ES2324701T3 - Metodos y productos relacionados con heparina de peso molecular bajo. - Google Patents
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Abstract
Un método de análisis de una muestra que comprende: a) aplicar una restricción experimental a un polisacárido contenido en una muestra para producir un polisacárido modificado que tiene un componente de firma, b) detectar la presencia del componente de firma en la muestra como indicación de que el polisacárido está presente en la muestra, y c) determinar la presencia o ausencia del componente de firma para analizar la muestra; en donde el componente de firma se selecciona de deltaHNAC,6SGHNS,3S,6S; deltaUH NS,6SGH NS,3S,6S; deltaUH NAc,6SGH NS,3S; deltaUH NS,6SGH NS,3S; deltaU 2SH NS,6SI 2SH NS,6SI 2SH NS,6SIH NAc,6SGH NS,3S,6S; deltaU2SHNS,6SIHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S; deltaU2SHNS,6SGHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S; deltaU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGMan3S,6S; I2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S; deltaU 2SH NS,6SI 2SH NS,6SIH NAc,6SGH NS,3S,6S; I 2SH NS,6SI 2SH NS,6SIH NAc,6SGMan 3S,6S; deltaU 2SH NS,6SIH NAc,6SGH NS,3S,6S; I 2SH NS,6SIH NAc,6SGH NS,3S,6S; deltaU 2SH NS,6SI 2SH NS,6S; deltaU2SHNS,6SIHNS,6S; deltaU2SHNS,6SGHNS,6S; deltaU2SHNS,6SI2SMan6S; IHNAc,6SGMan3S,6S; HNAc,6SGMan3S,6S; HNS,6SGHNS,3S,6SI2SHNS,6S,OMe; HNS,6SGHNS,6SI2SHNS,6S,OMe; deltaUHNS,6SI2SHNS,6S,OMe; HNS,6SGHNS,6S; HNS,6SGHNS,3S,6S; deltaU2SHNS,6S,OMe; deltaU2SHNS,6S; deltaU 2SH NS; deltaUH NS,6S; deltaU 2SH NAc,6S; deltaUH NS; deltaU 2SH NAc; deltaUH NAc,6S o deltaUH NS,3S,GS.
Description
Métodos y productos relacionados con heparina de
peso molecular bajo.
La coagulación es un camino fisiológico
implicado en el mantenimiento de la hemostasis normal de la sangre
en los mamíferos. En condiciones en las que se produce una lesión
vascular, el camino de la coagulación se estimula para formar un
coágulo de sangre a fin de prevenir la pérdida de sangre.
Inmediatamente después que ocurre la lesión vascular, las plaquetas
de la sangre comienzan a agregarse en el sitio de la lesión formando
un tapón físico para detener la pérdida. Adicionalmente, el vaso
lesionado sufre una vasoconstricción para reducir el flujo de
sangre al área y comienza a agregarse la fibrina formando una red
insoluble o coágulo, que cubre el área lesionada. Cuando un
desequilibrio en el camino de la coagulación se desplaza hacia una
coagulación excesiva, el resultado es el desarrollo de tendencias
trombóticas, que se manifiestan a menudo como ataques cardiacos,
derrames cerebrales, trombosis venosa profunda, e infartos de
miocardio. Las terapias actuales para tratamiento de los trastornos
asociados con los desequilibrios en el camino de la coagulación
implican muchos riesgos y deben ser controladas cuidadosamente.
La heparina, un glucosaminoglucano fuertemente
sulfatado afín a la heparina (HLGAG) (sic) producido por las
células cebadas, es un anticoagulante muy utilizado en clínica, y es
uno de los primeros fármacos biopolímeros y uno de los pocos
fármacos constituidos por carbohidratos. La heparina provoca
fundamentalmente su efecto por dos mecanismos, los dos cuales
implican la fijación de la antitrombina III (AT-III)
a una secuencia específica de pentasacárido,
H_{NAc/S,6S}GH_{NS,3S,6S}I_{2S}H_{NS,6S} contenida en el
polímero. En primer lugar, la fijación de AT-III al
pentasacárido induce un cambio de conformación en la proteína que
media su inhibición del factor Xa. En segundo lugar, la trombina
(factor IIa) se fija también a la heparina en un sitio próximo al
sitio de fijación de AT-III al pentasacárido. La
formación de un complejo ternario entre AT-III,
trombina y heparina da como resultado la desactivación de la
trombina. Al contrario de su actividad anti-Xa que
requiere únicamente el sitio de fijación de AT-III
al pentasacárido, la actividad anti-IIA de la
heparina es dependiente del tamaño, requiriendo al menos 18
unidades de sacárido para la formación eficiente de un complejo
ternario AT-III, trombina, y heparina.
Además de las propiedades anticoagulantes de la
heparina, su complejidad y amplia distribución en los mamíferos han
conducido a la sugerencia de que la misma puede estar implicada
también en una extensa gama de actividades biológicas adicionales.
Los glucosaminoglucanos semejantes a la heparina (HLGAGs) presentes
tanto en la superficie de la célula como en la matriz extracelular,
son un grupo de polisacáridos complejos que tienen una longitud
variable, coherentes en una unidad repetida de disacárido compuesta
de glucosamina y un ácido urónico (ácido idurónico o ácido
glucurónico). El alto grado de complejidad para los HLGAGs proviene
no sólo de su polidispersidad y de la posibilidad de dos
componentes de ácido urónico diferentes, sino también de la
modificación diferencial en cuatro posiciones de la unidad de
disacárido. Tres posiciones, a saber, C2 del ácido urónico, y las
posiciones C3, C6 de las glucosamina pueden estar
O-sulfatadas. Adicionalmente, C2 de la glucosamina
puede estar N-acetilado o
N-sulfatado. En conjunto, estas modificaciones
podrían conducir teóricamente a 32 unidades de disacárido posibles,
haciendo los HLGAGs potencialmente más densos en información que el
DNA (4 bases) o las proteínas (20 aminoácidos). Esta enormidad de
posibles variantes estructurales hace posible que los HLGAGs estén
involucrados en un gran número de procesos biológicos diversos, que
incluyen la angiogénesis (Sasisekharan, R., Moses, M. A., Nugent,
M. A., Cooney, C. L. y Langer, R. (1994) Proc Natl Acad Sci
USA 91, 1524-8.), embriogénesis (Binari,
R. C., Staveley, B. E., Johnson, W. A., Godavarti, R., Sasisekharan,
R. y Manoukian, A. S. (1997) Development 124,
2623-32; Tsuda, M., Kamimura, K., Nakato, H.,
Archer, M., Staatz, W., Fox, B., Humphrey, M., Olson, S., Futch,
T., Kaluza, V., Siegfried, E., Stam, L. y Selleck, S. B. (1999)
Nature 400, 276-80; y Lin, X., Buff,
E. M., Perrimon, N. y Michelson, A. M. (1999) Development
126, 3715-23) y la formación de fibrillas
\beta en la enfermedad de Alzheimer (McLaurin, J., Franklin, T.,
Zhang, X., Deng, J. y Fraser, P. E. (1999) Eur J Biochem
266, 1101-10; y Lindahl, B., Westling, C.,
Giménez-Gallego, G., Lindahl, U. y Salmivirta, M.
(1999) J Biol Chem 274, 30631-5).
Aunque la heparina es muy eficaz en una
diversidad de situaciones clínicas y tiene el potencial de ser
utilizada en muchas otras, los efectos secundarios asociados con la
terapia de heparina son muchos y variados. Efectos secundarios
tales como la trombocitopenia inducida por heparina (HIT) están
asociados fundamentalmente con la cadena larga de la heparina no
fraccionada (UFH), que proporciona dominios de fijación para
diversas proteínas. Esto ha conducido a la explosión en la
generación y utilización de heparina de peso molecular bajo (LMWH)
como una alternativa eficaz para UFH. Aunque la atención se ha
enfocado en LMWH como sustitutos de heparina debido a su acción
farmacológica más predecible, efectos secundarios reducidos,
actividad antitrombótica prolongada, y mejor biodisponibilidad,
existe actualmente una posibilidad limitada de normalizar el proceso
de fabricación de LMWH. Dado que las LMWH se derivan de heparinas y
por tanto son polidispersas y microheterogéneas, con estructura
indefinida, poseen variabilidad inherente, lo que impide actualmente
un proceso eficiente para su fabricación. Sería valioso tanto
médica como científicamente disponer de un método coherente, de
calidad controlada, eficiente en tiempo, independiente de la
concentración, y altamente reproducible para fabricar heparina y
otros glucosaminoglucanos.
En un intento de caracterizar las variaciones
moleculares, estructurales y de actividad de la heparina, se han
investigado varias técnicas para el análisis de las preparaciones de
heparina. La electroforesis en gradiente de gel de poliacrilamida
(PAGE) y la HPLC de intercambio de iones fuertes (SAX) han sido
utilizadas para el análisis cualitativo y cuantitativo de las
preparaciones de heparina. Aunque el método PAGE en gradiente puede
ser útil en la determinación del peso molecular, el mismo adolece de
falta de resolución, particularmente falta de resolución de
diferentes oligosacáridos que tengan el mismo tamaño. La
SAX-HPLC, que está basada en la detección por
absorbancia ultravioleta, es a menudo insuficientemente sensible
para la detección de pequeñas cantidades de oligosacáridos
estructuralmente importantes derivados de heparina. Las tecnologías
actuales para purificación y análisis de heparinas y otros
glucosaminoglucanos son insuficientes. Existe una gran necesidad
clínica y científica de métodos mejorados de aislamiento y
análisis.
La invención se refiere en algunos aspectos a
métodos para caracterización de preparaciones de polisacáridos.
Como resultado de las estructuras complejas de los sacáridos, ha
sido difícil, si no imposible, caracterizar la pureza y/o actividad
de las preparaciones de polisacáridos. Al contrario que las muestras
de ácido nucleico y proteínas, las preparaciones de polisacáridos
se caracterizan generalmente basándose en su capacidad para
producir un cierto nivel de actividad en una muestra biológica.
Estos ensayos no alcanzan el nivel de exactitud que puede
alcanzarse por caracterización estructural directa. De acuerdo con
algunos aspectos de la invención, se proporciona un método de
análisis y caracterización de una muestra de polisacárido. El método
implica aplicar una restricción experimental a un polisacárido en
una muestra a fin de producir un polisacárido modificado que tiene
un componente de firma, detección de la presencia del componente de
firma en la muestra como indicación de que el polisacárido está
presente en la muestra, y determinación de la presencia o ausencia
del componente de firma para analizar la muestra. En algunas
realizaciones, el componente de firma tiene una actividad biológica
conocida y en otras realizaciones el componente de firma es
biológicamente inactivo.
La restricción experimental aplicada a la
muestra es cualquier tipo de manipulación que dé como resultado la
identificación de la presencia o ausencia del componente de firma.
La restricción experimental puede, por ejemplo, ser una cualquiera
sola o una combinación de los tipos siguientes de restricciones
experimentales: electroforesis capilar, cromatografía líquida de
alta presión, cromatografía de permeación en gel, resonancia
magnética nuclear, modificación con una enzima tal como digestión
con una exoenzima o una endoenzima, digestión química, o
modificación
química.
química.
El componente de firma puede utilizarse para
proporcionar información acerca de la muestra. Algunos de los usos
dependen de si el componente de firma es un componente biológico
activo o inactivo. Por ejemplo, en algunos casos en que el
componente de firma es un componente biológico activo y la muestra
es un lote de polisacárido, el componente de firma puede utilizarse
para monitorizar la pureza del lote por determinación de la cantidad
del componente de firma en el lote. En otras realizaciones, el
método de análisis es un método para monitorización de la presencia
de componentes activos en la muestra, en donde la presencia del
componente de firma en la muestra es indicativa de un componente
activo en la muestra. En otras realizaciones, el método de análisis
es un método para la determinación de la cantidad de componentes
activos en la muestra por determinación de la cantidad del
componente de firma de la muestra. El método puede realizarse
también al menos sobre dos muestras de tal modo que se determinan
las cantidades relativas del componente de firma en cada una de las
al menos dos muestras, siendo el nivel relativo más alto del
componente de firma indicativo de la muestra más activa.
En algunos casos en que el componente de firma
es un componente biológico inactivo, el método de análisis puede
ser un método para monitorización de la presencia de componentes
activos en la muestra, siendo la presencia del componente de firma
en la muestra indicativa de una muestra que carece de un componente
activo.
Los métodos son útiles también en algunas
realizaciones para identificación de moléculas biológicamente
activas. Por ejemplo, el componente de firma puede utilizarse para
cribar una genoteca.
Así, en algunas realizaciones, el componente de
firma es una porción biológicamente activa y de un polisacárido.
Porciones biológicamente activas de polisacáridos incluyen, pero sin
carácter limitante, un tetrasacárido del dominio de fijación de
AT-III de la heparina, un tetrasacárido del dominio
de fijación de FGF de heparina,
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; y
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
En algunas realizaciones, el polisacárido es un
glucosaminoglucano, tal como una heparina de peso molecular bajo
(LMWH), heparina, una heparina preparada por medios biotecnológicos,
una heparina modificada químicamente, una heparina sintética, y un
sulfato de heparano.
En otra realización, el polisacárido contenido
en la muestra se compara con una base de datos de referencia de
polisacáridos de tamaño idéntico que el polisacárido, en donde los
polisacáridos de la base de datos de referencia se han sometido
también a las mismas restricciones experimentales que el
polisacárido de la muestra, proporcionando la comparación un
análisis de la composición del polisacárido de la muestra.
En algunas realizaciones preferidas, la muestra
es un producto farmacéutico. En otras realizaciones, la muestra es
una muestra biológica, tal como una muestra de sangre.
Un método para evaluar la calidad de una muestra
de polisacáridos se proporciona de acuerdo con otros aspectos de la
invención. El método implica identificar un componente contenido en
la muestra de polisacárido, determinar un valor cuantitativo de la
cantidad de componente, en donde el valor cuantitativo del
componente es indicativo de la calidad de la muestra de
polisacárido. En una realización, el método implica identificar al
menos dos componentes en la muestra de polisacárido y determinar un
valor cuantitativo de la cantidad de cada uno de los al menos dos
componentes para evaluar la calidad de la muestra de
polisacárido.
El valor cuantitativo puede calcularse por una
diversidad de métodos diferentes, que dependen del modo en que se
procesa la muestra para identificar el componente. Por ejemplo, el
valor cuantitativo puede calcularse como el área bajo la curva
cuando la muestra se procesa por electroforesis capilar, como el
factor de respuesta, o como la cantidad relativa en porcentaje de
cada fracción presente en la muestra.
En una realización, el paso de calcular la
cantidad relativa en porcentaje de cada fracción presente en la
muestra se determina de acuerdo con la ecuación siguiente:
PRA = RF x
AUC_{%}R
en
donde
PRA = cantidad relativa en porcentaje de cada
fracción
RF = factor de respuesta
AUC_{%}R = AUC relativa en porcentaje [(100 x
AUC_{C})/AUC_{T})]
AUC_{C} = área bajo la curva para un
componente
AUC_{T} = la suma del área bajo la curva para
todos los componentes.
En otro método de realización implementado por
ordenador para generar una estructura de datos, materializada
tangiblemente en un medio legible por ordenador, que representa un
valor cuantitativo de un componente de un polisacárido,
comprendiendo el método un acto de realización del cálculo anterior
(sic).
En una realización, el componente es el
componente de firma \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S}; \DeltaUH_{NAc,6S}
GH_{NS,3S}; o \DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
GH_{NS,3S}; o \DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
En algunas realizaciones, el método de
degradación química se selecciona del grupo que incluye
despolimerización oxidante con H_{2}O_{2} o CU^{+} y
H_{2}O_{2}, escisión desaminante con nitrito de isoamilo, o
ácido nitroso, escisión \beta-eliminadora con
éster bencílico de heparina por tratamiento alcalino o por
heparinasa.
En otras realizaciones, el glucosaminoglucano se
selecciona del grupo constituido por heparina, análogos de
heparina, LMWH, heparina biotecnológica, heparina modificada
químicamente, o heparina sintética.
Los métodos de la presente invención pueden
utilizarse para analizar o evaluar una muestra en donde la muestra
es una preparación de LMWH.
En algunos aspectos, la preparación de LMWH
puede tener al menos 15% de disacáridos disulfatados, menos de 75%
de disacáridos trisulfatados, 3-5% de disacáridos
monosulfatados, y al menos 2% de tetrasacárido
4-7.
En algunas realizaciones, la preparación de LMWH
incluye al menos 3,5%, 4,0%, ó 5% de
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
La preparación de LMWH puede incluir al menos
3,5%, 4,0%, ó 5,0% de \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
Cada una de las limitaciones de la invención
puede abarcar diversas realizaciones de la invención. Por esta
razón, se prevé que todas las limitaciones de la invención que
implica un elemento cualquiera o combinaciones de elementos pueden
incluirse en cada uno de los aspectos de la invención.
La Figura 1 es un espectro de masas MALDI del
complejo protonizado de AT-10 con
(RG)_{19}R.
La Figura 2 muestra el tratamiento de
AT-10 con heparinasa. (A) Tratamiento incompleto de
AT-10 con heparinasa I. En las condiciones
utilizadas en este estudio, la heparinasa I escinde un enlace
glicosídico que contiene un I_{2S}. (B) Espectro de masas MALDI
de fragmentos de AT-10 procedentes de la digestión
exhaustiva con heparinasa I. (C) El espectro de masas MALDI de
AT-10 marcado y tratado con heparinasa I exhibe 5
fragmentos: uno con peso molecular de 576,7 Da (atribuible a \pm
D), dos tetrasacáridos con peso molecular de 1037,9 (*) y 1154,0
Da, y un hexasacárido marcado másico con un peso molecular de 1671,4
(masa de 1715,3 más el marcador másico de 56,1). Dado que la
eficiencia de acoplamiento era \sim 90%, se observa también un
hexasacárido sin marcar (masa de 1615,1).
La Figura 3 representa la degradación exhaustiva
de AT-10 con ácido nitroso. El ácido nitroso escinde
en los residuos H_{NS}, dejando como residuo una anhidromanosa
(\Delta = 97,1 Da). En el recuadro se muestra el espectro de
masas del perfil de degradación cuando la muestra se trató con
iduronidasa (arriba),
glucosamina-6-O-sulfatasa
(centro) y glucuronidasa (abajo) en dicho orden.
La Figura 4 es un espectro de masas MALDI que
muestra la degradación parcial de AT-10 con ácido
nitroso.
La Figura 5 muestra las estructuras de los tres
compuestos modelo de oligosacáridos utilizados en este estudio. (A)
El pentasacárido 1 (Penta 1) tiene la secuencia
H_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe}, contiene un
sitio de fijación de AT-III intacto y tiene un peso
molecular calculado de 1508,2. Los dos enlaces glicosídicos
potencialmente sensibles a la escisión por heparinasa I, II o III
están marcados como A.1 y A.2. (B) El pentasacárido 2 (Penta 2),
con la secuencia H_{NS,6S}GH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe}, y
un peso molecular calculado de 1428,1, es estructuralmente idéntico
a Penta 1, menos un 3-O-sulfato en
la glucosamina interna, por lo que no contiene un sitio
AT-III completo. Como en el caso de Penta 1, los
enlaces potencialmente sensibles a la escisión por heparinasa están
marcados B.1 y B.2. (C) Se utilizó también en este estudio un
hexasacárido derivado de heparinasa (Hexa 1), con la secuencia
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Hexa 1
(peso molecular calculado 1614,3) contiene sólo un sitio de fijación
de AT-III parcialmente intacto; análogamente a
AT-10, falta la unidad de disacárido del extremo
reductor I_{2S}H_{NS,6S}. Como en el caso de Penta 1 y Penta 2,
los sitios de escisión potencial están marcados como C.1, C.2.
