ES2323946T3 - Adnc que codifica la subunidad alfa2 delta4 del canal de calcio humano. - Google Patents
Adnc que codifica la subunidad alfa2 delta4 del canal de calcio humano. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2323946T3 ES2323946T3 ES02728726T ES02728726T ES2323946T3 ES 2323946 T3 ES2323946 T3 ES 2323946T3 ES 02728726 T ES02728726 T ES 02728726T ES 02728726 T ES02728726 T ES 02728726T ES 2323946 T3 ES2323946 T3 ES 2323946T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- subunit
- calcium channel
- sequence
- protein
- channel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/06—Antimigraine agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/22—Anxiolytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Addiction (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compression, Expansion, Code Conversion, And Decoders (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Una molécula de ácido nucleico de alfa2delta-4 aislada y purificada, que codifica un polipéptido que es capaz de formar un canal de calcio funcional, seleccionado del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con los nucleótidos 1 a 224 del SEQ ID NO: 9; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con los nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9; (c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a los polinucleótidos de (a) o (b).
Description
ADNc que codifica La Subunidad Alfa2 Delta4 del
Canal de Calcio Humano.
Esta solicitud es una continuación de parte de
la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con el número de
serie 09/833.222 presentada el 11 de Abril de 2.001 y titulada
"ADNc que codifica La Subunidad Alfa2 Delta4 del Canal de Calcio
Humano".
Los canales de calcio regulados por el voltaje
(VGCC) median la entrada de Ca^{2+} en las células en respuesta a
la despolarización de la membrana (Catterall, W.A. (1988) Science
242:50-61 y Bean BP. (1989) Annu. Rev. Physiol.
51:367-368). El Ca^{2+} que entra en la célula a
través de los canales de Ca^{2+} regulados por el voltaje sirve
como segundo mensajero de la señalización eléctrica, iniciando
eventos intracelulares tales como la contracción, la secreción, la
transmisión sináptica, y la expresión génica. Por lo tanto, los VGCC
están implicados en una variedad de procesos fisiológicos en
vertebrados, tales como la contracción del músculo, la liberación
de insulina desde el páncreas, y la liberación de neurotransmisores
en el sistema nervioso (véanse Greenberg (1997), Annals of
Neurology, 42:275-82; Rorsman et al. (1994),
Diabete Metab. 20:138-145; y Catterall (1993),
Trends in Neurosciences
16:500-506).
16:500-506).
Los estudios electrofisiológicos revelan
diferentes tipos de canales de calcio denominados de tipo L (para
Larga Duración), de tipo T (para Transitorio), de tipo N (para ni L
ni T, o para "Neuronal"), de tipo P (para célula de Purkinje),
de tipo Q y de tipo R (para resistente) véanse Hess, (1990), Ann. NY
Acad. Sci. 560:27-38; Bertolino y Llinás, (1992)
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:399-421; y Randall
y Tsien, (1995) J. Neurosci. 15:2995-3012). Excepto
el canal de calcio de tipo T, que está activado por un voltaje bajo
(LVA), los tipos L, N, P, Q y R están todos activados por el
voltaje alto (HVA), esto es sus umbrales de activación son
normalmente superiores a -40 mV.
Los canales de Ca^{2+} HVA que han sido
caracterizados bioquímicamente son complejos de una subunidad
\alpha_{1} formadora de poro; un complejo transmembrana unido a
disulfuro de subunidades \alpha_{2} y \delta; una subunidad
\beta intracelular; y en algunos casos una subunidad \gamma
transmembrana. Hasta la fecha, la clonación molecular de canales de
calcio ha revelado que existen diez subunidades \alpha_{1},
cuatro complejos \alpha_{2}\delta, cuatro subunidades
\beta, y dos subunidades \gamma (Catterall, (2000), Annu. Rev.
Cell Dev. Biol.16: 521-555, y referencias allí
citadas). Los análisis de estas secuencias indican que las
secuencias primarias de los ADNc del canal de calcio tienen
homologías que oscilan entre 40% - 70%.
Las estructuras primarias de las cinco
subunidades del canal de Ca^{2+} fueron determinadas mediante una
combinación de química de proteínas con clonación de ADNc y
secuenciación. La subunidad \alpha_{1} es una proteína de
aproximadamente 2000 restos aminoácido con una secuencia de
aminoácidos y una estructura transmembrana pronosticada como la
caracterizada previamente, subunidad \alpha formadora de poro de
los canales de Na^{+} (Tanabe et al. (1987) Nature
328:313-18). La secuencia de aminoácidos se organiza
en cuatro dominios repetidos (I a IV), cada uno de los cuales
contiene seis segmentos transmembrana (S1 a S6) junto con un bucle
asociado a la membrana entre los segmentos transmembrana S5 y S6.
La subunidad \beta intracelular tiene hélices \alpha
pronosticadas pero no segmentos transmembrana (Ruth et al.,
(1989) Science 245:1115-18). La subunidad \gamma
es una glicoproteína con cuatro segmentos transmembrana (Jay et
al. (1990) Science 248:490-92). La subunidad
\alpha_{2} clonada tiene muchos sitios de glicosilación y varias
secuencias hidrófobas (Ellis et al. (1988) Science
241:1661-64), pero los estudios de la biosíntesis
indican que es una proteína de la membrana extrínseca, extracelular
anclada a la membrana por medio de un enlace disulfuro a la
subunidad \delta (Gurnett et al. (1996) Neuron
16:431-40). La subunidad \delta está codificada
por el extremo 3' de la secuencia codificadora del mismo gen que la
subunidad \alpha_{2}. Las formas maduras de las subunidades
\alpha_{2} y \delta son producidas mediante procesamiento
proteolítico post-traduccional y enlace disulfuro
(De Jongh et al. (1990) J. Biol. Chem.
265:14738-41; y Jay et al. (1991) J. Biol.
Chem. 266:3287-93).
La subunidad \alpha_{2}\delta regula la
mayoría de las propiedades de los canales de calcio, incluyendo la
cinética dependiente del voltaje y la unión al ligando (Qin et
al., (1998) Am J. Physiol. (Cell Physiol.), 274:
C1324-31). La expresión alterada de
\alpha_{2}\delta está implicada en diversos trastornos o
enfermedades, tales como la epilepsia y otros síndromes
relacionados con las convulsiones, la migraña, la ataxia y otros
defectos vestibulares (para una revisión véase Terwindt et.
al. (1998), Eur J Hum Genet
6(4):297-307), el dolor crónico (Backonja
(1998), JAMA, 280(21):1831-6), el estado de
ánimo, las interrupciones del sueño (Rowbotham (1998), JAMA,
280(21):1837-42), la ansiedad (Singh et
al. (1996), Psychopharmocology, 127(I):
1-9), la ELA (Mazzini L et. al. (1998), J
Neurol Sci 160 Suppl LS57- 63), la esclerosis múltiple (Metz,
(1998), Semin Neurol, 18(3):389-95), las
manías (Erfurth et al. (1998), J Psychiatr Res,
32(5):261-4), el temblor (Evidente, et
al. (1998), Mov Disord, 13(5):829-3 1),
el parkinson (Olson et al. (1997), Am J Med,
102(I):60-6), los síndromes de
abuso/adicción a sustancias (Watson et al. (1997),
Neuropharmacology, 36(10):1369-75), la
depresión, y el cáncer y al menos un gen \alpha_{2}\delta
está localizado en una región del genoma que se piensa que alberga
un importante gen supresor de tumores (Kok et al. (1997), Adv
Cancer Res, 71:27- 92). El gen \alpha_{2}\delta defectuoso
también ha sido asociado con enfermedades proliferativas distintas
del cáncer, tales como la inflamación.
La caracterización de los efectos de la
subunidad del canal de calcio sobre la unión al ligando demostró que
la subunidad \alpha_{2}\delta altera la unión de fármacos
neurológicos y cardiovasculares a la subunidad \alpha_{1}
formadora de poro de los canales iónicos. Recientemente, se demostró
que la gabapentina, un fármaco anticonvulsivo novedoso, se une con
una elevada afinidad a la subunidad \alpha_{2}\delta del
canal de calcio (Gee, et al. (1996) J. Biol. Chem.
271:5768-76). La gabapentina puede controlar la
excitabilidad neuronal modificando la actividad o la expresión del
canal de calcio (Rock et al. (1993) Epilepsy Res.
16:89-98). Muy interesantemente, los anticuerpos
dirigidos contra la subunidad \alpha_{2}\delta bloquean la
secreción desde las células PC12, sugiriendo que la subunidad
\alpha_{2}\delta puede jugar un papel distinto en la
liberación de neurotransmisores (Gilad et al. (1995)
Neurosci. Lett. 193:157-60; Tokumaru, et al.
(1995) J. Neurochem. 65:831-836 y Wiser, et
al. (1996) FEBS Lett. 379:15-20). Además, el
tratamiento con compuestos que se unen a \alpha_{2}\delta
conduce a cambios en el mecanismo de transducción de la señal de
ciertas proteínas incluyendo la alteración de los niveles de MEK
(quinasa quinasa MAP), una enzima que activa la quinasa MAP
(proteína quinasa activada por mitógeno). La activación de la
quinasa MAP parece ser esencial para la proliferación celular y la
activación constitutiva de esta quinasa es suficiente para inducir
la transformación celular.
La comprensión de la farmacología de los
compuestos que interaccionan con los canales de calcio y el diseño
de tales compuestos están limitados por una comprensión de los genes
que los codifican. La identificación de las subunidades del canal
de calcio permite la producción recombinante de cantidades
suficientes de subunidades de canal altamente purificadas que
pueden ser utilizadas en análisis de escrutinio para identificar o
determinar el efecto de diversos compuestos sobre la función del
canal, proporcionando una base para el diseño de agentes
terapéuticos que afectan al canal de calcio. En particular, la
identificación de nuevas subunidades \alpha2\delta podría
presentar posibilidades adicionales para la regulación diferencial y
específica de los canales de calcio.
La presente invención hace referencia a
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una isoforma
novedosa de la subunidad \alpha2\delta del canal de calcio
humano, referida en la presente memoria como
\alpha2\delta-4, a los polipéptidos codificados
por las secuencias de ácido nucleico aisladas, y al uso de las
moléculas de ácido nucleico y sus polipéptidos.
La Figura 1 ilustra la estructura genómica de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
humano.
La Figura 2 ilustra los resultados del análisis
de influjo de Ca^{2+}. Las células transfectadas con diferentes
combinaciones de constructos de expresión y cargadas con Ca^{2+}
Plus Dye durante 1 hora a 37ºC. Las células fueron despolarizadas
después añadiendo KCI al medio (a una concentración final de 50 mM)
y se midieron los cambios de [Ca^{2+}] intracelular en células
individuales mediante videomicroscopía de fluorescencia utilizando
el sistema Attofluor Digital Imaging. Para bloquear el influjo de
Ca^{2+}, se añadieron 10 \muM de Nifedipina antes de la
despolarización. Cada diagrama de barras representa la media \pm
ETM de los cambios de fluorescencia pico después de la
despolarización. El número de células analizadas se indica en cada
diagrama de barras.
El término "dominio de proteína" según se
utiliza en la presente memoria hace referencia a una región de una
proteína que tiene una estructura tridimensional concreta que tiene
características funcionales independientes del resto de la proteína.
Esta estructura puede proporcionar una actividad concreta a la
proteína. Las actividades ilustrativas incluyen, sin limitación,
actividad enzimática, creación de un motivo de reconocimiento para
otra molécula, o para proporcionar componentes estructurales
necesarios para que una proteína exista en un entorno concreto. Los
dominios de proteínas son normalmente regiones conservadas
evolutivamente de proteínas, tanto dentro de una familia de
proteínas como dentro de superfamilias de proteínas que realizan
funciones similares.
El término "superfamilia de proteínas"
según se utiliza en la presente memoria hace referencia a proteínas
cuya relación evolutiva no puede ser establecida completamente o
puede ser distante para los patrones filogenéticos aceptados
mostrando sin embargo una estructura tridimensional similar o
mostrando un consenso único de aminoácidos críticos.
El término "familia de proteínas" según se
utiliza en la presente memoria hace referencia a proteínas cuya
relación evolutiva ha sido establecida por los patrones
filogenéticos aceptados.
El término "proteína de fusión" según se
utiliza en la presente memoria hace referencia a constructos de
proteína que son el resultado de combinar múltiples dominios de
proteínas o regiones conectoras. Las proteínas de fusión pueden ser
creadas con el fin de obtener las funciones combinadas de los
dominios o las regiones conectoras. Las proteínas de fusión pueden
ser creadas por clonación molecular de las secuencias de nucleótidos
para generar una secuencia de nucleótidos contigua que codifique la
proteína de fusión. Alternativamente, la creación de una proteína
de fusión se puede completar mediante unión química de dos
proteínas.
El término "región conectora" o "dominio
conector" o términos descriptivos similares a estos según se
utilizan en la presente memoria hacen referencia a una o más
secuencias de polinucleótidos o polipéptidos que se utilizan en la
construcción de un vector de clonación o una proteína de fusión. La
función de una región conectora puede incluir la introducción de
sitios de clonación en la secuencia de nucleótidos, la introducción
de una región de componente flexible o creadora de espacio entre
dos dominios de una proteína, o la creación de una etiqueta de
afinidad para facilitar una interacción molecular específica. Una
región conectora puede ser introducida en una proteína de fusión,
si se desea, durante la construcción de la secuencia de polipéptidos
o nucleótidos.
El término "sitio de clonación" o "sitio
de policlonación" según se utiliza en la presente memoria hace
referencia a una región de la secuencia de nucleótidos que tiene
una o más secuencias de escisión consenso para las endonucleasas de
restricción disponibles. Estas secuencias de nucleótidos se pueden
utilizar para una variedad de fines incluyendo, pero no limitados
a, la introducción de estas secuencias en vectores de ADN para crear
proteínas de fusión novedosas, o para introducir mutaciones
dirigidas a sitios específicos. Es bien sabido por los expertos en
la técnica que los sitios de clonación pueden ser diseñados en una
localización deseada por medio de una mutación silenciosa, una
mutación conservada, o la introducción de una región conectora que
contiene secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de
restricción deseadas. También es bien sabido por los expertos en la
técnica que la localización precisa de un sitio de clonación puede
ser diseñada en cualquier localización de una secuencia de
nucleótidos. El término "etiqueta" según se utiliza en la
presente memoria hace referencia a una secuencia de aminoácidos o
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
aminoácidos que facilita el aislamiento, la purificación o la
detección de una proteína que contiene la etiqueta. Una amplia
variedad de tales etiquetas son conocidas por los expertos en la
técnica y son adecuadas para su uso en la presente invención. Las
etiquetas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, el péptido
HA, péptidos de polihistidina, biotina/avidina, y una variedad de
sitios de unión a epítopos de anticuerpos.
Los términos "gen
\alpha2\delta-4", "ácido nucleico que
codifica una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4", y "gen de la subunidad
del canal de calcio \alpha2\delta-4" según se
utiliza en la presente memoria, hacen referencia todos a una
molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es
esencialmente similar a la mostrada en el SEQ ID NO: 9. El término
"esencialmente similar" según se utiliza en la presente
memoria, incluye secuencias idénticas, así como deleciones,
sustituciones o adiciones a una secuencia de polinucleótidos o
polipéptidos que mantienen al menos una porción biológicamente
activa de la misma de la proteína producto y poseen cualquiera de
los motivos conservados. Se pretende que según se utilizan en la
presente memoria "gen \alpha2\delta-4",
"ácido nucleico que codifica una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4", o "gen de la subunidad
del canal de calcio \alpha2\delta-4",
comprendan una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de
al menos 70% con los nucleótidos 1 a 224 o 3308 a 3486 del SEQ ID
NO: 9, o comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga una
identidad de al menos 70% con los nucleótidos 1 a 224 del SEQ ID
NO:9 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al
menos 70% con los nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO:9. Los
términos "subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4", "una subunidad del canal
de calcio \alpha2\delta-4", y "una proteína
\alpha2\delta-4" según se utilizan en la
presente memoria, hacen referencia todos a una isoforma novedosa de
la subunidad del canal de calcio \alpha2\delta codificada por
un gen de la subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 e incluye además las variantes
modificadas conservativamente de la subunidad del canal de calcio.
El término "variante modificada conservativamente" según se
utiliza en la presente memoria se define más abajo.
El término "un canal de calcio funcional"
según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un canal
de calcio capaz de mediar el influjo de Ca^{2+} en una célula.
Éste está compuesto por al menos una subunidad del canal de calcio
\alpha1 formadora de poro, una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 y una o más subunidades del
canal de calcio adicionales, tales como \beta y \gamma.
A menos que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria
tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la
técnica.
Previamente, se habían identificado tres genes
\alpha2\delta y se habían caracterizado funcionalmente:
\alpha2\delta-1 (Ellis et al.,
supra), \alpha2\delta-2 y
\alpha2\delta-3 que también se denominan
\alpha2\delta-C (publicación WO 00/20450).
Además, se clonó una cuarta molécula de ADN,
\alpha2\delta-D, sin caracterización funcional
en la publicación WO 00/20450. En la presente invención, se
identificó y se caracterizó funcionalmente un gen \alpha2\delta
novedoso denominado en la presente memoria
\alpha2\delta-4. La secuencia completa del gen
\alpha2\delta-4 así como la de la subunidad del
canal de calcio \alpha2\delta-4 codificada no
se conocían previamente.
Se pueden utilizar células que expresan
naturalmente la subunidad para el aislamiento del ADNc de la
subunidad \alpha2\delta-4. Las células de
vertebrado que expresan naturalmente la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio incluyen,
pero no están limitadas a, cerebro, corazón y músculo esquelético.
También se pueden utilizar otras células y líneas celulares para
aislar el ADNc de la subunidad \alpha2\delta-4
del canal de calcio. La selección de otras células se puede
realizar después del escrutinio de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio en análisis
con extractos celulares o con células completas, descritos en la
presente memoria. Las células que poseen actividad de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio en estos
análisis pueden ser adecuadas para el aislamiento de ADN o ARNm de
la subunidad \alpha2\delta-4 del canal
de
calcio.
calcio.
Se puede utilizar cualquiera de una variedad de
procedimientos conocidos en la técnica para clonar el ADN de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio.
Un método consiste en dirigir la expresión funcional de los genes
de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio después de la construcción de una genoteca de ADNc que
contiene la subunidad \alpha2\delta-4 del canal
de calcio en un sistema vector de expresión adecuado. Otro método
consiste en escrutar una genoteca de ADNc que contiene la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio construida
en un vector lanzadera de bacteriófago o plásmido con una sonda
oligonucleotídica marcada diseñada a partir de toda o de parte de
la secuencia de aminoácidos de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Un método
adicional incluye escrutar una genoteca de ADNc que contiene la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
construida en un vector lanzadera de bacteriófago o plásmido con un
ADNc parcial que codifica la proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Este ADNc
parcial se obtiene utilizando la amplificación mediante PCR
específica de fragmentos de ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio por medio
del diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de
la secuencia de aminoácidos de la proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio.
Otro método más consiste en aislar ARN de
células productoras de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio y traducir
el ARN a proteína por medio de un sistema de traducción in
vitro o in vivo. La traducción del ARN a péptido o
proteína dará como resultado la producción de al menos una porción
de la proteína de la subunidad \alpha2\delta-4
del canal de calcio. Esta proteína puede ser identificada después,
por ejemplo, mediante reactividad inmunológica con un anticuerpo
anti-subunidad \alpha2\delta-4
del canal de calcio o mediante actividad biológica de la proteína
de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio midiendo por ejemplo el influjo de calcio o la unión de
gabapentina a la subunidad \alpha2\delta-4.
Alternativamente, se pueden analizar reservas de ARN aislado de
células productoras de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio en busca de
la presencia de un ARN que codifica al menos una porción de la
proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio. Se puede realizar un fraccionamiento adicional de
la reserva de ARN para purificar el ARN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio a partir de
un ARN que no es de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. El péptido
o proteína producidos mediante este método pueden ser analizados
para proporcionar secuencias de aminoácidos, que a su vez se
utilizan para proporcionar cebadores para la producción de ADNc de
la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio. El ARN que se utilizó para la traducción puede ser
analizado para proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican
una subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio y producir sondas para la producción de ADNc de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Este método
es conocido en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en
Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.
Resulta fácilmente evidente para los expertos en
la técnica de la biología molecular que pueden ser útiles otros
tipos de genotecas, así como genotecas construidas a partir de otras
células o tipos celulares, para el aislamiento del ADN que codifica
la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio. Otros tipos de genotecas incluyen, pero no están limitadas
a, genotecas de ADNc derivado de otras células, genotecas derivadas
de una variedad de organismos que expresan otras subunidades
\alpha2\delta-4 del canal de calcio, y genotecas
de ADN genómico que incluyen genotecas de YAC (cromosomas
artificiales de levadura) y de cósmidos.
