ES2323996B1 - Nuevo marcador de seleccion termoestable para la manipulacion genetica de thermus spp. - Google Patents
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Abstract
Nuevo marcador de selección termoestable para la
manipulación genética de Thermus spp.
La invención describe un nuevo marcador de
selección termoestable para la manipulación genética de bacterias
del género Thermus spp., en particular, con un
polinucleótido que, cuando se expresa, la proteína resultante
proporciona a las bacterias del género Thermus spp. un
fenotipo dependiente de estreptomicina, lo que tiene distintas
aplicaciones en el campo de la biotecnología como marcador de
selección de clonaje y expresión de genes de interés o en la
deleción específica de genes.
Description
Nuevo marcador de selección termoestable para la
manipulación genética de Thermus spp.
La invención se relaciona, en general, con
marcadores de selección termoestable para la manipulación genética
de bacterias del género Thermus spp., en particular, con un
polinucleótido que, cuando se expresa, la proteína resultante
proporciona a las bacterias del género Thermus spp. un
fenotipo dependiente de estreptomicina, lo que tiene distintas
aplicaciones en el campo de la biotecnología como marcador de
selección de clonaje y expresión de genes de interés o en la
deleción específica de genes.
La producción de proteínas de interés
biotecnológico a escala industrial suele llevarse a cabo mediante
el clonado del gen que codifica dicha proteína en bacterias o
levaduras modelos fácilmente manipulables (e.g., Escherichia
coli o Saccharomyces cerevisiae). Sin embargo, cuando se
trata de proteínas procedentes de bacterias termófilas, como las
procedentes del género Thermus spp., que poseen una
complejidad en su estructura muy particular, dichos sistemas modelo
no son eficaces, lo que hace necesario emplear al propio organismo
termófilo del que procede la proteína como factoría celular.
Lamentablemente, las estrategias empleadas actualmente para la
expresión de proteínas de interés en organismos termófilos (e.g.
Thermus spp.), dependen exclusivamente de vectores que
confieren resistencia a kanamicina lo que impide la producción de
proteínas en cepas que posean dicha resistencia de forma
natural.
Las bacterias del género Thermus spp. se
caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y
por su facilidad de manipulación genética, única entre organismos
termófilos extremos. Por otro lado, constituyen una fuente
enormemente amplia de enzimas termoestables, tanto de aplicación
industrial, tal como lipasas, catalanas, pululasas y proteasas,
como de aplicación en técnicas de biología molecular, como las ADN
polimerasas.
La producción de enzimas de interés
biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos,
suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una
bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como E.
coli o S. cerevisiae. Sin embargo, existen una gran
cantidad de enzimas termófilas cuya complejidad de síntesis hace
imposible su obtención en forma activa en estos organismos modelo
(Hidalgo, A. y cols., 2004. Thermus thermophilus as a cell
factory for the production of a thermophilic
Mn-dependent catalase which fails to be synthesized
in an active form in Escherichia coli. Appl. Environ.
Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es el caso
frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o el de
aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor en el
proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas
específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición
abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos,
que pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas
codificadas en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la
de utilizar en la producción un microorganismo termófilo
relacionado evolutivamente con aquel del que procede la enzima de
interés.
Actualmente, existen vectores o plásmidos
seleccionables para el clonaje y la expresión de enzimas en cepas
del género Thermus spp. Tales plásmidos se basan en los
siguientes sistemas de selección:
(Liao, H. y cols., 1986. Isolation of a
thermostable enzyme variant by cloning and selection in a
thermophile. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 83:
576-580). A partir de este gen, se han desarrollado
una serie de vectores para Thermus spp., descritos
esencialmente en los siguientes artículos:
- Lasa y cols., 1992. Development of Thermus
thermophilus. Escherichia shuttle vectors and their use
for the expression of the Clostridium thermocellum celA gene
in Thermus thermophilus. Journal of Bacteriology. Vol.
174:6424-6431. En este artículo se describe la
autoselección de orígenes de replicación crípticos de cepas de
Thermus spp. mediante la incorporación del gen quimérico de
resistencia termoestable a kanamicina, desarrollado en el artículo
publicado por el mismo grupo en la revista Molecular Microbiology.
Vol. 6:1555-1564 (1992) titulado "Insertional
mutagenesis in the extreme thermophilic eubacteria Thermus
thermophilus", y descrito en la patente española número
P9301522.
- Mather y Fee. 1992. Development of plasmid
cloning vectors for Thermus thermophilus HB8: Expression of
a heterologous, plasmid-borne kanamycin nucleotidyl
transferase gene. Applied and Environmental Microbiology. Vol.
58:421-425. Los autores emplean el gen de
resistencia termoestable a kanamicina descrito por Liao y
colaboradores en 1986 (citado supra) para generar por
inserción al azar un plásmido con el origen del replicación de
pTT8.
- De Grado y cols., 1999. A
high-transformation-efficiency
cloning vector for Thermus thermophilus. Plasmid. Vol.
42:241-245. Los autores describen un vector
derivado del publicado por Lasa y cols. en 1992 (citado at
supra) en el que se ha definido y recortado el origen de
replicación mínimo necesario para su mantenimiento en
Thermus spp., y se ha integrado en el vector pUC18 junto con
el gen quimérico que confiere resistencia termoestable a kanamicina
(P9301522). Este vector ha sido empleado en trabajos posteriores
para la expresión de proteínas y de ARN.
- Moreno y cols., 2003. Development of a gene
expression vector for Thermus thermophilus based on the
promoter of the respiratory nitrate reductase. Plasmid. Vol:
49:2-8. En este artículo se describe el desarrollo
de un vector derivado del descrito en de Grado y cols (1999) (citado
at supra) al que se le incorporó un promotor inducible en
cepas capaces de respirar nitrato, mostrándose su actividad con dos
genes testigo.
- Brouns y cols., 2005. Engineering a selectable
marker for hyperthermophiles. Journal of Biological Chemistry. Vol.
280:11422-11431. Los autores describen en dicho
artículo un nuevo sistema de selección para Thermus
thermophilus basado en una forma termoestable de una proteína
de resistencia al antibiótico bleomicina, donada en un vector
derivado del de de Grado y cols. 1999 (citado at supra).
- Nakamura y cols., 2005. In vivo
directed evolution for thermostabilization of Escherichia
coli hygromycin B phosphotransferase and the use of the gene as
a selection marker in the host-vector system of
Thermus thermophilus. J Biosci Bioeng. Vol.
100:158-63. En este trabajo se desarrolla por
evolución dirigida una versión termoestable de la proteína de
resistencia a hygromicina de E. coli, capaz de conferir
resistencia a este antibiótico en Thermus thermophilus hasta
67ºC, y lo emplean para el desarrollo de nuevos vectores
replicativos.
- Koyama y cols., 1990. A plasmid vector for an
extreme thermophile, Thermus thermophilus. FEMS Microbiology
Letters. Vol. 72:97-102. En este artículo los
autores combinan un plásmido críptico con los genes trpBA,
seleccionable en una cepa auxotrófica para triptófano, aunque
presenta una alta frecuencia de recombinación con el cromo-
soma.
soma.
- Kayser y Kilbane., 2001. New
host-vector system for Thermus spp. based on
the malate dehydrogenase gene. Journal of Bacteriology. Vol.
183:1792-5. En este artículo se propone la
utilización del gen de la enzima malato deshidrogenasa como sistema
de selección de plásmidos en cepas defectivas en esta enzima. Este
trabajo se continuó con la publicación por Kayser y cols. (2001)
del artículo titulado "inducible and constitutive expression
using new plasmid and integrative expression vectors for
Thermus spp" en Lett Appl Microbiol. Vol.