La Figura 6 es un espectro de masas MALDI de los
productos de digestión con (A) heparinasa I, (B) heparinasa II, y
(C) heparinasa III de Penta 1. Heparinasa I y II cortan Penta 1 en
el enlace G_{NS,3S,6S} ^{\downarrow}I_{2S}H_{NS,6S} (sitio
A.2) para dar un disacárido pentasulfatado y un producto disacárido
trisulfatado. Penta 1 no es escindible por heparinasa III.
La figura 7 es un espectro de masas MALDI de los
productos de digestión con (A) heparinasa I, (B) heparinasa II, y
(C) heparinasa III de Penta 2 complejados con
(RG)_{19}R.
La Figura 8 es un espectro de masas MALDI de los
productos de digestión con (A) heparinasa I, (B) heparinasa II, y
(C) heparinasa III de Hexa 1 complejados con
(RC)_{19}R.
La Figura 9 muestra la titulación por
fluorescencia de AT-III con heparina de longitud
total (\medbullet) o AT-10 (\blacklozenge) a pH
6,0 I = 0,025. Los datos se representan gráficamente como la
relación de fluorescencia de AT-III después de la
introducción de sacárido a la fluorescencia inicial de
AT-III (I/I_{0}) frente a la concentración de
sacárido añadida. Los datos se ajustaron por regresión no lineal y
se determinó el valor K_{D}. Para la heparina, el valor K_{D}
medido era 10 nM, mientras que para AT-10 este valor
era 800 nM. El recuadro muestra la fijación de heparina a
AT-III a pH 7,4 I = 0,15. El valor K_{D} medido de
36 nM concuerda favorablemente con otras determinaciones de la
afinidad de heparina para AT-III.
La Figura 10 muestra el análisis funcional del
decasacárido AT-10 y su comparación con el
pentasacárido de fijación de AT-III. La actividad
anticoagulante in vitro del decasacárido
AT-10 (\ding{115}) se comparó con el
pentasacárido sintético 100 o enoxaparina
101 una heparina de peso molecular bajo generada por
escisión química de la heparina. Las actividades de los tres
compuestos se evaluaron por medida de (A) actividad
anti-IIa, (B) la actividad anti-Xa,
o (C) actividad anti-Xa utilizando el factor Xa
purificado, o (D) vía HepTest. Asimismo, se midieron el tiempo
parcial de tromboplastina activada (APTT) y el tiempo de protrombina
(PT), en donde ninguno de los compuestos exhibía actividad
significativa, coherente con su alta relación de actividad
anti-Xa:anti-IIa.
Las Figuras 11A y 11B muestran gráficos del
análisis de composición de UFH derivada de mucosa intestinal de
porcino. Se digirió UFH con Heparinasa I, II, y III y se sometió a
Electroforesis Capilar (CE). El pico 1 (Figura 9A) se confirmó así
como el disacárido trisulfatado \DeltaU_{2S}, H_{NS,6S}). Los
picos 2, 3, y 4 son disacáridos disulfatados, y 5, 6, y 7 son
disacáridos monosulfatados. El pico 8 es el tetrasacárido
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Además de éstos, existe una
pequeña cantidad de disacáridos no sulfatados que migran de modo
mucho más lento que los sacáridos sulfatados, como se muestra en la
Figura 9B.
La Figura 12 muestra la traza CE del producto de
digestión exhaustiva del pentasacárido AT-10 (sic)
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S} \DeltaU_{2S}H_{NS,6S}
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S} IH_{NAc,6S} GH_{NS,3S,6S}. El
tetrasacárido del pico 8 en el producto de digestión exhaustiva de
heparina tiene la misma masa y tiempo de migración que
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}.
La Figura 13 es un gráfico de actividad
anti-factor Xa para fracciones diferentes de UFH
como una función de su contenido de
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Un gráfico de actividad
anti-factor Xa como función de %
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} da una línea recta con r =
0,91.
La invención implica varios descubrimientos que
han conducido a nuevos avances en el campo de la biología de los
polisacáridos. Uno de los problemas principales en la
caracterización de los polisacáridos es consecuencia de su
diversidad estructural. Esta diversidad estructural es uno de los
factores que han hecho difícil estudiar las relaciones
secuencia-función para los polisacáridos. La
síntesis química de oligosacáridos definidos se ha utilizado en el
estudio de la contribución relativa a las actividades biológicas,
tales como la fijación con afinidad alta a AT-III
de modificaciones específicas en la secuencia de pentasacáridos de
heparina (Desai, U. R., Petitou, M., Bjork, I. y Olson, S. T.
(1998) J Biol Chem 273, 7478-87). Sin
embargo, tales métodos de síntesis son complejos y no han sido
aplicados extensamente al estudio de otras secuencias biológicas.
Un enfoque alternativo que implica fraccionamiento por afinidad de
polisacáridos con proteínas de interés y caracterización
subsiguiente ha proporcionado alguna información global en relación
con los patrones de sulfatación de los polisacáridos que determinan
afinidad (Parthasarathy, N., Gotow, L. F., Bottoms, J. D., Kute, T.
E., Wagner, W. D. y Mulloy, B. (1998) J Biol Chem 273,
21111-4.; Sasaki, T., Larsson, H., Kreuger, J.,
Salmivirta, M., Claesson-Welsh, L., Lindahl, U.,
Hohenester, E. y Timpl, R. (1999) Embo J 18,
6240-8; y Kreuger, J., Prydz,, K., Pettersson, R.
F., Lindahl, U. y Salmivirta, M. (1999) Glycobiology 9,
723-9).
La invención está basada, en un aspecto, en un
nuevo método para caracterización de muestras de polisacáridos. Se
ha descubierto que las secuencias de polisacáridos pueden
secuenciarse rápida y exactamente a fin de identificar un
componente de firma del polisacárido. El componente de firma puede
utilizarse para caracterizar la muestra de polisacárido de maneras
que no eran posibles anteriormente. El análisis de polisacáridos de
grado farmacéutico está regido por la Farmacopea de los Estados
Unidos (USP) y otras farmacopeas nacionales. Por regla general, los
tipos de análisis requeridos para los polisacáridos son ensayos
funcionales y en algunos casos ensayos estructurales muy generales.
Los ensayos que están siendo utilizados actualmente para determinar
la actividad/pureza de una preparación de heparina disponible
comercialmente son un ensayo de coagulación in vitro y un
test para endotoxinas bacterianas. Se ha determinado que la
cantidad de heparina es aquella cantidad que hará que 1 ml de
plasma de oveja experimente semicoagulación cuando se mantiene
durante 1 hora a 20ºC en comparación con un estándar USP de
referencia (definido como unidades/ml) o el estándar Quinto
Internacional para Heparina no Fraccionada (WHO-5)
(definido como Unidades Internacionales/ml). (Linhardt, R. J. y
Gunay, N. S. (1999) Semin Thromb Hemost 25,
5-16). Comparados con los requisitos reguladores
estrictos para otros fármacos (no polisacáridos), estos estándares
de caracterización están anticuados.
Los métodos de la invención proporcionan una vía
mucho más exacta para caracterización de estas muestras. Los
métodos implican manipular una muestra que contiene polisacárido a
fin de identificar la presencia o ausencia de un componente de
firma. Puede determinarse la cantidad del componente de firma
presente en la muestra. La cantidad de componente de firma
proporciona una caracterización exacta de la muestra.
Así, en algunos aspectos, la invención es un
método de análisis de una muestra por aplicación de una restricción
experimental a un polisacárido en una muestra, para producir un
polisacárido modificado, que tiene un componente de firma, detectar
la presencia del componente de firma en la muestra como indicación
de que el polisacárido está presente en la muestra, y determinar la
presencia o ausencia del componente de firma para analizar la
muestra.
Un "polisacárido" es un polímero compuesto
de monosacáridos enlazados unos a otros. En muchos polisacáridos,
el bloque de construcción básico del polisacárido es realmente una
unidad de disacárido, que puede ser repetitiva o no repetitiva.
Así, una unidad, cuando se utiliza con respecto a un polisacárido,
hace referencia a un bloque de construcción básico de un
polisacárido y puede incluir un bloque de construcción monómero
(monosacárido) o un bloque de construcción dímero (disacárido).
Los métodos para caracterización de muestras de
polisacáridos se desarrollaron basándose en el análisis experimental
de glucosaminoglucanos afines a heparina (HLGAGs), pero las
propiedades expuestas en esta memoria pueden extenderse a otros
polisacáridos. Los métodos de la invención se expondrán con respecto
a HLGAGs como ejemplo, pero los métodos no se limitan a HLGAGs.
Así, en una realización, la muestra de polisacárido a analizar
incluye HLGAGs o glucosaminoglucanos. Como se utilizan en esta
memoria, los términos "HLGAG" y "glucosaminoglucanos" se
utilizan intercambiablemente para hacer referencia a una familia de
moléculas que tienen estructuras y propiedades afines a la
heparina. Estas moléculas incluyen, pero sin carácter limitante,
heparina de peso molecular bajo (LMWH), heparina, heparina
preparada biotecnológicamente, heparina modificada químicamente,
heparina sintética, y sulfato de heparano. El término "heparina
biotecnológica" abarca heparina que se prepara a partir de
fuentes naturales de polisacáridos que han sido modificados
químicamente y se describe en Razi et al., Biochem. J.
(1995, 15 de julio); 309 (parte 2): 465-72. La
heparina modificada químicamente se describe en Yates et al.,
Carbohydrate Res (1996, 20 de noviembre); 294:
15-27, y es conocida por los expertos en la técnica.
La heparina sintética es bien conocida por los expertos en la
técnica y se describe en Petitou, M. et al., Bioorg. Med
Chem Lett. (1999, 19 de abril); 9(8):
1161-6.
Como se muestra en los ejemplos siguientes, la
secuencia de un decasacárido fraccionado de AT-III
(AT 10), que puede utilizarse como componente de firma de HLGAGs,
ha sido identificada utilizando un esquema de nomenclatura
codificada en propiedades/espectrometría de masas
(PEN-MALDI), una metodología de secuenciación
descrita en las Solicitudes de Patente US Núms. de Serie 09/557.997
y 09/558.137 presentadas el 24 de abril de 2000, que tienen
inventores comunes, y Venkataraman, G., Shriver, Z., Raman, R. y
Sasisekharan, R. (1999) Science 286, 537-42.
Secuenciación Integral de Glucanos (IGS) (Turnbull, J. E., Hopwood,
J. J. y Gallagher, J. T. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96,
2698-703.) y análisis por resonancia magnética
nuclear del protón (^{1}H NMR) del decasacárido son coherentes
con los resultados de PEN-MALDI. La flexibilidad de
esta estrategia de secuenciación se demuestra también por el hecho
de que es posible deducir información de secuencia para
oligosacáridos contaminantes, si están presentes. La secuenciación
de un sacárido químicamente complejo fraccionado de
AT-III (con inclusión de la rara sulfatación en
3-O de la glucosamina) estableció una metodología
que puede extenderse al análisis de otros oligosacáridos HLGAG de
interés, por ejemplo aquellos HLGAGs con propiedades de fijación de
factores de crecimiento. Una metodología de secuenciación directa
para estos tipos de secuencias ha hecho posibles estudios
estructura-función de esta clase importante de
moléculas.
Los HLGAGs y otros polisacáridos tienen todos
ellos componentes de firma. Un "componente de firma" es un
oligosacárido que está presente en y es característico de un
polisacárido particular. Las propiedades de la firma seleccionada
pueden depender del tipo de polisacárido que se estudia y del tipo
de restricción experimental aplicada al polisacárido. La firma es
un elemento reproducible de un polisacárido particular que se
manipula con una restricción experimental particular. Por ejemplo,
algunas firmas de los HLGAGs que han sido identificadas y cuya
utilidad se ha demostrado son \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}. Cuando una muestra que contiene
HLGAG se somete a electroforesis capilar después de tratamiento con
heparinasa, esta firma será identificada y es susceptible de ser
cuantificada.
El componente de firma puede ser biológicamente
activo o inactivo. Puede derivarse una información importante del
componente de firma tanto si el mismo es un componente activo como
si se trata de un componente inactivo. Una firma que tiene
actividad biológica es un oligosacárido que se sabe produce una
función biológica específica. Por ejemplo, se sabe que los
tetrasacáridos \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S} forman parte de las secuencias que
poseen actividad antico-agulante, dando como
resultado la inhibición del factor Xa. Por tanto, la presencia de
este componente en una muestra es directamente indicativa de la
actividad anti-coagulante del HLGAG.
Las firmas que tienen actividad biológica pueden
utilizarse para una diversidad de propósitos. Por ejemplo, estos
tipos de firmas son útiles para monitorizar la variabilidad
lote-a-lote de una preparación de
polisacárido. La pureza de cada lote puede determinarse por
determinación de la cantidad de componente activo de firma en el
lote. Estas firmas son útiles también para monitorizar la presencia
de componentes activos en la muestra, cuando la presencia del
componente de firma en la muestra es indicativa de un componente
activo en la muestra. Por ejemplo, el componente de firma puede
utilizarse para seguir el componente activo a lo largo de un
procedimiento de procesamiento. Utilizando este método, es posible
testar los productos después de cada paso de separación para
determinar qué fracción contiene el componente biológicamente
activo. La cantidad de componentes activos en la muestra puede
cuantificarse también por determinación de la cantidad de componente
de firma en la muestra.
Los métodos pueden realizarse también sobre al
menos dos muestras a fin de determinar qué muestra tiene la
actividad máxima o comparar de algún otro modo la pureza de las
muestras. En este caso, se determinan las cantidades relativas de
componente de firma en cada una de las al menos dos muestras. El
nivel máximo relativo de componente de firma es indicativo de la
muestra más activa.
Adicionalmente, la firma activa puede utilizarse
para identificar moléculas biológicamente activas por cribado de
compuestos o genotecas de compuestos. Las genotecas incluyen, por
ejemplo, genotecas de presentación de fago, genotecas
combinatorias, genotecas de peptoides y restos de síntesis no
peptídicos. La presentación de fago puede ser particularmente
eficaz en la identificación de péptidos que interaccionan con los
componentes de firma, con inclusión de anticuerpos humanos.
Resumidamente, se prepara una genoteca de fagos (utilizando v.g.
los fagos m13, fd, o lambda), presentando inserciones de 4 a
aproximadamente 80 residuos de aminoácidos con utilización de
procedimientos convencionales. Las inserciones pueden representar,
por ejemplo, una red totalmente degenerada o sesgada. Es posible
seleccionar luego inserciones portadoras de fago que se fijan al
componente de firma. Este proceso puede repetirse a lo largo de
varios ciclos de reselección de fago que se fijan al componente de
firma. Las tandas repetidas conducen al enriquecimiento de
secuencias particulares portadoras del fago. El análisis de
secuencias de DNA puede conducirse para identificar las secuencias
de los polipéptidos expresados. Puede determinarse la porción
lineal mínima de la secuencia que se fija al componente de firma.
Es posible repetir el procedimiento utilizando una genoteca sesgada
que contiene inserciones que contienen parte o la totalidad de la
porción lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales
aguas arriba o aguas abajo de la misma. Pueden utilizarse también
métodos de cribado de levadura de dos híbridos para identificar
polipéptidos que se fijan al componente de firma. Genotecas
peptídicas y no peptídicas que están basadas en un componente de
firma conocido pueden ser generadas fácilmente por los expertos en
la técnica. Entidades comerciales tales como ArQule (Woburn, MA)
fabrican genotecas preparadas por encargo para la generación de
compuestos miméticos.
Ejemplos de porciones biológicamente activas de
un polisacárido incluyen, pero sin carácter limitante, un
tetrasacárido del dominio de fijación de AT-III de
heparina, un tetrasacárido del dominio de fijación de FGF de
heparina, \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S}, UH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
Las firmas que son biológicamente inactivas son
oligosacáridos que no están asociados con una función biológica
específica conocida. Estos oligosacáridos pueden tener alguna
función biológica, pero no la función específica que se analiza.
Por ejemplo, el oligosacárido puede causar realmente una inhibición
del crecimiento de las células tumorales, pero no tener efecto
alguno sobre la cascada de la coagulación. Si la muestra de
polisacárido está siendo evaluada con el propósito de identificar
la presencia o la cantidad de polisacáridos que son útiles para
propósitos anti-coagulación, se considera que el
oligosacárido que se detecta es una firma biológicamente inactiva.
Por el contrario, si la muestra de polisacárido está siendo evaluada
con el propósito de identificar la presencia o cantidad de
polisacáridos que son útiles para la prevención de la proliferación
de las células tumorales, se considera que el oligosacárido que se
detecta es una firma biológicamente activa.
Las firmas que son biológicamente inactivas
pueden utilizarse para algunos de los mismos propósitos que las
firmas biológicamente activas, así como para otros propósitos. Las
firmas biológicamente inactivas pueden utilizarse también para
monitorizar la variabilidad lote a lote de una preparación de
polisacáridos. Puesto que se están comparando uno a otro dos lotes,
pueden utilizarse tanto firmas inactivas como firmas activas. Los
componentes de firma inactivos pueden utilizarse también para
monitorizar la presencia de componentes activos en la muestra
cuando la presencia del componente de firma en la muestra es
indicativa de una muestra que carece de una actividad específica o
que tiene niveles inferiores de esta actividad. Así, si la presencia
de un componente de firma inactivo es inversamente proporcional a
la presencia de un componente activo, entonces la presencia del
componente inactivo puede proporcionar información importante acerca
de la actividad de la muestra. Por ejemplo, si el componente de
firma inactivo es un producto de degradación de un componente activo
de un polisacárido, entonces la presencia del componente inactivo
indica que algo del componente activo se ha descompuesto y por
tanto la muestra es menos activa que lo sería en el caso de que no
estuviera presente el componente inactivo.
Una "restricción experimental", como se
utiliza en esta memoria, es un proceso bioquímico realizado sobre
una muestra de polisacárido que da como resultado una modificación
de la muestra que permite que la detección de la firma.
Restricciones experimentales incluyen, pero sin carácter limitante,
métodos de separación, v.g. espectrometría de masas, electroforesis
capilar, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), cromatografía
de permeación de gel, resonancia magnética nuclear; digestión
enzimática, v.g., con una exoenzima o una endoenzima; digestión
química; modificación química; desprendimiento químico (es decir,
eliminación de una unidad de monosacárido); y modificación
enzimática, por ejemplo sulfatación en una posición particular con
una sulfotransferasa de sulfato de heparano.
La firma puede identificarse por cualquier medio
que sea coherente con la restricción experimental utilizada. El
peso molecular de un componente de firma, por ejemplo, puede
determinarse por varios métodos que incluyen espectrometría de
masas. El uso de espectrometría de masas para determinación del peso
molecular de los polisacáridos es bien conocido en la técnica. La
Espectrometría de Masas ha sido utilizada como una herramienta
potente para caracterizar polisacáridos debido a su exactitud
(\pm 1 Dalton) en la información de las masas de fragmentos
generadas (v.g. por escisión enzimática), y también debido a que se
requieren únicamente concentraciones de muestra del orden de pM.
Por ejemplo, se ha descrito la espectrometría de masas por con
ionización por desorción láser asistida por matriz
(MALDI-MS) para la identificación del peso molecular
de fragmentos de polisacáridos en publicaciones tales como
Rhomberg, A. J. et al, PNAS, USA, v. 95, p.
