ES2324401T3 - Composiciones y metodos para la deteccion de ehrlichia chaffeensis y de anticuerpos frente a ehrlichia canis. - Google Patents
Composiciones y metodos para la deteccion de ehrlichia chaffeensis y de anticuerpos frente a ehrlichia canis. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido aislado que consiste en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un anticuerpo anti-P30-1 de Ehrlichia.
Description
Composiciones y métodos para la detección de
Ehrlichia chaffeensis y de anticuerpos frente a Ehrlichia
canis.
La invención proporciona composiciones y métodos
para la detección y cuantificación de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpo frente a Ehrlichia canis y Ehrlichia
chaffeensis.
El género Ehrlichia son patógenos
intracelulares estrictos que infectan linfocitos circulantes en
huéspedes mamíferos. Ehrlichia canis y Ehrlichia
chaffeensis son miembros del mismo grupo de subgénero que
infectan a los cánidos y seres humanos y causan la ehrlichiosis
monocítica canina (EMC) y la ehrlichiosis monocítica humana (EMH),
respectivamente. La enfermedad canina se caracteriza por fiebre,
linfadenopatía, pérdida de peso y pancitopenia. En seres humanos,
la enfermedad de caracteriza por fiebre, dolor de cabeza, mialgia y
leucopenia. La detección y el tratamiento precoces son importantes
para tratar tanto la ehrlichiosis canina como la humana.
Se usan frecuentemente ensayos de
inmunofluorescencia indirecta (IFA) y ensayos de inmunoabsorción
ligados a enzimas (ELISA) como medios auxiliares en el diagnóstico
de estas enfermedades. Estos ensayos miden o detectan de otro modo
la unión de anticuerpos anti-Ehrlichia de suero, plasma o
sangre de un paciente a células, lisados celulares infectados o
proteínas purificadas de Ehrlichia. El documento WO 99/13720
da a conocer la proteína P30 de Ehrlichia canis y su uso
para diagnosticar ehrlichiosis. Sin embargo, los ensayos conocidos
actualmente para detectar anticuerpos anti-Ehrlichia o
fragmentos de los mismos son de utilidad gravemente limitada debido
a los problemas de sensibilidad y especificidad relacionados
directamente con la naturaleza impura del antígeno de
Ehrlichia usado en estas pruebas. Se necesitan reactivos
sumamente purificados para construir ensayos más precisos.
Es un objeto de la invención proporcionar
reactivos y métodos para detectar anticuerpos anti-Ehrlichia
canis y anticuerpos anti-Ehrlichia chaffeensis. Este y
otros objetos de la invención se proporcionan mediante una o más de
las realizaciones descritas a continuación.
Una realización de la invención proporciona una
composición que comprende un polipéptido aislado seleccionado del
grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de
aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un
anticuerpo anti-P30-1 de
Ehrlichia.
Otra realización de la invención proporciona una
composición de materia que comprende un polipéptido aislado
seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 y variantes
de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen
específicamente a un anticuerpo
anti-P30-1 de Ehrlichia, y
un portador.
Todavía otra realización de la invención
proporciona un método para detectar la presencia de anticuerpos
frente a Ehrlichia. El método comprende poner en contacto
uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en los
polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución
de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un
anticuerpo anti-P30-1 de
Ehrlichia, con una muestra de prueba que se sospecha que
comprende anticuerpos frente a Ehrlichia, en condiciones que
permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo. Se
detectan los complejos polipéptido/anticuerpo. La detección de
complejos polipéptido/anticuerpo es una indicación de que están
presentes anticuerpos frente a Ehrlichia en la muestra de
prueba.
Aún otra realización de la invención proporciona
un dispositivo que contiene uno o más polipéptidos seleccionados
del grupo que consiste en los polipéptidos mostrados en la SEQ ID
NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1
que se unen específicamente a un anticuerpo
anti-P30-1 de Ehrlichia, e
instrucciones para el uso del uno o más polipéptidos para la
identificación de una infección por Ehrlichia en un
mamífero.
Todavía otra realización de la invención
proporciona un artículo de fabricación que comprende material de
envasado y, contenidos dentro del material de envasado, uno o más
polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en los
polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución
de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un
anticuerpo anti-P30-1 de
Ehrlichia, y variante de los mismos. El material de envasado
comprende una etiqueta que indica que pueden usarse el uno o más
polipéptidos para la identificación de infección por
Ehrlichia en un mamífero.
Incluso otra realización de la invención
proporciona un método de diagnóstico de una infección por
Ehrlichia en un mamífero. El método comprende obtener una
muestra biológica de un mamífero que se sospecha que tiene una
infección por Ehrlichia, y poner en contacto uno o más
polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en los
polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución
de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un
anticuerpo anti-P30-1 de
Ehrlichia, con la muestra biológica en condiciones que
permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo. Se detectan
los complejos polipéptido/anticuerpo, siendo la detección de
complejos polipéptido/anticuerpo una indicación de que el mamífero
tiene una infección por Ehrlichia.
Otra realización de la invención proporciona un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a al menos un
epítopo de un polipéptido de Ehrlichia canis o Ehrlichia
chaffeensis seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID
NO:1.
Por tanto, la invención proporciona anticuerpos
y polipéptidos sumamente purificados para su uso en ensayos
precisos para la detección de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpo frente a Ehrlichia.