32:412-8, en el que se muestra el empleo de este
sistema de selección para el desarrollo de vectores con una cierta
capacidad de expresión en Thermus spp. Más recientemente,
los mismos autores han extendido el número de enzimas expresables
en Thermus spp. en el artículo de Park y cols. de 2004
titulado "Heterologous gene expression in Thermus
thermophilus: beta-galactosidase,
dibenzothiophene monooxygenase, PNB carboxy esterase,
2-aminobiphenyl-2,3-diol
dioxygenase, and chloramphenicol acetyl transferase". J Ind
Microbiol Biotechnol. Vol. 31:189-97.
- Tamakoshi y cols., 1997. A new
Thermus-Escherichia coli shuttle integration
vector system. J. Bacteriol. Vol. 179:4811-4814. En
este artículo se emplean dos sistemas de selección basados en los
genes leuB y pyrE que complementan mutantes de Thermus
thermophilus defectivos en la síntesis de Leucina y de Uracilo,
respectivamente. Resulta interesante destacar que el gen pyrE
silvestre puede ser contraseleccionado en presencia de ácido
fluoro-orótico, una propiedad que aprovecha el
mismo grupo de investigación para desarrollar en su artículo
Tamakoshi y cols. de 1999 titulado "An efficient gene replacement
and deletion system for an extreme thermophile, Thermus
thermophilus" y publicado en FEMS Microbiol Lett. Vol.
173:431-437, una metodología de deleción dirigida
de
genes.
genes.
Adicionalmente a la producción de enzimas de
interés, las bacterias del género Thermus spp. tienen gran
potencial de utilización como sistemas de obtención de enzimas
termoestables mediante selección funcional a elevadas temperaturas,
existiendo algunos ejemplos de ello en la literatura científica
(Fridjonsson y cols., 2002. Thermoadaptation of
alpha-galactosidase AgaB1 in Thermus
thermophilus. J Bacteriol. Vol. 184:3385-3391;
Brouns y cols., 2005. Engineering a selectable marker for
hyperthermophiles. J Biol Chem. Vol. 280:11422-31) y
en los archivos de patentes (US 5,786,174 y la patente española
número P9301522). No obstante, la aplicación de estos métodos
depende de la generación de una cepa de Thermus spp. mutante
que requiera de la actividad funcional de la enzima a
termoestabilizar para su crecimiento, siendo muy limitadas en la
actualidad las metodologías existentes para la obtención de dichos
mutantes debido a que su aislamineto pasa bien por utilizar el gen
de resistencia termoestable a kanamicina, limitando la utilización
posterior de vectores, o alternativamente, empleando una
metodología de selección positiva y negativa de la presencia del
gen pyrE según se describe en (Tamakoshi y cols., 1999. An efficient
gene replacement and deletion system for an extreme thermophile,
Thermus thermophilus. FEMS Microbiol. Lett. Vol.
173:431-437), que resulta mucho más compleja y
laboriosa, y no siempre efectiva por la elevada presencia de falsos
positivos en varios de los procesos de selección.
No hay precedentes en la literatura científica
de la utilización de genes de dependencia a estreptomicina para la
generación de plásmidos de clonaje y/o expresión para
Thermus spp. ni para la obtención dirigida de mutantes de
deleción mediante selección negativa directa. Lo más parecido que
existe actualmente para generar mutantes de deleción es el
anteriormente comentado de utilización de procesos de selección
negativa de mutantes pyrE con el antimetabolito
5-fluoro-orótico, seguidos de
selección positiva de su presencia por prototrofia, para llegar a un
paso final de selección negativa con
5-fluoro-orótico (Tamakoshi y cols.,
1999. citado at supra). Existen en el estado de la técnica
mutaciones en la bacteria Thermus thermophilus en las
proteínas S12 de la subunidad pequeña del ribosoma o en el propio
ARN 16S, como las responsables de uno u otro fenotipos de
resistencia o dependencia a estreptomicina (Gregory y cols., 2001.
Streptomycin-resistant and
streptomycin-dependent mutants of the extreme
thermophile Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. Vol.
309:333-338), aunque en ninguno de estos casos se
ha descrito el polinucleótido que comprende la doble mutación, ni
los mutantes sencillos, que constituyen el objeto de la presente
invención.
A partir de mutantes espontáneos de Thermus
thermophilus HB27 crecidos en estreptomicina, los inventores
han aislado una proteína S12 mutada (en ocasiones denominada
proteína S12* en esta descripción) y, sorprendentemente, han
descubierto que la expresión del gen que codifica dicha proteína
S12* de Thermus spp. confiere un fenotipo de dependencia a
estreptomicina, surgiendo como un nuevo marcador de selección
termoestable en la generación de plásmidos de clonaje y/o de
expresión para la producción de proteínas de interés en organismos
termófilos del género Thermus spp. Adicionalmente, tal como
se muestra en los ejemplos que acompañan a la presente descripción,
dicho nuevo marcador de selección termoestable para especies del
género Thermus spp. puede tener otras aplicaciones
biotecnológicas, como la obtención de mutantes de deleción de
Thermus spp. de genes específicos.
La invención se relaciona, en general, con un
marcador de selección termoestable útil en la manipulación genética
de bacterias del género Thermus spp., como por ejemplo, en
la producción de proteínas de interés industrial procedentes de
Thermus spp., en la obtención de mutantes de deleción
dirigida de genes concretos, u otras aplicaciones de interés
biotecnológico. A modo ilustrativo, dicho marcador de selección es
un polinucleótido que comprende el gen rpsL mutado de Thermus
spp. que codifica una proteína S12 mutada de Thermus
spp.
Por tanto, en un aspecto la invención se dirige
a un polinucleótido aislado constituido por la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos
se muestra en la SEQ ID NO: 1, o una proteína funcionalmente
equivalente. Dicha proteína constituye un aspecto adicional de esta
invención.
En otros aspectos, la invención se relaciona con
un ácido nucleico que comprende un polinucleótido según se describe
en la presente invención, y con una construcción génica que
comprende dicho ácido nucleico donde, además, dicha construcción
génica puede contener un marcador de selección adicional, tal como
un gen de resistencia a antibiótico, y/o un origen de replicación
en Thermus spp.
Adicionalmente, en otro aspecto, la invención se
dirige a un vector que comprende un polinucleótido, un ácido
nucleico o una construcción génica según se describen en la
presente descripción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una bacteria del género Thermus spp. que comprende un
polinucleótido, un ácido nucleico, una construcción génica o un
vector según la invención.
Por otro lado, en otro aspecto la invención hace
referencia a una composición que comprende las bacterias del género
Thermus spp. descritas en la presente descripción.
Los diferentes usos del polinucleótido, el ácido
nucleico, la construcción génica y el vector definidos en la
presente descripción constituyen aspectos inventivos
adicionales.
Dicho polinucleótido, ácido nucleico,
construcción génica y vector pueden emplearse como un marcador de
selección termoestable, o para proporcionar un fenotipo
estreptomicina dependiente a una bacteria termófila del género
Thermus spp., o para el diseño de un plásmido termoestable
para expresar un gen de interés en una bacteria termófila del
género Thermus spp.
Por tanto, en la presente invención se describen
métodos para proporcionar un fenotipo estreptomicina dependiente a
una bacteria termófila del género Thermus spp., y para el
diseño de un plásmido termoestable para expresar un gen de interés
en una bacteria termófila del género Thermus spp.
Aspectos adicionales de la invención, lo
constituyen un método para producir una proteína de interés en
bacterias termófilas del género Thermus spp. y un método para
obtener mutantes de deleción dirigida de genes específicos en
bacterias termófilas del género Thermus spp., que comprenden
el empleo de una construcción o en un vector según la
invención.
La Figura 1 es un esquema de los plásmidos pS18a
y pS19a. Se muestra un esquema de los plásmidos donde se indica su
tamaño en kilopares de bases (kbp), la posición de del gen de
resistencia a betalactámicos en E. coli (amp^{r}) y el gen
de dependencia de estreptomicina (gen rpsL*) objeto de la presente
invención. También se indican la posición del sitio de clonaje
múltiple (MCS) y la orientación del promotor de la lactosa (flecha)
derivados de los plásmidos pUC18 y pUC19.
