ES2324766T3 - Inhibidores de spla2 contra la arteriosclerosis. - Google Patents

Inhibidores de spla2 contra la arteriosclerosis. Download PDF

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Kohji c/o Shionogi & Co. Ltd. HANASAKI
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Abstract

Uso de un compuesto inhibidor de las sPLA2 de los grupos V o X representado por la fórmula general (I):** ver fórmula** donde el anillo A es:** ver fórmula** donde cualquiera de R 1 y R 2 es un grupo de fórmula: -(L 1 )-(grupo ácido) donde L 1 es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L 1 )-(grupo ácido) donde L 1 es como se ha definido anteriormente; y cada uno de R 3 y R 4 es independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un substituyente no interfiriente; y donde -B- es un grupo entre (e)-(h): ** ver fórmula** donde R 5 es un substituyente seleccionado entre el grupo consistente en (j) un grupo alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C 2-C 20 o carbocíclico o un grupo heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de fórmula: -(L 2 )-R 8 en el que L 2 es un grupo de enlace divalente de 1-18 átomos seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno, un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y R 8 es un grupo seleccionado entre (j) y (k); R 6 es un átomo de hidrógeno, un halógeno, un alquilo C1-C3, un cicloalquilo C3-C4, un cicloalquenilo C3-C4, un alquiloxi C1-C3 o un alquiltío C1-C3; R 7 es un átomo de hidrógeno o un substituyente no interfiriente; R A es un grupo de fórmula: ** ver fórmula** donde cada uno de R 9 y R 10 es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C1-C3 o un halógeno; cada uno de X e Y es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es -NH2 o -NHNH2; R B es -CONH 2 o -CONHNH 2; y el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un anillo de benceno; a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o (f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c); o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C1-C6 del mismo, para la fabricación de un medicamento para suprimir la degeneración de las lipoproteínas del suero y/o tratar o prevenir la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir una enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.

Description

Inhibidores de sPLA_{2} contra la arteriosclerosis.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el uso de inhibidores de la fosfolipasa A_{2} secretora del grupo V o X para la fabricación de un medicamento para suprimir la degeneración de las lipoproteínas séricas y/o para tratar o prevenir la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir la enfermedad isquémica basada en arteriosclerosis.
Técnica anterior
La arteriosclerosis es un término general que significa una patología en la que la pared arterial se engrosa y endurece. La lesión arteriosclerótica se clasifica patológicamente en los tres tipos siguientes: aterosclerosis, arteriosclerosis arteriolar y necrosis medial, y, entre ellos, se ha destacado la aterosclerosis en las causas de enfermedades isquémicas tales como el infarto de miocardio y el infarto cerebral. La hiperlipemia, que es una condición en la cual el nivel de lípidos séricos, tales como el colesterol y las grasas neutras en suero, está aumentado, está estrechamente asociada al desarrollo de aterosclerosis. Los lípidos séricos aparecen como lipoproteínas que forman complejos con una proteína. Concretamente, las lipoproteínas que contienen colesterol se clasifican dependiendo de la densidad en lipoproteína de muy baja densidad ("VLDL"), lipoproteína de baja densidad ("LDL"), lipoproteína de alta densidad ("HDL") y similares. Entre ellas, la LDL es captada por células de los tejidos periféricos a través del receptor de LDL y es responsable de la administración de colesterol a las células.
Las LDL en la fase inicial de la aterosclerosis se degeneran de cualquier modo para inducir lípidos peroxidados, con implicación de una mayor carga negativa de las partículas totales, composición alterada por fosfolipolisis y alteración estructural, disminución de tamaño (aumento de densidad) y similares, en comparación con las LDL normales (Yokode y col., Rinshokensa 44, 1052-1058 (2000)), y las LDL degeneradas son captadas por monocitos y macrófagos que se infiltran en los tejidos de la íntima vascular mediante receptores capturadores, depositando así gotitas oleosas de ésteres de colesterilo en las células espumosas y acelerando la formación de franjas grasas en asociación con los linfocitos T y el músculo liso vascular. A continuación, la patología continúa por interacción entre las células que residen en la franja grasa para formar lesiones rígidas que sobresalen en las luces vasculares, llamadas placas fibrosas, y se desarrolla entonces para producir aterosclerosis, que se asocia a calcificación y sucesos trombóticos, con aumento de los tejidos conectivos circundantes. Por otra parte, las HDL desempeñan un papel en el suministro de un exceso de colesterol de los tejidos periféricos al hígado y son responsables de la supresión del desarrollo de la arteriosclerosis. Así, en caso de que el nivel de HDL en sangre esté disminuido o de que la HDL esté degenerada, entonces las funciones de la HDL están disminuidas y el nivel de colesterol liberado en sangre aumenta, lo cual es uno de los factores etiológicos de la arteriosclerosis.
Como se ha mostrado anteriormente, la degeneración o la alteración cualitativa de las lipoproteínas tales como la LDL y la HDL son uno de los factores etiológicos mayores en el desarrollo de la arteriosclerosis. Como degeneración, se conoce la modificación oxidativa, donde las LDL oxidadas aumentan su carga negativa, disminuida, y aumentan su densidad. Se ha pensado que la modificación oxidativa es responsable del desarrollo de la patología arteriosclerótica, ya que se detectan las LDL oxidadas en las lesiones arterioscleróticas reales y las LDL artificialmente oxidadas inducen espumación del macrófago y activan las células para promover la producción de diversas citokinas.
Por otra parte, se ha visto que la composición de fosfolípidos en las LDL degeneradas está alterada (fosfolipolisis) y, por lo tanto, este descubrimiento ha centrado la atención en una enzima fosfolipolítica, la fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) como molécula responsable de la degeneración de LDL y HDL. Fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}; EC 3.1.1.4) es un término general que representa una enzima fosfolipolítica que hidroliza el enlace éster de 2-acilo de los 3-sn-fosfoglicéridos. Entre ellas, la PLA_{2} secretora (sPLA_{2}) representa moléculas de PLA_{2} que tienen un peso molecular inferior (13-18 kDa) y que se segregan extracelularmente y que se sabe incluyen ocho tipos de grupos IB, IIA, IID, IIE, IIF, V, X, y XII en humanos. Cualquiera de las especies moleculares contiene de 12 a 16 residuos de Cys en su estructura, que forman enlaces disulfuro intramoleculares, y contiene el centro activo conservado compuesto por residuos de His-Asp. También contienen el sitio común de unión a Ca^{2+} y requieren un nivel de Ca^{2+} de orden mM para expresar la actividad enzimática (Ishizaki y col., J. Biol. Chem. 274, 24973-24979 (1999); Suzuki y col., J. Biol. Chem. 275, 5785-5793 (2000); Six y col., Biochim. Biophys. Acta 1488, 1-19 (2000); y Gelb y col., J. Biol. Chem. 275, 39823-39826 (2000)). Se vio que la sPLA_{2} del Grupo IIA se expresaba en los músculos lisos vasculares y las células espumosas en lesiones arterioscleróticas humanas y se ha reconocido que la expresión guarda correlación con el desarrollo de arteriosclerosis (Elinder y col., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17, 2257-2263 (1997), y Menschikowski y col., Atherosclerosis 118, 173-181 (1995)). Además, se vio que en ratones transgénicos que expresan un alto nivel de sPLA_{2} del Grupo IIA humana aumentaba el nivel de LDL y disminuía el nivel de HDL y que tenían lesiones arterioscleróticas (Tietge y col., J. Biol. Chem. 275, 10077-10084 (2000)), así como que se producía un deterioro de la arteriosclerosis en comparación con ratones normales cuando se administraba una dieta rica en grasas (Ivandic y col., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19, 1284-1290 (1999)), por lo que la sPLA_{2} del Grupo IIA atrajo la atención en la contribución al desarrollo de la arteriosclerosis. Se ha visto también que las LDL tratadas con sPLA_{2} de veneno de abeja tienen una mayor carga negativa de la partícula total, una composición de fosfolípidos alterada y una mayor captación por los macrófagos (Aviram y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 185, 465-472 (1992)) y que tienen caracterizaciones muy similares a las LDL de pequeña densidad, que se consideran como uno de los factores de riesgo de las enfermedades isquémicas (Sartipy y col., J. Biol. Chem. 274, 25913-25920 (1999)). Además, se sabe que las HDL tratadas con sPLA_{2} de veneno de serpiente tienen un tamaño y una densidad alterados en asociación con la fosfolipolisis y que tienen una mayor captación por los hepatocitos (Collet y col., Biochim. Biophys. Acta 1043, 301-310 (1990)). Aunque entre las moléculas de sPLA_{2} humana la sPLA_{2} del grupo IIA tiene particularmente una potencia hidrolizante para los fosfolípidos de las lipoproteínas como se ha descrito anteriormente, se ha visto que la sPLA_{2} del grupo IIA es extremadamente más débil en cuanto a fosfolipolisis para la LDL que la sPLA_{2} del veneno de abeja (Hurt-Camejo y col., Curr. Opin. Lipidol. 11, 465-471 (2000)) y que es más potente en cuanto a fosfolipolisis para la HDL que para la LDL (Pruzanski y col., J. Lipid. Res. 39, 2150-2160 (1998)). A la vista de estos descubrimientos, especies moleculares de sPLA_{2} distintas de la sPLA_{2} del grupo IIA serían responsables del desarrollo de arteriosclerosis y no se sabe qué molécula de sPLA_{2} endógena sería responsable del desarrollo de arteriosclerosis, lo que muestra que se desconoce la actividad exacta de degeneración
de estas moléculas de sPLA_{2} sobre las lipoproteínas y sus perfiles exactos de expresión en la arteriosclerosis.
Se clonó sPLA_{2} del grupo X humana a partir de tejidos pulmonares fetales en 1997 en base a secuencias relacionadas con sPLA_{2} de la base de datos de ADN (Cupillard y col., J. Biol. Chem. 272, 15745-15752 (1997)). El gen de la sPLA_{2} del grupo X humana se localiza en el cromosoma 16, a diferencia de las otras sPLA_{2}. La enzima contiene 16 residuos de cisteína en la molécula y contiene todas las uniones disulfuro intramoleculares localizadas en posiciones características tanto de la sPLA_{2} del grupo IB como de la sPLA_{2} del grupo II (grupos IIA/IID/IIE/IIF). Adicionalmente, la enzima posee una estructura de extensión basada en el extremo carboxilo única de la sPLA_{2} del grupo II. La sPLA_{2} del grupo X existe en dos especies moleculares, una de las cuales es una forma inactiva, o proforma, que posee una secuencia propeptídica consistente en 11 residuos de aminoácidos unida al extremo N, y la otra de las cuales es una forma activa que se produce por escisión y deleción de la secuencia propeptídica con una proteasa, tal como tripsina (Morioka y col., Arch. Biochem. Biophys. 381, 31-42 (2000)). Se ha visto que la sPLA_{2} del grupo X activa tiene una actividad enzimática más potente que otras sPLA_{2} de mamíferos, tales como las sPLA_{2} de los grupos IB y IIA, independientemente del tipo y de la propiedad de los substratos, fosfolípidos, y además que tiene actividades mucho más potentes de liberación de ácidos araquidónicos de las membranas celulares en contacto con las células y de producción de mediadores lipídicos, tales como eicosanoides y lisofosfolípidos, que la sPLA_{2} de los grupos IB y IIA (Hanasaki y col., J. Biol. Chem. 274, 34203-34211 (1999); Saiga y col., Biochim. Biophys. Acta 1530, 67-76 (2001)). El análisis inmunohistoquímico utilizando los anticuerpos específicos reveló que la sPLA_{2} del grupo X se expresa en células epiteliales alveolares de tipo II y macrófagos esplénicos y que su expresión se acelera en células de cáncer de colon humanas, lo que sugiere que la enzima sería responsable de respuestas inflamatorias e inmunológicas, así como de la aparición y el desarrollo de cánceres de colon (Morioka y col., FEBS Lett. 487, 262-266 (2000)). Sin embargo, dado que ninguna publicación describe la actividad de degeneración de la sPLA_{2} del grupo X sobre lipoproteínas y su expresión en las lesiones arterioscleróticas, no se ha sabido que la enzima fuera responsable de la aparición y el desarrollo de la arteriosclerosis.
