas en los vectores como un mecanismo de
"autodestrucción" proporciona defensas adicionales que
minimizan el riesgo para células normales.
Ejemplo
9
También se realizó la aplicación in vivo
de vectores MoMLV con capacidad de replicación por inyección
intratumoral en tumores sólidos obtenidos de células NMU de rata
(cáncer de mama inducido por nitrosometilurea) en un modelo de
xenoinjerto subcutáneo de ratón atímico. Se conoce que las células
NMU son tumorigénicas en ratones atímicos. Los ratones atímicos se
anestesiaron y se realizó una inyección subcutánea de 2 x 10^{6}
células NMU en suspensión de PBS para establecer los tumores. Se
dejó que los tumores crecieran hasta aproximadamente 1 cm de
diámetro a lo largo de un periodo de 4 semanas, punto en el cual se
administró el vector RCR g1ZD-GFP por inyección
intratumoral de 100 \mul de la preparación de vector.
El título de la preparación de vector
gIZD-GFP fue 10^{5}/ml de título por ensayo de
sincitios celulares XC, por lo tanto, esto constituye un inóculo
total de solamente 10^{4} unidades infecciosas de virus. En este
caso, teniendo en cuenta el crecimiento de tumor y la división
celular después del establecimiento inicial, una estimación
conservativa de la multiplicidad de infección (MOI) sería del orden
de al menos 0,001 (y, probablemente, del orden del 0,0001). Por
tanto, se esperaría que la eficacia de transducción inicial fuera de
tan solo, o inferior, al 0,1%. De nuevo, este inóculo inicial de
sobrenadante de virus se puede comparar con las bajas eficacias de
transducción obtenidas en los experimentos clínicos usando inyección
intratumoral de líneas de células de empaquetamiento PA317 para
transducir glioblastoma.
Se dejaron crecer los tumores durante diversos
intervalos después de la inyección del vector y se eutanasió un
conjunto de ratones y los tumores se recogieron en los puntos de
tiempo post-inyección de la semana 2, semana 4 y
semana 6. Después de la recogida del tumor, los tumores se cortaron
y algunas muestras de tumor se congelaron inmediatamente para
asilamiento posterior de ADN genómico y análisis por transferencia
de Southern. Las demás muestras de tumor se trituraron, se trataron
inmediatamente con colagenasa durante 3-4 horas para
disgregar las células de tumor mientras que todavía eran viables,
se lavaron y resuspendieron en PBS y se examinaron por análisis
FACS esa misma tarde. Por tanto, la propagación horizontal del
vector de virus después de la disgregación de las células tumorales
probablemente no había afectado a los resultados y no había
transcurrido suficiente tiempo para la entrada retroviral,
integración y expresión de transgén de GFP antes del análisis
FACS.
Los resultados se muestran en la Figura 7:
aunque en el punto de tiempo de 2 semanas, solamente un pequeño
porcentaje de células parece mostrar inicialmente un desplazamiento
en la fluorescencia, la transferencia de genes altamente eficaz a
lo largo de todo el tumor se evidencia por análisis FACS de células
tumorales disgregadas 4-6 semanas después de la
inyección del inóculo inicial. Se detectaron bandas genómicas
intactas, de longitud completa en transferencias de Southern de ADN
proviral aislado de tumores individuales en los puntos de tiempo 4
y 6 semanas. Esto indica que el vector RCR tenía capacidad de
replicación eficaz y suministro de genes en el contexto de tumores
sólidos in vivo sin que tuvieran lugar deleciones durante
este intervalo de tiempo y proporciona un ejemplo ilustrativo del
potencial poder de esta estrategia para terapia génica del cáncer,
especialmente teniendo en cuenta la MOI extremadamente baja del
inóculo inicial.
Ejemplo
10
Como se ha descrito anteriormente, se
construyeron vectores variando el tamaño del genoma viral. Mediante
el uso de secuencias IRES más cortas que el IRES de EMCV presente en
las anteriores construcciones, puede ser posible insertar
transgenes de mayor tamaño que GFP o grandes secuencias de dirección
específicas de tipo celular. Se construyeron dos nuevos vectores
usando secuencias IRES de los genes de BiP (Yand y Sarnow, 1997) y
VEGF (Stein et al., 1998) (Figura 14). El vector que contiene
IRES de BiP, ZB-GFP, y el vector que contiene IRES
de VEGF ZV-GFP, son 450 pb y 380 pb más cortos que
g1ZD-GFP, respectivamente. La infección de células
NIH3T3 por los vectores demostró que ambos transducen de forma
eficaz las células y expresan GFP, aunque los niveles de expresión
de transgenes son ligeramente inferiores que con
g1ZD-GFP (Figura 15). La capacidad de
ZB-GFP y ZV-GFP de conservar sus
secuencias IRES-GFP durante la propagación de vector
se determinó realizando infecciones seriadas de células NIH3T3 con
los vectores. Se preparó ADN proviral (Hirt) a partir de 13
poblaciones de NIH3T3 infectadas de forma seriada y se sometió a
análisis de Southern usando una sonda para la región de
LTR-gag de Mo-MLV. La Figura 16
muestra que las secuencias IRES-GFP de los dos
nuevos vectores se conservaron durante aproximadamente el mismo
número de infecciones seriadas que para
ZAPd-GFP.