La Figura 2 es un esquema de los plásmidos pMS18
y pMS19. Se muestra un esquema de los plásmidos donde se indica su
tamaño en kilopares de bases (kbp), la posición y orientación del
gen de resistencia a betalactámicos en E. coli (gen
amp^{r}) y del gen de dependencia de estreptomicina (gen rpsL*)
objeto de la presente invención, y la región de ADN necesaria para
la replicación en Thermus spp., incluyendo al gen repA.
También se indican la posición del sitio de clonaje múltiple (MCS) y
la orientación del promotor de la lactosa (flecha) derivados de los
plásmidos pUC18 y pUC19.
La Figura 3 es una representación gráfica que
muestra el número de transformantes obtenidos en placas con
estreptomicina. Se representa gráficamente el número de colonias de
Thermus thermophilus capaces de crecer en placas de medio
nutritivo con estreptomicina a las concentraciones indicadas como
consecuencia de la transformación con los plásmidos pS18a (círculos
blancos) o pMS18 (círculos negros), frente al número de mutantes
espontáneos obtenido (cuadrados negros).
La Figura 4 es una representación gráfica que
muestra la expresión del gen bgaA desde pS18a y pMS18. Se
representa, en forma de barras con su desviación estándar
correspondiente, los valores de las actividades
beta-galactosidasas en unidades arbitrarias de la
estirpe silvestre (wt) y de las estirpes transformadas con pS18bgaA
(pS) y pMS18bgaA (pM).
La Figura 5 es una representación gráfica que
muestra la expresión de la actividad del gen PhoA en mutantes
phoA::kat. Se muestran los valores de actividad fosfatasa
hiperalcalina alcanzados por una cepa de Thermus thermophilus
mutante phoA::kat transformada con los plásmidos pS18phoA (pS) o
pMS18phoA (pM) frente a los de la misma cepa sin transformar
(-).
La Figura 6 muestra la secuencia del gen rpsL*
(gen rpsL mutado de T. thermophilus) que confiere
dependencia a estreptomicina en Thermus spp. Se indica la
secuencia de las dos hebras del ADN, y se marca en negrita las
dianas de restricción para la enzima NdeI incluidas durante el
proceso de amplificación, así como los cambios observados en la
secuencia de la zona codificante (secuencia subrayada) con respecto
al gen silvestre. La traducción a proteínas de este gen se muestra
bajo la secuencia del ADN, indicando con doble subrayado y en
negrita, la posición y carácter de las dos mutaciones
identificadas.
En un aspecto la invención se relaciona con un
polinucleótido aislado constituido por la secuencia de nucleótidos
que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra
en la SEQ ID NO: 1, o una proteína funcionalmente equivalente.
Dicha proteína, cuya secuencia de aminoácidos se
muestra en la SEQ ID NO: 1, o una proteína funcionalmente
equivalente de la misma, constituye un aspecto adicional de esta
invención.
Dicha proteína, es una variante o forma mutada
de la proteína S12 de Thermus thermophilus. Por este motivo,
en ocasiones, dicha proteína ha sido identificada como proteína
S12* en esta descripción.
La secuencia de aminoácidos de la proteína S12*
codificada por el polinucleótido de la invención presenta las
mutaciones K47R y K57E, tal como se muestra en la Figura 6 de la
presente descripción.
La secuencia de aminoácidos de la proteína S12
silvestre de una cepa de T. thermophilus está disponible en
la base de datos del National Center for Biotecnology Information
(NCBI) con el número de acceso YP_005302. Cuando en dicha secuencia
de aminoácidos la lisina en posición 46 es sustituida por arginina
(K46R) y la lisina en posición 56 es sustituida por ácido glutámico
(K56E) se obtiene una proteína S12 de T. thermophilus
mutante funcionalmente equivalente a la proteína S12* codificada por
el polinucleótido de la invención, en la que las dos valinas
presentes en las posiciones 1 y 2 de la SEQ ID NO: 1 han sido
reemplazas por una metionina. El experto en la materia entiende
que, dependiendo de la base de datos consultada, la secuencia de
aminoácidos mostrada de la proteína S12 silvestre de T.
thermophilus puede variar de longitud, debido a los diferentes
métodos empleados en la resolución de la secuencia de aminoácidos o
de la cepa concreta de origen y que por tanto, el número de
referencia correspondiente a la posición de los restos de lisina
que van a ser sustituidos puede cambiar. Por ejemplo, la base de
datos NCBI se basa en la secuencia de aminoácidos codificada por el
gen, mientras que en otras como UNIPROTKB/SWISS-PROT
se muestran sólo los aminoácidos que aparecen definidos en la
estructura de S12 resuelta mediante rayos X, y de la que faltan los
primeros aminoácidos codificados por el gen. No obstante, para el
experto en la materia resulta obvio que, comparando la secuencia de
aminoácidos de la proteína S12 de T. thermophilus de la base
de datos del NCBI con la secuencia de aminoácidos de dicha proteína
en otra base de datos, se puede deducir la posición de las lisinas
que van a ser sustituidas por arginina y ácido glutámico para
obtener la proteína S12* de T. thermophilus. Por ejemplo, si
se obtiene la secuencia de aminoácidos de la proteína S12 silvestre
de T. thermophilus de la base de datos
SWISS-PROT (Entry name RS 12_THET2 y Primary
accession number P61941), las lisinas que van a ser sustituidas por
arginina y ácido glutámico en la proteína S12 silvestre para
obtener la proteína S12* de T. thermophilus, funcionalmente
equivalente a la proteína codificada por el polinucleótido de la
presente invención, corresponden a las posiciones 43 y 53
respectivamente.
En la presente descripción, se entiende por
"proteína funcionalmente equivalente" I aquella proteína que,
aunque presente diferencias puntuales en su secuencia de
aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEQ ID NO: 1, conserva la capacidad de conferir un fenotipo
dependiente de estreptomicina a bacterias termófilas del género
Thermus spp., tal como se describe en la presente invención.
Por ejemplo, la proteína S12* de T. thermophilus descrita en
la SEQ ID NO: 1, la proteína S12 de T. thermophilus descrita
bajo el número de acceso YP_005302 que presenta las sustituciones
K46R y K56E, y la proteína S12 de T. thermophilus descrita
bajo el número de acceso P61941 que presenta las sustituciones K43R
y K53E, son proteínas funcionalmente equivalentes porque todas,
cuando están presentes en una especie del género Thermus
spp., confieren un fenotipo dependiente de estreptomicina. Las
expresiones "conferir dependencia a estreptomicina",
"conferir un fenotipo dependiente de estreptomicina" y
"proporcionar un fenotipo estreptomicina dependiente" son
equivalentes y, por tanto, se emplean indistintamente a lo largo de
la descripción.
El experto en la materia entiende que las
sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no
criticas para la funcionalidad de la proteína observadas al comparar
las secuencias de la proteína S12 de distintas cepas de
Thermus spp., son mutaciones evolutivamente neutras que no
afectan a su estructura global ni a su funcionalidad. Por tanto, la
proteína S12* de T. thermophilus codificada por el
polinucleótido de la invención puede contener "mutaciones
conservativas" sin que ello altere su capacidad funcional. La
capacidad de conferir dependencia a estreptomicina puede ser
evaluada mediante un ensayo similar al descrito en el Ejemplo 2 a
partir de la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína
funcionalmente equivalente a ensayar.