Se clonó sPLA_{2} del grupo V humana en 1994 (Chen y col., J. Biol.Chem., 1994, 269, 2365-2368). El gen de la sPLA_{2} del grupo V humana se localiza en el cromosoma 1, al igual que la sPLA_{2} del grupo IIA. La enzima contiene 12 residuos de cisteína en la molécula, lo cual es inferior a la sPLA_{2} del grupo IIA en dos residuos, y no contiene estructura de extensión basada en el extremo carboxilo como la que se encuentra en la sPLA_{2} del grupo II. La expresión de la sPLA_{2} del grupo V se detecta principalmente en el corazón, así como en el pulmón y en células inflamatorias, tales como las células cebadas y los macrófagos, y en tales células se sabe que la enzima conlleva la producción de mediadores lipídicos (Makoto Murakami, Ichirou Kudou, Gendaiiryou, 2000, 32, 517-548). Sin embargo, como ninguna publicación describe la actividad degenerativa de la sPLA_{2} del grupo V sobre lipoproteínas, no se ha sabido que la enzima fuera responsable de la aparición y el desarrollo de la arteriosclerosis.
Descripción de la invención
Los inventores de la presente solicitud investigaron las actividades fisiológicas de la sPLA_{2} humana del grupo V o X y vieron que estas enzimas exhiben una potencia que libera intensamente ácidos grasos del fosfolípido comprendido en lipoproteínas en la sangre.
En base al descubrimiento, los inventores demostraron que los compuestos que inhiben la sPLA_{2} del grupo V y/o X suprimen la actividad degenerativa de la sPLA_{2} del grupo V o X sobre las lipoproteínas del suero, logrando así la presente invención.
Para compuestos que inhiben la sPLA_{2}, EP-620214 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 7-010838, US-5578634), EP-620215 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 7-025850, US-5684034), EP-675110 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 7-285933, US-5654326), WO96/03120 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 10-505336), WO96/03376 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 10-503208, US-5641800), WO96/03383 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 10-505584), WO97/21664 (EP-779271), WO97/21716 (EP-779273), WO98/18464 (EP839806), WO98/24437 (EP846687), WO98/24756, WO98/24794, WO98/25609, WO99/51605 y WO99/59999 describen algunos compuestos; Roberts M.F. y col., J. Biol. Chem. 1977, 252, 2405-2411 describen el bromuro de p-bromofenacilo; Vadas P. y col., Lab. Invest. 1986, 55, 391-404 describen la mepacrina; Lombardo D. y col., J. Biol. Chem. 1985, 260, 7234-7240 describen la manoalida; y Yoshida T. y col., J. Antibiotics. 1991, 44, 1467-1470 describen la tielocina A1; y Hanasaki K. y col., J.Biol.Chem. 26 de Nov. de 1999; 274 (48): 34203-11, y Suzuki N y col., J.Biol.Chem. 2000 Feb 25; 275 (8): 5785-93, describen el indoxam. Sin embargo, ninguna publicación describe que los compuestos que inhiben la sPLA_{2} según se describe en ellas tengan alguna actividad inhibidora sobre la degeneración de las lipoproteínas del suero.
La presente invención ha sido lograda en base a los hallazgos antes mostrados.
Específicamente, la presente invención se relaciona con el uso de un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V o X representado por la fórmula general (I):
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1 
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donde
el anillo A es:
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donde cualquiera de R^{1} y R^{2} es un grupo de fórmula: -(L^{1})-(grupo ácido) donde L^{1} es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L^{1})-(grupo ácido) donde L^{1} es como se ha definido anteriormente; y
cada uno de R^{3} y R^{4} es independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un substituyente no interfiriente; y
-B- es un grupo entre (e)-(h):
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3 
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donde
R^{5} es un substituyente seleccionado entre el grupo consistente en (j) un grupo alquilo C_{1}-C_{20}, alquenilo C_{2}-C_{20}, alquinilo C_{2}-C_{20} o carbocíclico o un grupo heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de fórmula: -(L^{2})-R^{8} en el que L^{2} es un grupo de enlace divalente de 1-18 átomos seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno, un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y R^{8} es un grupo seleccionado entre (j) y (k);
R^{6} es un átomo de hidrógeno, un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{3}, un cicloalquilo C_{3}-C_{4}, un cicloalquenilo C_{3}-C_{4}, un alquiloxi C_{1}-C_{3} o un alquiltío C_{1}-C_{3};
R^{7} es un átomo de hidrógeno o un substituyente no interfiriente;
R^{A} es un grupo de fórmula:
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donde cada uno de R^{9} y R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; cada uno de X y Y es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es -NH_{2} o -NHNH_{2};
R^{B} es -CONH_{2} o -CONHNH_{2}; y
el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un anillo de benceno;
a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o (f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c);
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo, para la fabricación de un medicamento para suprimir la degeneración de las lipoproteínas del suero y/o tratar o prevenir la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir una enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
Preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que
R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula: -(L^{3})-R^{11} donde L^{3} es -OCH_{2}-, -SCH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -O-CH(CH_{3})- o -O-CH-(CH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5})-, y R^{11} es -COOH, -CONHSO_{2}C_{6}H_{5}, -SO_{3}H o -P(O)(OH)_{2}; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula: -(L^{4})-R^{12} donde L^{4} es un grupo de fórmula:
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5
donde cada uno de R^{13} y R^{14} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un aralquilo C_{1}-C_{10}, un carboxi, un alquiloxicarbonilo o un halógeno; y R^{12} es -COOH, -SO_{3}H o -P(O)(OH)_{2},
a condición de que R^{1} y R^{2} no sean un átomo de hidrógeno simultáneamente; o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
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Más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que
R^{3} es un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{6}, un cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un arilo o un grupo heterocíclico, y R^{4} es un átomo de hidrógeno o un halógeno; o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de éstos. Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que
R^{5} es un grupo -(CH_{2})_{1-6}-R^{15}, donde R^{15} es un grupo de fórmula:
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donde cada uno de b, d, f, h, j, m y o es independientemente un número entero de 0 a 2; cada uno de R^{16} y R^{17} es un grupo seleccionado independientemente entre un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiltío C_{1}-C_{10}, un ariloxi, un fenilo y un haloalquilo C_{1}-C_{10}; \alpha es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; \beta es -CH_{2}- o -(CH_{2})_{2}-; \gamma es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; c, i y p son un número entero de 0 a 5; e es un número entero de 0 a 7; g es un número entero de 0 a 4; y cada uno de k y n es independientemente un número entero de 0 a 3; o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
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Incluso mucho más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual
R^{5} es un grupo de -CH_{2}-R^{18}, donde R^{18} es un grupo de fórmula:
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donde \beta es -CH_{2}- o -(CH_{2})_{2}-; R^{19} es un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; y E es un enlace sencillo, -CH_{2}-, o -O-;
o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que R^{1} es -OCH_{2}COOH, o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que R^{2} es un átomo de hidrógeno, o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que R^{6} es un alquilo C_{1}-C_{3}; o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la que R^{A} es -CH_{2}CONH_{2} o -COCONH_{2}; o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula:
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o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Específicamente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V es mostrado por la fórmula:
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o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
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Alternativamente, el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X es mostrado por la fórmula:
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o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 representa un gráfico que muestra la liberación dosis-dependiente de ácido araquidónico de LDL inducida por sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X (a 37ºC durante una hora).
La Fig. 2 representa un gráfico que muestra los efectos de los inhibidores sobre la liberación de ácido araquidónico de LDL inducida por sPLA_{2} del grupo X (inhibidor de sPLA_{2}: indoxam, inhibidor de COX: indometacina, inhibidor de 5-LOX: AA-861, cada uno a 10 \mumol/L; los resultados son expresados como porcentaje de ácido araquidónico liberado por la sPLA_{2} del grupo X en ausencia de inhibidores).
La Fig. 3 representa un gráfico que muestra cambios en los contenidos de un fosfolípido mayor de LDL, la fosfatidilcolina (FC) (Fig. 3A) y su lisoforma (liso-FC) (Fig. 3B) cuando la LDL reacciona con las sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X y CuSO_{4} durante 3, 6 y 24 horas.
La Fig. 4 representa un substituto fotográfico de dibujo que muestra los resultados del análisis de electroforesis en gel de agarosa para la carga eléctrica de la LDL sometida a las reacciones con sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X y CuSO_{4} durante 3, 6 y 24 horas (parte superior: cátodo, parte inferior: ánodo).
La Fig. 5 representa un gráfico que muestra cambios en la peroxidación del lípido contenido en la LDL (A) y la HDL (B) sometidas a reacciones con sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X y CuSO_{4} durante 3, 6 y 24 horas, donde se expresan las substancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRATB) en términos de malondialdehído (MDA).
La Fig. 6 representa un gráfico que muestra la reducción en el eflujo de colesterol inducido por HDL degenerada por sPLA_{2} del grupo X. La adición de HDL no degenerada (HDL natural) al medio redujo significativamente el nivel de éster de colesterol intracelular en comparación con el medio solo, mientras que la adición de HDL degenerada con el grupo X (X-HDL) suprimió significativamente la reducción.
La Fig. 7 representa un gráfico que muestra la liberación de ácidos grasos dependiente del tiempo de la LDL inducida por sPLA_{2} del grupo IIA o V (a 37ºC, adición de 50 nmol/L de sPLA_{2}).
La Fig. 8 representa un gráfico que muestra los efectos de inhibidores sobre la liberación de ácido linoleico de la LDL inducida por sPLA_{2} del grupo V (inhibidor de sPLA_{2}: indoxam, inhibidor de COX: indometacina, cada uno a 10 \muM; los resultados son expresados como porcentaje de ácido linoleico liberado por sPLA_{2} del grupo V en ausencia de inhibidores).
La Fig. 9 representa un gráfico que muestra los cambios en los contenidos de un fosfolípido mayor de la LDL, la fosfatidilcolina (FC) (A) y su lisoforma (liso-FC) (B), cuando la LDL reacciona con sPLA_{2} del grupo IIA y V o CuSO_{4} durante 24 horas (a 37ºC, adición de 50 nmol/L de sPLA_{2}).
La Fig. 10 representa un substituto fotográfico de dibujo que muestra los resultados del análisis de electroforesis en gel de agarosa para la carga eléctrica de la LDL sometida a reacciones con sPLA_{2} del grupo V durante 3, 6 y 24 horas (parte superior: cátodo, parte inferior: ánodo).
Mejor modo para desarrollar la invención (1) Una composición farmacéutica para suprimir la degeneración de las lipoproteínas séricas, que contiene un compuesto inhibidor de las sPLA_{2} del grupo V y/o X como ingrediente activo
Los inventores de la presente invención vieron que las sPLA_{2} del grupo V y X humanas liberan potentemente ácidos grasos de los fosfolípidos de las lipoproteínas de la sangre. Además, los inventores mostraron que la sPLA_{2} del grupo V y/o X es muy potente en cuanto a la degeneración de la LDL y de la HDL, incluyendo la fosfolipolisis, la liberación de ácidos grasos, la producción de lisofosfolípidos, el aumento de la carga negativa y la captación por macrófagos, por comparación con la sPLA_{2} del grupo IB y del IIA, y vieron que estas acciones de las sPLA_{2} del grupo V y X difieren de las acciones degenerativas de las lipoproteínas causadas por oxidación anteriormente descritas. En este contexto, el término "degeneración de las lipoproteínas séricas" según la presente invención se refiere a la fosfolipolisis, a la liberación de ácidos grasos, a la producción de lisofosfolípidos, al aumento de carga negativa, a la captación por macrófagos y similares y no incluye la degeneración por oxidación.
"Un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X" o "un inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X", tal como se usa en la invención y se define en la reivindicación 1, incluye un compuesto que inhibe la sPLA_{2} del grupo V, un compuesto que inhibe la sPLA_{2} del grupo X y un compuesto que tiene actividad inhibidora sobre las sPLA_{2} de los grupos tanto V como X. En una realización, la presente invención incluye una composición farmacéutica que contiene tanto un compuesto que inhibe la sPLA_{2} del grupo V como un compuesto que inhibe la sPLA_{2} del grupo X como ingredientes activos.
Los inventores vieron también que la sPLA_{2} del grupo X se expresa en las células espumosas en lesiones vasculares en un modelo patológico animal de arteriosclerosis mediante el empleo de un anticuerpo específico para la sPLA_{2} del grupo X. Así, la presente invención incluye una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de la arteriosclerosis o para el tratamiento o la prevención de una enfermedad isquémica basada en arteriosclerosis, que contiene un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X como ingrediente activo. El término "arteriosclerosis", tal como se usa aquí, es un término general que significa una patología en la cual la pared arterial se engrosa y endurece y se refiere a cualquier condición patológica que dé lugar a un ataque isquémico cerebral, a infarto cerebral, a angina de pecho, a infarto de miocardio y a claudicación intermitente, todos ellos causados por constricción y oclusión de la arteria. Según la presente invención, se trata preferiblemente la aterosclerosis entre las arteriosclerosis. El término "enfermedad isquémica basada en arteriosclerosis", tal como se usa aquí, se refiere a una enfermedad isquémica causada por, o asociada a, arteriosclerosis. Las enfermedades isquémicas incluyen, en general, diversas condiciones patológicas clínicas causadas por anemia tópica, tal como necrosis. Sin embargo, según la presente invención, el término "enfermedad isquémica" se refiere a una enfermedad cardíaca isquémica causada por isquemia oclusiva debida a alteraciones en los vasos o de los propios vasos, tal como la angina de pecho, el infarto de miocardio, el fallo cardíaco y el infarto cerebral.