La selección de las células o líneas celulares
para su uso en la preparación de una genoteca de ADNc para aislar
ADNc de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal
de calcio se puede realizar midiendo primero la actividad de la
subunidad \alpha2-4 del canal de calcio asociada
con la célula utilizando la medida de la actividad biológica
asociada con la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio o utilizando un análisis del unión a ligando.
La preparación de genotecas de ADNc se puede
realizar mediante mecanismos normalizados bien conocidos en la
técnica. Los mecanismos de construcción de genotecas de ADNc bien
conocidos se pueden encontrar por ejemplo en Maniatis, T., et
al., supra. También resulta fácilmente evidente para los
expertos en la técnica que el ADN que codifica una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio puede ser
aislado de una genoteca adecuada de ADN genómico. La construcción
de genotecas de ADN genómico se puede realizar mediante mecanismos
convencionales bien conocidos en la técnica. Las técnicas de
construcción de genotecas de ADN genómico bien conocidas también se
encuentran en Maniatis, T., et al., supra.
Con el fin de clonar el gen de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio por medio de
los métodos anteriores, se puede requerir el conocimiento de la
secuencia de aminoácidos de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. La
proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio se puede purificar y se pueden determinar
secuencias de aminoácidos parciales por medio de secuenciadores. No
es necesario determinar la secuencia de aminoácidos completa, sino
que se puede determinar la secuencia de lineal de dos regiones de 6
a 8 aminoácidos de la proteína para la producción de cebadores para
la amplificación de un fragmento parcial de ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio.
Una vez que se han identificado las secuencias
de aminoácidos adecuadas, se sintetizan las secuencias de ADN
capaces de codificarlas. Debido a que el código genético es
degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un
aminoácido concreto, y por lo tanto, se puede codificar una
secuencia de aminoácidos por medio de un grupo de oligonucleótidos
de ADN similares. Solamente un miembro del grupo será idéntico a la
secuencia de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio, pero, en las condiciones de hibridación
apropiadas, será capaz de hibridar con el ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. El ADN
aislado por medio de estos métodos se puede utilizar para escrutar
genotecas de ADN de una variedad de tipos celulares, de origen
invertebrado y vertebrado, y para aislar genes homólogos.
La subunidad \alpha2\delta-4
del canal de calcio biológicamente activa purificada puede tener
varias formas físicas diferentes. La subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio puede
existir en forma de un polipéptido naciente o no procesado
completo, o en forma de polipéptidos parcialmente procesados o
combinaciones de polipéptidos procesados. El polipéptido de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
naciente completo puede ser modificado
post-traduccionalmente mediante eventos de escisión
proteolítica específicos que dan como resultado la formación de
fragmentos del polipéptido naciente completo. Un fragmento o
asociación física de fragmentos puede tener la actividad biológica
completa asociada con la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio; sin
embargo, el grado de actividad de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio puede variar
entre los fragmentos de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio individuales
y los fragmentos de polipéptidos de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio asociados
físicamente.
Debido a que el código genético es degenerado,
se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido
concreto. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser
codificada por cualquiera de una serie de oligonucleótidos de ADN
similares. Solamente un miembro de la serie será idéntico a la
secuencia de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio pero será capaz de hibridar con el ADN de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con emparejamientos
erróneos en condiciones apropiadas. En condiciones alternativas,
los oligonucleótidos de ADN emparejados erróneamente todavía pueden
hibridar con el ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio para
permitir la identificación y el aislamiento del ADN que codifica la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio.
El ADN que codifica una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio de un
organismo concreto se puede utilizar para aislar y purificar
homólogos de las subunidades \alpha2\delta-4 del
canal de calcio de otros organismos. Para completar esto, se puede
utilizar el primer ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio para
hibridar con una muestra que contiene ADN que codifica subunidades
\alpha2\delta-4 del canal de calcio homólogas
en condiciones de hibridación apropiadas. El complejo de ADN
hibridado puede ser aislado y después el ADN que codifica el ADN
homólogo puede ser purificado.
Existe una cantidad sustancial de redundancia en
los diversos codones que codifican los aminoácidos específicos. Por
lo tanto, esta invención también está dirigida a aquellas secuencias
que contienen codones alternativos que codifican la traducción del
aminoácido idéntico. Para los fines de esta memoria, una secuencia
de ácido nucleico que tiene uno o más codones que varían
codificando todavía una secuencia de aminoácidos idéntica será
definida como variación degenerada. Las secuencias de ácido nucleico
con variaciones degeneradas se contemplan dentro del alcance de
esta invención.
También están incluidas en el alcance de esta
invención las secuencias que incluyen mutaciones en la secuencia de
ADN o en la proteína traducida, que no alteran esencialmente las
propiedades físicas fundamentales de la proteína expresada. Por
ejemplo, la sustitución de aminoácidos alifáticos alanina, valina,
leucina e isoleucina; el intercambio de los restos hidroxilo de
serina y treonina; el intercambio de los restos ácidos del ácido
aspártico y el ácido glutámico; la sustitución entre los restos
amida de asparagina y glutamina; el intercambio de los restos
alcalinos de lisina y arginina; y la sustitución entre los restos
aromáticos de fenilalanina y tirosina pueden no causar un cambio en
la funcionalidad del polipéptido. Tales sustituciones, a menudo
denominadas mutaciones conservativas dan como resultado
"variantes modificadas conservativamente", que han sido
manipuladas en un entorno de laboratorio o son de origen natural,
son bien conocidas y se describen, por ejemplo en Molecular Biology
of the Gene, 4ª Ed. Bengamin Cummings Pub. Co. por Watson et
al.
Se sabe que las secuencias de ADN que codifican
un péptido pueden ser alteradas para codificar péptidos que tienen
propiedades que son diferentes de las del péptido de origen natural.
Los métodos de alteración de las secuencias de ADN incluyen, pero
no están limitados a, mutagénesis dirigida al sitio, sustitución
quimérica, y fusión de genes. La mutagénesis dirigida al sitio se
utiliza para cambiar uno o más restos de ADN que pueden dar como
resultado una mutación silenciosa, una mutación conservativa, o una
mutación no conservativa. Los genes quiméricos pueden ser
preparados remplazando dominios del gen de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio por
dominios de genes similares o diferentes. Los genes de fusión se
pueden preparar añadiendo dominios o fragmentos de genes de otros
genes al gen de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio. Los ejemplos de los genes de fusión incluyen los
genes que codifican una proteína que contiene una etiqueta de
afinidad para facilitar la identificación y el aislamiento del gen
de fusión o de la proteína resultante. Los genes de fusión pueden
ser preparados creando una versión soluble de la proteína, por
ejemplo, separando uno o más dominios transmembrana o añadiendo una
secuencia direccionable para redirigir el transporte normal de la
proteína. Alternativamente, se pueden preparar genes de fusión que
añaden nuevas secuencias de modificación
post-traduccional al gen de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Tales
mutaciones se pueden usar para alterar las propiedades de unión de
una proteína. Los ejemplos de propiedades alteradas incluyen, pero
no están limitados a, cambios en la afinidad de un enzima por un
sustrato o de un receptor por un ligando. Tales cambios se pueden
utilizar para crear variantes útiles de la presente invención con
tal que se mantenga la función original (esto es, la capacidad del
gen de la subunidad para formar un canal de calcio funcional) de la
secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención
descrita en la presente memoria.
Identidad o similitud, como es sabido en la
técnica, hace referencia a la relación entre dos o más secuencias
de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos
determinadas comparando las secuencias. En la técnica, identidad
también hace referencia al grado de relación de la secuencia entre
secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso,
determinado basándose en el grado de emparejamiento entre las hebras
de tales secuencias. Tanto la identidad como la similitud se pueden
calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,
ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press,
Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I,
Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey,
1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,
Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y
Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Si bien
existen numerosos métodos para medir la identidad y la similitud
entre dos secuencias de polinucleótidos o dos de polipéptidos,
ambos términos son bien conocidos por los expertos en la técnica
(Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic
Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J.,
eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman,
D., (1988) SIAM J. Applied Math., 48, 1073. Los métodos comúnmente
empleados para determinar la identidad o similitud entre secuencias
incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos por Carillo,
H., y Lipman, D., supra. Los métodos preferidos para
determinar la identidad se diseñan para proporcionar el mayor
emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos
para determinar la identidad y la similitud son codificados en
programas de ordenador. Los métodos de los programas de ordenador
preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos
secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete de
programas GCG (Devereux, J., et al., (1984) Nucleic Acids
Research 12(1), 387), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S. F.
et al., (1990) J. Molec. Biol. 215, 403).
El término "polinucleótido o
polinucleótidos" o "molécula o moléculas de ácido nucleico"
según se utiliza en la presente memoria hace referencia a cualquier
polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o
ADN no modificado o ARN o ADN modificado. De este modo
polinucleótidos, según se utiliza en la presente memoria; hace
referencia, entre otros, a ADN monocatenario y bicatenario, ADN que
es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, ADN que es una
mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias o regiones mono-,
bi- y tri-catenarias, ARN mono- y bicatenario, y
ARN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moléculas
híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias, o
más típicamente, bicatenarias, o tricatenarias, o una mezcla de
regiones mono- y bicatenarias. Además, polinucleótido según se
utiliza en la presente memoria también hace referencia a regiones
tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las
cadenas de tales regiones pueden ser de la misma molécula o de
diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir la totalidad de
una o más de las moléculas, pero más típicamente implican solamente
una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una
región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. Según se
utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido incluye
ADN o ARN como se ha descrito antes que contienen una o más bases
modificadas. De este modo, los ADN o ARN con cadenas principales
modificadas por estabilidad o por otras razones son
"polinucleótidos" en lo que se pretende que signifique el
término en la presente memoria. Por otra parte, los ADN o ARN que
comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases
modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar solamente dos
ejemplos, son polinucleótidos según se utiliza el término en la
presente memoria. Se apreciará que se han realizado una gran
variedad de modificaciones en el ADN y el ARN que sirven para fines
muy útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término
polinucleótido según se emplea en la presente memoria abarca formas
modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente de
polinucleótidos, así como las formas químicas de los ADN y ARN
característicos de virus y células, incluyendo células tanto
eucarióticas como procarióticas. El término "polinucleótidos"
se utiliza adicionalmente en la presente memoria para incluir
polinucleótidos cortos referidos a menudo como oligonucleótidos.
El término "polipéptido o polipéptidos" o
"proteína o proteínas", según se utiliza en la presente
memoria, hace referencia a la estructura química básica de los
polipéptidos que es bien conocida y ha sido descrita en los libros
de texto y otras publicaciones de la técnica. En este contexto, el
término se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a
cualquier péptido, polipéptido o proteína que comprende dos o más
aminoácidos unidos entre sí en una cadena lineal por medio de
enlaces peptídicos. Según se utiliza en la presente memoria, el
término hace referencia tanto a cadenas cortas, que también son
referidas comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y
oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente
son referidos en la técnica como proteínas, de las cuales existen
muchos tipos. Se apreciará que los polipéptidos a menudo contienen
aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos referidos comúnmente
como 20 aminoácidos naturales, y que muchos aminoácidos, incluyendo
los aminoácidos terminales, pueden ser modificados en un polipéptido
dado, ya sea mediante procesos naturales, tales como el
procesamiento y otras modificaciones
post-traduccionales, pero también mediante
mecanismos de modificación química que son bien conocidas en la
técnica. Incluso las modificaciones más comunes que se producen
naturalmente en los polipéptidos son demasiado numerosas para
enumerarlas exhaustivamente aquí, pero están bien descritas en los
textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una
literatura de investigación voluminosa y son bien conocidas en la
técnica.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
incluir modificaciones conocidas tales como acetilación, acilación,
ribosilación de ADP, amidación, anclaje covalente de flavina,
anclaje covalente de un radical hemo, anclaje covalente de un
nucleótido o derivado de nucleótido, anclaje covalente de un lípido
o derivado de lípido, anclaje covalente de fosfatidilinositol,
entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro,
desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación
de cisteína, formación de piroglutamato, formilación,
gamma-carboxilación, glicosilación, formación del
ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación,
oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación,
racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN
de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación,
y ubiquitinación. Tales modificaciones son bien conocidas por los
expertos en la técnica y han sido descritas con gran detalle en la
literatura científica. Algunas modificaciones particularmente
comunes incluyendo, pero no limitadas a, glicosilación, anclaje de
lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos
ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación se
describen en los textos más básicos, tales como, por ejemplo
Proteins - Structure and Molecular Properties, 2ª Ed., T. E.
Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Se
encuentran disponibles muchas revisiones detalladas sobre esta
materia, tales como, por ejemplo, aquellas proporcionadas por Wold,
F., Post-traduccional Protein Modifications:
Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en
Post-traductional Covalent Modification of
Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York (1983);
Seifter et al., (1990) Meth. Enzymol. 182:
626-646 y Rattan et al., "Protein
Synthesis: Postraductional Modifications and Aging", (1992) Ann.
N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62.
Se apreciará, como es bien sabido y se ha
observado antes, que los polipéptidos no son siempre completamente
lineales. Por ejemplo, el término "polipéptido" incluye
adicionalmente moléculas que pueden no existir naturalmente, pero
pueden ser el producto, por ejemplo, de eventos
post-traduccionales o de una manipulación humana
adicional. Los ejemplos de estos polipéptidos incluyen polipéptidos
circulares, ramificados y circulares ramificados que pueden ser
sintetizados mediante procedimientos de traducción no naturales y
también mediante métodos completamente sintéticos. Las
modificaciones pueden producirse en cualquier parte de un
polipéptido, incluyen la cadena principal del péptido, las cadenas
laterales de aminoácidos o los extremos carboxilo. De hecho, el
bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o de ambos,
mediante una modificación covalente, es común en los polipéptidos
naturales y sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes
también en los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo,
el resto amino terminal de los polipéptidos elaborados en E.
coli u otras células, antes del procesamiento proteolítico será
casi invariablemente N-formilmetionina. Durante la
modificación post-traduccional del péptido, se puede
suprimir un resto metionina en el extremo NH_{2}. Por
consiguiente, esta invención contempla el uso tanto de variantes
amino terminales que contienen metionina como sin metionina de la
proteína de la invención.
Las modificaciones que se producen en un
polipéptido a menudo serán una función de cómo es elaborado. Para
los polipéptidos elaborados expresando una secuencia de ácido
polinucleico clonada en un anfitrión, por ejemplo, la naturaleza y
el grado de las modificaciones estarán determinados en gran parte
por la capacidad de modificación post-traduccional
de la célula anfitriona y las señales de modificación presentes en
la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como es
bien sabido, la glicosilación no se produce a menudo en anfitriones
bacterianos tales como, por ejemplo, E. coli. Por
consiguiente, cuando se desea una glicosilación, el polipéptido
debe ser expresado en un anfitrión glicosilante, generalmente una
célula eucariótica. Las células de insecto a menudo llevan las
mismas glicosilaciones post-traduccionales que las
células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado sistemas
de expresión en células de insecto para expresar eficazmente
proteínas de mamífero que tienen patrones de glicosilación nativos.
Se aplican consideraciones similares a otras modificaciones.
Se apreciará que el mismo tipo de modificación
puede estar presente en el mismo grado o un grado variable en
diversos sitios de un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido
dado puede contener muchos tipos de modificaciones. En general,
según se utiliza en la presente memoria, el término polipéptido
abarca todas estas modificaciones, particularmente aquellas que
están presentes en los polipéptidos sintetizados recombinantemente
expresando un polinucleótido en una célula anfitriona.
El término "variante o variantes" según se
utiliza en la presente memoria hace referencia a polinucleótidos o
polipéptidos que difieren de un polinucleótido o polipéptido de
referencia, respectivamente. Una variante de un polinucleótido
puede ser una variante de origen natural tal como una variante
alélica de origen natural o puede ser una variante que no se sabe
que se produzca en la naturaleza.
Las variantes polinucleotídicas son aquellas que
difieren en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de
referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que
las secuencias de nucleótidos de la referencia y la variante son
sobre todo muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Como se
indica más abajo, los cambios en la secuencia de nucleótidos de la
variante pueden ser silenciosos. Esto es, el cambio puede no
alterar los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Cuando
las alteraciones se limitan a cambios silenciosos de este tipo una
variante codificará un polipéptido con la misma secuencia de
aminoácidos que la referencia. Asimismo como se indica más abajo,
los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden
alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por
el polinucleótido de referencia. Tales cambios de nucleótidos
pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones,
fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido
codificado por la secuencia de referencia, como se ha comentado
antes.
Una variante polipeptídica hace referencia a un
polipéptido cuya secuencia de aminoácidos difiere de otro
polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están
limitadas de manera que las secuencias de la referencia y la
variante son muy similares en general, y en muchas regiones
idénticas. Un polipéptido variante y uno de referencia pueden
diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones,
adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos, que pueden estar
presentes en cualquier combinación. Como se usa en la presente
memoria, un "derivado funcional" de una subunidad del canal de
calcio \alpha2\delta-4 es un compuesto que
posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que
es esencialmente similar a la actividad biológica de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio
proporcionada en el SEQ ID NO: 10. Se pretende que el término
"derivados funcionales" incluya los "fragmentos",
"variantes", "variantes degeneradas", "análogos" y
"homólogos" o "derivados químicos" de las subunidades
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Los
derivados químicos útiles de los polipéptidos son bien conocidos en
la técnica e incluyen, por ejemplo la modificación covalente de uno
o más sitios orgánicos reactivos contenidos en el polipéptido con un
radical químico secundario. Los reactivos de entrecruzamiento bien
conocidos son útiles para hacer reaccionar restos amino, carboxilo,
o aldehído para introducir, por ejemplo una etiqueta de afinidad tal
como biotina, un colorante fluorescente, o para conjugar el
polipéptido con una superficie de una fase sólida (por ejemplo para
crear una resina de
afinidad).
afinidad).
Se pretende que el término "fragmento" haga
referencia a cualquier subgrupo de polipéptidos de una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Una
molécula es "esencialmente similar" a una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio si ambas
moléculas tienen estructuras esencialmente similares o si ambas
moléculas poseen una actividad biológica similar. Por lo tanto, si
las dos moléculas poseen una actividad esencialmente similar, se
considera que son variantes incluso si la estructura de una de las
moléculas no se encuentra en la otra o incluso si las dos
secuencias de aminoácidos no son idénticas. El término
"análogo" hace referencia a una molécula esencialmente similar
en función a la molécula de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio completa o
a uno de sus fragmentos.
Una realización de los polinucleótidos de la
invención es una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con
los nucleótidos 1 a 224 del SEQ ID NO: 9; o uno de sus
complementos. Más preferiblemente, el polinucleótido de la invención
que codifica una proteína de la subunidad \alpha2\delta del
canal de calcio comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de al menos 85% con nucleótidos 1 a 22 del SEQ ID NO:9, o
uno de sus complementos.
Otra realización de los polinucleótidos de la
invención es una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con
los nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9; o uno de sus
complementos. Más preferiblemente, el polinucleótido de la invención
es un polinucleótido que codifica una proteína de la subunidad del
canal de calcio \alpha2\delta que comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% con los
nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9, o uno de sus
complementos.
Otra realización de los polinucleótidos de la
invención es una molécula de ácido nucleico que comprende tanto una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con
los nucleótidos 1 a 225 como una secuencia de nucleótidos que tiene
una identidad de al menos 70% con los nucleótidos 3308 a 3486 del
SEQ ID NO: 9; o uno de sus complementos. Preferiblemente, el
polinucleótido de la invención que codifica una proteína de la
subunidad del canal de calcio \alpha2\delta comprende tanto una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85%
con los nucleótidos 1 a 225 como una secuencia de nucleótidos que
tiene una identidad de al menos 85% con los nucleótidos 3308 a 3486
del SEQ ID NO: 9; o uno de sus complementos.
Los polinucleótidos particularmente preferidos
de esta invención codifican variantes, análogos, derivados y
fragmentos del SEQ ID NO: 9, y las variantes, análogos y derivados
de los fragmentos, que tienen la secuencia de aminoácidos del
polipéptido del SEQ ID NO: 10 en la cual varios, unos pocos, 5 a 10,
1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún restos aminoácidos están sustituidos,
suprimidos o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente
preferidas entre estas están las sustituciones, adiciones y
deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y
actividades de la proteína codificada por el ácido nucleico del SEQ
ID NO: 9. Asimismo son especialmente preferidas en este aspecto las
sustituciones conservativas. Son muy preferidos los polinucleótidos
que codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos
del SEQ ID NO: 10, sin sustituciones.