En una realización particular, el polinucleótido
de la invención está constituido por la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEQ ID NO: 2 [gen rpsL mutado (gen rpsL*) de T.
thermophilus]. Dicha SEQ ID NO: 2 corresponde a una variante del
gen rpsL de T. thermophilus que contiene los nucleótidos que
codifican las mutaciones en las posiciones 47 y 57 de la SEQ ID NO:
1. La secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 puede
verse en la Figura 6 (secuencia subrayada) con respecto al gen
silvestre.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un ácido nucleico, en adelante, ácido nucleico de la invención, que
comprende el polinucleótido de la invención. Dicho ácido nucleico
puede estar comprendido dentro de una construcción génica, donde
puede estar acompañada de otras secuencias de ácido nucleico tales
como secuencias reguladoras de la expresión, secuencias que
codifiquen marcadores de selección, orígenes de replicación,
etc.
Por tanto, en otro aspecto la invención se
relaciona con una construcción génica, de aquí en adelante,
construcción génica de la invención, que comprende el ácido nucleico
de la invención.
En una realización particular, la construcción
génica de la invención comprende, además, un marcador de selección.
Los marcadores de selección son ampliamente conocidos en el estado
de la técnica. Estos marcadores de selección o genes de selección
pueden ser genes de resistencia antibióticos, genes reporteros, como
el gen que codifica la beta-galactosidasa del
operón lactosa, etc...
Por tanto, en otra realización particular, la
invención se relaciona con una construcción génica de la invención,
donde dicha construcción comprende, además, un marcador de
selección y dicho marcador de selección es un gen de
resistencia.
En el estado de la técnica existen múltiples
genes de resistencia que pueden ser empleados en la construcción
génica de la invención. Los genes de resistencia más habituales son
aquellos que proporcionan resistencia a antibióticos, es decir,
permiten al organismo que expresa dichos genes sobrevivir en
presencia del antibiótico en cuestión. Ejemplos de dichos genes de
resistencia a antibióticos son, por ejemplo, genes de resistencia a
beta-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, etc),
a eritromicina, a kanamicina, a neomicina, a gentamicina etc. Entre
las penicilinas podemos encontrar, entre otros, bencilpenicilina,
ampicilina, amoxicilina, etc. Adicionalmente, si se desea, dichos
genes de resistencia a antibióticos pueden ser genes de resistencia
termoestables con la finalidad de que puedan expresarse
adecuadamente en Thermus spp. Un ejemplo de gen de
resistencia termoestable es, por ejemplo, el gen quimérico de
resistencia termoestable a kanamicina (Moreno, R., 2004. Clonaje de
enzimas termoestables de interés biotecnológico y desarrollo de
herramientas para su expresión en Thermus thermophilus. Tesis
Doctoral. Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias).
Así, en una realización particular, la
construcción de la invención comprende, además, el gen quimérico de
resistencia termoestable a kanamicina.
Por otro lado, la construcción de la invención
puede contener un origen de replicación funcional en Thermus
spp. que permita a dicha construcción, cuando es insertada en un
vector adecuado, replicarse dentro de una bacteria del género
Thermus spp. Por tanto, en otra realización particular, la
construcción de la invención comprende un origen de replicación en
Thermus spp. Las distintas técnicas y procedimientos de
obtención de construcciones génicas pueden encontrarse en Sambrook y
cols., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual",
3^{red} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol.
1-3.
El polinucleótido de la invención o el ácido
nucleico de la invención o la construcción génica de la invención,
puede estar contenido dentro de un vector apropiado para su clonaje
en una célula huésped. Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un vector, en adelante vector de la invención, que
comprende un polinucleótido, un ácido nucleico o una construcción
génica según la presente invención. Como entiende el experto en la
materia, dicho vector puede contener, entre otras cosas, sitios de
clonaje múltiple para insertar genes de interés, secuencias
reguladoras de la expresión y orígenes de replicación adecuados a la
célula huésped donde se va a introducir el vector.
Por tanto, la invención se relaciona en otro
aspecto con una bacteria del género Thermus spp., en
adelante bacteria de la invención, que comprende el polinucleótido,
el ácido nucleico, la construcción génica o el vector de la
invención.
En una realización particular, dicha bacteria
del género Thermus spp. se selecciona entre, T.
brockianus, T. scotoductus, T. filiformis, y T. oshimai,
preferentemente, T. thermophilus y T. aquaticus.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición que comprende las bacterias de la invención. Dicha
composición contiene todos los componentes necesarios para mantener
la viabilidad de las bacterias, tales como reguladores del pH,
nutrientes, etc.
Los diferentes usos del polinucleótido, el ácido
nucleico, la construcción génica y el vector de la invención
constituyen aspectos inventivos adicionales.
Dichos polinucleótido, ácido nucleico,
construcción génica y vector de la invención pueden emplearse como
un marcador de selección termoestable para su empleo en bacterias
del género Thermus spp. Dicho marcador de selección
termoestable permite, cuando se introduce en una bacteria del
género Thermus spp., seleccionar aquellas bacterias que
contengan dicho marcador. Si dicho marcador se introduce en una
célula bacteriana del género Thermus spp. junto con un gen
que codifica una proteína de interés, entonces dicho marcador
permite la selección de las bacterias que hayan introducido el gen
que codifica la proteína de interés.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con el empleo del polinucleótido, el ácido nucleico o la
construcción génica de la invención como marcador de selección
termoestable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo del polinucleótido, el ácido nucleico, la construcción
génica o el vector de la invención para proporcionar un fenotipo
estreptomicina dependiente a una bacteria termófila del género
Thermus spp.
Por tanto, en un aspecto la invención se
relaciona con un método para proporcionar un fenotipo
estreptomicina dependiente a una bacteria termófila del género
Thermus spp. que comprende el empleo del polinucleótido, el
ácido nucleico, la construcción génica o el vector de la invención.
Brevemente, dicho método consiste en introducir el polinucleótido,
el ácido nucleico, la construcción génica o el vector de la
invención, mediante cualquiera de las técnicas conocidas por el
experto en la materia, por ejemplo, mediante transformación, en una
bacteria del género Thermus spp. Cuando dicho
polinucleótido, ácido nucleico, construcción génica o vector de la
invención se expresa adecuadamente en dicha bacteria, ésta adquiere
un fenotipo estreptomicina dependiente. Los distintos
procedimientos de introducir material genético en una célula se
describen ampliamente en la literatura científica, tal como
Sambrook y cols. (citado at supra).
En una realización particular, bacteria
termófila del género Thermus spp. pertenece a las especies
T. thermophilus, T. aquaticus, T. brockianus, T. scotoductus, T.
filiformis y T. oshimai.
Una de las principales aplicaciones de la
materia descrita en la presente invención es la producción de
proteínas de interés industrial en especies del género
Thermus spp. Tal como se ha indicado en los antecedentes de
la invención, existen una gran cantidad de proteínas termófilas de
interés industrial cuya especial estructura hace necesario emplear
como factoría celular (o célula huésped) para su producción, el
organismo termófilo del que procede dicha proteína termófila en
lugar de los organismos modelos habituales, tales como E.
coli o S. cerevisiae. Como entiende el experto en la
materia, el clonaje del gen que codifica la proteína de interés
debe efectuarse a través de un plásmido o vector apropiado a la
célula que va a ser empleada como factoría celular, por lo que si
se va emplear como factoría celular un organismo termófilo, tal como
Thermus spp., el plásmido diseñado para tal fin debe ser
termoestable, es decir, tiene que ser funcional a las temperaturas
a las que se desarrollan dichos microorganismos termófilos, las
cuales se encuentran entre los 40ºC y 85ºC. En el diseño de dichos
plásmidos se pueden incluir orígenes de replicación, secuencias
reguladoras de la expresión, secuencias de recombinación homólogas,
etc. o marcadores de selección que permitan seleccionar la bacteria
que ha incorporado el gen que codifica para la proteína de
interés.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona el empleo de un polinucleótido, un ácido nucleico o una
construcción génica de la invención en el diseño de un plásmido
termoestable para expresar genes de interés en una bacteria
termófila del género Thermus spp.