4176-4181 (1998); Rhomberg, A. J. et al,
PNAS, USA, v. 95, p. 12232-12237 (1998); y
Ernst, S. et. al., PNAS, USA, v. 95, p.
4182-4187 (1998). Otros tipos de espectrometría de
masas conocidos en la técnica, tales como MS con pulverización
electrónica, espectrometría de masas con bombardeo de átomos
rápidos (FAB-MS) y espectrometría de masas con
disociación activada por colisión (CAD) pueden utilizarse también
para identificar el peso molecular de los fragmentos de
polisacáridos.
Los datos de espectrometría de masas pueden ser
un instrumento valioso para averiguar información acerca del
componente de firma del polisacárido solo o después que el
polisacárido ha sufrido degradación con enzimas o productos
químicos. Después que se ha identificado el peso molecular de un
polisacárido, puede compararse el mismo con pesos moleculares de
otros polisacáridos conocidos (v.g. utilizando los métodos de las
Solicitudes de Patente de EE.UU. Núms. 09/557.997 y 09/558.137
presentadas el 24 de abril de 2000). Como se muestra en estas
solicitudes de patente, una técnica para comparar pesos moleculares
consiste en generar una línea de masas y comparar el peso molecular
del polisacárido desconocido con la línea de masas a fin de
determinar una subpoblación de polisacáridos que tienen el mismo
peso molecular. Una "línea de masas" es una base de datos de
información, preferiblemente en la forma de un gráfico o diagrama
que almacena información para cada tipo posible de polisacárido que
tenga una secuencia única basada en el peso molecular del
polisacárido. Dado que los datos de espectrometría de masas indican
la masa de un fragmento con exactitud de 1 Da, puede asignarse una
longitud únicamente a un fragmento por consulta de una masa en la
línea de masas. Adicionalmente, puede determinarse a partir de la
línea de masas que, dentro de un fragmento de una longitud
particular mayor que un disacárido, existe un mínimo de 4,02 Da
diferente en masas que indica que dos grupos acetato (84,08 Da) han
reemplazado a un grupo sulfato (80,06 Da). Por tanto, puede
determinarse un número de sulfatos y acetatos de un fragmento de
polisacárido a partir de la masa proporcionada por los datos de
espectrometría de masas, y puede asignarse dicho número al
fragmento de polisacárido.
Además del peso molecular, pueden determinarse
otras propiedades de un componente de firma. Las relaciones de
composición de los sustituyentes o unidades químicas (cantidad y
tipo de sustituyentes o unidades químicas totales) pueden
determinarse utilizando metodología conocida en la técnica, tal como
electroforesis capilar. Un polisacárido puede someterse a una
primera restricción experimental tal como degradación enzimática o
química para separar el polisacárido en fragmentos más pequeños.
Estos fragmentos pueden someterse luego a una segunda restricción
experimental, es decir, pueden separarse utilizando electroforesis
capilar para determinar la cantidad y tipo de sustituyentes o
unidades químicas presentes en el polisacárido. Alternativamente, el
polisacárido puede someterse a una sola restricción experimental
tal como electroforesis capilar, sin degradación enzimática
previa.
En el método de electroforesis capilar en gel,
pueden analizarse muestras de reacción por capilares de pequeño
diámetro llenos de gel. El pequeño diámetro de los capilares (50
\mum) permite la disipación eficiente del calor generado durante
la electroforesis. Así, pueden utilizarse altas intensidades de
campo sin calentamiento Joule excesivo (400 V/m), reduciendo el
tiempo de separación a aproximadamente 20 minutos para cada
ejecución de la reacción, aumentando con ello la resolución con
respecto a la electroforesis en gel convencional. Adicionalmente,
pueden analizarse muchos capilares en paralelo, permitiendo la
amplificación de la información de polisacáridos generada.
Pueden utilizarse también otros métodos para
evaluación del componente de firma. Por ejemplo, otros métodos
incluyen métodos que están basados en parámetros tales como la
viscosidad (Jandik, K.A., Gu, K. y Linhardt, R.J., (1994),
Glycobiology, 4:284-296) o la absorbancia UV
total (Ernst, S. et al., (1996), Biochem. J.,
315:589-597).
Los fragmentos HLGAG pueden degradarse
utilizando enzimas tales como enzimas heparina-liasa
(heparinasas) o ácido nitroso, y los mismos pueden modificarse
también utilizando enzimas diferentes que transfieren grupos
sulfato a las posiciones mencionadas anteriormente o eliminan los
grupos sulfato de dichas posiciones. Las enzimas modificadoras son
exolíticas y no progresivas, lo que significa que las mismas actúan
una sola vez sobre el extremo no reductor y se soltarán de la
cadena de heparina sin modificar posteriormente el resto de la
cadena. Para cada una de las posiciones modificables en la unidad de
disacárido existe una enzima modificadora. Una enzima que añade un
grupo sulfato se conoce como una sulfotransferasa, y una enzima que
elimina grupos sulfato se denomina sulfatasa. Las enzimas
modificadoras incluyen
2-O-sulfatasa/sulfotransferasa,
3-O-sulfatasa/sulfotransferasa,
6-O-sulfatasa/sulfotransferasa y
N-desacetilasa-N-sulfotransferasa.
La función de estas enzimas es evidente por sus nombres, por
ejemplo una 2-O-sulfotransferasa
transfiere un grupo sulfato a la posición 2-O de un
ácido idurónico (el ácido glucurónico
2-O-sulfatado es un suceso raro en
las cadenas de HLGAG) y una
2-O-sulfatasa elimina el grupo
sulfato de la posición 2-O de un ácido
idurónico.
Las enzimas degradantes de HLGAG incluyen, pero
sin carácter limitante, heparinasa-I,
heparinasa-II, heparinasa-III,
D-glucuronidasa y L-iduronidasa,
versiones modificadas de heparinasas, variantes y fragmentos
funcionalmente activos de las mismas. Las tres heparinasas de
Flavobacterium heparinum son instrumentos enzimáticos que
han sido utilizados para la generación de heparina LMWH
(5.000-8.000 Da) y heparina de peso molecular
ultra-bajo
(\sim 3000 Da). La heparinasa I escinde las regiones altamente sulfatadas de HLGAGs en los ácidos urónicos sulfatados en 2-O, mientras que la heparinasa II tiene una especificidad de sustrato más amplia y escinde enlaces glicosídicos que contienen ácidos urónicos tanto sulfatados en 2-O como no sulfatados (Ernst, S., Langer, R., Cooney, C. L. y Sasisekharan, R. (1995) Crit Rev Biochem Mol Biol 30, 387-444). La heparinasa III, en oposición a la heparinasa I, escinde fundamentalmente regiones infrasulfatadas de HLGAGs, a saber, enlaces glicosídicos que contienen un ácido urónico no sulfatado (Ernst, S., Langer, R., Cooney, C. L. y Sasisekharan, R. (1995) Crit Rev Biochem Mol Biol 30, 387-444). Investigaciones múltiples acerca de la especificidad de sustrato de las heparinasas han aumentado su utilidad como instrumentos para el establecimiento de las relaciones estructura-función para HLGAGs. Varias patentes y solicitudes de patente describen modificaciones y variantes y fragmentos de heparinasa útiles, con inclusión de la patente US 6.217.863 B1 y las solicitudes pendientes 09/384.959 y 09/802.285. Otras modificaciones y variantes son también útiles. Se requiere una comprensión más detallada para maximizar su utilidad como generadores de LMWH farmacológica. Los descubrimientos de la invención proporcionan algo más de este detalle (como se describe más adelante).
(\sim 3000 Da). La heparinasa I escinde las regiones altamente sulfatadas de HLGAGs en los ácidos urónicos sulfatados en 2-O, mientras que la heparinasa II tiene una especificidad de sustrato más amplia y escinde enlaces glicosídicos que contienen ácidos urónicos tanto sulfatados en 2-O como no sulfatados (Ernst, S., Langer, R., Cooney, C. L. y Sasisekharan, R. (1995) Crit Rev Biochem Mol Biol 30, 387-444). La heparinasa III, en oposición a la heparinasa I, escinde fundamentalmente regiones infrasulfatadas de HLGAGs, a saber, enlaces glicosídicos que contienen un ácido urónico no sulfatado (Ernst, S., Langer, R., Cooney, C. L. y Sasisekharan, R. (1995) Crit Rev Biochem Mol Biol 30, 387-444). Investigaciones múltiples acerca de la especificidad de sustrato de las heparinasas han aumentado su utilidad como instrumentos para el establecimiento de las relaciones estructura-función para HLGAGs. Varias patentes y solicitudes de patente describen modificaciones y variantes y fragmentos de heparinasa útiles, con inclusión de la patente US 6.217.863 B1 y las solicitudes pendientes 09/384.959 y 09/802.285. Otras modificaciones y variantes son también útiles. Se requiere una comprensión más detallada para maximizar su utilidad como generadores de LMWH farmacológica. Los descubrimientos de la invención proporcionan algo más de este detalle (como se describe más adelante).
Glucuronidasa e iduronidasa, como sugiere su
nombre, escinden en el enlace glicosídico después de un ácido
glucurónico y ácido idurónico respectivamente. El ácido nitroso
corta aleatoriamente en los enlaces glicosídicos después de una
hexosamina N-sulfatada y convierte el anillo de
hexosamina de 6 miembros en un anillo de anhidromanitol de 5
miembros.
Los métodos para análisis de polisacáridos por
identificación de la presencia de un componente de firma pueden
utilizarse para proporcionar una evaluación cualitativa del
polisacárido (v.g., si el componente de firma está presente o
ausente) o una evaluación cuantitativa (v.g. la cantidad de
componente de firma presente que indica cualidades de la muestra
tales como actividad, pureza o simplemente para comparar muestras
diferentes). El método se realiza en algunos aspectos por
identificación de un componente dentro en la muestra de polisacárido
y determinación de un valor cuantitativo de la cantidad de
componente. En algunas realizaciones, el método implica la
identificación y cuantificación de al menos dos componentes.
El valor cuantitativo puede calcularse por
cualquier medio, tal como por determinación del área bajo la curva
(AUC) cuando la muestra se procesa por electroforesis capilar, el
factor de respuesta (RF), o la cantidad porcentual relativa de cada
fracción presente en la muestra. Métodos para la realización de
estos tipos de cálculos se describen más adelante en detalle en la
sección de Ejemplos. Resumidamente, el AUC puede calcularse
directamente a partir de un espectro CE. El factor de respuesta es
aquella cantidad de firma que proporciona la misma respuesta que un
oligosacárido de control. El RF puede calcularse, por ejemplo, en
términos de absorbancia y compararse con la absorbancia de una
muestra de control. La cantidad porcentual relativa de cada fracción
presente en la muestra puede determinarse de acuerdo con la
ecuación siguiente:
PRA = RF x
AUC_{%}R
en
donde
PRA = cantidad relativa en porcentaje de cada
fracción
RF = factor de respuesta
AUC_{%}R = AUC relativa en porcentaje [(100 x
AUC_{C})/AUC_{T})]
AUC_{C} = área bajo la curva para un
componente
AUC_{T} = la suma del área bajo la curva para
todos los componentes.
Los datos pueden procesarse individualmente o
por medio de un ordenador. Por ejemplo, puede realizarse de acuerdo
con la invención un método implementado por ordenador para
generación de una estructura de datos, materializada tangiblemente
en un medio legible por ordenador, que representa un valor
cuantitativo de un componente de un polisacárido,. La determinación
cuantitativa se efectúa por realización del cálculo anterior.
Un sistema de ordenador que puede realizar lo
anterior como un programa de ordenador puede incluir típicamente
una unidad principal conectada a la vez a un dispositivo de salida
que presenta la información a un usuario y a un dispositivo de
entrada que recibe la entrada de un usuario. La unidad principal
incluye generalmente un procesador conectado a un sistema de
memoria por un mecanismo de interconexión. El dispositivo de entrada
y el dispositivo de salida pueden estar conectados también al
procesador y al sistema de memoria por el mecanismo de
interconexión.
Pueden estar conectados a un sistema de
ordenador uno o más dispositivos de salida. Ejemplos de dispositivos
de salida incluyen una presentación por tubo de rayos catódicos
(CRT), presentaciones de cristal líquido (LCD), impresoras,
dispositivos de comunicación tales como un módem, y salida de audio.
Pueden estar conectados también al sistema de ordenador uno o más
dispositivos de entrada. Dispositivos de entrada ilustrativos
incluyen un teclado convencional, teclado numérico, esfera de
control, ratón, pluma y pastilla, dispositivo de comunicación, y
dispositivos de entrada de datos tales como sensores. La materia que
constituye el objeto descrito en esta memoria no se limita a los
dispositivos particulares de entrada o salida utilizados en
combinación con el sistema de ordenador o a los descritos en esta
memoria.
El sistema de ordenador puede ser un sistema de
ordenador de uso general que puede programarse utilizando un
lenguaje de programación de ordenador, tal como C++, Java, u otro
lenguaje, tal como un lenguaje descriptivo o lenguaje ensamblador.
El sistema de ordenador puede incluir también hardware para
propósitos especiales programado específicamente tal como, por
ejemplo, un Circuito Integrado de Aplicación Específica (ASIC). En
un sistema de ordenador de uso general, el procesador es típicamente
un procesador disponible comercialmente, del que son ejemplos las
series de procesadores x86, Celeron, y Pentium, disponibles de
Intel, y dispositivos similares de AMD y Cyrix, los
microprocesadores de la serie 680X0 disponibles de Motorola, el
microprocesador PowerPC de IBM y los procesadores de la serie Alpha
de Digital Equipment Corporation. Están disponibles muchos otros
procesadores. Un microprocesador de este tipo ejecuta un programa
denominado sistema operativo, del que son ejemplos Windows NT,
Linux, UNIX, DOS, VMS y OS8, que controla la ejecución de otros
programas de ordenador y proporciona programación, depuración de
fallos, control entrada/salida, contabilidad, compilación,
asignación de almacenamiento, tratamiento de los datos y gestión de
la memoria, así como control de las comunicaciones y servicios
análogos. El procesador y el sistema operativo definen una
plataforma de ordenador para la cual pueden escribirse programas de
aplicación en lenguajes de programación de alto nivel.
Un sistema de memoria incluye típicamente un
medio de registro no volátil legible por ordenador y susceptible de
escritura, del cual son ejemplos un disco magnético, una memoria
flash y cinta. El disco puede ser movible, tal como un "disco
flexible", o permanente, conocido como un disco duro. Un disco
tiene cierto número de pistas en las cuales se almacenan señales,
típicamente en forma binaria, es decir, una forma interpretada como
una secuencia de unos y ceros. Señales de este tipo pueden definir
un programa de aplicación a ejecutar por el microprocesador, o
información almacenada en el disco que debe ser procesada por el
programa de aplicación. Típicamente, durante la operación, el
procesador hace que los datos sean leídos del medio de registro no
volátil a un elemento de memoria de circuito integrado, que es
típicamente una memoria volátil de acceso aleatorio tal como una
memoria dinámica de acceso aleatorio (DRAM) o memoria estática
(SRAM). El elemento de memoria de circuito integrado permite
típicamente un acceso más rápido que el disco a la información por
el procesador. El procesador manipula generalmente los datos
contenidos en la memoria de circuito integrado y copia luego los
datos al disco después que se ha completado el procesamiento. Se
conocen una diversidad de mecanismos para gestionar el movimiento
de los datos entre el disco y el elemento de memoria de circuito
integrado, y el objeto descrito en esta memoria no se limita a
tales mecanismos. Adicionalmente, el objeto descrito en esta
memoria no se limita a un sistema de memoria particular.
El objeto descrito en esta memoria no está
limitado a una plataforma de ordenador particular, procesador
particular, o lenguaje de programación de alto nivel particular.
Adicionalmente, el sistema de ordenador puede ser un sistema de
ordenador multiprocesador o puede incluir ordenadores múltiples
conectados a una red de ordenadores. Debe entenderse que cada
módulo (v.g. 110, 120) en FIG. 1 puede ser un módulo separado de un
programa de ordenador, o puede tratarse de programas de ordenador
separados. Tales módulos pueden ser operativos en ordenadores
separados. Los datos (v.g., 104, 106, 110, 114, y 116) pueden
almacenarse en un sistema de memoria o transmitirse entre sistemas
de ordenadores. El objeto descrito en esta memoria no está limitado
a ninguna implementación particular que utilice software o hardware
o microprogramación por cable, o cualquier combinación de los
mismos. Los diversos elementos del sistema, sea individualmente o
en combinación, pueden implementarse como un producto de programa
de ordenador materializado tangiblemente en un dispositivo de
almacenamiento legible por la máquina para ejecución por un
procesador de ordenador. Diversos pasos del proceso pueden ser
realizados por un procesador de ordenador que ejecute un programa
materializado tangiblemente en un medio legible por ordenador para
realizar funciones trabajando sobre una entrada y generando una
salida. Los lenguajes de programación de ordenador adecuados para
implementación de un sistema de este tipo incluyen lenguajes de
programación de procedimientos, lenguajes de programación
orientados al objeto, y combinaciones de ambos.
Una muestra que contiene glucosaminoglucano es
una muestra, al menos una fracción de la cual está compuesta de
glucosaminoglucanos o HLGAGs. Como se ha expuesto anteriormente, los
términos glucosaminoglucano o HLGAG incluyen, pero sin carácter
limitante, heparina, análogos de heparina, LMWH, heparina
biotecnológica, heparina modificada químicamente, o heparina
sintética.
El término heparinasa se utiliza genéricamente
para abarcar variantes funcionalmente activas y fragmentos de las
mismas además de las heparinasas naturales. Varias patentes y
solicitudes de patente describen modificaciones y variantes y
fragmentos de heparinasa útiles, con inclusión de la patente US
6.217.863 B1 y las solicitudes pendientes 09/384.959 y 09/802.285.
La heparinasa III causa despolimerización de la heparina.
Dependiendo de la concentración de heparinasa III utilizada, y del
periodo durante el cual se utiliza (digestión parcial frente a
digestión exhaustiva), se obtiene heparina de peso molecular
específico, y/o carga. Por ejemplo, aunque no se pretende ser
limitantes, ocurre que una digestión parcial de heparina con un
equivalente molar de heparinasa III daría como resultado una
fracción de mayor peso molecular, y/o mayor carga que lo haría una
reacción con un tiempo de digestión más largo. Asimismo, el aumento
de la equivalencia molar de heparinasa III dará como resultado una
fracción con menor peso molecular y/o menor carga que si se utiliza
una equivalencia molar de heparinasa inferior. En algunas
realizaciones, pueden utilizarse concentraciones y duración de
digestiones de Heparinasa III en combinación con sal, temperatura,
y composición del disolvente, como se describe en esta memoria, a
fin de obtener heparina de peso molecular, carga y/o actividad
biológica específicas.
En una realización, la muestra a analizar o
evaluar se degrada químicamente utilizando un método seleccionado
del grupo que incluye, pero sin carácter limitante:
despolimerización oxidante con H_{2}O_{2} o CU^{+} y
H_{2}O_{2}, escisión desaminante con nitrito de isoamilo, o
ácido nitroso, escisión eliminadora \beta con éster bencílico de
heparina por tratamiento alcalino o por heparinasa.
Una composición de LMWH es una mezcla de
moléculas de diversos pesos moleculares. Como se ha descrito arriba,
la mezcla homogénea contiene fragmentos que pueden variar en peso
molecular pero tienen un peso molecular medio inferior a 8.000 D.
