ES2324709T3 - Agonistas de brs-3 no peptidicos. - Google Patents

Agonistas de brs-3 no peptidicos. Download PDF

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ES2324709T3 ES03757007T ES03757007T ES2324709T3 ES 2324709 T3 ES2324709 T3 ES 2324709T3 ES 03757007 T ES03757007 T ES 03757007T ES 03757007 T ES03757007 T ES 03757007T ES 2324709 T3 ES2324709 T3 ES 2324709T3
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Abstract

Compuestos de la fórmula general I, ** ver fórmula** en los que significan A1 CH o, con la condición de que A2 no represente un enlace y A3, simultáneamente, signifique NH, también nitrógeno; A2 un enlace, alquileno-C1-2 o, con la condición de que A1 represente CH y R2 signifique hidrógeno, también carbonilo; A3 metileno, eventualmente sustituido con alquilo-C1-4 o alquil-C1-4-carbonilamida o, con la condición de que R2 signifique hidrógeno o represente, conjuntamente con R1 un enlace, también NH; R1 hidrógeno o, con la condición de que A2 represente carbonilo, también amino, y R2 hidrógeno, o R1 y R2 representan, conjuntamente, un enlace, con la condición de que A2 signifique un enlace; R3 hidrógeno o metilo; Ar1 fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C1-4, o con alquilen-C1-2-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo; Ar2 furilo, benzofuranilo, tienilo, benzotiofenilo, pirrolilo o indolilo; Ar3 fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno, o piridilo; m 0 ó 1, y n 0 ó 1, así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.

Description

Agonistas de BRS-3 no peptídicos.
La presente invención se refiere a nuevos compuestos, no peptídicos, que exhiben una actividad agonista selectiva sobre el receptor de bombesina del subtipo 3 (BRS-3), y a los preparados farmacéuticos que contienen estos compuestos, así como a procedimientos para la preparación de estos compuestos.
Bombesina (Bn) es un péptido compuesto por 14 aminoácidos, originalmente aislado de anfibios. Los dos péptidos identificados en mamíferos, neuromedina B (NMB) y el "péptido liberador de gastrina" (GRP), representan péptidos estructuralmente similares. Estos péptidos similares a bombesina son los ligandos endógenos naturales de los correspondientes receptores de bombesina, es decir, el "receptor de neuromedina B" (NMB-R, BB1) y del "receptor del péptido liberador de gastrina" (GRP-R, BB2). Los receptores de bombesina pertenecen al grupo de los receptores G-acoplados con 7 dominios trans-membranosos.
El receptor de bombesina del subtipo 3 (BRS-3 o BB3) se incluye en esta familia de receptores de bombesina debido a la homología de su secuencia de aminoácidos [véase Fathi et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:5979-84; en lo sucesivo citado como "Fathi et al."]. Hasta la fecha, se desconoce el ligando natural de BRS-3. Se ha detectado la expresión de BRS-3 en diferentes regiones del cerebro [véase Yamada et al. (1999), Physiol Behav. 66:863-7], en espermatocitos secundarios [véase Fathi et al.], en células de los islotes pancreáticos [véase Fleischmann et al. (2000), Lab Invest. 80:1807-17], así como en el tejido uterino de animales preñados [véase Gorbuley et al. (1992), Eur J Biochem. 208:405-10]. Adicionalmente, se ha identificado BRS-3 en distintas líneas de células cancerosas humanas (por ejemplo, pulmón [véase Fathi et al.], mama [véase Gorbulev et al. (1994) FEBS Lett. 340:260-4], próstata [véase Sun et al. (2000) Prostate. 42:295-303] u ovarios [véase Sun et al. (2000) Regul Pept. 90:
77-84]).
Ratones genéticamente modificados, en los que se desactivó el gen BRS-3 ("BRS-3 Knockout Mice"), mostraron un cuadro patológico que comprendió obesidad, hiperfagia, así como hipertensión y diabetes [véase Okhi-Hamazaki et al. (1997), Nature 390:165-9]. En consecuencia, BRS-3 parece intervenir, de manera esencial, en la regulación del metabolismo de la glucosa y los lípidos, en la conservación de la situación energética y en el control de la tensión arterial, así como en la conducta alimentaria. Por lo tanto, se puede deducir que los compuestos con acción agonista de BRS-3 resultan adecuados especialmente para la profilaxis y/o el tratamiento de estados patológicos tales como obesidad (adiposidad), diabetes, hiperinsulinemia, enfermedades cardiovasculares, trastornos alimentarios (hiperfagia, anorexia, bulimia) y/o el síndrome metabólico (= síndrome X). El síndrome X se manifiesta, principalmente, por diabetes mellitus tipo II o una tolerancia reducida a la glucosa, hipertensión arterial, trastornos del metabolismo lipídico, obesidad, y por enfermedad coronaria.
Se sabe, además, que la activación de BRS-3 puede tener un efecto neuroprotector [véase documento WO
01/68120]. Asimismo, BRS-3 parece estar relacionado con la percepción del gusto [véase Yamada et al. (1999) Physiol Behav. 66:863-7], la influencia sobre el comportamiento social [véase Yamada et al. (2000) Physiol Behav. 68:555-61] y determinadas conductas emocionales [véase Yamada et al. (2002) Mol Psychiatry. 7:113-7]. Por lo tanto, también es posible deducir, entonces, que los compuestos capaces de modular BRS-3 pueden ser adecuados para la profilaxis y/o el tratamiento de cuadros patológicos psiquiátricos tales como depresión o estados de ansiedad, trastornos de la percepción del gusto y/o enfermedades degenerativas del sistema nervioso central, por ejemplo, Parkinson o Alzheimer.
Se conocen ya algunos ligandos peptídicos sintéticos que se fijan con una cierta afinidad a BRS-3, desarrollando una acción agonista, a saber el octapéptido selectivo de BRS-3 [D-Phe^{6}, Phe^{13}]Bn(6-13) propilamida [véase Wu et al. (1996) Mol Pharmacol. 50:1355-63], así como el nonapéptido menos selectivo [D-Tyr^{6}, \beta-Ala^{11}, Phe^{13}, Nle^{14}]Bn(6-14) [véase Mantey et al. (1997) J Biol Chem. 272:26062-71] y sus derivados [véanse Pradhan et al. (1998) Eur J Pharmacol. 343:275-87; Mantey et al. (2001) J Biol Chem. 276:9219-29].
Por el documento WO 98/07718 se conocen ya, adicionalmente, compuestos análogos de bombesina, no peptídicos y de bajo peso molecular, pero que representan antagonistas selectivos de los otros subtipos de la familia de receptores de bombesina (NMB-R y GRP-R). Por el contrario, hasta la fecha no se han descrito compuestos de bajo peso molecular, no peptídicos y selectivos, con una elevada afinidad por BRS-3, con acción agonista.
La presente invención tiene, por lo tanto, la misión de poner a disposición nuevos compuestos con acción agonista sobre BRS-3, de bajo peso molecular, no peptídicos, selectivos y de alta afinidad.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los nuevos compuestos de bajo peso molecular y no peptídicos según la invención son agonistas selectivos de BRS-3 y son, por lo tanto, adecuados para la profilaxis y/o el tratamiento de cuadros patológicos sobre los que se puede influir favorablemente por la estimulación de BRS-3. Debido a su perfil de actividad, los compuestos según la invención parecen ser especialmente apropiados para la profilaxis y/o el tratamiento de la obesidad (= adiposidad), diabetes, hiperinsulinemia, enfermedades cardiovasculares, trastornos alimentarios (hiperfagia, anorexia, bulimia) y/o síndrome X.
\newpage
Objeto de la invención son nuevos compuestos de la fórmula general I
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1 
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en la que significan
A^{1}
CH o, con la condición de que A^{2} no represente un enlace y A^{3} no sea simultáneamente NH, también nitrógeno,
A^{2}
un enlace, alquileno-C_{1-2} o, con la condición de que A^{1} represente CH y R^{2} sea hidrógeno, también carbonilo,
A^{3}
metileno, eventualmente sustituido con alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida, o, con la condición de que R^{2} signifique hidrógeno o forme junto con R^{1} un enlace, también NH,
R^{1}
hidrógeno o, con la condición de que A^{2} sea carbonilo, también amino, y
R^{2}
hidrógeno, o
R^{1} y R^{2} representan, juntos, un enlace, con la condición de que A^{2} signifique un enlace,
R^{3}
hidrógeno o metilo,
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4}, o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo,
Ar^{2}
furilo, benzofuranilo, tienilo, benzotiofenilo, pirrolilo o indolilo,
Ar^{3}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno, o piridilo,
m
0 ó 1, y
n
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido, fisiológicamente aceptables. Adicionalmente, son objeto de la invención los preparados farmacéuticos que contienen compuestos de la fórmula I, así como un procedimiento para la preparación de estos compuestos.
Cuando los compuestos de la fórmula I contienen sustituyentes alquilo-C_{1-4}, éstos pueden ser de cadena lineal o ramificada. Si contiene halógeno, éste puede ser, en especial, flúor, cloro o bromo. Se prefiere cloro.
Si A^{3} está sustituido con alquilo-C_{1-4}, se prefiere metilo. Si A^{3} está sustituido con alquil-C_{1-4}-carbonilamida, se prefiere n-propilamida.
R^{3} significa, preferentemente, hidrógeno.
Ar^{1} significa, preferentemente, fenilo, eventualmente sustituido una vez con halógeno, piridilo, furilo, en especial, 2-furilo, o indolilo, en especial, 2-indolilo.
Ar^{2} representa, preferentemente, benzotiofenilo o indolilo. Se prefiere indolilo, en especial, 3-indolilo.
Ar^{3} representa, preferentemente, fenilo, en especial, fenilo no sustituido.
n significa, preferentemente, 1.
\newpage
Compuestos preferidos de la fórmula I son los compuestos de la fórmula general Ia que se indican a continuación,
2
en la que Ar^{1} y m poseen los significados anteriores, R^{101} significa hidrógeno o amino, R^{4} significa hidrógeno, alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida y Ar^{201} significa benzotiofenilo o indolilo, de la fórmula general Ib
3
en la que R^{4}, Ar^{1}, Ar^{201} y m poseen los significados anteriores, de la fórmula general Ic
4
en la que Ar^{1}, Ar^{201} y m poseen los significados anteriores, de la fórmula general Id
5
en la que Ar^{1}, Ar^{201} y m poseen los significados anteriores, y de la fórmula general Ie
6
en la que Ar^{1}, Ar^{201} y m poseen los significados anteriores.
Los compuestos de la fórmula I representan compuestos no peptídicos, pero que contienen uniones peptídicas. Por lo tanto, los compuestos de la fórmula I se pueden considerar como polipéptidos no naturales, siendo posible construirlos parcial o totalmente de forma conocida en la síntesis de péptidos, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis sólida o líquida con componentes amino o carboxilo adecuados, preferentemente de manera secuencial. Si se utilizan, adicionalmente, también otros métodos de síntesis de la química orgánica para la construcción de los compuestos de la fórmula I, se pueden utilizar métodos sintéticos clásicos de la química orgánica.