Las realizaciones más preferidas de la invención
son los polinucleótidos que son idénticos al menos en 94% a lo
largo de toda la longitud de la secuencia de polinucleótidos
mostrada en el SEQ ID NO: 9, y los polinucleótidos que son
complementarios a tales polinucleótidos.
Otra realización preferida de la invención son
los polinucleótidos que codifican polipéptidos que son idénticos al
menos en 96% a lo largo de toda su longitud a las secuencias de
aminoácidos mostradas en el SEQ ID NO: 10, y los polinucleótidos
que son complementarios a tales polinucleótidos.
La presente invención hace referencia
adicionalmente a los polinucleótidos que hibridan con las secuencias
descritas antes en la presente memoria. Con respecto a esto, la
presente invención hace referencia especialmente a los
polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los
polinucleótidos descritos antes en la presente memoria. Existen un
gran número de mecanismos de hibridación de polinucleótidos
conocidas en la técnica incluyendo hibridaciones que acoplan ADN a
ADN, ARN a ARN y ARN a ADN. Todos estos métodos pueden incorporar
condiciones de hibridación rigurosas para facilitar la
identificación exacta del direccionamiento de un ácido nucleico a
una sonda hibridable. Como es sabido en la técnica, los métodos
varían dependiendo del sustrato utilizado para la hibridación y en
Maniatis et al. supra, así como en una variedad de
referencias de la técnica se detallan numerosos mecanismos de
hibridación rigurosos. Según se utiliza en la presente memoria, el
término "condiciones de hibridación rigurosas" hace referencia
a la hibridación de una molécula de ácido nucleico sobre un soporte
de filtro a una sonda de interés a 42ºC durante aproximadamente 8 a
24 horas en un tampón de hibridación con bajo contenido de sal,
seguido de lavado a 65ºC en un tampón que comprende fosfato de sodio
0,02 a 0,04 M, pH 7,2, SDS al 1% y EDTA 1 mM durante
aproximadamente 30 minutos a 4 horas. Se puede utilizar un sustrato
adecuado tal como nitrocelulosa, nailon, difluorouro de
polivinilideno, o similar como soporte del filtro. Se utiliza una
sonda marcada, preferiblemente con suficiente actividad específica
(generalmente mayor de aproximadamente 10^{8} cpm/\mug de sonda
cuando se marca radiactivamente, o siguiendo las instrucciones el
fabricante cuando se utiliza un kit de marcaje químico). En una
realización, el tampón de hibridación con bajo contenido de sal
comprende, SDS del 0,5 al 10%, fosfato de sodio 0,05 a 0,5 M. En una
realización ilustrativa, en la que se utiliza nitrocelulosa, y el
ácido nucleico inmovilizado es ADN inmovilizado sobre nitrocelulosa,
la nitrocelulosa con ADN se incuba con una solución de hibridación
que comprende formamida-desionizada al 50%, 6X SSC,
SDS al 1%, Tween 20 al 0,1% y 100 \mug/ml de ARNt a 42ºC durante
15 minutos. Se añade la sonda y la nitrocelulosa se inmoviliza
adicionalmente a 42ºC durante aproximadamente 12-19
horas. La nitrocelulosa se lava después en al menos dos lavados
sucesivos a 22ºC seguidos de lavados rigurosos a 65ºC en un tampón
de fosfato de sodio 0,04 M, pH 7,2, SDS al 1% y EDTA 1 mM. Las
condiciones para aumentar la restricción de una variedad de
hibridaciones de nucleótidos son bien conocidas en la técnica.
Como se comenta adicionalmente en la presente
memoria con respecto a los análisis de polinucleótidos de la
invención, por ejemplo, se pueden utilizar los polinucleótidos de la
invención como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN
genómico para aislar ADNc completos y clones genómicos que codifican
las secuencias del SEQ ID NO: 9 y para aislar ADNc y clones
genómicos de otros genes que tienen una alta similitud de secuencia
con el SEQ ID NO: 9. Tales sondas comprenderán generalmente al menos
15 bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 bases y
pueden tener al menos 50 bases. Las sondas particularmente
preferidas tendrán al menos 30 bases y preferiblemente tendrán 50
bases o menos. Por ejemplo, la región codificante del gen de la
invención puede ser aislada utilizando la secuencia de ADN conocida
para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Un oligonucleótido
marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la
presente invención se utiliza después para escrutar una genoteca de
ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar con qué miembros de la
genoteca hibrida la
sonda.
sonda.
La presente invención hace referencia
adicionalmente a polipéptidos codificados por los polinucleótidos de
la invención.
Una realización de los polipéptidos de la
invención es un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con los
aminoácidos 1 a 12 del SEQ ID NO: 10; donde el polipéptido es capaz
de formar un canal de calcio funcional con las otras subunidades de
los canales de calcio, tales como \alpha1, \beta y \gamma.
Comprendiendo preferiblemente el polipéptido una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos 95% con los
aminoácidos 1 a 12 del SEQ ID NO:10.
Otra realización de los polipéptidos de la
invención es un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos 70% con los
aminoácidos 1040 a 1090 del SEQ ID NO: 10; donde el polipéptido es
capaz de formar un canal de calcio funcional con las otras
subunidades de canales de calcio, tales como \alpha1, \beta y
\gamma. Comprendiendo preferiblemente el polipéptido una secuencia
de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con los
aminoácidos 1040 a 1090 del SEQ ID NO: 10.
Otra realización más de los polipéptidos de la
invención es un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con los
aminoácidos 1 a 12 y una secuencia de aminoácidos que tiene una
identidad de al menos 70% con los aminoácidos 1040 a 1090 del SEQ ID
NO: 10; donde el polipéptido es capaz de formar un canal de calcio
funcional con las otras subunidades de canales de calcio, tales como
\alpha1, \beta y \gamma. Comprendiendo preferiblemente el
polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de
al menos 95% con los aminoácidos 1 a 12 y una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con los
aminoácidos 1040 a 1090 del SEQ ID NO: 10.
Las realizaciones preferidas de la invención son
polipéptidos que son idénticos al menos en 96% a lo largo de toda
su longitud con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID
NO: 10. Muy preferiblemente, el polipéptido de la presente
invención incluye el polipéptido del SEQ ID NO: 10.
El ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio obtenido por
medio de los métodos descritos en la presente memoria puede ser
expresado recombinantemente mediante clonación molecular en un
vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros
elementos reguladores de la transcripción apropiados y transferido
a células anfitrionas procarióticas o eucarióticas para producir una
proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio recombinante. Los mecanismos para tales
manipulaciones son descritos en detalle por Maniatis, T, et
al., supra, y son bien conocidos en la técnica.
Los vectores de expresión se definen en la
presente memoria como secuencias de ADN que son requeridas para la
transcripción de copias clonadas de genes y para la traducción de
sus ARNm en un anfitrión apropiado. Tales vectores pueden ser
utilizados para expresar genes eucarióticos en una variedad de
anfitriones tales como bacterias incluyendo E. coli, algas
verdeazuladas, células vegetales, células de insectos, células
fúngicas incluyendo células de levadura, y células animales.
Los vectores diseñados específicamente permiten
el lanzamiento de ADN entre anfitriones tales como
bacterias-levaduras o
bacterias-células de animales o
bacterias-células fúngicas o
bacterias-células de invertebrados. Un vector de
expresión construido apropiadamente contiene preferiblemente un
origen de replicación para la replicación autónoma en células
anfitrionas, marcadores seleccionables, al menos un sitio de
reconocimiento para una endonucleasa de restricción, un potencial
para un elevado número de copias, y promotores activos. Un promotor
se define como una secuencia de ADN que dirige una ARN polimerasa a
unirse con el ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte
es aquél que hace que los ARNm se inicien con una frecuencia
elevada. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no están
limitados a, vectores de clonación, vectores de clonación
modificados, plásmidos o virus diseñados específicamente.
Se pueden utilizar varios vectores de expresión
en mamífero para expresar subunidades
\alpha2\delta-4 del canal de calcio
recombinante en células de mamífero. Los vectores de expresión
disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la
expresión de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio recombinante incluyen, pero no están limitados a,
pMAMneo (Clontech), pcADN3 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1
(Stratagene), pSG5 (Stratagene),
EBO-pSV2-neo (ATCC 37593)
pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC
37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y IZD35
(ATCC 37565).
Se pueden utilizar varios vectores de expresión
bacterianos para expresar una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio
recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión
bacterianos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para
la expresión de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio recombinante incluyen, pero no están limitados a,
vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen).
Se pueden utilizar varios vectores de expresión
en células fúngicas para expresar una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 recombinante en células fúngicas
tales como levaduras. Los vectores de expresión en células fúngicas
disponibles en el mercado adecuados para la expresión de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
recombinante incluyen, pero no están limitados a, pYES2 (Invitrogen)
y vectores de expresión en Pichia (Invitrogen).
Se pueden utilizar varios vectores de expresión
en células de insectos para expresar una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio
recombinante en células de insecto. Los vectores de expresión en
células de insecto disponibles en el mercado adecuados para la
expresión recombinante de una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio incluyen,
pero no están limitados a pBlueBacII (Invitrogen).
El ADN que codifica una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio puede ser
clonado en un vector de expresión para su expresión en una célula
anfitriona recombinante. Las células anfitrionas recombinantes
pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo, pero no
limitadas a, bacterias tales como E. coli, células fúngicas
tales como levadura, células de mamífero incluyendo, pero no
limitadas a, líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de
mono y de roedor, y células de insecto incluyendo, pero no limitadas
a, líneas celulares derivadas de Drosophila y gusano de seda. Las
líneas celulares derivadas de especies de mamífero que se
encuentran disponibles en el mercado y se pueden utilizar en esta
invención incluyen, pero no están limitadas a, CV-1
(ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650),
COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC
CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL
2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1
(ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, y
HEK-293 (ATCC CRL1573).
El vector de expresión puede ser introducido en
las células anfitrionas por medio de uno de los numerosos
mecanismos que incluyen, pero no están limitados a, transformación,
transfección, fusión de protoplastos, lipofección, y
electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se
propagan clónicamente y se analizan individualmente para determinar
si producen la proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. La
identificación de los clones que expresan la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio se puede
realizar utilizando anticuerpos que reconocen la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio o
alternativamente, se pueden identificar las células que expresan la
subunidad basándose en la presencia de actividad de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio asociada a
la célula anfitriona.
La expresión del ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio también se
puede realizar utilizando ARNm sintético producido in vitro.
El ARNm sintético o el ARNm aislado de células productoras de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
puede ser traducido eficazmente en diversos sistemas libres de
células incluyendo, pero no limitados a, extractos de germen de
trigo y extractos de reticulocitos. El ARNm también puede ser
traducido en sistemas basados en células, por ejemplo, mediante
microinyección en oocitos de rana.
Para determinar la secuencia o las secuencias de
ADN de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio que producen niveles óptimos de actividad de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio y/o de
proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio, se pueden construir moléculas de ADN de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio.
Un constructo contemplado para su uso es el marco de lectura abierto
completo del ADNc de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio que codifica
una proteína de 1090 aminoácidos y que corresponde a
aproximadamente la base 189 a aproximadamente la base 3472 del SEQ
ID NO: 9 (estos números corresponden al primer nucleótido de la
primera metionina y al último nucleótido antes del primer codón de
parada). Otros constructos son aquellos que contienen porciones del
ADNc que codifican una proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio. Todos los
constructos pueden ser diseñados para contener ninguna, toda o
porciones de la región no traducida 5' o 3' de un ADNc de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio.
La actividad de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio y los niveles de expresión de proteína pueden ser
determinados después de la introducción, tanto individualmente o
combinada, de estos constructos en células anfitrionas apropiadas.
Una vez que el casete de ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio que produce
una expresión óptima en los análisis transitorios ha sido
identificado, se puede transferir este constructo de ADN de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio a
una variedad de vectores de expresión para la expresión en células
anfitrionas incluyendo, pero no limitadas a, células de mamífero,
células de insecto infectadas con baculovirus, E. coli, y la
levadura S. cerevisiae.
La presente invención proporciona métodos para
producir un polipéptido esencialmente purificado de la invención.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "esencialmente
purificado" significa que la proteína o una de sus porciones
biológicamente activas están esencialmente libre de material celular
u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido de origen del
cual deriva la proteína, o esencialmente libre de precursores
químicos u otros agentes químicos cuando son sintetizadas
químicamente. La expresión "esencialmente libre de material
celular" incluye preparaciones de proteína en las cuales la
proteína es separada de los componentes celulares de las células de
las cuales se aísla o se produce recombinantemente. De este modo, la
proteína que está esencialmente libre de material celular incluye
preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%,
20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también
referida en la presente memoria como "proteína contaminante").
Cuando la proteína o una de sus porciones biológicamente activas es
producida recombinantemente, también está preferiblemente
esencialmente libre de medio de cultivo, esto es, el medio de
cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10%, o 5% del
volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteína es
producida mediante síntesis química, ésta se encuentra
preferiblemente esencialmente libre de precursores químicos u otros
agentes químicos, esto es, está separada de los precursores químicos
u otros agentes químicos que están implicados en la síntesis de la
proteína. Por consiguiente tales preparaciones de la proteína tienen
menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de
precursores químicos o compuestos distintos del polipéptido de
interés.
Según se utiliza en la presente memoria,
polipéptidos "recombinantes" hace referencia a polipéptidos
producidos mediante técnicas de ADN recombinante; esto es,
producidos a partir de células transformadas por un constructo de
ADN exógeno que codifica el polipéptido deseado. Los polipéptidos
"sintéticos" son aquellos preparados mediante síntesis
química.
En una realización, el polipéptido puede ser
aislado de células o fuentes de tejido que los expresan naturalmente
por medio de un esquema de purificación apropiado utilizando
mecanismos de purificación de proteínas convencionales. En otra
realización, los polipéptidos de la invención son producidos
mediante técnicas de ADN recombinante. Alternativamente, un
polipéptido de la invención puede ser sintetizado en un sistema de
traducción y/o transcripción in vitro. Adicionalmente un
polipéptido de la invención puede ser sintetizado químicamente de
manera alternativa utilizando mecanismos de síntesis de péptidos
convencionales. Tras la expresión de una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio de esta
invención en una célula anfitriona recombinante, se puede recuperar
la proteína de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio para
proporcionar una subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio purificada en una forma activa. Se encuentran
disponibles varios procedimientos de purificación de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio y son
adecuados para su uso. Por ejemplo, como se ha comentado antes, una
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio recombinante puede ser purificada a partir de productos
lisados celulares y extractos o a partir de medio de cultivo
acondicionado utilizando diversas combinaciones o de
fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción
en hidroxilapatita y cromatografía de interacción hidrófoba, y
cromatografía de afinidad anticuerpo/ligando o su aplicación
individual.
Las subunidades
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio
recombinante se pueden separar de otras proteínas celulares
utilizando una columna de inmunoafinidad elaborada con anticuerpos
monoclonales o policlonales monoespecíficos para una subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio
naciente completa, específica para fragmentos polipeptídicos de una
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio o específica para subunidades de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio. Una
vez que la resina de afinidad es preparada y cargada sobre una
columna, la resina de afinidad se equilibra en un tampón adecuado,
por ejemplo solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3). Los
sobrenadantes del cultivo celular o los extractos celulares que
contienen la subunidad \alpha_{2}\delta-4 del
canal de calcio o las subunidades del canal de calcio
\alpha_{2}\delta-4 se hacen pasar lentamente a
través de la columna. La columna se lava con el tampón hasta que la
densidad óptica (A_{280}) cae hasta el fondo, después se hace
eluir la proteína cambiando las condiciones del tampón, por ejemplo
disminuyendo el pH usando un tampón tal como
glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6). La proteína de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio purificada se somete a diálisis después frente a un tampón
adecuado tal como solución salina tamponada con fosfato.
Los polipéptidos de la invención también pueden
ser producidos utilizando un sistema de traducción y/o transcripción
in vitro. Tales métodos son conocidos por los expertos en la
técnica. Por ejemplo, se puede traducir eficazmente ARN, de
\alpha2\delta-4 sintético o ARNm aislado de
células productoras de \alpha2\delta-4 del canal
de calcio en diversos sistemas sin células, incluyendo pero no
limitados a extractos de germen de trigo y extractos de
reticulocitos. Alternativamente, la secuencia codificante del ADNc
de \alpha2\delta-4 puede ser clonada bajo el
control de un promotor de T7. Después, utilizando este constructo
como molde, se puede producir la proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 en un sistema de transcripción y
traducción in vitro, el Sistema de Producto Lisado de
Reticulocitos acoplado a T7 de TNT, que se encuentra disponible en
el mercado de Promega.
Los polipéptidos de la invención también pueden
ser producidos mediante síntesis química, tal como síntesis de
péptidos en fase sólida en un sintetizador peptídico automatizado,
utilizando secuencias de aminoácidos conocidas o secuencias de
aminoácidos derivadas de la secuencia de ADN de los genes de
interés. Tales métodos son conocidos por los expertos en la
técnica.
Otro aspecto de la invención tiene que ver con
los anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de la invención. El
término "anticuerpo" según se utiliza en la presente memoria
hace referencia a moléculas de inmunoglobulina y porciones
inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, esto es,
moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une
específicamente a un antígeno, tal como un polipéptido de la
invención, p. ej., un epítopo de un polipéptido de la invención.
Una molécula que se une específicamente a un polipéptido dado de la
invención es una molécula que se une al polipéptido, pero no se une
esencialmente a otras moléculas de la muestra, p. ej., una muestra
biológica, que contiene naturalmente el polipéptido. Los ejemplos de
las porciones inmunológicamente activas de las moléculas de
inmunoglobulina incluyen los fragmentos F(ab) y
F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con
una enzima tal como pepsina.
La invención proporciona anticuerpos
policlonales y monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal"
o "composición de anticuerpo monoclonal", según se utiliza en
la presente memoria, hace referencia a una población de moléculas
de anticuerpo que contiene solamente una especie de sitio de unión
al antígeno capaz de reaccionar inmunológicamente con un epítopo
concreto. El término "anticuerpo policlonal" hace referencia a
anticuerpos dirigidos contra uno o varios polipéptidos de la
invención capaces de reaccionar inmunológicamente con más de un
epítopo. Las preparaciones de anticuerpo policlonal particularmente
preferidas son aquellas que contienen solamente anticuerpos
dirigidos contra uno o varios polipéptidos de la invención.
El término "antígeno" según se utiliza en
la presente memoria hace referencia a una molécula que contiene uno
o más epítopos que estimularán el sistema inmunitario del anfitrión
para elaborar una respuesta específica del antígeno humoral y/o
celular. El término también se utiliza en la presente memoria
indistintamente con "inmunógeno".
El término "epítopo" según se utiliza en la
presente memoria hace referencia al sitio de un antígeno o un
hapteno al cual se une la molécula de anticuerpo específico. El
término también se utiliza en la presente memoria indistintamente
con "determinante antigénico" o "sitio del determinante
antigénico".
Un polipéptido aislado de la invención, o uno de
sus fragmentos, puede ser utilizado como inmunógeno para generar
anticuerpos empleando técnicas convencionales para la preparación de
anticuerpos policlonales y monoclonales. Se pueden utilizar el
polipéptido o la proteína completos, o alternativamente, la
invención proporciona fragmentos peptídicos antigénicos para su uso
como inmunógenos. El péptido antigénico de una proteína de la
invención comprende al menos 8 (preferiblemente 10, 15, 20, o 30)
restos aminoácido de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10
y abarca un epítopo de la proteína de manera que un anticuerpo
originado contra el péptido forma un complejo inmunitario
específico con la proteína. Los epítopos preferidos abarcados por el
péptido antigénico son regiones que están localizadas sobre la
superficie de la proteína, p. ej., regiones hidrófilas de las
proteínas de la invención. Las regiones hidrófobas o hidrófilas de
una proteína pueden ser identificadas usando programas de soporte
lógico para el trazado del carácter hidrófobo.
Típicamente se utiliza un inmunógeno para
preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado, (p. ej.,
conejo, cabra, ratón u otro mamífero). Una preparación inmunogénica
apropiada puede contener, por ejemplo, un polipéptido expresado
recombinantemente o sintetizado químicamente. La preparación puede
incluir adicionalmente un coadyuvante, tal como coadyuvante
completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador
similar. Las composiciones de inmunógeno particularmente preferidas
son aquellas que no contienen otras proteínas humanas tales como,
por ejemplo, composiciones de inmunógeno elaboradas utilizando una
célula anfitriona no humana para la expresión recombinante de un
polipéptido de la invención. De esta manera, el único o los únicos
epítopos humanos reconocidos por las composiciones de anticuerpo
resultantes originadas contra este inmunógeno estarán presentes como
parte de uno o varios polipéptidos de la invención.