Una composición de LMWH de compuestos que tengan un intervalo de
pesos moleculares de 4000-6000 Daltons, por
ejemplo, es una mezcla de diversas LMWH en la cual el tamaño medio
oscila entre 4.000 a 6.000 Da. En algunas realizaciones, el
porcentaje de LMWH que está comprendido entre 4.000 y 6.000 Da en
la muestra es 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de los
componentes de la mezcla.
Las preparaciones LMWH se preparan a partir de
fuentes de HLGAG. Una "fuente de HLGAG", como se utiliza en
esta memoria, hace referencia a una composición de
glucosaminoglucano semejante a heparina que puede manipularse para
producir LMWH utilizando tecnología estándar, con inclusión de
degradación enzimática, etc. Como se ha descrito arriba, los HLGAGs
incluyen, pero sin carácter limitante heparina aislada, heparina
modificada químicamente, heparina preparada por biotecnología,
heparina sintética, sulfato de heparano, y LMWH. Así pues, pueden
aislarse HLGAGs de fuentes naturales, prepararse por síntesis
directa, mutagénesis, etc. Los HLGAGs pueden ser sustancialmente
puros en algunas realizaciones. Como se utiliza en esta memoria, el
término "sustancialmente puro" significa que los polisacáridos
están esencialmente exentos de otras sustancias en una proporción
práctica y apropiada para su uso propuesto. En particular, los
polisacáridos son suficientemente puros y están suficientemente
exentos de otros constituyentes biológicos de sus ambientes
hospedadores, de tal modo que son útiles en, por ejemplo,
producción de preparaciones farmacéuticas.
Las preparaciones de LMWH como se utilizan en
esta memoria son sales de GAGs sulfatados que tienen un peso
molecular (MW) medio inferior a 8.000 Da y para las cuales al menos
60% de todas las moléculas tienen un NW inferior a 8.000 Da. Por
definición, las preparaciones LMWH se producen a partir de una
muestra de HLGAG. El término LMWH no abarca polisacáridos que se
sintetizan directamente como LMWHs, tales como SR90107A. SR90107A
es un polisacárido sintético que tiene un peso molecular de
aproximadamente 1.500 Da. Estos tipos de compuestos, que se
preparan directamente como compuestos de peso molecular bajo en
lugar de prepararse a partir de una fuente de HLGAGs no se
consideran comprendidos dentro de la clase de LMWH. El término LMWH
incluye de hecho, sin embargo, los HLGAGs sintéticos que están
procesados para producir LMWHs.
Se han utilizado varios métodos diferentes para
la preparación comercial de LMWHs. El fraccionamiento directo por
tamaños se ha utilizado para preparar LMWH (Fraxiparina) en una
escala experimental, pero su deficiente rendimiento ha impedido por
regla general su utilización en escala industrial. Para propósitos
de producción industrial, se han utilizado cierto número de
procesos químicos o enzimáticos. Los procesos químicos aprovechan
la ventaja de una extensa gama de reacciones tales como
despolimerización parcial con ácido nitroso (Fragmina), escisión
oxidante con H_{2}O_{2} (Normiflo y Fluxum), escisión oxidante
con Cu^{++} y H_{2}O_{2}, o por bencilación seguida por
\beta-eliminación e hidrólisis alcalina
(Enoxaparina). Se han descrito también métodos enzimáticos para
generar LMWH utilizando despolimerización parcial
\beta-eliminadora por heparinasa I
(Logiparina).
La posibilidad de identificar el porcentaje de
región de fijación de AT no escindida, tal como el decasacárido que
tiene la estructura
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S},
o uno de los tetrasa-cáridos
\DeltaUH_{NAC,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAC,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S} (o compuestos afines) en una
muestra permite que se formulen composiciones con cantidades
específicas de región no escindida de fijación de AT intacta. Esta
posibilidad de preparar LMWH con porcentajes conocidos de la región
de fijación de AT intacta proporciona un método para cuantificar la
actividad de composiciones terapéuticas de LMWH. Así pues, los
métodos de la invención hacen posible que una persona con
experiencia en la técnica prepare o identifique una composición
apropiada de LMWH, dependiendo del individuo y el trastorno a
tratar.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"intacto" significa no escindido y completo. El término
"regiones de fijación de AT" hace referencia a una región de
HLGAG que interacciona específicamente con AT-III.
La región de fijación de AT incluye el compuesto decasacárido que
tiene la estructura:
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}
y los tetrasacáridos \DeltaUH_{NAC,6S}GH_{NS,3S,6S},
\DeltaU_{HN,6S}GH_{NS,3S,6S}; \DeltaUH_{NAC,6S}
GH_{NS,3S}; y \DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}. En algunas realizaciones, la preparación de LMWH es una composición en la cual al menos 20% de la secuencia del polisacárido en la composición es región de fijación de AT intacta. En otras realizaciones, al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o 55% de la secuencia del polisacárido en la composición es región de fijación de AT intacta. Como se ha expuesto anteriormente, el porcentaje óptimo de AT-10 intacto en una composición para tratamiento variará dependiendo de la condición médica objeto de tratamiento. Un nivel mayor de actividad puede ser deseable para pacientes en peligro de formación de coágulos de sangre que en pacientes sometidos a tratamiento por cáncer, en los cuales no es deseable actividad anticoagulante.
GH_{NS,3S}; y \DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}. En algunas realizaciones, la preparación de LMWH es una composición en la cual al menos 20% de la secuencia del polisacárido en la composición es región de fijación de AT intacta. En otras realizaciones, al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o 55% de la secuencia del polisacárido en la composición es región de fijación de AT intacta. Como se ha expuesto anteriormente, el porcentaje óptimo de AT-10 intacto en una composición para tratamiento variará dependiendo de la condición médica objeto de tratamiento. Un nivel mayor de actividad puede ser deseable para pacientes en peligro de formación de coágulos de sangre que en pacientes sometidos a tratamiento por cáncer, en los cuales no es deseable actividad anticoagulante.
En otros aspectos, la preparación LMWH puede
tener >15% de disacáridos disulfatados, <75% de disacáridos
trisulfatados, 3-5% de disacáridos monosulfatados y
>2% de tetrasacárido 4-7.
La cantidad de región de fijación de AT en las
preparaciones de LMWH puede manipularse por una diversidad de
parámetros experimentales. Los métodos de la invención hacen posible
controlar las cantidades de región de fijación de AT en una
preparación LMWH, permitiendo el control de calidad de las
preparaciones LMWH que utilizan el componente de firma,
proporcionando un procedimiento de aislamiento mejorado que dé como
resultado el aislamiento de una preparación rica en LMWH, y
proporcionando nuevas reglas para las especificidades de escisión
de las heparinasas. Las dos primeras de estas propiedades se han
expuesto en detalle anteriormente.
El papel de las heparinasas en la preparación de
LMWHs con regiones de fijación de AT intactas ha sido descrito en
la técnica anterior. Específicamente, una secuencia publicada que
contenía un sitio de fijación de AT-III intacto, se
describió como
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}
(Toida, T., Hileman, R. E., Smith, A. E., Vlahova, P. I. &
Linhardt, R J. (1996) J Biol Chem 271,
32040-7). Adicionalmente, se ha demostrado en la
técnica anterior que tetrasacáridos que contienen
3-O-sulfato no son escindibles por
ninguna de las heparinasas (Yamada, S., Yoshida, K., Sugiura, M,
Sugahara, K., Khoo, K. H., Morris, H. R. y Dell, A. (1993) J
Biol Chern 268, 4780-7.), lo que sugiere que los
enlaces con una glucosamina sulfatada en 3-O son
resistentes a la escisión. Sorprendentemente, se descubrió que estas
doctrinas de la técnica anterior eran incorrectas. En los ejemplos,
los autores de la presente invención han demostrado concluyentemente
por una diversidad de técnicas físico-químicas, que
la estructura real de AT-10 es
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2s}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}
y por consiguiente no contiene un sitio de fijación de
AT-III intacto. Teniendo en cuenta la
reinterpretación de la estructura de AT-10, los
autores de la invención trataron de reexaminar la acción de las
heparinasas I-III frente a oligosacáridos de
fijación de AT que contienen
3-O-sulfato. Dado que
AT-10 (ultra-LMWH, MW = 2769,3 Da)
se obtiene por escisión controlada de heparina con heparinasa I, se
intentó también examinar las consecuencias funcionales de un
oligosacárido, utilizando técnicas bio-analíticas
establecidas. Es necesaria una comprensión de este tipo tanto de la
acción de las heparinasas como de sus consecuencias funcionales para
la generación eficiente y óptima de LMWH para uso clínico.
Así, como se muestra en los Ejemplos, se ha
descubierto que las heparinasas I y II escinden realmente la región
de fijación de AT de los HLGAGs dando como resultado la pérdida de
la región de fijación de AT intacta, mientras que la heparinasa III
no lo hace. Adicionalmente, se ha descubierto que la sulfatación en
3-O de la glucosamina en el extremo reductor de un
enlace glicosídico imparte resistencia a la escisión por las
heparinasas I, II y III. El examen de las consecuencias biológicas
y farmacológicas de un oligosacárido de heparina que contiene
únicamente un sitio de fijación parcial de AT-III
muestra que un oligosacárido de este tipo tiene una actividad
anti-Xa significativa pero carece de algunos de los
atributos funcionales de los glucosaminoglucanos afines a heparina
que contiene un sitio
AT-III intacto.
AT-III intacto.
Estos métodos son también válidos para una clase
más amplia de compuestos. Las doctrinas de la invención pueden
utilizarse para desarrollar terapéuticas especializadas de
polisacáridos a partir de una gran diversidad de materiales
polisacáridos de partida. Una vez que se identifica un componente
activo en un polisacárido, dicho componente activo puede utilizarse
como firma para el control de calidad de la muestra, y puede
utilizarse para generar e identificar composiciones terapéuticas
que están mejoradas para una actividad terapéutica particular, y
que poseen las regiones que son responsables para la eliminación de
dichos efectos.
Las composiciones pueden administrarse
terapéuticamente a un individuo. Como se utiliza en esta memoria, un
individuo es un humano, primate no humano, vaca, caballo, cerdo,
oveja, cabra, perro, gato o roedor.
Los HLGAGs y las LMWHs en particular tienen
muchas utilidades terapéuticas. Las composiciones LMWH de la
invención pueden utilizarse para el tratamiento de cualquier tipo
de afección en el cual la terapia con LMWH haya sido identificada
como una terapia útil. Así, la invención es útil en una diversidad
de métodos in vitro, in vivo y ex vivo en los
cuales son útiles las terapias con LMWH. Por ejemplo, es sabido que
las composiciones LMWH son útiles para prevenir la coagulación,
inhibir el crecimiento de las células cancerosas y las metástasis,
prevenir la angiogénesis, prevenir la neovascularización, y prevenir
la psoriasis. Las composiciones LMWH pueden ser utilizadas también
en ensayos in vivo, tales como una muestra de control de
calidad.
\newpage
Todos estos trastornos son bien conocidos en la
técnica y se describen, por ejemplo, en Harrison's Principles of
Internal Medicine (McGraw Hill, Inc., Nueva
York).
La descripción siguiente de experimentos
realizados es ilustrativa y no limitante del alcance la invención
reivindicada.
La heparina y los glucosaminoglucanos de sulfato
de heparano representan una clase importante de moléculas que
interaccionan con y modulan la actividad de factores de crecimiento,
enzimas, y morfogenes. De las muchas funciones biológicas de esta
clase de moléculas, una de sus funciones más importantes es su
interacción con antitrombina III (AT-III). La
fijación de AT-III a una secuencia específica del
pentasacárido de heparina, que contenga un
3-O-sulfato extraño en una
glucosamina N-sulfatada,
6-O-sulfatada, aumenta 1000 veces la
capacidad de AT-III para inhibir proteasas
específicas en la cascada de coagulación. De esta manera, los
glucosaminoglucanos afines a la heparina (HLGAGs) juegan un papel
biológico y farmacológico importante en la modulación de la
coagulación de la sangre. Recientemente, se ha desarrollado una
metodología de secuenciación (Solicitudes de Patente US Núms. de
Serie 09/557.997 y 09/558.137, presentadas en fecha 24 de abril de
2000, de los mismos inventores, y Venkataraman, G., Shriver, Z.,
Raman, R. y Sasisekharan, R. (1999) Science 286,
537-42.) que sugiere las relaciones
estructura-función de esta importante clase de
moléculas. Esta metodología combina un esquema de nomenclatura
codificado por propiedades (PEN), para tratar el gran contenido de
información (propiedades) de los HLGAGs, con la ionización por
desorción láser asistida con matriz-espectrometría
de masas (MALDI-MS) y la degradación enzimática y
química como restricciones experimentales para secuenciar
rápidamente cantidades de picomoles de los oligosacáridos HLGAG.
Utilizando el enfoque PEN-MALDI anterior, los
autores de la presente invención han encontrado que la secuencia
del decasacárido utilizado en este estudio es
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}
(\pmDDD4-7). Los autores de la presente invención
han confirmado sus propios resultados utilizando Secuenciación
Integral de Glucanos y resonancia magnética nuclear unidimensional
del protón. Adicionalmente, los autores de la presente invención
han demostrado que este enfoque es flexible y es capaz de deducir
información de secuencia a partir de una mezcla de oligosacáridos.
Así pues, esta metodología hace posible tanto el análisis de otras
secuencias extrañas en polisacáridos tales como heparina/sulfato de
heparano con actividades biológicas importantes, al mismo tiempo
que proporciona la base para el análisis estructural de este grupo
farmacológicamente importante de heparina/sulfatos de heparano.
Abreviaturas: HLGAG, glucosaminoglucanos afines
a heparina; AT-III, antitrombina III;
AT-10, decasacárido fraccionado de
AT-III aislado por digestión parcial de heparina;
IGS, Secuenciación Integral de Glucanos; PEN, nomenclatura
codificada por propiedades; MALDI-MS, espectrometría
de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz;
CE, electroforesis capilar; abreviaturas de las secuencias de HLGAG
como sigue, I, ácido
\alpha-L-idurónico; G, ácido
\beta-D-glucurónico; \DeltaU, un
ácido \Delta^{4,5}-urónico; 2S,3S, y 6S,
sulfatación en 2-O, 3-O, o
6-O respectivamente; NS y _{NAc},
N-sulfatación y N-acetilación de la
glucosamina.
Materiales. El decasacárido
AT-10 es el mismo sacárido utilizado en estudios
previos (Rhomberg, A. J., Shriver, Z., Biemann, K. y Sasisekharan,
R. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95,
12232-7 y Ernst, S., Rhomberg, A. J., Biemann, K. y
Sasisekharan, R. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95,
4182-7). Los oligosacáridos se disolvieron en agua
desionizada a concentraciones de 10-35 \muM. Las
heparinasas I-III de Flavobacterium
heparinum se purificaron como se ha descrito previamente. Las
exoenzimas
\alpha-L-iduronato-2-O-sulfatasa,
\alpha-L-iduronidasa,
\beta-D-glucuronidasa y
N-acetilglucosamina-6-sulfatasa
se adquirieron de Oxford Glycosciences. Una solución acuosa al 40%
de nitrito de sodio se adquirió de Aldrich Chemical. Los estándares
de disacáridos para el análisis de composición se adquirieron de
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Análisis de la composición. El análisis
de la composición de los oligosacáridos se completó por digestión
exhaustiva de una muestra 30 \muM de AT-10 seguida
por electroforesis capilar (CE) como se ha descrito previamente
(Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998)
Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81).
De modo resumido, se añadieron a 1 nmol de oligosacárido 200 nM de
heparinasas I, II y III en acetato de sodio 25 mM, NaCl 100 mM, y
tampón de acetato de calcio 5 mM, de pH 7,0. Se dejó que la reacción
transcurriera a 30ºC durante una noche y se analizó luego por CE en
polaridad invertida con un tampón corriente de
tris-fosfato 50 mM y sulfato de dextrano 10 \muM
de pH 2,5.
Productos de digestión. Se diseñaron
digestiones con heparinasa I cortas o exhaustivas. Para digestión
corta, se incubó heparinasa I 50 nM con el sustrato durante 10
minutos antes del análisis. Las digestiones exhaustivas se
completaron con enzima 200 nM durante una noche. Las reacciones
enzimáticas se realizaron por adición de 1 \mul de solución de
enzima en un tampón que contenía ovoalbúmina 10 \muM, sulfato de
dextrano 1 \muM, acetato de calcio 5 mM y tampón de
etilenodiamina 10 mM a pH 7,0 para 4 \mul de solución acuosa de
sustrato; se dejó que la digestión transcurriera a la temperatura
ambiente como se ha descrito anteriormente (Venkataraman, G.,
Shriver, Z., Raman, R. y Sasisekharan, R. (1999) Science
286, 537-42 y Rhomberg, A. J., Ernst, S.,
Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA
95, 4176-81). Se completó la escisión parcial
con ácido nitroso utilizando una modificación de procedimientos
publicados (Turnbull, J. E., Hopwood, J. J. y Gallagher, J. T.
(1999) Proc Natl Acad Sci USA 96,
2698-703). Las digestiones con exoenzimas se
completaron simultánea o secuencialmente. Las concentraciones
finales de enzima están comprendidas en el intervalo de
20-40 miliunidades/ml, y la digestión se llevó a
cabo a 37ºC.
Espectrometría de masas. Los análisis
espectrales de masas se realizaron en un equipo Reflectron
PerSeptive Biosystems Voyager Elite de tiempo de vuelo en el modo
lineal con extracción retardada. Se prepararon muestras de los
materiales digeridos tomando 0,5 \mul de la mezcla de reacción y
añadiéndolos a 4,5 \mul de solución matriz (12 mg/ml de ácido
cafeico en acetonitrilo al 30%) que contenía un exceso molar de dos
veces del péptido básico (RG)_{19}R (masa calculada del
ión (M+H)^{+} = 4.226,8). La adición del péptido básico
para formar específicamente quelatos con los oligosacáridos HLGAG y
los parámetros de recogida de los espectros de masa permiten el
análisis directo de la muestra sin necesidad de repurificación de la
muestra(Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y
Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 417681).
Las muestras se aplicaron por puntos sobre la diana y se recogieron
los espectros de masas utilizando los parámetros reseñados
previamente (Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y
Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95,
4176-81). Se observan en cada espectro de masas los
iones (M+H)^{+} del péptido básico y el ión
(M+H)^{+} de un complejo 1:1 péptido:sacárido, y se
determina la masa del sacárido por sustracción del valor m/z
medido del ión (M+H)^{+} del péptido del correspondiente
al complejo 1:1 (Juhasz, P. y Biemann, K. (1995) Carbohydr
Res 270, 131-47). Todos los espectros obtenidos
de una placa se calibraron externamente utilizando un estándar de
(RG)_{19}R y su complejo con un hexasacárido derivado con
ácido nitroso de la secuencia
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}Man_{6S} (masa
calculada de 1655,4) con parámetros instrumentales idénticos. Esta
metodología requiere sulfatación suficiente del sacárido para
asegurar una complejación eficiente del complejo. Como tal, los
sacáridos pequeños infrasulfatados (es decir, mono- y disacáridos)
no se observan con esta metodología (Juhasz, P. y Biemann, K.
(1995) Carbohydr Res 270, 131-47).
Secuenciación Integral de Glucanos. La
secuenciación integral de glucanos (IGS) utilizando separación
electroforética se llevó a cabo como se ha descrito (Turnbull, J.