De esta forma, los compuestos de la fórmula I y sus sales por adición de ácido se pueden preparar, por ejemplo,
a) para preparar un compuesto de la fórmula general Ig
7
en la que A^{3}, R^{101}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula general II
8
en el que m posee el significado anterior, Ar^{101} tiene el significado anteriormente indicado para Ar^{1}, en el que, en todos los casos, los grupos reactivos están protegidos con grupos protectores, y R^{111} posee el significado anteriormente indicado para R^{101}, en el que, en todos los casos, un grupo amino está protegido con un grupo protector, con un compuesto de la fórmula general III
9
en el que R^{3}, Ar^{3} y n poseen los significados anteriores, Ar^{210} tiene el significado anteriormente indicado para Ar^{2}, en el que, en todos los casos, los grupos reactivos están protegidos con grupos protectores, y A^{310} tiene el significado indicado para A^{3}, en el que, en todos los casos, los átomos de nitrógeno reactivos están protegidos con grupos protectores, o
b) para preparar con compuesto de la fórmula general Ih
10
en el que A^{1}, A^{2}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores y A^{301} tiene el significado anteriormente indicado para A^{3}, con la excepción de NH, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula general IV
11
en el que A^{1}, A^{2}, Ar^{110} y m poseen los significados anteriores, A^{311} tiene el significado anteriormente indicado para A^{301}, en el que, en todos los casos, los átomos de nitrógeno reactivos están protegidos con grupos protectores, R^{110} tiene el significado anteriormente indicado para R^{1}, en el que, en todos los casos, los grupos amino están protegidos con un grupo protector, y R^{201} tiene el significado anteriormente indicado para R^{2}, con la excepción de hidrógeno, o significa un grupo amino-protector, con un compuesto de la fórmula general V
12
en el que R^{3}, Ar^{210}, Ar^{3} y n poseen los significados anteriores, o
c) para preparar un compuesto de la fórmula general Ii
13
en el que A^{1}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores, y A^{201} tiene el significado anteriormente indicado para A^{2}, con la excepción de carbonilo, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula V con un equivalente de síntesis de grupos carbonilo y con un compuesto de la fórmula general VI
14
en el que A^{1}, A^{201}, Ar^{110} y m poseen los significados anteriores, R^{104} representa hidrógeno o, con la condición de que A^{1} signifique nitrógeno, puede representar también un grupo protector de nitrógeno, y SG representa un grupo protector adecuado en la química de péptidos, o
d) para preparar un compuesto de la fórmula general Ij,
15
en el que A^{310}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula III con un compuesto de la fórmula general VIII
16
en el que Ar^{110} y m poseen los significados anteriores,
y, en todos los casos, los grupos protectores se vuelven a separar de forma secuencial, y un compuesto de la fórmula I obtenido se transforma, si se desea, en su sal por adición de ácido, o una sal por adición de ácido se transforma en un compuesto libre de la fórmula I.
Según la variante del procedimiento a), se puede preparar un compuesto de la fórmula Ig haciendo reaccionar un derivado de ácido carboxílico de la fórmula II con una amina primaria de la fórmula III, y se vuelven a separar, eventualmente, los grupos protectores presentes. La reacción puede llevarse a cabo de manera conocida en la química de péptidos como reacción en fase líquida, o también como reacción en fase sólida, por ejemplo, en el sentido de una síntesis de péptidos de fase sólida de "Merrifield". Cuando la síntesis se efectúa en fase sólida, se hace reaccionar, preferentemente, un compuesto de la fórmula II unido a una resina en un disolvente polar aprótico, tal como N-metilpirrolidinona (= NMP), con un compuesto de la fórmula III, así como con compuestos adecuados como reactivos de acoplamiento, en especial N-hidroxi-benzotriazol (= HOBT), tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (= TBTU), N-hidroxi-9-azabenzotriazol (= HOAt) y/o hexafluorofosfato de 2-(1H-9-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (= HATU), así como en presencia de una base orgánica no nucleófila, en especial, diisopropil-etilamina (= DIPEA). Como resina para la síntesis de fase sólida resulta apropiada, en especial, la resina de 2-(4-formil-3-metoxifenoxi)-etilo (= resina FMPE, véase, por ejemplo, A. Floersheimer et al., Pept. 1990, Proc. Eur. Pept. Symp., 21º (1991), Fecha de Reunión 1990, E. Giralt et al. (compiladores) ESCOM.: Leiden, 1991; 131). La carga de la resina con el correspondiente compuesto previsto para la reacción adicional, puede tener lugar de manera en sí conocida (véase más adelante).
Los compuestos de la fórmula II son conocidos en sí mismos, o se pueden preparar de forma en sí conocida a partir de compuestos conocidos (véase, por ejemplo, R. Gretler et al. (1978), Helv Chim Acta 61(5):1730-1755). De este modo, por ejemplo, se pueden obtener compuestos de la fórmula II, en los que Ar^{110} representa 2-indolilo eventualmente protegido, de manera en sí conocida por reacción reductora de derivados del éster acetoacético de nitrofenilo con tricloruro de titanio (véanse, por ejemplo, C.J. Moody et al. (1990), J Chem Soc Perkin Trans 1:673-679; A. Mai et al. (1999), J Med Chem 42:619-627). Los grupos protectores que se utilizan en el marco de la presente invención, se pueden introducir, respectivamente, de manera en sí conocida y de forma a menudo selectiva e independiente entre sí, separándolos nuevamente después. Grupos protectores adecuados para la síntesis de péptidos se conocen, por ejemplo, de J.A.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press 1971, o T.W. Green y P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley and Sons, 1999. Cuando se protegen sustituyentes R^{111} por medio de grupos protectores adecuados, resultan especialmente apropiados los grupos protectores conocidos de la química de péptidos. Preferentemente, resultan adecuados los grupos protectores terc-butilcarboniloxi (= Boc) o (9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonilo (=Fmoc).
Los compuestos de la fórmula III se pueden preparar, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula V con un compuesto de la fórmula general X
17
en el que A^{310} posee el significado anterior y SG tiene el significado indicado y representa, preferentemente, el grupo protector Fmoc, separando a continuación, de forma en sí conocida, el grupo protector SG. La reacción se puede llevar a cabo del modo indicado anteriormente para la reacción de un compuesto de la fórmula II con un compuesto de la fórmula III, en la que el compuesto de la fórmula V está, preferentemente, unido a una resina. Cuando los átomos de nitrógeno reactivos presentes en el grupo A^{310} están protegidos con grupos protectores adecuados, resulta especialmente apropiado el grupo protector trifenil-metilo (= tritilo, Trt). Los compuestos de la fórmula X son conocidos o se pueden preparar de forma en sí conocida a partir de compuestos conocidos.
Los compuestos de la fórmula V se pueden preparar haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula general XI
18
en el que Ar^{210} y SG poseen los significados anteriores, con un compuesto de la fórmula general XII
19
en el que R^{3}, Ar^{3} y n poseen los significados anteriores y, seguidamente, se vuelve a separar un grupo protector SG. La reacción se puede llevar a cabo, por ejemplo, de la forma descrita para la reacción de un compuesto de la fórmula II con un compuesto de la fórmula III, como síntesis de fase sólida, en la que, preferentemente, el compuesto de la fórmula XII está unido a una resina. Si se utiliza resina FMPE, la carga de la resina puede tener lugar con un compuesto de la fórmula XII de manera en sí conocida, a modo de una aminación reductora (véase B. Dörner et al., Pept. 1998, Proc. Eur. Pept. Symp, 25º (1999), Fecha de Reunión 1998; S. Bajusz et al. (compiladores), Akadémiai Kiadó: Budapest, 1999; 90). Los compuestos de la fórmula XI son conocidos en sí mismos o se pueden preparar de forma conocida a partir de compuestos conocidos. Cuando los sustituyentes Ar^{210} en los compuestos de la fórmula XI están protegidos con grupos protectores, resultan especialmente adecuados los grupos protectores de la química de péptidos. Preferentemente, resulta adecuado el grupo protector Boc. Los compuestos de la fórmula XII son conocidos en sí mismos, o se pueden preparar de manera conocida a partir de compuestos conocidos.
En una forma de realización de la variante a) del procedimiento, se puede preparar un compuesto de la fórmula Ik
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en el que R^{101}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores, haciendo reaccionar un derivado de ácido carboxílico de la fórmula II con un derivado de hidracina de la fórmula IIIa
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en el que R^{3}, Ar^{210}, Ar^{3} y n poseen los significados anteriores, y los grupos protectores eventualmente presentes se vuelven a separar posteriormente. La reacción se puede llevar a cabo, por ejemplo, de la forma anteriormente indicada para la reacción de un compuesto de la fórmula II con un compuesto de la fórmula III, en forma de síntesis de fase sólida. Los compuestos de la fórmula IIIa se pueden preparar mediante reacción de un compuesto de la fórmula V con una 5-(9H-fluoren-9-il-metoxi)-3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona en sí conocida y posterior separación de los grupos protectores no deseados. La reacción se puede llevar a cabo, por ejemplo, de la forma anteriormente indicada para la reacción de un compuesto de la fórmula II con un compuesto de la fórmula III, a modo de síntesis de fase sólida, en la que se puede utilizar como disolvente, especialmente, diclorometano.
Según la variante b) del procedimiento, se puede preparar un compuesto de la fórmula Ih haciendo reaccionar un derivado de ácido carboxílico de la fórmula IV con una amina primaria de la fórmula V, volviendo a separar posteriormente los grupos protectores eventualmente presentes. La reacción se puede llevar a cabo, por ejemplo, de la manera anteriormente indicada para la reacción de un compuesto de la fórmula II con un compuesto de la fórmula III, en forma de una síntesis de fase sólida o, también, en fase líquida. Cuando la reacción se efectúa sobre fase sólida, el compuesto de la fórmula V está, preferentemente, unido a una resina. Cuando la reacción se lleva a cabo en fase líquida, se puede trabajar en un disolvente polar aprótico tal como dimetilformamida (= DMF) y en presencia de compuestos adecuados como reactivos de acoplamiento, mencionados en la variante a) del procedimiento, así como en presencia de una base orgánica no nucleófila, en especial, colidina sim. Cuando R^{201} significa un grupo amino-protector, éste puede ser, preferentemente, el grupo protector Fmoc. Si los sustituyentes R^{110} están protegidos con grupos protectores apropiados, resultan adecuados los grupos protectores mencionados anteriormente como apropiados para los sustituyentes R^{111}. Los compuestos de la fórmula IV se pueden preparar haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula general
XIII
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en el que A^{1}, A^{2}, R^{110}, R^{2}, Ar^{110} y m poseen los significados anteriores, con un compuesto de la fórmula general XIV
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en el que A^{311} posee el significado anterior, X representa un grupo volátil separable y SG^{1} significa un grupo protector de ácido carboxílico, se vuelve a separar, posteriormente, el grupo protector de ácido carboxílico SG^{1} y, en caso necesario, se introduce en los sustituyentes R^{2} un grupo protector. La reacción puede llevarse a cabo en un disolvente aromático tal como tolueno, a temperaturas entre -20ºC y temperatura ambiente (= RT), preferentemente, a 0ºC. Como grupo volátil X en los compuestos de la fórmula XIV, se toma en consideración en especial un halógeno, preferentemente, cloro o bromo. Como grupo protector de carboxilo SG^{1} se toman en consideración especialmente un alquilo inferior, preferentemente, etilo, o terc-butilo. Los compuestos de la fórmula XIII son conocidos en sí mismos, o se pueden preparar de manera conocida a partir de compuestos conocidos. Los compuestos de la fórmula XIV son conocidos en sí mismos, o se pueden preparar de manera conocida a partir de compuestos conocidos.
Según la variante c) del procedimiento, se puede preparar una compuesto de la fórmula Ii haciendo reaccionar una amina primaria de la fórmula V con un equivalente de síntesis de grupos carbonilo y con un derivado de hidracina de la fórmula VI, volviendo a separar posteriormente los grupos protectores eventualmente presentes. La reacción se puede llevar a cabo, preferentemente, a temperatura ambiente en fase líquida, especialmente en un disolvente dipolar aprótico tal como diclorometano. De manera conveniente, se trabaja en presencia de una base orgánica no nucleófila soluble en el disolvente, tal como 4-dimetil-aminopiridina (= DMAP). Como equivalentes de síntesis de grupos carbonilo resultan adecuados, preferentemente, carbonato de dipenta-fluorocarbonilo o, también, fosgeno, carbonato de bis-(triclorometilo) (trifosgeno), éster tricloro-metílico del ácido clorofórmico (difosgeno) o carbonil-diimidazol. Los compuestos de la fórmula VI son en sí conocidos, o se pueden preparar de manera conocida a partir de compuestos conocidos. De esta forma, por ejemplo, se puede preparar un compuesto de la fórmula general VIa
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en el que Ar^{110}, m y SG poseen los significados anteriores, de manera en sí conocida, por aminación reductora a partir de un correspondiente aldehído de la fórmula general VIII y una correspondiente amina de la fórmula general XVII,
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en la que SG^{1} representa un grupo protector conocido en la química de péptidos, preferentemente, un grupo protector Boc, consiguiente introducción de un grupo protector SG y, por último, separación del grupo protector SG^{2}. La reacción se puede llevar a cabo en un disolvente dipolar aprótico tal como tetrahidrofurano (= THF) y, preferentemente, a temperatura ambiente. La reducción de un compuesto imina correspondiente, obtenido como producto intermedio, se puede efectuar en un disolvente dipolar aprótico tal como THF y a temperaturas entre -20ºC y temperatura ambiente, preferentemente, a 0ºC. Como agente reductor resultan adecuados borohidruros complejos tales como NaCNBH_{3}. Los compuestos de las fórmulas VIII y XVII son conocidos en sí mismos, o se pueden preparar de manera conocida a partir de compuestos conocidos.
