ES2324741T3 - Procedimiento para la preparacion de 11beta-hidroxi-9beta,10alfa-esteroides empleando celulas de amycolatopsis mediterranei. - Google Patents

Abstract

Uso de un microorganismo bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei para la transformación de un compuesto 9 beta,10alfa-esteroide de Fórmula general (I) ** ver fórmula** en la que R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o R4 es un grupo beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C1-C4), y -O- CO-alquilo(C1-C4), y R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno, en su análogo de 11beta-hidroxilo correspondiente.

Description

Procedimiento para la preparación de 11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-esteroides empleando células de Amycolatopsis mediterranei.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de cepas bacterianas de la especie Amycolatopsis mediterranei para la transformación microbiana de 9\beta,10\alpha-esteroides (retroesteroides) en sus análogos de 11\beta-hidroxilo correspondientes, así como a una cepa específica de esa especie. Además, la presente invención se refiere al proceso de transformación de 9\beta,10\alpha-esteroides (retroesteroides) en sus derivados de 11\beta-hidroxilo correspondientes mediante el uso de cepas bacterianas de la especie Amycolatopsis mediterranei, y al aislamiento posterior de los derivados de 11\beta-hidroxilo del medio de cultivo bacteriano. Los productos 11\beta-hidroxilados resultantes son intermedios útiles para la preparación de compuestos esteroides nuevos con una conformación 9\beta,10\alpha que portan diferentes tipos de sustituyentes en la posición 11\beta.

Antecedentes de la invención Retroesteroides

Los retroesteroides, es decir, los esteroides con una conformación 9\beta,10\alpha, se conocen bien en el estado de la técnica. El compuesto disponible comercialmente didrogesterona ((9\beta,10\alpha)-pregna-4,6-dien-3,20-diona) de la fórmula (I-1) siguiente

1

es una hormona progestacional activa oralmente y se usa en general para corregir las deficiencias de progesterona en el organismo. La síntesis de didrogesterona mediante irradiación y reacción fotoquímica se describe, por ejemplo, en las patentes europeas EP0152138B1 (documento US 4.601.855) y EP0558119B1 (documento US 5.304.291).

Los retroesteroides adicionales conocidos son, por ejemplo, 1,2-metilen-3-ceto-\Delta^{4,6}-bisdeshidro-6-halo-9\beta,10\alpha-esteroides como se describen en el documento US 3.937.700 y 3-ceto-\Delta^{4,6}-bisdeshidro-6-halo-9\beta,10\alpha-esteroides como se describen en los documentos BE 652.597 y US 3.304.314. Además, la patente US 3.555.053 describe un proceso para la preparación de 6-halo- o 6-alquil-9\beta,10\alpha-esteroides. Se describen algunos 6,7-deshidro-9\beta,10\alpha-esteroides en Westerhof & Hartog [1965]. La síntesis de retroesteroides adicionales se describe en Hartog et al. [1972] para algunos derivados de 16-metilen-17\alpha-acetoxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona y en Halkes et al [1972] para 1,2\beta-metilen-17\alpha-acetoxi-9\beta,10\alpha-pregnanos. Además, se describen derivados de 18-alquil-9\beta,10\alpha-pregnano en Van Moorselaar & Halkes [1969]. Sin embargo, todos los compuestos retroesteroides conocidos hasta ahora se desarrollaron para que tuvieran actividad progestacional, es decir, para ser agonistas de los receptores de progesterona.

Los retroesteroides adicionales que muestran actividad hormonal y que portan sustituyentes hidroxilo o hidroxilo esterificado en la posición C11 ya se describieron en el documento GB 1.111.320. Los compuestos o los intermedios descritos especialmente son

11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona (nº de CAS 22413-62-3),

11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (nº de CAS 10007-43-9), y

11\beta-17\alpha-dihidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (nº de CAS 4076-89-5),

así como sus derivados de 11\beta-acetoxi que se obtuvieron a partir de los compuestos de 11\beta-hidroxilo correspondientes mediante modificación química.

Debido a que se considera que los compuestos que son agonistas, agonistas parciales (es decir, activadores parciales y/o activadores específicos de tejido) y/o antagonistas para los receptores de progesterona, y que muestran preferiblemente un perfil agonista/antagonista equilibrado, son de valor significativo para la mejora de la salud femenina, aún permanece la necesidad de desarrollar compuestos nuevos que modulen terapéuticamente el receptor de progesterona de un modo agonista y/o antagonista mejorado, que muestren una selectividad de receptor más elevada por el receptor de progesterona que por otros receptores de hormonas esteroides que los compuestos conocidos actualmente, y que proporcionen una buena selectividad de tejido (p.ej., selectividad por el tejido uterino respecto del tejido mamario). Los compuestos retroesteroides que portan diferentes tipos de sustituyentes en la posición C11\beta podrían cumplir este objetivo. Sin embargo, a pesar de los compuestos descritos en el documento GB 1.111.320, no se han descrito hasta ahora derivados de retroesteroides que porten sustituyentes en la posición C11\beta.

Por lo tanto, un aspecto importante de la presente invención es proporcionar compuestos intermedios claves que son útiles para la preparación de compuestos esteroides nuevos con conformación 9\beta,10\alpha que portan diferentes tipos de sustituyentes en la posición C11\beta, así como un proceso para obtener los intermedios deseados con un elevado rendimiento y en gran cantidad. Estos intermedios clave poseen preferiblemente un grupo hidroxilo en la posición C11\beta del núcleo esteroide y comprenden 11\beta-hidroxi-didrogesterona, 11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-progesterona y sus derivados.

Transformación microbiana - hidroxilación de la posición C11 del núcleo esteroide

La transformación microbiana de los compuestos esteroides, que incluye la hidroxilación de la posición C11 del núcleo esteroide, es un proceso conocido en el estado de la técnica. Típicamente, se usan cepas fúngicas de las especies Aspergillus o Rhizopus para la 11\alpha-hidroxilación de los esteroides con conformación 9\alpha,10\beta (como se describe, p.ej., en la solicitud de patente europea EP0028309 y en la patente de EE.UU. nº 6.046.023). La 11\beta-hidroxilación de esteroides con conformación 9\alpha,10\beta es realizable mediante el uso de hongos tales como los del género Curvularia (patente de EE.UU. nº 4.353.985), o más específicamente Curvularia lunata (patente de EE.UU. nº 4.588.683), o Cochliobolus lunatus [Zakelj-Mavric et al., 1990].

Hidroxilación de retroesteroides

La publicación de van der Sijde et al [1966] trata sobre la C11-hidroxilación de retroesteroides, por ejemplo de 9\beta,10\alpha-progesterona, con la cepa fúngica de Aspergillus ochraceus NRRL405. Sin embargo, la hidroxilación del núcleo de retroesteroide se dio en la posición 11\alpha.

Otra publicación de Saucy et al [1966] describe también la hidroxilación microbiana de retroesteroides en la posición C11 al usar Aspergillus ochraceus para la 11\alpha-hidroxilación y un microorganismo no revelado para la 11\beta-hidroxilación.

La memoria descriptiva de la patente GB 1.111.320 describió la hidroxilación microbiana de algunos retroesteroides específicos en la posición C11. En particular, la descripción reveló un proceso para la fabricación de ciertos 11\beta-hidroxi-retroesteroides que comprende fermentar un retroesteroide sin sustituir en la posición 11 correspondiente con un microorganismo del subgrupo taxonómico Funghi imperfecti, Ascomycetes, Phytomycetes, Basidiomycetes o Actinomycetales. Las cepas específicas de los subgrupos taxonómicos anteriormente mencionados especialmente adecuadas para llevar a cabo el proceso de hidroxilación incluyen Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Helicostylum piriforme, Penicillium canescens, Mucor griseocyanus, Mucor corymbifer, Choanephora circinans, Nocardia lurida (= Amycolatopsis orientalis subsp. lurida), Streptomyces rimosus y Streptomyces fradiae. Los ejemplos proporcionados muestran la hidroxilación de 9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona (didrogesterona), 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (9\beta,10\alpha-progesterona) o 17\alpha-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona, es decir, retroesteroides que corresponden o son muy similares a didrogesterona, mediante el uso de las siguientes cepas: Nocardia lurida, Penicillium canescens, Gliocladium catenulatum, Helicostylum piriforme, Choanephora circinans, Streptomyces fradiae, Mucor griseocyanus y Streptomyces rimosus. Una desventaja importante del proceso de fermentación descrito fue el rendimiento relativamente bajo del producto de fermentación deseado, que es típicamente de entre el 2 al 10%, en un ejemplo hasta el 30% del educto correspondiente.

Amycolatopsis mediterranei

La especie bacteriana Amycolatopsis mediterranei se conocía antiguamente con los nombres Streptomyces mediterranei y Nocardia mediterranei [Margalith y Beretta, 1960, y Lechevalier et al. 1986]. Amycolatopsis mediterranei pertenece a la clase de Actinobacteria, en particular al subgrupo taxonómico Actinomycetales, y al género Amycolatopsis. Se conocen varias cepas de esta especie y están disponibles en colecciones de cultivos públicas como la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", la DSMZ (dirección: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) tales como DSM 43304 (también depositada en otras colecciones de cultivos como ATCC 13685, CBS 121.63, CBS 716.72, DSM 40501, IFO 13415, IMET 7651, ISP 5501, JCM 4789, KCC S-0789, LBG A 3136, NBRC 13142, NBRC 13415, NCIB 9613, NRRL B-3240, RIA 1376 o VKM Ac-798), DSM 40773 y DSM 46096 (también depositadas en otras colecciones de cultivos como ATCC 21411, IMET 7669).

Las cepas de Amycolatopsis mediterranei se conocen bien para la producción microbiológica del compuesto antibiótico activo rifamicina B; sin embargo, esta especie no se ha descrito hasta ahora para la hidroxilación de compuestos esteroides, y en particular para la C11\beta-hidroxilación de retroesteroides.

Proceso para la purificación de esteroides a partir de cultivos microbianos

El producto de un proceso de fermentación se aísla típicamente del medio de cultivo mediante un proceso en múltiples etapas de filtración (eliminación del micelio), extracción, opcionalmente purificación cromatográfica, cristalización y recristalización posterior para obtener un compuesto puro. Por ejemplo, los productos de hidroxilación microbiana descritos en la memoria descriptiva de la patente GB 1.111.320 se obtienen de la carga de fermentación mediante un procedimiento bastante elaborado, que incluye varias etapas de extracción líquido-líquido y la posterior cromatografía en columna o recristalización para la purificación adicional, por lo que se usan disolventes orgánicos tóxicos y/o insanos tales como benceno o tetracloruro de carbono.

Por lo tanto, todavía persiste la necesidad de un proceso optimizado para la 11\beta-hidroxilación microbiana de un compuesto retroesteroide, y en particular para la identificación de una especie bacteriana y de las cepas correspondientes que son capaces de llevar a cabo este proceso de hidroxilación con una eficacia elevada y un rendimiento elevado.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención fue desarrollar un método de transformación microbiana nuevo para la producción sencilla y cuantitativa de compuestos retroesteroides que portan un grupo C11\beta-hidroxilo, y cuyos compuestos son útiles como intermedios claves para la síntesis de compuestos nuevos moduladores del receptor de progesterona basados en el núcleo retroesteroide del agonista de progesterona conocido didrogesterona. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención identificar una especie microbiana que es capaz de llevar a cabo la 11\beta-hidroxilación de retroesteroides idénticos o similares a didrogesterona con una eficacia elevada y un rendimiento elevado.

Sorprendentemente, se descubrió que mediante la utilización de un microorganismo bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei se puede transformar un compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide (retroesteroide) de Fórmula general (I)

2

en la que

R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o

R4 es un grupo \beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno,

en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente.

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En una realización, el compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide (retroesteroide) usado en la transformación anteriormente mencionada se representa mediante un compuesto de Fórmula general (II)

3

en la que

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}); y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno.

Una realización adicional se refiere al uso de un microorganismo bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei para la transformación anteriormente mencionada, cuyo microorganismo bacteriano es una cepa seleccionada del grupo que consiste en LS30, DSM 43304 (que corresponde a ATCC 13685, CBS 121.63, CBS 716.72, DSM 40501, IFO 13415, IMET 7651, ISP 5501, JCM 4789, KCC S-0789, LBG A 3136, NBRC 13142, NBRC 13415, NCIB 9613, NRRL B-3240, RIA 1376 ó VKM Ac-798), DSM 40773, y DSM 46096 (que corresponde a ATCC 21411, IMET 7669) de Amycolatopsis mediterranei. El microorganismo usado preferiblemente es la cepa bacteriana LS30 de Amycolatopsis mediterranei depositada como DSM 17416 en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", la DSMZ (dirección: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania).