Esto indicó que una reducción en el tamaño del
IRES en estos vectores no altera significativamente la estabilidad
del vector, pero puede permitir la inserción de transgenes de mayor
tamaño que GFP.
Ejemplo
11
Para obtener vectores RCR dirigidos a células de
tumor de mama se construyeron vectores que contenían modificaciones
en el gen de envuelta que permitirían la unión específica de
partículas de vector a proteínas expresadas sobre la superficie de
células de tumor de mama. Se usaron dos estrategias para la
dirección de los vectores. La primera estrategia implica la
inserción de secuencias que codifican el dominio de unión a IgG
("dominio Z", Nilsson et al., 1987) de la proteína A de
S. aureus en la región rica en prolina (PRR o "bisagra")
del gen de envuelta (Figura 17). La presencia del dominio Z sobre
la superficie del vector permitiría la unión de anticuerpos
específicos de tumor al vector y, por lo tanto, probablemente
permitiría la unión específica del vector a células tumorales por
el anticuerpo. La segunda estrategia implica la sustitución del
dominio de unión a receptor de tipo silvestre (RBD) de la envuelta
con secuencias que codifican un anticuerpo de cadena única (scFv)
frente a HER2 (proporcionado amablemente por los Drs. Michael Press
y Jinha Park), (Figura 18). Se espera que esta modificación elimine
la unión del vector a su receptor normal mientras que permite la
unión directa a células tumorales que expresan HER2.
Aunque la invención se ha descrito con
referencia a la realización preferida, se debe entender que se
pueden realizar diversas modificaciones. Por consiguiente, la
invención solamente está limitada por las siguientes
reivindicaciones.
Claims (44)
1. Un oncorretrovirus con capacidad de
replicación recombinante que comprende:
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína GAG retroviral;
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína POL retroviral;
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una envuelta retroviral;
- una secuencia polinucleotídica retroviral que comprende secuencias de Repetición Terminal Larga (LTR) en el extremo 5' y 3' de la secuencia polinucleotídica retroviral, donde una secuencia de promotor específico de tejido está contenida dentro de las secuencias LTR en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia polinucleotídica retroviral, siendo dicho promotor un promotor de un mamífero,
- un casete que comprende un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) unido operativamente a un gen heterólogo, donde el casete se coloca justo cadena abajo de la secuencia que codifica la envuelta retroviral pero cadena arriba de la LTR 3'; y
- secuencias de ácido nucleico que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, el empaquetamiento y la integración en una célula diana;
- donde la secuencia polinucleotídica retroviral se obtiene de virus de leucemia murina (MLV), virus de leucemia murina de Moloney (MoMLV) o virus de leucemia de gibón (GALV).
2. El oncorretrovirus de la reivindicación 1, en
el que el MLV es un MLV anfotrópico.
3. Un oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la envuelta retroviral comprende una
proteína quimérica.
4. Un oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la proteína quimérica comprende una
proteína ENV y un resto de dirección.
5. El oncorretrovirus de la reivindicación 4, en
el que el resto de dirección es un anticuerpo, un receptor de
hormonas o un ligando.
6. El oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el ligando es heregulina.
7. El oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de cadena
única.
8. El oncorretrovirus de la reivindicación 4, en
el que la proteína ENV se selecciona del grupo que consiste en
proteína ENV de virus de leucemia murina (MLV) y proteína ENV de
virus de necrosis esplénica (SNV).
9. El oncorretrovirus de la reivindicación 4, en
el que la proteína ENV es una proteína anfotrópica.
10. El oncorretrovirus de la reivindicación 4,
en el que la proteína ENV es una proteína ecotrópica.
11. El oncorretrovirus de la reivindicación 1,
en el que la célula diana es una célula que tiene un trastorno
proliferativo de células.
12. El oncorretrovirus de la reivindicación 1,
en el que la célula diana es una célula neoplásica.
13. El oncorretrovirus de la reivindicación 11,
en el que el trastorno proliferativo de células se selecciona del
grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer
de mama, cáncer de próstata, cáncer de tracto urinario, linfoma de
cáncer uterino, cáncer oral, cáncer pancreático, leucemia, melanoma,
cáncer de estómago y cáncer ovárico.
14. Un oncorretrovirus con capacidad de
replicación recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el promotor específico de tejido es el promotor de tipo
silvestre.
15. El oncorretrovirus de la reivindicación 1,
en el que la secuencia de promotor está asociada con un gen
regulador del crecimiento.