E., Hopwood, J. J. y Gallagher, J. T. (1999) Proc Natl Acad Sci
USA 96, 2698-703). Las condiciones de escisión
parcial con ácido nitroso se modificaron utilizando HCl 25 mM y
nitrito de sodio 2,5 mM y tiempos de parada de 5, 10, 20, 30, 120 y
240 minutos.
Espectroscopia ^{1}H NMR. La
espectroscopia ^{1}H NMR se realizó utilizando las condiciones
descritas previamente (Nadkarni, V. D., Toida, T., Van Gorp, C. L.,
Schubert, R. L., Weiler, J. M., Hansen, K. P., Caldwell, E. E. y
Linhardt, R. J. (1996) Carbohydr Res 290,
87-96). Se sometió AT-10 a
cromatografía de intercambio iónico para separar las impurezas
paramagnéticas. Una columna (1 cm x 10 cm) de AG
50W-X8 (Bio-Rad Japan, Tokio) se
convirtió en la forma sodio por tratamiento con 5 ml de NaOH 0,1M y
se lavó con agua durante 12 horas antes de su utilización. La
muestra para los experimentos NMR se aplicó a la columna, se eluyó
con 20 ml de agua y se liofilizó. La muestra (\sim1 mg) se
liofilizó luego tres veces a partir de 99,8% D_{2}O (Merck,
Alemania) y se disolvió en 0,5 ml de D_{2}O 100% (Aldrich Japan,
Tokio) para espectroscopia NMR en un tubo de 5 mm. La
espectroscopia ^{1}H-NMR 1D de
AT-10 se realizó en un espectrómetro JEOL GSX500A
equipado con una sonda sintonizable de 5 mm en gradiente de campo a
298 K.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha desarrollado recientemente una técnica de
espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida
por matriz (MALDI-MS) que hace posible la
determinación de la masa de oligosacáridos HLGAG complejos (desde
di- a decasacáridos) con una exactitud mejor que \pm1 Da (Juhasz,
P. y Biemann, K. (1995) Carbohydr Res 270,
131-47 and Juhasz, P. y Biemann, K. (1994) Proc
Natl Acad Sci USA 91, 4333-7). Debido a la
exactitud de la medida resultante de la peso molecular de los HLGAGs
individuales, es posible una asignación única tanto de la longitud
de un fragmento como del número y clase de sustituyentes,
especialmente si el oligosacárido es un tetradecasacárido o más
pequeño (Venkataraman, G., Shriver, Z., Raman, R. y Sasisekharan, R.
(1999) Science 286, 53742). Adicionalmente,
MALDI-MS puede detectar fragmentos de oligosacáridos
generados por degradación enzimática o química de un oligosacárido
(Rhomberg, A. J., Shriver, Z., Biemann, K. y Sasisekharan, R.
(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 12232-7;
Ernst, S., Rhomberg, A. J., Biemann, K. y Sasisekharan, R.
(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4182-7; y
Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998)
Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81).
Finalmente, la sensibilidad de MALDI-MS es tal que
pueden detectarse fácilmente cantidades tan pequeñas como 100
femtomoles de material.
Además de la técnica experimental
MALDI-MS, se desarrolló una nomenclatura codificada
por propiedades (PEN) para representar las 32 unidades de
disacáridos utilizando un sistema de codificación hexadecimal
(Venkataraman, G., Shriver, Z., Raman, R. y Sasisekharan, R. (1999)
Science 286, 537-42). El desarrollo de
PEN es necesario para manejar el gran contenido de información
(propiedades) de los HLGAGs. Cada uno de los números hexadecimales
se deduce basándose en una lógica interna que se manifiesta en sí
misma en términos de la distribución de los sulfatos en una unidad
de bloque de construcción particular y no está asignado de modo
aleatorio simplemente para identificar cada unidad de disacárido.
Este sistema es importante para los HLGAGs en el sentido de que
permite la manipulación rápida de secuencias utilizando operaciones
matemáticas o binarias simples, proporcionando con ello un
instrumento de manipulación del gran contenido de información de los
polisacáridos complejos. Adicionalmente, la diversidad estructural
inherente en los HLGAGs surge necesariamente de las diferencias de
propiedades (localización de los grupos sulfato y acetato cargados)
haciendo de este modo del PEN un esquema de asignación natural para
los HLGAGs. Esto está en contraste directo con los códigos
alfabéticos utilizados para representar los nucleótidos del DNA y
los aminoácidos o proteínas que sirven como meros identificadores y
no codifican información alguna (propiedades) y no capturan por
tanto la heterogeneidad química de estos biopolímeros.
El sistema de codificación hexadecimal comprende
los alfanuméricos 0-9 y A-F. Dado
que la unidad de disacárido tiene cuatro posiciones, a
saber, 2-O, N-, 3-O y
6-O que pueden modificarse, es inmediato asignar
cada una de las cuatro posiciones de dígitos binarios del código
hexadecimal a una de estas posiciones químicas. Adicionalmente,
dado que existen únicamente dos modificaciones posibles en cada
posición (2-O, 3-O y
6-O pueden estar sulfatados o libres, y la posición
N puede estar sulfatada o acetilada *), el uso de un
sistema binario captura estas modificaciones como estados simples
encendidos o apagados. Por ejemplo, si, dentro de una unidad de
disacárido dada, la posición 2-O está sulfatada,
entonces se le asigna el valor binario de 1. Inversamente, si la
posición 2-O en un disacárido dado no está
sulfatada, entonces se le asigna el valor binario de 0.
Para identificar un disacárido con un carácter
alfanumérico, se han asignado las 4 posiciones binarias de la
manera siguiente: se asignó la posición 2-O a la
posición binaria situada más a la izquierda, seguido por las
posiciones 6-O, 3-O y N- en este
orden. En cada caso, como se ha reseñado anteriormente, se utilizó
el código binario 1 para representar posiciones sulfatadas y se
utilizó 0 para representar posiciones no sulfatadas en el caso de
2-O, 6-O y 3-O, y
acetilación en el caso de la posición N.
Para codificar el estado isomérico del ácido
urónico (a saber, ácido idurónico frente a ácido glucurónico), se
designaron las unidades de disacáridos como +/-. De este modo, es
posible asignar los códigos hexadecimales positivos a las unidades
que contienen ácido idurónico y los códigos hexadecimales negativos
a las unidades que contienen ácido glucurónico. Así, las unidades
de disacáridos con el mismo código hexadecimal pero signos opuestos
poseen el mismo patrón de sulfatación, difiriendo únicamente en el
estado isomérico del ácido urónico. La Tabla 1 reseña el uso de PEN
para las unidades de disacáridos presentes en este estudio.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los códigos hexadecimales derivados para las
unidades de disacáridos existentes en AT-10 se
muestran en la Tabla 1. La columna 1 es la posición binaria que
codifica el estado isomérico del ácido urónico. Las columnas 2 a 5
codifican las modificaciones en las posiciones 2-O,
6-O, 3-O y N- de la unidad de
disacárido. La columna 6 muestra los códigos hexadecimales
representados por los dígitos binarios en las columnas 2 a 5. La
columna 7 muestra la unidad de disacárido representada por el
código en la columna 6. La columna 8 muestra las masas teóricas
calculadas de la unidad de disacárido presente internamente en una
secuencia. Para las modificaciones químicas o enzimáticas de estos
disacáridos, se utiliza la nomenclatura siguiente: ácido urónico con
un enlace insaturado \Delta^{4-5} (\DeltaU) =
\pm; unidad de disacárido del extremo reductor con un marcador de
masa = ^{t}; unidad de disacárido con un anillo anhidromanosa de
cinco miembros = ^{1}.
\newpage
De este modo, la estrategia para la asignación
de secuencias de los oligosacáridos HLGAG por
PEN-MALDI implica esencialmente los pasos
siguientes. En primer lugar, se utiliza MALDI-MS
del oligosacárido intacto para asignar la longitud y el número
total de sulfatos y acetatos presentes en el oligosacárido. Se
utiliza luego el análisis de la composición para determinar el
número y tipo de los bloques de construcción de los disacáridos. Con
esta información, se construye una lista maestra de todas las
secuencias posibles que contienen dichas unidades de disacárido. De
esta manera, no se excluye secuencia alguna del análisis, por
extraña que pueda ser una secuencia dada. La masa de fragmentos de
oligosacáridos generados por digestión enzimática o degradación
química se aplica como restricciones experimentales, y se eliminan
las secuencias que no satisfacen estas restricciones. De manera
iterativa, moviéndose desde las restricciones experimentales a la
lista maestra de secuencias posibles cada vez menor, puede llegarse
rápidamente a una solución de secuencia única utilizando un mínimo
de material. Es importante que pueden utilizarse caminos múltiples
utilizando restricciones experimentales separadas para convergir en
una sola secuencia, asegurando la exactitud de la asignación.
\vskip1.000000\baselineskip
AT-10 y todos los oligosacáridos
derivados del mismo por tratamiento enzimático o químico se detectan
con MALDI-MS como complejos no covalentes con el
péptido básico (RG)_{19}R (Rhomberg, A. J., Ernst, S.,
Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA
95, 4176-81 y Juhasz, P. y Biemann, K. (1995)
Carbohydr Res 270, 131-47). Utilizando esta
metodología, se observan dos especies, un ión (M+H)^{+} de
(RG)_{19}R y un ión (M+H)^{+} para el complejo
péptido:sacárido. La peso molecular de un oligosacárido se obtiene
por sustracción del valor (M+H)^{+}
del péptido del valor (M+H)^{+} del complejo 1:1 sacárido:péptido. La Tabla 2 enumera todos los fragmentos posibles observados en este estudio, sus valores de masa calculados y derivados experimentalmente, y la estructura deducida de los fragmentos después de la asignación de secuencias de AT-10. La Figura 1 muestra que el componente principal de AT-10 tiene un valor m/z de 6.999,3. Cuando se sustrae el valor m/z del péptido protonizado, se encuentra que el valor experimental para la masa de este oligosacárido es 2770,2, que puede asignarse únicamente a un decasacárido con 13 sulfatos y un grupo acetato. El espectro de masas de AT-10 indica la presencia de otra especie (a la que se hace referencia en lo sucesivo como el contaminante) de masa 2690,1 (después de sustracción de la contribución del péptido), que corresponde a un oligosacárido con 12 sulfatos y un grupo acetato.
del péptido del valor (M+H)^{+} del complejo 1:1 sacárido:péptido. La Tabla 2 enumera todos los fragmentos posibles observados en este estudio, sus valores de masa calculados y derivados experimentalmente, y la estructura deducida de los fragmentos después de la asignación de secuencias de AT-10. La Figura 1 muestra que el componente principal de AT-10 tiene un valor m/z de 6.999,3. Cuando se sustrae el valor m/z del péptido protonizado, se encuentra que el valor experimental para la masa de este oligosacárido es 2770,2, que puede asignarse únicamente a un decasacárido con 13 sulfatos y un grupo acetato. El espectro de masas de AT-10 indica la presencia de otra especie (a la que se hace referencia en lo sucesivo como el contaminante) de masa 2690,1 (después de sustracción de la contribución del péptido), que corresponde a un oligosacárido con 12 sulfatos y un grupo acetato.
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En la columna 1 se muestra el valor m/z del
complejo protonizado 1:1 del sacárido y el péptido básico
(RG)_{19}R. La columna 2 muestra la masa observada del
sacárido obtenido por sustracción del valor del péptido protonizado
observado en el espectro del complejo protonizado 1:1. Las
estructuras químicas deducidas de los sacáridos para los picos
correspondientes en los espectros de masas se muestran en la columna
3. En la columna 4 se muestran las masas teóricas calculadas para
las estructuras deducidas. Obsérvese que la masa observada (col. 2)
está siempre dentro de \pm1 Dalton de la masa calculada (col.
4).
\newpage
El análisis de composición utilizando CE indica
la presencia de 4 bloques de construcción disacáridos,
correspondientes a AU_{2S}-H_{NS,6S} (\pmD),
\DeltaU-H_{NAc,6S} (\pm4),
\DeltaU-H_{NS,6S} (\pm 5), y
\DeltaU-H_{NS,3S,6S} (\pm7), en la relación
relativa de 2,90:1,00:1,05:0,15, respectivamente. Así, el análisis
de composición de esta muestra confirmó que existen dos especies,
una principal (\sim85%) y la otra menos importante (\sim15%).
AT-10 tiene que ser un decasacárido constituido por
los bloques de construcción
\DeltaU_{2S}-H_{NS,6S}(\pmD),
\DeltaU-H_{NAc,6S} (\pm4), y
\DeltaU-H_{NS,3S,6S} (\pm7) en una relación de
3:1:1. Colectivamente, los datos CE y MALDI-MS se
utilizaron para construir una lista maestra de posibles secuencias
para AT-10. Los autores de la invención han
encontrado que existen 320 secuencias que pueden justificar los
datos CE y MS (Tabla 2). Estas 320 secuencias constituyen la lista
maestra de la que se eliminaron secuencias sobre la base de las
restricciones experimentales hasta convergencia en una solución
única.
Adicionalmente, el análisis de composición
confirmó que existe un contaminante presente que era
estructuralmente similar a AT-10, excepto por la
presencia de \DeltaU-H_{NS,6S} (\pm5). A
partir de los datos CE, se determinó que la composición del
contaminante era \DeltaU_{2S}-H_{NS,6S}
(\pmD), \DeltaU-H_{NAc,6S} (\pm4),
\DeltaU-H_{NS,3S,6S} (\pm7), y
\DeltaU-H_{NS,6S} (\pm 5) en la relación
relativa de 2:1:1:1 por sustracción sucesiva.
Una vez construida la lista maestra de
posibilidades de secuencia, se utilizó una combinación de
PEN-MALDI, IGS (Turnbull, J. E., Hopwood, J. J. y
Gallagher, J. T. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96,
2698-703), y análisis NMR para secuenciar
AT-10 y analizaron luego la secuencia del
contaminante.
\vskip1.000000\baselineskip
De la lista de 320 secuencias posibles generadas
a partir de los datos de composición, se han utilizado una serie de
restricciones experimentales, que incluyen el uso de heparinasa I y
ácido nitroso, respectivamente, para asignar la secuencia de
AT-10.
La digestión corta (incompleta) de
AT-10 con la heparinasa I da como resultado cinco
fragmentos de peso molecular 577,7, 1073,9, 1155,6, 1614,6 y 2192,2
(Figura 2a). El fragmento con masa 577,7 corresponde a \pmD. El
fragmento 1155,6 corresponde a un tetrasacárido hexasulfatado que
debe tener una de las estructuras siguientes: \pmDD,
\pmD-D, \pmD7, \pmD-7, \pm7D
o \pm7-D. El fragmento con 1614,6 corresponde a un
hexasacárido heptasulfatado y monoacetilado, y el fragmento con
2192,2 corresponde a un octasacárido decasulfatado y monoacetilado.
El último pico, a 1073,9 fue asignado inequívocamente al
contaminante (véase más adelante para análisis). Cuando se
investigó la lista de 320 secuencias respecto a estos fragmentos
formados por digestión simulada con heparinasa I, se redujo la
lista a 52 secuencias (Tabla 2).
La tasa de escisión del sustrato por heparinasa
I es dependiente del tamaño (Linhardt, R. J., Turnbull, J. E.,
Wang, H. M., Loganathan, y Gallagher, J. T. (1990)
Biochemistry 29, 2611-7). Para identificar la
totalidad de los enlaces sulfatados en 2-O que
contenían iduronato en AT-10, se trató la misma con
heparinasa I en condiciones que dieron como resultado la escisión
completa de todos los enlaces susceptibles. En estas condiciones, el
hexasacárido y el tetrasacárido del contaminante, se mantenían
intactos (Figura 2b). Sin embargo, el tetrasacárido hexasulfatado
(masa de 1155,6 de la Figura 2a) se escindía. Por tanto, este
sacárido tiene la secuencia \pmDD. De las 52 asignaciones de
secuencia posibles para AT-10, únicamente 28 pueden
satisfacer los datos exhaustivos de los materiales digeridos con
heparinasa I.
A continuación, se trató AT-10
con semicarbazida para producir una semicarbazona en la posición
anomérica. De esta manera se introdujo un marcador de masa
(\Delta = 56,1) para diferenciar fragmentos derivados del extremo
reductor en oposición al extremo no reductor. El tratamiento de
AT-10 marcado con heparinasa I produjo cinco
fragmentos (Figura 2c). Por una comparación de AT-10
no derivatizado tratado con heparinasa I (Figura 2a), el
hexasacárido heptasulfatado y monoacetilado aparece marcado y por
tanto tiene que derivarse del extremo reductor de
AT-10. La aplicación de esta restricción a las 28
secuencias restantes elimina todas ellas excepto 12
(Tabla 3).
(Tabla 3).
La estrategia por pasos utilizada para
secuenciar la muestra de decasacárido se presenta en la Tabla 3. La
aplicación de restricciones experimentales para eliminar las
secuencias de la lista maestra de 320*
secuencias se utilizó para convergir en la secuencia final. En los
recuadros de la izquierda se muestra el número de secuencias que
satisfacían las restricciones experimentales. Los recuadros a la
derecha muestran las secuencias que satisfacen las restricciones
experimentales junto con los posibles fragmentos formados para las
masas representadas entre paréntesis en la parte superior de la
tabla.
La inspección de las 12 secuencias que quedaban
en la Tabla 3 indica que la diferencia primaria estriba en la
identidad del hexasacárido del extremo reductor. Por esta razón, por
degradación de AT-10 con ácido nitroso y
utilización cuidadosa de las exoenzimas, se determinó la secuencia
del tetrasacárido del extremo reductor. En primer lugar, se trató
exhaustivamente con ácido nitroso AT-10 marcado y
fueron fácilmente detectables dos especies (Figura 3). La primera,
con una masa de 1013,8, corresponde a un tetrasacárido de
anhidromanosa marcado con cuatro sulfatos y un acetato. La otra,
con una masa de 958,8, corresponde al mismo tetrasacárido sin
marcar. Ambos podrían asignarse a una de las secuencias siguientes:
\pm47, \pm4-7, \pm4-D. Así,
sobre la base de esta información, pudieron eliminarse la mitad de
las secuencias posibles, dejando únicamente seis soluciones de
secuencia posibles para AT-10 (Tabla 3).
Para asignar únicamente el estado isomérico de
las dos unidades de disacárido en el extremo reductor de
AT-10, se utilizaron las restricciones
experimentales siguientes: se incubó el producto de digestión
exhaustiva con ácido nitroso con la enzima exolítica
\alpha-iduronidasa, que corta específicamente el
ácido idurónico en el extremo no reductor. Un desplazamiento en el
espectro de 178,0 confirmó el ácido urónico como 4 y su estado
isomérico como +, es decir, IH_{NAc,6S} o +4. Únicamente tres
secuencias podrían proporcionar los fragmentos observados, a
saber, \pm7DD4-D, \pmDDD4-7
y \pmDDD47.
Para diferenciar entre estas tres últimas
alternativas e identificar el disacárido del extremo reductor, el
producto tratado con iduronidasa se trató primeramente con
6-O-sulfatasa y
N-desacetilasa a fin de separar la hexosamina,
dejando únicamente el disacárido del extremo reductor. El
tratamiento de esta muestra con
\beta-glucuronidasa dio como resultado la
degradación a monosacáridos. Esto identificó el disacárido del
extremo reductor como -7 (G-H_{NS},3S,6S). Por
tanto, la secuencia deducida del decasacárido fraccionado de
AT-III es \pmDDD4-7
(\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}
GH_{NS,3S,6S}). Debe observarse el hecho de que esta secuencia no está de acuerdo con la asignación de secuencia para un decasacárido producido de manera idéntica (Toida, T., Hileman, R. E., Smith, A. E., Vlahova, P. y Linhardt, R. J. (1996) J Biol Chem 271, 32040-7). Por esta razón, los autores de la invención trataron de confirmar su asignación de secuencia utilizando otras metodologías analíticas.