Un microorganismo particular usado para dicha transformación microbiana es la cepa bacteriana LS30 de Amycolatopsis mediterranei que se ha identificado recientemente y que no se ha descrito antes en la bibliografía. La cepa bacteriana LS30 se caracterizó como perteneciente a la especie Amycolatopsis mediterranei basándose en la apariencia macroscópica y microscópica (morfología de colonias), basándose en la clasificación quimiotaxonómica (patrón de ácidos grasos), y basándose en la secuenciación comparativa de rRNA 16S. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a la cepa bacteriana LS30 de Amycolatopsis mediterranei depositada como DSM 17416 en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen", la DSMZ (dirección: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania).

Cuando se transforma un compuesto retroesteroide de Fórmula general (I), se obtendrá un análogo de 11\beta-hidroxilo suyo como producto de la transformación que se representa mediante la Fórmula general (IV) siguiente

4

en la que

R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o R4 es un grupo \beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno.

Cuando se transforma un compuesto retroesteroide de Fórmula general (II), se obtendrá un análogo de 11\beta-hidroxilo suyo como producto de transformación que se representa mediante la Fórmula general (V) siguiente

5

en la que

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno.

Dichos compuestos de las fórmulas generales (IV) y (V) son los compuestos intermedios claves deseados que son útiles para la preparación de compuestos esteroides nuevos con una conformación 9\beta,10\alpha que portan diferentes tipos de sustituyentes en la posición C11\beta.

Se conocen ya algunos de los compuestos particulares que están dentro del alcance de la fórmula general (V), tales como 11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona (nº de CAS 22413-62-3), 11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (nº de CAS 10007-43-9), y 11\beta-17\alpha-dihidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (nº de CAS 4076-89-5); sin embargo, los compuestos restantes de fórmula general (V) son nuevos y forman también parte de la presente invención.

Por lo tanto, es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar compuestos 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmula general (V)

6

en la que

a)

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y R2 y R3 juntos forman un grupo metileno, o

b)

R1 se selecciona del grupo que consiste en -O-alquilo(C_{1}-C_{4}) y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y R2 y R3 representan ambos hidrógeno; o

c)

R1 es -OH, R2 y R3 representan ambos hidrógeno, y el compuesto es un 4,6-dieno.

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En una realización, el compuesto intermedio 11\beta-hidroxi-retroesteroide se selecciona del grupo que consiste en

11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

11\beta-17\alpha-dihidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

11\beta-17\alpha-dihidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona, y

11\beta-17\alpha-dihidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona.

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Ya que el objetivo de la presente invención fue el desarrollo de un proceso nuevo y mejorado para la producción de dichos compuestos intermedios, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un proceso para la transformación microbiana in vitro de un compuesto retroesteroide de Fórmula general (I)

7

\newpage

en la que

R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o

R4 es un grupo \beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}) y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno;

en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente, cuyo proceso comprende poner en contacto un compuesto de Fórmula (I) en un medio de fermentación (adecuado) con un miembro bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei capaz de llevar a cabo la transformación de un compuesto de Fórmula (I) en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente.

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En una realización, la presente invención se refiere a un proceso para la transformación microbiana in vitro de un compuesto retroesteroide de Fórmula general (II)

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en la que

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}) y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}); y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno,

en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente, cuyo proceso comprende poner en contacto un compuesto de Fórmula (II) en un medio de fermentación (adecuado) con un miembro bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei capaz de llevar a cabo la transformación de un compuesto de Fórmula (II) en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente.

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Una realización adicional de la presente invención se refiere a un proceso para la transformación microbiana in vitro de un compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide de Fórmula general (III)

9

en la que

R1 es hidrógeno o -O-alquilo(C_{1}-C_{4}); y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno,

en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente, cuyo proceso comprende poner en contacto un compuesto de Fórmula (III) en un medio de fermentación (adecuado) con un miembro bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei capaz de llevar a cabo la transformación de un compuesto de Fórmula (III) en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente.

Además, la presente invención trata sobre un método optimizado para aislar los compuestos 11\beta-hidroxi-retroesteroides de las fórmulas generales (IV) y/o (V) como se definieron anteriormente del caldo de fermentación. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un proceso para el aislamiento de dicho análogo de 11\beta-hidroxilo del medio de fermentación (= medio de cultivo bacteriano) tras la transformación del compuesto retroesteroide de las Fórmulas generales (I), (II) o (III) como se definieron anteriormente con un miembro de la especie Amycolatopsis mediterranei, por lo que se aísla el análogo de 11\beta-hidroxilo del medio de fermentación mediante un proceso que comprende las etapas de

a)

obtener el sobrenadante del medio de fermentación opcionalmente exento de células bacterianas, residuos bacterianos, sustancias mucilaginosas y sólidos,

b)

poner en contacto un material de sobrenadante seleccionado del grupo que consiste en el sobrenadante obtenido en la etapa a), un concentrado formado reduciendo el volumen de dicho sobrenadante, y una fracción retenida obtenida mediante filtración en membrana de dicho sobrenadante, con una cantidad de una resina adsorbente polimérica semipolar no iónica suficiente para la adsorción del análogo de 11\beta-hidroxilo contenido en el material de sobrenadante, por lo que se obtiene una resina adsorbente polimérica semipolar no iónica cargada con el análogo de 11\beta-hidroxilo, y después separar la resina adsorbente cargada del resto del material de sobrenadante;

c)

lavar la resina adsorbente cargada con un líquido de lavado acuoso alcalino que tiene un valor de pH de al menos 12,0, preferiblemente de 12,5 a 14;

d)

realizar opcionalmente una etapa de lavado intermedia, en la que la resina adsorbente cargada se lava con agua; y

e)

poner en contacto la resina adsorbente lavada con una cantidad de un líquido de elución suficiente para la desorción del análogo de 11\beta-hidroxilo adsorbido en ella, y dicho líquido de elución comprende al menos un disolvente orgánico miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en éteres miscibles con agua, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, o una mezcla de agua que se ha alcalinizado opcionalmente y al menos un disolvente orgánico miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en éteres miscibles con agua, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, y

f)

separar un eluato que contiene el análogo de 11\beta-hidroxilo de la resina adsorbente, y opcionalmente concentrar el eluato mediante reducción del volumen.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Como se usan aquí, los siguientes términos tienen los siguientes significados, a menos que se indique explícitamente de otra manera.

Como se usan aquí, las expresiones "que comprende" y "que incluye" se usan en su sentido amplio, no limitante.

La palabra "compuesto" se entiende que cubre aquí todos y cada uno de los isómeros (p.ej., enantiómeros, estereoisómeros, diastereoisómeros, rotámeros, tautómeros) o cualquier mezcla de isómeros, profármacos y cualquier sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, a menos que se indique de otra manera.

Cuando se usa la forma plural para los compuestos, las sales, y similares, esto se interpreta también como un único compuesto, sal, o similar.

Los compuestos de la invención pueden contener al menos un centro asimétrico en la molécula, p.ej., un átomo de carbono quiral, dependiendo de la naturaleza de los diversos sustituyentes. En el caso de tal centro asimétrico, los compuestos podrían estar presentes así en dos formas estereoisoméricas ópticamente activas o como un racemato. La presente invención debería incluir tanto las mezclas racémicas como los compuestos isoméricamente puros, a menos que se indique específicamente en la escritura o en las fórmulas estructurales expuestas, como por ejemplo para la conformación 9\beta,10\alpha o para la conformación C11\beta o para el grupo C17\beta-acetilo. Los compuestos de la presente invención pueden contener centros asimétricos adicionales en la molécula, dependiendo de la naturaleza de los diversos sustituyentes. En ciertos casos, la asimetría puede estar presente también debido a la rotación restringida alrededor del enlace central contiguo a los dos anillos aromáticos de los compuestos especificados. Se pretende que todos los isómeros (lo que incluye los enantiómeros y diastereoisómeros), ya sea por la naturaleza de sus centros asimétricos o por la rotación restringida como se describió anteriormente, como isómeros separados, puros o parcialmente purificados o sus mezclas racémicas, estén incluidos dentro del ámbito de la presente invención.

Cualquier átomo de carbono asimétrico puede estar presente en la configuración (R), (S) o (R,S), preferiblemente en la configuración (R) o (S), la que sea más activa. Los sustituyentes en un enlace doble o en un anillo pueden estar presentes en la forma cis- (.=Z-) o trans (=E-).

El término "retroesteroide" se refiere a un compuesto esteroide con una conformación 9\beta,10\alpha.

El término "sustituido" significa que el grupo o resto especificado alberga uno o más sustituyentes. Cuando un grupo pueda portar múltiples sustituyentes y se proporcione una diversidad de sustituyentes posibles, los sustituyentes se seleccionan independientemente y no es necesario que sean iguales. La expresión "sin sustituir" significa que el grupo especificado no alberga sustituyentes. La expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo especificado está sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

El término "hidroxilo" o "hidroxi" se refiere al grupo -OH.

El término "alquilo" representa un radical de hidrocarburo que puede ser lineal, cíclico o ramificado, con ramificación simple o múltiple, en el que el grupo alquilo comprende en general 1 a 12 átomos de carbono. En una realización, el término "alquilo" representa una cadena alquilo lineal o ramificada (con ramificación simple o múltiple) de 1 a 4 átomos de carbono, ejemplificada por el término alquilo(C_{1}-C_{4}). El término alquilo(C_{1}-C_{4}) se ejemplifica adicionalmente mediante grupos tales como metilo; etilo; n-propilo; isopropilo; n-butilo; sec-butilo; isobutilo; y tert-butilo. El grupo alquilo o alquilo(C_{1}-C_{4}) puede estar parcialmente insaturado, por lo que se forman grupos tales como, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, 2-propenilo (alilo), y butenilo. El término "alquilo" comprende además los grupos cicloalquilo, preferiblemente cicloalquilo(C_{3}-C_{4}) que se refiere a ciclopropilo o ciclobutilo, y sus formas isoméricas tales como metilciclopropilo. El grupo cicloalquilo puede estar además parcialmente insaturado. Además, la expresión alquilo(C_{1}-C_{4}) comprende también un grupo ciclopropilmetilo.

El término "metileno" se refiere a -CH_{2}-.

El término "acetilo" se refiere a -CO-CH_{3}.

Numeración de compuestos (nomenclatura)

Además, en un intento por mantener la consistencia en la nomenclatura de los compuestos de estructura similar pero con sustituyentes diferentes, los compuestos descritos aquí se nombran según las siguientes directrices generales. También se proporciona el sistema de numeración para la localización de los sustituyentes en tales compuestos.

Los átomos de C del núcleo esteroide del derivado de pregnano se numeran según el siguiente esquema general:

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10

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Didrogesterona, 9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona, tiene la fórmula (I-1) siguiente:

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11

\newpage

Retroprogesterona, 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona, tiene la fórmula (I-3) siguiente:

12

Las fórmulas estructurales generales se designan típicamente con un número romano, I, II, III, etc. Los intermedios se indican con los mismos números romanos de las fórmulas generales correspondientes y una letra o número adicional, p.ej. I-2 para un derivado particular que está dentro del alcance de la fórmula general I. Los compuestos de la invención se designan nº 1, nº 2, etc.

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Abreviaturas y siglas

VL

volumen de lecho

d

día(s)

DCM

diclorometano

DDQ

2,3-dicloro-5,6-dicianonezoquinona

MS

materia seca

DMSO

sulfóxido de dimetilo

DSMZ

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

h

hora(s)

HPLC

cromatografía líquida de alto rendimiento

HLA

hidruro de litio y aluminio

min

minutos

NMMO

N-metilmorfolin-N-óxido

rpm

revoluciones por minuto

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Eductos de Fórmula general (I)

Un compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide (retroesteroide) de Fórmula general (I)

13

en la que

R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o

R4 es un grupo \beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno,

y que se usa como material de partida en los procesos de la presente invención, se puede preparar a partir de retroesteroides conocidos mediante el uso de reacciones químicas y procedimientos conocidos. No obstante, los siguientes métodos preparativos generales se presentan para ayudar al lector a sintetizar los eductos usados en la presente invención. Todos los grupos variables de estos métodos son como se describe en la descripción genérica, si no se definen específicamente más adelante.

