ES2324767T3 - Marcador para estados inflamatorios. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento ex vivo para diagnosticar un estado inflamatorio seleccionado del grupo constituido por síndrome coronario agudo y artritis reumatoide, comprendiendo dicho procedimiento: a) medir el nivel de proteína-A de plasma asociada a embarazo (PAPP-A) en una muestra biológica de un paciente no embarazado; b) comparar dicho nivel con el de sujetos testigo; y c) diagnosticar dicho estado inflamatorio si el nivel de PAPP-A está aumentado con relación al de sujetos testigo.
Description
Marcador para estados inflamatorios.
La invención se refiere a usos de
proteína-A del plasma asociada con embarazo
(PAPP-A) como marcador y objetivo terapéutico para
estados inflamatorios seleccionados del grupo constituido por
síndromes coronarios agudos y artritis reumatoide.
La proteína-A del plasma
asociada a embarazo (PAPP-A) es una glicoproteína de
alto peso molecular aislada del suero del embarazo humano. Se usa
rutinariamente en la actualidad como un índice de la función
placental y examen en el primer trimestre de síndrome de Down. No
se conocía una función biológica para PAPP-A hasta
una evidencia reciente enlazada al eje del factor de crecimiento de
tipo insulina (IGF), el equilibrio dinámico entre
IGF-1, propiedades de unión de IGF (IGFBP's) y
proteasas de IGFBP, que determinan finalmente la extensión de
sucesos celulares dependientes de IGF. PAPP-A divide
específicamente IGFBP-4, que libera
IGF-1 y lo hace disponible para activar receptores.
Lawrence et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96:3149-3153; y Durham et al. (1994) J. Bone
Min. Res. 9:111-117.
El documento WO 00/54806 describe un
procedimiento para examinar estados de proliferación local alterados
en pacientes no embarazados, que incluye detectar niveles de
PAPP-A.
La invención se basa en el uso de niveles de
PAPP-A en suero para diagnosis de estados
inflamatorios seleccionados del grupo constituido por síndromes
coronarios agudos (angina inestable, infarto de miocardio agudo,
muerte cardiaca súbita, rotura de placas coronarias o trombosis) en
todas las fases de su existencia, y artritis reumatoide. Los
pacientes con síndromes coronarios agudos están en un riesgo
considerable de muerte y complicaciones graves, y pueden mejorarse
los resultados con una terapia apropiada. Así, una diagnosis rápida
y precisa de dolor de pecho es crítica para el paciente. También,
hay implicaciones importantes para predecir qué pacientes están en
riesgo de síndromes coronarios agudos antes de que tenga lugar el
síndrome. Los resultados descritos en la presente memoria
demuestran que los niveles de PAPP-A del suero son
elevados en angina inestable e infarto de miocardio agudo, están
dentro de intervalos normales en angina estable y se correlacionan
con niveles en suero de proteína reactiva con C de alta
sensibilidad (CRP) e IGF-1 libre. Además,
PAPP-A es altamente expresada en placas inestables
de pacientes con muerte cardiaca súbita. Así, PAPP-A
puede usarse como un marcador temprano de estados inflamatorios y,
en particular, síndromes coronarios agudos.
En un aspecto, la invención presenta un
procedimiento para diagnosticar un estado inflamatorio seleccionado
del grupo constituido por síndrome coronario agudo tal como angina
inestable, muerte cardiaca súbita o infarto de miocardio o artritis
reumatoide. El procedimiento incluye medir el nivel de
PAPP-A en una muestra biológica (por ejemplo,
sangre completa, plasma o suero) de un paciente no embarazado;
comparar el nivel con el de sujetos testigo; y diagnosticar el
estado inflamatorio en base al nivel de PAPP-A con
relación al de sujetos testigo. Puede diagnosticarse que el
paciente tiene el estado inflamatorio si está aumentado el nivel de
PAPP-A con relación al de sujetos testigo. El nivel
de PAPP-A puede medirse usando un inmunoensayo tal
como un ELISA. Puede capturarse PAPP-A con
anticuerpos policlonales anti-PAPP-A
o un anticuerpo monoclonal
anti-PAPP-A. El procedimiento puede
incluir adicionalmente medir el nivel de un polipéptido seleccionado
del grupo constituido por proteína reactiva con C de alta
sensibilidad, creatina quinasa MB, troponina I, troponina T,
creatina quinasa, creatinina,. fibrinógeno,
interleuquina-1 e interleuquina-6, y
diagnosticar el estado inflamatorio en base al nivel del
polipéptido y el nivel de PAPP-A con relación al de
sujetos testigo.