De acuerdo con la variante d) del procedimiento, se puede preparar un compuesto de la fórmula Ij haciendo reaccionar un compuesto amino de la fórmula III con un aldehído de la fórmula VIII y, seguidamente, volver a separar los grupos protectores eventualmente presentes. La reacción se puede llevar a cabo de la forma indicada anteriormente para la reacción de los compuestos de la fórmula XVI con compuestos de la fórmula XVII, en la que, sin embargo, la imina formada no se reduce.
Los compuestos de la fórmula I obtenidos se pueden aislar y purificar de manera en sí conocida a partir de la mezcla de reacción. Las sales por adición de ácido se pueden transformar, de forma habitual, en las bases libres y éstas se pueden convertir, si se desea, de forma conocida en sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
Como sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de la fórmula I se toman en consideración sus sales con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido sulfúrico, ácidos fosfóricos o hidrácidos halogenados, preferentemente, ácido clorhídrico, o con ácidos orgánicos, por ejemplo, ácidos mono-, di- o tricarboxílicos alifáticos inferiores tales como ácido maleico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico, o con ácidos sulfónicos, por ejemplo, ácidos alcano-sulfónicos inferiores tales como ácido metano-sulfónico, o eventualmente, ácidos benceno-sulfónicos eventualmente sustituidos en el anillo benceno con halógeno o alquilo inferior, tales como ácido p-toluenosul-
fónico.
Los compuestos de la fórmula I pueden contener, además del átomo de carbono portador del resto -CH_{2}-Ar^{2}, otros centros de quiralidad adicionales, concretamente el átomo de carbono portador del sustituyente R^{3}, el átomo de carbono sustituido con alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida, del grupo metileno A^{3}, y/o el átomo de carbono del grupo CH A^{1}, con la condición de que R^{1} signifique amino. Los compuestos de la fórmula I pueden estar presentes, por lo tanto, en múltiples formas estereoisómeras. La presente invención comprende tanto las mezclas de isómeros ópticos, así como los compuestos isoméricamente puros de la fórmula I. Se prefieren los compuestos isoméricamente puros de la fórmula I, en particular, los compuestos de la fórmula I en los que el átomo de carbono, sustituido con alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida, del grupo metileno A^{3} tiene la configuración S. En caso de que en la síntesis de los compuestos de la fórmula I se utilicen mezclas de isómeros ópticos del compuesto de partida, también los compuestos de la fórmula I se obtendrán en forma de mezclas de isómeros ópticos. Partiendo de formas estereoquímicamente homogéneos del compuesto de partida, se pueden obtener también compuestos estereoquímicamente homogéneos de la fórmula I. Los compuestos estereoquímicamente homogéneos de la fórmula I se pueden obtener también de la mezclas de isómeros ópticos de manera en sí conocida, por ejemplo, por separación cromatográfica sobre materiales de separación quirales, o mediante reacción con ácidos ópticamente activos adecuados, por ejemplo, ácido tartárico o ácido canfor-10-sulfónico, y subsiguiente separación en las antípodas ópticamente activas por cristalización fraccionada de las sales diastereoisómeras obtenidas.
Los nuevos compuestos de la fórmula I y sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables se distinguen por una elevada afinidad por el receptor de bombesina del subtipo 3, sobre el que actúan como agonistas, comparativamente selectiva con respecto a los restantes subtipos de receptores de bombesina conocidos, NMB-R y GRP-R. Por lo tanto, cabe esperar de los compuestos de la fórmula I que sean adecuados para la profilaxis y/o el tratamiento de cuadros patológicos sobre los cuales se puede actuar favorablemente a través de una estimulación de BRS-3. Los compuestos según la invención parecen ser especialmente adecuados para la profilaxis y/o el tratamiento de la obesidad (= adiposidad), diabetes, hiperinsulinemia, enfermedades cardiovasculares, trastornos alimentarios (hiperfagia, anorexia, bulimia) y/o del síndrome X.
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Descripción de los métodos de ensayo farmacológico
Las acciones agonistas sobre BRS-3 de las sustancias de ensayo se pueden demostrar in vitro, por ejemplo, en un ensayo farmacológico estándar, de acuerdo con el método FLIPR ("Fluorometric Imaging Plate Reader" = "Lector de Placas de Imágenes Fluorométricas").
Para ello, se transfectan, en primer lugar, células CHO (= "Chinese hamster ovary cells", células ováricas del hámster chino) de manera en sí conocida con un vector de expresión para el subtipo 3 del receptor de bombesina humano, es decir, BRS-3.
El ADNc de BRS-3 humano (secuencia de nucleótidos bajo nº de acceso de GenBank L08893) cortó con ayuda de la endonucleasa de restricción EcoRI del vector de plasmidio pGEM4 (Cía. Promega, EE.UU.), subclonándolo en el vector de expresión pcDNA3.1(-) (Cía. Invitrogen, EE.UU.). Las células CHO-K1 transfectadas, que fueron estables con el vector de expresión RD-HGA16, portador de la secuencia de ADNc de la proteína G\alpha16 humana (secuencia de nucleótidos bajo nº de acceso de GenBank M63904), se depositaron el placas de ensayo con 24 pocillos ("24-well plate") y se incubaron durante una noche, bajo condiciones de esterilidad, en un incubador humidificado con aire a 37ºC y CO_{2} al 5% en medio F-12 más Glutamax-I (Cía. Gibco BRL, Nº de catálogo 31765), suplementado con suero de ternero fetal al 10% (inactivado a 56ºC durante 1 h, Cía. Gibco BRL), 25 \mug/ml de gentamicina (Cía. Gibco BRL) y 0,2 mg/ml de Higromicina B (Cía. Gibco BRL). Al día siguiente, las células se transfectaron con el vector de expresión para BRS-3; utilizando el "Effectene Transfection Reagent" (Cía. Qiagen), se agregaron a cada pocillo de ensayo 12 \mul de una solución que contenía 0,3 \mug/\mul de ADN del vector de expresión. Un día después de la transfección, se cambió el medio de cultivo por medio de selección. A tal efecto, se cultivaron las células transfectadas que expresaron simultáneamente BRS-3 y la proteína G\alpha16 humana, bajo condiciones de esterilidad, a 37ºC y CO_{2} al 5% en medio F-12 más Glutamax-I (Cía. Gibco BRL, Nº de catálogo 31765), suplementado con suero de ternero fetal al 10% (inactivado a 56ºC durante 1 h, Cía. Gibco BRL), 25 \mug/ml de gentamicina (Cía. Gibco BRL), o,2 mg/ml de higromicina B (Cía. Gibco BRL), y 0,5 mg/ml de geneticina (Cía. Gibco BRL). Para optimizar el ensayo celular, se seleccionaron las células con el mayor índice de expresión de receptores. Para ello, las células transfectadas se diluyeron con el medio de selección anteriormente descrito a 1:30000 y se sembraron en placas de ensayo con 96 pocillos ("96-well plate"). Las células se incubaron durante una noche a 37ºC y CO_{2} al 5%, a continuación, se seleccionaron los pocillos que contenían una sola célula. Estas células se cultivaron seguidamente en placas de ensayo con 24 pocillos ("24-well plate") y se cultivaron, entonces, en frascos de plástico Costar (primero de 25 ml y, después, 225 ml). El cálculo de la expresión del receptor de BRS-3 de los respectivos clones aislados se hizo a través de una determinación del valor de CE_{50} del nonapéptido sintético [D-Phe^{6},\beta-Ala^{11},Phe^{13},Nle^{14}]Bn(6-14) como ligando (véase más adelante la realización del experimento). Las células transfectadas se almacenaron a -80ºC en partes alícuotas de 1,8 ml de medio con dimetilsulfóxido (= DMSO) al 10% (concentración celular 1 x 10^{6} células/ml). Para el cultivo, se calentó a 37ºC una alícuota congelada, se la transfirió a un frasco plástico Costar (225 ml) y se diluyó con 50 ml del medio de selección anteriormente descrito. A continuación, el medio se cambió una vez, después de la incubación durante 30 minutos. En los uno a tres días sucesivos, se retiró el medio, las células adherentes (40-95% de confluencia) se lavaron con medio de PBS Dulbecco (Cía. Gibco BRL), y se desprendieron del suelo de los frascos por medio de tratamiento de 2 minutos con solución de tripsina-EDTA (Cía. Gibco BRL), a 37ºC. En caso de tener que seguir cultivando las células, se les transfirió a un nuevo frasco de plástico con medio fresco. Si se debían realizar experimentos con las células, éstas se transfirieron a placas de ensayo Costar con 96 pocillos, fondo de placa transparente y tapa ("Costar 96-well assay plates", Cía. Corning), tras lo cual se ajustó la concentración celular a 1,2 x 10^{4} células/ml.
BRS-3 está acoplado a través de la proteína G a la vía de transducción de señales de Ca^{2+} de las células CHO. Cuando se une un agonista al receptor, se activa a través de la proteína G la fosfolipasa C, la cual cataliza, entonces, por su parte, la síntesis de fosfatos de inositol hidrosolubles. Estos fosfatos de inositol determinan la liberación de Ca^{2+}, que se almacena en el retículo endoplásmico. La elevación temporal de la concentración citosólica de Ca^{2+} se midió en el llamado experimento FLIPR. Para esto, las células se cargaron con un colorante fluorescente que fija Ca^{2+}, Fluo 4 (Cía. Molecular Probes). Este colorante intracelular se fija a los iones de Ca^{2+} citosólicos liberados tras la activación y refuerza, de esta forma, su intensidad de fluorescencia. La modificación de la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la variación de la concentración intracelular de Ca^{2+} y es una medición de la activación de las células por el correspondiente agonista. Por debajo de la respuesta máxima de fluorescencia, el grado de activación depende de la concentración de los compuestos utilizados. Se determinó la variación de la fluorescencia por la activación de BRS-3 para cada una de las sustancias de ensayo con diferentes concentraciones de sustancia. Como valor de referencia para una activación de 100% se aplicó la respuesta máxima de fluorescencia en la activación de BRS-3 con el nonapéptido sintético [D-Phe^{6},\beta-Ala^{11},Phe^{13},Nle^{14}]Bn(6-14) [véase Mantey et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 26062-26071]. La concentración del compuesto a la que se produjo una activación de 50% se estableció como valor de CE_{50} y sirvió como medida para la eficacia de los respectivos compuestos de ensayo como agonistas de
BRS-3.