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Se reconoce que algunos eductos de la invención con cada grupo funcional opcional reivindicado pueden no prepararse mediante cada uno de los métodos enumerados a continuación. Dentro del alcance de cada método, pueden aparecer sustituyentes opcionales en los reactivos o intermedios que pueden actuar como grupos protectores o no participantes. Mediante la utilización de los métodos conocidos para los expertos en la técnica, estos grupos se introducen y/o se eliminan durante el curso de los esquemas sintéticos que proporcionan los compuestos de la presente invención.

A continuación se muestra la secuencia de las etapas para los esquemas generales para sintetizar los compuestos de la presente invención. En cada uno de los esquemas, los grupos R (p.ej., R1, R2, etc.) corresponden a los patrones de sustitución específicos indicados en la Descripción y en los Ejemplos.

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Esquema I

14

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El Esquema I muestra la reacción opcional en la que didrogesterona (9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona) disponible comercialmente de fórmula (I-1) se sustituye en la posición 1,2 con un grupo metileno. La introducción del grupo 1,2-metileno se podría llevar a cabo según los procedimientos conocidos descritos por Halkes et al [1972] y en la patente de EE.UU. nº 3.937.700 para 17\alpha-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona mediante deshidrogenación y reacción posterior con metiluro de dimetilsulfoxonio.

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Esquema II

15

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Según el Esquema II, la 9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona sustituida opcionalmente con metileno en 1,2 de fórmula general I-1,2 se convierte después en la 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (9\beta,10\alpha-progesterona) correspondiente de fórmula general I-3,4 en condiciones reductoras según los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. nº 3.555.053.

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Esquema III

16

La introducción de la cadena lateral adicional en la posición C17\alpha, como se expone en el Esquema III, para obtener compuestos de fórmula general (I-A), en los que R11 es -H, -alquilo(C_{1}-C_{4}), o -CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), se podría conseguir mediante los métodos según los procedimientos descritos por Halkes & van Moorselaar [1969] y en las patentes de EE.UU. n^{os} 3.555.053 y 3.937.700 mediante la introducción de un grupo 17\alpha-hidroxilo y opcionalmente la eterificación o esterificación posterior del grupo hidroxilo en el átomo de carbono 17. Si se desea, para obtener compuestos de fórmula general (I-B), el enlace doble en la posición C6-C7 se puede reintroducir mediante deshidrogenación.

La funcionalización de la posición C17 comienza con la introducción de un grupo -OH en la posición C17 \alpha: Por ejemplo, la (9\beta,10\alpha)-pregna-4-en-3,20-diona de la fórmula I-3 o I-4 se puede reducir mediante el uso de un agente reductor adecuado tal como hidruro de litio y aluminio (HLA) para producir el 3,20-diol correspondiente. El grupo 3-hidroxilo se re-oxida selectivamente después por medio de un agente oxidante selectivo tal como 2,3-dicloro-5,6-dicianonezoquinona (DDQ) en un disolvente aromático o dióxido de manganeso. La 20-hidroxi-(9\beta,10\alpha)-pregna-4-en-3-ona resultante se deshidrata adicionalmente mediante tosilación con cloruro de tosilo en piridina. El tratamiento posterior del tosilato generado con piridina en ebullición proporciona el derivado insaturado en la posición 17,20 en una mezcla de isómeros cis y trans. Este último compuesto se oxigena después mediante el uso de un oxido de amina tal como N-metilmorfolin-N-óxido (NMMO) como agente oxidante estequiométrico y peróxido de hidrógeno adicional en presencia de una cantidad catalítica de tetraóxido de osmio para producir la 17\alpha-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona correspondiente.

Este compuesto se puede modificar adicionalmente sometiéndolo a una reacción de eterificación o esterificación en el grupo hidroxilo en el átomo de carbono C17, mediante las reacciones descritas en general en la memoria descriptiva de la patente belga BE 577.615 o en la patente de EE.UU. nº 3.937.700. Los agentes acilantes adecuados son los ácidos carboxílicos, anhídridos de ácidos carboxílicos o cloruros de ácidos carboxílicos en presencia de un catalizador tal como ácido p-toluen-sulfónico, ácido o anhídrido trifluoroacético, o piridina-HCl o en presencia de un ligador de ácidos tal como una base orgánica, por ejemplo, colidina. La reacción de acilación se lleva a cabo en presencia de un disolvente tal como un hidrocarburo, por ejemplo, benceno o tolueno. La temperatura de la reacción puede variar entre la temperatura ambiente y el punto de ebullición del disolvente utilizado. Debido a que si el material de partida contiene, aparte del grupo 17-OH, uno o más grupos OH adicionales éstos también se esterificarán, los grupos OH adicionales se deben proteger por adelantado. De forma alternativa, la reacción de alquilación se puede llevar a cabo mediante una reacción con un haluro de alquilo en presencia de Ag_{2}O, o mediante una reacción de dihidropirano o dihidrofurano en un medio ácido débil, alcalino débil o neutro.

Finalmente, los compuestos obtenidos se podrían deshidrogenar de nuevo para proporcionar el derivado insaturado en la posición 4,6 de fórmula general I-B.

Esquema IV

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Según el Esquema IV, la 9\beta,10\alpha-pregna-4-(6-di)-en-3,20-diona sustituida opcionalmente con metileno en 1,2 de fórmula general I-1,2,3,4 se podría convertir adicionalmente en la 18-metil-9\beta,10\alpha-androst-4-(6-di)-en-3,17-diona correspondiente de fórmula general I-C mediante una secuencia de reducción, oxidación y eliminación seguida por una ozonolisis del intermedio 18-metil-9\beta,10\alpha-pregna-4,17(20)-dien-3-ona o del intermedio 18-metil-9\beta,10\alpha-pregna-4,6,17(20)-trien-3-ona como describieron Halkes & van Moorselaar [1969].

Proceso de la 11\beta-hidroxilación microbiana Procedimiento general

El proceso se lleva a cabo de la manera habitual. Con este propósito, en general se produce primero una disolución nutritiva esterilizada (=medio) para la cepa bacteriana, y esta disolución nutritiva se inocula después con la cepa bacteriana, en general desprendiendo algunas colonias de una placa de agar y suspendiéndolas en el medio, y después se cultiva. Opcionalmente, se puede preparar un segundo precultivo inoculando una disolución nutritiva nueva con una alícuota de la suspensión de cultivo obtenida. El precultivo que se produce de esta manera se puede añadir a un fermentador que también contiene una disolución nutritiva adecuada. Preferiblemente, después de la fase de crecimiento del cultivo de la cepa, se añade una sustancia de partida (un compuesto de fórmula general I) al fermentador, de forma que puede desarrollarse la reacción según la invención (la transformación del compuesto de fórmula general I en el compuesto 11-hidroxilado correspondiente de fórmula general IV). Después de que la reacción haya finalizado, la mezcla de sustancias se purifica de la manera habitual o de una manera según la presente invención para aislar el retroesteroide 11\beta-hidroxilado deseado.

Cepas de Amycolatopsis mediterranei

El proceso proporcionado por la presente invención se basa en el descubrimiento de que los microorganismos de la especie Amycolatopsis mediterranei son capaces de introducir un grupo 11\beta-hidroxilo en derivados de 9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona y 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona sin sustituir en la posición 11. Estas cepas bacterianas, obtenibles a partir de materiales naturales tales como tierra y también disponibles en colecciones de cultivos públicas, pueden utilizar retroesteroides como fuente de carbono o son capaces de tolerar estos esteroides en presencia de otras fuentes de carbono asimilables.

Por lo tanto, el proceso proporcionado por la presente invención para la fabricación de los retroesteroides de fórmula IV o V como se definieron anteriormente comprende fermentar un retroesteroide correspondiente sin sustituir en la posición 11 con un miembro de la especie Amycolatopsis mediterranei. Los ejemplos de cepas específicas de Amycolatopsis mediterranei que son útiles para llevar a cabo el proceso de esta invención incluyen la cepa recientemente identificada LS30, así como las cepas disponibles de colecciones de cultivos públicas tales como DSM 43304 (que corresponde a ATCC 13685, CBS 121.63, CBS 716.72, DSM 40501, IFO 13415, IMET 7651, ISP 5501, JCM 4789, KCC S-0789, LBG A 3136, NBRC 13142, NBRC 13415, NCIB 9613, NRRL B-3240, RIA 1376, VKM Ac-798), DSM 40773 y DSM 46096 (que corresponde a ATCC 21411, IMET 7669). En una realización, la cepa LS30 de Amycolatopsis mediterranei es la cepa de Amycolatopsis mediterranei depositada como DSM 17416 en la DSMZ ("Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen").

Los mutantes de las cepas de Amycolatopsis mediterranei generados mediante métodos de biología molecular, mediante métodos químicos (p.ej., mediante tratamiento con un nitrito) o mediante métodos físicos (p.ej., irradiación) se pueden usar también en el proceso de la invención. De forma alternativa, la enzima o las enzimas que fermentan los retroesteroides sin sustituir en la posición 11 se pueden extraer también del cultivo bacteriano o del medio nutritivo y ponerlos en contacto con el sustrato de esteroide en ausencia de las células vivas. Preferiblemente, se usan las propias cepas bacterianas en la práctica de esta invención para evitar etapas de fabricación adicionales. Las cepas bacterianas o las enzimas aisladas de ellas se pueden inmovilizar en un sustrato adecuado, si se desea.

El proceso de esta invención se lleva a cabo en condiciones empleadas por lo general para la 11\beta-hidroxilación con especies de actinomicetos; por ejemplo, tales como las expuestas en el documento GB 1.111.320.

Disolución nutritiva (medios nutritivos)

Las cepas de Amycolatopsis mediterranei usadas en el proceso de la invención se pueden cultivar en disoluciones nutritivas sólidas o líquidas (=medios) que contienen una fuente de nitrógeno asimilable, una fuente de carbono asimilable y sales inorgánicas.

Fuentes adecuadas de nitrógeno asimilable incluyen compuestos animales, vegetales, microbianos e inorgánicos tales como extractos de carne, peptonas, macerado de maíz, extractos de levadura, glicocola y nitrato sódico, o sus mezclas. Fuentes adecuadas de carbono asimilable incluyen todos los carbohidratos y sus polímeros (por ejemplo, almidón, dextrina, sacarosa, maltosa y glucosa) y aminoácidos, proteínas, peptonas, ácidos grasos, grasas y esteroides (especialmente retroesteroides), así como sus mezclas. Preferiblemente, el medio nutritivo contiene extractos de levadura en cantidades de hasta el 2,5% (p/p), preferiblemente 0,2 - 2% como fuente de nitrógeno y glucosa en cantidades de hasta el 20% (p/p), preferiblemente 5 - 10% como fuente de carbono.

El medio puede contener oligoelementos (presentes de forma natural o añadidos) que están disponibles a partir de ingredientes minerales u orgánicos. La presencia de hierro es especialmente deseable. Preferiblemente, el medio nutritivo contiene hierro en forma de iones Fe^{3+} en concentraciones de 0 a 200 mg/ml (FeCl_{3}), preferiblemente alrededor de 50 mg/ml de FeCl_{3}. El azufre puede estar presente en forma de compuestos orgánicos o inorgánicos que están presentes en otros componentes del medio, o se puede añadir expresamente. Lo mismo es aplicable al fósforo, pero en general está presente en forma de una sal inorgánica.

Según las necesidades o según se desee, se pueden añadir a los medios factores de crecimiento adicionales o estimulantes tales como vitaminas (p.ej., biotina o piridoxina) o auxinas (p.ej., ácido indolil-acético).

Para protegerlo contra las infecciones, el medio se puede esterilizar y, además, se pueden proporcionar materiales que inhiben el crecimiento de, p.ej., bacterias.

Para volúmenes mayores de medio de cultivo, en particular en fermentadores, se puede añadir un agente antiespumante al medio. Opcionalmente, el grado de formación de espuma se puede medir con un electrodo antiespumante y se puede controlar mediante la adición automática de un agente antiespumante. Los agentes antiespumantes comprenden, por ejemplo, agentes antiespumantes basados en silicio o tensoactivos tales como PEG o PPG.