GH_{NS,3S,6S}). Debe observarse el hecho de que esta secuencia no está de acuerdo con la asignación de secuencia para un decasacárido producido de manera idéntica (Toida, T., Hileman, R. E., Smith, A. E., Vlahova, P. y Linhardt, R. J. (1996) J Biol Chem 271, 32040-7). Por esta razón, los autores de la invención trataron de confirmar su asignación de secuencia utilizando otras metodologías analíticas.
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Se secuenció también AT-10
utilizando la técnica recientemente establecida, Secuenciación
Integral de Glucanos (IGS), que emplea una separación
electroforética de los sacáridos marcados en el extremo reductor con
un fluoróforo. La escisión parcial con ácido nitroso y digestión
con exoenzima del sacárido produce una escalera de la cual puede
deducirse la secuencia. De acuerdo con los datos
PEN-MALDI, el análisis electroforético de la muestra
marcada con fluoróforo produjo un solo decasacárido principal, pero
adicionalmente, era también evidente el contaminante menor. Los
productos de la escisión parcial con ácido nitroso eran deca-,
octa-, hexa-, y tetrasacáridos, sin que se observara producto
disacárido alguno. Este resultado define las posiciones de todos los
restos NS y NAc, con un solo disacárido acetilado en N en la
posición próxima al extremo reductor. Los desplazamientos en gel
debidos al tratamiento de estos productos con combinaciones
diferentes de exoenzimas demostraron residuos iduronato en tres
posiciones, dos de las cuales estaban sulfatadas en
2-O, y la presencia en tres posiciones de residuos
glucosamina sulfatados en 6-O. El extremo no
reductor estaba claramente sulfatado en 2-O, pero
la confirmación de la presencia de un
6-O-sulfato en el residuo
glucosamina del extremo no reductor, y los detalles del patrón de
sulfatación en el monosacárido del extremo reductor no se obtuvieron
en este análisis. Estos datos definen la estructura de
AT-10 como \DeltaU_{2S}H_{NS,\pm
6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NAc/NS,\pm
3S,\pm 6S}. Este dato, deducido de un enfoque de secuenciación
independiente, es totalmente coherente con el análisis
PEN-MALDI.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos del espectro de masa también pueden
usarse conjuntamente con el análisis de la composición CE para
llegar a una estructura propuesta para el contaminante
12-sulfatado y 1-acetilado de
AT-10. Como se ha indicado arriba, el producto de
digestión con heparinasa I (Figura 2a) proporcionaba un pico para
m/z de 1073,9 que corresponde a un tetrasacárido
pentasulfatado (\pmD\pm5, \pm7\pm5, o \pm5\pm7), que es
asignable únicamente al contaminante.
\newpage
Este fragmento tetrasacárido no se
derivaba del extremo reductor del contaminante, dado que no se
encontró en ningún caso un sacárido marcado que contuviera \pm5.
Adicionalmente, un producto de digestión con heparinasa I del
decasacárido marcado sitúa 4-7 en el extremo
reductor, tanto para el contaminante como para
AT-10. Para localizar la posición del tetrasacárido
D5 o D-5 observado en el producto de digestión con
heparinasa I, se trató el decasacárido con iduronato
2-O antes del tratamiento con heparinasa I. En estas
condiciones, la masa del tetrasacárido pentasulfatado se reducía en
80 Da (desde una masa de 1073,9 a 993,9, resultante de la pérdida
de sulfato). Por tanto, este tetrasacárido tiene que derivarse del
extremo no reductor del contaminante. En conjunto, esta información
sugiere que la secuencia del contaminante es
\pmD5D4-7 o
\pmD-5D4-7.
La asignación para AT-10 y el
contaminante se confirmó cuando el decasacárido se degradó
incompletamente con ácido nitroso (Figura 4). Se observa claramente
AT-10 con una anhidromanosa en el extremo reductor
(masa de 2673,0) así como fragmentos resultantes de la escisión con
ácido nitroso (masas de 2209,2, 2113,2 y 1633,2) de
AT-10. Adicionalmente, puede obtenerse únicamente
una especie con masa 1057,9 a partir de
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}Man_{6S}, proporcionando una
firma única de masa del extremo no reductor de
AT-10. Es importante que todas las especies podrían
asignarse a AT-10 o al contaminante.
\vskip1.000000\baselineskip
El espectro NMR de AT-10 se
muestra en la Figura 6. Coherentemente con el análisis de los
autores de la invención, las señales pequeñas de
\alphaH-1, \alphaH-2 y
\alphaH-3 de H_{NS,3S,6S} (a 5,45, 3,45 y 4,50
ppm, respectivamente) permiten asignar la unidad del monosacárido
del extremo reductor como H_{NS,3S,6S}. En este caso, el protón
anomérico de residuo H_{NS3S6S} del extremo reductor tiene que
dividirse en configuraciones \alpha y \beta. La configuración
\alpha del protón anomérico del residuo H_{NS} es dominante
(\sim95%) en los disolventes próticos, tales como óxido de
deuterio, basándose en el efecto anomérico. Adicionalmente, pudo
detectarse la presencia de dos restos I_{2S}. Es interesante que
las señales anoméricas de los dos I_{2S} que resuenan usualmente
alrededor de 5,20 ppm, estaban desplazadas. Esto es muy
probablemente consecuencia de un cambio en la conformación del
resto interno I_{2S} de ^{1}C_{4} a ^{2}S_{0}.
Asimismo, pudo confirmarse que el oligosacárido contiene tres
H_{NS,6S} y un solo residuo G no sulfatado basándose en los
valores de integración de los protones H-2 de
H_{NS,6S} y los residuos G observados a 3,28 y 3,38 ppm,
respectivamente. La presencia de una sola señal
N-acetil-metilo del residuo H_{NAc,6S} a
2,1 ppm demuestra claramente que el oligosacárido contiene un solo
residuo H_{NAc,6S}. La presencia de señales correspondientes a
los protones H-6 de los residuos H_{NY} sulfatados
en 6-O (Y = Ac o S) aproximadamente a 4,3 y 3,9 ppm,
confirma que todos los residuos H_{NY} del oligosacárido están
O-sulfatados en C-6. En conjunto,
estos datos permiten la asignación de secuencia de la especie
principal en la muestra de AT-10 como
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado en este ejemplo que pueden
utilizarse varias técnicas analíticas rigurosas para convergir en
la estructura de un oligosacárido HLGAG complejo. Adicionalmente, se
demostró que la asignación de secuencias utilizando los dos
procedimientos de secuenciación, a saber, IGS y
PEN-MALDI es la misma. Esto es sumamente evidente
en el tratamiento parcial y exhaustivo del decasacárido con ácido
nitroso (Figura 3). Es importante que, por el presente análisis, es
posible ahora asignar las secuencias siguientes a los deca, octa,
hexa, y tetrasacáridos observados por la electroforesis en gel y
MALDI-MS, es decir, DDD4-7,
DD4-7, D4-7, y un tetrasacárido
4-7 resistente al ácido nitroso. En el ejemplo que
sigue, se exploraron las consecuencias funcionales de un sitio de
fijación de AT-III parcialmente intacto y la acción
enzimática de las heparinasas frente al sitio de fijación de
AT-III.
Adicionalmente, se demostró que el método
PEN-MALDI es suficientemente sensible y
discriminador para permitir a los autores de la invención
determinar la información de secuencia para una mezcla de
oligosacáridos. Es esencial subrayar el hecho de que la
convergencia a una solución única para AT-10
utilizando PEN-MALDI es posible utilizando
restricciones experimentales ortogonales múltiples (Venkataraman,
G., Shriver, Z., Raman, R. y Sasisekharan, R.(1999) Science
286, 537-42), minimizando así la dependencia de una
sola restricción experimental, v.g., la escisión con ácido
nitroso. Finalmente, el ejemplo presentado ilustra el valor de
PEN-MALDI para obtener información definitiva de
secuencia para oligosacáridos biológica y farmacológicamente
relevantes.
\vskip1.000000\baselineskip
La heparina ha sido utilizada como
anticoagulante clínico durante más de 50 años, lo que la convierte
en uno de los agentes farmacológicos más eficaces conocidos. Gran
parte de la actividad de la heparina puede atribuirse a su
capacidad para fijarse a la antitrombina III
(AT-III). La heparina de peso molecular bajo (LMWH),
derivada de heparina por su descomposición controlada, mantiene
gran parte de la actividad antitrombótica de la heparina sin muchos
de sus graves efectos secundarios. La significación clínica de LMWH
ha puesto de manifiesto la necesidad de comprender y desarrollar
medios químicos y enzimáticos para generarla. Las herramientas
enzimáticas primarias utilizadas para la producción de heparina de
peso molecular bajo son las heparinasas de Flavobacterium
heparinum, específicamente las heparinasas I y II. Utilizando
compuestos modelo pentasacáridos y hexasacáridos, se ha demostrado
que las heparinasas I y II, pero no la heparinasa III, escinden el
sitio de fijación de AT-III. Adicionalmente, se
demuestra en esta memoria que la sulfatación en 3-O
de la glucosamina en el extremo reductor de un enlace glicosídico
imparte resistencia a la escisión por las heparinasas I, II y III.
Finalmente, se examinan las consecuencias biológicas y
farmacológicas de un oligosacárido de heparina. Se demuestra que un
oligosacárido de este tipo carece de algunos de los atributos
funcionales de HLGAG que contienen un sitio AT-III
intacto.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales. Penta 1 y 2 fue un obsequio
generoso del Dr. Robert Rosenberg, Departamento de Biología, MIT.
Se generó Hexa 1 utilizando digestión de heparina con heparinasa I
(Ernst, S., Langer, R., Cooney, C. L. y Sasisekharan, R. (1995)
Crit Rev Biochem Mol Biol 30, 387-444). La
heparina se adquirió de Celsus Laboratories Cincinnati, OH y se
calcularon las concentraciones molares de los stocks basándose en un
peso molecular medio de 13.000 Da. La enoxaparina se adquirió de
Avantis Pharmaceuticals (Chicago, IL).
Productos de Digestión. Se completaron
las digestiones con heparinasa I como se ha descrito. (Venkataraman,
G., Shriver, Z., Raman, R. y Sasisekharan, R. (1999) Science
286, 537-42 and Rhomberg, A. J., Ernst, S.,
Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA
95, 4176-81). Las reacciones con heparinasa II o
III se completaron esencialmente del mismo modo a la temperatura
ambiente en ovoalbúmina 10 \muM, sulfato de dextrano 1 \muM, y
etilenodiamina 10 mM, pH 7,0. Las digestiones cortas se completaron
con enzima 50 nM durante 10 minutos, mientras que las digestiones
exhaustivas se completaron con enzima 200 nM durante una noche. Se
recogieron los espectros de masas utilizando los parámetros arriba
indicados (véase también Shriver, Z., Raman, R., Venkataraman, G.,
Drummond, K., Turnbull, J., Toida, T., Linhardt, R., Biemann, K. y
Sasisekharan, (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 12 de sept.
2000; 97(19):10359-64) y se calibraron
externamente utilizando señales para (RG)_{19}R
protonizado y su complejo con un hexasacárido derivado con ácido
nitroso de la secuencia
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}Man_{6S}.
Experimentos de Titulación por Fluorescencia
en Equilibrio. Las titulaciones de AT-III humana
con el decasacárido AT-10 o heparina se completaron
a 25ºC utilizando una máquina Fluorolog 2 (Spex Instruments)
(Meagher, J. L., Beechem, J. M., Olson, S. T. y Gettins, P. G.
(1998) J Biol Chem 273, 23283-9 y Desai, U.
R., Petitou, M., Bjork, I. y Olson, S. T. (1998) J Biol Chem
273, 7478-87). Las medidas se completaron en
fosfato de sodio 20 mM, que contenía EDTA 0,1 mM y 0,1% de PEG
8.000, ajustado a pH 7,4 ó 6,0. Con el tampón de pH 7,4, se añadió
cloruro de sodio a una concentración final de 100 mM.
Se recogieron los espectros de emisión por
fluorescencia desde 300 a 400 nm con una longitud de onda de
excitación de 280 nm y un tiempo de integración de 5 s.
Resumidamente, los experimentos de titulación se condujeron como
sigue - se añadieron partes alícuotas de decasacárido o heparina a
una solución 1 \muM de AT-III, se dejó que la
solución alcanzara el equilibrio durante un minuto, y se recogió un
espectro de emisión. Se añadieron partes alícuotas sucesivas de
sacárido y se ajustó la señal de fluorescencia para justificar la
dilución de la proteína.
Medidas Biológicas de la Actividad de
Decasacárido. Se determinó in vitro la actividad
anticoagulante como se ha descrito previamente (Hoppensteadt, D.
A., Jeske, W. P., Walenga, J. M., Fu, K., Yang, L. H., Ing, T. S.,
Herbert, J. M. y Fareed, J. (1999) Thromb Res 96,
115-24 y Dietrich, C. P., Paiva, J. F., Castro, R.
A., Chavante, S. F., Jeske, W., Fareed, J., Gorin, P. A., Mendes, A.
y Nader, H. B. (1999) Biochim Biophys Acta 1428,
273-83), de acuerdo con la farmacopea de los Estados
Unidos. Los ensayos de inhibición de la gene-ración
de trombina (FIIA) y factor Xa (FXa) se completaron esencialmente
como se ha descrito. De manera resumida, el decasacárido
AT-10, Enoxaparina LMWH o el pentasacárido sintético
de fijación de AT-III (Penta 1) utilizado en este
estudio se disolvió en solución salina estéril a las concentraciones
designadas. Se añadió a esta muestra un volumen igual de plasma
deficiente en fibrinógeno, diluido en relación 1:8 en
Tris-HCl 100 mM (pH 8,5). En una muestra separada,
se añadió la misma concentración de oligosacárido de heparina y
actina en una relación 1:1 a Spectrozyme TH o FXa. De esta manera,
se midió la generación intrínseca de IIa y Xa. Adicionalmente, para
justificar la inhibición de la trombina y la generación extrínseca
de FXa, se diluyó tromboplastina C en relación 1:6 con Spectrozyme
TH o FXa. Para todas las muestras, se midió la densidad óptica a
405 nm y se expresan los resultados como % de inhibición comparada
con un control de solución salina sin suplemento. Para estos
ensayos, el reactivo trombina (Fibrindex) se obtuvo de Ortho
Diagnostic Systems, Inc. (Raritan, NJ), y el factor Xa se obtuvo de
Enzyme Research (South Bend, IN). Spectrozyme TH y FXa se obtuvieron
de American Diagnostica (Greenwich, CT).
Se utilizaron también datos de sangre entera
para determinar la actividad anticoagulante de
AT-10. Los ensayos de tiempo parcial de
tromboplastina activada (APTT) y tiempo de protrombina (PT) se
condujeron de manera similar a la que se ha consignado previamente
(Dietrich, C. P., Paiva, J. F., Castro, R. A., Chavante, S. F.,
Jeske, W., Fareed, J., Gorin, P. A., Mendes, A. y Nader, H. B.
(1999) Biochim Biophys Acta 1428, 273-83). El
reactivo APTT se obtuvo de Organon Teknika (Durham, NC) y el
Reactivo HepTest se obtuvo de Haemachem (St. Louis, MO).
Previamente, se investigó la especificidad de
sustrato de las heparinasas I y II frente a AT-10
(Romberg, A. J., Shriver, Z., Biemann, K. y Sasisekharan, R. (1998)
Proc Natl Acad Sci USA 95, 12232-7 y Ernst,
S., Rhornberg, A. J., Biemann, K. y Sasisekharan, R. (1998) Proc
Natl Acad Sci USA 95, 4182-7). Estos estudios,
sin embargo, se llevaron a cabo suponiendo una estructura publicada
(Toida, T., Hileman, R. E., Smith, A. E., Vlahova, P. I. y
Linhardt, R. J. (1996) J Biol Chem 271,
32040-7). Teniendo en cuenta la estructura ahora
determinada de AT-10 descrita en esta memoria (véase
también Shriver, Z., Raman, R., Venkataraman, G., Drummond, K.,
Turnbull, J., Toida, T., Linhardt, R., Biemann, K. y Sasisekharan,
R. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 12 sept. 2000;
97(19):10359-64), se examinó de nuevo la
acción enzimática de las heparinasas I, II y III frente a los
oligosacáridos que contienen un sulfato en posición
3-O que es importante para la fijación de
AT-III con afinidad alta. Para estos estudios, se
utilizaron tres oligosacáridos, dos pentasacáridos (Penta 1 y Penta
2, Figura 5) y un hexasacárido (Hexa 1, Figura 5). Debe observarse
el hecho de que los pentasacáridos se derivan por síntesis,
mientras que Hexa 1 se deriva por tratamiento de heparina con
heparinasa I. Como resultado, al contrario que Penta 1 o Penta 2,
Hexa 1 contiene un ácido \Delta^{4,5}-urónico en
el extremo no reductor. Adicionalmente, Penta 1 y Penta 2 difieren
uno de otro únicamente por la presencia (Penta 1) o ausencia (Penta
2) de un sulfato en posición 3-O en el residuo
glucosamina interno (Figura 5). La estrategia empleada en esta
memoria implica esencialmente tratamiento de cada uno de los
sacáridos con heparinasa I, II o III, respectivamente, en
condiciones de digestión exhaustivas, seguido por la identificación
de los productos resultantes por espectrometría de masas. La masa
calculada de los sustratos sacáridos y los productos, su identidad,
y la masa observada se enumera en la Tabla 4.
En la columna 1 de la Tabla 4 se muestra el
valor m/z del complejo protonizado 1:1 del sacárido y el péptido
básico (RG)_{19}R. La columna 2 muestra la masa observada
del sacárido obtenido por sustracción de la masa del péptido básico
protonizado del complejo protonizado 1:1. Las estructuras químicas
de los sacáridos para los picos correspondientes en los espectros
de masas se muestran en la columna 3. La columna 4 muestra las
masas teóricas calculadas para las estructuras químicas. Obsérvese
que la masa observada está comprendida dentro de \pm1 Da de la
masa calculada.