La invención proporciona reactivos sumamente
purificados para la detección de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpo frente a E. canis y E. chaffeensis. En
particular, la invención proporciona polipéptidos que tienen una
identidad de al menos el 85%, más preferiblemente una identidad de
al menos el 90% y todavía más preferiblemente una identidad de al
menos el 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de polipéptidos
mostrada en las SEQ ID NO:1-7. Véase la tabla 1.
Los polipéptidos que no comprenden una identidad del 100% con una
secuencia de polipéptidos mostrada en las SEQ ID
NO:1-7 se consideran "variantes", y se
consideran polipéptidos de la invención.
Se identificaron los péptidos de E. canis
usando la tecnología de presentación en fago determinando la
secuencia de aminoácidos unida mediante un anticuerpo monoclonal de
ratón (IIIH7) producido frente al antígeno nativo de E.
canis. Se usó el anticuerpo monoclonal IIIH7 para purificar por
afinidad péptidos de expresión en virus en una biblioteca de
presentación en fago PDH 10. Las secuencias o mimétopos unidos por
IIIH7 mostraron una fuerte homología de secuencia con proteínas de
la membrana externa de E. canis y E. chaffeensis. Las
proteínas de la membrana externa de ambas especies están
codificadas por una familia de genes polimórficos, lo que da como
resultado múltiples reproducciones de las proteínas.
Identidad significa similitud en la secuencia de
aminoácidos y tiene un significado reconocido en la técnica. Las
secuencias con identidad comparten aminoácidos idénticos o
similares, en las que los aminoácidos similares son preferiblemente
aminoácidos conservados. Los aminoácidos conservados son
aminoácidos que tienen cadenas laterales y propiedades (por
ejemplo, hidrófilas, hidrófobas, aromáticas) similares a los
aminoácidos codificados por la secuencia de referencia. Por tanto,
una secuencia candidata que comparte una identidad de la secuencia
de aminoácidos del 85% con una secuencia de referencia (es decir,
la SEQ ID NO:1) requiere que, tras la alineación de la secuencia
candidata con la secuencia de referencia, el 85% de los aminoácidos
en la secuencia candidata sean idénticos a los aminoácidos
correspondientes en la secuencia de referencia, y/o constituyan
cambios conservativos de aminoácidos.
Las secuencias se alinean para cálculos de
identidad usando un algoritmo matemático, tal como el algoritmo de
Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA
87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
Está incorporado un algoritmo de este tipo en los programas XBLAST
de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.
215:403-410. Pueden realizarse búsquedas tipo BLAST
de proteínas con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de
palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos con identidad
con los polipéptidos de la invención. Para obtener alineaciones con
huecos para fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST tal
como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids
Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas
BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de
los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST). Cuando se realiza
el cálculo de identidad se ignoran los huecos internos y las
inserciones de aminoácidos en la secuencia candidata alineada.
La invención contempla variantes en las que se
sustituyen, se delecionan o se añaden en cualquier combinación
aminoácidos de los polipéptidos de la invención. Están incluidas en
la invención variantes que se producen de manera natural y
variantes que no se producen de manera natural y pueden producirse
mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
Con el uso de métodos conocidos de tecnología de
ADN recombinante y de modificación mediante ingeniería de proteínas
pueden generarse variantes para mejorar o modificar las
características de los polipéptidos de la presente invención. Tales
variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones,
repeticiones y sustituciones seleccionadas según las reglas
generales conocidas en la técnica de modo que tienen poco efecto
sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan las directrices
referentes a cómo realizar sustituciones de aminoácidos
fenotípicamente silenciosas en Bowie et al., Science,
247:1306-1310 (1990), indicando los autores que
existen dos estrategias principales para estudiar la tolerancia al
cambio de una secuencia de aminoácidos.
La primera estrategia aprovecha la tolerancia de
sustituciones de aminoácidos mediante selección natural durante el
proceso de evolución. Comparando secuencias de aminoácidos en
diferentes especies, pueden identificarse las posiciones de
aminoácidos que se han conservado entre las especies. Es probable
que estos aminoácidos conservados sean importantes para la función
de las proteínas. Al contrario, las posiciones de aminoácidos en
las que se han tolerado las sustituciones mediante selección
natural indican posiciones que no son críticas para la función de
las proteínas. Por tanto, pueden modificarse las posiciones que
toleran la sustitución de aminoácidos mientras que todavía se
mantiene la actividad de unión específica del polipéptido a
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo
anti-
Ehrlichia.
Ehrlichia.
La segunda estrategia usa la modificación
mediante ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos
en posiciones específicas de un gen clonado para identificar
regiones críticas para la función de las proteínas. Por ejemplo,
pueden usarse la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de
exploración de alanina (la introducción de mutaciones de una sola
alanina en cada residuo en la molécula) (Cunningham et al.,
Science, 244:1081-1085 (1989)). Entonces, pueden
someterse a prueba las moléculas mutantes resultantes para
determinar la unión específica a anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo anti-Ehrlichia.