Condiciones de cultivo (valor de pH, temperatura, tiempo de incubación)

Antes de la inoculación, el valor de pH del medio nutritivo se ajusta idealmente dentro del intervalo aproximado: el valor de pH óptimo para el crecimiento de Amycolatopsis mediterranei es de 5 a 8, preferiblemente de 7,0 a 7,5. La temperatura de cultivo se ajusta preferiblemente a la temperatura de crecimiento óptima de Amycolatopsis mediterranei, que es de 18ºC - 40ºC, preferiblemente de 25 - 35ºC, y lo más preferiblemente de 28 - 32ºC.

Por regla general, sin embargo, se permite un cierto período de precultivo para Amycolatopsis mediterranei antes de comenzar el proceso de transformación microbiana. Generalmente, las bacterias se cultivan durante hasta 96 horas, preferiblemente de alrededor de 12 a alrededor de 72 horas, e incluso más preferiblemente de alrededor de 24 a alrededor de 48 horas. Sin embargo, la fase de crecimiento real podría variar dependiendo del volumen y de la edad del precultivo usado para la inoculación, y dependiendo del volumen del medio de cultivo. Preferiblemente, las bacterias están en la fase media o tardía de su período de crecimiento exponencial cuando comienza el proceso de transformación mediante la adición del retroesteroide de fórmula (I).

Se puede emplear una técnica de fermentación sumergida. Preferiblemente, los cultivos se mantienen con aireación (es decir, agitando los matraces que contienen el medio de fermentación en un agitador rotatorio a una cierta velocidad, o, en un fermentador, agitando y bombeando aire estéril en el medio de fermentación).

Adición del retroesteroide sin sustituir en la posición 11 (9\beta,10\alpha-esteroide) (= "educto" o "sustrato")

El retroesteroide sin sustituir en la posición 11 de fórmula (I) se puede añadir a la carga de fermentación en cualquier etapa del crecimiento de Amycolatopsis mediterranei. Preferiblemente, sin embargo, se permite un cierto período de precultivo para Amycolatopsis mediterranei como se expuso anteriormente, y el retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se añade por primera vez 12 a 96 horas después del comienzo de la fermentación. El retroesteroide sin sustituir en la posición 11 a transformar se puede añadir de cualquier manera conveniente, pero preferiblemente de tal manera que se da como resultado una superficie de contacto máxima entre el retroesteroide sin sustituir en la posición 11 y las bacterias. Por ejemplo, el retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se puede añadir al cultivo en forma de un polvo mediante dispersión mecánica en el medio o en una forma emulsionada por medio de agentes de dispersión, o se puede añadir en disolución disuelto en un disolvente orgánico miscible con agua (p.ej., acetona, propilenglicol, glicolmonometil éter, sulfóxido de dimetilo (DMSO), dimetilformamida y alcoholes tales como metanol o etanol). Se debe tener cuidado, sin embargo, de mantener el nivel de cualquier disolvente utilizado por debajo del nivel que afecta de manera adversa a las bacterias, es decir, en general menos de alrededor del 1 por ciento en volumen. La emulsión del sustrato de retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante pulverización de este último en forma micronizada o en un disolvente miscible con agua (tal como metanol, etanol, acetona, glicolmonometil éter, dimetilformamida o sulfóxido de dimetilo) con gran turbulencia en agua (preferiblemente descalcificada) que contiene los agentes emulsionantes auxiliares habituales. Los agentes emulsionantes auxiliares adecuados incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes no iónicos, tales como, por ejemplo, aductos de óxido de etileno o ésteres de ácidos grasos de poliglicoles. Preferiblemente, el educto (el retroesteroide sin sustituir en la posición 11) se disuelve en DMSO en una concentración de hasta 40 mg/ml, y después se añade al medio tras esterilización en condiciones estériles.

La concentración del retroesteroide sin sustituir en la posición 11 tiene una gran influencia sobre el rendimiento y la eficacia del resultado de la reacción de fermentación. Debido a la solubilidad relativamente baja de los compuestos de fórmula general (I) y (II) en los medios acuosos, la concentración del educto y del producto no debería superar cierto valor. Dependiendo de la edad del cultivo bacteriano y de la solubilidad del educto usado, se puede añadir hasta alrededor de 1 gramo suyo por litro de disolución nutritiva; sin embargo, preferiblemente se deberían añadir alrededor de 50 mg a alrededor de 500 mg del educto por litro de disolución nutritiva, e incluso más preferiblemente entre 100 - 250 mg por litro. Lo más preferiblemente, la cantidad del compuesto de partida de esteroide no debería superar valores de 150 mg por litro de medio de fermentación. En consecuencia, se debería tener cuidado de que la cantidad del producto hidroxilado deseado no se acumule por encima de valores de 1 g por litro de disolución nutritiva; preferiblemente, el producto debería estar presente en cantidades de alrededor de 50 mg a alrededor de 500 mg por litro, e incluso más preferiblemente entre 100 - 250 mg por litro de disolución de fermentación. Lo más preferiblemente, la cantidad del producto hidroxilado no debería superar valores de 150 mg por litro de disolución de fermentación.

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En una realización, la cantidad total del compuesto retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se añade de una sola vez al comienzo del proceso de transformación o a lo largo de un período de 1 a 5 horas (es decir, un periodo de tiempo corto) al comienzo del proceso de transformación.

En una realización alternativa, la cantidad del compuesto retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se añade de manera continua a lo largo del periodo de transformación completo. Por ejemplo, el retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se añade en una concentración de 1 a 20 mg por hora de cultivo y por litro de disolución nutritiva (mg/h/l). Preferiblemente, el retroesteroide sin sustituir en la posición 11 se añade en una concentración de 2 a 5 mg por hora de cultivo y por litro de disolución nutritiva (mg/h/l).

Condiciones de transformación

La transformación se lleva a cabo normalmente al mismo pH y temperatura que necesita la cepa de Amycolatopsis mediterranei para crecer. Sin embargo, en algunos casos, la temperatura y/o el pH óptimos para el crecimiento pueden no ser óptimos completamente para la hidroxilación de los retroesteroides sin sustituir en la posición 11, y es necesario adaptarlos. El tiempo necesario para la transformación del retroesteroide sin sustituir en la posición 11 fluctúa algo, dependiendo de la carga de fermentación, el modo de operación y la cepa individual de Amycolatopsis mediterranei utilizada, pero en general está dentro del periodo aproximado de 2 a 172 horas. Preferiblemente, el tiempo de transformación es de alrededor de 12 a 96 horas, e incluso más preferiblemente de 36 a 60 horas.

El proceso de fermentación se lleva a cabo generalmente en condiciones aeróbicas, preferiblemente la saturación de O_{2} relativa, pO_{2}/pO_{2,max} del medio se regula para que sea de alrededor del 5% a alrededor del 95%, preferiblemente de alrededor del 20% a alrededor del 80%, e incluso más preferiblemente de alrededor del 30% a alrededor del 75%, y lo más preferiblemente de alrededor del 40% a alrededor del 70%.

El curso de la transformación se puede determinar para cada carga de fermentación por medio de los métodos analíticos habituales, tales como cromatografía en capa fina, absorción ultravioleta o HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia) de muestras pequeñas tomadas de la carga de fermentación. Además, el curso del proceso de transformación se monitoriza mediante el análisis de parámetros tales como el valor de pH, la temperatura, la saturación de O_{2} relativa, el contenido de glucosa, etc.

Los detalles específicos de la fase de crecimiento y del proceso de transformación para proporcionar un 11\beta-hidroxi-retroesteroide particular de fórmula general IV o V se proporcionan en la sección de ejemplos más adelante. La concentración óptima de sustrato, el tiempo de adición del sustrato y la duración de la transformación dependen de la estructura de los retroesteroides sin sustituir en la posición 11\beta de la fórmula I, II o III, y finalmente también de la cepa individual de Amycolatopsis mediterranei utilizada para la reacción de hidroxilación. Estas variables se pueden determinar fácilmente en cada reacción de hidroxilación individual con experimentación preliminar rutinaria que está dentro de los conocimientos del experto en la técnica.

Inducción

La velocidad de la transformación y el rendimiento del producto se pueden incrementar mediante la inducción de las enzimas deseadas antes de la adición del retroesteroide sin sustituir en la posición 11. Se puede usar cualquier esteroide, que incluye los esteroides normales tales como estradiol y testosterona, como inductores enzimáticos. Sin embargo, los esteroides que son más hidrosolubles que el sustrato a emplear son inductores enzimáticos preferidos. La cantidad y el tiempo de la adición de los inductores no es crítica, aunque normalmente se añade al medio de alrededor del 1 al 10 por ciento en peso del esteroide empleado.

Una posibilidad adicional para incrementar el rendimiento de los 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmula IV o V consiste en la adición de sustancias citotóxicas tales como 2,4-dinitro-fenol o cianuro potásico, o sustancias antibióticas tales como cloromicetina a la carga de fermentación en la que ya están presentes las enzimas necesarias para la 11\beta-hidroxilación.

Aislamiento del producto de retroesteroide hidroxilado

Tras la transformación completa, el retroesteroide hidroxilado se aísla de la carga. Preferiblemente, la carga de fermentación se separa primero en el sobrenadante y el material celular, los restos bacterianos y otros materiales sólidos mediante medios de separación conocidos tales como sedimentación y decantación, separación, filtración o centrifugación, cuyos métodos se explican con más detalle más adelante. Un método posible para llevar a cabo el aislamiento es la extracción por medio de un disolvente para los esteroides que es inmiscible con el agua (p.ej., acetato de etilo, cloruro de metileno, cloroformo, metil-isobutil-cetona, tetracloruro de carbono, éter, tricloroetileno, alcoholes, benceno y hexano). La sustancia celular se puede separar también con los disolventes mencionados en los párrafos precedentes y también se puede extraer por medio de disolventes miscibles con agua (p.ej., acetona, sulfóxido de dimetilo y etanol). Los esteroides obtenidos de los extractos se pueden purificar mediante recristalización, cromatografía o por medio de distribución en contracorriente y se separan de los subproductos indeseados del proceso de fermentación.

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Preferiblemente, los 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmula IV o V se aíslan de la carga de fermentación mediante cromatografía en columna mediante el uso de una resina adsorbente no iónica semipolar. Se describió un protocolo similar para el aislamiento de estrógenos conjugados a partir de la orina de yeguas preñadas (PMU) en la solicitud de patente internacional WO 98/08526, y se adaptó para el propósito de la presente invención.

En la primera etapa se eliminan los sólidos, células y componentes bacterianos y sustancias mucilaginosas del caldo de fermentación de una manera conocida. De forma ventajosa, los materiales sólidos se separan mediante métodos de separación conocidos, por ejemplo decantación, separación y/o filtración. Así, el caldo de fermentación se puede hacer pasar, por ejemplo, a través de un aparato de separación conocido, p.ej. un separador, una unidad de filtración o un sedimentador. Los separadores disponibles comercialmente pueden servir como aparatos de separación, p.ej. se pueden usar separadores de toberas o separadores de cámaras. Si se desea, también se puede usar un aparato de microfiltración o un aparato de ultrafiltración, y si se usan es posible obtener un sobrenadante sustancialmente exento de bacterias y filtrado al mismo tiempo. De forma alternativa, se puede usar la centrifugación como medio de separación.

El sobrenadante de la etapa a), un concentrado obtenido de él reduciendo su volumen o una fracción retenida obtenida de él mediante filtración en membrana se puede usar como el material de sobrenadante de partida para el método de purificación según la invención.

Si se va a usar una fracción retenida de sobrenadante concentrado en lugar del sobrenadante, ésta se puede obtener del sobrenadante mediante una filtración en membrana conocida. El contenido sólido de la fracción retenida y su composición pueden variar según el cultivo de fermentación individual usado y la membrana usada para la filtración en membrana, por ejemplo su diámetro de poro, y las condiciones de la filtración. Por ejemplo, cuando se usa una membrana de nanofiltración, se puede conseguir una concentración prácticamente exenta de pérdidas de contenido de esteroide en la fracción retenida de sobrenadante con la eliminación simultánea de hasta el 50% en peso de los contenidos del caldo de fermentación de bajo peso molecular. Las fracciones retenidas de sobrenadante que se han concentrado hasta una proporción de aproximadamente 1:10, por ejemplo una proporción de alrededor de 1:7, y el volumen del cual se puede reducir así hasta aproximadamente 1/10, por ejemplo alrededor de 1/7, del volumen de sobrenadante original, se pueden usar para el método según la invención.