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(2) La composición farmacéutica que contiene un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X mostrado por la fórmula general (I)
El término "alquilo" tal como se usa en la fórmula (I), solo o en combinación con otros términos, significa un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado, que tiene un número indicado de átomos de carbono. Los radicales incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decanilo, n-undecanilo, n-dodecanilo, n-tridecanilo, n-tetradecanilo, n-pentadecanilo, n-hexadecanilo, n-heptadecanilo, n-octadecanilo, n-nonadecanilo, n-eicosanilo y similares.
El término "alquenilo" tal como se usa en la fórmula (I), solo o en combinación con otros términos, significa un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado, que tiene un número indicado de átomos de carbono y tiene uno o más dobles enlaces. Los radicales incluyen, por ejemplo, vinilo, alilo, propenilo, crotonilo, isopentenilo, diversos isómeros de butenilo y similares.
El término "alquinilo" tal como se usa en la fórmula (I), solo o en combinación con otros términos, significa un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado, que tiene un número indicado de átomos de carbono y tiene uno o más triples enlaces. Los radicales incluyen, por ejemplo, etinilo, propinilo, 6-heptinilo, 7-octinilo, 8-nonilo y similares.
El término "grupo carbocíclico", tal como se usa en la fórmula (I), significa un radical derivado de un núcleo orgánico de 5 a 14, preferiblemente de 5 a 10, más preferiblemente de 5 a 7, miembros saturado o insaturado, substituido o sin substituir, cuyos átomos formadores del anillo (aparte del hidrógeno) son únicamente átomos de carbono. El término incluye un grupo donde se conectan dos o tres de los radicales antes mencionados entre sí. Como grupos carbocíclicos típicos, se incluyen cicloalquilos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo; cicloalquenilos tales como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y ciclooctenilo, fenilo, naftilo, norbornanilo, bicicloheptadienilo, indenilo, estilbenilo, terfenililo, fenilciclohexenilo, acenaftilo, antrilo, bifenililo, bibencililo y derivados fenilalquilfenilo mostrados por la fórmula (II):
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Como grupo carbocíclico preferido en R^{3} y R^{4}, se incluyen fenilo, ciclohexilo y similares.
El término "grupo heterocíclico", tal como se usa en la fórmula (I), significa un radical derivado de núcleos heterocíclicos monocíclicos o policíclicos, saturados o insaturados, substituidos o sin substituir que tienen de 5 a 14 átomos de anillo y contienen de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo consistente en nitrógeno, oxígeno y azufre. Como grupos heterocíclicos, se incluyen, por ejemplo, piridilo, pirrolilo, furanilo, benzofuranilo, tienilo, benzotienilo, pirazolilo, imidazolilo, fenilimidazolilo, triazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, indolilo, carbazolilo, norharmanilo, azaindolilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, dibenzotiofenilo, indazolilo, imidazo[1,2-a]piridinilo, benzotriazolilo, antranililo, 1,2-benzisoxazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, purinilo, piridinilo, dipiridinilo, fenilpiridinilo, bencilpiridinilo, pirimidinilo, fenilpirimidinilo, pirazinilo, 1,3,5-triazinilo, quinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo y similares.
Como grupo heterocíclico preferido en R^{3} y R^{4}, se incluyen furilo, tienilo y similares.
Como grupo carbocíclico y grupo heterocíclico preferidos en el grupo R^{5}, se incluye un radical mostrado por la fórmula:
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donde h es un número entero de 0 a 2; cada uno de R^{16} y R^{17} es un grupo seleccionado independientemente entre un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiltío C_{1}-C_{10}, un ariloxi, un fenilo y un haloalquilo C_{1}-C_{10}; \alpha es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; \beta es -CH_{2}- o -(CH_{2})_{2}-; \gamma es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; c, i y p son un número entero de 0 a 5; e es un número entero de 0 a 7; g es un número entero de 0 a 4; y cada uno de k y n es independientemente un número entero de 0 a 3. Cuando c, e, g, i, k, n y/o p son 2 o más, entonces cada uno de los grupos R^{16} y de los grupos R^{17} pueden ser diferentes entre sí. Cuando R^{16} es un substituyente sobre un grupo naftilo, R^{16} puede substituir en cualquier posición sobre el grupo naftilo.
Como grupos más preferibles, se incluyen un radical mostrado por la fórmula:
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donde R^{19} es un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; E es un enlace sencillo, -CH_{2}- o -O-; y \beta es -CH_{2}- o -(CH_{2})_{2}-.
Como grupo R^{5} preferido, se incluye un "grupo carbocíclico"-alquilo C_{1}-C_{3} y un "grupo heterocíclico"-alquilo C_{1}-C_{3}.
El término "substituyente no interfiriente", tal como se utiliza en la fórmula (I), significa un radical adecuado para substitución sobre un "grupo carbocíclico" y un "grupo heterocíclico" tal como se han definido anteriormente y el núcleo básico. Como ejemplos de radicales no interfirientes, se incluyen un alquilo C_{1}-C_{10}, un alquenilo C_{2}-C_{6}, un alquinilo C_{2}-C_{6}, un aralquilo C_{7}-C_{12} (tal como bencilo y fenetilo), un alcarilo C_{7}-C_{12}, un cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un cicloalquenilo C_{3}-C_{8}, fenilo, tolilo, xililo, bifenilo, un alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiloxi C_{1}-C_{6}-alquilo C_{1}-C_{6} (tal como metiloximetilo, etiloximetilo, metiloxietilo y etiloxietilo), un alquiloxi C_{1}-C_{6}-alquiloxi C_{1}-C_{6} (tal como metiloximetiloxi y metiloxietiloxi), un alquil C_{1}-C_{6}-carbonilo (tal como metilcarbonilo y etilcarbonilo), un alquil C_{1}-C_{6}-carbonilamino (tal como metilcarbonilamino y etilcarbonilamino), un alquiloxiamino C_{1}-C_{6} (tal como metiloxiamino y etiloxiamino), un alquil C_{1}-C_{6}-oxiaminocarbonilo (tal como metiloxiaminocarbonilo y etiloxiaminocarbonilo), un mono- o dialquilamino C_{1}-C_{6} (tal como metilamino, etilamino, dimetilamino y etilmetilamino), un alquiltío C_{1}-C_{10}, un alquil C_{1}-C_{6}-tiocarbonilo (tal como metiltiocarbonilo y etiltiocarbonilo), un alquilsulfinilo C_{1}-C_{6} (tal como metilsulfinilo y etilsulfinilo), un alquilsulfonilo C_{1}-C_{6} (tal como metilsulfonilo y etilsulfonilo), un haloalquiloxi C_{2}-C_{6} (tal como 2-cloroetiloxi y 2-bromoetiloxi), un haloalquilsulfonilo C_{1}-C_{6} (tal como clorometilsulfonilo y bromometilsulfonilo), un haloalquilo C_{1}-C_{10}, un hidroxialquilo C_{1}-C_{6} (tal como hidroximetilo e hidroxietilo), un alquil C_{1}-C_{6}-oxicarbonilo (tal como metiloxicarbonilo y etiloxicarbonilo), -(CH_{2})_{1-8}-O-(alquilo C_{1}-C_{6}), benciloxi, un ariloxi (tal como feniloxi), un ariltío (tal como feniltío), -(CONHSO_{2}R^{20}, donde R^{20} es un alquilo C_{1}-C_{6} o un arilo), -CHO, amino, amidino, un halógeno, carbamilo, carboxilo, carbalquiloxi, -(CH_{2})_{1-8}-COOH (tal como carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo), ciano, cianoguanidino, guanidino, hidrazido, hidrazino, hidroxi, hidroxiamino, nitro, fosfono, -SO_{3}H, tioacetal, tiocarbonilo, un carbonilo C_{1}-C_{6}, un grupo carbocíclico, un grupo heterocíclico y similares. Estos substituyentes pueden estar substituidos por uno o más substituyentes seleccionados entre el grupo consistente en un alquilo C_{1}-C_{6}, un alquiloxi C_{1}-C_{6}, un haloalquiloxi C_{2}-C_{6}, un haloalquilo C_{1}-C_{6} y un halógeno.
Como substituyentes no interfirientes preferidos usados en el contexto de "substituidos por un substituyente no interfiriente" en R^{3}, R^{4} y R^{5}, se incluyen un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{6}, un alquiloxi C_{1}-C_{6}, un alquiltío C_{1}-C_{6} y un haloalquilo C_{1}-C_{6}. Como más preferidos, se incluyen un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{3}, un alquiloxi C_{1}-C_{3}, un alquiltío C_{1}-C_{3} y un haloalquilo C_{1}-C_{3}.
Como substituyentes no interfirientes preferidos usados R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{7}, se incluyen un alquilo C_{1}-C_{6}, un aralquilo, un alquiloxi C_{1}-C_{6}, un alquiltío C_{1}-C_{6}, un hidroxialquilo C_{1}-C_{6}, un haloalquiloxi C_{2}-C_{6}, un halógeno, un carboxi, un alquil C_{1}-C_{6}-oxicarbonilo, un ariloxi, un ariltiol, un grupo carbocíclico y un grupo heterocíclico. Como más preferidos, se incluyen un alquilo C_{1}-C_{6}, un aralquilo, un carboxi, un hidroxialquilo C_{1}-C_{6}, fenilo y un alquil C_{1}-C_{6}-oxicarbonilo.
El término "halógeno", tal como se usa en la fórmula (I), significa fluoro, cloro, bromo o yodo.
El término "cicloalquilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa un radical hidrocarbonado cíclico monovalente que tiene un número indicado de átomos de carbono. Los radicales incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo y similares.
El término "cicloalquenilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa un radical hidrocarbonado cíclico monovalente que tiene un número indicado de átomos de carbono y que contiene uno o más dobles enlaces. Los radicales incluyen, por ejemplo, 1-ciclopropenilo, 2-ciclopropenilo, 1-ciclobutenilo, 2-ciclobutenilo y similares.
El término "alquiloxi", tal como se usa en la fórmula (I), incluye, por ejemplo, metiloxi, etiloxi, n-propiloxi, isopropiloxi, n-butiloxi, n-pentiloxi, n-hexiloxi y similares.
El término "alquiltío", tal como se usa en la fórmula (I), incluye, por ejemplo, metiltío, etiltío, n-propiltío, isopropiltío, n-butiltío, n-pentiltío, n-hexiltío y similares.
El término "grupo ácido", tal como se usa en la fórmula (I), significa un grupo orgánico que, cuando se une a un núcleo a través de átomos de unión adecuados (en adelante aquí definido como "un grupo de enlace al grupo ácido"), actúa como donador de protones capaz de formar enlaces de hidrógeno. Los grupos ácidos incluyen, por ejemplo, un grupo mostrado por la fórmula:
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donde R^{21} es un átomo de hidrógeno, un metal o un alquilo C_{1}-C_{10} y cada R^{22} es independientemente un átomo de hidrógeno o un alquilo C_{1}-C_{10}, siempre que, cuando un grupo ácido tiene tanto R^{21} como R^{22}, entonces al menos uno de R^{21} y R^{22} sea un átomo de hidrógeno. Como grupos preferidos, se incluyen -COOH, -SO_{3}H, -CONHSO_{2}C_{6}H_{5} o P(O)(OH)_{2} y como más preferidos, se incluye -COOH.
El término "un grupo de enlace al grupo ácido", tal como se usa en la fórmula (I), significa un grupo de unión divalente simbolizado como -(L^{1})-, que tiene la función de unir el núcleo a un grupo ácido en una relación general. El grupo incluye, por ejemplo, un grupo mostrado por la fórmula:
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donde M es -CH_{2} -, -O-, -N(R^{25})- o -S- y cada R^{23} y R^{24} son independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un arilo, un aralquilo, un carboxi o un halógeno, y un grupo mostrado por la fórmula:
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donde cada uno de R^{13} y R^{14} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un aralquilo C_{1}-C_{10}, un carboxi, un alquiloxicarbonilo o un halógeno. Como preferidos, se incluyen, por ejemplo, -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}-, -N(R^{25})-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -O-CH(CH_{3})- y -O-CH((CH_{2})_{2}C_{6}H_{5})-, donde R^{25} es un alquilo C_{1}-C_{6}, y, como más preferidos, se incluyen -O-CH_{2} - y -S-CH_{2}-.