Análogamente, la invención se relaciona con un
método para el diseño de un plásmido termoestable para expresar
genes de interés en una bacteria termófila del género
Thermus spp., que comprende el empleo del polinucleótido, el
ácido nucleico o la construcción génica de la invención.
Brevemente, dicho método consiste en insertar el polinucleótido, el
ácido nucleico o la construcción génica de la invención en un
plásmido, convirtiendo a dicho plásmido en un plásmido termoestable
para expresar un gen de interés en una bacteria termófila del
género Thermus spp. Los distintos procedimientos de insertar
material genético en un plásmido son ampliamente conocidos por el
experto en la materia y se recogen en la literatura científica, tal
como Sambrook y cols. (citado at supra).
En una realización particular, dicho plásmido
termoestable es un plásmido integrativo o replicativo. La selección
del tipo de plásmido, replicativo o integrativo, para la donación
del gen que codifica la proteína de interés dependerá de la
finalidad.
En la presente descripción, se entiende por
plásmido integrativo aquel plásmido que recombina con zonas
homólogas del genoma de las células que sirven como factoría
celular asegurando así la mayor estabilidad del plásmido, y por
plásmido replicativo aquel que puede replicarse en la célula que
sirve como factoría celular aumentando así el número de copias de
dicho plásmido.
Los vectores replicativos están dirigidos,
esencialmente, a una mayor producción de proteína al encontrarse el
gen que codifica dicha proteína en multicopia, como se muestra en
el Ejemplo 4.
Los vectores o plásmidos integrativos son útiles
para expresar genes desde copia única en el cromosoma, algo útil
para estudios de complementación de mutaciones (Ejemplo 5 que
acompaña a la presente descripción), o para trabajos de
estabilización de enzimas mesófilas mediante selección térmica o
para el aislamiento de mutantes de deleción "limpios" mediante
retrorecombinación, como se muestra en el Ejemplo 6 que acompaña a
la presente descripción.
Son muchas las bacterias del género
Thermus spp. que pueden servir como factoría celular para la
producción de proteínas de interés de origen termófilo. En una
realización particular, dicha bacteria termófila del género
Thermus spp. pertenece a las especies T. thermophilus, T.
aquaticus, T. brockianus, T. scotoductus, T. filiformis y T.
oshimai.
Las proteínas de interés industrial procedentes
de bacterias termófilas son muy numerosas y tienen amplias
aplicaciones tanto en la industria como en técnicas de biología
molecular. Dichas proteínas de interés son codificadas por lo que en
esta descripción se ha denominado "gen de interés". En una
realización particular de la invención, el gen de interés codifica
una proteína de interés, preferentemente, una enzima. De especial
interés son las enzimas termoestables "Taq" ADN polimerasa,
aldolasa, numerosas proteasas, lipasas, pululanasas, alfa y beta
glucosidasas, galacturonasas, esteraras, fosfatasas, alcohol
deshidrogenasas, enzimas de modificación de ADN o ARN (Lioliou y
cols., 2004, Thermus thermophilus genome analysis: benefits
and implications, Microbial Cell Factories, 3:1-5;
Bruins y cols., Thermozymes and their applications: a review of
recent literature and patents Appl Biochem Biotechnol. 2001
Feb;90(2):155-86).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para producir una proteína de interés en bacterias
termófilas del género Thermus spp. que comprende
- a)
- introducir el gen que codifica dicha proteína de interés en una construcción génica o en un vector según la presente invención, bajo el control de un promotor,
- b)
- transformar células del género Thermus spp. con la construcción génica o el vector obtenido en la etapa (a),
- c)
- seleccionar las colonias transformantes sobre placas que contienen estreptomicina, y
- d)
- incubar las células obtenidas a partir de las colonias transformantes de la etapa (c) bajo condiciones apropiadas para expresar el gen de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos sobre cómo introducir genes en
construcciones génicas o vectores y cómo transformar células con
construcciones génicas o vectores, están ampliamente descritos en
el estado de la técnica y son conocidos por el experto en la
materia. Asimismo, el gen que codifica la proteína de interés debe
estar bajo el control de un promotor, o secuencia reguladora, que
permita de forma adecuada la expresión de dicho gen en una célula
del género Thermus spp.
La selección de las colonias transformantes
según se especifica en el apartado (c) se lleva a cabo sobre placas
que contienen estreptomicina en una concentración suficiente,
preferentemente entre 10 y 500 mg/L, para poder diferenciar las
colonias transformantes de las que no lo son. En particular, una
concentración preferida de estreptomicina para este propósito es
100 mg/L tal como se emplea en los Ejemplos que acompañan a la
presente descripción.
Una vez seleccionadas las colonias
transformantes, el método implica incubar las células obtenidas a
partir de dichas colonias transformante bajo condiciones apropiadas
para expresar el gen de interés, es decir, incubar las células con
la temperatura, pH, nutrientes, etc. adecuadas para que la célula
pueda crecer y desarrollarse y, como consecuencia, se exprese el
gen de interés. Por ejemplo, la temperatura puede estar
comprendida, aproximadamente, entre 40ºC y 85ºC.
Otra de las aplicaciones que presenta la materia
descrita en la invención, es decir, el polinucleótido, el ácido
nucleico, la construcción génica o el vector de la invención, es la
obtención de mutantes de deleción dirigida de genes específicos en
bacterias termófilas del género Thermus spp., tal como se
muestra en el Ejemplo 6 que acompaña a la presente descripción.
La obtención de mutantes de deleción dirigida de
genes específicos es útil en la obtención de cepas donde se han
eliminado actividades no deseadas en procesos de bioconversión, o
en donde se quiera sustituir un gen termoestable por otro procedente
de un organismo mesófilo con idea de termoestabilizar éste mediante
un proceso de selección funcional a temperaturas crecientes. Un
ejemplo paradigmático fue publicado por Tamakoshi y cols. en 2001
(Selection of stabilized 3-isopropylmalate
dehydrogenase of S. cerevisiae using the
host-vector system of an extreme thermophile,
Thermus thermophilus, Extremophiles, 5:
17-229) quienes mostraron la posibilidad de
seleccionar formas termoestables de la 3-isopropil
malato deshidrogenasa de S. cerevisiae mediante la
complementación a temperaturas crecientes de un mutante leuB de
T. thermophilus que previamente habían obtenido por selección
genética.
Por tanto, en otro aspecto, la presente
invención se relaciona con el empleo del vector de la invención
para obtener un mutante de deleción dirigida de un gen específico
en una bacteria termófila del género Thermus spp.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para obtener un mutante de deleción dirigida un gen
específico en una bacteria termófila del género Thermus spp.
que comprende
- a)
- introducir las regiones que flanquean el gen diana a eliminar de dicha bacteria termófila en una construcción o en un vector según la presente invención,
- b)
- transformar dicha bacteria termófila con la construcción o el vector obtenido en la etapa (a),
- c)
- seleccionar las colonias transformantes sobre placas que contienen estreptomicina,
- d)
- resuspender las colonias seleccionadas en la etapa (c) y extenderlas sobre un medio de cultivo carente de estreptomicina, y
- e)
- identificar por métodos genéticos el mutante de deleción de entre las colonias obtenidas en la etapa (d).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo ilustrativo de cómo llevar a cabo
dicho método se recoge en el Ejemplo 6, donde el gen a eliminar en
una bacteria termófila del género Thermus spp. es el gen
narC de T. thermophilus, que codifica un citocromo c de
localización periplasmática necesario para la síntesis de nitrato
reductasa. Como entiende el experto en la materia, después de
transformar una bacteria termófila del género Thermus spp.
con una construcción génica o un vector según se define en la etapa
(a) del presente método, es necesario cultivar dicha bacteria
termófila transformada el tiempo suficiente (de 1 a 4 horas) para
permitir la recombinación homóloga entre una construcción o un
vector según la presente invención que contiene las regiones que
flanquean el gen diana a eliminar y el genoma de la bacteria
termófila que se ha transformado.