Los anticuerpos policlonales pueden ser
originados inmunizando sujetos animales adecuados tales como
ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares,
prefiriéndose los conejos, con un polipéptido de la invención como
inmunógeno con o sin coadyuvante inmunitario. El suero preinmune se
recoge antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre
aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 1000 mg de polipéptido de
la invención asociado con o sin un coadyuvante inmunitario
aceptable. Tales coadyuvantes aceptables incluyen pero no están
limitados a, completo de Freund, incompleto de Freund, precipitado
con alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene
Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial
consiste en el polipéptido, preferiblemente, en coadyuvante
completo de Freund en múltiples sitios subcutáneamente (SC),
intraperitonealmente (IP) o ambos. Se toman muestras de sangre de
cada animal a intervalos regulares, preferiblemente semanalmente,
para determinar el título de anticuerpo. Los animales pueden recibir
o no inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial. A
los animales que reciben inyecciones de refuerzo generalmente se les
administra una cantidad igual del antígeno en coadyuvante
incompleto de Freund por la misma ruta. Las inyecciones de refuerzo
se administran a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta
que se obtienen títulos máximos. Aproximadamente 7 días después de
cada inmunización de refuerzo o aproximadamente semanalmente después
de una única inmunización, se toman muestras de sangre de los
animales, se recoge el suero, y se almacenan alícuotas a
aproximadamente -20ºC.
Se preparan anticuerpos monoclonales (mAb)
reactivos con la subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 inmunizando ratones
endogámicos, preferiblemente Balb/c, con el polipéptido de la
invención. Los ratones se inmunizan por la ruta IP o SC con
aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1,0 mg, preferiblemente
aproximadamente 0,1 mg, de polipéptido de la invención en
aproximadamente 0,1 ml de tampón o solución salina incorporados a
un volumen igual de un coadyuvante aceptable, como se ha comentado
antes. Se prefiere el coadyuvante de Freund, utilizándose el
coadyuvante completo de Freund para la inmunización inicial y
utilizándose coadyuvante incompleto de Freund después de eso. Los
ratones reciben una inmunización inicial el día 0 y se dejan
descansar durante aproximadamente 2 a aproximadamente 30 semanas.
Se administran a los ratones inmunizados una o más inmunizaciones
de refuerzo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,0 mg de
polipéptido de la invención en una solución tampón tal como
solución salina tamponada con fosfato por la ruta intravenosa (IV).
Se obtienen los linfocitos, de ratones positivos para el
anticuerpo, preferiblemente linfocitos esplénicos, separando los
bazos de ratones inmunizados mediante procedimientos convencionales
conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma mezclando
los linfocitos esplénicos con un compañero de fusión apropiado,
preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitan la
formación de hibridomas estables. Los compañeros de fusión pueden
incluir, pero no están limitados a: mielomas de ratón P3/NS1/Ag
4-1; MPC-11; S-194 y
Sp2/0, prefiriéndose generalmente Sp2/0. Las células productoras de
anticuerpo y las células de mieloma se fusionan en polietilenglicol,
aproximadamente 1000 mol. en peso, a concentraciones de
aproximadamente 30% a aproximadamente 50%. Las células de hibridoma
fusionadas se seleccionan por crecimiento en Medio de Eagle
Modificado por Dulbecco (DMEM) con suplemento de hipoxantina,
timidina y aminopterina mediante procedimientos conocidos en la
técnica. Los fluidos del sobrenadante se recogen de los pocillos
con crecimiento positivo aproximadamente a los días 14, 18, y 21 y
se escrutan en busca de producción de anticuerpo por medio de un
inmunoanálisis tal como inmunorradioanálisis en fase sólida (SPIRA)
utilizando el polipéptido de la invención como antígeno. Los fluidos
del sobrenadante también se someten a ensayo en un análisis de
precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb.
Las células de hibridoma de los pocillos positivos para el
anticuerpo se clonan mediante una técnica tal como la técnica de
agar blando de MacPherson, Técnicas en Agar Blando, en Tissue
Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds.,
Academic Press, 1973 o mediante la técnica de la dilución
limitante.
Los anticuerpos monoclonales son producidos
in vivo por inyección de ratones Balb/c cebados con pristano,
aproximadamente 0,5 ml por ratón, con aproximadamente 1 x 10^{6}
a aproximadamente 6 x 10^{6} células de hibridoma al menos
aproximadamente 4 días después del cebado. El fluido de las ascitis
se recoge a aproximadamente 8-12 días de la
transferencia celular y los anticuerpos monoclonales se purifican
mediante mecanismos conocidos en la técnica.
Los Ab monoclonales también pueden ser
producidos In vitro haciendo crecer el hibridoma en medios
para el cultivo de tejidos bien conocidos en la técnica. Se puede
llevar a cabo un cultivo celular in vitro de alta densidad
para producir grandes cantidades de mAb utilizando mecanismos para
el cultivo en fibra hueca, reactores neumáticos, botella giratoria,
o mecanismos de cultivo en matraces de agitación bien conocidos en
la técnica. Los mAb se purifican mediante mecanismos conocidos en
la técnica.
Los títulos de anticuerpo de los fluidos de
ascitis o cultivo de hibridoma se determinan mediante diversos
análisis serológicos o inmunológicos que incluyen, pero no están
limitados a, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de
inmunoabsorción de anticuerpos con enzima ligada (ELISA) y técnicas
de radioinmunoanálisis (RIA). Las moléculas de anticuerpo pueden
ser aisladas del mamífero (p. ej., de la sangre) o de células de
cultivo y adicionalmente purificadas mediante mecanismos bien
conocidos, tales como cromatografía con proteína A para obtener la
fracción de IgG. Alternativamente, los anticuerpos específicos para
una proteína o polipéptido de la invención pueden ser seleccionados
(p. ej., purificados parcialmente) o purificados, p. ej., mediante
cromatografía de afinidad. Por ejemplo, una proteína expresada
recombinantemente y purificada (o parcialmente purificada) de la
invención es producida como se describe en la presente memoria, y
acoplada covalentemente o no covalentemente a un soporte sólido tal
como, por ejemplo, una columna de cromatografía. Después se puede
utilizar la columna para purificar por afinidad los anticuerpos
específicos para las proteínas de la invención a partir de una
muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran número de
epítopos diferentes, generando de ese modo una composición de
anticuerpo esencialmente purificada, esto es, una que está
esencialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por composición
de anticuerpo esencialmente purificada se quiere significar, en
este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene a lo sumo
solamente 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos
contra epítopos distintos de los de la proteína deseada o el
polipéptido de la invención, y preferiblemente a lo sumo 20%, aún
más preferiblemente a lo sumo 10%, y muy preferiblemente a lo sumo
5% (en peso seco) de la muestra son anticuerpos contaminantes. Una
composición de anticuerpo purificada significa que al menos 99% de
los anticuerpos de la composición están dirigidos contra la proteína
deseada o el polipéptido de la invención.
Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes,
tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados,
que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que se
pueden elaborar utilizando mecanismos de ADN recombinante
convencionales, están dentro del alcance de la invención. Un
anticuerpo quimérico es una molécula en la que las diferentes
porciones derivan de diferentes especies animales, tales como las
que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una
región constante de inmunoglobulina humana (Véase, p. ej., Cabilly
et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y Boss
et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.397). Los
anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especie no
humana que tienen una o más regiones determinantes de la
complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región marco
de una molécula de inmunoglobulina humana (Véase, p. ej., Queen,
Patente de los Estados Unidos Núm. 5.585.089,). Tales anticuerpos
monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos
mediante mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por
ejemplo utilizando los métodos descritos en la Publicación PCT Núm.
WO 87/02671; Solicitud de Patente Europea 184.187; Solicitud de
Patente Europea 171.496; Solicitud de Patente Europea 173.494;
Publicación PCR Núm. WO 86/01533; Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.816.567; Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et
al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et
al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol.
139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al.
(1987) Canc. Res. 47:999- 1005; Wood et al. (1985) Nature
314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl.
Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science
229:1202-1207; Oi et al. (1986)
BiolTechniques 4:214; Patente de los Estados Unidos 5,225,539; Jones
et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan
et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al.
(1988) J Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son
particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de
pacientes humanos. Tales anticuerpos pueden ser producidos, por
ejemplo, utilizando ratones transgénicos que son incapaces de
expresar los genes de las cadenas pesada y ligera de la
inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar los genes de las
cadenas pesada y ligera humanas. Los ratones transgénicos son
inmunizados de la manera normal con un antígeno seleccionado, p.
ej., todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden ser
obtenidos utilizando la tecnología de hibridomas convencional. Los
transgenes de la inmunoglobulina humana albergados por los ratones
transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de las
células B, y con posterioridad experimentan cambio de clase y
mutación somática. De este modo, utilizando semejante técnica, es
posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente
útiles. Para una visión de conjunto de esta tecnología para producir
anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev.
Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de
esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos
monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos,
véase, p. ej., Patente de los Estados Unidos 5.625.126; Patente de
los Estados Unidos 5.633.425; Patente de los Estados Unidos
5.569.825; Patente de los Estados Unidos 5.661.016; y Patente de los
Estados Unidos 5.545.806. Además, compañías tales como Abgenix,
Inc. (Fremont, CA), pueden comprometerse a proporcionar anticuerpos
humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando una
tecnología similar a la descrita antes.
Se pueden generar anticuerpos completamente
humanos que reconocen un epítopo seleccionado utilizando un
mecanismo referido como "selección guíada". En este enfoque se
utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, p. ej., un
anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo
completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et
al. (1994) Bioltechnology 12:899-903).
Se puede utilizar un anticuerpo dirigido contra
un polipéptido de la invención (p. ej., un anticuerpo monoclonal)
para aislar el polipéptido mediante mecanismos convencionales, tales
como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Por otra
parte, semejante anticuerpo puede utilizarse para detectar la
proteína (p. ej., en un producto lisado celular o sobrenadante
celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de
expresión del polipéptido. Los anticuerpos también pueden ser
utilizados diagnósticamente para controlar los niveles de proteína
en un tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, p.
ej., para determinar, por ejemplo la eficacia de un régimen de
tratamiento dado. La detección se puede facilitar acoplando el
anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las
sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos
prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes,
materiales bioluminescentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos
de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante,
fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o
acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos con grupos
prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y
avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes
adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina,
diclorotriazinilamin-fluoresceína, cloruro de
dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente
incluye luminol; los ejemplos de los materiales bioluminescentes
incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y los ejemplos del
material radiactivo adecuado incluyen I^{125}, I^{131},
S^{35} o H^{3}. Adicionalmente, se puede conjugar un anticuerpo
(o uno de sus fragmentos) con un radical terapéutico tal como una
citotoxina, un agente terapéutico o un ión metálico radiactivo. Una
citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea
perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen taxol,
citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina,
mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina,
colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina,
dihidroxiantracino-diona, mitoxantrona, mitramicina,
actinomicina D, I-deshidrotestosterona,
glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y
puromicina y sus análogos u homólogos. Los agentes terapéuticos
incluyen, pero no están limitados a, antimetabolitos (p. ej.,
metotrexato, 6-mercaptopurina,
6-tioguanina, citarabina,
5-fluorouracil-descarbazina),
agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina,
tioepa-clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y
lomustina (CCN-LJ), ciclofosfamida, busulfan,
dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y
cis-diclorodiamina platino (11) (DDP) cisplatino),
antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y
doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes
actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y
agentes anti-mitóticos (p. ej., vincristina y
vinblastina).
Los productos conjugados de la invención pueden
ser utilizados para modificar una respuesta biológica dada, el
radical del fármaco no se debe considerar limitado a los agentes
terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el radical del fármaco
puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad
biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una
toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o
toxina de la difteria; una proteína tal como factor de necrosis
tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento
nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del
plasminógeno tisular; o, modificadores de la respuesta biológica
tales como, por ejemplo, linfoquinas,
interleuquina-1 ("IL-1"),
interleuquina-2 ("IL-2"),
interleuquina-6 ("IL-6"),
factor estimulador de las colonias de
monocitos-granulocitos
("GM-CSF"), factor estimulador de las colonias
de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de
crecimiento. Las técnicas para conjugar tal radical terapéutico con
anticuerpos son bien conocidas, véase, p. ej., Amon et al.,
"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer
Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld
et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss,
Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug
Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et
al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.
1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer
Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And
Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs.
475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In
Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection
And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs.
303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et
al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.,
62:119-58 (1982). Alternativamente, se puede
conjugar un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un
producto heteroconjugado de anticuerpos como describe Segal en la
Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980. Resulta fácilmente
evidente para los expertos en la técnica que los métodos descritos
antes para producir anticuerpos policlonales o monoclonales pueden
ser utilizados para producir anticuerpos específicos para los
fragmentos de la subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4, o la subunidad del canal de
calcio \alpha2\delta-4 naciente completa, o la
subunidad del canal de calcio \alpha2\delta-4
individual. También resulta evidente para los expertos en la
técnica que se pueden generar anticuerpos que inhiben la función
normal del canal de calcio que comprenden la subunidad del canal de
calcio \alpha2\delta-4.
Preferiblemente, la invención proporciona
anticuerpos esencialmente purificados o uno de sus fragmentos, que
se unen específicamente a un polipéptido con una secuencia de
aminoácidos esencialmente similar a los aminoácidos 1 a 12 o 1040 a
1090 del SEQ ID NO: 10. En diversas realizaciones, los anticuerpos
esencialmente purificados de la invención, o sus fragmentos, pueden
ser anticuerpos humanos, no-humanos, quiméricos y/o
humanizados. Tales anticuerpos de la invención pueden ser, pero no
están limitados a, anticuerpos de cabra, ratón, oveja, caballo,
pollo, conejo, o rata. Además, tales anticuerpos de la invención
pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales.
Cualquiera de los anticuerpos de la invención
puede ser conjugado con un radical terapéutico o una sustancia
detectable. Los ejemplos no limitantes de las sustancias detectables
que pueden ser conjugadas con los anticuerpos de la invención son
una enzima, un grupo prostético, un material fluorescente, un
material luminescente, un material bioluminescente, y un material
radioactivo.
Un aspecto de la presente invención hace
referencia a un método para identificar una enfermedad o trastorno
relacionado con una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 defectuosa en un sujeto.
Alternativamente, estos métodos se pueden utilizar para identificar
una variación en la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de la
subunidad del canal de calcio \alpha2\delta-4 o
para detectar una actividad alterada de una subunidad del canal de
calcio \alpha2\delta-4, concretamente a partir
de aquellas que forman un canal de calcio con las subunidades del
canal de calcio.
Según se utiliza en la presente memoria, el
término "una enfermedad o trastorno asociado con una subunidad
del canal de calcio \alpha2\delta-4
defectuosa" hace referencia a una enfermedad o trastorno
caracterizados por una expresión o actividad aberrante de una
subunidad del canal de calcio \alpha2\delta-4.
Dicha enfermedad o trastorno incluyen, pero no están limitados a,
un miembro seleccionado del grupo que consiste en: síndromes
relacionados con convulsiones, epilepsia, migraña, ataxia, defectos
vestibulares, dolor crónico, dolor neuropático, estado de ánimo,
interferencias del sueño, ansiedad, ELA, esclerosis múltiple,
manías, temblores, parkinson, síndromes de abuso/adicción de
sustancias, depresión, cáncer, e inflamación.
El término "subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 defectuosa" según se utiliza
en la presente memoria hace referencia a la expresión o actividad
aberrante de una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 causadas por una o más de las
siguientes condiciones: 1) aumento de la expresión de
\alpha2\delta-4; 2) disminución de la expresión
de \alpha2\delta-4; 3) cambios en la actividad
de la subunidad \alpha2\delta-4 que causan un
aumento o disminución de la conductividad iónica en un canal de
calcio que comprende la subunidad
\alpha2\delta-4; o 4) presencia de mutaciones en
el gen \alpha2\delta-4 que afectan
significativamente a la integridad del gen.
Según se utiliza en la presente memoria,
"mutación en un gen \alpha2\delta-4 que afecta
significativamente a la integridad del gen", incluye, pero no
está limitado a: 1) una supresión de uno o más nucleótidos del gen;
2) una adición de uno o más nucleótidos al gen; 3) una sustitución
de uno o más nucleótidos del gen; 4) una transposición cromosómica
del gen; 5) una alteración en el nivel de un transcrito del ARN
mensajero del gen; 6) una modificación aberrante del gen, por
ejemplo del patrón de metilación del ADN genómico; 7) la presencia
de un patrón de empalme de tipo no salvaje del transcrito del ARN
mensajero del gen; 8) un nivel de tipo no salvaje de una proteína
codificada por el gen; 9) una pérdida alélica del gen; y 10) una
modificación post-traduccional inapropiada de la
proteína codificada por el gen.
El término "sujeto" según se utiliza en la
presente memoria, hace referencia a un animal, preferiblemente un
mamífero, muy preferiblemente un ser humano, que ha sido objeto de
tratamiento, observación o experimento.
El término "individuo de control" según se
utiliza en la presente memoria, hace referencia al mismo animal que
el sujeto con el que se compara, que no tiene una enfermedad o
trastorno asociado con una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 defectuosa.
Los anticuerpos de la invención son útiles en un
método para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con
subunidad del canal de calcio \alpha2\delta-4
defectuosa en un sujeto que comprende obtener una muestra biológica
del sujeto y el individuo de control; analizar la cantidad de ARNm o
proteína de \alpha2\delta-4 en las muestras
biológicas; y comparar los resultados de análisis obtenidos del
sujeto y el individuo de control, donde un cambio significativo en
los niveles de ARNm o proteína de
\alpha2\delta-4 en el sujeto con respecto a los
del individuo de control indica que el sujeto está aquejado de una
enfermedad o trastorno asociados con una subunidad del canal de
calcio \alpha2\delta-4 defectuosa.
Se pretende que el término "muestra
biológica" según se utiliza en la presente memoria incluya
tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así
como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. En una
realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del
sujeto. Las moléculas de proteína pueden conservar o no sus
actividades biológicas nativas. En otra realización, la muestra
biológica contiene ácido nucleico incluyendo ADN genómico, y/o
moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o del sujeto. En otra
realización más, la muestra biológica contiene tanto proteínas como
moléculas de ácido nucleico.
Según se utiliza en la presente memoria, "un
cambio significativo" hace referencia a un incremento o un
descenso de la cantidad de ARNm o proteína de
\alpha2\delta-4 o de la densidad de la corriente
de Ca^{2+}, que se mide de manera reproducible, o una mutación en
un gen \alpha2\delta-4 que afecta
significativamente a la integridad del gen
\alpha2\delta-4. Generalmente, un descenso
significativo de la cantidad de ARNm o proteína de
\alpha2\delta-4 o de la densidad de corriente de
Ca^{2+} es de al menos 10% a 20%, preferiblemente al menos 30% a
50%, más preferiblemente al menos 60% a 80%, y muy preferiblemente
al menos 90% a 100%. Típicamente, un incremento significativo de la
cantidad de ARNm o proteína de \alpha2\delta-4 o
de la densidad de corriente de Ca^{2+} es de al menos 20% a 200%,
preferiblemente al menos 400% a 800%, y muy preferiblemente al menos
1.000%.
El nivel de ARNm o proteína de
\alpha2\delta-4 en las muestras biológicas puede
ser medido poniendo en contacto la muestra con un compuesto o un
agente capaz de detectar el ARNm o la proteína de
\alpha2\delta-4, respectivamente.
Un agente preferido para detectar el ARNm de
\alpha2\delta-4 es una sonda de ácido nucleico
marcada capaz de hibridar específicamente con el ARNm. La sonda de
ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc completo, tal como
el ácido nucleico del SEQ ID NO: 9, o una de sus porciones, tal como
un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500
nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente
en condiciones rigurosas con el ARNm de
\alpha2\delta-4.
Un agente preferido para detectar un polipéptido
de \alpha2\delta-4 es un anticuerpo capaz de
unirse específicamente al polipéptido, preferiblemente un
anticuerpo marcado con una marca detectable. Los anticuerpos pueden
ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Se puede
utilizar un anticuerpo intacto, o uno de sus fragmentos (p. ej.,
Fab o F(ab')).
Se pretende que el término "marcado", con
respecto a la sonda de ácido nucleico o anticuerpo, abarque el
marcaje directo de la sonda o anticuerpo mediante el acoplamiento
(esto es, unión física) de una sustancia detectable a la sonda o
anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo
por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente.
Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un
anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado
fluorescentemente y el marcaje final de una sonda de ADN con biotina
de manera que puede ser detectada con estreptavidina marcada
fluorescentemente.
La proteína y el ARNm de las muestras biológicas
pueden ser analizados in vitro así como in vivo. Por
ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm
incluyen hibridaciones Northern, micromatrices de ADN, y
RT-PCR. Las técnicas in vitro para la
detección de un polipéptido incluyen análisis de inmunoabsorción con
enzima ligada (ELISA), transferencias Western, RIA e
inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in
vivo para la detección de ARNm incluyen la fusión
transcripcional descrita más abajo. Además, también se pueden
analizar el ARNm o las proteínas mediante hibridación
in-situ e inmunohistoquímica (para localizar
ARN mensajero y proteína en compartimentos subcelulares específicos
y/o en estructuras neuropatológicas asociadas con la
enfermedad).
Más abajo se describen kits para diagnosticar y
controlar el progreso del tratamiento del dolor neuropático. Tales
kits comprenderían un compuesto marcado o un agente capaz de
detectar proteína o ARNm de \alpha2\delta-4
específicamente (p. ej., un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido de \alpha2\delta-4 o a una sonda
oligonucleotídica que se une al ARNm que codifica el polipéptido de
\alpha2\delta-4) y un medio de detección tal
como un antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares. Los
kits también pueden incluir instrucciones para observar que el
sujeto está padeciendo un dolor neuropático si la cantidad del
polipéptido o ARNm que codifica el polipéptido está por encima o por
debajo del nivel normal. Para los kits basados en anticuerpos, el
kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (p. ej.,
anclado a un soporte sólido) que se une a una proteína
\alpha2\delta-4; y, opcionalmente; (2) un
segundo anticuerpo, diferente que se une al polipéptido o al primer
anticuerpo y está conjugado con un agente detectable; y (3) una
proteína \alpha2\delta-4 purificada como control
positivo.
Para los kits basados en oligonucleótidos, el
kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, p. ej.,
oligonucleótido marcado detectablemente, que hibrida con el SEQ ID
NO: 9 en condiciones de hibridación rigurosas; y (2) un par de
cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico del
SEQ ID NO: 9 o sus porciones. El kit también puede comprender, p.
ej., un agente tamponador, un conservante, o un agente
estabilizador de la proteína. El kit también puede comprender
componentes necesarios para la detección del agente detectable (p.
ej., una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una
muestra de control o una serie de muestras de control que pueden
ser analizadas y comparadas con la muestra de ensayo contenida.
Cada componente del kit está incluido normalmente en un recipiente
individual y todos los diversos recipientes están dentro de un solo
paquete junto con las instrucciones para observar si el sujeto
sometido a ensayo padece o está en riesgo de desarrollar un
trastorno asociado con la expresión aberrante del polipéptido.
Se pueden utilizar una variedad de métodos de
análisis para determinar el efecto del compuesto para incrementar o
disminuir el flujo de iones a través del canal de calcio, que
incluyen pero no están limitados a, técnica del pinzamiento de
voltaje, las técnicas de flujo de radioisótopos, y los análisis de
fluorescencia utilizando colorantes sensibles al voltaje (Véanse,
p. ej., Vestergarrd-Bogind et al., J.
Membrane Biol., 88: 67-75, 1988; Daniel et
al., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193, 1991;
Holevinsky et al., J. Membrane Biology, 137:
59-70, 1994). Tales análisis son conocidos por los
expertos en la técnica. Un análisis ilustrativo para el flujo de
Ca^{2+} se describe en el Ejemplo 14.
Otro uso para los productos de la presente
invención es un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno
asociado con una subunidad \alpha2\delta-4
defectuosa del canal de calcio en un sujeto o identificar
variaciones en una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 o una actividad de la subunidad
del canal de calcio \alpha2\delta-4, que
comprende obtener una muestra biológica de un sujeto; analizar la
cantidad de ácido nucleico o polipéptido de
\alpha2\delta-4 en la muestra o medir el flujo
iónico a través de un canal de calcio o identificar mutaciones en
el ácido nucleico que codifica una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4 y comparar los resultados de la
porción de análisis del método con una muestra biológica de un
sujeto de control. Los cambios en una muestra con respecto a un
control indican defectos que pueden ser asociados con una
enfermedad.
Existe un gran número de mecanismos de análisis
conocidos en la técnica que pueden ser utilizados para detectar
lesiones en un gen. En ciertas realizaciones, la detección de la
lesión implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), tal como una PCR ancla o
RACE-PCR, o, alternativamente, en una reacción en
cadena de la ligasa (LCR) (véase, p. ej., Landegran et al.
(1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et
al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:360-364), de las cuales la última puede ser
particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en un gen
(véase, p. ej., Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res.
23:675-682). En una realización alternativa, se
pueden identificar las mutaciones en un gen seleccionado de una
célula de muestra por las alteraciones en los patrones de escisión
con enzimas de restricción. En otras realizaciones, se pueden
identificar mutaciones genéticas hibridando una muestra y los ácidos
nucleicos de control, p. ej., ADN o ARN, a matrices de alta
densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas
(Cronin et al. (1996) Human Mutation
7:244-255). En otra realización más, se puede
utilizar cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación
conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen
seleccionado y detectar las mutaciones comparando la secuencia de
los ácidos nucleicos de la muestra con la correspondiente secuencia
de tipo salvaje (control). En otras realizaciones, se utilizarán las
alteraciones en la movilidad electroforética para identificar
mutaciones en los genes.
Se puede utilizar la terapia antisentido de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
para disminuir la expresión de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio en las
células de los organismos diana. La terapia antisentido de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio
puede resultar particularmente útil para el tratamiento de
enfermedades en las que es beneficioso disminuir la actividad de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio.
El principio de las estrategias basadas en el
antisentido se apoya en la hipótesis de que se puede lograr la
supresión específica de una secuencia de la expresión génica
mediante hibridación intracelular entre el ARNm y una especie
antisentido complementaria. La formación de un dúplex de ARN híbrido
puede interferir en ese caso en el
procesamiento/transporte/traducción y/o la estabilidad del ARNm de
\alpha2\delta-4 diana. Se requiere la
hibridación para que se produzca el efecto antisentido. Las
estrategias antisentido pueden utilizar una variedad de enfoques
incluyendo el uso de oligonucleótidos antisentido, inyección de ARN
antisentido y transfección de vectores de expresión de ARN
antisentido. Los efectos fenotípicos inducidos por los efectos
antisentido se basan en cambios de criterio tales como niveles de
proteína, medida de la actividad de la proteína, y niveles de ARNm
diana. La resistencia a múltiples fármacos es un control útil para
estudiar eventos moleculares asociados con cambios fenotípicos
debido a efectos antisentido, puesto que el fenotipo de resistencia
a múltiples fármacos puede ser establecido mediante la expresión de
un único gen mdr1 (gen MDR) que codifica la glicoproteína P.
Un ácido nucleico antisentido puede ser
complementario a una cadena codificante completa de un gen
\alpha2\delta-4, o solamente a una de sus
porciones. Una molécula de ácido nucleico antisentido también puede
ser complementaria a toda o parte de una región no codificante de
la cadena codificante de un gen \alpha2\delta-4.
Las regiones no codificantes ("regiones no traducidas 5' y
3'") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región
codificante y no son traducidas a aminoácidos. Preferiblemente, la
región no codificante es una región reguladora para la
transcripción o traducción del gen del canal
\alpha2\delta-4. Se pretende que el término
"región reguladora" o "secuencia reguladora" incluya
promotores, intensificadores y otros elementos de control de la
expresión (p. ej., señales de poliadenilación, y sitios de unión al
ribosoma (para la expresión bacteriana) y, un operador). Tales
secuencias reguladoras están descritas y se determinan fácilmente
utilizando una variedad de métodos conocidos por los expertos en la
técnica (véase, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la
expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos
tipos de células anfitrionas y aquellas que dirigen la expresión de
la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células anfitrionas
(p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejidos).
Un oligonucleótido antisentido puede tener, por
ejemplo, aproximadamente 15, 25, 35, 45 o 65 nucleótidos o más de
longitud tomados de la secuencia complementaria del SEQ ID NO: 9. Se
puede construir un ácido nucleico antisentido utilizando reacciones
de síntesis química y de ligación enzimática empleando
procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede
sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (p. ej., un
oligonucleótido antisentido) usando nucleótidos de origen natural o
diversos nucleótidos modificados diseñados para incrementar la
estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la
estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos
antisentido y efector, p. ej., se pueden utilizar derivados
fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos
de los nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar
el ácido nucleico antisentido incluyen
5-fluorouracilo, 5- bromouracilo,
5-clorouracilo, 5-yodouracilo,
hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroxilmetil) uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metioxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metiloxicarboximetiluracilo,
5-metiloxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacetico (v),
wibutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico de ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacetico (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo,
(acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Una molécula
de ácido nucleico antisentido puede ser una molécula de ácido
nucleico con CC anomérico. Una molécula de ácido nucleico con CC
anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con el ARN
complementario en los que, al contrario que en las unidades P
habituales, las cadenas discurren paralelas entre sí (Gaultier
et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-664
1). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede
comprender un
2'-o-metilribonucleótido (Inoue
et al. (1987) Nucleic Acids Res.
15:6131-6148) o un análogo ARN-ADN
quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett.
215:327-330).
Alternativamente, el ácido nucleico antisentido
también puede ser producido biológicamente utilizando un vector de
expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en
orientación antisentido (esto es, el ARN transcrito desde el ácido
nucleico insertado estará en orientación antisentido con respecto a
un ácido nucleico diana de interés). Esto es, una molécula de ADN
está unida operablemente a una secuencia reguladora de una manera
que permite la expresión (mediante transcripción de la molécula de
ADN) de una molécula de ARN que es antisentido con respecto al ARNm
que codifica una subunidad de calcio
\alpha2\delta-4. Se pueden elegir secuencias
reguladoras unidas operablemente a un ácido nucleico clonado en
orientación antisentido que dirigen la expresión continua de la
molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos celulares, por
ejemplo promotores y/o intensificadores virales, o se pueden elegir
secuencias reguladoras que dirigen la expresión del ARN antisentido
específica de un tejido o específica de un tipo celular. El vector
de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido
recombinante, un fagémido o un virus atenuado en el cual se producen
ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región
reguladora de alta eficacia, cuya actividad puede ser determinada
por el tipo de célula en el cual es introducido. Para un estudio de
la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido
véase Weintraub et al. (Reviews - Trends in Genetics, Vol.
I(I) 1986).
Típicamente, el ácido nucleico antisentido se
administra al sujeto mediante microinyección, encapsulación en
liposomas o se genera in situ mediante la expresión a partir
de vectores que albergan la secuencia antisentido. El ácido
nucleico antisentido se puede ligar en vectores virales que median
la transferencia del ácido nucleico antisentido mediante infección
de células anfitrionas receptoras. Los vectores virales adecuados
incluyen retrovirus, adenovirus, virus
adeno-asociados, virus del herpes, virus vaccinia,
virus de la polio y similares. Alternativamente, los ácidos
nucleicos antisentido se pueden transferir a células para la terapia
génica por medio de mecanismos no virales incluyendo la
transferencia de ácido nucleico dirigida mediada por receptores
utilizando productos conjugados de ligando-ácido nucleico o
productos conjugados de adenovirus-ligando-ácido
nucleico, fusión de membranas por lipofección o microinyección
directa.
Una vez dentro de la célula, las moléculas de
ácido nucleico antisentido hibridan con o se unen a ARNm celular
y/o ADN genómico que codifica una proteína
\alpha2\delta-4 para inhibir de ese modo la
expresión, p. ej., inhibiendo a transcripción y/o la traducción. La
hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos
convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el
caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a
dúplex de ADN, por medio de interacciones específicas en el surco
principal de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de
administración de moléculas de ácido nucleico antisentido incluye la
inyección directa en un sitio del tejido. Alternativamente, se
pueden modificar las moléculas de ácido nucleico antisentido para
dirigirlas a células seleccionadas y después administrarlas
sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, se
pueden modificar las moléculas antisentido de manera que se unan
específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una
superficie celular seleccionada, p. ej., uniendo las moléculas de
ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a
receptores de la superficie celular o antígenos. Las moléculas de
ácido nucleico antisentido también pueden ser distribuidas a las
células usando los vectores descritos en la presente memoria. Para
obtener concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas
antisentido, se prefieren constructos de vectores en los cuales la
molécula de ácido nucleico antisentido se sitúa bajo el control de
un promotor fuerte de pol II o pol III.
La terapia génica con la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio se puede
utilizar para introducir una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio en las
células de los organismos diana. La terapia génica con la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio puede ser
particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que
es beneficioso elevar la actividad de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio.
El procedimiento para realizar la terapia génica
ex vivo se esboza en la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.399.346 y en los documentos presentados en el historial de
archivos de esa patente, todos los cuales son documentos
disponibles al público. En general, implica la introducción in
vitro de una copia funcional de un gen en una o varias células
de un sujeto, y el regreso de las células diseñadas genéticamente al
sujeto. La copia funcional del gen está bajo el control operable de
elementos reguladores que permiten la expresión del gen en las
células diseñadas genéticamente. Los expertos en la técnica conocen
numerosos vectores de transfección y transducción así como vectores
de expresión apropiados, algunos de los cuales se describen en la
solicitud PCT WO95/00654. La terapia génica in vivo utiliza
vectores tales como adenovirus, retrovirus, virus vaccinia, virus
del papiloma bovino, y virus del herpes tales como el virus de
Epstein-Barr. La transferencia génica también se
podría lograr utilizando medios no virales que requieren infección
in vitro. Esto incluiría fosfato de calcio, DEAE dextrano,
electroporación, y fusión de protoplastos. Los liposomas dirigidos
también pueden ser potencialmente beneficiosas para la distribución
de ADN a las células. Por ejemplo, la molécula de ADN que codifica
la proteína \alpha2\delta-4, es clonada primero
en un vector retroviral. La expresión de la proteína
\alpha2\delta-4 a partir del vector es conducida
desde su promotor endógeno o desde la larga repetición terminal
retroviral o desde un promotor específico para ciertas células
diana. El vector se introduce después en un sujeto que necesita
expresar con éxito la proteína \alpha2\delta-4
en las células diana. El gen debe ser distribuido a esas células en
una forma en la cual pueda ser absorbido y codifique suficiente
proteína para proporcionar una función eficaz. Los vectores
retrovirales se pueden utilizar como un vector de distribución de
genes para la Terapia Génica especialmente debido a su elevada
eficacia de infección e integración y expresión estables.
Alternativamente, el ADN de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio puede ser
transferido a células para la terapia génica mediante mecanismos no
virales incluyendo la transferencia de ADN dirigida mediada por
receptores utilizando productos conjugados de
ligando-ADN o productos conjugados de
adenovirus-ligando-ADN, fusión de
membranas por lipofección o microinyección directa. Estos
procedimientos y sus variaciones son adecuados para la terapia
génica con la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio ex vivo así como in vivo. Los
protocolos para la metodología molecular de la terapia génica
adecuada para su uso con el gen de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio se describe
en Gene Therapy Protocols, editado por Paul D. Robbins, Human
press, Totowa NJ, 1996.
La invención proporciona adicionalmente métodos
eficientes de identificación de compuestos que son útiles para
tratar enfermedades o trastornos asociados con una subunidad del
canal de calcio \alpha2\delta-4 defectuosa o
para identificar variaciones en las subunidades del canal de calcio
\alpha2\delta-4 o en la actividad de la
subunidad. Generalmente, los métodos implican la identificación de
compuestos que activan o reprimen la expresión de una subunidad del
canal de calcio \alpha2\delta-4, o aumentan o
disminuyen el flujo de Ca^{2+} a través de un canal de calcio que
comprende una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4.
Los métodos de identificación de compuestos
pueden estar en un formato de laboratorio convencional o adaptados
para un elevado rendimiento. El término "elevado rendimiento"
hace referencia a un diseño de análisis que permite un análisis
fácil de múltiples muestras simultáneamente, y con susceptibilidad
de manipulación robótica. Otra característica deseada de los
análisis de alto rendimiento es un diseño de análisis que se
optimiza para reducir el uso de reactivos, o minimizar el número de
manipulaciones con el fin de obtener el análisis deseado. Los
ejemplos de los formatos de análisis incluyen placas de 96 pocillos
o de 384 pocillos, gotitas levitantes, y chips de microcanales
"laboratorio en un chip" utilizados para experimentos de
manipulación de líquidos. Es bien sabido por los expertos en la
técnica que a medida que avanza la miniaturización de moldes de
plástico y dispositivos de manipulación de líquidos, o a medida que
se diseñan dispositivos de análisis mejorados, se pueden realizar
un mayor número de muestras utilizando el diseño de la presente
invención.
Los compuestos candidato abarcan numerosas
clases químicas, aunque típicamente son compuestos orgánicos.
Preferiblemente, son compuestos orgánicos pequeños, esto es,
aquellos que tienen un peso molecular de más de 50 incluso menos de
aproximadamente 2500. Los compuestos candidato comprenden grupos
químicos funcionales necesarios para interacciones estructurales
con polipéptidos, e incluyen típicamente al menos un grupo amino,
carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de
los grupos químicos funcionales y más preferiblemente al menos tres
de los grupos químicos funcionales. Los compuestos candidato pueden
comprender una estructura carbonada cíclica o heterocíclica y/o
estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de
los grupos funcionales identificados antes. Los compuestos
candidato también pueden ser biomoléculas tales como péptidos,
sacáridos, ácidos grasos, esteroles, isoprenoides, purinas,
pirimidinas, derivados o análogos estructurales de los anteriores,
o sus combinaciones y similares. Cuando el compuesto es un ácido
nucleico, el compuesto es típicamente una molécula de ADN o ARN,
aunque también se contemplan ácidos nucleicos modificados que tienen
enlaces o subunidades no naturales.
Los compuestos candidato se obtienen a partir de
una amplia variedad de fuentes incluyendo genotecas de compuestos
naturales o sintéticos. Por ejemplo, se encuentran disponibles
numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una
amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo
la expresión de oligonucleótidos al azar, genotecas combinatorias
orgánicas sintéticas, genotecas de presentación en fagos de péptidos
al azar, y similares. También se pueden obtener compuestos
candidato utilizando cualquiera de los numerosos enfoques de los
métodos de genotecas combinatorias conocidos en la técnica,
incluyendo: genotecas biológicas; genotecas en fase sólida o en
fase de disolución paralelas dirigibles espacialmente: métodos de
genotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de la
genoteca "una cuenta-un compuesto"; y los
métodos de genotecas sintéticas que utilizan la selección por
cromatografía de afinidad (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Alternativamente, se encuentran disponibles o se producen fácilmente
genotecas de compuestos fúngicos en forma de extractos bacterianos,
fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, las genotecas y los
compuestos producidos sintéticamente pueden ser modificados
fácilmente por medio de métodos químicos, físicos, y bioquímicos
convencionales.
Adicionalmente, se pueden someter agentes
farmacéuticos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o al
azar tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación,
etc. para producir análogos estructurales de los agentes. Los
compuestos candidato se pueden seleccionar al azar o se pueden basar
en compuestos existentes que se unen a y/o modulan la función de
los canales \alpha2\delta-4. Por lo tanto, una
fuente de agentes candidato son las genotecas de moléculas basadas
en los activadores o inhibidores del canal de calcio, en los que la
estructura del compuesto se cambia a una o más posiciones de la
molécula para contener más o menos radicales químicos o radicales
químicos diferentes. Los cambios estructurales realizados en las
moléculas al crear las genotecas de activadores/inhibidores
análogos pueden ser dirigidos, aleatorios, o una combinación de
sustituciones y/o adiciones dirigidas y aleatorias. Un experto en la
técnica de la preparación de genotecas combinatorias puede preparar
fácilmente tales genotecas basándose en los activadores/inhibidores
del canal de calcio existentes.
También se pueden incluir en la mezcla una
variedad de reactivos diferentes. Estos incluyen reactivos tales
como sales, tampones, proteínas neutras (p. ej., albúmina),
detergentes, etc. que se pueden utilizar para facilitar una unión
proteína/proteína y/o proteína-ácido nucleico óptima. Semejante
reactivo también puede reducir las interacciones no específicas o
de fondo de los componentes de la reacción. También se pueden
utilizar otros reactivos que mejoran la eficacia del análisis tales
como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes
antimicrobianos, y similares.
Los ejemplos de los métodos para la síntesis de
genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por
ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:11422; Zuckermann et al. (1994). J Med. Chem. 37:2678. Las
genotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (p. ej.,
Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o sobre
cuentas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor
(1993) Nature 364:555-556), bacterias (Patente de
los Estados Unidos Núm. 5.223.409), esporas (Patente Núm.