Según Bowie et al., estas dos estrategias
han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a
las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además que es
probable que los cambios de aminoácidos sean permisivos en ciertas
posiciones de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, los residuos
de aminoácido más ocultos o interiores (dentro de la estructura
terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares,
mientras que generalmente se conservan pocas características de las
cadenas laterales de superficie o exteriores. Además, las
sustituciones de aminoácidos conservativas toleradas implican el
reemplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu
e Ile; el reemplazo de los residuos hidroxilados Ser y Thr; el
reemplazo de los residuos ácidos Asp y Glu; el reemplazo de los
residuos de amida Asn y Gln; el reemplazo de los residuos básicos
Lys, Arg e His; el reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr y
Trp; y el reemplazo de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser,
Thr, Met y Gly.
Además de la sustitución conservativa de
aminoácidos, las variantes de la presente invención incluyen: (i)
sustituciones por uno o más de los residuos de aminoácido no
conservados, en las que los residuos de aminoácido sustituidos
pueden estar codificados o no por el código genético; (ii)
sustitución por uno o más de los residuos de aminoácido que tienen
un grupo sustituyente; (iii) fusión del polipéptido maduro con otro
compuesto, tal como un compuesto para aumentar la estabilidad y/o
solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol); (iv)
fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales, tal como un
péptido con región de fusión a Fc de IgG, una secuencia líder o
secretora, o una secuencia que facilita la purificación. Se
consideran que tales polipéptidos variantes se encuentran dentro
del alcance de los expertos en la técnica a partir de las
enseñanzas en el presente documento.
Los polipéptidos de la invención se unen
específicamente a un anticuerpo anti-Ehrlichia. En este
contexto "se une específicamente" significa que el polipéptido
reconoce y se une a un anticuerpo anti-Ehrlichia, pero no
reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra
de prueba.
Los polipéptidos de la invención comprenden al
menos un epítopo que es reconocido por un anticuerpo
anti-Ehrlichia. Un epítopo es un determinante antigénico de
un polipéptido. Un epítopo puede ser un epítopo lineal, secuencial
o un epítopo conformacional. Pueden identificarse epítopos dentro
de un polipéptido de la invención mediante varios métodos. Véanse,
por ejemplo, la patente estadounidense número 4.554.101; Jameson
& Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988). Por ejemplo,
puede aislarse y seleccionarse un polipéptido de la invención.
Puede prepararse una serie de péptidos cortos, que juntos abarcan
toda la secuencia del polipéptido, mediante escisión proteolítica.
Partiendo de, por ejemplo, fragmentos de polipéptido de 20
unidades, puede someterse a prueba cada fragmento para determinar
la presencia de epítopos reconocidos en, por ejemplo, un ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En un ensayo ELISA, se
une un polipéptido, tal como un fragmento de polipéptido de 20
unidades, a un soporte sólido, tal como los pocillos de una placa
de plástico de múltiples pocillos. Se marca una población de
anticuerpos, se añade al soporte sólido y se deja que se una al
antígeno no marcado, en condiciones en las que se bloquea la
adsorción no específica, y se eliminan por lavado cualquier
anticuerpo no unido y otras proteínas. La unión de anticuerpos se
detecta, por ejemplo, mediante una reacción que convierte un
reactivo indicador incoloro en un producto de reacción coloreado.
Entonces, pueden someterse a prueba los fragmentos solapantes y
progresivamente más pequeños a partir de un polipéptido de 20
unidades identificado para mapear el epítopo de interés.
Preferiblemente, se sintetiza un polipéptido de
la invención usando sintetizadores de péptidos convencionales, que
se conocen bien en la técnica. También puede producirse un
polipéptido de la invención de manera recombinante. Puede
introducirse un polinucleótido que codifica para un polipéptido de
Ehrlichia en un vector de expresión que puede expresarse en
un sistema de expresión adecuado usando técnicas bien conocidas en
la técnica. Está disponible una variedad de sistemas de expresión
de bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos en la
técnica y puede usarse cualquiera de tales sistemas de expresión.
Opcionalmente, puede traducirse un polinucleótido que codifica para
un polipéptido de Ehrlichia en un sistema de traducción sin
células.
Si se desea, puede producirse un polipéptido de
Ehrlichia como una proteína de fusión, que también puede
contener otras secuencias de aminoácidos, tales como espaciadores
de aminoácidos o secuencias señal, así como ligandos útiles en la
purificación de proteínas, tales como
glutatión-S-transferasa, cola de
histidina y proteína estafilocócica A. Puede estar presente más de
un polipéptido de Ehrlichia en una proteína de fusión. Si se
desea, pueden incluirse diversas combinaciones de polipéptidos de
Ehrlichia procedentes de diferentes aislados o cepas de
Ehrlichia en una proteína de fusión.
Puede sintetizarse un polipéptido de la
invención de manera que comprende varios polipéptidos de
Ehrlichia repetidos. Esto es un polipéptido multimérico.
Estos polipéptidos repetidos pueden comprender un polipéptido
específico, por ejemplo el polipéptido mostrado en la SEQ ID NO:1,
repetido 2 o más veces. Alternativamente, los polipéptidos
repetidos pueden comprender una o más copias de un polipéptido de
Ehrlichia específico junto con una o más copias de otro
polipéptido de Ehrlichia diferente. Puede combinarse o
sintetizarse un polipéptido de la invención con uno o más
polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o polipéptidos de longitud
completa. Preferiblemente el uno o más polipéptidos son otros
polipéptidos de la invención u otras proteínas de
Ehrlichia.