Adsorbentes adecuados para el uso para el método de purificación según la invención son resinas de adsorción poliméricas. Las resinas de adsorción particularmente preferidas son semipolares, en particular resinas de adsorción poliméricas semipolares no iónicas. Las resinas adsorbentes poliméricas semipolares no iónicas que se pueden usar en la etapa b) del método son polímeros no iónicos orgánicos porosos que, en contraste con las resinas adsorbentes poliméricas hidrofóbicas apolares, tienen una polaridad intermedia (p.ej., con un momento dipolar de la superficie activa de la resina en el intervalo de 1,0 a 3,0, en particular 1,5 a 2,0 Debye) y una estructura algo más hidrofílica, por ejemplo resinas de ésteres de ácidos policarboxílicos. De forma ventajosa, se usan resinas semipolares macroporosas que tienen una estructura preferiblemente macrorreticular y diámetros medios de poro en el intervalo de 50 a 150, preferiblemente 70 a 100 Angstrom, y un área superficial específica en el intervalo de 300 a 900 m^{2}/g, preferiblemente en el intervalo de 400 a 500 m^{2}/g. Las resinas reticuladas macroporosas de éster de ácido policarboxílico alifático, en particular las resinas reticuladas de éster poliacrílico tales como Amberlite XAD-7^{TM}, o Amberlite XAD-7-HP^{TM} fabricadas por Rohm and Haas, han resultado particularmente adecuadas.

Según la invención, la adsorción de los retroesteroides hidroxilados en la resina adsorbente semipolar se puede llevar a cabo poniendo en contacto el sobrenadante o su concentrado o su fracción retenida con la resina adsorbente, en la que el material de sobrenadante se introduce en un reactor que contiene la resina adsorbente y se mantiene en contacto con la resina adsorbente en él durante un tiempo suficiente para la adsorción del contenido de esteroide. Una vez que ha tenido lugar la adsorción de los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo en la resina adsorbente semipolar, la resina adsorbente cargada con los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo se puede separar del resto del material de sobrenadante de una manera conocida. De forma ventajosa, el material de sobrenadante se puede hacer pasar a través de una columna que contiene la resina adsorbente a tal caudal que el tiempo de contacto es suficiente para la adsorción del contenido de esteroide. Los caudales adecuados son, por ejemplo, aquellos que corresponden a una producción de 3 a 10, preferiblemente 5 a 7, partes en volumen de material de sobrenadante por una parte en volumen de resina adsorbente por hora. La adsorción se lleva a cabo preferiblemente a temperatura ambiente. De forma ventajosa, el caudal de material de sobrenadante a través del reactor se puede controlar con una ligera sobrepresión o subpresión (es decir, respecto de la presión ambiental). La cantidad de resina adsorbente semipolar no iónica a usar puede variar dependiendo del tipo de resina adsorbente usada y de la cantidad de sólidos contenidos en el material de sobrenadante. Cuando se usa el sobrenadante, por ejemplo una parte en volumen de resina adsorbente, p.ej. resina adsorbente reticulada de éster de ácido policarboxílico alifático, se puede cargar con hasta 80, preferiblemente de alrededor de 30 a 50 partes en volumen de sobrenadante pretratado, sin que se detecten cantidades perceptibles de compuestos esteroides en el efluente. Cuando se usa un concentrado de sobrenadante o fracción retenida de sobrenadante, la capacidad de carga de la resina adsorbente se reduce, por supuesto, hasta el grado en el que el material de sobrenadante se ha concentrado. Por ejemplo, 1 parte en volumen de resina adsorbente reticulada de éster de ácido policarboxílico alifático se puede cargar con una cantidad de material de sobrenadante concentrado que corresponde a 20 a 80, preferiblemente 30 a 50, partes en volumen de sobrenadante sin concentrar.

La resina adsorbente semipolar cargada con los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo se lava en la etapa c) del método con agua de lavado ajustada a un intervalo de pH de al menos 12,0, en particular de 12,5 a 14, preferiblemente alrededor de 13,5 a 14. Las disoluciones acuosas de sustancias básicas inertes que son solubles en el sobrenadante y que son lo suficientemente fuertes como para alcanzar un valor de pH de al menos 12,5 se pueden usar como líquido de lavado. Las sustancias básicas hidrosolubles adecuadas que son inertes para la resina adsorbente polimérica semipolar son preferiblemente bases inorgánicas hidrosolubles tales como hidróxidos de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, en particular hidróxido sódico. De forma ventajosa, el agua de lavado solamente contiene alrededor de la cantidad de sustancias básicas que es necesaria para conseguir el valor de pH deseado, preferiblemente aproximadamente un pH 13 a 14. La cantidad de agua de lavado alcalina se selecciona de forma que es suficiente para eliminar sustancialmente todos los demás contenidos del caldo de fermentación, sin que se eliminen en el lavado con ellos cantidades significativas de los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo. Por ejemplo, el uso de 2 a 10, en particular 4 a 6, volúmenes de lecho del líquido de lavado por volumen de lecho de resina adsorbente ha resultado ser ventajoso. En este caso, el agua de lavado se pasa ventajosamente a través de un reactor que contiene la resina adsorbente a un caudal de 3 a 10, preferiblemente 5 a 7, partes en volumen de agua de lavado por una parte en volumen de resina adsorbente por hora.

En la etapa d) del método, la resina de adsorción semipolar no iónica cargada con los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo se lava después opcionalmente con agua en una segunda operación de lavado intermedia tras la etapa c) del proceso. La cantidad de agua de lavado se adapta de manera individual. Preferiblemente, ha resultado conveniente el uso de 2 a 10, más preferiblemente 4 a 6, volúmenes de lecho de agua de lavado por volumen de lecho de resina de adsorción. En este caso, el agua de lavado se pasa convenientemente a través de un reactor que contiene la resina de adsorción a un caudal de 3 a 10, preferiblemente 5 a 7, partes en volumen de agua de lavado por 1 parte en volumen de resina de adsorción por hora.

En una realización ventajosa del método según la invención, la etapa de lavado opcional d) se lleva a cabo a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a temperaturas entre 0ºC y 10ºC, ya que se ha demostrado que se puede reducir considerablemente las pérdidas del retroesteroide sustituido con 11\beta-hidroxilo debidas posiblemente a la operación de lavado intermedia adicional. Normalmente, la temperatura atmosférica se considera la "temperatura ambiente", p.ej. la expresión designa una temperatura de entre 20ºC y 30ºC. Es muy conveniente realizar el método a temperaturas de exactamente 0ºC o aproximadamente 0ºC. En la práctica, se recomienda por lo tanto trabajar a temperaturas cercanas pero superiores a 0ºC, y asegurar que los intervalos de temperatura anteriormente mencionados se mantienen mediante medidas adecuadas. Se pueden usar medidas convencionales para disminuir la temperatura, p.ej. el uso de reactores refrigerados, materiales refrigerados y/o materiales de partida refrigerados tales como el material de sobrenadante. Desde un punto de vista práctico, un intervalo de temperaturas de 0ºC a alrededor de 5ºC, en particular de 0ºC a alrededor de 3ºC, se puede considerar como temperaturas de 0ºC o de aproximadamente 0ºC.

Para mantener las pérdidas del compuesto retroesteroide sustituido con 11\beta-hidroxilo durante el lavado intermedio tan bajas como sea posible, según esta variante del proceso el agua de lavado usada en la operación de lavado intermedia y/o también el agua de lavado que se ha alcalinizado usada en la etapa c) del proceso se prerrefrigera a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a temperaturas entre 0ºC y 10ºC. Los intervalos de temperatura adicionales adecuados o preferidos son, como se indicó anteriormente, las temperaturas de 0ºC a alrededor de 5ºC, en particular de 0ºC a alrededor de 3ºC. Preferiblemente, la operación se lleva a cabo a temperaturas de 0ºC o de aproximadamente 0ºC, es decir, preferiblemente el agua de lavado usada en la operación de lavado intermedia y/o también el agua de lavado que se ha alcalinizado usada en la etapa d) del proceso se prerrefrigera a temperaturas cercanas pero superiores a 0ºC. Mediante el uso del agua de lavado refrigerada que se ha alcalinizado en la etapa c) del proceso, se consigue un tipo de prerrefrigeración o de mantenimiento de la refrigeración de la resina de adsorción que ya ha tenido lugar, p.ej. para evitar que tenga lugar el recalentamiento indeseable del agua cuando se usa agua de lavado refrigerada para el lavado intermedio. Preferiblemente, por lo tanto, la etapa de lavado intermedia y la etapa c) del proceso se llevan a cabo en el intervalo de temperaturas, p.ej. a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a temperaturas entre 0ºC y 10ºC, o preferiblemente en los mismos intervalos de temperaturas indicados anteriormente.

En la variante anterior del proceso, en la que el método se lleva a cabo a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, puede ser deseable usar todos los dispositivos utilizados, tales como reactores para recibir la resina de adsorción semipolar o reactores que ya contienen la misma y/o el sobrenadante utilizado, prerrefrigerados por lo tanto a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a temperaturas entre 0ºC y 10ºC, o a los intervalos de temperaturas preferidos proporcionados anteriormente.

En la etapa e) del método, la resina adsorbente lavada cargada con los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo se trata después con una cantidad de un líquido de elución suficiente para la elución de los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo, y en la etapa f) del método se obtiene un eluato que contiene los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo. El líquido de elución usado según la invención consiste preferiblemente de manera esencial en un disolvente orgánico miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en éteres miscibles con agua, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, o una mezcla de tal disolvente orgánico miscible con agua y agua que opcionalmente se ha alcalinizado. Los constituyentes de éter adecuados del líquido de elución incluyen éteres cíclicos miscibles con agua tales como tetrahidrofurano o dioxano, pero también éteres de cadena abierta miscibles con agua tales como etilenglicol dimetiléter (= monoglima), dietilenglicol dimetiléter (= diglima) o etiloxietiloxi etanol (= Carbitol). Los alcanoles inferiores adecuados incluyen los alcoholes alquílicos miscibles con agua con 1 a 4, preferiblemente 1 a 3, átomos de carbono, en particular etanol o isopropanol. Las cetonas alifáticas inferiores adecuadas incluyen cetonas miscibles con agua con 3 a 5 átomos de carbono, en particular acetona. Se ha demostrado que los líquidos de elución en los que el disolvente orgánico es etanol son particularmente ventajosos. De forma ventajosa, se usan como líquidos de elución las mezclas de uno de los disolventes orgánicos miscibles con agua anteriormente mencionados y agua que opcionalmente se ha alcalinizado. El valor de pH de tales eluyentes que contienen agua está en el intervalo neutro a alcalino hasta un pH 13, y puede ser ventajosamente de 10 a 12. Se selecciona un disolvente que es estable en el intervalo de pH utilizado como el componente del disolvente del líquido de elución que contiene agua. En los líquidos de elución alcalinos que contienen agua que tienen valores de pH de aproximadamente 10 a 12, los alcanoles inferiores, preferiblemente etanol, son particularmente adecuados como componentes del disolvente. El valor de pH deseado del eluyente que contiene agua se consigue añadiendo una cantidad correspondiente de una sustancia básica inerte hidrosoluble, preferiblemente una base inorgánica, por ejemplo un hidróxido de metal alcalino o de metal alcalinotérreo, en particular hidróxido sódico. En los líquidos de elución que contienen agua puede haber una proporción en volumen de disolvente orgánico miscible con agua respecto del agua en el intervalo de 40:60 a 20:80, preferiblemente aproximadamente 30:70. La cantidad del eluyente utilizado puede ser aproximadamente 3 a 10, en particular aproximadamente 4 a 6, volúmenes de lecho de líquido de elución por volumen de lecho de resina adsorbente. De forma ventajosa, el líquido de elución se pasa a través de un reactor que contiene la resina adsorbente cargada con el retroesteroide sustituido con 11\beta-hidroxilo a un caudal tal que el tiempo de contacto es suficiente para completar la elución de los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo. Cuando se usa una mezcla de etanol con agua en una proporción de volúmenes de 30:70, son adecuados por ejemplo los caudales de 3 a 10, preferiblemente 5 a 7, partes en volumen de líquido de elución por 1 parte en volumen de resina adsorbente por hora. Cuando se usa etanol como líquido de elución, son adecuados los caudales de 3 a 10, preferiblemente 5 a 7, partes en volumen de líquido de elución por 1 parte en volumen de resina adsorbente por hora.