Análogamente al método descrito en la presente
invención para producir una proteína de interés, en el método para
obtener mutantes de deleción dirigida de genes, la selección de las
colonias transformantes se lleva a cabo sobre placas que contienen
estreptomicina en una concentración suficiente, preferentemente
entre 10 y 500 mg/L, para poder diferenciar las colonias
transformantes de las que no lo son. En particular, una
concentración preferida de estreptomicina para este propósito es 100
mg/L tal como se emplea en los Ejemplos que acompañan a la presente
descripción.
En la presente descripción, se entiende por
métodos genéticos todos aquellos métodos empleados en ingeniería
genética y biología molecular que permiten identificar y, por
tanto, distinguir, un genoma de otro. Ejemplos de dichos métodos
genéticos son, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), la hibridación con sondas radiactivas específicas del gen
sobre fragmentos de restricción separados mediante electroforesis
(Southern Blot), la utilización de sondas radiactivas específicas
del gen sobre colonias individuales, etc. En la presente invención,
el método genético seleccionado para identificar el mutante de
deleción de entre las colonias de la etapa (d) del presente método,
es PCR de ADN genómico.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no pretenden limitar el contenido de la misma.
En los Ejemplos que acompañan a esta descripción
se utilizaron los materiales y métodos que se describen a
continuación.
En la realización de los siguientes ejemplos se
empleó la cepa silvestre de Thermus thermophilus HB27 [Koyama
Y. y cols., 1986. Genetic transformation of the extreme thermophile
Thermus thermophilus and of other Thermus spp. J.
Bacteriol. Vol. 166: 338-340,], la cepa Thermus
thermophilus mutante para el gen phoA [Moreno, R., 2004.
Clonaje de enzimas termoestables de interés biotecnológico y
desarrollo de herramientas para su expresión en Thermus
thermophilus. Tesis Doctoral. Universidad Autónoma de Madrid] y
la cepa anaerobia facultativa Thermus thermophilus HB27::nar
(Ramírez-Arcos y cols, 1988, Anaerobic Growth, a
Property Horizontally Transferred by an Hfr-Like
Mechanism among Extreme Thermophiles. Journal of Bacteriology, 180:
3137-3143).
La cepa de E. coli DH5\alpha (supE44
\DeltalacU169 (ø80 lacZ\DeltaAM15) hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1) [Hanahan, D. Studies on
transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. Vol.
166, 557-580, 1983] se empleó para la obtención de
los plásmidos pS18a y pMS18 y de sus derivados.
Las cepas de Thermus spp. fueron
cultivadas en medio TB compuesto de: 8 g/L de Tripticasa de la casa
Becton Dickinson and Company (BD, Ref 211921), 4 g/L de extracto de
levadura (BD, Ref: 212750), 3 g/L de NaCl (Merck), ajustado a pH 7,5
con NaOH. Para preparar medio sólido se añadió a este medio 15 g/L
de agar 7,5 (PRONADISA). Cuando fue necesario, se añadieron a los
medios de cultivo estreptomicina (10-500 mg/L) o de
kanamicina (20-100 mg/L).
E. coli se cultivó en medio LB (Lennox,
E. X. 1955. Transduction of linked genetic characters of the host
by bacteriophage P1. Virology. Vol. 1:133-141), o en
su forma solidificada por adición de agar (15 g/L). Para la
selección de plásmidos se añadió ampicilina (100 mg/L) a estos
medios.
Las enzimas de restricción, de la casa comercial
Fermentas, empleadas en los ejemplos que ilustran la presente
invención fueron las siguientes: NdeI [clonaje del gen rpsL*]; XbaI
y HindIII (clonaje del gen bgaA); y XhaI y HindIII (clonaje del gen
phoA).
Los vectores empleados para la construcción de
los plásmidos integrativos o replicativos descritos en la presente
invención fueron los plásmidos pUC18 y pUC19 de Escherichia
coli (Viera y Messing, 1982. The pUC plasmids, an
M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and
sequencing with synthetic universal primers. Gene. Vol.
19:259-269), el vector pMK18 (Grado y cols. 1999. A
high-transformation-efficiency
cloning vector for Thermus thermophilus. Plasmid. Vol.
42:241-245), el vector pMKEbgaA (Moreno y cols.
2003. Development of a gene expression vector for Thermus
thermophilus based on the promoter of the respiratory nitrate
reductase. Plasmid. Vol. 49:2-8) y el plásmido
pMKEphoA (Moreno y cols. 2003, citado supra).
El número de copia por célula de los plásmidos
replicativos se comparó con el de pMK18 mediante extracción y
análisis de la concentración extraída de una cantidad equivalente
de células de T. thermophilus HB27 transformadas con cada uno
de ellos.
Las cepas de Thermus thermophilus se
transformaron mediante competencia natural según lo descrito en
Koyama y cols. 1986. [Koyama y cols., 1986. Genetic transformation
of the extreme thermophile Thermus thermophilus and other
Thermus spp. J. Bacteriol. Vol.
166:338-340].
E. coli se transformó empleando el método
descrito por Hanahan, D. 1983 [Hanahan, D., 1983. Studies on
transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. Vol.
166: 557-580].
El gen rpsL* fue secuenciado por métodos
automáticos basados en la utilización de dideoxinucleótidos en un
secuenciador de Applied Biosystems. La presencia de las mutaciones
en la secuencia de aminoácidos fue deducida de la secuencia de
ADN.
La actividad termoestable
\beta-galactosidasa producto del gen bgaA empleada
en los Ejemplos 3 y 4 se midió a 70ºC en la fracción soluble de
células rotas mediante sonicación según se describe en Moreno y
cols. 2002 [Moreno y cols., 2002. Development of a gene expression
vector for Thermus thermophilus based on the promoter of the
respiratory nitrate reductase. Plasmid. Vol.
49:2-8,] sobre el sustrato cromogénico
o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG). La actividad fosfatasa alcalina empleada en el Ejemplo 5 se
midió sobre fracciones solubles empleando el sustrato
p-nitrofenil-fosfato. La reacción se
llevó a cabo a 70ºC en tampón Tris-HCl 100 mM, pH
10. La actividad de ambas enzimas, medida como la cantidad necesaria
para transformar 1 \mumol de sustrato por minuto, fue normalizada
con respecto a la masa celular para efectuar las comparaciones
entre muestras del mismo ensayo.
El gen de dependencia a estreptomicina se obtuvo
mediante el aislamiento de mutantes espontáneos de la cepa
Thermus thermophilus HB27. Para ello, se llevó a cabo la
extensión de cultivos densos de dicha cepa sobre placas de medio
nutritivo conteniendo 100 mg/L del antibiótico estreptomicina, y se
obtuvieron preparaciones de ADN total de 10 de ellos. El gen rpsL*
que codifica la proteína S12* de cada uno de estos mutantes se
amplificó mediante la técnica de amplificación en cadena de la
polimerasa (PCR) con los cebadores O-str1 (SEQ ID
NO: 3) y O-str2 (SEQ ID NO: 4).
Cantidades idénticas de los fragmentos de ADN
así amplificados se emplearon individualmente para transformar
mediante competencia natural (Koyama y cols. 1986. Genetic
transformation of the extreme thermophile Thermus
thermophilus and other Thermus spp. J. Bacteriol.
166:338-340) la cepa parental de Thermus
thermophilus HB27 sensible a estreptomicina, y se seleccionaron
aquellas cepas capaces de generar mayor número de colonias sobre
placas de medio nutritivo conteniendo 100 mg/L de estreptomicina.