Los polipéptidos de la invención también pueden
comprender fragmentos de los polipéptidos mostrados en la SEQ ID
NO:1, o variantes de los mismos. Por ejemplo, los fragmentos de
polipéptidos pueden comprender cualquier número de aminoácidos
entre 6 y 20 aminoácidos.
Un polipéptido de la invención se combina
preferiblemente con un portador. Un portador es un vehículo para un
polipéptido de la invención. Los portadores incluyen, por ejemplo,
excipientes, diluyentes, adyuvantes y estabilizadores. Ejemplos de
tales estabilizadores son proteínas tales como albúminas séricas y
gelatina; sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa,
trehalosa, sorbitol, maltitol, manitol y lactitol; y tampones que
están compuestos principalmente por fosfato o succinato.
Se producen diversos aislados y cepas de
Ehrlichia canis y Ehrlichia chaffeensis y pueden
usarse en la presente invención polipéptidos de cualquiera de
estos aislados y cepas. Se conocen en la técnica secuencias de
aminoácidos y ácido nucleico de polipéptidos y genes de
Ehrlichia. Por ejemplo, se dan a conocer varias secuencias
de la familia de genes OMP de E. chaffeensis y varias
secuencias de la familia de genes P30 de E. canis en el
documento WO 99/13720.
Los métodos de la invención detectan anticuerpos
o fragmentos de anticuerpo frente a Ehrlichia canis o
Ehrlichia chaffeensis en una muestra de prueba, tal como una
muestra biológica, una muestra ambiental o una muestra de
laboratorio. Una muestra biológica puede incluir, por ejemplo,
sueros, sangre, células, plasma o tejido de un mamífero tal como un
cánido o un ser humano. La muestra de prueba puede estar sin
tratar, puede precipitarse, fraccionarse, separarse, diluirse,
concentrarse o purificarse antes de combinarla con un polipéptido
de la invención.
Los métodos comprenden poner en contacto un
polipéptido de la invención con una muestra de prueba en
condiciones que permiten que se forme un complejo
polipéptido/anticuerpo. Se detecta la formación de un complejo
entre el polipéptido y los anticuerpos anti-Ehrlichia en la
muestra. En una realización de la invención, se detecta el complejo
polipéptido/anticuerpo cuando un reactivo indicador, tal como una
enzima que se une al anticuerpo, cataliza una reacción detectable.
Opcionalmente, puede aplicarse un reactivo indicador que comprende
un compuesto de generación de señales al complejo
polipéptido/anticuerpo en condiciones que permiten la formación de
un complejo polipéptido/anticuerpo/indicador. Se detecta el
complejo polipéptido/anticuerpo/indicador. Opcionalmente, puede
marcarse el polipéptido o anticuerpo con un reactivo indicador
antes de la formación de un complejo polipéptido/anticuerpo. El
método puede comprender opcionalmente un control positivo o
negativo.
Los ensayos de la invención incluyen, pero sin
limitarse a los basados en la competencia, ensayos de tipo sándwich
o reacción directa. Los ensayos pueden usar sustratos o fases
sólidos o pueden realizarse mediante inmunoprecipitación o
cualquier otro método que no utiliza fases sólidas. Cuando se usa
un sustrato o una fase sólidos, se une directa o indirectamente un
polipéptido de la invención a un sustrato o un soporte sólido tal
como un pocillo de microtitulación, una perla magnética, una perla
no magnética, una columna, una matriz, una membrana, un fieltro
fibroso compuesto por fibras naturales o sintéticas (por ejemplo,
materiales a base de celulosa o vidrio o polímeros termoplásticos,
tales como polietileno, polipropileno o poliéster), una estructura
sinterizada compuesta por materiales particulados (por ejemplo,
vidrio o diversos polímeros termoplásticos) o una película de
membrana colada compuesta por nitrocelulosa, nailon, polisulfona o
similares (generalmente de naturaleza sintética). Un sustrato
preferido son partículas finas sinterizadas de polietileno,
conocido comúnmente como polietileno poroso, por ejemplo,
polietileno poroso de 10-15 micras de Chromex
Corporation. Todos estos materiales de sustrato pueden usarse en
formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o pueden
recubrirse sobre o unirse a o laminarse en portadores inertes
apropiados, tales como películas de plástico, papel, vidrio o
tejidos. Los métodos adecuados para inmovilizar péptidos sobre
fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas,
covalentes y similares.
Pueden usarse los polipéptidos de la invención
para detectar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo
anti-Ehrlichia en ensayos que incluyen, pero no se limitan a
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA),
inmunotransferencia de tipo Western, IFA, radioinmunoanálisis
(RIA), hemaglutinación (HA) e inmunoensayo de polarización de
fluorescencia (FPIA). Un ensayo preferido de la invención es el
ensayo de unión cromatográfico de flujo reversible, por ejemplo un
ensayo SNAP®. Véase la patente estadounidense número 5.726.010.
En un tipo de formato de ensayo, pueden
recubrirse uno o más polipéptidos sobre un sustrato o una fase
sólidos. Se incuba una muestra de prueba que se sospecha que
contiene anticuerpos anti-Ehrlichia con un reactivo
indicador que comprende un compuesto de generación de señales
conjugado con un anticuerpo específico para Ehrlichia
durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar
complejos antígeno/anticuerpo de o bien anticuerpos de la muestra
de prueba frente a los polipéptidos de la fase sólida o bien el
compuesto reactivo indicador conjugado con un anticuerpo específico
para Ehrlichia frente a los polipéptidos de la fase sólida.