En otro aspecto todavía, la invención presenta
un artículo de fabricación para diagnosticar un estado inflamatorio
seleccionado del grupo constituido por síndrome coronario agudo o
artritis reumatoide en un paciente no embarazado que incluye
anticuerpos para medir niveles de una pluralidad de polipéptidos en
una muestra biológica del paciente. La pluralidad de polipéptidos
incluye PAPP-A y uno o más de los polipéptidos
seleccionados del grupo constituido por proteína reactiva con C de
alta sensibilidad, creatina quinasa MB, troponina I, troponina T,
creatina quinasa, creatinina,. fibrinógeno,
interleuquina-1 e interleuquina-6.
La muestra biológica puede seleccionarse del grupo constituido por
sangre completa, plasma y suero.
La invención presenta también un anticuerpo para
uso en diagnosis de un estado inflamatorio seleccionado del grupo
constituido por síndrome coronario agudo y artritis reumatoide, en
el que el anticuerpo tiene afinidad de unión específica para
PAPP-A eficaz para unirse detectablemente a
PAPP-A, en el que el anticuerpo está marcado. Puede
detectarse el nivel del anticuerpo unido a PAPP-A en
el paciente; y diagnosticarse el estado inflamatorio en base al
nivel del anticuerpo unido a PAPP-A. La etapa de
detección puede incluir formación de imagen de diagnóstico tal como
tomografía de emisión de positrones, escintigrafía gamma, tomografía
informatizada de emisión de fotones simple, formación de imagen de
resonancia magnética, ultrasonido intravascular o formación de
imagen de resonancia magnética funcional. La marca puede ser un
radioisótopo (por ejemplo, ^{123}I, ^{18}F, ^{111}In,
^{67}Ga y ^{99}mTc).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Salvo definición en contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen
el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de
experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta
invención. Aunque pueden usarse para practicar la invención
procedimientos y materiales similares o equivalentes a los
descritos en la presente memoria, se describen después
procedimientos y materiales adecuados. En caso de conflicto, regirá
la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones. Además,
los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y
no pretenden ser limitativos.
Otros aspectos y ventajas de la invención serán
evidentes por la siguiente descripción detallada y por las
reivindicaciones.
La Figura 1 es un gráfico de bloques de niveles
de PAPP-A circulantes. El análisis de
Kruskal-Wallis para PAPP-A indicó
diferencias de grupos altamente significativas (p < 0,0001).
La Figura 2 es un gráfico de niveles de proteína
reactiva con C en los cuatro grupos estudiados: testigos no
ateroscleróticos, angina estable, angina inestable e infarto de
miocardio agudo. El análisis de Kruskal-Wallis para
proteína reactiva con C indicó diferencias de grupos altamente
significativas (p = 0,0015).
Las Figuras 3A y 3B son gráficos de la
correlación entre PAPP-A y proteína reactiva con C
(3A), y entre PAPP-A y niveles de
IGF-I libre (3B) en pacientes con síndromes
coronarios agudos (n = 37). Se encontró una asociación
significativa entre PAPP-A y proteína reactiva con C
(Ñ = 0,61, p < 0,001) y con IGF-I libre (Ñ =
0,39, p = 0,018).
Las Figuras 4A y 4B son gráficos de la
correlación entre niveles de PAPP-A y los marcadores
de necrosis cardiaca troponina I (4A) y CK-MB (4B)
en pacientes con infarto de miocardio agudo. No se encontró una
asociación significativa entre troponina I (Ñ = 0,33, p = 0,18) o
CK-MB (Ñ = 0,23, p = 0,36) y niveles de
PAPP-A.
Las Figuras 5A y 5B son gráficos del análisis de
características de funcionamiento del receptor (ROC) de
PAPP-A y proteína reactiva con C en pacientes con
infarto de miocardio agudo (5A) y angina inestable (5B). El área
bajo la curva (AUC) de PAPP-A fue 0,94 en infarto de
miocardio agudo (error típico = 0,03) y 0,88 (error típico = 0,05)
en angina inestable. Se encontraron diferencias significativas
estadísticamente en AUCs entre los dos marcadores para infarto de
miocardio agudo (p = 0,026) y angina inestable (p = 0,011). CRP =
proteína reactiva con C.
La invención presenta procedimientos para
diagnosticar estados inflamatorios en un mamífero (por ejemplo, un
paciente humano), en los que el estado inflamatorio se selecciona
del grupo constituido por síndromes coronarios agudos (angina
inestable, infarto de miocardio agudo, muerte cardiaca súbita,
rotura de placas coronaria o trombosis), y artritis reumatoide.