En el caso de Penta 1, únicamente las
heparinasas I y II, pero no la heparinasa III, escinden el
oligosacárido en un trisacárido pentasulfatado de masa 916,7 y un
disacárido trisulfatado de masa 591,3 (Figura 6), lo que es
indicativo de la escisión en el enlace glicosídico que contiene
I_{2S} (enlace A.2 en la Figura 5). Los datos presentados en la
Figura 6 muestran que los enlaces que contienen 3-O
son resistentes a la escisión por heparinasa I, II o III. Esta
resistencia parece ser independiente de la longitud. Sobre la base
de la comprensión previa de la estructura de AT-10
(Toida, T., Hileman, R. E., Smith, A. E, Vlahova, P. I. y Linhardt,
R. J. (1996) J Biol Chem 271, 32040-7), se
informó que la heparinasa II podría escindir un sacárido que
contenga sulfato en posición 3-O con tal que el
mismo fuera de longitud suficiente (Rhomberg, A. J., Shriver,
Biemann, K. y Sasisekharan, R. (1998) Proc Natl Acad Sci USA
95, 12232-7). Teniendo en cuenta la estructura
recién determinada para el decasacárido AT-10 (véase
también Shriver, Z., Raman, R., Venkataraman, G., Drummond, K.,
Turnbull, J., Toida, T., Linhardt, R., Biemann, K. y Sasisekharan,
R. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 12 de sept. 2000;
97(19):10359-64), así como los datos
presentados en la Figura 6, tienen que reinterpretarse los
hallazgos previos, y en esta memoria se llega a la conclusión de que
la heparinasa II no escinde los enlaces con una glucosamina
sulfatada en la posición 3-O próxima al extremo
reductor. Adicionalmente, la resistencia de este enlace a la acción
de las heparinasas I, II y III es debida totalmente a la presencia
de un sulfato en posición 3-O como se muestra por
el tratamiento con heparinasa I, II y III de Penta 2 (Figura 7). En
este caso, todas las heparinasas escinden eficientemente el
sustrato. Como en el caso de Penta 1, la heparinasa I escinde en el
enlace que contiene I_{2S}, produciendo un trisacárido de masa
837,3 y un disacárido de masa 591,9 (escisión en el enlace B.2 en
la Figura 5). Inversamente, tanto heparinasa II como heparinasa III
escinden en el enlace no sulfatado que contiene G, escindible
fácilmente ahora (enlace B.1 en la Figura 5). La heparinasa III
escinde únicamente este enlace, dando un tetrasacárido de masa
1428,3 y un monosacárido (no observado). La heparinasa II escinde
en los enlaces B.2 y B.1, reduciendo Penta 2 a un monosacárido y
dos disacáridos, uno de los cuales se observa y tiene una masa de
592,0 (Figura 7).
Para explorar adicionalmente la especificidad de
sustrato de las heparinasas hacia los sacáridos sulfatados en
3-O, se utilizó Hexa 1, un hexasacárido derivado de
heparinasa I que contiene sulfato en posición 3-O
(Figura 8). Se seleccionó también Hexa 1 como sustrato para este
estudio debido a que el mismo representa una truncación en el
extremo no reductor de AT-10 y contiene el mismo
resto GH_{NS,3S,6S} en el extremo reductor. Se encontró que Hexa
1 es sensible a la escisión por las heparinasas II y III, pero no a
la escisión por la heparinasa I. Debe observarse que la escisión de
Hexa 1 por heparinasa II o III no tiene lugar en el enlace
que contiene G sino, en lugar de ello, en el enlace que contiene I
(escisión en C.1 pero no en C.2 en la Figura 5). En el caso de la
escisión por heparinasa II, los productos son un tetrasacárido de
masa 1036,5 y un disacárido de masa 577,4. Para la escisión con
heparinasa III, se observan los mismos productos, es decir,
un tetrasacárido de masa 1036,1 y un di-sacárido de
masa 577,8. Estos resultados confirman la opinión de los autores de
la invención de que los enlaces con un sulfato en
3-O próximo al extremo reductor están protegidos
contra la acción de las heparinasas, con inclusión de la heparinasa
II. Con el tratamiento de Hexa 1 tanto por heparinasa II como por
heparinasa III, se forma un tetrasacárido resistente a las
heparinasas, con la secuencia \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}.
El hecho de que este tetrasacárido es resistente a la escisión
ulterior con heparinasa es coherente con observaciones previas
(Yamada, S., Yoshida, K., Sugiura, M., Sugahara, K., Khoo, K. H.,
Morris, H. R. y Dell, A. (1993) J Biol Chem 268,
4780-7). Coherentemente también con la especificidad
de sustrato conocida de la heparinasa I, Hexa 1, que no contiene
enlace I_{2S} alguno, no es escindido por esta enzima.
A la vista de estos estudios, es evidente ahora
que las heparinasas I y II pueden escindir el sitio
AT-III en el enlace
H_{NS,3S,6S}^{\downarrow}I_{2S}H_{NS,6S}, donde el enlace
fácilmente escindible se designa con una flecha (A.2 de Penta 1 y
B.2 de Penta 2, Figura 5). Adicionalmente, con la estructura de
nueva asignación para AT-10, se encuentra que los
enlaces con un sulfato en posición 3-O en la
glucosamina del extremo reductor, a saber,
H_{NS,6S}^{\downarrow}GH_{NS,3S,6S} no son escindibles por las
heparinasas II o III (A. 1 de Penta 1 y B.1 de Penta 2, Figura 5).
Adicionalmente, se encuentra que esta inhibición es debida
enteramente a la modificación inusual 3-O sulfato.
Finalmente, considerado junto con los estudios previos de los
autores de la invención de la acción enzimática de la heparinasa I,
la estructura de AT-10 refuerza el hecho de que la
heparinasa I actúa de una manera exolítica, y progresiva sobre los
oligosacáridos de heparina/heparano (Ernst, S., Rhomberg, A. J.,
Biemann, K. y Sasisekharan, R. (1998) Proc Natl Acad Sci USA
95, 4182-7).
Fijación de AT-III al
Decasacárido AT-10: El análisis de la secuencia
de AT-10 de los autores de la invención comunicado
en esta memoria y en Shriver, Z., Raman, R., Venkataraman, G.,
Drummond, K., Turnbull, J., Toida, T., Linhardt, R., Biemann, K. y
Sasisekharan, R. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 12 de sep
2000; 97(19):10359-64 reveló que este
decasacárido no contiene una secuencia de pentasacárido de fijación
a AT-III intacta sino que contiene en su lugar
únicamente la unidad de trisacárido del extremo no reductor. Los
autores de la invención trataron de extender esta asignación de
secuencia y proporcionar un contexto funcional a este resultado por
medida de la afinidad de fijación a AT-III de
AT-10. A pH 7,4, I = 0,15, AT-10
tiene muy poca afinidad para AT-III (Figura 9).
Inversamente, en las mismas condiciones, la heparina de la mucosa
intestinal de porcino fijaba AT-III con un valor
K_{D} aparente de 36 nM. Para medir exactamente la afinidad de
AT-10 para AT-III, se completó la
titulación en su lugar a pH 6,2, condiciones que se sabe favorecen
la fijación de AT-III a los sacáridos. En estas
condiciones, AT-10 fijaba AT-III con
un valor K_{D} aparente de 0,8 \muM, mientras que el valor
K_{D} para la heparina de longitud total disminuía a 10 nM. EL
valor K_{D} medido para AT-10 es comparable con
sacáridos similares que tienen un extremo reductor truncado, con
valores K_{D} medidos de 0,3-2 \muM (Desai, U.
R., Petitou, M., Bjork, I. y Olson, S. T. (1998) J Biol Chem
273, 7478-87). Así pues, los resultados de los
experimentos de titulación son coherentes con que
AT-10 contenga una secuencia de fijación del
pentasacárido AT-III parcialmente intacta (Desai, U.
R., Petitou, M., Bjork, I. y Olson, S. T. (1998)J Biol
Chem 273, 7478-87). Las tres unidades de
sacárido en el extremo no reductor de la secuencia del
pentasacárido, a saber, H_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}, son
fundamentalmente responsables de la fijación del estado nativo de
AT-III, mientras que la unidad de disacárido del
extremo reductor, I_{2S}H_{NS,6S}, que está ausente en
AT-10, es importante para la fijación de la
AT-III activa, alterada conformacionalmente. El
valor K_{D} medido para AT-10 (0,8 \muM a pH
6,0, I = 0,05) es \sim100 veces mayor que el de la heparina de
longitud total, lo que confirma que AT-10 no
contiene una secuencia de pentasacárido AT-III
intacta. La disminución en la afinidad de AT-III
observada para AT-10 no puede deberse simplemente a
una cuestión de tamaño dado que, en estudios previos, se ha
demostrado que el pentasacárido sólo tiene una afinidad similar a la
de la heparina de longitud total (Desai, U. R., Petitou, M., Bjork,
I. y Olson, S. T. (1998) J Biol Chem 273,
7478-87). Una vez medida la interacción de fijación
entre AT-III y el decasacárido, se trató a
continuación de definir las consecuencias
funcionales de un oligosacárido HLGAG que contenga únicamente un sitio de fijación parcial de AT-III.
funcionales de un oligosacárido HLGAG que contenga únicamente un sitio de fijación parcial de AT-III.
Actividad biológica de
AT-10: Como podría esperarse para un
oligosacárido que no contiene un sitio AT-III
intacto, la actividad biológica de AT-10 es menor
que la de la enoxaparina (utilizada aquí como ejemplo de una LMWH)
o la del pentasacárido, Penta 1 (Figura 10). Coherentemente con el
mecanismo conocido de inhibición mediada por la heparina de la
actividad de trombina por AT-III, ni el decasacárido
ni el pentasacárido tienen actividad anti-IIa
importante (Figura 10a). En el caso del pentasacárido, está falta de
actividad es debida enteramente a que su tamaño es insuficiente
para actuar como molde para la formación de un complejo
AT-III/IIa. Para el decasacárido, esta restricción
de tamaño es también una explicación probable (dado que estudios
bioquímicos rigurosos han implicado que oligosacáridos con al menos
18 unidades de monosacárido son importantes para la formación
eficiente del complejo) (Petitou, M., Herault, T. P., Bernat, A.,
Driguez, P. A., Duchaussoy, P., Lormeau, J. C. y Herbert, J. M.
(1999) Nature 398, 417-22), aunque la falta
de un sitio AT-III intacto puede contribuir también
a su reducida actividad anti-IIa.
Estos resultados se confirman y amplían por
examen de la actividad anti-Xa del factor Xa de tres
usos del suero (Figura 10b) o el factor Xa purificado (Figura 10c).
Como se ha expuesto anteriormente, la inhibición del factor Xa por
AT-III requiere fijación del motivo pentasacárido
sólo concomitante con un cambio conformacional en
AT-III. En el ensayo anti-Xa, tanto
enoxaparina como el pentasacárido tienen actividad notablemente
mayor que el decasacárido. Los valores CI_{50} de enoxaparina y
el pentasacárido sintético son 66 nM y 39 nM, respectivamente,
mientras que el de AT-10 es diez veces mayor a 280
nM. Estos valores son coherentes con la menor afinidad de
AT-10 para AT-III en comparación con
heparina, que se determinó en los experimentos de titulación por
fluorescencia de AT-III (Figura 9). Que el
decasacárido posee actividad anti-Xa no es
sorprendente, dado que la unidad del trisacárido no reductor
(presente en el decasacárido) es fundamentalmente responsable de la
fijación inicial de heparina a AT-III. La unidad de
disacárido del extremo reductor, es decir,
I_{2S}H_{NS,6S} (ausente en AT-10) se espera
que se fije a la antitrombina III alterada conformacionalmente,
estabilizándola. Las medidas HepTest (Figura 10d) proporcionan
resultados similares, a saber, que enoxaparina y el
pentasacárido tienen actividad significativamente mayor que el
decasacárido AT-10. Consideradas como un todo, las
actividades anti-IIa y anti-Xa del
decasacárido comparado con el pentasacárido y la enoxaparina están
satisfactoriamente de acuerdo con los experimentos de titulación de
AT-III así como con la farmacología conocida del
mecanismo de la heparina en la inhibición de la cascada de
coagulación.
En resumen, se demuestra en este ejemplo que las
heparinasas I y II escinden el sitio de fijación de
AT-III dejando atrás la unidad de trisacárido en el
extremo reductor del oligosacárido. Se demuestra también que la
heparinasa III no escinde el sitio AT-III debido a
la presencia de un sulfato en posición 3-O en el
residuo glucosamina interno. Así pues, la utilización de las
heparinasas I o II para la generación de LMWHs requiere
precauciones extremadas para asegurar la retención de los sitios
antitrombina III intactos en los fragmentos LMWH. De hecho, los
resultados presentados en esta memoria demuestran que las
heparinasas I o II pueden ser agentes ideales para la
neutralización de dosis farmacológicas de heparina.
Para purificar UFH e identificar sus
componentes, se digirió exhaustivamente UGH y se analizó utilizando
electroforesis capilar y espectrometría de masas MALDI. La
electroforesis capilar (CE) es un método muy sensible con elevado
poder de resolución para el análisis de la composición de
disacáridos de las heparinas. Se desarrolló un método de análisis
de la composición (CAM) que utiliza CE para cuantificar los bloques
de construcción disacáridos de UFH y LMWH. Este método utiliza
menos de un microgramo de heparina, es eficiente en tiempo (cada
operación CE tiene una duración de 25 minutos), es independiente de
la concentración, y es sumamente reproducible. Una ventaja de este
método es su eficacia como proceso de control de calidad que puede
ayudar a minimizar la variación lote a lote en la composición de
LMWH diferentes.
Así pues, se ha utilizado CE en combinación con
espectrometría de masas MALDI fuera de línea para identificar un
tetrasacárido único en el producto de digestión exhaustiva de UFH, y
LMWH. Este tetrasacárido, que forma parte del dominio de
pentasacárido de fijación a AT-III de los
glucosaminoglucanos, es resistente a la degradación ulterior con
heparinasa I, II, o III. Se demuestra a continuación que la
utilización de este tetrasacárido único en la medida directa del
anti-factor Xa de la heparina mediaba la actividad
anticoagulante.
Productos Químicos y Materiales: Se
adquirió UFH de Celsus Laboratories (Cincinnati, OH) y se calcularon
las concentraciones molares de los stocks sobre la base de un peso
molecular medio de 13.000 Da. Los estándares de disacáridos se
adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Las
heparinasas I y III son heparinasas recombinantes. La heparinasa II
procede de Flavobacterium heparinum, purificada como se ha
descrito previamente. (Shriver et al., Journal of Biological
Chemistry 1998, 273, 22904-22912).
Análisis de la composición: Se sometió
UFH a despolimerización exhaustiva con un cóctel de enzimas
constituido por Heparinasa I, Heparinasa II, y Heparinasa III. Se
digirieron 9 \mul de UFH de concentración 10 \mug/\mul en
agua con 1 \mul de cóctel de enzimas constituido por 100 nM en
cada caso de heparinasa I, II, y III en acetato de sodio 25 mM,
cloruro de sodio 100 mM, tampón de acetato de calcio 5 mM, pH 7,0
durante 12 h a 37ºC. La muestra para CE se preparó por dilución de
1 \mul del producto de digestión con 9 \mul de agua. Las
muestras se analizaron por CE en polaridad invertida con un tampón
corriente de tris/fosfato 50 mM, sulfato de dextrano 10 \muM, pH
2,5. Se inyectaron 57 nl de cada muestra en la CE y los tiempos de
ejecución fueron de 25 minutos. Cada muestra se digirió por
duplicado y el experimento se repitió dos veces para cada muestra,
dando como resultado cuatro lecturas por muestra. Se recogieron la
totalidad de los 8 picos resultantes, y se comprobó la pureza de
las muestras recogidas por reinyección en CE, midiéndose sus masas
por espectrometría de masas MALDI fuera de la línea. La identidad
de los picos 1-7 se confirmó ulteriormente por
adaptación de su tiempo de migración con el de disacáridos estándar
disponibles comercialmente. Por ejemplo, el espectro CE del pico 1
se recogió del análisis CE del producto de digestión enzimático
total de UFH y se generó un espectro de masas MALDI del pico 1. Los
espectros de masas se recogieron utilizando parámetros como los
reseñados previamente y se calibraron externamente utilizando
señales para (RG)_{19}R protonizado y su complejo con un
hexasacárido derivado de ácido nitroso de la secuencia
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S} I_{2S}Man_{6S}.
Como se observa en la Figura 11A, se ven 8 picos
en el espectro CE. Cada uno de los picos marcados 1 a 8 tiene un
tiempo de migración idéntico en las diferentes muestras. Después de
la recogida de cada pico y la comparación de la pureza de cada
muestra por re-inyección en CE, se midió su masa por
espectrometría de masas MALDI fuera de la línea. El pico 1 tiene la
misma masa que el disacárido de heparina trisulfatado
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}. El \DeltaU_{2S}H_{NS,6S}
comercial de Sigma tiene el mismo tiempo de migración que el pico 1
en condiciones CE idénticas. Esto identifica el pico 1 como
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}. De manera similar, se establecieron
las identidades de los 7 picos de 2 a 7 en el producto de digestión
de análisis de la composición de UFH. Los resultados se muestran
las Figuras 3A y 3B - 6A y 6B. La identidad de cada pico se confirmó
ulteriormente por adaptación de su tiempo de migración con el de
disacáridos estándar disponibles comercialmente. Los picos 2, 3, y
4 son disacáridos disulfatados, y los picos 5, 6 y 7 son
disacáridos
monosulfatados.
monosulfatados.
Se generó una traza del espectro de masas CE y
MALDI del pico 2. Este pico tiene la misma masa que
\DeltaU_{2S}H_{NS}. Asimismo, el \DeltaU_{2S}H_{NS}
comercial de Sigma tiene el mismo tiempo de migración que el pico 2
en condiciones CE idénticas. Esto confirma que el pico 2 es
\DeltaU_{2S}H_{NS}.
Se generó una traza del espectro de masas CE y
MALDI del pico 3. Dicho pico tiene la misma masa que
\DeltaUH_{NS,6S}. Asimismo, el \DeltaUH_{NS,6S} comercial
de Sigma tiene el mismo tiempo de migración que el pico 3 en
condiciones CE idénticas. Esto confirma que el pico 3 es
\DeltaUH_{NS,6S}.
Se generó una traza de la CE del pico 5. Dicho
pico tiene la misma masa que \DeltaUH_{NS}. Asimismo, el
\DeltaUH_{NS} comercial de Sigma tiene el mismo tiempo de
migración que el pico 5 en condiciones CE idénticas. Esto confirma
que el pico 5 es \DeltaUH_{NS}.
Se generó una traza de la CE del pico 6. Dicha
traza tiene la misma masa que \DeltaU_{2S}HN_{NAc}. Asimismo,
el \DeltaU_{2S}H_{NAc} comercial de Sigma tiene el mismo
tiempo de migración que el pico 6 en condiciones CE idénticas. Esto
confirma que el pico 6 es \DeltaU_{2S}H_{NAc}.
Se generó una traza de la CE del pico 7. Dicha
traza tiene la misma masa que \DeltaUH_{NAc,6S}. Asimismo, el
\DeltaUH_{NAc,6S} comercial de Sigma tiene el mismo tiempo de
migración que el pico 7 en condiciones CE idénticas. Esto confirma
que el pico 7 es \DeltaUH_{NAc,6S}.
Además de los siete disacáridos, se identificó
también un tetrasacárido (pico 8) en el material obtenido por
digestión exhaustiva de heparina con heparinasa I, II, y III. Se
aisló este tetrasacárido, y se determinó su masa por espectrometría
de masas MALDI. El material tenía el mismo tiempo de migración en CE
que el tetrasacárido \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} que
formaba parte del decasacárido
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAC,6S}GH_{NS,3S,6S},
cuya estructura se determinó previamente. Esto condujo a la
confirmación del pico 8 como el tetrasacárido
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Este pico es resistente a la
degradación ulterior con las heparinasas I, II, o III.
Además de los picos 1-8, había
una pequeña cantidad de disacáridos no sulfatados que migraban de
modo mucho más lento que los sacáridos sulfatados, como se muestra
en la Figura 11B. Se estima que los disacáridos no sulfatados
constituyen <2% de UFH como se muestra en la Tabla 5 (más
adelante).