Estas colonias se replicaron en placas con y sin estreptomicina,
seleccionando aquellas que contenían el gen rpsL mutado (gen rpsL*)
[SEQ ID NO: 2] cuya presencia impedía el crecimiento en ausencia de
estreptomicina. Su traducción a proteína [SEQ ID NO: 1] presenta
dos cambios de aminoácidos, lisina 46 por arginina (K46R) y lisina
56 por ácido glutámico (K56E), con respecto la secuencia
correspondiente al gen natural presente en la cepa parental
(ProteinBank (NCBI), YP_005302).
El gen arriba descrito objeto de esta invención
(gen rpsL*) fue integrado en la diana NdeI de los plásmidos pUC18 y
pUC19 de Escherichia coli para generar los vectores pS18a y
pS19a respectivamente (Figura 1). Dichos vectores se pueden replicar
en Escherichia coli, donde confieren resistencia a
beta-lactámicos, pero no pueden replicar en
Thermus spp., donde sin embargo pueden conferir dependencia
de estreptomicina mediante su inserción en el cromosoma a través de
los mecanismos de recombinación homóloga.
Para obtener un plásmido que replicara en
Thermus ssp., se amplificó por PCR la secuencia de ADN
correspondiente al origen de replicación autónoma del vector pMK18
mediante los cebadores O-repnde2d (SEQ ID NO: 5) y
O-repnder (SEQ ID NO: 6), y el producto de
amplificación se clonó en derivados de los vectores pS18a y pS19a
poseedores de una única diana de restricción NdeI, dando lugar a los
vectores pMS18 y pMS19 respectivamente (Figura 2). Éstos son
capaces de replicar en Escherichia coli, confiriendo
resistencia a \beta-lactámicos, y también en
Thermus spp., donde generan dependencia de estreptomicina.
El número de copia por célula de los plásmidos replicativos es
similar al descrito para el plásmido pMK18, según se deduce de la
comparación de las concentraciones respectivas obtenidas a partir
del mismo número de células transformadas.
Cultivos en fase exponencial de la cepa
Thermus thermophilus HB27 crecida hasta una densidad óptica
(OD) a 550 nm de 0,5 (espectómetro Hitachi U-2000),
se transformaron con cantidades idénticas (200 ng) de los plásmidos
pS18a y pMS18, disponiéndose también de controles no transformados.
Tras un periodo de incubación de 4 horas a 70ºC con agitación, 100
\muL de cada transformación se extendieron sobre placas de medio
nutritivo para Thermus ssp. conteniendo concentraciones
crecientes de estreptomicina (100, 200, 300, 400, 500 y 600 mg/L).
Las placas se incubaron a 70ºC durante 48 horas, antes de proceder
al contaje del número de colonias crecidas en cada una de ellas.
Los resultados obtenidos, que se muestran en la Figura 3, confirman
que la transformación con los plásmidos pS18a y pMS18 genera un
número de colonias en placas conteniendo 100 mg/L de estreptomicina
entre 30 y 300 veces superior al de mutantes espontáneos que
aparecen en las placas control. Cuando un número representativo de
colonias (300 aproximadamente) resultantes de cada transformación
se resuspendió hasta una OD a 550 nm de 0,5 en medio TB sin
estreptomicina, y extendido posteriormente sobre placas sin el
antibiótico, se detectó un número inferior a 10 colonias tras un
periodo de incubación de 48 horas a 70ºC, mientras que apareció un
césped bacteriano cuando se extendió un control equivalente de
células no transformadas. Estos resultados muestran la alta
eficiencia del gen empleado en los vectores para ser seleccionados
en presencia de estreptomicina y producir una fuerte dependencia de
este antibiótico para crecer.
El gen bgaA codifica una
beta-galactosidasa termoestable procedente de la
cepa Thermus spp. ATCC 27737 que se puede expresar en
Thermus thermophilus HB27::nar desde el vector pMKEbgaA
(Moreno y cols., 2002, citado supra). Utilizando las enzimas
de restricción XbaI y HindIII, el gen bgaA unido al promotor
inducible por nitrato y anoxia del vector pMKEbgaA fue insertado en
las dianas equivalentes del plásmido pS18a y la construcción
resultante, denominada pS18bgaA, fue empleada para transformar la
cepa silvestre Thermus thermophilus HB27 y se crecieron en
placas de medio nutritivo con estreptomicina, seleccionando
derivados dependientes de estreptomicina por inserción del plásmido
en el cromosoma. Tras el proceso de inducción se comprobó que las
cepas dependientes de estreptomicina que habían incorporado el
plásmido eran capaces de expresar entre 6 y 10 veces más actividad
beta-galactosidasa termoestable que la cepa parental
transformada con el plásmido pS18a como control (Figura 4).
Utilizando la misma estrategia explicada en el
ejemplo anterior, el gen bgaA y su promotor inducible fueron
donados en el plásmido pMS18 y la construcción resultante,
denominada pMS18bgaA, se empleó para transformar la cepa silvestre
Thermus thermophilus HB27::nar. Los transformantes que
crecieron en placas de medio nutritivo con estreptomicina
presentaron tras el proceso de inducción una actividad
beta-galactosidasa 20 a 30 veces superior a la de la
estirpe silvestre transformada con el plásmido pMS18 como control
(Figura 4).
Hasta ahora, la obtención dirigida de mutantes
de inserción en Thermus spp. ha empleado la kanamicina como
único marcador de selección, haciendo al receptor resistente a este
antibiótico, y limitando posibles manipulaciones ulteriores por la
limitación de marcadores genéticos termoestables aplicables a alta
temperatura. Al actuar la kanamicina sobre la síntesis de proteínas
(al igual que el gen rpsL) modificando los ribosomas, existía la
posibilidad de que se produjera un cierto fondo de resistencia a
estreptomicina en los mutantes resistentes a la kanamicina. Para
descartar dicha posibilidad, se procedió a insertar el gen phoA en
un fondo genético phoA::kat resistente a kanamicina.
El gen phoA codifica una fosfatasa hiperalcalina
termoestable de Thermus thermophilus (Castán y cols., 2002.
The periplasmic space in Thermus thermophilus: evidences
from a regulation-defective S-layer
mutant overexpressing an alkaline phosphatase. Extremophiles. Vol.
6:225-232) que fue donada y expresada bajo el
control de un promotor inducible por anoxia en el plásmido
pMKEphoA.
Este gen, y el promotor que lo controla en
pMKEphoA, fueron donados tanto en pS18a como en pMS18 empleando las
enzimas de restricción XhaI y HindIII Las construcciones
resultantes, pS18phoA y pMS18phoA se emplearon después para
transformar una cepa de Thermus thermophilus mutante en este
gen por inserción del gen quimérico de resistencia termoestable a
kanamicina (Moreno, R., 2004. Clonaje de enzimas termoestables de
interés biotecnológico y desarrollo de herramientas para su
expresión en Thermus thermophilus. Tesis Doctoral.
Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias). Las colonias
que crecieron sobre placas de medio nutritivo con estreptomicina
fueron sometidas a ensayo de la actividad con el sustrato
cromogénico para-nitrofenil fosfato a 80ºC y pH 11
tras un proceso de inducción estándar por nitrato y anoxia. Los
resultados, que se describen en la Figura 5, demuestran que ambas
construcciones recuperan similares niveles de actividad fosfatasa
hiperalcalina, lo que demuestra que pueden ser incorporadas a
Thermus spp. mediante el gen de dependencia a
estreptomicina, independientemente del hecho de que la cepa
receptora sea ya resistente a kanamicina, un antibiótico que, al
igual que la estreptomicina, actúa inhibiendo la síntesis de
proteínas de las bacterias.
En el presente ejemplo se ha obtenido un mutante
de deleción completa del gen narC, codificante de un citocromo C de
localización periplásmica necesario para la síntesis de la nitrato
reductasa respiratoria de Thermus thermophilus (Zafra y
cols., 2002. A cytochrome c encoded by the nar operon is
required for the synthesis of active respiratory nitrate reductase
in Thermus thermophilus. FEBS Letters. Vol.