El término "la longitud del enlazante al grupo ácido", tal como se usa en la fórmula (I), significa el número de átomos (excluyendo el hidrógeno) de la cadena más corta del grupo de enlace -(L^{1})- que conecta el núcleo con el grupo ácido. La presencia de un anillo carbocíclico en -(L^{1})- cuenta como un número de átomos aproximadamente equivalente al diámetro calculado del anillo carbocíclico. Así, un anillo de benceno o ciclohexano en el enlazante al grupo ácido cuenta como 2 átomos al calcular la longitud de -(L^{1})-. La longitud preferida es de 2 a 3.
El término "haloalquilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa "un alquilo" como se ha definido anteriormente substituido en cualquier posición por un halógeno como se ha definido anteriormente. Como haloalquilo, se incluyen, por ejemplo, clorometilo, trifluorometilo, 2-clorometilo, 2-bromometilo y similares.
El término "hidroxialquilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa "un alquilo" como se ha definido anteriormente substituido en cualquier posición por hidroxi. Como hidroxialquilo, se incluyen, por ejemplo, hidroximetilo, 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo y similares, prefiriéndose hidroximetilo.
El término "haloalquilo" en "haloalquiloxi", tal como se usa en la fórmula (I), es como se ha definido anteriormente. Como haloalquiloxi, se incluyen, por ejemplo, 2-cloroetiloxi, 2-trifluoroetiloxi, 2-cloroetiloxi y similares.
El término "arilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa un grupo hidrocarbonado aromático monocíclico o condensado e incluye, por ejemplo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, antrilo y similares, prefiriéndose fenilo o 1-naftilo.
El término "aralquilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa "un alquilo" como se ha definido anteriormente substituido en cualquier posición substituible por "un arilo" como se ha definido anteriormente e incluye, por ejemplo, bencilo, fenetilo, fenilpropilo (v.g. 3-fenilpropilo), naftilmetilo (v.g. 1-naftilmetilo) y similares.
El término "alquiloxicarbonilo", tal como se usa en la fórmula (I), incluye, por ejemplo, metiloxicarbonilo, etiloxicarbonilo, n-propiloxicarbonilo y similares.
El término "ariloxi", tal como se usa en la fórmula (I), incluye, por ejemplo, feniloxi y similares.
El término "ariltío", tal como se usa en la fórmula (I), incluye, por ejemplo, feniltío y similares.
El término "halofenilo", tal como se usa en la fórmula (I), significa un fenilo substituido en una o más posiciones por "un halógeno" como se ha definido anteriormente e incluye, por ejemplo, fluorofenilo, clorofenilo, bromofenilo, yodofenilo, difluorofenilo, diclorofenilo, dibromofenilo, trifluorofenilo, triclorofenilo, tribromofenilo, clorofluorofenilo, bromoclorofenilo y similares.
"Anillo de ciclohexeno" en el anillo D, tal como se usa en la fórmula (I), significa un anillo de ciclohexeno que tiene, en el anillo, sólo un doble enlace en la parte condensada que comparte con el anillo adyacente.
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Son combinaciones preferidas entre el anillo A y -B- una de las (m) a (r) siguientes:
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prefiriéndose más una de las (m) a (p).
Los compuestos inhibidores de las sPLA_{2} de los grupos V y/o X mostrados por la fórmula general (I) pueden ser preparados según la bien conocida preparación descrita en EP-620214 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 7-010838, US-5578634), EP-620215 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 7-025850, US-5684034), EP-675110 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 7-285933, US-5654326), WO96/03120 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 10-505336), WO96/03383 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 10-505584), WO98/18464 (EP-839806), WO99/51605, WO99/59999 o similares.
Los compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del grupo X pueden ser seleccionados preparando células que expresan la sPLA_{2} del grupo X humana y el sobrenadante de cultivo de las mismas y estudiando luego los candidatos para la actividad inhibitoria como se describe a continuación. Concretamente, se inserta la secuencia de ADNc codificante de la sPLA_{2} del grupo X humana (Cupillard y col., J. Biol. Chem, 1997, 272, 15745-15752) en un vector de expresión en células animales. Se transfecta con el vector de expresión resultante una célula huésped para obtener una célula que expresa de manera estable sPLA_{2} del grupo X humana. Se cultivan las células para preparar los sobrenadantes de cultivo de las mismas. Se emplea entonces un ensayo cromogénico como se describe a continuación para identificar compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del grupo X y valorar su actividad. Las directrices generales de este ensayo están descritas en el artículo "Analysis of Human Synovial Fluid Phospholipase A_{2} on Short Chain Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a Spectrophotometric Assay Suitable for A Microtiterplate Reader", Analytical Biochemistry, 204, pp 190-197,1992, de Laure J. Reynolds, Lori L. Hughes y Edward A. Dennis.
Los compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del grupo V pueden ser seleccionados por un procedimiento similar al antes descrito, excepto por la utilización de la secuencia de ADNc codificante de la sPLA_{2} del grupo V humana (Chen y col., J. Biol. Chem, 1994, 269, 2365-2368).
Cuando un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X tiene un grupo ácido o un grupo básico, puede formar una sal más soluble en agua y más adecuada fisiológicamente. Como sales típicas farmacéuticamente aceptables, se incluyen, aunque sin limitación, sales formadas con un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, tal como litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio o similar. Se pueden producir sales fácilmente a partir de un ácido libre tratando el ácido en una solución con una base, o poniendo en contacto el ácido con una resina de intercambio iónico. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición preparadas a partir de una base inorgánica u orgánica relativamente no tóxica de un compuesto para el tratamiento o la prevención de una lesión por reperfusión isquémica, tal como un catión de amina, un amonio o un amonio cuaternario derivado de una base nitrogenada, que sean lo suficientemente básicos como para formar una sal con el compuesto (por ejemplo, S.M.Berge y col., "Pharmaceutical Salts", J.Phar.Sci., 66, 1-19 (1977)). Además, el grupo básico contenido en el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X puede reaccionar con un ácido orgánico o inorgánico adecuado para formar sales tales como acetatos, bencenosulfonatos, benzoatos, bicarbonatos, bisulfonatos, bitartratos, boratos, bromuros, camsilatos, carbonatos, cloruros, clavulanatos, citratos, edetatos, edisilatos, estolatos, esilatos, fluoruros, fumaratos, gluceptatos, gluconatos, glutamatos, glicolilarsanilatos, hexilresorcinatos, hidroxinaftoatos, yoduros, isotionatos, lactatos, lactobionatos, lauratos, malatos, malseatos, mandelatos, mesilatos, metilbromuros, metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitratos, oleatos, oxalatos, palmitatos, pantotenatos, fosfatos, poligalacturonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos, succinatos, tanatos, tartratos, tosilatos, trifluoroacetatos, trifluorometanosulfonatos, valeratos y similares. Los solvatos, tal como se utilizan aquí, incluyen los formados con un solvente orgánico y/o agua. Se pueden formar hidratos con cualquier número de moléculas de agua.
Cuando un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X tiene uno o más centros quirales, éstos pueden existir en formas ópticamente activas. De igual modo, cuando los compuestos contienen un grupo alquenilo o alquenileno, existe la posibilidad de formas isoméricas cis y trans de los compuestos. Esta invención contempla los isómeros R y S y sus mezclas, incluyendo las mezclas racémicas, así como las mezclas de isómeros cis y trans. Puede haber presencia de átomos de carbono asimétricos adicionales en un grupo substituyente, tal como un grupo alquilo. Todos esos isómeros, así como sus mezclas, pretenden quedar incluidos en la invención. Si se desea un estereoisómero particular, se puede preparar por métodos bien conocidos en la técnica utilizando reacciones estereoespecíficas con materiales de partida que contengan los centros asimétricos y ya resueltos, o, alternativamente, por métodos que den lugar a mezclas de los estereoisómeros y posterior resolución por métodos conocidos.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa soportes, diluyentes o aditivos que sean compatibles con otros ingredientes de la composición e inocuos para un receptor.
Las composiciones para tratamiento o prevención según la presente invención pueden ser administradas por una variedad de vías, incluyendo la oral, en aerosol, la rectal, la transdérmica, la subcutánea, la intravenosa, la intramuscular y la intranasal. Se preparan formulaciones que contienen los compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del grupo V o X combinando (v.g., mezclando) una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos junto con un soporte o diluyente para los mismos farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones son preparadas por procedimientos conocidos usando ingredientes bien conocidos y de fácil adquisición.
Al preparar las composiciones, se mezcla el ingrediente activo con un soporte o se diluye mediante un soporte, o se encierra en un soporte, que puede estar en forma de cápsula, bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el soporte sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúe como medio, o puede estar en forma de tabletas, píldoras, polvos, pastillas masticables, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido en un medio líquido) ó ungüentos, que contengan, por ejemplo, hasta un 10% del compuesto activo. Los compuestos que exhiben una actividad antiarteriosclerosis de la presente invención son preferiblemente formulados antes de su administración.
Para las formulaciones, se puede usar cualquier soporte adecuado conocido en la técnica. En dicha formulación, el soporte puede ser un sólido, un líquido o una mezcla de un sólido y un líquido. Por ejemplo, se disuelve un compuesto para el tratamiento o la prevención de la lesión por reperfusión isquémica en una solución acuosa de dextrosa al 4%/citrato de sodio al 0,5% para obtener una concentración de 2 mg/ml para inyección intravenosa. Las formulaciones en forma sólida incluyen polvos, tabletas y cápsulas. Un soporte sólido puede ser una o más substancias que pueden también actuar como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes suspensores, ligantes, agentes de desintegración de tabletas y material encapsulante. Las tabletas para administración oral pueden contener excipientes adecuados, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio, junto con agentes desintegrantes, tales como almidón de maíz o ácido algínico, y/o agentes ligantes, tales como gelatina o acacia, y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
En los polvos, el soporte es un sólido finamente pulverizado en mezcla con el ingrediente activo finamente pulverizado. En las tabletas, se mezcla el ingrediente activo con un soporte que tiene las propiedades de unión necesarias en proporciones adecuadas y se compacta para obtener la forma y el tamaño deseados. Los polvos y las tabletas contienen preferiblemente de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 99 por ciento en peso del ingrediente activo, que es el nuevo compuesto de esta invención. Son soportes sólidos adecuados carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, ceras de bajo punto de fusión y manteca de cacao.
Las formulaciones estériles en forma líquida incluyen suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires. Se puede disolver o suspender el ingrediente activo en un soporte farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, un solvente orgánico estéril o una mezcla de ambos. El ingrediente activo puede con frecuencia ser disuelto en un solvente orgánico adecuado, por ejemplo, propilenglicol acuoso. Se pueden preparar otras composiciones dispersando el ingrediente activo finamente dividido en una solución acuosa de almidón o de carboximetilcelulosa sódica o en un aceite adecuado.
Aunque la forma apropiada de dosificación varía dependiendo del tipo de enfermedad, de la vía de administración y de la edad y el peso corporal del paciente, en el caso de la administración intravenosa la dosificación para un adulto puede ser, en general, de 0,01 a 10 mg/kg/hora y preferiblemente de 0,1 a 1 mg/kg/hora.
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos son ilustrativos de la presente invención.