5.571.698), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:1865-1869) o fagos (véase p. ej., Scott
y Smith (1990) Science 249:3 86-390).
Según se utiliza en la presente memoria, los
"compuestos que activan o reprimen (esto es, incrementan o
disminuyen) la expresión de la proteína
\alpha2\delta-4" incluyen compuestos que
activan o reprimen la transcripción y/o traducción del gen
\alpha2\delta-4. La invención proporciona un
método para identificar semejante compuesto, que comprende las
etapas de poner en contacto un compuesto con una célula anfitriona
que comprende una secuencia reguladora del gen
\alpha2\delta-4; y determinar el efecto del
compuesto sobre la expresión de la proteína
\alpha2\delta-4. El término "secuencia
reguladora" se define como antes.
En una realización, el análisis basado en
células comprende las etapas de: (1) poner en contacto un compuesto
con una célula anfitriona que tiene la secuencia reguladora para el
gen \alpha2\delta-4; (2) medir el efecto del
compuesto sobre la expresión de la proteína
\alpha2\delta-4, o el informador; y (3) comparar
el efecto del compuesto con el del control de referencia. La célula
anfitriona puede ser una célula anfitriona nativa, o una célula
anfitriona recombinante. El control de referencia contiene solamente
el tampón vehículo en el que se disuelve el compuesto de ensayo. Se
pueden utilizar varios métodos diferentes para medir el efecto del
compuesto sobre la expresión de la proteína
\alpha2\delta-4 en el interior de la célula. Por
ejemplo, se pueden utilizar fusiones de genes o proteínas que
comprenden la secuencia reguladora de
\alpha2\delta-4 y un informador, tal como la
proteína fluorescente verde (GFP) o la
\beta-galactosidasa. La fusión de genes se
construye de manera que solamente la transcripción del gen
informador está bajo el control de la secuencia reguladora de
\alpha2\delta-4. La proteína de fusión se
construye de manera que tanto la transcripción como la traducción
de la proteína del gen informador están bajo el control de la
secuencia reguladora de \alpha2\delta-4.
Preferiblemente, se puede utilizar una segunda fusión de genes o
proteínas que comprende el mismo informador pero una secuencia
reguladora diferente (esto es, una secuencia reguladora para un gen
no relacionado con la familia de
\alpha2\delta-4) para incrementar la
especificidad del análisis. Alternativamente, también se puede
utilizar un atributo del fenotipo celular para el canal
\alpha2\delta-4, tal como un perfil potencial
de membrana característico, para medir el efecto del compuesto sobre
la expresión de la proteína \alpha2\delta-4.
Además, el efecto del compuesto se puede analizar midiendo la
cantidad de ARNm o proteína \alpha2\delta-4 en
el interior de la célula directamente utilizando los métodos
descritos más arriba (esto es, Transferencia Northern,
RT-PCR, SDS-PAGE, Transferencia
Western, etc).
En otra realización preferida, el método implica
una secuencia reguladora del gen \alpha2\delta-4
en un sistema de análisis sin células. El análisis sin células
comprende las etapas de: (1) poner en contacto un compuesto con la
secuencia reguladora del gen \alpha2\delta-4 en
un sistema de análisis sin células; (2) medir el efecto del
compuesto sobre la expresión de la proteína
\alpha2\delta-4; y (3) comparar el efecto del
compuesto con el de un control de referencia. El control de
referencia contiene solamente el tampón en el cual se disuelve el
compuesto de ensayo. Los ejemplos del sistema de análisis sin
células incluyen los sistemas de traducción y/o transcripción in
vitro, que son conocidos por los expertos en la técnica. Por
ejemplo, se puede clonar en un plásmido el ADNc de
\alpha2\delta-4 completo, incluyendo la
secuencia reguladora. Después, utilizando este constructo como
molde, se puede producir una proteína
\alpha2\delta-4 en un sistema de transcripción
y traducción in vitro. Alternativamente, el ARNm de
\alpha2\delta-4 sintético o el ARNm aislado de
células productoras de la proteína
\alpha2\delta-4 puede ser traducido eficazmente
en diversos sistemas sin células, incluyendo pero no limitado a
extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos. El
efecto del compuesto sobre la expresión de la proteína
\alpha2\delta-4 puede ser controlado mediante
la medida directa de la cantidad de ARNm o proteína de
\alpha2\delta-4 utilizando los métodos descritos
antes.
En otro aspecto la invención hace referencia a
la identificación de compuestos que inhiben o potencian el flujo de
Ca^{2+} a través de un canal de calcio que comprende la subunidad
del canal de calcio \alpha2\delta-4.
La invención proporciona adicionalmente un
método de identificación de un compuesto que aumenta o disminuye el
flujo de Ca^{2+} a través de un canal de calcio que comprende una
subunidad del canal de calcio \alpha2\delta-4.
El método comprende las etapas de poner en contacto un compuesto de
ensayo con una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4, o una variante modificada
conservativamente de la misma, donde dicha variante modificada
conservativamente se une específicamente a anticuerpos reactivos con
la subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4; y determinar el efecto del
compuesto para aumentar o disminuir el flujo de iones a través del
canal de calcio que comprende una subunidad del canal de calcio
\alpha2\delta-4.
Los métodos de análisis que se pueden utilizar
para determinar el efecto del compuesto para aumentar o disminuir
el flujo de iones a través de un canal de calcio se han descrito
antes.
\global\parskip0.850000\baselineskip
En una realización, la presente invención hace
referencia a un método para identificar un compuesto útil para
aumentar o disminuir la expresión de una subunidad de la proteína
del canal de calcio \alpha2\delta-4 que
comprende las etapas de poner en contacto un compuesto de ensayo con
una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos una
secuencia reguladora y un gen informador unido operablemente a ésta;
y determinar su el compuesto de ensayo aumenta o disminuye la
expresión del gen informador. En una realización la etapa de
identificación del compuesto se realiza en forma de un análisis sin
células y en otra realización el método se realiza in situ.
En una realización el gen informador es la subunidad del canal de
calcio \alpha2\delta-4 y en otra realización el
gen informador es un gen no relacionado. Preferiblemente la
secuencia reguladora puede incluir, pero no está limitada a una o
más secuencia promotoras, una o más secuencias intensificadoras, o
una de sus combinaciones así como una variedad de secuencias
reguladoras cis y trans que son conocidas en la técnica.
Cuando el método se realiza in situ (esto
es, en un análisis basado en células utilizando células intactas),
la cantidad de tiempo necesaria para el contacto celular con el
compuesto se determina empíricamente, por ejemplo, haciendo
transcurrir el tiempo con un modulador de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio conocido y
midiendo los cambios celulares como una función del tiempo.
El término "funcional" según se utiliza en
la presente memoria hace referencia a la expresión de una actividad
característica de la proteína \alpha2\delta-4.
Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un canal de calcio
\alpha2\delta-4 funcional se puede unir a
gabapentina (GBP) o puede actuar como un canal de calcio regulado
por el voltaje cuando se expresa con sus proteínas complejas del
canal de calcio, las subunidades alfa1, beta, y gamma.
La medios para la medición del método de la
presente invención se pueden definir adicionalmente comparando una
célula que ha sido expuesta a un compuesto con una célula idéntica
que no ha sido expuesta similarmente al compuesto. Alternativamente
dos células, una que contiene una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio y una
segunda célula idéntica a la primera, pero que carece de subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio se pueden
poner en contacto con el mismo compuesto y comparar las diferencias
entre las dos células. Este mecanismo también es útil para
establecer el ruido de fondo de estos análisis. Un experto normal en
la técnica apreciará que estos mecanismos de control también
permiten una fácil selección de los cambios celulares que son
sensibles a la modulación de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio
funcional.
El término "célula" hace referencia al
menos a una célula, pero incluye una pluralidad de células
apropiadas para la sensibilidad del método de detección. Las
células adecuadas para la presente invención pueden ser
bacterianas, de levadura, o eucarióticas.
Los cambios celulares contemplados en el método
de la presente invención comprenden la medición directa de los
cambios en la función o la cantidad de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio o mediante
la medición de los efectos aguas abajo de la función de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio, por
ejemplo mediante la medición de las concentraciones de mensajero
secundario o los cambios en la transcripción o mediante la
detección de los cambios en los niveles de proteína de los genes que
están afectados transcripcionalmente por la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio.
Alternativamente se pueden medir los cambios fenotípicos en la
célula. Los medios de medición preferidos incluyen cambios en la
cantidad de proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio, los cambios
en la actividad funcional de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio, los
cambios en la cantidad de ARNm, los cambios en la proteína
intracelular, los cambios en la proteína de la superficie celular,
o la proteína secretada, o los cambios en la concentración de
Ca^{2+}, AMPc o GTP. Los cambios en la cantidad o la actividad
funcional de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio se describen en la presente memoria. Los cambios en
los niveles de ARNm se detectan mediante transcripción inversa -
reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) o
mediante expresión diferencial de genes. La inmunoafinidad, la
afinidad con el ligando, o la medida enzimática cuantifican los
cambios en los niveles de proteína en las células anfitrionas. Se
pueden utilizar cuentas de afinidad específica por la proteína o
anticuerpos específicos para aislar la proteína marcada o no
marcada. La proteína marcada puede ser visualizada tras la
separación mediante SDS-PAGE. La proteína no
marcada puede ser detectada mediante transferencia Western,
detección en la superficie de la célula mediante clasificación de
células fluorescentes, análisis de la imagen celular, ELISA o RIA
empleando anticuerpos específicos. Cuando la proteína es una enzima,
la inducción de proteína se controla mediante escisión de un
sustrato fluorogénico o colorimétrico.
En otra realización, se pueden utilizar
membranas celulares aisladas de células que expresan la subunidad
\alpha2\delta-4 recombinantemente de forma
nativa en análisis de unión para determinar si un compuesto inhibe
la unión de un ligando, tal como gabapentina, a la subunidad
\alpha2\delta-4. Comprendiendo el método las
etapas de: (a) incubar una membrana celular de una célula que
expresa la subunidad \alpha2\delta-4 con un
ligando marcado para la subunidad
\alpha2\delta-4, tal como una gabapentina
radiactiva (GBP), y un compuesto candidato, donde la membrana
comprende una subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio y donde el contacto se produce durante un tiempo
suficiente para permitir que el ligando marcado se una a la
subunidad \alpha2\delta-4 de los canales de
calcio en las membranas celulares; (b) separar las membranas
celulares del ligando marcado no unido; y (c) identificar un
compuesto que inhibe la unión del ligando a la subunidad mediante
una reducción de la cantidad de unión del ligando marcado a la
membrana celular.
En otra realización, se puede utilizar una
proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio esencialmente purificada en el análisis de unión,
que comprende: 1) poner en contacto un compuesto con un ligando
marcado de manera medible para la proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio, tal como
una gabapentina radiactiva (GBP) y una proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio; y 2) medir
la unión del compuesto a la proteína mediante una reducción en la
cantidad de ligando marcado que se une a la proteína de la
subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención sin limitar, no obstante, la misma a estos.
Ejemplo
1
La frase "Canal de Calcio" se utilizó como
palabra clave para la búsqueda en bases de datos de ADN no
redundantes de Genbank. Se identificaron veintinueve aciertos
relacionados con subunidades \alpha_{2}\delta. El análisis
adicional de la secuencia condujo a la identificación de dos clones
EST solapantes que podrían codificar una subunidad
\alpha_{2}\delta del canal de calcio humano novedosa. Los
números de acceso son AA001473 (572 pb de longitud) y H86016 (306
pb de longitud). Los dos clones son idénticos casi en un 100% en la
región solapante de 292 pb, sugiriendo que podrían codificar el
mismo polipéptido. La búsqueda BLAXTX frente a la base de datos de
proteínas no redundante de Genbank reveló que el clon más largo
AA001473 era idéntico en un 40% a la subunidad
\alpha_{2}\delta-3 del canal de calcio de
ratón a lo largo de los restos 839 a 977 (Núm. de Acceso AJ10949),
idénticos en un 36% a la subunidad
\alpha_{2}\delta-2a del canal de calcio
humano a lo largo de los restos 870 a 949 (Núm. de Acceso AF042793)
e idénticos en un 34% a la subunidad
\alpha_{2}\delta-1 del canal de calcio humano
desde los restos 836 a 927 (Núm. de Acceso U73483),
respectivamente.
Ejemplo
2
Con el fin de clonar la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
completa, se utilizaron tres rondas de RACE-PCR.
Para la primera ronda de RACE-PCR, se sintetizaron
dos cebadores basándose en la secuencia N-terminal
del clon EST AA001473. Estos fueron
A2-4-9 (SEQ ID NO: 1
5'-CAG GGG CTG GGC TGC ACT GTG GTG
GTG-3') y A2-4-10
(SEQ ID NO: 2 5'-CTC TCG GGA CCT CTT GGA GAT CAG
AAT-3'). Se realizó una Race-PCR
primaria en un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción
contenía 5 \mul de ADNc de cerebro humano
Marathon-Ready® adquirido de Clontech (Palo Alto,
CA), 5 \mul de 10 x tampón de reacción, 200 \muM de dNTP,
cebador AP1 200 nM (Clontech, SEQ ID NO: 3 5'-CCA
TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3'), cebador
específico de la subunidad \alpha_{2}\delta-4
del canal de calcio humano 200 nM
A2-4-9 y 1 \mul de 50 x Mezcla de
ADN polimerasa Advantage2 (Clontech). Los parámetros del ciclador
término para la RACE-PCR fueron: desnaturalización
inicial a 94ºC durante 30 seg,
5 ciclos de 94ºC/5 seg y 72ºC/4 min, 5 ciclos de 94ºC/5 seg y 70ºC/4 min, y 20 ciclos de 94ºC/5 seg y 68ºC/4 min.
5 ciclos de 94ºC/5 seg y 72ºC/4 min, 5 ciclos de 94ºC/5 seg y 70ºC/4 min, y 20 ciclos de 94ºC/5 seg y 68ºC/4 min.
Después de la reacción de
RACE-PCR, se realizó una PCR anidada directamente
para intensificar adicionalmente la amplificación de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano.
La mezcla de reacción (en 50 \mul de volumen final) contenía: 5
\mul del producto de la RACE PCR anterior, 5 \mul de 10 x
tampón de reacción, dNTP 200 \muM, cebador AP2 200 nM (Clontech,
SEQ ID NO: 4 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG
GC-3'), cebador específico de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
200 nM A2-4-10 y 1 \mul de 50 x
mezcla de ADN polimerasa Advantage2 (Clontech). Los parámetros del
ciclador térmico para la reacción de PCR anidada fueron:
desnaturalización inicial a 94ºC durante 30 seg, 5 ciclos de 94ºC/5
seg y 72ºC/4 min, 5 ciclos de 94ºC/5 seg y 70ºC/4 min, y 20 ciclos
de 94ºC/5 seg y 68ºC/4 min.
El producto de la PCR anidada se subclonó
después con un kit de clonación TA (Invitrogen, CA). En
resumen, el producto de la PCR anidada se fraccionó primero por
tamaños sobre un gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN que
oscilaban entre 1 y 3 kb fueron separados por corte del gel y
purificados con Qiaquick Spin Purification Kit (Qiagen, CA).
Después se ligaron 6 \mul de producto de PCR anidada purificado
con 2 \mul de vector linealizado pCR2.1 (Invitrogen) en presencia
de 1 \mul de 10 x tampón de reacción, y 1 \mul de ligasa
(4U/\mul) a 14ºC durante 4 horas. Finalmente, se utilizaron 2
\mul de mezcla de ligadura y se utilizó el producto para
transformar células bacterianas competentes TOP10F'
(Invitrogen).
El análisis de secuenciación del clon NQC45, un
producto de la primera ronda de RACE-PCR del extremo
5', reveló que el ADNc de \alpha_{2}\delta-4
había sido prolongado satisfactoriamente aproximadamente 1,7 kb de
ADNc hacia el extremo 5' del ADNc. No obstante, todavía faltaba la
información de la secuencia N-terminal para los
primeros 320 aminoácidos.
Con el fin de clonar el fragmento de ADNc que
codifica los 320 aminoácidos N-terminales de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 humana, se
realizó una segunda ronda de RACE-PCR. Basándose en
la secuencia N-terminal de NQC45, se sintetizaron
el cebador específico de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
A2-4-16 (SEQ ID NO: 5
5'-CAG GCT CTG AGC CTG CGA GCT
GAG-3') y A2-4-17
(SEQ ID NO: 6 5'-ATG TCG TGG TCG TGG TTG ATG ACC
AT-3'). La segunda RACE-PCR se
realizó con los cebadores A2-4-16 y
AP1 y seguida de PCR anidada utilizando los cebadores
A2-4-17 y AP2 en las condiciones
utilizadas en la primera ronda de RACE y PCR anidada. El producto de
la PCR anidada se fraccionó después por tamaños sobre un gen de
agarosa al 1% y se separó por corte un fragmento de ADN de
aproximadamente 1 kb, se purificó y se subclonó en un vector de clonación pCR2.1, como se ha descrito previamente.
aproximadamente 1 kb, se purificó y se subclonó en un vector de clonación pCR2.1, como se ha descrito previamente.
El análisis de la secuencia de los clones reveló
que la segunda ronda de RACE-PCR prolongaba el
fragmento de ADNc hasta 190 pb de la región no traduccional 5'. Se
encuentra presente un codón de parada en marco (TGA) 30 pb de aguas
arriba de la primera metionina. La secuencia adyacente aguas arriba
(CAGGCCATGG, especialmente en la posición -3 G y en la posición +4
G) del primer ATG es similar a la secuencia Kozak
(5'-GCCA/GCCAUGG-3'),
sugiriendo un sitio para el inicio de la traducción (Kozak, (1991)
J. Cell. Biol. 115:887-903). Por lo tanto, el marco
de lectura abierto traduccional puede comenzar en el codón ATG
localizado en la posición 190. Partiendo de este codón ATG, el
marco de lectura abierto contiene 3273 pb que codifican un
polipéptido de 1090 aminoácidos (SEQ ID NO: 10) y que tiene una
masa molecular calculada de 123,2 kDa. La secuencia primaria
deducida se muestra en el SEQ ID NO: 9. El análisis de la proteína
reveló que la subunidad \alpha_{2}\delta-4 del
canal de calcio humano contenía múltiples sitios de
N-glicosilación que están localizados en los restos
94, 137, 455, 600, 682 y 1013, respectivamente. La subunidad
\alpha_{2}\delta-4 humana también contiene dos
supuestos sitios PKA (proteína quinasa A) (en los restos 60 y 633),
y 14 sitios PKC (proteína quinasa C).
La subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
completo se ensambló y se subclonó en vectores pAGA3 como describen
Qin et al. (1997), supra, de acuerdo con los métodos
de la biología molecular convencional. En resumen, se clonó el
fragmento N-terminal de 1,26 kb desde el pb 190
(sitio Ncol con codón de iniciación) al pb 1452 (KpnI que derivaba
del vector pCR2.1) en el vector pAGA3. El constructo resultante se
designó pAGA3/h\alpha_{2}\delta4-NT. Los tres
fragmentos C-terminales se suclonaron en pBS (KS)
(Stratagene) por medio de dos etapas. Primero, se subclonaron los
dos fragmentos de 0,9 kb desde el pb 1639 (HindIII) al pb 2575
(EcoRI) y 2575 (EcoRI) hasta el extremo (BglII, derivado del
vector) junto con pBS digerido con HindIII y BamHI. Después, se
subclonó un fragmento de 0,3 kb desde el pb 1350 (SalI, derivado
del vector) al pb 1639 (HindIII) en el constructo obtenido de la
primera etapa siguiente a la digestión con XhoI y HindIII y la
ligación produciendo el constructo
pBS/h\alpha_{2}\delta4-CT. Finalmente, se
subclonó el fragmento de ADN de 2,1 kb separado por corte de
pBS/h\alpha_{2}\delta4-CT mediante digestión
con BglII y XbaI en
pAGA3/h\alpha_{2}\delta4-NT digerido con las
mismas enzimas de restricción para generar la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
completo, pAGA3/h\alpha_{2}\delta-4. El
constructo final se confirmó mediante secuenciación de ADN.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:
9) junto con la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 10) que
codifica la subunidad \alpha_{2}\delta-4 del
canal de calcio humano se proporciona más abajo:
La comparación de la secuencia de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
con otras subunidades \alpha_{2}\delta del canal de calcio
humano demostró que la secuencia de aminoácidos de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
(SEQ ID NO: 10) es idéntica en 30%, 32%, 61%, y 96% a las
subunidades \alpha_{2}\delta-1,
\alpha_{2}\delta-2,
\alpha_{2}\delta-3, y
\alpha_{2}\delta-D del canal de calcio humano,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se utilizó la secuencia de ADNc completa de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano para la búsqueda en la base de datos del genoma
humano Genbank. La búsqueda indicó que el gen que codifica la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 humana está
localizado en el cromosoma 12p13.3, aproximadamente a 400 kb del
locus de la subunidad \alpha_{1}1.2 (\alpha_{1}c) del canal
de calcio de tipo L humano (Ertel, et al., (2000) Neuron
25:533-535). El gen abarca aproximadamente 130 kb
del genoma humano.