Las células CHO transfectadas se cultivaron durante 18 a 24 horas (= h) en las placas de ensayo de 96 pocillos de Costar (Cía. Corning), hasta que mostraron confluencia. Se preparó diariamente una solución madre 250 mM de probenecid. Para esto, se disolvieron 710 mg de probenecid (Cía. Sigma, nº P8761) en 5 ml de NaOH 1N y, a continuación, se diluyó hasta 10 ml con Medio HBSS sin rojo fenol (Gibco BRL), que contuvo HEPES 20 mM (Cía. PAA Laboratories). Se preparó una solución madre 2 mM del colorante indicador de iones de calcio fluorescente Fluo4 por disolución de 1 mg de Fluo4 en 440 \mul de DMSO, y se almacenó a -20ºC. Adicionalmente, se utilizó una solución al 20% (peso/volumen) de Pluronic F-127 (Cía. Sigma) en DMSO. Inmediatamente antes de su uso, se descongeló una alícuota de 22 \mul de la solución madre de Fluo4. El medio de carga se preparó en el momento, mezclando 42 ml de Medio HBSS sin rojo fenol (Gibco BRL), que contuvo HEPES 60 mM (Cía. PAA Laboratories), con 420 \mul de la solución madre de probenecid y sendos 22 \mul de la solución madre de Fluo4 y de la solución de Pluronic-F-127. Las células se incubaron en cada pocillo de ensayo con 100 \mul de medio de carga fresco durante 45-60 min a 37ºC y CO_{2} al 5%. A continuación, las células se lavaron tres veces con sendos 100 \mul de Medio HBSS con HEPES 20 mM y probenecid 2,5 mM. Al final de la última fase de lavado quedó, en cada uno de los 96 pocillos de ensayo, un volumen de 100 \mul sobre las células.
A partir de los compuestos de la fórmula I se prepararon, respectivamente, soluciones madre 10 mM en DMSO, de las que se depositaron en placas de microtitulación con 96 pocillos de ensayo ("96-well plates", Cía. Greiner) series de dilución con Medio HBSS con HEPES 20 mM. La concentración máxima utilizada en las mediciones fue, habitualmente, de 33 \muM, si bien en algunos casos fue de sólo 1 \muM. Las soluciones se diluyeron, en función de los correspondientes compuestos, a 1:2, 1:3, 1:4 ó 1:10 sobre 8 ó 16 pocillos de ensayo diferentes. Como referencia, cada placa de microtitulación contuvo una serie de dilución del nonapéptido [D-Phe^{6},\beta-Ala^{11},Phe^{13}, Nle^{14}]Bn
(6-14).
El dispositivo de FLIPR (Cía. Molecular Devices) se programó de manera que midió la fluorescencia de fondo durante un espacio de tiempo de 30 segundos (= seg), a intervalos de 6 seg. Después de la transferencia de, respectivamente, 50 \mul de cada pocillo de la placa de microtitulación al correspondiente pocillo de ensayo en la placa celular, se evaluó la modificación de la fluorescencia durante un período de tiempo de 100 seg, a intervalos de 1 seg, y a intervalos de 6 seg durante los últimos 48 seg.
Se registraron las variaciones de fluorescencia del compuesto de referencia en función de la concentración y se determinó la concentración de péptidos del nonapéptido, a la que se había observado ya la máxima variación de fluorescencia (a menudo, 16 \muM). El valor de la variación máxima de fluorescencia por pocillo de ensayo se exportó al programa de hojas de cálculo Excel (Cía. Microsoft) y se normalizó con ayuda del valor máximo de la variación de la fluorescencia para el correspondiente compuesto de referencia, que se tomó como valor de 100%. Las curvas para la evolución de las variaciones relativas de fluorescencia en función de la concentración del compuesto de ensayo y del correspondiente valor de CE_{50}, se calcularon con ayuda del programa Graphpad Prism (Versión 3,00, Cía. Graphpad Software).
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En el ensayo farmacológico FLIPR anteriormente descrito, todos los compuestos de ejemplo indicados a continuación mostraron valores de CE_{50} (en nM) que fueron menores que o iguales a 2.600. Los compuestos de los Ejemplos 13 a 4 mostraron valores de CE_{50} que fueron menores que o iguales a 710. En la Tabla 1 siguiente, figuran los valores de CE_{50} calculados en el experimento FLIPR anteriormente descrito para compuestos de la fórmula I aislados. Los números de ejemplo mencionados en la Tabla 1 se refieren a los Ejemplos de realización que aparecen más adelante.
TABLA 1 Actividad agonista de las sustancias de ensayo sobre BRS-3
26
Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar en preparaciones farmacéuticas habituales. Las dosis utilizadas pueden ser individualmente diferentes y varían, naturalmente, dependiendo del tipo del trastorno a tratar y de la sustancia utilizada. En general, sin embargo, para la aplicación a seres humanos y mamíferos superiores, resultan adecuados medicamentos con un contenido en principio activo de 0,1 hasta 300 mg por dosis individual.
De acuerdo con la invención, los compuestos de la fórmula I pueden estar contenidos en preparaciones farmacéuticas sólidas o líquidas junto con coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticos habituales. Como ejemplo de preparados sólidos, se pueden mencionar preparados de administración oral tales como comprimidos, grageas, cápsulas, polvos o granulados, o también supositorios. Estos preparados pueden contener vehículos farmacéuticos inorgánicos y/u orgánicos habituales tales como, por ejemplo, talco, lactosa o almidón, además de coadyuvantes farmacéuticamente habituales, por ejemplo, agentes lubricantes o dispersantes para comprimidos. Preparados líquidos tales como suspensiones o emulsiones de los principios activos pueden contener diluyentes habituales tales como agua, aceites y/o agentes de suspensión tales como polietilenglicoles y similares. Se pueden agregar, adicionalmente, otros coadyuvantes tales como, por ejemplo, conservantes, correctores del sabor y similares.
Los principios activos se pueden mezclar y formular con los coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticos de manera en sí conocida. Para la preparación de formas medicamentosas sólidas, se pueden mezclar, por ejemplo, los principios activos con los coadyuvantes y/o vehículos de modo habitual, y proceder a su granulación en húmedo o en seco. El granulado o polvo se puede envasar directamente en cápsulas, o comprimir de manera habitual para formar núcleos de comprimidos. Éstos se pueden grageificar, en caso deseado, de manera conocida.
Los siguientes Ejemplos deben explicar de forma más detallada la invención, sin limitar su alcance.
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Ejemplo 1
N1-[(1R)-2-(1H-3-indolil)-1-(fenetil-carbamoil)-etil]-(2S)-2-{[(1R)-1-amino-2-fenetil]-carboxamido}-pentandia- mida; (H-D-Phe-Gln-D-Trp-fenil-etilamida)
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A)
Se dejaron hinchar 100 mg de resina FMPE (capacidad máxima 0,54 mmol/g) en 1 ml de dicloroetano durante 10 min. Se agregaron a este recipiente 0,5 ml de ortoformiato trimetílico (= TMOF), 68 \mul de 2-fenil-etilamina y 114 mg de NaBH(Oac)_{3}, la mezcla formada se trató durante 10 min con ultrasonidos y, a continuación, se agitó durante una noche a RT. Seguidamente, se lavó la resina consecutivamente tres veces durante tres min con sendos 3 ml de diclorometano y tres veces durante tres min con sendos 3 ml de NMP. Se agregó, entonces, a la resina lavada una solución de 56 mg de Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, 41 mg de HATU, 14,6 mg de HOAt y 143 \mul de colidina sim. en 1 ml de NMP. La resina se agitó en esta solución durante 5 h a RT, se lavó tres veces durante tres min con sendos 3 ml de NMP y la resina se trató nuevamente durante una noche con una solución de 56 mg de Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, 41 mg de HATU, 14,6 mg de HOAt y 143 \mul de colidina sim. en 1 ml de NMP. A continuación, se lavó la resina tres veces durante tres min con sendos 1 ml de diclorometano y se secó al vacío en una bomba de difusión de aceite. Se obtuvieron 129 mg de una resina FMPE cargada con Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida [carga de 0,366 mmol/g; correspondiente a 30 mg (0,047 mmol) de Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida libre] que se utilizó directamente, sin separar el producto intermedio, en la reacción que se indica a continuación.
B)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, anteriormente obtenida, [cargada con 0,366 mmol/g de Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamina, correspondientes a 30 mg (0,047 mmol) del compuesto libre], se dejó hinchar durante 10 min en 5 ml de NMP. Se trató, entonces, la resina FMPE durante 15 min con 5 ml de una solución recién preparada, al 20% (en volumen) de piperidina en NMP, se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP y, por último, la resina FMPE se trató nuevamente durante 15 min con 5 ml de una solución recién preparada, al 20% (en volumen) de piperidina en NMP. Finalmente, la resina se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. La resina FMPE obtenida, cargada con D-Trp(Boc)-fenil-etilamida se utilizó directamente, sin aislar el producto intermedio, en la reacción que se describe a continuación.
C)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,366 mmol/g de D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 19,2 mg (0,047 mmol) del compuesto libre], se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. A continuación, se agregó a la resina FMPE cargada una solución de 57,4 mg de Fmoc-Gln(Trt)-OH, 12,7 mg de HOBTxH_{2}O y 30 mg de TBTU en 2 ml de NMP. Por último, se agregaron a la muestra formada 46 \mul de DIPEA y se agitó durante 45 min. Después de lavar la resina FMPE cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP, se repitió la fase de acoplamiento anteriormente descrita. Para finalizar, se lavó nuevamente cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Fmoc-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislar el producto intermedio, en la reacción que se menciona a continuación.
D)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, anteriormente obtenida, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,366 mmol/g de Fmoc-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 47 mg (0,047 mmol) del compuesto libre], se trató de la forma descrita anteriormente en el apartado B) para separar el grupo protector Fmoc. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislar el producto intermedio, en la reacción que se describe a continuación.
E)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,366 mmol/g de Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 36,6 mg (0,047 mmol) del compuesto libre], se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. A continuación, se agregó a la resina FMPE cargada una solución de 36,4 mg de Fmoc-Phe-OH, 12,7 mg de HOBTxH_{2}O y 30 mg de TBTU en 2 ml de NMP. Finalmente, se agregaron a la muestra formada 46 \mul de DIPEA y se agitó durante 45 min. Después de lavar la resina FMPE durante tres min con sendos 5 ml de NMP, se repitió el etapa de acoplamiento anteriormente descrita. Para finalizar, se lavó nuevamente cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Fmoc-Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislar el producto intermedio, en la reacción que se describe a continuación.
F)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,366 mmol/g de Fmoc-Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 54 mg (0,047 mmol) del compuesto libre], se trató de la forma anteriormente descrita en el apartado B) para la separación del grupo protector Fmoc. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislar el producto intermedio, en la reacción que se describe a continuación.
G)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,366 mmol/g de Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 43,5 mg (0,047 mmol) del compuesto libre], se lavó tres veces durante diez min con sendos 3 ml de diclorometano. Seguidamente, la resina FMPE cargada se trató tres veces durante 30 min con sendos 2 ml de una mezcla de ácido trifluoroacético (= TFA)/triisopropil-silano (= TIPS)/H_{2}O (18:1:1, en volumen) y se separó por filtración de la resina FMPE. A continuación, se lavó nuevamente tres veces durante tres min con sendos 3 ml de diclorometano, y se separó por filtración de la resina FMPE. Los filtrados combinados se concentraron al vacío con una bomba de chorro de agua con el recipiente enfriado por nitrógeno. El residuo remanente se recogió en DMSO y se purificó por HPLC de fase inversa [sistema de HPLC de Amersham Pharmacia Biotech Äkta Basic 100F; sistema de bomba P-900 y detector UV-900; columna ODS-A C_{18} de Omnicrom YMC (250 mm \times 20 mm, 10 \mum, caudal: 8 ml/min); Elución de gradiente lineal (30 Min.) de agua (solvente A) en acetonitrilo (solvente B) y TFA al 0,1% (en volumen)]. La liofilización de las fracciones porificadas proporcionó 19,2 mg del compuesto del título en forma de polvo incoloro.
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 276,1 (32), 308,1 (90), 583,3 (72) [M+H]^{+}, 605,4 (100) [M+Na]^{+}, 893,6 (13), 1165,2 (10) [2M+H]^{+}, 1187,2 (40) [2M+Na]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
N1-fenetil-(2R)-2-[(1S)-1-(bencilcarboxamido)-etil]-carboxamido-3-(1H-3-indolil)-propanamida
28
A)
Se hicieron reaccionar 100 mg de una resina FMPE cargada con Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida [preparación, véase el Ejemplo 1A); carga, 0,345 mmol/g; correspondientes a 22,3 mg (0,035 mmol) de Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida libre], de la forma descrita en el Ejemplo 1B. La Trp(Boc)-fenil-etilamida formada, unida a la resina, se utilizó directamente, sin aislamiento ni purificación, en la reacción descrita a continuación.