Ejemplo 1 Efecto de la sPLA_{2} del grupo X sobre la liberación de ácidos grasos a partir de lipoproteínas humanas aisladas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). Se hicieron reaccionar sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (de 0,5 nmol/L a 500 nmol/L) con LDL y HDL (0,35-1 mg/ml) a 37ºC en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Se extrajeron los ácidos grasos liberados de las lipoproteínas según el método de Dole (Dole y col., J. Biol. Chem. 235, 2595-2599 (1960)) y se marcaron con 9-antrildiazometano por un método conocido (Hanasaki y col., J. Biol. Chem. 274, 34203-34211 (1999)). Se determinaron entonces los ácidos grasos liberados detectando la fluorescencia de los productos marcados (ácidos grasos) eluidos por cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") en columna de fase invertida (LichroCART 125-4 Superspher 100 RP-18 columnmol/Merck). Para examinar la liberación dosis-dependiente de ácidos grasos inducida por cada sPLA_{2}, se hizo reaccionar a la lipoproteína con 0,5, 5, 50 y 500 nmol/L de sPLA_{2} del grupo X y 50 y 500 nmol/L de sPLA_{2} de los grupos IB y IIA durante 60 minutos. Además, con objeto de examinar la liberación de ácidos grasos tiempo-dependiente inducida por sPLA_{2}, se usaron 50 nmol/L de cada sPLA_{2} y se trazó el cambio en la liberación en el curso del tiempo durante un período de tiempo de 4 horas tras la adición de sPLA_{2}. En el experimento para la determinación de la actividad inhibidora de un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam; Yokota y col., Biochim. Biophys. Acta 1438, 213-222 (1999)), un inhibidor de la ciclooxigenasa (COX) (indometacina) o un inhibidor de la 5-lipoxigenasa (5-LOX) (AA-861; 2,3,5-trimetil-6-(12-hidroxi-5,10-dodecadiinil)-1,4-benzoquinona (Yoshimoto y col., Biochem. Biophys. Acta. 713, 470-473 (1982)), se añadieron estos agentes a la reacción, para obtener una concentración final de 10 \mumol/L, virtualmente con simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
El experimento para la liberación tiempo-dependiente reveló que sólo la sPLA_{2} del grupo X entre las sPLA_{2} de los grupos IB, IIA y X liberaba los ácidos grasos significativamente. La liberación de ácidos grasos de la HDL inducida por la sPLA_{2} del grupo X alcanzaba una meseta a los 60 minutos de la adición, mientras que la liberación de ácidos grasos de la LDL continuaba aumentando de un modo dependiente del tiempo durante 4 horas. El experimento para la liberación dosis-dependiente de ácidos grasos mostró que la sPLA_{2} del grupo X a tan sólo 5 nmol/L liberaba significativamente ácidos grasos de la LDL y de la HDL de un modo dosis-dependiente, mientras que la sPLA_{2} de los grupos IB y IIA liberaba sólo cantidades menores de ácidos grasos de ácidos grasos incluso a una dosis elevada de 500 nmol/L (Fig. 1). La liberación de ácidos grasos inducida por la sPLA_{2} del grupo X resultó inhibida por un inhibidor de la sPLA_{2} (indoxam) y no resultó afectada ni por un inhibidor de la COX (indometacina) ni por un inhibidor de la 5-LOX (AA-861) (Fig. 2).
Ejemplo 2 Efecto de la sPLA_{2} del grupo X sobre la composición de fosfolípidos de las lipoproteínas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). Se hicieron reaccionar sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Se trazó entonces el cambio en la composición de fosfolípidos de la LDL y de la HDL por HPLC. Se extrajeron los fosfolípidos de una muestra de 10 \mug de LDL y de una muestra de 15 \mug de HDL según un método conocido (Bligh y col., Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959)). A continuación, se cargaron los fosfolípidos en una columna de HPLC de fase normal (Ultrasphere silica, 4,6 x 250 mm y 4,6 x 45 mm, Beckman) para fraccionar la fosfatidilcolina (FC) y la lisofosfatidilcolina (liso-FC) eluidas y se determinó la cantidad de fósforo como se ha descrito previamente (Saiga y col., Biochim. Biophys. Acta 1530, 67-76 (2001)).
El resultado mostró que el tratamiento con CuSO_{4} y sPLA_{2} del grupo X disminuía los contenidos en FC en la LDL en el curso del tiempo, como puede verse en los puntos temporales de 3, 6 y 24 horas (Fig. 3A), y los contenidos en liso-FC aumentaban de acuerdo con la disminución de FC (Fig. 3B). El tratamiento con CuSO_{4} provocó una disminución de los contenidos en FC en la HDL y aumentó los contenidos en liso-FC en el curso del tiempo de forma similar al caso de la LDL. El tratamiento con sPLA_{2} del grupo X descompuso la FC en la HDL mucho más rápidamente que en el caso de la LDL y el tratamiento de 3 horas disminuyó el contenido en hasta un 10% del nivel original, mientras que los contenidos en liso-FC aumentaron de acuerdo con la disminución de la FC y se produjeron en una cantidad de 6 veces la cantidad de la HDL tratada con CuSO_{4} después de 3 horas. Por otra parte, el tratamiento con sPLA_{2} de los grupos IB y IIA no mostró cambios significativos en la composición de fosfolípidos (Fig. 3A, B).
Ejemplo 3 Efecto de la sPLA_{2} del grupo x sobre la carga negativa de lipoproteínas humanas aisladas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). Se hicieron reaccionar sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Se sometieron entonces una muestra de 1 \mug de LDL y una muestra de 2 \mug de HDL a electroforesis en gel de agarosa (Helena Laboratories, TITAN GEL Lipoprotein; 90V, 25 minutos). Tras la electroforesis, se secó el gel a una temperatura de 50 a 60ºC durante aproximadamente 1 hora, se tiñó con 6 ml de una solución de tinción (Helena Laboratories, Fat Red 7B agarose solution) durante aproximadamente 3 minutos y se decoloró después con 25 ml de una solución decolorante (metanol al 70%). En el experimento para la determinación de la actividad de un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam), un inhibidor de COX (indometacina) o un inhibidor de 5-LOX (AA-861), se añadieron estos agentes a la reacción para obtener una concentración final de 10 \mumol/L, virtualmente con simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
En la Fig. 4 se muestra el resultado. El tratamiento tanto de la LDL como de la HDL con CuSO_{4} dio lugar a un gran desplazamiento migratorio hacia el ánodo en el curso del tiempo en comparación con las lipo no tratadas (sin datos para la HDL). Entre los tratamientos con sPLA_{2} humanas, sólo el tratamiento con la sPLA_{2} del grupo X dio lugar a un desplazamiento migratorio dependiente del tiempo hacia el ánodo similar al del tratamiento con CuSO_{4}, lo que muestra que el cambio en la composición de fosfolípidos provocado por la liberación de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo X causó el aumento de carga negativa de cada lipoproteína. Este tipo de degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} del grupo X era inhibido por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) y no resultó afectado ni por un inhibidor de COX (indometacina) ni por un inhibidor de 5-LOX (AA-861).
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Ejemplo 4 Actividad degenerativa de la sPLA_{2} del grupo X sobre apoproteínas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Después de deslipidar con una solución de acetona:etanol (1:1), se disolvieron las mezclas de reacción en un tampón para electroforesis (10 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 6,8), 2% de SDS, 30% de glicerol, 0,1% de 2ME, 0,1% de BPB) y se analizaron por electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). En la electroforesis, se cargaron 5 \mug de cada de LDL (apoB-100) y de HDL (apoA-1) en gel al 4% y gel en gradiente al 4-20%, respectivamente.
El resultado mostró que la banda de la apoA-1 tratada con CuSO_{4} desaparecía en la posición original a la tenía que migrar a la vista del peso molecular de la proteína y se desplazaba hacia el lado de alto peso molecular como una banda ancha que parecía una forma de agregación, mientras que la banda de la apoB-100 en la LDL también se desplazaba hacia el lado de alto peso molecular. Por otra parte, una parte de apoB-100 y apoA-1 tratadas con sPLA_{2} del grupo X se desplazó hacia el lado de alto peso molecular como se ha mostrado antes 24 horas después del tratamiento, aunque no tan significativamente como en el tratamiento con CuSO_{4}. El tratamiento con sPLA_{2} de los grupos IB y IIA no causó cambios en comparación con la ausencia de tratamiento.
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Ejemplo 5 Efecto de la sPLA_{2} del grupo X sobre la peroxidación del lípido de las lipoproteínas A. Efecto sobre la producción de substancias reactivas con ácido tiobarbitúrico
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Se añadieron entonces 500 \mul de TCA al 20% y 500 \mul de ácido tiobarbitúrico (3,35 mg/ml) a una preparación de 10 \mug de cada de LDL y HDL en 200 \mul de solución salina fisiológica y se hirvió la mezcla a 95ºC durante 60 minutos, según el método conocido (Nagano y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6457-6461, (1991)). Después de enfriar, se extrajeron las substancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRATB), que son uno de los indicadores para la peroxidación de lípidos, con n-butanol (2 ml) y se determinó la fluorescencia en el sobrenadante (longitud de onda de excitación: 515 nm, longitud de onda de fluorescencia: 550 nm). Se calculó la cantidad de SRATB por referencia a una curva estándar generada usando tetraetoxipropano como patrón.
En las Fig. 5A y B se muestran los resultados. Se observó una cantidad significativamente elevada de SRATB que tenían un pico a las 6 horas tanto en LDL (Fig. 5A) como en HDL (Fig. 5B) tratadas con CuSO_{4}. Por otra parte, no se observó elevación de la cantidad de SRATB en el tratamiento con todas las sPLA_{2}, incluyendo la sPLA_{2} del grupo X.
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B. Efecto sobre la producción de dieno conjugado
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) con LDL y HDL (0,2 mg/ml) a 37ºC durante 0 a 6 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Se analizó entonces la producción de dieno conjugado, que es uno de los indicadores para la peroxidación de lípidos, monitorizando los cambios en la absorbancia a 234 nm en el curso del tiempo según el método conocido (Esterbauer y col., Free Rad. Res. Comms. 6, 67-75 (1989)).
El resultado mostró que la absorbancia a 234 nm aumentaba de un modo tiempo-dependiente durante 90 minutos desde la adición en el tratamiento tanto de la LDL como de la HDL con CuSO_{4} y la absorbancia decreció luego gradualmente. Por otra parte, no se observó ningún cambio en la absorbancia a 234 nm en el tratamiento con todas las sPLA_{2}, incluyendo la sPLA_{2} del grupo X.
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Los resultados antes descritos demostraron que la degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} del grupo X (liberación de ácidos grasos, cambio en la composición de fosfolípidos, mayor carga negativa, polimerización de apoproteína) es similar a la degeneración por oxidación del tratamiento con CuSO_{4}, pero no es dependiente de la oxidación de lipoproteínas.
Ejemplo 6 Efecto de la sPLA_{2} del grupo X sobre la captación de LDL degenerada por macrófagos peritoneales de ratón
Se inyectaron ratones C57BL/6J (machos, 8 semanas) peritonealmente con 2 ml de una solución de tioglicolato al 4% y, 4 días después, se recogieron las células de los fluidos peritoneales. Se plaquearon las células en un portaobjetos de cámara y se incubaron durante 2 horas en presencia de medio libre de suero (BIO WHITTAKER: X-VIVO 15). Se extrajeron entonces las células no adherentes por un procedimiento de lavado para preparar macrófagos peritoneales. Se añadieron a las células 0,2 mg/ml de LDL (Sigma) y 50 nmol/L de PLA2 del grupo X y se incubaron en el medio libre de suero durante 48 horas. Se confirmó la captación de LDL por los macrófagos inmovilizando las células con formaldehído al 4% durante 20 minutos y tiñendo luego los lípidos con una solución de tinción Oil Red O. El experimento para determinar la actividad inhibidora de un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam), un inhibidor de COX (indometacina) o un inhibidor de 5-LOX (AA-861), se añadieron estos agentes a la reacción para obtener una concentración final de 10 \mumol/L, virtualmente con simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
Los resultados mostraron que se detectaba una señal positiva para la tinción con Oil Red O en las células tratadas con sPLA_{2} del grupo X, lo que demuestra la captación de LDL por las células, mientras que no se detectó ninguna señal positiva en las células no tratadas. Esto revelaba que la sPLA_{2} del grupo X aumentaba la captación de LDL por los macrófagos y tiene el potencial de contribuir a la formación de células espumosas desarrolladas en lesiones arterioscleróticas. El efecto de la sPLA_{2} del grupo X sobre la captación de LDL por las células resultó inhibido por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam), que se añadió a las células simultáneamente a la adición de sPLA_{2} del grupo X y LDL, y no resultó afectado ni por un inhibidor de COX (indometacina) ni por un inhibidor de 5-LOX (NDGA).