Como se muestra en la Figura 1, el ADNc de
\alpha2\delta-4 del canal de calcio humano está
compuesto por 38 exones. Aunque la secuencia de nucleótidos del
exón2 al exón36 (nt 225 a 3308 del SEQ ID NO: 9) es idéntica a la
correspondiente porción del ADNc de
\alpha_{2}\delta-D del canal de calcio humano,
el exón 1 del extremo 5' (nt 1 a 224 of SEQ ID NO: 9) y el exón 37
del extremo 3' (nt 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9) son claramente
únicos para el ADNc de \alpha2\delta-4. Para
diferenciarlo del ADNc de \alpha_{2}\delta-4,
los extremos 5' y 3' de \alpha_{2}\delta-D se
denominan en la presente memoria exón 1B y exón 37B,
respectivamente. No se observa homología de la secuencia entre el
exón 1 y 1B, o el exón 37 y 37B, indicando que tanto
\alpha2\delta-4 como
\alpha2\delta-D derivan del mismo gen
\alpha2\delta-4 y son generados mediante empalme
diferencial.
Tanto el exón 1 como el 1B tienen un codón de
inicio en marco y tanto el exón 37 como el 37B tienen un codón de
parada en marco, sugiriendo que existen cuatro posibles tipos de
variantes de empalme alternativas: (1) exón 1,
2-36, y 37; (2) exón 1B, 2-36, y 37;
(3) exón 1, 2-36, y 37B; y (4) exón 1B,
2-36, y 37B. La subunidad
\alpha_{2}\delta-D está codificada por la
cuarta variante de empalme. Se pretende que la "subunidad
\alpha2\delta-4" según se utiliza en la
presente memoria esté codificada solamente por las otras tres
variantes de empalme que comprende el exón 1, y/o el exón 37.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se diseñaron dos oligopéptidos a partir del
medio y los extremos carboxilo de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
con el fin de originar anticuerpos policlonales en conejos. Las
secuencias de aminoácidos para los dos oligopéptidos fueron:
- 1.
- (1) Ac-KVSDRKFLTPEDEASVC-amida (SEQ ID NO: 7), que incluye los aminoácidos 713 a 729 del SEQ ID NO: 10, y
- 2.
- (2)(2) Ac-RVEADRGWAGFSSPNPLC-amida (SEQ ID NO: 8), que incluye los aminoácidos 1041 a 1057 del SEQ ID NO: 10.
Se sintetizaron los oligopéptidos y se
originaron los anticuerpos para estos oligopéptidos y se purificaron
por medio de BioSource International, Inc. Los anticuerpos
resultantes se sometieron a ensayo por medio de ELISA contra los
oligopéptidos antigénicos y se purificaron por afinidad con los
mismos péptidos. Se utilizaron el suero y los anticuerpos
purificados por afinidad para un inmunoanálisis, incluyendo
transferencia Western, inmunoprecipitación, inmunocitoquímica e
inmunohistoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El ADNc completo de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
se subclonó primero en un vector pAGA3, que se diseñó para una
elevada eficacia de la transcripción y la traducción in vitro
como describen Qin et al. (1997), supra. El
procedimiento de subclonación utilizado se describió en el Ejemplo
2 y produjo la subunidad \alpha_{2}\delta-4
del canal de calcio humano completa. La traducción in vitro
de la subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal
de calcio humano se realizó con el Sistema de
Transcripción/Traducción Acoplado a TnT® T7 Quick (Promega)
siguiendo el protocolo recomendado proveedor. En resumen, se añadió
1 \mug de constructo
h\alpha_{2}\delta-4/pAGA3 a 40 \mul de TNT
Quick Master Mix con 2 \mul de metionina[S^{35}]
(1000Ci/mmol a 10 mCi/ml) en un volumen final de 50 \mul. La
mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 90 min. Se mezclaron
dos \mul de la mezcla de reacción con un volumen igual de tampón
de carga SDS/PAGE y se sometieron a análisis en gel de SDS/PAGE al
8-16%. Tras la electroforesis, el gel se tiñó con
Azul de Commassie R250, se secó y se expuso a película de rayos X.
La subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano traducida in vitro migró al peso molecular de
123 kDa como se preveía por la traducción de las secuencias de
aminoácidos a partir de las correspondientes secuencias de ácido
nucleico.
Asimismo se analizó mediante transferencia
Western la subunidad \alpha_{2}\delta-4 del
canal de calcio humano traducida in vitro. En resumen, se
sometió 1 ml de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
traducida in vitro a ASDS-PAGE al
8-16%. La proteína del gel se transfirió después a
nitrocelulosa. La transferencia se bloqueó con leche en polvo al 5%
en TTBS (Tween 20 al 0,5%, Tris-HCl 100 mM, pH 7,5,
NaCl 0,9%) a la temperatura ambiente durante 1 hora y después se
incubó con anticuerpos policlonales
anti-\alpha_{2}\delta-4
humana purificada por afinidad (dilución 1:1000 con solución de
bloqueo de nueva aportación) a 4ºC durante la noche. Al día
siguiente la transferencia se lavó tres veces con 100 ml de TTBS, y
se incubó con anticuerpo anti-IgG de conejo de
cabra conjugado con Peroxidasa de Rábano Picante (Pierce) a la
temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces
con 100 ml de TTBS, la transferencia se visualizó con reactivos
luminiscentes, ECL-Plus
(Amersham-Pharmacia
Biotech).
Biotech).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se utilizó la transferencia Northern para
evaluar la distribución en los tejidos de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio
humano. El fragmento de ADNc que codificaba los restos
1-270 de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
se utilizó como sonda. Para elaborar la sonda, se aisló un fragmento
de ADN de 710 pb y se purificó a partir de
pAGA3/h\alpha_{2}\delta4-NT mediante digestión
con Ncol y EcoRI. Para marcar la sonda, se desnaturalizaron 25 ng
de un fragmento de ADN que codificaba los restos
1-270 de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
en un volumen final de 45 \mul a 99ºC durante 4 min. La sonda de
ADN desnaturalizada se incubó con 5 \mul de
dCTP[\alphaP^{32}] a 6000 Ci/mmol (Amersham Pharmacia
Biotech) y después se transfirió al tubo que contenía
READY-TO-GO ADN Labeling Bead
(-dCTP) (Amersham Pharmacia Biotech) y se incubó a 37ºC
durante 30 min. La sonda marcada se separó después de
dCTP[\alphaP^{32}] libre con una columna MICROSPIN
G-50 (Amersham Pharmacia Biotech). La sonda
marcada se desnaturalizó incubando a 99ºC durante 4 min e
inmediatamente se colocó sobre hielo antes de ser añadida a la
solución de hibridación.
Se adquirió una transferencia de MTN Humano
(Northern de Múltiples Tejidos) (Núm. Cat.
7760-1) de Clontech (Palo Alto, CA) y se incluyeron
muestras de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo
esquelético, riñón, y páncreas. Las transferencias se prehibridaron
con 5 ml de Solución ExpressHyb (Clontech) a 65ºC durante 4 horas,
y después se hibridó en presencia de 2 x 10^{6} cpm/\mul de
sonda de la subunidad \alpha2\delta-4 humana a
65ºC durante la noche. La sonda era un fragmento de ADNc de 270 pb
marcado con [P^{32}] que codificaba los 90 restos amino
terminales de la subunidad \alpha_{2}\delta-4
del canal de calcio humano. Las transferencias se lavaron dos veces
con 200 ml de solución de 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 65ºC durante dos
horas. Finalmente las transferencias se expusieron a película de
rayos X en un congelador a -80ºC durante 1-3
días.
Se utilizó un fragmento de ADNc de 2,0 kb que
codificaba la \beta-actina humana como sonda de
control (Figura 7B). Las mismas transferencias fueron retiradas con
SDS al 0,5% a 90ºC durante 10 min tras la hibridación con la sonda
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano.
Las transferencias se prehibridaron después con 5 ml ExpressHyb a
68ºC durante 1 hora y después se hibridaron en presencia de una
sonda de \beta-actina humana durante 2 horas a
68ºC. Las transferencias se lavaron dos veces con 200 ml de solución
de 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 68ºC durante dos horas. Finalmente las
transferencias se expusieron a una película de rayos X en un
congelador a -80ºC durante 6 horas. En estos estudios, el VGCC que
contenía \alpha_{2}\delta-4 aparecía muy
fuertemente en corazón y músculo esquelético.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El gen de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
se insertó en pcADN3.1 (Invitrogen) mediante una ligación de
tres porciones. Se obtuvo el ADNc de 850 pb que codificaba la
porción amino terminal de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
a partir de
pAGA3/h\alpha_{2}\delta-4-NT
mediante digestión con NcoI, seguido de digestión de los extremos
romos con BamHI. El fragmento de 2,6 kb que codificaba la porción
carboxilo terminal de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
se aisló y se purificó a partir de
pAGA3/h\alpha_{2}\delta-4 mediante digestión
con BamHI y XbaI. Los dos fragmentos de ADNc se ligaron con el
vector pcADN3, previamente digerido con EcoRV y XbaI. Los plásmidos
recombinantes que contenían la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
se aislaron y se confirmaron mediante digestión con enzimas de
restricción y secuenciación del ADN.
Se utilizó el clon
pcADN3.1/h\alpha_{2}\delta-4 para la
transfección transitoria y estable de las células HEK293 por medio
de SuperFect (Qiagen) siguiendo el protocolo del proveedor. Los
clones estables se seleccionaron en cuanto al crecimiento en
presencia de G418. Los clones resistentes a G418 individuales se
aislaron y se demostró que contenían el ADNc de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
intacto. Los clones que contenían los ADNc de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
se analizaron en cuanto a la expresión utilizando técnicas
inmunológicas, tales como transferencia Western,
inmunoprecipitación, e inmunofluorescencia utilizando anticuerpos
específicos para la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio
humano. Se determinó la afinidad de unión de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
a Gabapentina mediante análisis de unión a un ligando
radiactivo.
Las células que estaban expresando la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano,
establemente o transitoriamente, se utilizaron para someter a
ensayo la expresión de la proteína del canal y la actividad de
unión al ligando. Estas células se utilizaron para identificar y
examinar otros compuestos en cuanto a su capacidad para modular,
inhibir o activar el canal y competir por la unión al ligando
radiactivo.
Los casetes que contenían el ADNc de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano en orientación positiva, con respecto al promotor,
fueron ligados en los sitios de restricción apropiados 3' del
promotor e identificados mediante mapeo y/o secuenciación de los
sitios de restricción. Estos vectores de expresión de ADNc se
introdujeron en células anfitrionas fibroblásticas tales como
COS-7 (ATCC núm. CRL1651), y CV-1
tat (Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987), o 293, L
(ATCC núm. CRL6362) mediante métodos convencionales, incluyendo,
pero no limitados a, electroporación, o procedimientos químicos
(tales como liposomas catiónicos, DEAE dextrano, o fosfato de
calcio). Las células transfectadas y los sobrenadantes de cultivo de
las células se cosecharon y se analizaron en busca de la expresión
de la subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal
de calcio humano como se describe en la presente
memoria.
memoria.
Los vectores utilizados para la expresión
transitoria en mamíferos deben ser utilizados para establecer líneas
celulares estables que expresan la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano.
La subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano se expresa extracelularmente en forma de una proteína
secretada ligando constructos de ADNc de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
a ADN que codifica la secuencia señal de una proteína secretada,
como es sabido en la técnica. Las células anfitrionas para la
transfección incluyen, pero no están limitadas a,
CV-1-P (Sackevitz et al.,
Science 238: 1575 (1987), tk-L (Wigler, et
al. Cell 11: 223 (1977), NS/0, y dHFr- CHO (Kaufman y Sharp, J.
Mol. Biol. 159: 601, (1982). La co-transfección de
cualquier vector que contiene ADNc de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
con un plásmido de selección de fármacos incluyendo, pero no
limitado a, G418, aminoglicosido-fosfotransferasa;
higromicina, higromicina-B fosfotransferasa; APRT, o
xantina-guanina
fosforribosil-transferasa permitirá la selección de
clones transfectados establemente. Los niveles de subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio humano se
cuantifican mediante los análisis descritos en la presente
memoria.
Los constructos de ADNc de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
también se ligan en vectores que contienen marcadores de
resistencia a fármacos amplificables para la producción de clones
de células de mamífero que sintetizan los niveles más altos posibles
de subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano. Tras la introducción de estos constructos en las
células, se seleccionan con el agente apropiado los clones que
contienen el plásmido. El aislamiento de un clon que expresa en
exceso un elevado número de plásmidos, se completa mediante
selección en dosis crecientes del agente.
La expresión de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
recombinante se logra mediante transfección del ADNc de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano completo en una célula anfitriona de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se diseñan vectores de baculovirus, que derivan
del genoma del virus AcNPV, para proporcionar un elevado nivel de
expresión de ADNc en la línea Sf9 de células de insecto (ATCC CRL
núm. 1711). El baculovirus recombinante que expresa el ADNc de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 Humana es
producido mediante los siguientes métodos convencionales
(InVitrogen Maxbac Manual): se ligan los constructos de ADNc de la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio Humano en el gen de la polihedrina en una variedad de
vectores de transferencia de baculovirus, incluyendo el vector
pAC360 y el BlueBac (InVitrogen). Los baculovirus recombinantes se
generan mediante recombinación homóloga siguiente a la
co-transfección del vector de transferencia de
baculovirus y ADN genómico de AcNPV linealizado [Kitts, P.A., Nucl.
Acid. Res. 18: 5667 (1990)] en células Sf9. Los virus pAC360
recombinantes se identifican por la ausencia de cuerpos de
inclusión en las células infectadas y los virus pBlueBac
recombinantes se identifican basándose en la expresión de la
\beta-galactosidasa. Tras la purificación en
placa, se mide la expresión de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
mediante los análisis descritos en la presente memoria.
El ADNc que codifica el marco de lectura abierto
completo para la subunidad \alpha_{2}\delta-4
del canal de calcio humano se inserta en pBlueBacII. Los
constructos en orientación positiva se identifican mediante
análisis de la secuencia y se utilizan para transfectar células Sf9
en presencia de ADN de tipo salvaje de AcNPV lineal.
La subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
activa auténtica se encuentra en la membrana del citoplasma de las
células infectadas. La subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
activa se extrae de las células infectadas por métodos conocidos en
la técnica (incluyendo, por ejemplo, lisis hipotónica o con
detergente).
\newpage
Ejemplo
9
La subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
recombinante es producida en la levadura S. cerevisiae
después de la inserción del cistrón del ADNc de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
óptimo en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión
intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de
la expresión intracelular, se ligan vectores tales como EmBLyex4, o
similar, al cistrón de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
(véase Rinas, U. et al., Biotechnology 8:
543-545 (1990); y Horowitz B. et al., J.
Biol. Chem. 265: 4189-4192 (1989). Para la
expresión extracelular, se liga el cistrón de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
en vectores de expresión de levadura que fusionan una señal de
secreción (un péptido de levadura o mamífero) al extremo NH_{2}
de la proteína de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio Humano
(Jacobson, M. A., Gene 85: 511-516 (1989) y Riett L.
y Bellon N. Biochem. 28: 2941-2949 (1989).
Estos vectores incluyen, pero no están limitados
a, pAVE1.6, que fusiona la señal de la albúmina de suero humana al
ADNc expresado (Steep O. Biotechnology 8: 42-46
(1990), y el vector pL8PL que fusiona la señal de la lisozima
humana al ADNc expresado (Yamamoto, Y., Biochem. 28:
2728-2732). Además, la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
es expresada en levadura como una proteína de fusión conjugada con
ubiquitina utilizando el vector pVEP (véase Ecker, D. J., J. Biol.
Chem. 264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A.,
Biotechnology 7: 705-709 (1989), y McDonnell D. P.,
Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989). Los niveles de
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano expresada se determinan mediante los análisis
descritos en la presente memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
producida recombinantemente puede ser purificada mediante
cromatografía de afinidad con anticuerpos.
Las columnas de afinidad con anticuerpo para la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano se elaboran añadiendo los anticuerpos
anti-subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
a Affigel-10 (Biorad), un soporte en gel que es
pre-activado con ésteres de
N-hidroxisuccinimida de manera que los anticuerpos
formen enlaces covalentes con el soporte de cuentas de gel de
agarosa. Los anticuerpos son acoplados después al gen por medio de
enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados
restantes se sofocan después con etanolamina\cdotHCl 1 M (pH 8).
La columna se lava con agua seguido de glicina\cdotHCl 0,23 M (pH
2,6) para separar cualquier anticuerpo o proteína extraña no
conjugados. La columna se equilibra después en solución salina
tamponada con fosfato (pH 7,3) junto con agentes de solubilización
de la membrana apropiados tales como detergentes. Los sobrenadantes
del cultivo celular o los extractos celulares que contienen la
subunidad \alpha_{2}\delta-4 del canal de
calcio humano solubilizada se hacen pasar lentamente a través de la
columna. La columna se lava después con solución salina tamponada
con fosfato de calcio junto con detergentes hasta que la densidad
óptica (A_{280}) cae hasta el fondo, después la proteína se hace
eluir con glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6) junto con
detergentes. La proteína de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
purificada se somete a diálisis después frente a solución salina
tamponada con fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se desparafinaron portas de tejido de patrón en
cuadrícula humano comercial (Dako, Carpenteria, CA; Biomeda, Foster
City, CA; Novagen, Milwaukee, WI), se hidrataron y se trataron para
la inmunoistoquímica rutinaria (IHC) como se ha descrito
previamente (D'Andrea et al., (1998) J. Histochem. Cytochem.
46(1): 1-8. En resumen, los portas se
introdujeron en el microondas en Tampón Target (Dako), se enfriaron,
se pusieron en H_{2}O destilada y después se trataron con
H_{2}O_{2} al 3,0% durante 10 min. Después de eso, los portas se
enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4, PBS) y
después se trataron por medio de un sistema de bloqueo de
avidina-biotina de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Vector Labs, Burlingame, CA) y luego se colocaron en
PBS. Todas las incubaciones de reactivos y lavados posteriores se
realizaron a la temperatura ambiente. Se colocó suero de bloqueo
normal (Vector Labs) sobre todos los portas durante 10 min. Después
de enjuagar brevemente en PBS, se puso anticuerpo primario
(anticuerpos policlonales
anti-\alpha_{2}\delta-4
humana purificados por afinidad, dilución 1:1000) sobre los portas
durante 30 min. Los portas se lavaron y los anticuerpos secundarios
biotinilados, aquí anti-conejo de cabra (anticuerpos
policlonales) o anti-ratón de caballo (anticuerpos
monoclonales) se pusieron sobre las secciones de tejido durante 30
min (Vector Labs). Después de enjuagar en PBS, se añadió el
reactivo complejo avidina-peroxidasa de rábano
picante-biotina (HRP-ABC, Vector
Labs) durante 30 min. Los portas se lavaron y se trataron con el
cromógeno 3,3'-diaminobenzidina (DAB, Biomeda) dos
veces durante cinco minutos cada uno, después se enjuagaron en
dH_{2}O, y se contratiñeron con hematoxilina. Se utilizó un
anticuerpo monoclonal para vimentina, la proteína filamentosa
intracelular ubícua ampliamente conservada, como control positivo
para demostrar la antigenicidad del tejido y la calidad del
reactivo de control. Los controles negativos incluyeron la
sustitución del anticuerpo primario por suero preinmune o por suero
no inmune del isotipo IgG de la misma especie.
Los resultados se resumen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados sugieren un papel para la
variante de empalme en tejidos específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Los siguientes procedimientos se llevan a cabo
todos a 4ºC. Las células con la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 del canal de calcio humano
transfectada estable se lavan con PBS y se suspenden en tampón de
lisis (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 2 mM y cóctel
inhibidor de proteinasa). Las células se incuban sobre hielo durante
40 minutos seguido de una breve sonicación. El desecho celular se
separa mediante centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos, y
después se centrifuga el sobrenadante durante 1 hora a 50.000 x g.
El sedimento se resuspende en tampón de lisis y se mantiene a
80ºC.