De forma ventajosa, la elución se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de la temperatura ambiente hasta aproximadamente 60ºC, preferiblemente a temperatura ambiente. Si se desea, el caudal se regula trabajando a una presión ligeramente elevada, p.ej. a una sobrepresión de hasta 0,2 bares (respecto de la presión atmosférica), y el eluato se recoge en varias fracciones. El contenido de retroesteroide sustituido con 11\beta-hidroxilo deseado y opcionalmente el contenido de los retroesteroides sin sustituir en la posición 11 correspondientes en las fracciones de eluato individuales se puede determinar de una manera conocida mediante HPLC.

Tras la elución, inicialmente se obtiene una fracción preliminar prácticamente exenta de esteroides, cuya cantidad corresponde en general a aproximadamente un volumen de lecho. En el caso de que la etapa de lavado intermedia e) se haya realizado, la primera fracción obtenida cuando se comienza el proceso de elución puede contener ya cantidades significativas del retroesteroide sustituido con 11\beta-hidroxilo. Sin embargo, la mayor parte de los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo, por ejemplo entre el 80% y el 99% de los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo presentes en el sobrenadante de partida, está en las fracciones de eluato principales subsiguientes, cuya cantidad es generalmente 2 a 4 volúmenes de lecho. En general, solamente hay indicios de esteroides en las fracciones posteriores. Si se obtienen fracciones sucesivas que todavía tienen un contenido significativo de esteroides, éstas se pueden combinar con el eluato principal que contiene retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo para su procesamiento
posterior.

La columna adsorbente se puede regenerar posteriormente lavándola con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua.

El eluato principal separado de la resina adsorbente de la manera descrita previamente contiene los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo. Si se desea, el volumen del eluato se puede reducir adicionalmente de una manera conocida, p.ej. mediante evaporación, para obtener un concentrado sustancialmente exento de disolvente orgánico. Típicamente, el retroesteroide sustituido con 11\beta-hidroxilo precipita del eluato concentrado. De forma alternativa, el volumen de concentrado de eluato se puede reducir adicionalmente hasta que los retroesteroides sustituidos con 11\beta-hidroxilo se obtienen como un material sólido. Típicamente, el compuesto retroesteroide precipitado se aísla mediante filtración y se puede lavar adicionalmente con agua. Tras el secado, el material sólido se puede usar directamente para las reacciones de transformación posteriores sin la necesidad de una purificación adicional. Sin embargo, si se desea, el compuesto obtenido se puede disolver de nuevo en un disolvente orgánico adecuado y cristalizarlo a partir suyo. De forma alternativa, la purificación adicional del compuesto se puede llevar a cabo mediante cromatografía por desorción súbita.

11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-esteroides (11\beta-hidroxi-retroesteroides) de fórmula IV: Rendimiento, identificación y uso

El rendimiento de los 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmula IV obtenidos en el proceso de la invención variará dependiendo de las condiciones de incubación y de fermentación empleadas, pero en general el rendimiento del producto deseado al final del proceso de fermentación es mayor de alrededor del 40%, preferiblemente mayor de alrededor del 50%, aún más preferiblemente mayor del 60%, y lo más preferiblemente más del 70% del rendimiento teórico basado en la cantidad de material de partida. Una persona experta en la técnica puede, con experimentación rutinaria, seleccionar las condiciones óptimas, que incluyen la elección de la mejor cepa bacteriana y la concentración de sustrato óptima para un material de partida dado, para proporcionar un rendimiento óptimo.

Incluyendo los procesos de aislamiento preferidos de los 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmulas IV y V de la carga de fermentación y las etapas de purificación adicionales que usan la cromatografía por desorción súbita, el rendimiento total de los 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmula IV y V es de alrededor del 40% a alrededor del 60% del rendimiento teórico basado en la cantidad de material de partida.

La separación y la identificación de los productos de fermentación (es decir, los 11\beta-hidroxi retroesteroides de fórmulas IV y V) se puede llevar a cabo mediante cromatografía en capa fina. Se consigue una reacción coloreada adecuada para la identificación pulverizando con ácido sulfúrico concentrado seguido por un 3 por ciento de vainillina en etanol. Los diversos productos esteroides dan con ácido sulfúrico una reacción coloreada al calentar. La coloración con pulverización de vainillina en etanol es también característica. De forma alternativa, los productos de fermentación se pueden identificar y también cuantificar mediante análisis de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento).

Los 11\beta-hidroxi-retroesteroides de fórmulas IV y V obtenidos llevando a cabo la etapa de fermentación del proceso representan intermedios preferidos para la síntesis de compuestos retroesteroides nuevos con sustituyentes en la posición 11 que muestran actividad progestacional y/o anti-progestacional.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención con más detalle.

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Sección experimental Experimental 1. Síntesis de eductos (no forma parte de la invención) 1.1 Síntesis de 1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona

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Se convierte didrogesterona (9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona) disponible comercialmente de fórmula I-1 en la 1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona correspondiente (1,2-metilen-didrogesterona) de fórmula 1-3 mediante deshidrogenación y reacción posterior con metiluro de dimetilsulfoxonio como se describió en la patente de EE.UU. nº 3.937.700.

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1.2 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (9\beta,10\alpha-progesterona)

19

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Se convierte didrogesterona (9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona) disponible comercialmente de fórmula I-1 en la 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona correspondiente (9\beta,10\alpha-progesterona) de fórmula 1-3 en condiciones reductoras.

Se hidrogenó una suspensión de 0,75 g de Pd/CaCO_{3} (5% de Pd) en 100 ml de tolueno con H_{2}. Después se añadió una disolución de 50 g de didrogesterona (160 mmoles) en 550 ml de tolueno; los residuos de didrogesterona se añadieron aclarando con porciones de 2x 50 ml de tolueno. La hidrogenación se llevó a cabo con agitación enérgica hasta que se absorbieron 3,6 l de H_{2} (aprox. 1 h). La suspensión se filtró por succión a través de tierra de diatomeas y se volvió a lavar con tolueno. El disolvente se eliminó en vacío, y el residuo resultante se redisolvió en aprox. 90 ml de diclorometano (DCM). El producto se cristalizó mediante la adición de 900 ml de hexano caliente. Los cristales formados se extrajeron mediante filtración por succión y se volvieron a lavar con 100 ml de un 10% de DCM/hexano. El secado al vacío dio lugar a 36,9 g de (I-3) ([\alpha]D_{20} = -60 (c=1, CHCl_{3})). El disolvente se eliminó completamente del licor madre y el residuo (aprox. 13 g) se disolvió en aproximadamente 20 ml de DCM. La cristalización se inició mediante la adición de 150 ml de hexano. Después de la filtración por succión y del lavado, se obtuvieron 7,3 g de cristales secundarios de (I-3). Rendimiento total: 44,2 g de (I-3) (88%).

1.3 Síntesis de 17\alpha-etoxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona

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La 9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona (9\beta,10\alpha-progesterona) de fórmula I-3 obtenida en el Ejemplo 1.2 se convierte después en la 17\alpha-etoxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona correspondiente de fórmula 1-5 mediante una reacción en múltiples etapas como se describió en la sección general.

1.4 Síntesis de 17\alpha-etoxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona

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La 1,2-metilen-didrogesterona (obtenida en el Ejemplo 1.2) de fórmula I-2 se convierte en la 17\alpha-etoxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona correspondiente de fórmula 1-6 según los protocolos expuestos en el Ejemplo 1.2 y 1.3 anteriormente.

1.5 Síntesis de 18-metil-9\beta,10\alpha-androst-4-en-3,17-diona

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La didrogesterona (9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona) disponible comercialmente de fórmula I-1 se convierte en la 18-metil-9\beta,10\alpha-androst-4-en-3,17-diona correspondiente (des-acetil-9\beta,10\alpha-progesterona) de fórmula I-7 mediante una secuencia de reducción, oxidación y eliminación seguida por una ozonolisis de la 18-metil-9\beta,10\alpha-pregna-4,17(20)-dien-3-ona intermedia como se describió en la sección general.

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2. Biotransformación con Amycolatopsis mediterranei Detección del educto y del producto

El curso o el resultado de la reacción de fermentación se puede monitorizar mediante análisis de HPLC de muestras tomadas del medio de fermentación o de muestras diluidas tomadas después de la extracción del producto.

La cromatografía se realizó mediante el uso de un aparato (de Shimadzu) equipado con una bomba LC-10 AT VP, un detector de longitud de onda UV-VIS SPD-10 A VP, un sistema de control SCL-10 A VP, un organizador de disolventes FCV-10 10 AL VP y un muestreador automático SIL-10 AD-VP. Los esteroides y los productos de la transformación se separaron mediante el uso de una columna ET 250/4 Nucleosil 120-5 de fase inversa de C18 (Machery & Nagel) y un sistema de disolventes de metanol/agua (75:25, en volumen). Las condiciones de operación fueron un volumen de muestra de 20 \mul, un caudal de 0,5 ml/min, detección UV a 298 nm y una presión de alrededor de 92 bares.

Medio nutritivo

Para el cultivo de Amycolatopsis mediterranei se usó un medio acuoso que contenía 80 g/l de glucosa, 2 g/l de extracto de levadura, 1,3 g/l de K_{2}HPO_{4} x 3 H_{2}O y 1 g/l de MgSO_{4} x 7 H_{2}O. El valor de pH se ajustó a pH 7,0 - 7,2 por medio de HCl 0,1 M. En los volúmenes mayores (es decir, por encima de 5 l) no se ajustó el pH; el valor de pH del medio fue de alrededor de 7,5 sin ajuste. Los medios se esterilizaron a 121ºC durante al menos 20 minutos (dependiendo del volumen).

2.1 Biotransformación de didrogesterona con LS30 de Amycolatopsis mediterranei (volumen de cultivo pequeño)

Se transfirieron colonias bacterianas de LS30 de Amycolatopsis mediterranei de placas de agar y se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml mediante el uso de 100 ml del medio nutritivo. El cultivo se incubó en un agitador rotatorio que funcionaba a 200 rpm y 30ºC (Certomat, B. Braun, Alemania). Después de 3 - 4 días de cultivar en estas condiciones, el precultivo así obtenido que contenía las bacterias en forma de agregados (es decir, en forma agregada) se homogeneizó suavemente mediante el uso de un homogeneizador Stomacher. Se usó un inóculo del 1-10% (vol/vol), típicamente un inóculo del 2% (vol/vol), del medio de precultivo homogeneizado para sembrar matraces de 500 ml que contenían 100 ml del mismo medio nutritivo. El cultivo se incubó de nuevo como se describió anteriormente durante 46 - 50 horas. Después, se añadieron 15 mg de didrogesterona en forma de una disolución de 20 mg/ml en DMSO al segundo medio de cultivo de forma que la concentración inicial del esteroide fue de un 0,015% (en peso). La suspensión resultante se incubó a 30ºC y 200 rpm durante 46 - 50 horas como se describió anteriormente para provocar la hidroxilación de didrogesterona. Después, el medio de cultivo se centrifugó (20 min a 17.000 x g). Las alícuotas del sobrenadante se analizaron mediante HPLC. El sobrenadante se extrajo dos veces con ¼ de volumen de acetato de etilo con la adición de NaCl sólido. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron con NaSO_{4}, y se analizaron mediante HPLC como se indicó anteriormente. Los resultados de tres experimentos independientes se muestran en la tabla 1 siguiente:

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TABLA 1 Rendimiento de la fermentación de didrogesterona en matraces Erlenmeyer

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2.2 Biotransformación de didrogesterona con LS30 de Amycolatopsis mediterranei (carga de fermentador grande)