Ejemplo 7 Análisis inmunohistoquímico de lesiones arterioscleróticas de ratón usando anticuerpo policlonal anti-sPLA_{2} del grupo X
Se compraron ratones deficientes en el gen de la apolipoproteína E, C57BL/6J - ratones Apoe^{tmlUnc} (hembras, 8 semanas) descritos en The Journal of Clinical Investigation Vol. 94, pp. 937-945 (1994), a Jackson Lab. y se usaron como modelo animal para la arteriosclerosis. Como control, se usaron ratones C57BL/6 (machos, 8 semanas). Inmediatamente después de la compra, se mantuvo y alimentó a los animales con una dieta alta en grasas suplementada con un 15,8% de manteca de cacao, un 1,25% de colesterol y un 0,5% de colato de sodio en un gránulo convencional, CA-1. Se practicó una expulsión de la sangre por perfusión en cada uno de los ratones de 12 semanas, 17 semanas y 22 semanas de edad y se inmovilizaron los vasos químicamente con paraformaldehído acuoso al 4% y se disecaron para retirar la aorta ascendente yuxtacardíaca. Se sumergió el tejido en el mismo líquido de inmovilización durante la noche, se lavó con un tampón fosfato, se deshidrató convencionalmente con etanol acuoso brevemente y se embebió en cera de parafina. Se usó un microtomo para preparar secciones de parafina con un grosor de aproximadamente 5 \mum y se montaron después en un vidrio portaobjetos para obtener muestras patológicas para tinción. Para la inmunohistoquímica, se sumergió cada portaobjetos con la muestra en xilol para eliminar la cera de parafina, se le hizo reaccionar con metanol que contenía un 0,3% de H_{2}O_{2} para eliminar las peroxidasas endógenas y se le trató luego con suero normal de cabra al 5% durante 20 minutos. A continuación, se sumergieron los portaobjetos con las muestras en PBS que contenía un 0,1% de seroalbúmina bovina durante 30 minutos y se les hizo reaccionar con anticuerpo policlonal de conejo anti- sPLA_{2} humana del grupo X (6 \mug/mL) a 4ºC durante 14 horas como se describe en The Journal of Biological Chemistry Vol. 274, Nº 48, pp. 34203-34211 (1999). Se lavaron entonces bien los portaobjetos con PBS que contenía un 0,1% de monolaurato de polioxietilen(20)sorbitán (Tween 20; Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka), se les hizo reaccionar con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo biotinilado durante 30 minutos y se trataron con un reactivo de complejo de avidina-biotina que contenía peroxidasas (Vector Laboratories), dejando reposar a continuación durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, la reacción en un tampón Tris-HCl a 50 mmol/L (pH 7,6) que contenía 200 \mug/mL de diaminobencidina y un 0,006% de H_{2}O_{2} durante 10 minutos desarrolló coloración de la actividad peroxidasa amplificada alrededor de las moléculas diana del grupo X, de tal modo que se visualizaba la localización de la sPLA_{2} del grupo X en las muestras de tejidos. Este análisis detectará la señal positiva para las moléculas de sPLA_{2} del grupo X como una pigmentación marrón hígado de diaminobencidina. En el experimento de absorción-neutralización para la señal de la sPLA_{2} del grupo X, el anticuerpo reaccionó con proteínas sPLA_{2} del grupo X de ratón purificadas (300 \mug/mL) durante 2 horas antes de añadirlo a los portaobjetos y se trataron entonces los portaobjetos con la reacción de anticuerpo y proteína. Además, se trató la muestra de tejido con una solución de hematoxilina al 0,4% para contrateñir los núcleos celulares.
Los resultados mostraron que la señal positiva para la sPLA_{2} del grupo X en los vasos aislados de los ratones deficientes en el gen de la apolipoproteína E de 12 semanas, 17 semanas y 22 semanas de edad se detectaba localmente sólo en la población de células espumosas, lo cual es el signo inicial de la arteriosclerosis. Por otra parte, en los tejidos vasculares control de ratones normales no se detectó ningún signo inicial de arteriogénesis y no se detectó ninguna señal positiva para la sPLA_{2} del grupo X. Además, la señal detectada en la lesión arteriosclerótica en los ratones deficientes en el gen de la apolipoproteína E desapareció mediante el tratamiento de absorción-neutralización usando proteína sPLA_{2} de ratón del grupo X, lo que sugiere que la reacción positiva es específica para las moléculas de sPLA_{2} del grupo X. No se detectaron esas señales positivas con IgG preparada a partir de conejos no inmunizados. Los resultados antes descritos muestran que las moléculas de sPLA_{2} del grupo X se expresan significativamente en un elevado nivel en las células espumosas de lesiones vasculares del modelo de arteriosclerosis en ratón.
Ejemplo 8 Aumento de los ésteres de colesterol en macrófagos inducido por LDL degenerada con sPLA_{2} del grupo X
Se hizo reaccionar sPLA_{2} del grupo X (50 nmol/L) con LDL de plasma humano a 37ºC durante 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio para preparar LDL degenerada por sPLA_{2} del grupo X. Se prepararon macrófagos peritoneales inyectando 2 ml de una solución de tioglicolato al 3% a ratones C57BL/6J (machos, 8 semanas) peritonealmente, recogiendo las células de los fluidos peritoneales 4 días después, plaqueando las células en una placa de 24 pocillos, incubando durante 2 horas en presencia de medio libre de suero (BIO WHITTAKER: X-VIVO 15) y separando luego las células no adherentes por lavado. Se añadieron a las células 0,2 mg/ml de LDL, se incubaron éstas en el medio libre de suero durante 48 horas y se dejó que reposaran en una mezcla de hexano e isopropanol (3:2) durante 30 minutos para extraer el colesterol depositado en los macrófagos. Después de reemplazar el solvente con isopropanol, los colesteroles extraídos reaccionaron con 1 unidad/ml de colesterol oxidasa (Roche), 10 unidades/ml de peroxidasa (Boehringer Mannheim), 40 \mug/ml de acetato de p-hidroxifenilo (Sigma) y 1 unidad/ml de colesterol esterasa (TOYOBO) en un tampón fosfato 0,1 M a 37ºC durante 30 minutos según un método conocido (Gamble y col., J. Lipid. Res. 19, 1068-1070 (1978)) y se determinó el colesterol total (incluyendo el colesterol libre y los ésteres de colesterol) midiendo la fluorescencia de la solución (longitud de onda de excitación: 305 nm, longitud de onda de fluorescencia: 420 nm). Además, se llevó a cabo una reacción en una mezcla de reacción libre de colesterol esterasa a 37ºC durante 30 minutos y se determinó solamente el colesterol libre. Se calcularon las cantidades del colesterol total y del colesterol libre en relación a una curva estándar generada usando colesterol y oleato de colesterol como patrones y se restó la cantidad de colesterol libre de la cantidad de colesterol total para obtener la cantidad de ésteres de colesterol.
Los resultados mostraron que la cantidad de ésteres de colesterol en la captación de la LDL tratada con sPLA_{2} del grupo X aumentaba significativamente en comparación con la de la captación de la LDL no tratada y, por lo tanto, que la LDL modificada por la enzima tiene el potencial de acelerar la formación de células espumosas desarrolladas en lesiones arterioscleróticas.
Ejemplo 9 Efecto de la degeneración inducida por sPLA_{2} del grupo X sobre la extracción de colesterol por la HDL
Se hizo reaccionar sPLA_{2} del grupo X (50 nmol/L) con HDL de plasma humano a 37ºC durante 3 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio para preparar HDL degenerada por sPLA_{2} del grupo X. Se prepararon macrófagos peritoneales recogiendo el lavado de fluidos peritoneales de ratones ICR (hembras, 12 semanas), plaqueándolo en una placa de 24 pocillos, incubando durante 2 horas en presencia de medio que contenía un 10% de suero de ternera fetal (GIBCO BRL: Medio de Eagle modificado de Dulbecco) y extrayendo luego las células no adherentes por lavado. Se añadieron a las células 50 \mug/ml de LDL acetilada (Biomedical Technology Inc.) y se incubaron durante 24 horas para preparar macrófagos espumosos. Después de retirar el exceso de LDL acetilada del medio, se añadieron 100 \mug/ml de HDL al medio y se incubó entonces el medio en ausencia de suero durante 24 horas. Se extrajo y determinó el colesterol intracelular y se determinó después la capacidad de la HDL para provocar eflujo del colesterol celular de las células espumosas.
Los resultados mostraron que el eflujo de colesterol intracelular de las células tratadas con HDL degenerada con sPLA_{2} del grupo X disminuía significativamente en comparación con el de las células tratadas con HDL no degenerada. Esto demostró que la degeneración de la HDL por la enzima tiene el potencial de suprimir el eflujo de colesterol por la HDL en las células espumosas desarrolladas en placas arterioscleróticas (Fig. 6).
Ejemplo 10 Efecto de la sPLA_{2} del grupo V sobre la liberación de ácidos grasos de lipoproteínas humanas aisladas A. Preparación de células que expresan sPLA_{2} humana del grupo V y purificación de la enzima a partir del sobrenadante de cultivo
Se obtuvo ADNc codificante de la sPLA_{2} humana del grupo V por PCR usando Marathon Ready cDNA® de corazón humano de CLONTECH como plantilla. Se usaron los siguientes cebadores en la PCR:
hGV-S: 5'-caaagaacgcgtccaccatgaaaggcctcctcccactggct-3' (SEC. ID. Nº 1)
hGV-AS: 5'-ctcgctgcggccgcctaggagcagaggatgttgggaaa-3' (SEC. ID. Nº 2) 
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hGV-S contiene la secuencia Kozak y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mlu I. hGV-AS contiene un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Not I. Se llevó a cabo la PCR en 35 ciclos en condiciones de 94ºC durante 0,5 minutos, 55ºC durante 0,5 minutos y 72ºC durante 2,5 minutos. Se digirieron los fragmentos de amplificación por PCR con Mlu I y Not I y se insertaron en el pBluescript-SK(-) modificado. Se confirmó la secuencia de bases usando Sequenase Ver. 2,0 (USB). Se construyó entonces un marcaje sPLA_{2} del grupo V-His donde los seis residuos de His estaban unidos al extremo carboxilo por PCR usando un cebador hGV-S y un cebador hGV-H6AS (5'-ctcgctgcggccgcctaatggtgatggtgatgatgggagcagaggatgttgggaaag-3') (SEC. ID. Nº 3) y utilizando ADN plasmídico de sPLA_{2} humana del grupo V como plantilla. Se digirieron los fragmentos de amplificación por PCR con Sma I y Not I y se reemplazaron con el sitio correspondiente al ADN plasmídico sPLA_{2} del grupo V. Después de confirmar la secuencia de bases de la región como recién amplificada por PCR, se insertó el ADNc secuencia abajo del promotor SR-\alpha del vector de expresión para células de mamíferos. Se transfectó el vector de expresión en células huésped CHO usando un reactivo Lipofect AMINE (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante para preparar células CHO que expresaban de forma estable la sPLA_{2} humana del grupo V. Se incubaron las células hasta casi la fase de confluencia en medio \alpha-MEM que contenía un 10% de suero de ternera fetal y se recogió el sobrenadante de cultivo para obtener materiales para la purificación.
A partir del sobrenadante de cultivo, se purificó la sPLA_{2} humana del grupo V usando una columna de quelato de níquel HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia Biotech) hasta un estado homogéneo, según se vio por migración como una sola banda en electroforesis SDS-PAGE (peso molecular: aproximadamente 14 kDa), que se usó después en el siguiente análisis para la degeneración de lipoproteínas.
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B. Efecto de la sPLA_{2} del grupo V sobre la liberación de ácidos grasos de lipoproteínas humanas aisladas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IIA o V reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina, y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se extrajeron los ácidos grasos liberados según el método de Dole (Dole y col., J. Biol. Chem. 235, 2595-2599 (1960)). Se marcaron los ácidos grasos con 9-antrildiazometano por un método conocido (Hanasaki y col., J. Biol. Chem. 274, 34203-34211 (1999)) y se determinaron luego detectando la fluorescencia de los productos marcados (ácidos grasos) eluidos por cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") en columna de fase invertida (columna LichroCART 125-4 Superspher 100 RP-18, Merck). Para examinar la liberación de ácidos grasos dependiente del tiempo inducida por sPLA_{2} de los grupos IIA y V, se usaron 50 nmol/L de cada sPLA_{2} y se trazó el cambio en la liberación en el curso del tiempo en los puntos temporales de 3, 6 y 24 horas tras la adición de sPLA_{2}. En el experimento para la determinación de la actividad inhibidora de un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) o un inhibidor de COX (indometacina), se añadieron estos agentes a la reacción para obtener una concentración final de 10 pmol/L, virtualmente con simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
El resultado mostró que la sPLA_{2} del grupo V liberaba los ácidos grasos muy significativamente y que la liberación de ácidos grasos de la HDL alcanzaba una meseta 3 horas después de la adición y continuaba durante 24 horas. Por otra parte, la liberación de ácidos grasos de la LDL inducida por la sPLA_{2} del grupo V continuaba aumentando durante 24 horas en el curso del tiempo, mientras que se vio liberación de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo IIA en una cantidad bastante pequeña (Fig. 7). La liberación de ácido linoleico en la liberación de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo V resultó inhibida por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) y no resultó afectada por un inhibidor de COX (indometacina) (Fig. 8).