El análisis de unión se lleva a cabo en un
volumen final de 250 \mul que contiene 50 \mug de membrana
celular, 20 mM de gabapentina[H^{3}] y tampón Hepes 10 mM,
pH 7,5. Después de incubar a la temperatura ambiente durante 45
min, la mezcla de reacción se filtra sobre membranas GF/C
pre-humedecidas y se lava cinco veces con tampón
Tris 50 mM enfriado con hielo, pH 7,5. Después se secan los filtros
y se someten a recuento en un contador de centelleo líquido. Para
escrutar el ligando de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4 novedoso, se determina la
capacidad de los compuestos para inhibir la unión de gabapentina
[H^{3}] a la subunidad \alpha_{2}\delta-4
con el mismo análisis en presencia de los compuestos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Puesto que el canal de calcio es un complejo de
proteína con múltiples subunidades, una subunidad
\alpha_{2}\delta-4 funcional, como otras
subunidades \alpha_{2}\delta conocidas, sería un componente
del complejo. La formación de un complejo estable de
\alpha_{2}\delta-4 con otras subunidades del
canal se sometió a ensayo mediante inmunoprecipitación simultánea.
La subunidad \alpha_{2}\delta-4 se etiquetó
primero con un epítopo HA y se con-transfectó con
subunidades Ca_{V}1.2 (\alpha_{1C}) y \beta_{3} en células
HEK. La inmunoprecipitación simultánea se llevó a cabo con células
HEK 293 transfectadas transitoriamente por medio de constructos de
\alpha_{1C}, \beta_{3} y
\alpha_{2}\delta-4 etiquetados con el epítopo
HA. Dos días después de la transfección, las células (de dos placas
de 150 mm) se cosecharon y se lavaron con PBS. Las células se
resuspendieron después en 2 ml de tampón de extracción con
detergente: Nonidet P-40 al 1% (vol/vol),
desoxicolato al 0,5%, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM,
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y 20 \mul de cóctel
inhibidor de proteasa (Sigma), seguido de 10 pases cada uno
a través de agujas de calibre 20 y 26. Los extractos celulares se
aclararon mediante centrifugación. La inmunoprecipitación
simultánea se llevó a cabo con 500 \mul de productos lisados
celulares en presencia de 50 \mul de Anti-HA
(anticuerpo monoclonal de rata) Affinity Matrix (Roche Diagnostic) o
50 \mul de anticuerpo policlonal
anti-\alpha_{1C} (Alamone Labs) y 50 \mul de
Proteína A Sepharose® CL-4B (Pharmacia). Después de
incubar a 4ºC durante la noche, las cuentas se precipitaron mediante
una breve centrifugación, y se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón
de lisis. Finalmente, se añadieron 100 \mul de tampón de carga 1
x SDS, y se sometieron 20 \mul a SDS al 4-20%. Las
subunidades co-precipitadas se analizaron después
mediante transferencia Western con los anticuerpos indicados.
Los resultados de los autores de la presente
invención demuestran que \alpha_{2}\delta-4
está asociada con Ca_{V}1.2 y \beta_{3} después de la
cotransfección en células HEK293. La expresión de las tres
subunidades en las células HEK293 se confirmó mediante
transferencia Western. Se detectó la proteína
\alpha_{2}\delta-4(HA) por medio de
Abs anti-\alpha_{2}\delta-4 y
anti-HA.
\alpha_{2}\delta-4(HA) fue
inmunoprecipitado a partir de productos lisados con Ab
anti-HA, y la presencia de Ca_{V}1.2,
\alpha_{2}\delta-4 y \beta_{3} en los
productos precipitados fue confirmada mediante transferencia Western
utilizando Abs policlonales anti-Ca_{V}1.2,
anti-\alpha_{2}\delta-4 o
anti-\beta_{3}. En las mismas condiciones,
ninguna subunidad fue inmunoprecipitada de las células
transfectadas solamente por el vector, pcADN3.1. Se realizó una
inmunoprecipitación recíproca de la subunidad Ca_{V}1.2 a partir
de los mismos productos lisados utilizando cuentas de Ab
anti-Ca_{V}1.2/proteína-A, y se
confirmó la presencia de
\alpha_{2}\delta-4(HA) mediante
transferencia Western con Ab anti-HA. La
inmunoprecipitación simultánea de la subunidad
\alpha_{2}\delta-4(HA) se confirmó
adicionalmente mediante un control negativo, en el que solamente se
añadieron cuentas de proteína A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se sembraron células HEK 293 en placas de 6
pocillos (1,5 x 10^{5}/pocillo) el día antes de la transfección.
Las células se transfectaron con 1 \mug de ADN de cada constructo
como se indica utilizando el reactivo de transfección Genejammer®
(Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo el protocolo
proporcionado por la compañía. A las 24 horas de la transfección,
las células transfectadas se volvieron a cultivar en placa en placas
de 96 pocillos (2 x 10^{3}/100 \mul/pocillo) y se incubaron a
37ºC/CO_{2} al 5% durante otras 24 horas.
Se midió el influjo de calcio con Attofluor
Digital Imaging System. Las células HEK 293 transfectadas se
cargaron con un volumen igual (100 \mul) de Calcium Plus Dye
(Molecular Device, Sunnyvale, CA) con 2,5 mM de Probenecida
durante 1 hora a 37ºC. El canal de calcio se activó despolarizando
las células con KCI 50 mM o con tampón solamente con control
negativo. El calcio más colorante fue excitado utilizando un
RatioArc High-Speed Excitor a una longitud de onda
de 488-nm. La luz emitida fue transmitida a través
de un Long Pass Filter de 490-nm y recogida en una
cámara CCD intensificada con Attofluor. Las imágenes de una única
longitud de onda del colorante de fluorescencia se digitalizaron, y
se analizaron, utilizando el soporte lógico Attofluor Ratio Vision.
Los datos de las células individuales se recogieron de diversos
experimentos y se exportaron a Microsoft Excel para su análisis
adicional. El diagrama de barras representado en la Figura 2 mostró
las medias \pm ETM del cambio de fluorescencia después de la
adición de KCI 50 mM. Para confirmar el influjo de calcio por medio
del canal de tipo L \alpha_{1C} transfectado, se añadieron 10
\muM de Nifedipina, un bloqueador del canal de calcio de tipo L
específico, antes de la despolarización por KCI.
Como se muestra en la Figura 2, tras la
despolarización, el influjo de Ca^{2+} en las células
transfectadas estaba mediado por un canal de Ca^{2+} sensible a
Nifedipina, presumiblemente por el canal de Ca^{2+} de tipo L
Ca_{V}1.2 (\alpha_{1C}) expresado en exceso. El influjo de
Ca^{2+} en células transfectadas con Ca_{V}1.2 aumentaba
significativamente (-3 veces) mediante la
co-transfección de la subunidad \beta_{3}. El
efecto aumentaba adicionalmente a 6 veces en presencia de las
subunidades \beta_{3} y
\alpha_{2}\delta-4. Este resultado sugiere
que la subunidad \alpha_{2}\delta-4 juega un
papel básico similar al de \alpha_{2}\delta-1
en la formación de un canal funcional.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Ortho McNeil Pharmaceutical,
Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ADNc que Codifica una Subunidad del
Canal de Calcio Alfa2 Delta4 Novedosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ORT-1622
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> adjunto
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-04-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/833,222
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-04-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido de la secuencia N-terminal del clon
EST AAOO1473
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
<212 ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido de la secuencia
N-terminal del clon EST AAOO1473
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador AP-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
AP-2 primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de la subunidad del canal de calcio ????
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de la subunidad del canal de calcio ????
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: péptido sintético de la proteína de la subunidad del
canal de calcio ????
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: péptido sintético de la proteína de la subunidad del
canal de calcio ????
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3486
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1090
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (34)
1. Una molécula de ácido nucleico de
\alpha2\delta-4 aislada y purificada, que
codifica un polipéptido que es capaz de formar un canal de calcio
funcional, seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con los nucleótidos 1 a 224 del SEQ ID NO: 9;
- (b)
- una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% con los nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9;
- (c)
- una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a los polinucleótidos de (a) o (b).
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, donde el polinucleótido es ARN.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, donde el polinucleótido es ADN.
4. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1, donde la molécula de ácido
nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de al menos 85% con los nucleótidos 1 a 224 del SEQ ID
NO: 9 o su secuencia complementaria; donde la molécula de ácido
nucleico codifica un polipéptido que es capaz de formar un canal de
calcio funcional.
5. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% con los
nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9 o su secuencia
complementaria; donde la molécula de ácido nucleico codifica un
polipéptido que es capaz de formar un canal de calcio
funcional.
6. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1, donde la molécula de ácido
nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de al menos 85% con los nucleótidos 1 a 224 del SEQ ID
NO: 9 y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al
menos 85% con los nucleótidos 3308 a 3486 del SEQ ID NO: 9 o su
secuencia complementaria; donde la molécula de ácido nucleico
codifica un polipéptido que es capaz de formar un canal de calcio
funcional.
7. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que
tiene una identidad de al menos 96% con los aminoácidos 1 a 1090 del
SEQ ID NO: 10, o su secuencia complementaria.
8. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que
comprende los aminoácidos 1 a 1090 del SEQ ID NO: 10, o su secuencia
complementaria.
9. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1, que comprende una identidad de
al menos 94% con la secuencia de polinucleótidos mostrada en el SEQ
ID NO: 9, o su secuencia complementaria.
10. La molécula de ácido nucleico aislada y
purificada de la reivindicación 1, que tiene una secuencia de
nucleótido del SEQ ID NO: 9, o su secuencia complementaria.
11. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
12. Una célula anfitriona recombinante que
comprende el vector de expresión de la reivindicación 11.
13. Un polipéptido
\alpha2\delta-4 esencialmente purificado
codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10.
14. Un polipéptido sustancialmente purificado
seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con los aminoácidos 1 a 12 del SEQ ID NO: 10; y
- (b)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con los aminoácidos 1 a 12 del SEQ ID NO: 10 y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 70% con los aminoácidos 1040 a 1090 del SEQ ID NO: 10;
donde el polipéptido es capaz de formar un canal
de calcio funcional.
15. El polipéptido sustancialmente purificado de
la reivindicación 14 que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene identidad con los aminoácidos 1 a 12 y que tiene una secuencia
de aminoácidos con una identidad de al menos 85% con los
aminoácidos 1040 a 1090 del SEQ ID NO: 10.
16. El polipéptido esencialmente purificado de
la reivindicación 14 que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene una identidad de al menos 96% con los aminoácidos 1 a 1090 del
SEQ ID NO: 10.
17. El polipéptido esencialmente purificado de
la reivindicación 14 que comprende la secuencia de aminoácidos del
SEQ ID NO: 10.
18. Un método para expresar una proteína
\alpha2\delta-4 de la subunidad del canal de
calcio en una célula anfitriona recombinante, que comprende las
etapas de:
- (a)
- introducir un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11 en una célula; y
- (b)
- cultivar las células en condiciones que permitan la expresión de la proteína \alpha2\delta-4 de la subunidad del canal de calcio a partir del vector de expresión.
19. Un anticuerpo que se une selectivamente a un
péptido correspondiente a los aminoácidos 1 a 12 del SEQ ID NO: 10
o los aminoácidos 1040 a 1090 of SEQ ID NO: 10.
20. Un método de identificación de variaciones
en las secuencias de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio o la
actividad de la subunidad \alpha2\delta-4 del
canal de calcio en un sujeto que comprende las etapas de:
- (a)
- analizar la cantidad de ácido nucleico de \alpha2\delta-4, polipéptido \alpha2\delta-4 o variaciones en la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de \alpha2\delta-4 en una muestra biológica obtenida de un sujeto; y
- (b)
- comparar los resultados de la etapa de análisis con los resultados utilizando una muestra obtenida de un sujeto de control
donde la secuencia de ácido nucleico de
\alpha2\delta-4 se define como en los apartados
(a), (b) o (c) de la reivindicación 1, y la secuencia de
aminoácidos de \alpha2\delta-4 es la secuencia
de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de la
reivindicación 1.
21. Una molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 3 capaz de codificar una proteína
\alpha2\delta-4 de la subunidad del canal de
calcio para su uso en el tratamiento o la prevención de una
enfermedad o trastorno asociado con una subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio defectuosa
en un sujeto que lo necesite.
22. Una molécula de ADN que es la cadena
antisentido de una secuencia codificante capaz de codificar una
proteína \alpha2\delta-4 de la subunidad del
canal de calcio de acuerdo con reivindicación 13, para su uso en el
tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno asociado
con una subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio defectuosa en un sujeto que lo necesite.
23. La molécula de ADN de la reivindicación 21
o la reivindicación 22, donde la enfermedad se selecciona del grupo
que consiste en: síndromes relacionados con convulsiones, epilepsia,
migraña, ataxia, defectos vestibulares, dolor crónico, dolor
neuropático, estado de ánimo, interrupción del sueño, ansiedad, ELA,
esclerosis múltiple, manías, temblores, parkinson, síndromes de
abuso/adicción de sustancias, depresión, cáncer, e inflamación.
24. Un método de detección de una molécula de
ácido nucleico de un gen \alpha2\delta-4, que
comprende la etapa de poner en contacto una muestra de ensayo con
una sonda de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en condiciones rigurosas
y detectar el complejo de la sonda-molécula de
ácido nucleico.
25. Un método de detección de una proteína
\alpha2\delta-4 de la subunidad del canal de
calcio, que comprende las etapas de poner en contacto una muestra
de ensayo con un anticuerpo que se une selectivamente a los
aminoácidos 1 a 12 o 1040 a 1090 del SEQ ID NO: 10; y detectar el
complejo de proteína-anticuerpo.
26. Un método de identificación de un compuesto
útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado con un defecto
de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio de acuerdo con la reivindicación 13; y
- (b)
- identificar los compuestos capaces de aumentar o disminuir el flujo de iones a través del canal de calcio, comprendiendo dicho canal la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio.
27. El método de la reivindicación 26, donde
dicha subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio está aislada o esencialmente purificada.
28. El método de la reivindicación 26, donde
dicha subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio está asociada con una membrana.
29. El método de la reivindicación 26, donde
dicha subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio es expresada a partir de una célula anfitriona.
30. Un método para identificar un compuesto que
altera la actividad de la proteína de la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio, que
comprende las etapas de:
- (a)
- combinar un compuesto, una proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio de acuerdo con la reivindicación 13, y un ligando marcado mediblemente para la proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio; y
- (b)
- medir la unión del compuesto a la proteína de la subunidad mediante una reducción en la cantidad de ligando marcado que se une a la proteína de la subunidad \alpha2\delta-4 del canal de calcio.
31. El método de la reivindicación 30, donde el
ligando marcado para la subunidad
\alpha2\delta-4 del canal de calcio es una
gabapentina (GBP) marcada.
32. El método de la reivindicación 30, donde
dicha subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio está aislada o esencialmente purificada.
33. El método de la reivindicación 30, donde
dicha subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio está asociada con una membrana.
34. El método de la reivindicación 30, donde
dicha subunidad \alpha2\delta-4 del canal de
calcio es expresada a partir de una célula anfitriona.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/833,222 US7524643B2 (en) | 2001-04-11 | 2001-04-11 | CDNA encoding the human alpha2 delta4 calcium channel subunit |
| US833222 | 2001-04-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2323946T3 true ES2323946T3 (es) | 2009-07-28 |
Family
ID=25263783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02728726T Expired - Lifetime ES2323946T3 (es) | 2001-04-11 | 2002-04-10 | Adnc que codifica la subunidad alfa2 delta4 del canal de calcio humano. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7524643B2 (es) |
| EP (1) | EP1427825B8 (es) |
| JP (1) | JP2005503771A (es) |
| AT (1) | ATE427355T1 (es) |
| AU (1) | AU2002258760B2 (es) |
| DE (1) | DE60231816D1 (es) |
| ES (1) | ES2323946T3 (es) |
| WO (1) | WO2002083847A2 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8512971B2 (en) * | 2002-12-10 | 2013-08-20 | Echelon Biosciences, Inc. | Compounds and methods of use thereof for assaying lysophospholipase D activity |
| CN1919868B (zh) * | 2005-08-26 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 慢性神经痛相关蛋白及其基因 |
| WO2014110628A1 (en) * | 2013-01-18 | 2014-07-24 | Itek Ventures Pty Ltd | Gene and mutations thereof associated with seizure disorders |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE139542T1 (de) | 1988-04-04 | 1996-07-15 | Salk Inst Biotech Ind | Calciumkanal-zusammensetzungen und verfahren |
| US5712158A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-27 | Warner-Lambert Company | Cell line for the rapid expression of functional calcium channels |
| US7262052B1 (en) * | 1998-10-07 | 2007-08-28 | Warner Lambert Company | α-2/δ gene |
| CA2378331A1 (en) | 1999-07-28 | 2001-02-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Calcium channel transport polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
| US6783952B1 (en) * | 1999-09-16 | 2004-08-31 | Warner-Lambert Company | Secreted soluble α2δ-2, α2δ-3 or α2δ-4 calcium channel subunit polypeptides and screening assays using same |
-
2001
- 2001-04-11 US US09/833,222 patent/US7524643B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-04-10 EP EP02728726A patent/EP1427825B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-10 WO PCT/US2002/011297 patent/WO2002083847A2/en not_active Ceased
- 2002-04-10 DE DE60231816T patent/DE60231816D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-10 US US10/119,624 patent/US7157248B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-10 JP JP2002582186A patent/JP2005503771A/ja active Pending
- 2002-04-10 AT AT02728726T patent/ATE427355T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-10 ES ES02728726T patent/ES2323946T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-10 AU AU2002258760A patent/AU2002258760B2/en not_active Ceased
-
2009
- 2009-03-20 US US12/408,407 patent/US7820792B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1427825A4 (en) | 2005-03-16 |
| US7157248B2 (en) | 2007-01-02 |
| WO2002083847A3 (en) | 2004-04-01 |
| EP1427825B1 (en) | 2009-04-01 |
| EP1427825B8 (en) | 2009-06-17 |
| EP1427825A2 (en) | 2004-06-16 |
| HK1065067A1 (en) | 2005-02-08 |
| US20030170785A1 (en) | 2003-09-11 |
| DE60231816D1 (de) | 2009-05-14 |
| US20090259022A1 (en) | 2009-10-15 |
| US20030166045A1 (en) | 2003-09-04 |
| US7524643B2 (en) | 2009-04-28 |
| AU2002258760B2 (en) | 2007-08-09 |
| US7820792B2 (en) | 2010-10-26 |
| ATE427355T1 (de) | 2009-04-15 |
| JP2005503771A (ja) | 2005-02-10 |
| WO2002083847A2 (en) | 2002-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0579758B1 (en) | Parathyroid hormone receptor and dna encoding same | |
| US6417328B2 (en) | Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof | |
| US5886148A (en) | Parathyroid hormone receptor | |
| EP1036175B1 (en) | Human brain derived kcnq2 potassium channel | |
| JP2000083689A (ja) | シアロアドヘシンファミリ―メンバ――２（ｓａｆ―２） | |
| US7132260B2 (en) | DNA encoding parathyroid hormone receptor | |
| JP2001517441A (ja) | Ｇタンパク質共役糖タンパク質ホルモン受容体ｈｇ３８ | |
| US7150974B1 (en) | Parathyroid hormone receptor binding method | |
| ES2323946T3 (es) | Adnc que codifica la subunidad alfa2 delta4 del canal de calcio humano. | |
| WO1999026977A1 (en) | Novel receptors opg-2 | |
| US6455278B1 (en) | DNA encoding human vanilloid receptor VR3 | |
| JP2004514413A (ja) | ヒトの電位依存性ナトリウムチャンネルβ−１Ａサブユニットおよび使用法 | |
| JP4999688B2 (ja) | 細胞表面糖タンパク質 | |
| US6020158A (en) | Isolated polynucleotide for novel G-protein coupled receptor | |
| AU2002258760A1 (en) | cDNA encoding the human alpha2 delta4 calcium channel subunit | |
| JP2004516005A (ja) | Ｈ４サブタイプの哺乳動物のヒスタミン受容体をコードするｄｎａ | |
| HK1065067B (en) | Cdna encoding the human alpha2 delta4 calcium channel subunit | |
| JP2005503104A (ja) | ヒトの新規なカリウムチャンネルβサブユニット | |
| JP2003523181A (ja) | Ｄｎａヘリカーゼ、ヒトｎｈｌをコードするｄｎａ分子 | |
| JP2002531112A (ja) | 腫瘍壊死因子レセプターホモログ−１ | |
| JPWO2003002603A1 (ja) | 新規のニューロペプチドｙ様ペプチド |