B)
La cantidad total de la resina FMPE cargada con D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 14,4 mg (0,035 mmol) del compuesto libre], se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. A continuación, se agregó a la resina cargada una solución de 22 mg de Fmoc-Ala-OH, 9,5 mg de HOBTxH_{2}O y 22,5 mg de TBTU en 2 ml de NMP. Por último, se agregaron también 34 \mul de DIPEA y la mezcla formada se agitó durante 45 min. Después de lavar la resina FMPE cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP, se repitió la etapa de acoplamiento anteriormente descrita. Para finalizar, se lavó nuevamente cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Fmoc-Ala-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislamiento, en la reacción que se describe a continuación.
C)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de Fmoc-Ala-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 24,5 mg (0,035 mmol) del compuesto libre], se trató de la forma anteriormente descrita, en el Ejemplo 1B), para separar el grupo protector Fmoc. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Ala-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislamiento, en la reacción descrita a continuación.
D)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de Ala-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 16,7 mg (0,035 mmol) del compuesto libre], se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Seguidamente, se agregó a la resina cargada una solución de 9,6 mg de ácido fenilacético, 9,5 mg de HOBTxH_{2}O y 22,5 mg de TBTU en 2 ml de NMP. Por último, se agregaron todavía 34 \mul de DIPEA y la mezcla formada se agitó durante 45 min. Después de lavar la resina FMPE cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP, se repitió la etapa de acoplamiento anteriormente descrita. Para finalizar, se lavó nuevamente cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Se obtuvo una resina FMPE cargada con fenilacetato-Ala-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin aislamiento, en la reacción que se describe a continuación.
E)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente, [con una reacción aceptada de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de fenilacetato-Ala-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondiente a 20,9 mg (0,035 mmol) del compuesto libre], se trató para la disociación de la resina FMPE y separación del grupo protector Boc de la forma descrita anteriormente en el Ejemplo 1G). La purificación del producto bruto obtenido por HPLC y subsiguiente liofilización proporcionó 12,6 mg (0,025 mmol) del compuesto del título, en forma de polvo incoloro, con un punto de fusión de 205-207ºC.
\quad
RMN-H^{1} (500 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 10,78 (s, 1H, NH-CH-C), 8,24 (d, J_{HH} = 6,8 Hz, 1H, NH-CH-CH_{3}), 8,18 (d, J = 8,4 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 8,00 (t, J = 5,5 Hz, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 7,57 (d, J = 7,9 Hz, 1H, arom), 6,95-7,32 (m, 14H, arom), 4,38-4,43 (m, 1H, NH-CH-CH_{2}), 4,21-4,25 (m, 1H, NH-CH-CH_{3}), 3,45 (s, 2H, CO-CH_{2}), 3,19-3,24 (m, 2H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,11 (dd, J = 14,7 Hz, J = 4,6 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,84 (dd, J = 14,6 Hz, J = 9,6 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,61 (t, J = 7,6 Hz, 2H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 1,01 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH_{3}).
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 159,1 (40), 291,2 (35), 308,1 (100), 497,2 (80) [M+H]^{+}, 519,4 (55) [M+Na]^{+}, 764,5 (20), 993,1 (10) [2M+H]^{+}, 1015,2 (100) [2M+Na]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
N1-fenetil-(2R)-2-{1-[(4-clorobencil)-amino]-etilcarboxamido}-3-(1H-3-indolil)-propanamida 
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
A)
A una solución de 7,08 g de 4-clorobencilamina y 5,06 g de trietilamina en 38 ml de tolueno se agregó, gota a gota, bajo agitación y con refrigeración con hielo, durante un período de 4 h una solución de 8,35 g de éster etílico de ácido 2-bromopropiónico en 18 ml de tolueno, agitando la mezcla de reacción durante 4 días. Entonces, se extrajo la fase orgánica con 300 ml de agua y se la secó, a continuación, sobre Na_{2}SO_{4}. El disolvente se evaporó al vacío con una bomba de chorro de agua, y el residuo obtenido se purificó por cromatografía instantánea bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm, fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:1). Después de evaporar el disolvente al vacío con una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío con una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 4,25 g de éster etílico de N-(4-clorobencil)-alanina en forma de aceite amarillo.
\quad
RMN-H^{1} (250 MHz, DMSO-d6, 300 K) \delta = 7,31-7,38 (m, 4H, arom), 4,09 (q, J = 7,1 Hz, 2H, CH_{2}-CH_{3}), 3,65 (q, J = 13,9 Hz, NH-CH_{2}-C_{6}H_{4}Cl), 3,20-3,24 (m, 1H, NH-CH), 2,51 (bs, 1H, NH), 1,17-1.22 (m, 6H, CH_{2}-CH_{3} y CH-CH_{3}).
B)
Se mezcló 1,0 g de éster etílico de N-(4-clorobencil)-alanina anteriormente obtenido con 6,2 ml de NaOH 1N y 12 ml de metanol, y se agitó durante 30 min. Se neutralizó con HCl 1N y el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua. El residuo obtenido se recogió en una mezcla de 15 ml de solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y 4 ml de dioxano. A esta mezcla se agregó, gota a gota, durante un período de 15 min y bajo enfriamiento de hielo, una solución de 1,1 g de FmocCl en 8 ml de dioxano. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min bajo enfriamiento con hielo y, a continuación, se agitó durante una noche a RT. Entonces, se combinó la mezcla de reacción con 20 ml de agua, se separó la fase acuosa y se la extrajo con 100 ml de éster dietílico. La fase acuosa se ajustó a pH 1 mediante la adición de ácido clorhídrico concentrado y, seguidamente, se extrajo nuevamente tres veces con sendos 100 ml de éster etílico de ácido acético. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua. El residuo obtenido se purificó por cromatografía de columna (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano/ácido acético 1:1:1). Después de evaporar el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 1,3 g de ácido 2-{4-clorobencil-[(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-amino}-propanoico en forma de aceite incoloro (2,98 mmol). No se determinó la relación de los isómeros cis/trans.
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 179,1 (95), 436,0 (75) [M+H]^{+}, 458,2 (40) [M+Na]^{+}, 893,0 (50) [2M+Na]^{+}, 909,2 (100) [2M+K]^{+}.
C)
Se disolvieron 0,26 g de fenil-etilamina, 1,13 g de Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, 0,43 g de HOBT y 1,03 g de TBTU en 15 ml de DMF. A esta mezcla se agregaron, gota a gota, durante un período de 5 min, 1,19 g de DIPEA. A continuación, se agitó la mezcla de reacción durante 1 h, se evaporó el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua, y se purificó el residuo remanente mediante cromatografía instantánea bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:1). Después de evaporar el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 1,13 g de N1-fenetil-(2R)-2-(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carboxamido-3-[1-(terc-butoxicarbonil)-3-indolil]-propanamida (= Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida), en forma de sólido ceroso incoloro, con un punto de fusión de 140ºC.
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 308,2 (20), 530,3 (40), 630,3 (40) [M+H]^{+}, 652,4 (10) [M+Na]^{+}, 1259,5 (100) [2M+H]^{+}, 1281,5 (30) [2M+Na]^{+}.
D)
Se disolvió 1,0 g de la Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida en 6 ml de una solución al 20% (en volumen) de piperidina en DMF. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min y, seguidamente, se evaporó el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua con un depósito refrigerado por nitrógeno. El residuo remanente se separó por cromatografía instantánea del complejo Fmoc-piperidina formado, bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 2:1) y, a continuación, se eluyó (fase móvil: cloroformo/metanol 15:1). La evaporación del disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y el secado del residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, proporcionaron 0,63 g de carboxilato de terc-butil-3-[(2R)-2-amino-2-(fenetil-carbamoil)-etil]-1H-1-indol (= D-Trp(Boc)-fenil-etilamida) en forma de aceite amarillo.
\quad
MS (ESI) m/z 159,1 (20), 291,2 (75), 308,1 (95), 352,1 (70), 408,1 (100) [M+H]^{+}, 430,1 (35) [M+Na]^{+}, 815,2 (15) [2M+H]^{+}, 837,1 (20) [2M+Na]^{+}.
E)
0,32 g de ácido 2-[4-clorobencil-[(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-amino]-propanoico (0,763 mmol, preparación, véase anteriormente bajo B), 0,30 g de carboxilato de terc-butil-3-[(2R)-2-amino-2-(fenetil-carbamoil)-etil]-1H-1-indol, preparación, véase anteriormente bajo D), 0,42 g de HATU y 0,15 g de HOAt se disolvieron en 7 ml de DMF. A continuación, se agregaron gota a gota, durante un período de 10 min, 1,33 g de colidina-sim. Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h y el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua bajo refrigeración de nitrógeno. El residuo remanente se purificó por cromatografía instantánea, bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:1). La evaporación del disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y el secado del residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, proporcionaron 0,54 g de N1-fenetil-(2R)-2-{1-[N-(4-clorobencil)-N-(9H-fluoren-9-il-metoxi-carbonil)-amino]-etilcarboxamido}-3-[1-(terc-butoxi-carbonil)-3-indolil]-propanamida en forma de espuma incolora.
\quad
MS (ESI) m/z 179,2 (10), 769,4 (10), 825,4 (100) [m+H]^{+}, 1651,6 (55) [2m+H]^{+}.
F)
Se disolvió la cantidad total (0,54 g) de la N1-fenetil-(2R)-2-{1-[N-(4-clorobencil)-N-(9H-fluoren-9-il-metoxi-carbonil)-amino]-etilcarboxamido}-3-[1-(terc-butoxicarbonil)-3-indolil]-propanamida (0,654), anteriormente obtenida, en 2,5 ml de diclorometano. A esta mezcla se agregaron 0,25 ml de triisopropil-silano y la mezcla se enfrió a 0ºC. A continuación, se agregaron a la mezcla, gota a gota durante un período de 5 min, 2,5 ml de TFA y se agitó durante 1 h a 0ºC. El disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua, bajo refrigeración de nitrógeno. El residuo remanente se recogió en una mezcla de 20 ml de DMSO, 2,5 ml de agua y 2,5 ml de ácido acético, agitando durante una noche a RT. Entonces, se evaporó el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y la N1-fenetil-(2R)-2-{1-[N-(4-clorobencil)-N-(9H-fluoren-9-il-metoxi-carbonil)-amino]-etilcarboxamido}-3-[1H-3-indolil]-propanamida, remanente como residuo, se utilizó directamente, sin ulterior purificación o caracterización, para la reacción descrita a continuación.
G)
La cantidad total de la propanamida protegida por Fmoc obtenida anteriormente (0,654 mmol con una reacción de 100%) se disolvió en 10 ml de una solución al 20% (en volumen) de piperidina en DMF, y se agitó durante 30 min. El disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua bajo refrigeración de nitrógeno, y el residuo remanente se purificó por cromatografía instantánea bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético). Después de liofilizar las fracciones purificadas, se obtuvieron 320 mg del compuesto del título (0,637 mmol) en forma de polvo incoloro, con un punto de fusión de 107-110ºC. La relación de ambos isómeros entre sí ascendió a 1:1,24.
\newpage
\quad
RMN-H^{1} (500 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 10,85 y 10,83 (s, 1H, NH-CH-C), 9,2 (m, 1H, NH-CH-CH_{3}), 8,72 y 8,77 (d, J = 8,5 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 8,28 y 8,34 (t, J = 5,5 Hz, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 7,68 y 7,63 (d, J = 7,7 Hz, 1H, arom), 6,98-7,48 (m, 13H, arom), 4,61-4,69 (m, 1H, NH-CH), 3,98-4,02 (m, 1H, NH-CH_{2}-C_{6}H_{4}Cl), 3,75 (m, 1H, NH-CH-CH_{3}), 3,60-3,67 y 3,39-3,43 (m, 1H, NH-CH_{2}-C_{6}H_{4}Cl), 3,34-3,38 (m, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,24-3,29 (m, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,05-3,08 (m, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,85-2,92 (m, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,67-2,71 (m, 2H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 1,33 y 1,10 (d, J = 6,9 Hz, 3H, CH_{3}).