Ejemplo 11 Efecto de la sPLA_{2} del grupo V sobre la composición de fosfolípidos de las lipoproteínas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IIA y V (50 nmol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se trazó luego el cambio en la composición de fosfolípidos de la LDL y la HDL por HPLC. Se extrajeron los fosfolípidos de una muestra de 10 \mug de LDL y una muestra de 15 \mug de HDL según el método de Bligh y col. (Bligh y col., Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959)) y a continuación se cargaron los fosfolípidos en una columna de HPLC de fase normal (sílice Ultrasphere, 4,6 x 250 mm y 4,6 x 45 mm, Beckman) de tal forma que se fraccionaron la fosfatidilcolina (FC) y la lisofosfatidilcolina (liso-FC) eluidas y se determinó la cantidad de fósforo como se ha descrito con anterioridad (Saiga y col., Biochim. Biophys. Acta 1530, 67-76 (2001)).
El resultado mostró que el tratamiento de la LDL con sPLA_{2} del grupo V disminuía los contenidos en FC en el curso del tiempo, como pudo verse en los puntos temporales de 3, 6 y 24 horas, y que los contenidos en liso-FC aumentaban de acuerdo a la disminución de la FC (Fig. 9A y B). El tratamiento de la HDL con sPLA_{2} del grupo V descompuso la FC mucho más rápidamente y un tratamiento de 3 horas disminuyó el contenido en hasta aproximadamente un 30% del nivel inicial, mientras que los contenidos en liso-FC aumentaron también de acuerdo con la disminución de la FC. Por otra parte, el tratamiento con sPLA_{2} del grupo IIA no mostró cambio significativo en la composición de fosfolípidos.
Ejemplo 12 Actividad degenerativa de la sPLA_{2} del grupo V sobre lipoproteínas humanas aisladas
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IIA y V (50 nmol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8:0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se depositaron 1 \mug de la LDL y 2 \mug de la HDL sobre un el de agarosa (Helena Laboratories, TITAN GEL Lipoprotein), seguido de electroforesis a 90 V durante 25 minutos. Tras la electroforesis, se secaron los geles a una temperatura de 50 a 60ºC durante aproximadamente una hora, se tiñeron con 6 ml de una solución de tinción (Helena Laboratories, solución de agarosa Fat Red 7B) durante aproximadamente tres minutos y se decoloraron después con 25 ml de una solución decolorante (metanol al 70%). En el experimento para determinar la actividad de un inhibidor de la sPLA_{2} (indoxam) o un inhibidor de la COX (indometacina), se añadieron estos agentes a la reacción para obtener una concentración final de 10 pmol/L, virtualmente de forma simultánea a la adición de sPLA_{2}.
El resultado mostró que el tratamiento tanto de la LDL como de la HDL con sPLA_{2} del grupo V daba lugar a un gran desplazamiento migratorio hacia el ánodo en comparación con las no tratadas. La migración de la HDL hacia el ánodo alcanzó una meseta 3 horas después de la adición, de forma similar a la liberación de ácidos grasos, y continuó durante 24 horas. La migración de la LDL hacia el ánodo continuó aumentando durante 24 horas en el curso del tiempo. Como se ha mostrado anteriormente, la liberación de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo V reveló que la carga negativa de cada lipoproteína había cambiado (degenerada) (Fig. 10). Por otra parte, el tratamiento de cada lipoproteína con sPLA_{2} humana del grupo IIA no dio lugar a desplazamiento migratorio hacia el ánodo.
La degeneración de las lipoproteínas inducida por sPLA_{2} del grupo V resultó inhibida por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) y no resultó afectada por un inhibidor de COX (indometacina).
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Ejemplo 13 Efecto de la sPLA_{2} del grupo V sobre la peroxidación de lipoproteínas
(Efecto sobre la producción de substancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico)
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34, 1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos IIA y V (50 nmol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 24 y 3 horas, respectivamente, en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se añadieron entonces 500 \mul de TCA al 20% y 500 \mul de ácido tiobarbitúrico (3,35 mg/ml) a la preparación de 10 \mug de cada de LDL y HDL en 200 \mul de solución salina fisiológica, seguido de ebullición a 95ºC durante 60 minutos según el método de Nagano y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6457-6461, (1991)). Después de enfriar, se extrajeron las substancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRATB), que son uno de los indicadores de la peroxidación de lípidos, con n-butanol (2 ml) y se determinó la fluorescencia en el sobrenadante (longitud de onda de excitación: 515 nm, longitud de onda de fluorescencia: 550 nm). Se calculó la cantidad de SRATB en relación a una curva estándar generada usando tetraetoxipropano como patrón.
Los resultados mostraron que no se observaba ninguna cantidad elevada de SRATB en ninguno de los tratamientos con sPLA_{2} de los grupos IIA y V.
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Ejemplo 14 Efecto de la sPLA_{2} del grupo V sobre la captación de LDL degenerada por macrófagos peritoneales de ratón
Se prepararon macrófagos peritoneales inyectando 2 ml de una solución de tioglicolato al 4% a ratones C57BL/6J (machos, 8 semanas) peritonealmente, recogiendo las células peritoneales 4 días después, plaqueando las células en un portaobjetos de cámara, incubando durante 2 horas en presencia de medio libre de suero (BIO WHITTAKER: X-VIVO 15) y extrayendo luego las células no adherentes por lavado. Se añadieron a las células 0,2 mg/ml de LDL (Sigma) y 50 nmol/L de sPLA_{2} de los grupos IIA o V y se incubó el cultivo en el medio libre de suero durante 48 horas. Se confirmó la captación de LDL por los macrófagos inmovilizando las células con formaldehído al 4% durante 20 minutos y luego tinción de los lípidos con una solución de tinción Oil Red O. Los resultados mostraron que se detectaba una señal positiva para la tinción Oil Red O en las células tratadas con sPLA_{2} del grupo V, lo que demostró la captación de LDL por las células, mientras que no se detectó señal positiva alguna en las células tratadas con sPLA_{2} del grupo IIA y en las células no tratadas. Esto reveló que la sPLA_{2} del grupo V aumentaba la captación de LDL por los macrófagos y tiene el potencial de contribuir a la formación de células espumosas desarrolladas en lesiones arterioscleróticas.
Los siguientes ejemplos de referencia demuestran la actividad de los compuestos preferidos de la presente invención en la inhibición de la sPLA_{2} humana de los grupos V o X.
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Ejemplo de referencia A. Preparación de células que expresan sPLA_{2} humana de los grupos V o X y preparación de su sobrenadante de cultivo
Se insertó una secuencia de ADNc codificante de la sPLA_{2} humana de los grupos V o X (Chen y col., J. Biol. Chem, 1994, 269, 2365-2368; y Cupillard y col., J. Biol. Chem, 1997, 272, 15745-15752) en dirección hacia delante secuencia abajo del promotor de un vector de expresión para células de mamíferos, el Vector de Expresión del Promotor Tardío pSVL SV40 (Amersham Pharmacia Biotech). Se transfectó el vector de expresión en células huésped CHO usando un reactivo Lipofect AMINE (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante, para obtener células CHO que expresaban de manera estable la sPLA_{2} humana de los grupos V o X. Se incubaron las células en medio \alpha-MEM que contenía un 10% de suero de ternera fetal durante 3 días y se usó el sobrenadante de cultivo para determinar la actividad de las enzimas.
B. Ensayo de la actividad inhibidora
Se usa el siguiente ensayo cromogénico para identificar y evaluar inhibidores de la sPLA_{2} de los grupos V o X. El ensayo ha sido adaptado para un rastreo de alto volumen usando placas de microtitulación de 96 pocillos. Se encuentra una descripción general de este en el artículo "Analysis of Human Synovial Fluid Phospholipase A_{2} on Short Chain Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a Spectrophotometric Assay Suitable for A Microtiterplate Reader", de Laure. J. Reynolds, Lori L. Hughes y Edward A Dennis, Analytical Biochemistry, 204, pp 190-197,1992.
Se añadió un compuesto de ensayo (o un blanco de solvente) según la disposición predeterminada de la placa y se provocó la reacción de diheptanoiltio-FC (1 mM) con sPLA_{2} humana del grupo V o X en presencia de Tritón X-100 (0,3 mM), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (125 \muM) en un tampón Tris (25 mM, pH 7,3), CaCl_{2} (10 mM), KCl (100 mM) y seroalbúmina bovina. Se lee la absorbancia a 405 nm para evaluar la actividad inhibidora.
Se llevó a cabo la reacción con sPLA_{2} humana del grupo V a razón de 40 \mul/pocillo a 40ºC durante 45 minutos y se llevó a cabo la reacción con sPLA_{2} humana del grupo X a razón de 15 \mul/pocillo a 40ºC durante 30 minutos.
Se determinaron los valores de la CI_{50} representando las concentraciones logarítmicas de los compuestos de ensayo descritos en las Tablas 1-4 frente a los valores de inhibición en el rango de un 10-90% de inhibición.
En la Tabla 5 se muestran los resultados de las pruebas de inhibición de la sPLA_{2} del grupo V y en la Tabla 6 se muestran los resultados de las pruebas de inhibición de la sPLA_{2} del grupo X:
TABLA 1 Inhibidores de la sPLA_{2} del Grupo V
24
TABLA 2 Inhibidores de la sPLA_{2} del grupo V 
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25 
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TABLA 3 Inhibidores de la sPLA_{2} del grupo X 
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TABLA 4 Inhibidores de la sPLA_{2} del grupo X 
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27 
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28 
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TABLA 5 Resultados de las pruebas de inhibición de la sPLA_{2} del grupo V
29
TABLA 6 Resultados de las pruebas de inhibición de la sPLA_{2} del grupo X
30
Ejemplos de formulación 
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Los siguientes Ejemplos de Formulación 1 a 8 son ilustrativos. El término "ingrediente activo" significa un compuesto que inhibe la sPLA_{2} de los grupos V y/o X, un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
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Ejemplo de Formulación 1
Se prepara una cápsula de gelatina dura usando los siguientes ingredientes:
31 
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Ejemplo de Formulación 2
Se prepara una tableta usando los siguientes ingredientes:
32
Se mezclan los ingredientes y se comprimen para formar tabletas, con un peso cada una de 665 mg.
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Ejemplo de Formulación 3
Se prepara una solución de aerosol que contiene los siguientes ingredientes:
33
Se mezcla el ingrediente activo con etanol y se enfría la mezcla añadida a una porción del propulsor 22 a -30ºC y se transfiere a un dispositivo de llenado. Se alimenta entonces la cantidad necesaria en un recipiente de acero inoxidable y se diluye con el resto del propulsor. Se ajustan luego las unidades de válvula al recipiente.
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Ejemplo de Formulación 4
Se preparan tabletas, cada una con un contenido de 60 mg de un ingrediente activo, como sigue.
34
Se mezclan bien el ingrediente activo, el almidón y la celulosa, todos ellos pasados a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 45. Se mezcla la solución acuosa que contiene polivinilpirrolidona con el polvo resultante y se pasa entonces la mezcla a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 14. Se secan los gránulos así producidos a 50ºC y se pasan a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 18. Se añaden luego el carboximetilalmidón sódico, el estearato de magnesio y el talco, previamente pasados por un tamiz U.S. de malla del Nº 60, a los gránulos, los cuales, tras la mezcla, son comprimidos en una máquina de tabletas para obtener tabletas con un peso cada una de 150 mg.
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Ejemplo de Formulación 5
Se preparan cápsulas, cada una con un contenido de 80 mg de ingrediente activo, como sigue:
35
Se mezclan el ingrediente activo, la celulosa, el almidón y el estearato de magnesio, se pasan a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 45 y se introducen en cápsulas de gelatina duras en cantidades de 200 mg.
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Ejemplo de Formulación 6
Se preparan supositorios, cada uno con un contenido de 225 mg de ingrediente activo, como sigue:
36
Se pasa el ingrediente activo a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 60 y se suspende en los glicéridos de ácidos grasos saturados previamente fundidos usando el mínimo calor necesario. Se vierte entonces la mezcla en un molde de supositorios de 2 g de capacidad nominal y se deja enfriar.
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Ejemplo de Formulación 7
Se preparan suspensiones, cada una con un contenido de 50 mg de ingrediente activo, como sigue:
37
Se pasa el ingrediente activo a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 45 y se mezcla con la carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta homogénea. Se diluyen la solución de ácido benzoico, el sabor y el color con una porción del agua y se añaden con agitación. Se añade entonces suficiente agua para producir el volumen requerido.
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Ejemplo de Formulación 8
Se puede preparar una formulación intravenosa como sigue:
38
Se administra la solución de los ingredientes anteriores, en general, por vía intravenosa a un sujeto a un ritmo de 1 ml por minuto.