523:99-102), y pretende ilustrar la utilización del
gen de dependencia de estreptomicina objeto de la presente
invención para el aislamiento dirigido de un mutante de deleción sin
que quede huella genética alguna de los sistemas empleados para su
obtención.
Para ello, el gen narC fue eliminado mediante
PCR inversa de un fragmento KpnI-KpnI de 1768 pb
religado procedente del plásmido pNIT3
(Ramírez-Arcos, S., Caracterización y transferencia
natural de una nitrato reductasa de Thermus thermophilus HB8,
Tesis Doctoral, Universidad Autónoma de Madrid, 1997), empleando
para ello los cebadores onarGNdeD (SEQ ID NO: 7 y OcitcNdeR (SEQ ID
NO: 8). El producto obtenido fue digerido con la enzima NdeI y
religado para obtener una forma circular, que fue posteriormente
digerida con la enzima KpnI y donada en el vector pUC19 previamente
digerido con la misma enzima. Una vez amplificado el vector así
obtenido, se extrajo de él un fragmento de 977 pb mediante digestión
con KpnI, que fue donado en el vector pS18a tras la digestión de
éste con la misma enzima. La construcción resultante se utilizó
para transformar la cepa silvestre Thermus thermophilus
HB27::nar, seleccionándose aquellas colonias que crecieron en placas
de medio nutritivo con estreptomicina. Estas colonias fueron
resuspendidas en medio sin estreptomicina, incubadas durante 2
horas a 70ºC, y extendidas sobre placas de medio nutritivo sin
dicho antibiótico. Todas las colonias ensayadas que crecieron en
estas condiciones habían perdido el vector, encontrando que
aproximadamente el 50% de ellas presentaban el gen narC original,
mientras que el otro 50% resultaron ser mutantes de deleción
completa de éste. De esta forma se demuestra que el crecimiento en
medios sin antibióticos sólo es posible en cepas en las que el gen
objeto de la presente invención ha sido eliminado mediante procesos
de recombinación genética.
<110> Universidad Autónoma de Madrid
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo marcador de selección
termoestable para la manipulación genética de Thermus
spp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 135
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<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 405
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<212> ADN
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<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador O-str1
diseñado para amplificar el gen rpsL
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador O-str2
diseñado para amplificar el gen rpsL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador O-repnde2d
diseñado para amplificar la secuencia de ADN correspondiente al
origen de replicación autónoma del vector pMK18.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador O-repnder
diseñado para amplificar la secuencia de ADN correspondiente al
origen de replicación autónoma del vector pMK18.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador onarGNdeD diseñado para
eliminar mediante PCR inversa el gen narC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador OcitcNdeR diseñado para
eliminar mediante PCR inversa el gen narC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (22)
1. Un polinucleótido aislado constituido por la
secuencia de nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de
aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1, o una proteína
funcionalmente equivalente.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1,
cuya secuencia de nucleótidos está constituida por la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
3. Un ácido nucleico que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.
4. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 3.
5. Construcción según la reivindicación 4, donde
dicha construcción génica comprende, además, un marcador de
selección.
6. Construcción según la reivindicación 5, donde
dicho marcador de selección es un gen de resistencia.
7. Construcción según la reivindicación 6, donde
dicho gen de resistencia es el gen quimérico de resistencia
termoestable a kanamicina.
8. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, donde dicha construcción comprende, además,
un origen de replicación en Thermus spp.
9. Un vector que comprende un polinucleótido
según la reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la
reivindicación 3 o una construcción génica según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8.
10. Una bacteria del género Thermus spp.
que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, un
ácido nucleico según la reivindicación 3, una construcción génica
según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un vector según la
reivindicación 9.
11. Bacteria según la reivindicación 10, en
donde dicha bacteria del género Thermus spp. se selecciona
entre T. brockianus, T. scotoductus, T. filiformis y T.
oshimai, preferentemente, T. thermophilus y T.
aquaticus.
12. Una composición que comprende bacterias
según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.
13. Empleo de un polinucleótido según la
reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3,
una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4
a 8, como marcador de selección termoestable.
14. Empleo de un polinucleótido según la
reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3,
una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4
a 8, o un vector según la reivindicación 9, para proporcionar un
fenotipo estreptomicina dependiente a una bacteria termófila del
género Thermus spp.
15. Empleo de un polinucleótido según la
reivindicación 1 ó 2, un ácido nucleico según la reivindicación 3,
una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 4
a 8, para el diseño de un plásmido termoestable para expresar un
gen de interés en una bacteria termófila del género Thermus
spp.
16. Empleo según la reivindicación 15, en donde
dicho plásmido es integrativo o replicativo.
17. Empleo de un vector según la reivindicación
9, para obtener un mutante de deleción dirigida de un gen
específico en una bacteria termófila del género Thermus
spp.
18. Empleo según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en donde dicha bacteria termófila del
género Thermus spp. pertenece a las especies T.
thermophilus, T. aquaticus, T. brockianus, T. scotoductus, T.
filifbrmis y T. oshimai.
19. Empleo según cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, donde el gen de interés codifica una
proteína, preferentemente, una enzima.
20. Un método para producir una proteína de
interés en bacterias termófilas del género Thermus spp. que
comprende
- a)
- introducir el gen que codifica dicha proteína de interés en una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o en un vector según la reivindicación 9 bajo el control de un promotor
- b)
- transformar células del género Thermus spp. con la construcción génica o el vector obtenido en la etapa (a),
- c)
- seleccionar las colonias transformantes sobre placas que contienen estreptomicina, y
- d)
- incubar las células obtenidas a partir de las colonias transformantes de la etapa (c) bajo condiciones apropiadas para expresar el gen de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Un método para obtener un mutante de
deleción dirigida de un gen específico en una bacteria termófila
del género Thermus spp. que comprende
- a)
- introducir las regiones que flanquean el gen diana a eliminar de dicha bacteria termófila en una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o en un vector según la reivindicación 9,
- b)
- transformar dicha bacteria termófila con la construcción o el vector obtenido en la etapa (a),
- c)
- seleccionar las colonias transformantes sobre placas que contienen estreptomicina,
- d)
- resuspender las colonias seleccionadas en la etapa (c) y extenderlas sobre medio de cultivo carente de estreptomicina, y
- e)
- identificar por métodos genéticos el mutante de deleción de entre las colonias obtenidas en la etapa (d).
\vskip1.000000\baselineskip
22. Una proteína aislada constituida por la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o una
proteína funcionalmente equivalente de la misma.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200603279A ES2323996B1 (es) | 2006-12-27 | 2006-12-27 | Nuevo marcador de seleccion termoestable para la manipulacion genetica de thermus spp. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200603279A ES2323996B1 (es) | 2006-12-27 | 2006-12-27 | Nuevo marcador de seleccion termoestable para la manipulacion genetica de thermus spp. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2323996A1 ES2323996A1 (es) | 2009-07-28 |
| ES2323996B1 true ES2323996B1 (es) | 2010-05-31 |
Family
ID=40852634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200603279A Active ES2323996B1 (es) | 2006-12-27 | 2006-12-27 | Nuevo marcador de seleccion termoestable para la manipulacion genetica de thermus spp. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2323996B1 (es) |
-
2006
- 2006-12-27 ES ES200603279A patent/ES2323996B1/es active Active
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
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| CARR, J.F. et al. Effects of Streptomycin Resistance Mutations on Posttranslational Modification of Ribosomal Protein S12. Journal of Bacteriology. Marzo 2006, Vol. 188, No. 5, páginas 2020-2023. * |
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| YAKHNIN, A.V. et al. Nucleotide Sequence of the Thermus Thermophilus HB8 rps12 and rps7 genes coding for the ribosomal proteins S12 and S7. Nucleic Acids research. 1990, Vol. 18, No. 12, página 3659. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2323996A1 (es) | 2009-07-28 |
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