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 291,2 (30), 308,1 (100), 503,2 (35) [M+H]^{+}, 525,4 (15) [M+Na]^{+}, 1027,1 (20) [2M+ Na]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
N1-fenetil-(2R)-2-{N'-[2-(3-piridil)-etanoil]-hidrazino}-carboxamido-3-(1H-3-indolil)-propanamida (181) 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
30 
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\vskip1.000000\baselineskip
A)
En 200 ml de diclorometano anhidro y 12,95 ml de DIPEA (75,6 mmol) se disolvieron 10,0 g de Boc-hidrazina y, a continuación, se enfrió la mezcla a 0ºC. A esta mezcla se agregó gota a gota, durante un período de 30 min, una solución de 19.6 g de FmocCl en 100 ml de diclorometano anhidro. Entonces, se agitó la mezcla de reacción durante una noche a RT. Seguidamente, se extrajo la fase orgánica con 200 ml de agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró al vacío, en una bomba de chorro de agua, a un volumen de 100 ml. Bajo enfriamiento con hielo, se agregaron 100 ml de ácido trifluoroacético y se agitó durante 1,5 h. Se agregaron 300 ml de una solución acuosa saturada de Na_{2}CO_{3}, se filtró y secó la fase orgánica separada sobre Na_{2}SO_{4}. La evaporación del disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y el secado del residuo obtenido al vacío en una bomba de difusión de aceite, proporcionaron 18,02 g de N-[(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-hidrazina (70,8 mmol) en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 150-153ºC.
\quad
RMN-H^{1} (250 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 10,10 (bs, 1H, NH), 9,60 (bs, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,6 Hz, 2H, arom), 7,70 (d, J = 7,3 Hz, 2H, arom), 7,30-7,45 (m, 4H, arom), 4,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H, CO-CH_{2}), 4,27 (t, J = 6,7 Hz, 1H, CO-CH_{2}-CH).
B)
Una suspensión de 1,49 g de la N-[(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-hidrazina anteriormente obtenida (5,78 mmol), 60 ml de diclorometano y 60 ml de solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, se agitó fuertemente durante 5 min a 0ºC y, a continuación, se dejó reposar a esta temperatura durante 5 min. Entonces, se alimentaron con una inyección 7,95 ml de una solución de fosgeno 1,89 M en tolueno a la fase orgánica inferior. Tras la adición completa, se siguió agitando fuertemente la mezcla de reacción durante 10 min. Seguidamente, se agregaron a la mezcla de reacción 20 ml de agua y 20 ml de diclorometano y se separaron rápidamente las fases. La fase acuosa se extrajo con 50 ml de diclorometano y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. Después de evaporar al vacío el disolvente en una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 1,35 g de 5-(9H-fluoren-9-il-metoxi)-3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona (4,82 mmol) en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 125ºC.
\quad
RMN-H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}, 300 K) \delta = 8,72 (bs, 1H, NH), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H, arom), 7,59 (d, J = 7,4 Hz, 2H, arom), 7,28-7,45 (m, 4H, arom), 4,49 (d, J = 7,8 Hz, 2H, CH_{2}-CH), 4,32-4,41 (m, 1H, CH_{2}-CH).
C)
100 mg de una resina FMPE cargada con Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida (preparación, véase el Ejemplo 1A); carga 0,354 mmol/g; correspondiente a 22,3 mg (0,035 mmol) de Fmoc-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida) se dejó hinchar durante 10 min en 5 ml de NMP y, a continuación, se trató dos veces durante 15 min con sendos 5 ml de una solución recién preparada al 20% (en volumen) de piperidina en NMP. A continuación, la resina se lavó cinco veces durante sendos tres min con sendos 5 ml de diclorometano. Se dejó, entonces, reposar la resina durante 30 min en 5 ml de diclorometano anhidro. Después de separar por filtración el disolvente, se mezcló la resina FMPE cargada con D-Trp(Boc)-fenil-etilamida con una solución de 30,5 mg de la 5-(9H-fluoren-9-il-metoxi)-3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona preparada anteriormente bajo B), en 1 ml de diclorometano anhidro, y la mezcla se agitó durante 90 min. Por último, la resina se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de diclorometano y, a continuación, nuevamente cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Se obtuvo una resina FMPE cargada con Fmoc-hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó sin ulterior aislamiento del producto intermedio en la reacción que se describe a continuación.
D)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente [considerando una reacción de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de Fmoc-hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondientes a 24 mg (0,035 mmol) del compuesto libre], se trató de la forma descrita anteriormente en el Ejemplo 1B) para separar el grupo protector Fmoc. Se obtuvo una resina FMPE cargada con hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin ulterior separación y aislamiento del producto intermedio, para la reacción que se describe a continuación.
E)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, obtenida anteriormente ]considerando una reacción de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondientes a 16,5 mg (0,035 mmol) del compuesto libre], se lavó cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. A continuación, se agregó a la resina FMPE cargada una solución de 12 mg de ácido 3-piridil-acético (0,07 mmol), 9,5 mg de HOBTxH_{2}O (0,07 mmol) y 22,5 mg de TBTU (0,07 mmol) en 2 ml de NMP. Finalmente, se alimentaron a la mezcla formada 34 \mul de DIPEA (0,2 mmol) y se agitó durante 45 min. Después de haber lavado la resina FMPE cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP, se repitió la etapa de acoplamiento anteriormente descrita. Por último, se volvió a lavar cinco veces durante tres min con sendos 5 ml de NMP. Se obtuvo una resina FMPE cargada con 3-piridil-acetato-hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, que se utilizó directamente, sin ulterior aislamiento del producto intermedio, en la reacción que se describe a continuación.
F)
La cantidad total de la resina FMPE cargada, anteriormente obtenida [considerando una reacción de 100%, cargada con 0,354 mmol/g de 3-piridil-acetato-hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida, correspondientes a 20,5 mg (0,035 mmol) del compuesto libre] se trató de la forma descrita en el Ejemplo 1G) para la escisión de la resina FMPE y separación del grupo protector Boc. Después de la purificación por HPLC y liofilización, se obtuvieron 4,5 mg (0,0093 mmol) del compuesto del título en forma de polvo incoloro, con un punto de fusión de 116-120ºC.
\quad
RMN-H^{1} (500 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 10,79 (s, 1H, NH), 9,89 (s, 1H, NH), 8,63 (s, 1H, arom), 8,61 (d, J = 5,0 Hz, 1H, arom), 8,02-8,04 (m, 2H, NH y arom), 7,96 (bs, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 7,63 (t, J = 5,5 Hz, 1H, arom), 7,51 (d, J = 7,9 Hz, 1H, arom), 7,30 (d, J = 8,2 Hz, 1H, arom), 7,25 (t, J = 7,6 Hz, 2H, arom), 6,99-7,18 (m, 5H, arom), 6,95 (t, J = 8,0 Hz, 1H, arom), 6,44 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NH-CH), 4,32-4,36 (m, 1H, NH-CH), 3,59 (s, 2H, CO-CH_{2}-C_{5}H_{4}N), 3,22-3,26 (m, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,15-3,19 (m, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,01 (dd, J = 14,4 Hz, J = 5,6 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,91 (dd, J = 14,6 Hz, J = 7,4 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,58 (t, J = 7,5 Hz, 2H, NH-CH_{2}-CH_{2}).
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 152,1 (40), 185,2 (30), 334,3 (30), 485,3 (100) [M+H]^{+}, 507,3 (70) [M+Na]^{+}, 523,3 (10) [M+Na]^{+}, 969,3 (20) [2M+H]^{+}, 991,4 (50) [2M+Na]^{+}, 1007,5 (20) [2M+K]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
N1-fenetil-(2R)-2-[N'-(4-clorobencil)-hidrazino]-carboxamido-3-(1H-3-indolil)-propanamida (185) 
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
A)
A una solución de 1,98 g de carbazato de terc-butilo (Boc-hidrazina) en 15 ml de THF se agregaron gota a gota, bajo agitación constante a temperatura ambiente y durante un período de 10 min, 2,12 g de 4-clorobenzaldehído en 5 ml de THF. Después de 3 h, se evaporó al vacío el disolvente en una bomba de chorro de agua y el residuo obtenido se purificó por cromatografía instantánea, bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:5). Después de evaporar el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 3,64 g de éster terc-butílico de ácido N'-(4-clorofenil-metilen)-hidrazin-carboxílico en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 170-171ºC.
\quad
MS (EI) m/z 41,2 (20), 57,2 (100), 154,0 (10), 181,0 (5), 197,9 (20), 253,9 (5) [M]^{+}.
B)
A una suspensión de 1,5 g del éster terc-butílico del ácido N'-(4-clorofenil-metil)-hidrazin-carboxílico anteriormente obtenido en 25 ml de THF anhidro, se agregaron bajo enfriamiento con hielo y una atmósfera protectora de argón 0,55 g de NaCNBH_{3}. A esta mezcla se agregaron, gota a gota, durante un período de 10 min, 10 ml de ácido acético. La solución transparente formada se agitó a RT durante una noche. Entonces, se agregaron 60 ml de agua y 60 ml de éster etílico de ácido acético y se ajustó el valor de pH de la fase acuosa con NaHCO_{3} a 8. Se separó la fase orgánica y se lavó consecutivamente con 50 ml de solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y con 50 ml de solución acuosa saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua. El residuo incoloro remanente se mezcló consecutivamente con 40 ml de metanol y con 20 ml de NaOH 1N, la mezcla formada se agitó, entonces, durante 1 h a RT y, se calentó bajo refrigeración de reflujo hasta ebullición. Se extrajo la mezcla enfriada a RT tres veces con éter dietílico, las fases etéricas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua. El aceite amarillo remanente se purificó por cromatografía instantánea, bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:4). La evaporación del disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y el secado del residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, proporcionaron 1,05 g de N-(terc-butoxi-carbonil)-N'-(4-clorobencil)-hidrazina en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 77-82ºC.
\quad
RMN-H^{1} (250 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 8,23 (bs, 1H, NH-CO), 7,35 (m, 4H, arom), 4,84 (bs, 1H, NH-CH_{2}), 3,85 (s, 2H, NH-CH_{2}), 1,37 (s, 9H, CH_{3}).
C)
0,8 g de la N-(terc-butoxicarbonil)-N'-(4-clorobencil)-hidrazina anteriormente obtenida se suspendieron, bajo enfriamiento con hielo, en una mezcla de 4 ml de dioxano y 16 ml de una solución acuosa al 10% de NaHCO_{3}. Se agregó entonces, durante un período de 10 min, una solución de 0,89 g de FmocCl en 10 ml de dioxano y se agitó la mezcla de reacción durante una noche a RT. Se agregaron 50 ml de agua y se extrajo la fase acuosa tres veces con sendos 100 ml de éter dietílico. Las fases orgánicas separadas se combinaron, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y, por último, se evaporó el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua. El residuo se purificó por cromatografía instantánea bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:2). La evaporación del disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y el secado del residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite proporcionaron 1,37 g de N-(4-clorobencil)-N-[(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-N'-(terc-butoxi-carbonil)-hidrazina en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 53-55ºC.
\quad
RMN-H^{1} (250 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 9,62 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,3 Hz, 2H, arom), 7,74 (d, J = 6,7 Hz, 1H, arom), 7,56 (m, 1H, arom), 7,27-7,43 (m, 7H, arom), 6,99 (m, 1H, arom), 4,2-5,52 (m, 5H, N-CH_{2} y CO-CH_{2}-CH), 1,43 (s, 9H, CH_{3}).