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Aplicabilidad industrial
Como se ha descrito antes, los inventores de la presente invención vieron por vez primera que las sPLA_{2} de los grupos V y X son responsables de la aparición y el desarrollo de la arteriosclerosis al demostrar que estas enzimas degeneran las lipoproteínas del suero y que estas enzimas se expresan en lesiones arterioscleróticas. La invención se basa en estos hallazgos. Los inventores examinaron la actividad inhibidora de inhibidores de sPLA_{2} sobre la degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} de los grupos V y X y mostraron que dichos compuestos son útiles en el tratamiento de la enfermedad isquémica basada en arteriosclerosis. Específicamente, la invención es aplicable a medicamentos para el tratamiento y la prevención de la enfermedad isquémica basada en arteriosclerosis debido a la inhibición de la degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} de los grupos V y/o X.

Claims (18)

1. Uso de un compuesto inhibidor de las sPLA_{2} de los grupos V o X representado por la fórmula general (I):
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39 
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donde
el anillo A es:
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40 
\vskip1.000000\baselineskip
donde cualquiera de R^{1} y R^{2} es un grupo de fórmula: -(L^{1})-(grupo ácido) donde L^{1} es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L^{1})-(grupo ácido) donde L^{1} es como se ha definido anteriormente; y
cada uno de R^{3} y R^{4} es independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un substituyente no interfiriente; y
-B- es un grupo entre (e)-(h):
41
donde
R^{5} es un substituyente seleccionado entre el grupo consistente en (j) un grupo alquilo C_{1}-C_{20}, alquenilo C_{2}-C_{20}, alquinilo C_{2}-C_{20} o carbocíclico o un grupo heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de fórmula: -(L^{2})-R^{8} en el que L^{2} es un grupo de enlace divalente de 1-18 átomos seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno, un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y R^{8} es un grupo seleccionado entre (j) y (k);
R^{6} es un átomo de hidrógeno, un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{3}, un cicloalquilo C_{3}-C_{4}, un cicloalquenilo C_{3}-C_{4}, un alquiloxi C_{1}-C_{3} o un alquiltío C_{1}-C_{3};
R^{7} es un átomo de hidrógeno o un substituyente no interfiriente;
R^{A} es un grupo de fórmula:
42
donde cada uno de R^{9} y R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; cada uno de X e Y es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es -NH_{2} o -NHNH_{2};
R^{B} es -CONH_{2} o -CONHNH_{2}; y
el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un anillo de benceno;
a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o (f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c);
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo, para la fabricación de un medicamento para suprimir la degeneración de las lipoproteínas del suero y/o tratar o prevenir la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir una enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
2. El uso según la reivindicación 1, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual
R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula: -(L^{3})-R^{11}, donde L^{3} es -OCH_{2}-, -SCH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -OCH(CH_{3})- o -O-CH-(CH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5})-; y R^{11} es -COOH, -CONHSO_{2}C_{6}H_{5}, -SO_{3}H o - P(O)(OH)_{2}; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula: -(L^{4})-R^{12} donde L^{4} es un grupo de fórmula:
43
donde cada uno de R^{13} y R^{14} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un aralquilo C_{1}-C_{10}, un carboxi, un alquiloxicarbonilo o un halógeno; y R^{12} es -COOH, -SO_{3}H o -P(O)(OH)_{2},
a condición de que R^{1} y R^{2} no sean un átomo de hidrógeno simultáneamente;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual
R^{3} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo C_{3}-C_{6}, arilo o heterocíclico y R^{4} es un átomo de hidrógeno o un halógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual
R^{5} es un grupo -(CH_{2})_{1-6}-R^{15} donde R^{15} es un grupo de fórmula:
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44 
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada uno de b, d, f, h, j, m y o es independientemente un número entero de 0 a 2; cada uno de R^{16} y R^{17} es un grupo seleccionado independientemente entre un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiltío C_{1}-C_{10}, un ariloxi, un fenilo y un haloalquilo C_{1}-C_{10}; \alpha es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; \beta es -CH_{2}- o -(CH_{2})_{2}-; \gamma es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; c, i y p son un número entero de 0 a 5; e es un número entero de 0 a 7; g es un número entero de 0 a 4; y cada uno de k y n es independientemente un número entero de
0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
\newpage
5. El uso según la reivindicación 4, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual
R^{5} es un grupo -CH_{2}-R^{18}, donde R^{18} es un grupo de fórmula:
46
donde \beta es -CH_{2}- o -(CH_{2})_{2}-; R^{19} es un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; y E es un enlace sencillo, -CH_{2}-, o -O-;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual R^{1} es -OCH_{2}COOH, o un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo.
7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual R^{2} es un átomo de hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual R^{6} es un alquilo C_{1}-C_{3}, o una sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I) en la cual R^{A} es -CH_{2}CONH_{2} o -COCONH_{2}, o una sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
10. El uso según la reivindicación 1, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula:
47
470 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
48
480
o una sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
11. El uso según la reivindicación 1, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V es mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\newpage
o
50
o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
12. El uso según la reivindicación 1, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X es mostrado por la fórmula:
51
52
o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
13. Un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V o X representado por la fórmula general (I):
53 
\newpage
donde
el anillo A es:
\vskip1.000000\baselineskip
54 
\vskip1.000000\baselineskip
donde cualquiera de R^{1} y R^{2} es un grupo de fórmula: -(L^{1})-(grupo ácido) donde L^{1} es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L^{1})-(grupo ácido) donde L^{1} es como se ha definido anteriormente; y
cada uno de R^{3} y R^{4} es independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un substituyente no interfiriente; y
-B- es un grupo entre (e)-(h):
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55 
\vskip1.000000\baselineskip
donde
R^{5} es un substituyente seleccionado entre el grupo consistente en (j) un grupo alquilo C_{1}-C_{20}, alquenilo C_{2}-C_{20}, alquinilo C_{2}-C_{20} o carbocíclico o un grupo heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de fórmula: -(L^{2})-R^{8} en el que L^{2} es un grupo de enlace divalente de 1-18 átomos seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno, un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y R^{8} es un grupo seleccionado entre (j) y (k);
R^{6} es un átomo de hidrógeno, un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{3}, un cicloalquilo C_{3}-C_{4}, un cicloalquenilo C_{3}-C_{4}, un alquiloxi C_{1}-C_{3} o un alquiltío C_{1}-C_{3};
R^{7} es un átomo de hidrógeno o un substituyente no interfiriente;
R^{A} es un grupo de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
56 
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada uno de R^{9} y R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; cada uno de X e Y es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es -NH_{2} o -NHNH_{2};
R^{B} es -CONH_{2} o -CONHNH_{2}; y
el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un anillo de benceno;
a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o (f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c);
o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo, para uso en el tratamiento de la supresión de la degeneración de las lipoproteínas del suero y/o el tratamiento o la prevención de la arteriosclerosis y/o el tratamiento o la prevención de una enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
14. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X según la reivindicación 13, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
59
o una sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
15. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V según la reivindicación 13, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V es mostrado por la fórmula:
60 
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61
o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
\newpage
16. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X según la reivindicación 13, donde el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X es mostrado por la fórmula:
62 
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63
64 
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
17. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X según la reivindicación 16 de fórmula:
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65 
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o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo para uso en el tratamiento de la arteriosclerosis y/o de la enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
\newpage
18. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X según la reivindicación 16 de fórmula:
66
o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo para uso en el tratamiento de la arteriosclerosis y/o de la enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001267823A1 (en) * 2000-06-29 2002-01-08 Shionogi And Co., Ltd. Compounds exhibiting x-type spla2 inhibiting effect
US20050244367A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-03 Ilypsa, Inc. Phospholipase inhibitors localized in the gastrointestinal lumen
MX2007004525A (es) 2004-10-12 2007-09-19 Decode Genetics Inc Sulfonamidas biciclicas peri-sustituidas para enfermedad de arteria oclusiva.
EP1852433B1 (en) 2004-10-29 2011-11-23 Zeria Pharmaceutical Co., Ltd. Carbazole derivative, solvate thereof, or pharmaceutically acceptable salt thereof
EP1960356A2 (en) 2005-11-03 2008-08-27 Ilypsa, Inc. Multivalent indole compounds and use thereof as phospholipase-a2 inhibitors
EP1948602A2 (en) * 2005-11-03 2008-07-30 Ilypsa, Inc. Indole compounds having c4-amide substituents and use thereof as phospholipase-a2 inhibitors
CA2652152A1 (en) 2006-05-16 2007-11-29 Decode Genetics Ehf Process for preparing 7-(acryloyl)indoles
US8048880B2 (en) * 2007-05-03 2011-11-01 Anthera Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cardiovascular disease and dyslipidemia using secretory phospholipase A2 (SPLA2) inhibitors and SPLA2 inhibitor combination therapies
EP2154958A4 (en) * 2007-05-03 2011-05-04 Anthera Pharmaceuticals Inc TREATMENT OF HEART CIRCULATION DISEASES AND DYSLIPIDEMIA WITH INHIBITORS OF SECRETARY PHOSPHOLIPASE A2 (SPLA2) AND SPLA2 HEMMER COMBINATION THERAPIES
US20090062369A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Joaquim Trias Use of secretory phospholipase a2 (spla2) inhibitors to decrease spla2 levels
WO2010038104A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination of cardiovascular risk factors for the diagnosis/prognosis of a cardiovascular disease/event.
CN107233337A (zh) 2009-04-29 2017-10-10 阿马里纳药物爱尔兰有限公司 含有epa和心血管剂的药物组合物以及使用其的方法
KR101037404B1 (ko) * 2010-12-07 2011-05-30 박철형 가변설치가 가능한 압출본체에 의한 천장용 엘이디 조명등

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL109311A0 (en) 1993-04-16 1994-07-31 Lilly Co Eli 1H-indole-3-acetamide sPla2 inhibitors
IL109309A (en) 1993-04-16 2000-06-29 Lilly Co Eli 1-H-indole-3-acetic acid hydrazide SPLA2 inhibitors and pharmaceutical compositions containing them
WO1995000649A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Smithkline Beecham Plc Lipoprotein associated phospholipase a2, inhibitors thereof and use of the same in diagnosis and therapy
US5498608A (en) * 1994-01-07 1996-03-12 Salix Pharmaceuticals Use of 2-hydroxy-5-phenylazobenzoic acid derivatives as colon cancer chemopreventative and chemotherapeutic agents
EP1950200B1 (en) 1994-04-01 2012-01-11 Eli Lilly And Company [[3-(2-amino-1,2-dioxoethyl)-2-ethyl-1-(phenylmethyl)-11H-indol-4-yl]oxy]acetic acid methyl ester as sPLA2 inhibitor
US5641800A (en) 1994-07-21 1997-06-24 Eli Lilly And Company 1H-indole-1-functional sPLA2 inhibitors
US6214876B1 (en) 1994-07-21 2001-04-10 Eli Lilly And Company Indene-1-acetamide sPLA2 inhibitors
US6645976B1 (en) 1994-07-21 2003-11-11 Eli Lilly And Company Indolizine SPLA2inhibitors
IL124871A (en) 1995-12-13 2002-04-21 Lilly Co Eli Naphthyl glyoxamides and medicinal preparations containing them, as inhibitors of sPLA2
DE69614232T2 (de) 1995-12-13 2002-01-10 Eli Lilly And Co., Indianapolis Naphthyl-Acetamide als sPLA2-Inhibitoren
KR20000049210A (ko) 1996-10-30 2000-07-25 피터 지. 스트링거 치환된 트리시클릭류
US5916922A (en) 1996-12-03 1999-06-29 Eli Lilly And Company Phenyl glyoxamides as SPLA2 inhibitors
US6353128B1 (en) 1996-12-03 2002-03-05 Eli Lilly And Company Phenyl acetamides as sPLA2 inhibitors
ID18983A (id) 1996-12-04 1998-05-28 Lilly Co Eli Pirazola sebagai inhibitor sekresi fosfolipase a2 non-pankreas pada manusia
US5919774A (en) 1996-12-10 1999-07-06 Eli Lilly And Company Pyrroles as sPLA2 inhibitors
BR9909345A (pt) * 1998-03-31 2000-12-12 Shionogi & Co Pirrolo [1,2-a] pirazina inibidor de spla2
KR20010034881A (ko) * 1998-05-21 2001-04-25 시오노 요시히코 ｓＰＬＡ2 억제 효과를 갖는 피롤로[1,2-ｂ]피리다진 유도체
DE69931963D1 (de) * 1998-10-14 2006-07-27 Shionogi & Co Spla2-inhibitoren zur behandlung von ischämischen reperfusionsschäden
WO2001036420A1 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Shionogi & Co., Ltd. Tricyclic azaindolizine derivatives having an spla2- inhibiting effect
AU2001267823A1 (en) * 2000-06-29 2002-01-08 Shionogi And Co., Ltd. Compounds exhibiting x-type spla2 inhibiting effect

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