Puede medirse cuantitativamente la reducción de la unión del
reactivo indicador conjugado con un anticuerpo
anti-Ehrlichia frente a la fase sólida. Una reducción
medible de la señal en comparación con la señal generada a partir
de una muestra de prueba confirmada como negativa para
Ehrlichia indica la presencia de anticuerpo
anti-Ehrlichia en la muestra de prueba. Este tipo de ensayo
puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia
en una muestra de prueba.
En otro tipo de formato de ensayo, se recubren
uno o más polipéptidos de la invención sobre un soporte o sustrato.
Se conjuga un polipéptido de la invención con un reactivo indicador
y se añade a una muestra de prueba. Esta mezcla se aplica al
soporte o sustrato. Si están presentes anticuerpos frente a
Ehrlichia en la muestra de prueba se unirán al polipéptido
conjugado con un reactivo indicador y al polipéptido inmovilizado
sobre el soporte. Entonces, puede detectarse el complejo
polipéptido/anticuerpo/indicador. Este tipo de ensayo puede
cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia en una
muestra de prueba.
Puede detectarse la formación de un complejo
polipéptido/anticuerpo o un complejo
polipéptido/anticuerpo/indica-
dor mediante métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, de separación por tamaños o de precipitación. Opcionalmente, la detección del complejo polipéptido/anticuerpo es mediante la adición de un anticuerpo secundario que está acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto de generación de señales. pueden detectarse reactivos indicadores que comprenden compuestos de generación de señales (etiquetas) asociados a un complejo polipéptido/anticuerpo e incluyen agentes cromogénicos, catalizadores tales como enzimas, compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio y luminol, elementos radiactivos, marcadores visuales directos, así como cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Los ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y similares. La selección de un marcador particular no es crítica, pero podrá producir una señal o bien por sí mismo o conjuntamente con una o más sustancias adicionales.
dor mediante métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, de separación por tamaños o de precipitación. Opcionalmente, la detección del complejo polipéptido/anticuerpo es mediante la adición de un anticuerpo secundario que está acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto de generación de señales. pueden detectarse reactivos indicadores que comprenden compuestos de generación de señales (etiquetas) asociados a un complejo polipéptido/anticuerpo e incluyen agentes cromogénicos, catalizadores tales como enzimas, compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio y luminol, elementos radiactivos, marcadores visuales directos, así como cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Los ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y similares. La selección de un marcador particular no es crítica, pero podrá producir una señal o bien por sí mismo o conjuntamente con una o más sustancias adicionales.
La formación del complejo es indicativa de la
presencia de anticuerpos anti-E. canis o anti-E.
chaffeensis en una muestra de prueba. Por tanto, pueden usarse
los métodos de la invención para diagnosticar una infección por
E. canis o E. chaffeensis en un paciente. Cada
polipéptido de la invención puede detectar E. canis o E.
chaffeensis o ambos debido a la reactividad cruzada de los
polipéptidos y anticuerpos.
Los métodos de la invención también pueden
indicar la cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia en una
muestra de prueba. Con muchos reactivos indicadores, tales como
enzimas, la cantidad de anticuerpo presente es proporcional a la
señal generada. Dependiendo del tipo de muestra de prueba, puede
diluirse con un reactivo tampón adecuado, puede concentrarse o
ponerse en contacto con una fase sólida sin ninguna manipulación.
Por ejemplo, normalmente es preferible someter a prueba muestras de
suero o plasma que se han diluido previamente o muestras de
concentrado tal como orina, con el fin de determinar la presencia
y/o la cantidad del anticuerpo presente.
La invención comprende además kits de ensayo
para detectar anticuerpos anti-Ehrlichia en una muestra. Un
kit comprende uno o más polipéptidos de la invención y medios para
determinar la unión del polipéptido a los anticuerpos frente a
Ehrlichia en la muestra. Un kit puede comprender un
dispositivo que contiene uno o más polipéptidos de la invención e
instrucciones para el uso del uno o más polipéptidos para la
identificación de una infección por Ehrlichia en un
mamífero. El kit también puede comprender material de envasado que
comprende una etiqueta que indica que pueden usarse el uno o más
polipéptidos del kit para la identificación de una infección por
Ehrlichia. Pueden incluirse otros componentes tales como
tampones, controles y similares, conocidos para los expertos en la
técnica, en tales kits de prueba. Los polipéptidos, ensayos y kits
de la invención son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de casos
individuales de infección por Ehrlichia en un paciente, así
como en estudios epidemiológicos de brotes de Ehrlichia.
Los polipéptidos y ensayos de la invención
pueden combinarse con otros polipéptidos o ensayos para detectar la
presencia de Ehrlichia junto con otros microorganismos. Por
ejemplo, los polipéptidos y ensayos de la invención pueden
combinarse con reactivos que detectan Dirofilaria immitis y/o
Borrelia burgdorferi.
Los polipéptidos de la invención también pueden
usarse para desarrollar anticuerpos monoclonales y/o policlonales
que se unen específicamente a un epítopo inmunológico de E.
canis o E. chaffeensis presente en los polipéptidos de
la invención.