16. El oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la secuencia de promotor específico de
tejido comprende al menos un elemento de respuesta a andrógenos
(ARE).
17. El oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el elemento de respuesta a andrógenos
se obtiene del promotor de probasina.
18. El oncorretrovirus de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el promotor es el promotor de
probasina.
19. Un polinucleótido de oncorretrovirus con
capacidad de replicación recombinante, que comprende:
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína GAG retroviral;
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína POL retroviral;
- una secuencia de ácido nucleico que codifica una envuelta retroviral;
- una secuencia polinucleotídica retroviral que comprende una Repetición Terminal Larga (LTR) en los extremos 5' y 3' de la secuencia polinucleotídica retroviral, donde una secuencia de promotor específico de tejido está contenida dentro de la LTR en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia polinucleotídica retroviral, siendo dicho promotor un promotor de mamífero,
- un casete que comprende un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) unido operativamente a un gen heterólogo, donde el casete se coloca justo cadena abajo de la secuencia que codifica la envuelta retroviral pero cadena arriba de la LTR 3'; y
- una secuencia polinucleotídica que actúa en cis necesaria para la transcripción inversa, el empaquetamiento y la integración en una célula diana;
- donde las secuencias GAG, POL y de envuelta retroviral se obtienen de virus de leucemia murina (MLV), virus de leucemia murina de Moloney (MoMLV) o virus de leucemia de gibón (GALV).
20. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que el promotor es el promotor de
probasina.
21. El polinucleótido de la reivindicación 19,
en el que el MoMLV es un MoMLV anfotrópico.
22. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que la envuelta retroviral comprende una
proteína quimérica.
23. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 22, en el que la proteína quimérica comprende una
proteína ENV y un resto de dirección.
24. El polinucleótido de la reivindicación 23,
en el que en el que el resto de dirección es un anticuerpo, un
receptor de hormonas o un ligando.
25. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que el ligando es heregulina.
26. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de
cadena única.
27. El polinucleótido de la reivindicación 23,
en el que la proteína ENV se selecciona del grupo que consiste en
proteína ENV de virus de leucemia murina (MLV) y proteína ENV de
virus de necrosis esplénica (SNV).
28. El polinucleótido de la reivindicación 23,
en el que la proteína ENV es una proteína anfotrópica.
29. El polinucleótido de la reivindicación 23,
en el que la proteína ENV es una proteína ecotrópica.
30. Los polinucleótidos de la reivindicación 19,
en los que la célula diana tiene un trastorno proliferativo de
células.
31. El polinucleótido de la reivindicación 19,
en el que la célula diana es una célula neoplásica.
32. El polinucleótido de la reivindicación 30,
en el que el trastorno proliferativo de células se selecciona del
grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer
de mama, cáncer de próstata, cáncer de tracto urinario, linfoma de
cáncer uterino, cáncer oral, cáncer pancreático, leucemia, melanoma,
cáncer de estómago y cáncer de tiroides, cáncer de hígado y cáncer
de cerebro y cáncer ovárico.
33. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que el promotor específico de tejido es el
promotor de tipo silvestre.
34. El polinucleótido de la reivindicación 19,
en el que la secuencia de promotor está asociado con un gen
regulador del crecimiento.
35. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que la secuencia de promotor específico de
tejido comprende al menos un elemento de respuesta a andrógenos
(ARE).
\newpage
36. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 35, en el que el elemento de respuesta a andrógenos
se obtiene del promotor de probasina.
37. El polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 35, en el que el promotor es el promotor de
probasina.
38. El polinucleótido de la reivindicación 19,
en el que la secuencia polinucleotídica está contenida en una
partícula viral.
39. El polinucleótido de la reivindicación 19,
en el que la secuencia polinucleotídica está contenida en un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
40. Un oncorretrovirus con capacidad de
replicación recombinante de acuerdo con la reivindicación 1:
- en el que gen heterólogo es un gen suicida.
41. El oncorretrovirus de la reivindicación 40,
en el que la envuelta retroviral comprende una proteína quimérica
que comprende una proteína ENV y un resto de dirección y en el que
la proteína ENV se selecciona del grupo que consiste en proteína
ENV de virus de leucemia murina (MLV) y proteína ENV de virus de
necrosis esplénica (SNV).
42. El oncorretrovirus de la reivindicación 40,
en el que la envuelta retroviral comprende una proteína quimérica
que comprende una proteína ENV y un resto de dirección y donde la
proteína ENV es una proteína anfotrópica.
43. El oncorretrovirus de la reivindicación 40,
en el que la envuelta retroviral comprende una proteína quimérica
que comprende una proteína ENV y un resto de dirección y en el que
la proteína ENV es una proteína ecotrópica.
44. El oncorretrovirus de la reivindicación 40,
en el que el gen suicida es timidina quinasa o nucleósido purina
fosforilasa (PNP).
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