La Figura 12 muestra la traza CE de la digestión
exhaustiva del pentasacárido de AT-10
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S} \DeltaU_{2S}H_{NS,6S}
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S} IH_{NAC,6S} GH_{NS,3S,6S}. El
tetrasacárido 8 en la digestión exhaustiva de la heparina tiene la
misma masa, y el mismo tiempo de migración que
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Esto confirma el pico 8 como
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el factor de respuesta (RF) a UV de
cada uno de los disacáridos (1-7) para identificar
ulteriormente los componentes de los disacáridos procedentes del
material obtenido por la digestión exhaustiva. El RF para un
disacárido se define como la cantidad de dicho disacárido en ng que
proporciona la misma respuesta que 1 ng de
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación del Factor de Respuesta: Se
calculó RF para los diferentes disacáridos por medida de la
respuesta a UV de 57 ng de cada disacárido y normalización de la
misma con la de \DeltaU_{2S}H_{NS,6S} como se muestra en la
Tabla 5.
Cada uno de los siete disacáridos
(1-7) tiene una magnitud diferente de respuesta
A_{232} a UV. Se disponía de una cantidad insuficiente del
tetrasacárido 8 (\DeltaUH_{NAc,,6S}GH_{NS,3S,6S} para permitir
la medida de la absorbancia A_{232} a UV para este tetrasacárido.
Es de esperar que los tetrasacáridos tengan menor absorbancia
A_{232} a UV que los disacáridos y por ello se ha supuesto que
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} tenga la misma respuesta que
el menos sensible de los disacáridos, a saber, 1
(\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}).
En la Tabla 5, se calculó el factor de respuesta
(RF) para los picos 1-8. La segunda columna da la
absorbancia UV a 232 nm para la inyección de 57 nl de concentración
1 ng/nl, es decir 57 ng de los disacáridos (1-7)
comerciales estándar. No pudo medirse la absorbancia UV a 232 nm
para la concentración conocida de 8 por falta de disponibilidad de
muestra en cantidad suficiente. Se supone que 8 tiene la misma
respuesta que la del menos sensible de los 7 disacáridos, a saber,
1. La tercera columna da el RF para cada uno de los 7 picos,
definiéndose el RF para un disacárido como la fracción de 1 ng del
mismo que proporciona la misma respuesta que 1 ng de 1
(\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}).
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la heparina se ha clasificado como un
glucosaminoglucano sulfatado, la misma contiene una cantidad menor
de sacáridos no sulfatados. Se llevaron a cabo procedimientos para
determinar la cantidad de sacáridos no sulfatados en la heparina.
Después de esta determinación, puede utilizarse el valor RF
calculado por los picos 1-8 para estimar el
porcentaje en peso de los bloques de construcción sulfatados de
heparina a partir del AUC medida por CE.
\vskip1.000000\baselineskip
Un peso conocido de heparina sometida a
digestión exhaustiva con el cóctel de enzimas se inyectó en la CE.
El área bajo la curva (AUC) medida para los picos
1-8 en la Figura 11 se convierte en el peso de
sacáridos sulfatados utilizando la respuesta para cantidades
conocidas de los picos 1-8. La diferencia entre la
cantidad total de sacáridos de heparina inyectada en la CE, y la
cantidad total de disacáridos y tetrasacáridos sulfatados, da la
cantidad de sacáridos no sulfatados en la digestión completa de UFH.
Multiplicando el AUC % relativo por el RF se obtiene la
concentración relativa corregida o el AUC % relativo de los picos
1-8 en términos de \DeltaU_{2S}H_{NS,6S}.
La Tabla 6 muestra la estimación de los
sacáridos no sulfatados en la heparina. Como se muestra en la Tabla
6, se determinó que los sacáridos no sulfatados constituyen menos
del 2% de la heparina. Los sacáridos no sulfatados no se tienen en
cuenta en la construcción de la tabla de análisis de la composición
de la heparina como se explica más adelante. La columna 1 de la
Tabla 7 da el valor de AUC medido para los picos
1-8. La columna 2 da el % relativo de AUC. Por
multiplicación del % relativo de AUC por el RF se obtiene la
concentración relativa corregida o el % relativo de AUC de los
picos 1-8 en términos de
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}. Éstos se normalizan luego para obtener
el porcentaje en peso de los picos de disacáridos
1-7 y el pico de tetrasacárido 8. Como se demuestra
en esta memoria, la construcción de esta tabla de análisis de
composición es independiente de la concentración o el peso del
producto de digestión con heparina analizado por la CE.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 6 muestra una estimación de la cantidad
de sacáridos no sulfatados en la digestión exhaustiva de UFH con
las heparinasas I, II, y III. Los picos 1-7 se
muestran como disacáridos conocidos, como se explica en las Figuras
2-6. El pico 8 es el tetrasacárido
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} que es resistente a la
degradación ulterior por las heparinasas I, II o III. La segunda
columna da el área bajo la curva (AUC) medida para cada uno de los
picos para una inyección de 57 nl de concentración 1 ng/nl del
producto de digestión por análisis de la composición de UFH. La
tercera columna da la absorbancia UV a 232 nm para la inyección de
57 nl de concentración 1 ng/nl de cada uno de los siete disacáridos
comerciales estándar (1-7). La columna 4 da el peso
de los diversos sacáridos sulfatados en ng. La diferencia entre su
suma (55,9 ng) y la cantidad de heparina inyectada (57 x 1 = 57 ng)
da la cantidad de sacáridos no sulfatados presentes en el producto
de digestión por análisis de la composición de UFH.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprobar la reproducibilidad del
instrumento y averiguar si la digestión por análisis de la
composición es realmente completa para las concentraciones de
enzima utilizadas, se digirieron por duplicado muestras de UFH y se
analizaron dos veces por CD. Los resultados se compararon luego para
determinar si existía variabilidad entre las operaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió UFH como se describe en el Ejemplo
1A, métodos con 1 \mul o 5 \mul de cóctel de enzimas (EC). Cada
muestra se digirió por duplicado, y el producto obtenido en cada
digestión se analizó dos veces por CE.
\vskip1.000000\baselineskip
La comparación del análisis duplicado de la
misma muestra (UFH 1/1 con UFH 1/2, UFH 2/1 con UFH 2/2, y UFH 3/2
con UFH 3/2 (sic)) indica que existe una reproducibilidad
instrumental satisfactoria. La comparación de UFH 1/1 o UFH 1/2 con
UFH 2/1 o UFH 2/2 demuestra que existe una variación mínima de
operación a operación. La comparación de UFH digerida con 1 \mul
de EC con UFH digerida con 5 \mul de EC ilustra que el aumento de
la cantidad de enzima no cambia apreciablemente el perfil de
disacáridos. Esto confirma que se consigue una digestión exhaustiva
utilizando 1 \mul de EC como se muestra en la Figura 11. El
análisis de composición de LMWH realizado por CE de acuerdo con el
protocolo reseñado en la Figura 11 y la Tabla 7 puede utilizarse
para comparar rigurosamente diferentes lotes de LMWH.
La Tabla 7 muestra los valores de Análisis de la
Composición para UFH. Se midió el área bajo la curva (AUC) para
cada pico del espectro CE de UFH digerida con el cóctel de enzimas
como se muestra en la Figura 11. Se utilizó el factor de respuesta
calculado para cada sacárido como se muestra en la Tabla 6 para
calcular su concentración relativa corregida en el producto de
digestión enzimáticamente. La última columna da el porcentaje en
peso de cada uno de los bloques de construcción de UFH. Los
sacáridos no sulfatados, que constituyen <2% de UFH, no se
tienen en cuenta en la construcción de esta tabla de análisis de la
composición. Como se demuestra en esta memoria, la construcción de
esta tabla de análisis de la composición mostrada por este método,
es independiente de la concentración o el peso del producto de
digestión de heparina analizado por la CE.
La cuantificación del tetrasacárido
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} por CAM tiene un papel
adicional en la estimación de la eficacia de la acción
anticoagulante anti-factor Xa de la heparina mediada
por AT-III. \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}
forma parte del pentasacárido de fijación de AT-III.
La cuantificación de \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} es una
medida de la determinación de la cantidad de pentasacárido de
fijación de AT-III presente en la heparina y por
tanto ayuda a la medida directa de la anticoagulación mediada por
el anti-factor Xa de la heparina que es dependiente
del dominio del pentasacárido de fijación de AT-III
de la heparina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fraccionó UFH por tamaños mediante una
columna de exclusión de tamaños P10. Se realizó el análisis de la
composición sobre las fracciones resultantes para estimar su
contenido de \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Estas fracciones
se ensayaron también respecto a su actividad
anti-factor Xa.
\vskip1.000000\baselineskip
Una gráfica de actividad
anti-factor Xa de diferentes fracciones en función
de su \DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S} da como resultado una
línea recta con r = 0,91, como se muestra en la Figura 11. Esto
indica que la acción anticoagulante mediada por el
anti-factor Xa de las heparinas puede medirse
directamente por su contenido de
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S}. Los datos se presentan también
en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 8 muestra un análisis de la composición
de UFH realizado por CE de acuerdo con el protocolo reseñado en la
Figura 11, y la Tabla 7 puede utilizarse para comparar rigurosamente
diferentes lotes de LMWH. Se digirió UFH con 1 \mul o 5 \mul de
cóctel de enzimas (EC). Cada muestra se digirió por duplicado y cada
producto de digestión se analizó por duplicado por CE. En todas las
muestras, los picos de los sacáridos 1-8 tenían el
mismo tiempo de migración. La comparación de los análisis duplicados
de la misma muestra (UFH 1/1 con UFH 1/2, UFH 2/1 con UFH 2/2, y
UFH 3/1 con UFH 3/2) demuestra que existe una reproducibilidad
instrumental satisfactoria. La comparación de UFH 1/1 o UFH 1/2 con
UFH2/1 o UFH 2/2 demuestra que existe una variación mínima de
operación a operación. La comparación de UFH digerida con 1 \mul
de EC con UFH digerida con 5 \mul de EC ilustra que el aumento de
la cantidad de enzima no cambia apreciablemente el perfil de
disacáridos, lo que demuestra que se alcanza una digestión
exhaustiva utilizando 1 \mul de EC como se representa en la
Figura 11.
Se prepararon las fracciones de LMWH MS
57-1 a MS 57-4 y MS
59-1 a MS 59-4 por tratamiento de
UFH con 200 \mug de heparinasa III (como se ha descrito arriba) y
paso del producto resultante a través de una columna P10.
Se prepararon las fracciones de LMWH MS
56-1 a MS 56-4 por tratamiento de
UFH con 1000 \mug de heparinasa III, y paso del producto
resultante a través de una columna P10.
Se generaron las fracciones de LMWH
MS60-1 a MS60-3, y MS
55-1 a MS 55-4 por tratamiento de la
Fracción 2 con 200 \mug de heparinasa III, y paso del producto
resultante a través de una columna P10.
Se prepararon las fracciones de LMWH
MS66-1 y MS66-2 por tratamiento de
la Fracción 2 con 1000 \mug de heparinasa III, y paso del
producto resultante a través de una columna P10.
La fracción 1 es la heparina de peso molecular
alto que se precipita por tratamiento de UFH con acetato de bario a
la temperatura ambiente, como se describe en la referencia de Volpi
arriba descrita.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La fracción 2 es la segunda fracción de un MW
inferior que se precipita por mantenimiento de la heparina tratada
con acetato de bario a 4ºC. Esta es la fracción utilizada de acuerdo
con los métodos de la invención.
Se midieron los perfiles de absorción subcutánea
e in vivo de MS 55-2. El perfil de absorción
de MS 55-2 se comparó con el de la LMWH disponible
comercialmente, Ardeparina, y Enoxaparina. Se ensayó también la
actividad anti-Xa de las diversas especies de
heparina en cuanto a su actividad biológica in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 9 proporciona el análisis de
composición y funcional de las preparaciones de LMWH producidas de
acuerdo con la invención y de la fracción de control 1. La Tabla
enumera el peso molecular, la actividad in vitro, y la
composición de las diversas fracciones.
MS 55-2 exhibía farmacocinética
muy similar a la de Enoxaparina, como resulta evidente en las fases
de absorción y eliminación comparables, así como en T_{max}. La
biodisponibilidad y las concentraciones de los picos eran
comparables entre las tres LMWHs testadas por inyección subcutánea.
Cuando se administra por la ruta IV, la actividad inicial
anti-Xa es mucho mayor para MS 55-2
en comparación con Ardeparina. De nuevo, la biodisponibilidad entre
las dos LMWHs era prácticamente idéntica. Tanto Ardeparina como MS
55-2 exhibían una disminución exponencial en la
actividad anti-Xa, y por tanto la eliminación sigue
farmacocinética de primer orden.
Se observó que la actividad
anti-Xa de MS 55-2 era 205 UI/ng.
Ésta es mayor que la de las LMWHs tales como Enoxaparina (135
UI/ng), Ardeparina (93 UI/ng) que están disponibles actualmente en
los Estados Unidos. Los resultados se muestran también en la Figura
13.
Se considera que la memoria descriptiva escrita
que antecede es suficiente para permitir que un experto en la
técnica lleve a la práctica la invención. La presente invención no
debe considerarse limitada en alcance por los ejemplos
proporcionados, dado que los ejemplos tienen por objeto servir como
simple ilustración de un aspecto de la invención y otras
realizaciones funcionalmente equivalentes están dentro del alcance
de la invención. Diversas modificaciones de la invención, además de
las mostradas y descritas en esta memoria, resultarán evidentes
para los expertos en la técnica a partir de la descripción que
antecede, y caen dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (27)
1. Un método de análisis de una muestra que
comprende:
- a)
- aplicar una restricción experimental a un polisacárido contenido en una muestra para producir un polisacárido modificado que tiene un componente de firma,
- b)
- detectar la presencia del componente de firma en la muestra como indicación de que el polisacárido está presente en la muestra, y
- c)
- determinar la presencia o ausencia del componente de firma para analizar la muestra;
en donde el componente de firma se selecciona de
\DeltaUH_{NAC,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S};
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}GH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}GH_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}Man_{6S};
IH_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
H_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
H_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe};
H_{NS,6S}GH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe};
\DeltaUH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe};
H_{NS,6S}GH_{NS,6S}; H_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S,OMe};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS};
\DeltaUH_{NS,6S}; \DeltaU_{2S}H_{NAc,6S};
\DeltaUH_{NS}; \DeltaU_{2S}H_{NAc}; \DeltaUH_{NAc,6S}
o \DeltaUH_{NS,3S,GS}.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde el componente de firma tiene una actividad biológica
conocida.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde el componente de firma es biológicamente inactivo.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la restricción experimental aplicada a la muestra es
electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta presión,
cromatografía de permeación de gel, o resonancia magnética
nuclear.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la muestra es un lote de polisacárido y el componente
de firma se utiliza para monitorizar la pureza del lote por
determinación de la cantidad de componente de firma en el lote.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación
2, en donde el método de análisis es un método para monitorizar la
presencia de componentes activos en la muestra, en donde la
presencia del componente de firma en la muestra es indicativa de un
componente activo en la muestra.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación
3, en donde el método del análisis es un método para monitorizar la
presencia de componentes activos en la muestra, en donde la
presencia del componente de firma en la muestra es indicativa de
una muestra que carece de una actividad específica.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación
2, en donde el método de análisis es un método para determinar la
cantidad de componentes activos en la muestra por determinación de
la cantidad de componente de firma en la muestra.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación
2, en donde el método se lleva a cabo sobre al menos dos muestras y
en donde se determinan las cantidades relativas de componente de
firma en cada una de las al menos dos muestras, en donde el nivel
máximo relativo de componente de firma es indicativo de la muestra
más activa.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación
2, que comprende adicionalmente el uso del componente de firma para
identificar moléculas biológicamente activas.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en donde el componente de firma se utiliza para cribar una
genoteca.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde el componente de firma es una porción biológicamente
activa de un polisacárido.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en donde la porción biológicamente activa de polisacárido es un
tetrasacárido del dominio de fijación de AT-III de
la heparina o un tetrasacárido del dominio de fijación de FGF de la
heparina.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la restricción experimental aplicada a la muestra es
digestión con una exoenzima, digestión con una endoenzima, digestión
química, modificación química, o modificación con una enzima.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde el polisacárido contenido en la muestra se compara con
una base de datos de referencia de polisacáridos de tamaño idéntico
que el polisacárido, en donde los polisacáridos de la base de datos
de referencia se han sometido también a las mismas restricciones
experimentales que el polisacárido contenido en la muestra, en
donde la comparación proporciona un análisis de composición del
polisacárido de la muestra.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la muestra es un producto farmacéutico, una muestra
biológica, o una muestra de sangre.
17. Un método para evaluar la calidad de una
muestra de polisacárido que comprende los pasos de:
identificar un componente en la muestra de
polisacárido, y
determinar un valor cuantitativo de la cantidad
de componente, en donde el valor cuantitativo del componente es
indicativo de la calidad de la muestra de polisacárido;
y en donde el componente se selecciona de
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S};
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}GH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
I_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
I_{2S}H_{NS,6S}IH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}IH_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}GH_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S}I_{2S}Man_{6S};
IH_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
H_{NAc,6S}GMan_{3S,6S};
H_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe};
H_{NS,6S}GH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe};
\DeltaUH_{NS,6S}I_{2S}H_{NS,6S,OMe};
H_{NS,6S}GH_{NS,6S}; H_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S,OMe};
\DeltaU_{2S}H_{NS,6S};
\DeltaU_{2S}H_{NS};
\DeltaUH_{NS,6S}; \DeltaU_{2S}H_{NAc,6S};
\DeltaUH_{NS}; \DeltaU_{2S}H_{NAc}; \DeltaUH_{NAc,6S}
o \DeltaUH_{NS,3S,6S}.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación
17, en donde el método implica identificar al menos dos componentes
en la muestra de polisacárido y determinar un valor cuantitativo de
la cantidad de cada uno de los al menos dos componentes para
evaluar la calidad de la muestra de polisacárido.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, en donde el valor cuantitativo se calcula como el área bajo la
curva cuando la muestra se procesa por electroforesis capilar.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, en donde el valor cuantitativo se calcula como el factor de
respuesta.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, en donde el valor cuantitativo se calcula como la cantidad
porcentual relativa de cada fracción presente en la muestra.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, en donde el paso de calcular la cantidad porcentual relativa de
cada fracción presente en la muestra se determina de acuerdo con la
ecuación siguiente:
PRA = RF x
AUC_{%}R
en
donde
PRA = cantidad relativa en porcentaje de cada
fracción
RF = factor de respuesta
AUC_{%}R = AUC relativa en porcentaje [(100 x
AUC_{C})/AUC_{T})]
AUC_{C} = área bajo la curva para un
componente
AUC_{T} = la suma del área bajo la curva para
todos los componentes.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación
22, en donde el cálculo se realiza por ordenador y se utiliza para
generar una estructura de datos, materializada tangiblemente en un
medio legible por ordenador, que representa un valor cuantitativo
de un componente de un polisacárido.
24. Un método de acuerdo con la reivindicación
1 ó 17, en donde el polisacárido es un glucosaminoglucano, una
heparina de peso molecular bajo, heparina, sulfato de heparano, una
heparina preparada biotecnológicamente, una heparina modificada
químicamente, o una heparina sintética.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación
24, en donde el polisacárido es un glucosaminoglucano afín a la
heparina.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación
24, en donde el polisacárido es una heparina de peso molecular
bajo.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación
1 ó 17, en donde el componente de firma es uno de los picos que
corresponden a uno cualquiera de
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S,6S};
\DeltaUH_{NAc,6S}GH_{NS,3S}; o
\DeltaUH_{NS,6S}GH_{NS,3S}.
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