Se transfirieron colonias bacterianas de LS30 de Amycolatopsis mediterranei de placas de agar y se cultivaron en un matraz Erlenmeyer de 500 ml mediante el uso de 100 ml del medio nutritivo. Los cultivos se incubaron en un agitador rotatorio que funcionaba a 200 rpm y 30ºC. Después de 4 días de cultivar en estas condiciones, se usaron alícuotas de 1 ml del primer precultivo para sembrar dos matraces de 500 ml que contenían 80 ml del medio nutritivo (= cultivo de inoculación). Los cultivos se incubaron de nuevo como se describió anteriormente durante 28 - 32 horas. Después, los precultivos de 1 día se combinaron y se añadieron al fermentador estéril (tamaño: 15 l, B. Braun, Alemania) llenado con 6 - 8 l del medio nutritivo esterilizado (el volumen de inoculación se ajustó a alrededor de un 2% vol/vol del volumen del fermentador). Las bacterias se dejaron crecer durante 40 - 44 horas con la adición opcional de PPG 2000 como agente antiespumante a 30ºC con aireación (3 l/min en el fermentador de 15 l) y agitación (300 rpm en el fermentador de 15 l al comienzo). La velocidad del agitador se ajustó opcionalmente a velocidades más elevadas para obtener una saturación de O_{2} relativa (pO_{2}/pO_{2,max}) de al menos un 50%. Después, se inició la adición de didrogesterona: La didrogesterona se añadió de manera continua a lo largo del siguiente periodo de transformación en forma de una disolución de 20 mg/ml en DMSO a una concentración generalmente de alrededor de 3 - 3,5 mg por litro de medio nutritivo por hora de cultivo hasta que se añadió la cantidad predeterminada de didrogesterona (véase la tabla 2 con los valores exactos) y después se paró la transformación, o la cantidad total de didrogesterona se añadió en 1 hora y después la transformación se continuó durante 46 - 50 horas. Después de un periodo de tiempo fijado, la transformación se paró y las bacterias se separaron del caldo de fermentación mediante microfiltración. El sobrenadante obtenido se analizó mediante HPLC. La didrogesterona hidroxilada se aisló del sobrenadante como se describe más adelante en el Ejemplo 3. Los resultados de cuatro fermentaciones independientes se resumen en la tabla 2 siguiente:

TABLA 2 Rendimiento de la fermentación de didrogesterona

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2.3 Biotransformación de 17-etoxi-1,2-metilen-didrogesterona con LS30 de Amycolatopsis mediterranei A) Fermentación en un matraz de 500 ml

De una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2.1 mediante el uso de 15 mg de 17-etoxi-1,2-metilen-didrogesterona como educto, se obtuvieron 4 mg de 17-etoxi-11-hidroxi-1,2-metilen-didrogesterona (rendimiento: 26%).

^{1}H RMN (501 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 0,87 (s, 3 H) 0,89 - 0,93 (m, 1 H) 1,13 - 1,18 (m, 3 H) 1,30 - 1,36 (m, 1 H) 1,39 (s, 3 H) 1,40 - 1,49 (m, 1 H) 1,69 - 1,83 (m, 3 H) 1,87 - 1,94 (m, 1 H) 1,95 - 2,01 (m, 1 H) 2,11 - 2,17 (m, 4 H) 2,39 - 2,47 (m, 1 H) 2,49 - 2,55 (m, 1 H) 2,59 (dd, J=14,5, 4,4 Hz, 1 H) 2,70 - 2,77 (m, 1 H) 2,98 - 3,06 (m, 1 H) 3,39 - 3,47 (m, 1 H) 4,70 - 4,75 (m, J=2,4 Hz, 1 H) 5,51 - 5,53 (m, 1 H) 6,08 - 6,10 (m, 2 H)

^{13}C RMN (126 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 13,8 (q, 1 C) 15,6 (q, 1 C) 16,4 (q, 1 C) 23,3 (t, 1 C) 24,2 (t, 1 C) 25,4 (d, 1 C) 26,5 (q, 1 C) 26,7 (d, 1 C) 28,6 (q, 1 C) 34,9 (d, 1 C) 36,9 (s, 1 C) 37,9 (t, 1 C) 44,2 (d, 1 C) 47,6 (s, 1 C) 48,1 (d, 1 C) 59,9 (t, 1 C) 69,3 (d, 1 C) 95,8 (s, 1 C) 120,3 (d, 1 C) 127,2 (d, 1 C) 139,0 (d, 1 C) 156,2 (s, 1 C) 198,3 (s, 1 C) 210,3 (s, 1 C).

B) Fermentación en un fermentador de 15 l

De una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2.2, se usó 17-etoxi-1,2-metilen-didrogesterona como educto para obtener el derivado de 17-etoxi-11-hidroxi-1,2-metilen-didrogesterona correspondiente:

Se transfirieron colonias bacterianas de LS30 de Amycolatopsis mediterranei de placas de agar y se cultivaron en un matraz Erlenmeyer de 500 ml mediante el uso de 100 ml de medio nutritivo. Los cultivos se incubaron en un agitador rotatorio que funcionaba a 200 rpm y 30ºC. Después de 4 días de cultivar en estas condiciones, se usaron alícuotas de 1 ml del primer medio de precultivo para sembrar dos matraces de 500 ml que contenían 80 ml del medio nutritivo (= cultivo de inoculación). Los cultivos se incubaron de nuevo como se describió anteriormente durante 24 - 30 horas. Después, los precultivos de 1 día se combinaron y se añadieron al fermentador estéril (tamaño: 15 l) llenado con 8 l del medio nutritivo esterilizado. Las bacterias se dejaron crecer durante 44 - 50 horas con la adición opcional de PPG 2000 como agente antiespumante a 30ºC con aireación (3 l/min) y agitación (290 rpm). La velocidad del agitador se ajustó a velocidades más elevadas para obtener una saturación de O_{2} relativa (pO_{2}/pO_{2,max}) de al menos un 50%. Después, se añadieron continuamente 0,578 g de 17-etoxi-1,2-metilen-didrogesterona en forma de una disolución de 8 mg/ml en DMSO a una concentración de generalmente alrededor de 22,7 mg por hora de cultivo. Después de 24 - 28 horas de fermentación, el proceso se paró y las bacterias se separaron del caldo de fermentación mediante microfiltración. El sobrenadante obtenido se analizó mediante HPLC. El sobrenadante contuvo 0,187 g de 17-etoxi-11-hidroxi-1,2-metilen-didrogesterona, que correspondió a un rendimiento del 31%. La 17-etoxi-11-hidroxi-1,2-metilen-didrogesterona se aisló del sobrenadante según el procedimiento descrito más adelante en el Ejemplo 3.

2.4 Biotransformación de 17-etoxi-didrogesterona con LS30 de Amycolatopsis mediterranei

De una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2.1 mediante el uso de 10, 15 ó 20 mg de 17-etoxi-didrogesterona como educto, se obtuvo la 17-etoxi-11-hidroxi-didrogesterona correspondiente con un rendimiento del 32, 37 y 30%, respectivamente.

^{1}H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 0,86 (s, 3 H) 1,15 (t, J=6,9 Hz, 3 H) 1,28 (s, 3 H) 1,37 - 1,52 (m, 1 H) 1,64 - 1,94 (m, 5 H) 2,15 (s, 3 H) 2,27 - 2,68 (m, 6 H) 2,70 - 2,79 (m, 1 H) 2,97 - 3,07 (m, 1 H) 3,39 - 3,52 (m, 1 H) 4,48 - 4,54 (m, 1 H) 5,70 - 5,73 (m, 1 H) 6,18 - 6,26 (m, 2 H)

^{13}C RMN (101 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 15,6 (q, 1 C) 16,3 (q, 1 C) 21,5 (q, 1 C) 23,3 (t, 1 C) 24,2 (t, 1 C) 26,4 (q, 1 C) 33,8 (t, 1 C) 35,1 (d, 1 C) 35,4 (t, 1 C) 35,7 (s, 1 C) 38,0 (d, 1 C) 44,7 (t, 1 C) 47,0 (s, 1 C) 50,1 (d, 1 C) 59,8 (t, 1 C) 68,2 (d, 1 C) 95,7 (s, 1 C) 124,1 (d, 1 C) 127,0 (d, 1 C) 140,6 (d, 1 C) 162,5 (s, 1 C) 199,1 (s, 1 C) 210,3 (s, 1 C).

2.5 Biotransformación de 18-metil-9\beta,10\alpha-androst-4-en-3,17-diona con LS30 de Amycolatopsis mediterranei

De una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2.1 mediante el uso de 10, 15 ó 20 mg de 18-metil-9\beta,10\alpha-androst-4-en-3,17-diona como educto, se obtuvo la 18-metil-11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-androst-4-en-3,17-diona correspondiente con un rendimiento del 27, 39 y 36%, respectivamente.

^{13}C RMN (126 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 15,4 (q, 1 C) 22,0 (t, 1 C) 22,3 (q, 1 C) 27,2 (t, 1 C) 29,0 (t, 1 C) 31,1 (d, 1 C) 33,5 (t, 1 C) 35,1 (t, 1 C) 37,8 (t, 1 C) 38,2 (s, 1 C) 38,3 (t, 1 C) 43,0 (d, 1 C) 47,3 (s, 1 C) 55,0 (d, 1 C) 68,6 (d, 1 C) 124,4 (d, 1 C) 170,7 (s, 1 C) 199,2 (s, 1 C) 219,4 (s, 1 C).

2.6 Biotransformación de didrogesterona con DSM 43304 de Amycolatopsis mediterranei

Para demostrar que otras cepas de Amycolatopsis mediterranei son capaces de transformar los retroesteroides de fórmula general (I) en sus compuestos 11-hidroxilados correspondientes, se repitió la fermentación descrita en el Ejemplo 2.1 con cepas disponibles de colecciones de cultivos públicas.

Se transfirieron colonias bacterianas de DSM 43304 de Amycolatopsis mediterranei de placas de agar y se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml mediante el uso de 100 ml del medio nutritivo. El cultivo se incubó en un agitador rotatorio que funcionaba a 200 rpm y 30ºC. Después de 2 días de incubación, se añadieron 15 mg de didrogesterona en forma de una disolución de 20 mg/ml en DMSO al medio de cultivo. La disolución resultante se fermentó a 30ºC y 200 rpm durante 46 - 50 horas como se describió anteriormente para provocar la hidroxilación de la didrogesterona. Después, el medio de cultivo se centrifugó (20 min a 17.000 x g). Las alícuotas del sobrenadante se analizaron mediante HPLC. Después, el sobrenadante se extrajo dos veces con ¼ del volumen de acetato de etilo y la adición de NaCl sólido. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron con NaSO_{4}, y se analizaron mediante HPLC como se indicó anteriormente. Los experimentos independientes produjeron alrededor de 5,7 mg de la 11-OH-didrogesterona deseada (rendimiento: 36% sin optimización).

3. Aislamiento de la 11\beta-OH didrogesterona del medio de cultivo bacteriano

Se realizaron tres reacciones de fermentación individuales de didrogesterona en 22 l, 8,8 l y 8,8 l como se describió en el Ejemplo 2.2. En conjunto, se añadieron 5,88 g de didrogesterona al medio nutritivo. Después de la finalización de la reacción de fermentación (después de alrededor de 47 horas), el medio que contenía la 11\beta-hidroxi didrogesterona deseada se purificó inmediatamente mediante microfiltración (tamaño de poro de la membrana 0,2 - 0,3 \mum). Mediante análisis de HPLC, se determinó que el rendimiento de 11\beta-OH didrogesterona en las tres cargas de fermentación fue de alrededor de 28 a 64%, por lo que el valor más bajo fue de una carga de fermentación con un rendimiento excepcionalmente bajo. El filtrado obtenido (= sobrenadante) de las tres cargas se combinó para producir 37,9 l de material de sobrenadante que contenía alrededor de 0,07 mg/ml de 11\beta-OH didrogesterona.

3.1 Adsorción del contenido de esteroides del sobrenadante de fermentación en una resina adsorbente de éster poliacrílico semipolar

Se cargó una columna que tenía una altura de 27 cm y un diámetro de 6,5 cm con 1000 ml de una resina adsorbente de éster poliacrílico semipolar (=Amberlite XAD-7 HP^{TM}, fabricada por Rohm and Haas) hinchada con agua. La columna se equilibró con 4 volúmenes de lecho (VL) de etanol del 99% y 5 VL de agua. Se hicieron pasar 37,9 litros de sobrenadante de fermentación (el contenido de materia seca (=MS) y también el contenido de 11-hidroxi-didrogesterona, 9-hidroxi-didrogesterona y didrogesterona se determinaron por medio de HPLC) a través de la columna a temperatura ambiente y a un caudal de alrededor de 110 ml/min (=aproximadamente 6,5 VL por hora). El contenido de esteroides de la disolución de fermentación se adsorbió completamente en la columna de resina adsorbente semipolar. El contenido de esteroides del efluente de la columna se determinó mediante HPLC, y se comprobó que el efluente estaba prácticamente exento de esteroides. Se desechó el producto residual.