D)
A una solución de 0,30 g de la N-(4-clorobencil)-N-](9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-N'-(terc-butoxi-carbonil)-hidrazina obtenida anteriormente en el apartado C), en 2,5 ml de diclorometano, se agregó 0,1 ml de triisopropil-silano y la mezcla se enfrió a 0ºC. A continuación, se agregaron gota a gota, durante un período de 5 min, 2,5 ml de TFA y la solución se agitó durante 30 min. El disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua bajo refrigeración de nitrógeno, y el residuo se volvió a recoger en una solución de 77 mg de DMAP (0,63 mmol) en 10 ml de diclorometano anhidro. Se alimentó, gota a gota, esta mezcla, durante un período de 20 min y bajo agitación, a una solución de 0,25 g de carbonato de dipenta-fluorofenilo (0,63 mml) en 20 ml de diclorometano anhidro. Tras finalizar la adición, se agregó a la mezcla obtenida, bajo agitación, una solución de 0,26 g de carboxilato de terc-butil-3-[(2R)-2-amino-2-(fenetil-carbamoil)-etil]-1H-1-indol (véase la preparación en el Ejemplo 3D)), 77 mg de DMAP (0,63 mmol) y 10 ml de diclorometano anhidro. Se agitó durante 30 min a RT, el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua y el residuo se recogió en 4 ml de diclorometano. A continuación, se agregó 0,1 ml de triisopropil-silano y se enfrió a 0ºC. Se agregaron entonces, gota a gota, durante un período de 5 min, 4 ml de TFA y se agitó durante 30 min. El disolvente se separó al vacío en una bomba de difusión de aceite y el residuo seco se mezcló durante 30 min a RT con 10 ml de una solución al 20% (en volumen) de piperidina en DMF. El disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua con refrigeración de nitrógeno, el residuo remanente se recogió en DMSO y se le purificó por HPLC de fase inversa [(Sistema de HPLC Amersham Pharmacia Biotech Äkta Basic 100F; sistema de bomba P-900 y detector de UV-900; columna ODS-A C_{18} de Omnicrom YMC (250 mm x 20 mm, 10 \mum, caudal: 8 ml/min); elución con gradientes lineales (30 min) de agua (solvente A) en acetonitrilo (solvente B) y TFA al 0,1% (en volumen). La liofilización de las fracciones purificadas proporcionó 26,8 mg del compuesto del título en forma de polvo incoloro, con un punto de fusión de 75-80ºC.
\quad
RMN-H^{1} (500 MHz, ACN-d_{3}, 300 K) \delta = 9,74 (bs, 1H, NH), 7,91 (d, J = 7,7 Hz, 1H, arom), 7,98 (d, J = 8,1 Hz, 1H, arom), 7,58-7,83 (m, 12H, arom), 6,99 (bs, 1H, NH-CH), 6,89 (bs, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 4,87 (q, J = 6,9 Hz, NH-CH), 4,34 (bs, 2H, NH-CH_{2}-C_{6}H_{4}Cl), 3,87-3,94 (m, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,76-3,82 (m, 1H, NH-CH_{2}-CH_{2}), 3,66 (d, J = 6,2 Hz, 2H, NH-CH-CH_{2}), 3,17 (t, J = 7,3 Hz, 2H, NH-CH_{2}-CH_{2}).
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 490,1 (70) [M+H]^{+}, 512,3 (50) [m+Na]^{+}, 754,8 (100), 978,9 (25) [2M+H]^{+}, 1001,0 (90) [2M+Na]^{+}, 1063,1 (20).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
N1-fenetil-(2R)-2-[N'-(furan-2-il-metilen)-hidrazino]-carboxamido-3-(1H-3-indolil)-propanamida (189)
32
A)
500 mg de carboxilato de terc-butil-3-[(2R)-2-amino-2-(fenetil-carbamoil)-etil]-1H-1-indol (preparación, véase el Ejemplo 3D)) y 515 mg de 5-(9H-fluoren-9-il-metoxi)-3H-[1,3,4]-oxadiazol-2-ona (preparación, véase el Ejemplo 4B)) se disolvieron en 20 ml de DMF anhidro y se agitó durante 75 min a RT. A continuación, el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua con refrigeración de nitrógeno, y el residuo se purificó por cromatografía de columna (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: cloroformo/metanol, 20:1). El disolvente se volvió a evaporar al vacío en una bomba de chorro de agua y el residuo se secó al vacío en una bomba de difusión de aceite. Se obtuvieron 0,58 g de N1-fenetil-2(2R)-2-{[N'-(9H-fluoren-9-il-metoxi)-carbonil]-hidrazino}-carboxamido-3-[1-terc-butoxi-carbonil)-3-indolil]-propanamida (= Fmoc-hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida), en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 135-137ºC.
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 179,2 (10), 334,3 (10), 378,2 (10), 588,4 (10), 632,3 (25), 654,4 (35), 688,3 (80) [M+H]^{+}, 710,4 (100) [M+Na]^{+}, 1375,5 (40) [2M+H]^{+}, 1397,5 (25) [2M+Na]^{+}.
B)
179 mg de la Fmoc-hidrazin-carbonil-D-Trp(Boc)-fenil-etilamida obtenida anteriormente se disolvieron en 2 ml de una solución al 20% (en volumen) de piperidina en DMF, y se agitó durante 30 min a RT. A continuación, se evaporó al vacío el disolvente en una bomba de chorro de agua con refrigeración de nitrógeno, y el residuo se recogió en 10 ml de THF. Se agregaron a esta mezcla 25 mg de furan-2-carbaldehído y se agitó durante 24 h a RT. Seguidamente, se agregaron otros 50 mg adicionales de furan-2-carbaldehído y se agitó durante otras 24 h. El disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua y el residuo se purificó por cromatografía instantánea bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: éster etílico de ácido acético/hexano 1:1). Después de evaporar el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 100 mg de N1-fenetil-(2R)-2-[N'-(furan-2-il-metilen)-hidrazino]-carboxamido-3-[1-(terc-butoxi-carbonil)-3-indolil]-propanamida en forma de sólido cristalino incoloro.
\quad
MS (ESI) m/z 510,3 (15), 544,3 (55) [M+H]^{+}, 566,3 (50) [M+Na]^{+}, 835,2 (25) [(3M+K+H)/2]^{2+}, 1087,4 (45) [2M+H]^{+}, 1109,5 (100) [2M+Na]^{+}, 1630,3 (5) [3M+H]^{+}, 1652,2 (20) [3M+Na]^{+}.
C)
100 mg de la N1-fenetil-(2R)-2-[N'-(furan-2-il-metilen)-hidrazino]-carboxamido-3-[1-(terc-butoxi-carbonil)-3-indolil]-propanamida obtenida anteriormente se disolvieron en 3 ml de diclorometano. Se agregó 0,1 ml de triisopropil-silano y se enfrió a 0ºC. A continuación, se agregaron, gota a gota, durante un período de 5 min, 3 ml de TFA y se agitó la mezcla de reacción durante 1 h. Seguidamente, se evaporó el disolvente al vacío en una bomba de chorro de agua, se recogió el residuo remanente en una mezcla de 8 ml de DMSO, 1 ml de agua y 1 ml de ácido acético y se agitó a RT durante una noche. Se evaporó. entonces, el disolvente a sequedad al vacío en una bomba de chorro de agua bajo refrigeración de nitrógeno, y el residuo se recogió en DMSO. La HPLC de fase inversa [(Sistema de HPLC Amersham Pharmacia Biotech Äkta Basic 100F; sistema de bomba P-900 y detector de UV-900; columna ODS-A C_{18} de Omnicrom YMC (250 mm x 20 mm, 10 \mum, caudal: 8 ml/min); elución con gradientes lineales (30 min) de agua (disolvente A) en acetonitrilo (disolvente B) y TFA al 0,1% (en volumen) y la liofilización de las fracciones purificadas proporcionó 46 mg del compuesto del título en forma de polvo incoloro, con un punto de fusión de 100-101ºC.
\quad
RMN-H^{1} (500 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 10,82 (s, 1H, NH-CH-C), 10,41 (s, 1H, N-NH), 8,09 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NH-CH_{2}), 7,75 (s, 1H, arom), 7,73 (s, 1H, arom), 7,55 (d, J = 7,9 Hz, 1H, arom), 7,30 (d, J = 8,1 Hz, 1H, arom), 7,23-7,26 (m, 2H, arom), 7,14-7,17 (m, 3H, arom), 7,07 (s, 1H, arom), 7,03 (t, J = 7,4 Hz, 1H, arom), 6,93 (t, J = 7.5 Hz, 1H, arom), 6,74 (d, J = 3,2 Hz, 1H, arom), 6,58-6,60 (m, 2H, NH-CH-CH_{2} y arom), 4,45 (q, J = 6,8 Hz, 1H, NH-CH), 3,24-3,31 (m, 1H, NH-CH_{2}), 3,17-3,24 (m, 1H, NH-CH_{2}), 3,02-3,10 (m, 2H, NH-CH-CH_{2}), 2,62 (t, J = 7,4 Hz, 2H, NH-CH_{2}-CH_{2}).
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 444,2 (30) [M+H]^{+}, 466,3 (65) [M+Na]^{+}, 685,1 (90), 909,2 (100) [2M+Na]^{+}, 1352,1 (15) [3M+Na]^{+}.
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Ejemplo 7
(No parte de la invención)
N1-fenetil-(2R)-2-[(4-bencil-piperidino)-metil]-carboxamido-3-(1H-3-indolil)-propanamida 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
33 
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\vskip1.000000\baselineskip
A)
A 13 ml de tolueno se agregaron, bajo agitación y enfriamiento de hielo, 3,0 g de 4-bencil-piperidina y 1,73 g de trietilamina. Se agregó a esta mezcla, gota a gota durante un período de 4 h, una solución de 2,86 g de éster etílico de ácido bromo-acético en 6,2 ml de tolueno. A continuación, se agitó la mezcla de reacción durante 4 días a RT. Se extrajo, entonces, la fase orgánica con 100 ml de agua y se la secó, a continuación, sobre Na_{2}SO_{4}. El disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua y el residuo se secó al vacío en una bomba de difusión de aceite. Se obtuvieron 4,2 g de éster etílico de ácido (4-bencil-piperidin-1-il)-acético en forma de aceite incoloro.
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 188,2 (100), 234,2 (45), 262,2 (100) [M+H]^{+}.
B)
1,0 g del éster etílico de ácido (4-bencil-piperidin-1-il)-acético anteriormente obtenido se agregó a una mezcla de 5,755 ml de NaOH acuoso 1N y 11,5 ml de metanol. Se agitó durante la noche a RT, se neutralizó con ácido clorhídrico concentrado y el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua. El residuo se purificó a una presión de 1-1,2 bar por cromatografía instantánea (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: metanol/cloroformo, 1:1). Después de evaporar al vacío el disolvente en una bomba de chorro de agua y secar el residuo al vacío en una bomba de difusión de aceite, se obtuvieron 0,89 g de ácido (4-bencil-piperidin-1-il)-acético en forma de sólido incoloro, con un punto de fusión de 250-252ºC.
\quad
GC-MS (EI) m/z 44,1 (10), 91,1 (15), 188,1 (100), 233,0 (5) [M]^{+}.
C)
Se disolvieron 86 mg del ácido (4-bencil-piperidin-1-il)-acético obtenido en el apartado B), 150 mg de carboxilato de terc-butil-3-[(2R)-2-amino-2-(fenetil-carbamoil)-etil]-1H-1-indol (preparación, véase el Ejemplo 3D)), 75 mg de HOBT y 177 mg de TBTU en 2,6 ml de DMF. A esta mezcla se agregaron, gota a gota durante un período de 5 min, 0,20 g de DIPEA. Se agitó la mezcla de reacción durante 23 h, el disolvente se evaporó al vacío en una bomba de chorro de agua con refrigeración de nitrógeno, y el residuo remanente se purificó por cromatografía instantánea bajo una presión de 1-1,2 bar (fase estacionaria: gel de sílice 60, tamaño de grano 0,040-0,063 mm; fase móvil: cloroformo/metanol, 10:1). Se obtuvieron 180 mg de N1-fenetil-(2R)-2-[(4-bencil-piperidino)-metil]-carboxamido-3-[1-(terc-butoxi-carbonil)-3-indolil]-propanamida en forma de aceite amarillo.