Pueden emplearse los anticuerpos o fragmentos de
los mismos en sistemas de ensayo tales como un ensayo de unión
cromatográfico de flujo reversible, ensayo de inmunoabsorción
ligado a enzimas, ensayo de inmunotransferencia de tipo Western o
ensayo de inmunofluorescencia indirecta, para determinar la
presencia, si la hay, de polipéptidos de Ehrlichia en una
muestra de prueba. Además, estos anticuerpos, en particular
anticuerpos monoclonales, pueden unirse a matrices similares a
Sepharose activada con CNBr y usarse para la purificación por
afinidad de proteínas específicas de Ehrlichia a partir de,
por ejemplo, cultivos celulares o suero sanguíneo, tal como para
purificar proteínas y antígenos de Ehrlichia nativos y
recombinantes. Los anticuerpos monoclonales de la invención también
pueden usarse para la generación de anticuerpos quiméricos para uso
terapéutico u otras aplicaciones similares.
Un experto en la técnica puede producir
anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epítopos de
Ehrlichia. La metodología general para producir tales
anticuerpos se conoce bien y se ha descrito, por ejemplo, en Kohler
y Milstein, Nature 256:494 (1975) y revisado en J. G. R. Hurrel,
ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications,
CRC Press Inc., Boca Raton, Fla. (1982), así como lo enseñado por
L. T. Mimms et al., Virology 176:604-619
(1990). Pueden crearse líneas celulares que producen anticuerpos
inmortales mediante fusión celular y también mediante otras
técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con ADN
oncogénico, o transfección con el virus
Epstein-Barr.
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Ejemplo
1
Se comparó el rendimiento de un ensayo SNAP® de
péptidos sintéticos con el rendimiento de un ensayo SNAP® de E.
canis disponible comercialmente que usa antígenos de E.
canis parcialmente purificados. Se obtuvieron los antígenos
nativos parcialmente purificados de microorganismos E.
canis, se hicieron crecer en el cultivo tisular y se
purificaron parcialmente mediante centrifugación diferencial y
cromatografía en columna. Los péptidos sintéticos usados en el
ensayo SNAP® de péptidos sintéticos eran formas monoméricas del
péptido P30-1 de E. canis o del
P-30 de E. canis, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2,
respectivamente.
Se obtuvo una población de 70 muestras caninas
que se sospechaba que eran positivas para E. canis de
Arizona, Texas y Arkansas y se sometieron a prueba usando el ensayo
SNAP® de péptidos sintéticos y el ensayo SNAP® de antígenos
nativos. También se sometieron a prueba las muestras usando un IFA
indirecto. En resumen, se realizó el ensayo IFA usando células
infectadas por E. canis recubiertas sobre portaobjetos para
IFA y anticuerpo anti-IgG canina de conejo marcado
con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Se recogió E.
canis de los cultivos celulares, se diluyó en tampón y se
recubrió sobre portaobjetos para IFA. Se realizaron diluciones de
las muestras de prueba con tampón, se incubaron con los
portaobjetos para IFA recubiertos y entonces se lavaron y se
incubaron con conjugado de anticuerpo anti-canino
marcado con FITC. Se lavaron los portaobjetos y se visualizaron
mediante microscopía con luz ultravioleta. Los resultados se
registran como un título de actividad de fluorescencia. Esto
representa el último reactivo de dilución de muestra sobre el
portaobjetos para IFA. Las muestras con títulos de IFA superiores a
o iguales a 1:100 son positivas.
En el caso de resultados discrepantes, se usó
una inmunotransferencia de tipo Western para E. canis como
ensayo de confirmación. En resumen, se recogió antígeno de E.
canis de cultivo tisular, se resolvió mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida-SDS
(SDS-PAGE) y entonces se transfirió a una membrana
de nitrocelulosa. Tras la transferencia, se bloqueó la membrana con
proteína heteróloga durante la noche a 4°C. Se incubaron muestras
de prueba diluidas de muestras de suero caninas positivas y
negativas para Ac frente a E. canis con inmunotransferencias
durante 2 horas a temperatura ambiente. Entonces se lavaron las
inmunotransferencias, se incubaron con reactivos comerciales de
conjugado de anticuerpo anti-IgG canina:peroxidasa
durante 1 hora y se lavaron. Se desarrollaron señales mediante la
incubación de tiras con un reactivo indicador de peroxidasa
comercial. Se requería una reacción con la banda inmunodominante
con un peso molecular de 30.000 Dalton para la confirmación de un
resultado positivo mediante inmunotransferencia de tipo Western.
Véase, por ejemplo, Suksawat et al. J. Vet. Internal Med.
14:50-55 (2000).
El ensayo SNAP® de péptidos sintéticos y el
ensayo SNAP® de antígenos nativos comprendían un sistema de ensayo
similar al descrito en la patente estadounidense número 5.726.010.