3.2 Lavado alcalino de la columna de resina adsorbente cargada

La columna de resina adsorbente cargada con esteroides se lavó con 5 l de una disolución acuosa de hidróxido sódico del 2% que tenía un valor de pH de aproximadamente 14. Con este propósito, el agua de lavado alcalina se hizo pasar a través de la columna a un caudal de 90 - 95 ml/min (=aproximadamente 5,5 - 5,7 VL por hora). El contenido de los diferentes retroesteroides del efluente del líquido de lavado se analizó mediante HPLC. El análisis demostró que se arrastró menos de un 1% de los esteroides totales cargados en la columna durante la fase de lavado.

3.3 Lavado intermedio de la columna de resina adsorbente cargada

La columna de resina adsorbente cargada con esteroides y lavada se lavó con 5 l de agua. Con este propósito, se hizo pasar agua a través de la columna a un caudal de 95 ml/min (=aproximadamente 5,7 VL por hora). El contenido de los diferentes retroesteroides del efluente del líquido de lavado se analizó mediante HPLC. El análisis demostró que prácticamente no se arrastró ninguna cantidad de los esteroides totales cargados en la columna durante la fase de lavado intermedia.

3.4 Desorción de los estrógenos conjugados de la columna de resina adsorbente lavada

Se pasaron 6 l del líquido de elución (etanol del 99%) a través de la columna a temperatura ambiente y a un caudal de aproximadamente 95 ml/min. El eluato que salía se recogió en 6 fracciones. Cada fracción fue de alrededor de 1000 ml (=aproximadamente 1 VL). El contenido de los retroesteroides individuales en las fracciones se analizó mediante HPLC. Aproximadamente un 92% de la cantidad total de 11\beta-OH didrogesterona adsorbida en la columna estuvo contenida en las fracciones 2 y 3. Opcionalmente, las fracciones restantes se pueden devolver a la etapa b) del método después de haber eliminado mediante destilación el contenido de disolvente.

El contenido de materia seca en % en peso y los contenidos respectivos de 11-hidroxi-didrogesterona, 9-hidroxi-didrogesterona y didrogesterona determinados mediante HPLC se proporcionan en la tabla 3 siguiente (en la página siguiente).

3.5 Regeneración de la columna de resina adsorbente

Para regenerar la columna, se lavó con 5 l (= 5 VL) de agua. La columna se puede cargar y regenerar muchas veces, por ejemplo hasta 40 veces.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Análisis de cromatografía de adsorción

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3.6 Procesamiento adicional de las fracciones de eluato

Las fracciones de eluato 1 a 4 (E1 = 970,95 g, E2 = 813,82 g, E3 = 764,80 g, E4 = 765,35 g) se mezclaron y se redujeron de 3314,92 g (MS = 0,26%) a 355,12 g mediante vaporización a 60ºC. El esteroide precipitó de la suspensión obtenida (MS del sobrenadante = 2,0%) y se aisló mediante filtración por succión (rendimiento: alrededor de 2,2 g de precipitado seco). A partir del sobrenadante restante se pudo obtener un segundo precipitado mediante una reducción del volumen adicional hasta 50,0 g mediante vaporización.

Los precipitados combinados (alrededor de 4 g) se purificaron adicionalmente mediante cromatografía por desorción súbita (eluyente: acetato de etilo:ciclohexano 2:1 que cambiaba hasta acetato de etilo puro). Se pudo identificar la impureza contenida en el precipitado original como 9-hidroxi-didrogesterona. Finalmente, se obtuvieron 2,15 g de 11-hidroxi-didrogesterona (rendimiento total: 35%).

^{13}C RMN (101 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 14,7 (q, 1 C) 21,7 (q, 1 C) 22,6 (t, 1 C) 24,8 (t, 1 C) 31,2 (q, 1 C) 33,7 (t, 1 C) 35,2 (d, 2 C) 35,7 (s, 1 C) 43,4 (s, 1 C) 46,2 (t, 1 C) 49,7 (d, 1 C) 49,9 (d, 1 C) 63,6 (d, 1 C) 67,6 (d, 1 C) 124,2 (d, 1 C) 126,9 (d, 1 C) 140,2 (d, 1 C) 162,2 (s, 1 C) 199,1 (s, 1 C) 208,6 (s, 1 C)

^{1}H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d): \delta ppm 0,9 (s, 3 H) 1,2 (s, 3 H) 1,4 - 1,5 (m, 1 H) 1,7 - 2,0 (m, 6 H) 2,2 (s, 3 H) 2,2 - 2,3 (m, 1 H) 2,3 - 2,4 (m, 2 H) 2,4 - 2,6 (m, 3 H) 2,7 (ddd, J=12,0, 5,8, 5,6 Hz, 1 H) 4,4 - 4,5 (m, 1 H) 5,7 - 5,7 (m, 1 H) 6,2 - 6,2 (m, 2 H).

La anterior descripción y los ejemplos se han expuesto simplemente para ilustrar la invención, y no pretenden ser limitantes. Debido a que las personas expertas en la técnica pueden idear modificaciones de las realizaciones descritas que incorporan el espíritu y la esencia de la invención, se debería considerar que la invención incluye en líneas generales todas las variaciones que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

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\bullet Documento BE 577.615

\bullet Documento BE 652.597

\bullet Documento EP 0 028 309

\bullet Documento EP 0 152 138 B1 (= US 4.601.855)

\bullet Documento EP 0 558 119 B1 (= US 5.304.291)

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(Formulario pasa a página siguiente)

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27

Claims (20)

1. Uso de un microorganismo bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei para la transformación de un compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide de Fórmula general (I)

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28

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en la que

R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o

R4 es un grupo \beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno,

en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el microorganismo bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei es una cepa seleccionada del grupo que consiste en LS30, DSM 43304, DSM 40773 y DSM 46096.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que la cepa es LS30 de Amycolatopsis mediterranei depositada como DSM 17416.

4. Cepa bacteriana LS30 de Amycolatopsis mediterranei depositada como DSM 17416.

5. Un proceso para la transformación in vitro microbiana de un compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide de Fórmula general (I)

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29

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en la que

R1 y R4 juntos forman un oxígeno, o

R4 es un grupo \beta-acetilo y R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno;

en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente, cuyo proceso comprende poner en contacto un compuesto de Fórmula (I) en un medio de fermentación con un miembro bacteriano de la especie Amycolatopsis mediterranei capaz de realizar la transformación de un compuesto de Fórmula (I) en su análogo de 11\beta-hidroxilo correspondiente.

6. Un proceso para la transformación in vitro microbiana según la reivindicación 5, en el que el compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide es de Fórmula general (II)

30

en la que

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}); y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno.

7. Un proceso para la transformación in vitro microbiana según la reivindicación 6, en la que el compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide es de Fórmula general (III)

31

en la que

R1 es hidrógeno o -O-alquilo(C_{1}-C_{4}); y

R2 y R3 son ambos hidrógeno o juntos forman un grupo metileno.

8. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el miembro de la especie Amycolatopsis mediterranei es una cepa seleccionada del grupo que consiste en LS30, DSM 43304, DSM 40773 y DSM 46096.

9. Un proceso según la reivindicación 8, en el que la cepa es LS30 de Amycolatopsis mediterranei depositada como DSM 17416.

10. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que al menos el proceso de transformación de la fermentación se lleva a cabo en condiciones aeróbicas, en particular con una saturación de O_{2} relativa pO_{2}/pO_{2max} del medio de fermentación de alrededor del 5% a alrededor del 95%, preferiblemente de alrededor del 20% a alrededor del 80%, mas preferiblemente de alrededor del 30% a alrededor del 75%, y lo más preferiblemente de alrededor del 40% a alrededor del 70%.

11. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que las bacterias Amycolatopsis mediterranei están en la fase intermedia o tardía de su período de crecimiento exponencial cuando la transformación se inicia mediante la adición del compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide al medio.

12. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que el compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide se añade en una cantidad de alrededor de 50 mg/l a alrededor de 500 mg/l, preferiblemente de alrededor de 100 mg/l a alrededor de 250 mg/l de medio de fermentación, y lo más preferiblemente en una cantidad de alrededor de 150 mg/l de medio de fermentación.

13. Un proceso según la reivindicación 12, en el que la cantidad total del compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide se añade de una vez al comienzo del proceso de transformación o a lo largo de un periodo de 1 a 5 horas al comienzo del proceso de transformación.

14. Un proceso según la reivindicación 12, en el que la cantidad del compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide se añade continuamente al medio de fermentación a lo largo del periodo de transformación completo.

15. Un proceso según la reivindicación 14, en el que el compuesto 9\beta,10\alpha-esteroide se añade en una concentración de 1 a 20 mg por hora de cultivo y por litro de medio de fermentación, preferiblemente en una concentración de 2 a 5 mg por hora de cultivo y por litro de medio de fermentación.

16. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, en el que el análogo de 11\beta-hidroxilo se aísla del medio de fermentación mediante un proceso que comprende las etapas de

a)

obtener el sobrenadante del medio de fermentación opcionalmente exento de células bacterianas, residuos bacterianos, sustancias mucilaginosas y sólidos,

b)

poner en contacto un material de sobrenadante seleccionado del grupo que consiste en el sobrenadante obtenido en la etapa a), un concentrado formado reduciendo el volumen de dicho sobrenadante, y una fracción retenida obtenida mediante filtración en membrana de dicho sobrenadante, con una cantidad de una resina adsorbente polimérica semipolar no iónica suficiente para la adsorción del análogo de 11\beta-hidroxilo contenido en el material de sobrenadante, por lo que se obtiene una resina adsorbente polimérica semipolar no iónica cargada con el análogo de 11\beta-hidroxilo, y después separar la resina adsorbente cargada del resto del material de sobrenadante;

c)

lavar la resina adsorbente cargada con un líquido de lavado acuoso alcalino que tiene un valor de pH de al menos 12,0, preferiblemente de 12,5 a 14;

d)

realizar opcionalmente una etapa de lavado intermedia, en la que la resina adsorbente cargada se lava con agua; y

e)

poner en contacto la resina adsorbente lavada con una cantidad de un líquido de elución suficiente para la desorción del análogo de 11\beta-hidroxilo adsorbido en ella, y dicho líquido de elución comprende al menos un disolvente orgánico miscible con agua seleccionado del grupo que consiste en éteres miscibles con agua, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, o una mezcla de agua que se ha alcalinizado opcionalmente y al menos un disolvente orgánico miscible con agua seleccionable del grupo que consiste en éteres miscibles con agua, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, y

f)

separar un eluato que contiene el análogo de 11\beta-hidroxilo de la resina adsorbente, y opcionalmente concentrar el eluato mediante reducción del volumen.

17. Un proceso según la reivindicación 16, en el que dicha resina adsorbente polimérica semipolar no iónica es una resina macroporosa de éster de ácido policarboxílico, preferiblemente una resina reticulada de éster de ácido policarboxílico alifático, y más preferiblemente una resina reticulada de éster de ácido policarboxílico que tiene una estructura macrorreticular.

18. Un proceso según la reivindicación 16 ó 17, en el que en la etapa e) el líquido de elución comprende etanol.

19. Un compuesto 11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-esteroide de fórmula general (V)

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32

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en la que

a)

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -O-alquilo(C_{1}-C_{4}), y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

\quad

R2 y R3 juntos forman un grupo metileno, o

b)

R1 se selecciona del grupo que consiste en -O-alquilo(C_{1}-C_{4}) y -O-CO-alquilo(C_{1}-C_{4}), y

\quad

R2 y R3 representan ambos hidrógeno; o

c)

R1 es -OH,

\quad

R2 y R3 representan ambos hidrógeno, y

\quad

el compuesto es un 4,6-dieno.

20. Un compuesto 11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-esteroide según la reivindicación 19, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en

11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

11\beta-17\alpha-dihidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

11\beta-17\alpha-dihidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4,6-dien-3,20-diona,

11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona,

17\alpha-etoxi-11\beta-hidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona, y

11\beta-17\alpha-dihidroxi-1,2-metilen-9\beta,10\alpha-pregna-4-en-3,20-diona.