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 188,1 (20), 567,3 (70), 623,3 (100) [M+H]^{+}, 645,2 (25) [M+Na]^{+}, 1245,2 (10) [2M+H]^{+}, 1267,3 (40) [2M+Na]^{+}
D)
Se disolvieron en 3 ml de diclorometano 180 mg de la N1-fenetil-(2R)-2-[(4-bencil-piperidino)-metil]-carboxamido-3-[1-(terc-butoxi-carbonil)-3-indolil]-propanamida anteriormente obtenida. Se agregó 0,1 ml de triisopropil-silano y se enfrió la solución a 0ºC. Se agregaron, entonces, 3 ml de TFA, gota a gota durante un período de 5 min, y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. A continuación, se evaporó el disolvente al vacío con una bomba de chorro de agua bajo refrigeración de nitrógeno. El residuo remanente se recogió en una mezcla de 8 ml de DMSO, 1 ml de agua y 1 ml de ácido acético y se agitó durante una noche. Se evaporó, entonces, hasta sequedad y al vacío el disolvente en una bomba de chorro de agua bajo refrigeración de nitrógeno. El residuo se recogió en DMSO y se le purificó por HPLC de fase inversa [(Sistema de HPLC Amersham Pharmacia Biotech Äkta Basic 100F; sistema de bomba P-900 y detector de UV-900; columna ODS-A C_{18} de Omnicrom YMC (250 mm x 20 mm, 10 \mum, caudal: 25 ml/min); elución con gradientes lineales (30 min) de agua (disolvente A) en acetonitrilo (disolvente B) y TFA al 0,1% (en volumen). La liofilización de las fracciones purificadas proporcionó 109 mg del compuesto del título en forma de polvo incoloro, con un punto de fusión de 73-75ºC.
\quad
RMN-H^{1} (500 MHz, DMSO-d_{6}, 300 K) \delta = 10,84 (s, 1H, NH-CH-C), 8,81 (d, J = 8,3 Hz, 1H, NH-CH), 8,25 (t, J = 5,2 Hz, NH-CH_{2}-CH_{2}), 7,61 (d, J = 7,7 Hz, 1H, arom), 7,07-7,33 (m, 12H, arom), 7,02 (t, J = 7,3 Hz, 1H, arom), 6,96 (t, J = 6,9 Hz, 1H, arom), 4,60 (q, J = 6,9 Hz, 1H, NH-CH), 3,81 (d, J = 15,2 Hz, 1H, N-CH_{2}-CO), 3,67 (d, J = 13,1 Hz, 1H, N-CH_{2}-CO), 3,21-3,34 (m, 3H, NH-CH_{2}-CH_{2} y N-CH_{2}-CH_{2}-CH), 3,06 (dd, J = 14,4 Hz, J = 4,9 Hz, 1H, NH-CH-CH_{2}), 2,97-2,93 (m, 3H, NH-CH-CH_{2} y N-CH_{2}-CH_{2}-CH), 2,59-2,67 (m, 3H, NH-CH_{2}-CH_{2} y N-CH2-CH_{2}-CH), 2,46-2,48 (m, 2H, CH-CH_{2}-C_{6}H_{5}), 1,57-1,70 (m, 3H, N-CH_{2}-CH_{2}-CH y CH), 1,32-1,46 (m, 2H, NCH_{2}-CH_{2}-CH).
\quad
HPLC-MS (ESI) m/z 188,1 (70), 523,3 (100) [M+H]^{+}, 803,7 (20), 1045,1 (20) [2M+H]^{+}, 1067,3 (40) [2M+ Na]^{+}.
De acuerdo con los procedimientos de preparación anteriormente indicados o de manera análoga a estos procedimientos de preparación, se pueden preparar también los compuestos de la fórmula I indicados en la siguiente Tabla 2. La Tabla 2 contiene las siguientes abreviaturas:
bi:
enlace
dm:
dioxolanil-metil
Ind:
Indolilo
Phe:
Fenilo
Py:
Piridilo
rac:
racémico
THI:
tetra-hidro-isoquinolilo
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(Tabla pasa a página siguiente)
34
35
Ejemplo I
Cápsulas que contienen N1-fenetil-(2R)-2-{1-[(4-clorobencil)-amino]-etilcarboxamido}-3-(1H-3-indolil)-propanamida
Se preparan cápsulas con la siguiente composición por cápsula:
N1-fenetil-(2R)-2-{1-[(4-clorobencil)-amino]-etilcarboxamido}-3-(1H-3- 20 mg
indolil)-propanamida
Almidón de maíz 60 mg
Lactosa 300 mg
Acetato etílico c.s.
El principio activo, el almidón de maíz y la lactosa se procesan, con ayuda del acetato etílico, en una mezcla pastosa homogénea. La pasta se tritura y el granulado formado se deposita sobre una chapa adecuada y se seca a 45ºC para separar el disolvente. El granulado seco se hace pasar por una máquina trituradora y se mezcla en una mezcladora con los siguientes coadyuvantes adicionales:
Talco: 5 mg
Estearato de magnesio 5 mg
Almidón de maíz 9 mg
y se envasa en cápsulas con una capacidad de 400 mg (= tamaño de cápsula 0).

Claims (12)

1. Compuestos de la fórmula general I,
36
en los que significan
A^{1}
CH o, con la condición de que A^{2} no represente un enlace y A^{3}, simultáneamente, signifique NH, también nitrógeno;
A^{2}
un enlace, alquileno-C_{1-2} o, con la condición de que A^{1} represente CH y R^{2} signifique hidrógeno, también carbonilo;
A^{3}
metileno, eventualmente sustituido con alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida o, con la condición de que R^{2} signifique hidrógeno o represente, conjuntamente con R^{1} un enlace, también NH;
R^{1}
hidrógeno o, con la condición de que A^{2} represente carbonilo, también amino, y
R^{2}
hidrógeno, o
R^{1} y R^{2} representan, conjuntamente, un enlace, con la condición de que A^{2} signifique un enlace;
R^{3}
hidrógeno o metilo;
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4}, o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo;
Ar^{2}
furilo, benzofuranilo, tienilo, benzotiofenilo, pirrolilo o indolilo;
Ar^{3}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno, o piridilo;
m
0 ó 1, y
n
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
2. Compuestos de la fórmula I según la reivindicación 1, en los que n representa 1 y R^{3} significa hidrógeno.
3. Compuestos de la fórmula I según una de las reivindicaciones anteriores, en los que Ar^{2} representa indolilo o benzotiofenilo.
4. Compuestos según la reivindicación 1 de la fórmula general Ia,
37
en los que significan
R^{101}
hidrógeno o amino;
R^{4}
hidrógeno, alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida;
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4} o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo;
Ar^{201}
benzotiofenilo o indolilo, y
m
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
5. Compuestos según la reivindicación 1 de la fórmula general Ib,
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38 
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en los que significan
R^{4}
hidrógeno, alquilo-C_{1-4} o alquil-C_{1-4}-carbonilamida;
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4} o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo;
Ar^{201}
benzotiofenilo o indolilo, y
m
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
6. Compuestos según la reivindicación 1 de la fórmula general Ic,
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39 
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en los que significan
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4}, o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo;
Ar^{201}
benzotiofenilo o indolilo, y
m
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
\newpage
7. Compuestos según la reivindicación 1 de la fórmula general Id,
\vskip1.000000\baselineskip
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40 
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\vskip1.000000\baselineskip
en los que significan
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4}, o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo;
Ar^{201}
benzotiofenilo o indolilo, y
m
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
8. Compuestos según la reivindicación 1 de la fórmula general Ie,
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41 
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en los que significan
Ar^{1}
fenilo, eventualmente sustituido 1 a 2 veces con halógeno o alquilo-C_{1-4}, o con alquilen-C_{1-2}-dioxi unido a dos átomos de carbono de anillo adyacentes, piridilo, furilo, indolilo o tetrahidro-isoquinolilo;
Ar^{201}
benzotiofenilo o indolilo, y
m
0 ó 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
9. Compuestos de la fórmula I según la reivindicación 1, para ser utilizados como medicamentos.
10. Medicamento que contiene una cantidad farmacológicamente eficaz de un compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1 y, adicionalmente, coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticos habituales.
11. Uso de compuestos de la fórmula I según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la obesidad, diabetes, hiperinsulinemia, enfermedades cardiovasculares, trastornos alimentarios y/o síndrome X.
\newpage
12. Procedimiento para la preparación de compuestos de la fórmula general I,
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
en los que significan
A^{1}, A^{2}, A^{3}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n tienen los significados mencionados en la reivindicación 1,
así como, eventualmente, sus sales por adición de ácido fisiológicamente aceptables.
caracterizado porque
a) para la preparación de un compuesto de la fórmula general Ig
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que A^{3}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores y R^{101} significa hidrógeno o amino, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula general II,
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que m posee el significado anterior, Ar^{110} tiene el significado anteriormente indicado para Ar^{1}, en donde, en todos los casos, los grupos reactivos están protegidos con grupos protectores y R^{111} tiene el significado anteriormente indicado para R^{101}, en donde, en todos los casos, el grupo amino está protegido con un grupo protector, con un compuesto de la fórmula general III,
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que R^{3}, Ar^{3} y n poseen los significados anteriores, Ar^{210} tiene el significado anteriormente indicado para Ar^{2}, en donde, en todos los casos, los grupos reactivos están protegidos con grupos protectores, y A^{310} tiene el significado anteriormente indicado para A^{3}, en el que, en todos los casos, los átomos de nitrógeno reactivo están protegidos con grupos protectores, o
b) para la preparación de un compuesto de la fórmula general Ih
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que A^{1}, A^{2}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores y A^{301} tiene el significado anteriormente indicado para A^{3}, con la excepción de NH, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula general IV
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que A^{1}, A^{2}, Ar^{110} y m poseen los significados anteriores, A^{311} posee el significado anteriormente indicado para A^{301}, en donde, en todos los casos, los átomos de nitrógeno reactivos están protegidos con grupos protectores, R^{110} tiene el significado anteriormente indicado para R^{1}, en donde, en todos los casos, los grupos amino están protegidos con un grupo protector, y R^{201} tiene el significado anterior para R^{2}, con la excepción de hidrógeno, o significa un grupo amino-protector, con un compuesto de la fórmula general V
48
en donde R^{3}, Ar^{210}, Ar^{3} y n poseen los significados anteriores, o
c) para la preparación de un compuesto de la fórmula general Ii,
49
en el que A^{1}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores, y A^{201} posee el significado anteriormente indicado para A^{2}, con la excepción de carbonilo, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula V con un equivalente de síntesis de grupos carbonilo y con un compuesto de la fórmula general VI,
50
en el que A^{1}, A^{201}, Ar^{110} y m poseen los significados anteriores, R^{104} representa hidrógeno o, con la condición de que A^{1} signifique nitrógeno, también puede representar un grupo protector de nitrógeno, y SG representa un grupo protector adecuado en la química de péptidos, o
d) para la preparación de un compuesto de la fórmula general Ij,
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que A^{310}, R^{3}, Ar^{1}, Ar^{2}, Ar^{3}, m y n poseen los significados anteriores, se hace reaccionar un compuesto de la fórmula III con un compuesto de la fórmula general VIII,
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que Ar^{110} y m poseen los significados anteriores,
y, en todos los casos, los grupos protectores se vuelven a separar posteriormente, y el compuesto de la fórmula I obtenido se convierte, en caso deseado, en su sal por adición de ácido, o una sal por adición de ácido se convierte en un compuesto de la fórmula I libre.
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