En resumen, se aplica una muestra de prueba a un dispositivo de
ensayo de unión cromatográfico de flujo inverso y se deja fluir por
el mismo y saturar una matriz de flujo. Esto facilita la formación
de complejos secuencial. Es decir, un anticuerpo frente a
Ehrlichia en la muestra de prueba se une en primer lugar a
un reactivo de unión específica marcado no inmovilizado. En el caso
del ensayo SNAP® de péptidos sintéticos, el reactivo de unión
específica marcado no inmovilizado es un polipéptido de la
invención conjugado con peroxidasa de rábano. Para el ensayo SNAP®
de antígenos nativos, el reactivo comprende antígenos nativos
parcialmente purificados. Este complejo se une a un reactivo de
captura de analitos inmovilizados. Para el ensayo SNAP® de péptidos
sintéticos, el reactivo de captura de analitos inmovilizados es uno
o más polipéptidos de la invención conjugados con albúmina sérica
bovina. Para el ensayo SNAP® de antígenos nativos, el reactivo de
captura son antígenos nativos parcialmente purificados. Se pone en
contacto un depósito absorbente con la matriz de flujo saturada,
invirtiendo de ese modo el flujo de fluido. Se suministra a la
matriz de flujo una disolución de lavado y detector. Los reactivos
líquidos eliminan la muestra no unida y el reactivo de unión
específica marcado no unido y facilitan la detección de complejos
de analitos en la ubicación del reactivo de captura de analitos
inmovilizados. El sustrato usado en estos experimentos era
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB).
En la tabla 2 se muestran los resultados de los
ensayos. Los resultados se dividen en cinco grupos.
El grupo 1 comprende cuarenta y siete muestras
que eran positivas según el ensayo SNAP® de péptidos sintéticos, el
ensayo SNAP® de antígenos nativos y el IFA. Estas son muestras
positivas para anticuerpos y no se realizó ninguna prueba adicional
en estas muestras.
El grupo 2 comprende diez muestras (números 15,
17, 18, 20, 22, 23, 24, 41, 42 y 46) que eran positivas según el
ensayo SNAP® de péptidos sintéticos, negativas según el ensayo
SNAP® de antígenos nativos, positivas en el IFA, y se confirmaron
mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Estas son
muestras verdaderas positivas que eran positivas en el ensayo SNAP®
de péptidos sintéticos y falsas negativas en el ensayo SNAP® de
antígenos nativos.
El grupo 3 comprende cinco muestras (números 1,
2, 3, 4 y 5) que eran positivas según IFA y se confirmaron
negativas mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
Estas son muestras verdaderas negativas que eran falsas positivas
en el IFA. Las 5 muestras se identificaron correctamente como
negativas mediante el ensayo SNAP® de péptidos sintéticos. El
ensayo SNAP® de antígenos nativos identificó correctamente tres de
las muestras (números 1, 2 y 5) como negativas, pero dio resultados
falsos positivos para dos muestras (números 3 y 4).
El grupo 4 comprende siete muestras (6, 7, 8, 9,
10, 11 y 12) que eran negativas mediante IFA y se confirmaron
positivas mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
Estas son muestras positivas que eran falsas negativas en el IFA.
Las siete muestras eran verdaderas positivas en el ensayo SNAP® de
péptidos sintéticos. El ensayo SNAP® de antígenos nativos
identificó correctamente sólo dos de las siete muestras (números 7
y 11) como positivas e identificó incorrectamente cinco de las
muestras (números 6, 8, 9, 10 y 12) dando como resultado resultados
falsos negativos para estas cinco muestras.
El grupo 5 comprende una muestra (número 21) que
era positiva mediante IFA y se confirmó como positiva mediante
análisis de inmunotransferencia de tipo Western. El ensayo SNAP® de
péptidos sintéticos y el ensayo SNAP® de antígenos nativos dieron
resultados negativos. Esta es una muestra positiva que era falsa
negativa tanto en el ensayo SNAP® de péptidos sintéticos como el
ensayo SNAP® de antígenos nativos.
Por tanto, se sometieron a prueba 70 muestras y
65 de estas muestras eran muestras verdaderas positivas. El ensayo
SNAP® de péptidos sintéticos identificó correctamente 64 de las
muestras positivas para obtener una sensibilidad del 98,5% (64/65).
El ensayo SNAP® de antígenos nativos identificó correctamente 49 de
las muestras para obtener una sensibilidad del 75,3% (49/65). De
las cinco muestras verdaderas negativas, el ensayo SNAP® de
péptidos sintéticos identificó correctamente 5 de las muestras
negativas para una especificidad del 100% (5/5). El ensayo SNAP® de
antígenos nativos identificó correctamente 3 de las muestras
negativas para una especificidad del 60% (3/5). Por tanto, el
ensayo SNAP® de péptidos sintéticos es más sensible y específico
que el ensayo SNAP® de antígenos nativos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> Lawton, Robert
\hskip1cmO'Connor, Thomas
\hskip1cmBartol, Barbara
\hskip1cmMacHenry, Paul
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones y métodos para la
detección de Ehrlichia chaffeensis y de anticuerpos frente a
Ehrlichia Canis
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00-1278
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento 09/765.739
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
18-01-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Ehrlichia canis
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Ehrlichia canis
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Ehrlichia chaffeensis
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<210> 4
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<213> Ehrlichia chaffeensis
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<210> 6
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<211> 18
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<213> Ehrlichia chaffeensis
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<210> 7
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Ehrlichia chaffeensis
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<400> 7
\hskip1cm
Claims (27)
1. Un polipéptido aislado que consiste en la SEQ
ID NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1
que se unen específicamente a un anticuerpo
anti-P30-1 de Ehrlichia.
2. Polipéptido aislado según la reivindicación
1, que comprende además un portador.
3. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos frente a Ehrlichia que comprende:
- (a)
- poner en contacto polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un anticuerpo anti-P30-1 de Ehrlichia, con una muestra de prueba que se sospecha que comprende anticuerpos frente a Ehrlichia, en condiciones que permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo;
- (b)
- detectar los complejos polipéptido/anticuerpo; siendo la detección de complejos polipéptido/anticuerpo una indicación de que están presentes anticuerpos frente a Ehrlichia en la muestra de prueba.
4. Método según la reivindicación 3, que
comprende además poner en contacto los complejos de la etapa (a)
con un reactivo indicador que comprende un compuesto de generación
de señales que genera una señal medible antes de la realización de
la etapa (b).
5. Método según la reivindicación 3, en el que
se detecta la presencia de anticuerpos frente a Ehrlichia
canis.
6. Método según la reivindicación 3, en el que
se detecta la presencia de anticuerpos frente a Ehrlichia
chaffeensis.
7. Método según la reivindicación 3, en el que
los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo.
8. Método según la reivindicación 3, en el que
se determina la cantidad de anticuerpo en una muestra de prueba.
9. Método según la reivindicación 3, en el que
los polipéptidos están unidos a un sustrato.
10. Método según la reivindicación 3, en el que
los polipéptidos se proporcionan en forma multimérica.
11. Método según la reivindicación 3, en el que
la muestra de prueba es una muestra biológica obtenida de un
mamífero.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el mamífero se selecciona del grupo que consiste en seres humanos y
cánidos.
13. Método según la reivindicación 3, en el que
el método comprende un ensayo seleccionado del grupo de ensayos que
consisten en un ensayo de unión cromatográfico de flujo
reversible, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, un
ensayo de inmunotransferencia de tipo Western y un ensayo de
inmunofluorescencia indirecta.
14. Un dispositivo que contiene polipéptidos que
consisten en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de
aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un
anticuerpo anti-P30-1 de
Ehrlichia.
15. Dispositivo según la reivindicación 14, que
comprende además instrucciones para el uso del uno o más
polipéptidos para la identificación de una infección por
Ehrlichia en un mamífero.
16. Dispositivo según la reivindicación 15, en
el que la identificación de una infección por Ehrlichia se
realiza usando un método para detectar la presencia de anticuerpos
frente a Ehrlichia que comprende:
- (a)
- poner en contacto polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un anticuerpo anti-P30-1 de Ehrlichia, con una muestra de prueba que se sospecha que comprende anticuerpos frente a Ehrlichia, en condiciones que permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo;
- (b)
- detectar los complejos polipéptido/anticuerpo;
siendo la detección de complejos
polipéptido/anticuerpo una indicación de que está presente una
infección por Ehrlichia.
17. Dispositivo según la reivindicación 15, en
el que la infección por Ehrlichia está causada por
Ehrlichia canis o Ehrlichia chaffeensis.
\newpage
18. Un artículo de fabricación que comprende
material de envasado y, contenidos dentro del material de envasado,
polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO:1 y variantes de
sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen
específicamente a un anticuerpo
anti-P30-1 de Ehrlichia.
19. Artículo de fabricación según la
reivindicación 18, en el que el material de envasado comprende una
etiqueta que indica que pueden usarse el uno o más polipéptidos
para la identificación de infección por Ehrlichia en un
mamífero.
20. Artículo de fabricación según la
reivindicación 19, en el que la identificación de una infección por
Ehrlichia se realiza usando un método para detectar la
presencia de anticuerpos frente a Ehrlichia que
comprende:
- (a)
- poner en contacto polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un anticuerpo anti-P30-1 de Ehrlichia, con una muestra de prueba que se sospecha que comprende anticuerpos frente a Ehrlichia, en condiciones que permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo;
- (b)
- detectar los complejos polipéptido/anticuerpo;
siendo la detección de complejos
polipéptido/anticuerpo una indicación de que está presente una
infección por Ehrlichia.
21. Artículo de fabricación según la
reivindicación 19, en el que la infección por Ehrlichia está
causada por Ehrlichia canis o Ehrlichia
chaffeensis.
22. Método de diagnóstico de una infección por
Ehrlichia en un mamífero que comprende:
- (a)
- poner en contacto polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO:1 y variantes de sustitución de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 que se unen específicamente a un anticuerpo anti-P30-1 de Ehrlichia, con una muestra biológica de un mamífero que se sospecha que tiene una infección por Ehrlichia, bajo condiciones que permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo;
- (b)
- detectar los complejos polipéptido/anticuerpo;
siendo la detección de complejos
polipéptido/anticuerpo una indicación de que el mamífero tiene una
infección por Ehrlichia.
23. Método según la reivindicación 22, que
comprende además poner en contacto los complejos de la etapa (a)
con un reactivo indicador que comprende un compuesto de generación
de señales que genera una señal medible antes de la realización de
la etapa (b).
24. Método según la reivindicación 22, en el que
la infección por Ehrlichia está causada por Ehrlichia
canis.
25. Método según la reivindicación 22, en el que
la infección por Ehrlichia está causada por Ehrlichia
chaffeensis.
26. Método según la reivindicación 22, en el que
el mamífero es un ser humano o un cánido.
27. Anticuerpo monoclonal que se une
específicamente a al menos un epítopo de un polipéptido de
Ehrlichia canis o Ehrlichia chaffeensis, consistiendo
dicho polipéptido en la SEQ ID NO:1.
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