Como se describe en la presente memoria, los niveles de
PAPP-A son significativamente más altos en
pacientes con tales estados inflamatorios. Por ejemplo, los niveles
de PAPP-A aumentan 100 veces o más en pacientes con
artritis reumatoide. Los niveles de PAPP-A también
aumentan significativamente en pacientes con angina inestable e
infarto de miocardio. Como los niveles de PAPP-A
elevados son comunes en angina inestable e infarto de miocardio
agudo, y PAPP-A está sobrerregulada en placas
inestables de pacientes con muerte cardiaca súbita, puede usarse
PAPP-A como marcador para tales estados. Como se
describe en la presente memoria, niveles de PAPP-A
por encima de 10 mUI/l identificaban 17 de 20 pacientes con angina
inestable (85,0%) y 16 de 17 pacientes con infarto de miocardio
(94,1%). Como contraste, las sensibilidades de diagnóstico de
troponinas específicas cardiacas y proteína reactiva con C en
angina inestable son bajas. Como se describe en la presente
memoria, la troponina I se elevó en 3 (15%) y la proteína reactiva
con C en 10 (50%) de pacientes con angina inestable. En otros
estudios, sólo un 22% de pacientes tenían un resultado positivo para
troponina T, 36% tenían un resultado positivo para troponina I y
65% habían elevado los niveles de proteína reactiva con C. Véase
Hamm et al., N. Engl. J. Med., 1997,
337;1648-1653 y Liuzzo et al., N. Engl. J.
Med., 1994, 331:417-424. No obstante, ambos
marcadores están asociados con resultados desfavorables cuando son
elevados. Así, PAPP-A parece ser un marcador de
placas inestables valioso incluso cuando no son elevadas troponinas
y proteína reactiva con C, identificando potencialmente pacientes
con alto riesgo que de otro modo podrían permanecer sin
diagnosticar. Sin quedar ligado a un mecanismo particular,
PAPP-A puede estar implicada directamente en la
patofisiología de síndromes coronarios agudos como una
metaloproteasa, e indirectamente a través de la liberación de
IGF-I.
La secuencia de cADN de PAPP-A
indica que la forma del suero se deriva de una
pre-proproteína con un péptido señal de 22 residuos
putativo, una pro-parte de 58 residuos y un
polipéptido maduro circulante de 1547 residuos. La secuencia no
muestra similitud global con ninguna proteína conocida, pero
contiene dos motivos de secuencia comunes a las metzincinas, una
superfamilia de metaloproteasas. La secuencia contiene también tres
repeticiones de Lin-12/Notch conocidas de la
superfamilia de proteínas Notch, y cinco repeticiones de consenso
cortas conocidas de componentes del sistema de complemento.
La inhibición de la actividad de
PAPP-A es útil para el tratamiento de los estados
inflamatorios definidos antes. Como se describe en la presente
memoria, la expresión de PAPP-A es más fuerte en el
hombro inflamatorio de una placa inestable. Por tanto, la
inhibición de la expresión de PAPP-A y/o la función
proteolítica podrían aumentar la estabilidad de la placa. Sin
quedar ligado a un mecanismo particular, PAPP-A como
metaloproteasa puede estar implicada directamente en la
vulnerabilidad de placas, incluso antes de que la placa se
manifieste clínicamente. La proforma de la proteína básica
principal de eosinófilos (proMBP), que está enlazada por disulfuro
a PAPP-A en el suero del embarazo para formar un
complejo 2:2 (PAPP-A/proMBP) de aproximadamente 500
kDa, puede ser útil para tratar estados inflamatorios ya que proMBP
funciona como un inhibidor de la actividad de
PAPP-A.
En general, los procedimientos de la invención
incluyen medir el nivel de PAPP-A en una muestra
biológica de un paciente no embarazado y comparar el nivel con el
de sujetos testigo. Un estado inflamatorio se diagnostica en base
al nivel de PAPP-A con relación al testigo. Así, se
determina si los niveles de PAPP-A son aumentados,
disminuidos o los mismos que los de los sujetos testigo. Si los
niveles de PAPP-A son aumentados con relación a los
de sujetos testigo, la diagnosis es que está presente un estado
inflamatorio. En particular, un valor umbral de
PAPP-A de 10 mUI/ml puede usarse para identificar
con precisión pacientes con síndromes coronarios agudos. El nivel
de PAPP-A puede valorarse midiendo proteína
PAPP-A, mensaje (mARN) o actividad. Las muestras
biológicas adecuadas para medir niveles de PAPP-A
incluyen, por ejemplo, sangre (incluyendo sangre completa, plasma y
suero), orina, saliva, lavados orales y biopsias de tejidos tales
como piel, hueso o placa de vasos sanguíneos. La sangre es una
muestra biológica particularmente útil.
La proteína PAPP-A puede
detectarse, por ejemplo, inmunológicamente. Por ejemplo, puede
efectuarse un ensayo sandwich capturando PAPP-A de
una muestra biológica con un anticuerpo que tenga afinidad de unión
específica para PAPP-A. Puede detectarse entonces
PAPP-A con un anticuerpo marcado que tenga actividad
de unión específica para PAPP-A. Alternativamente,
pueden usarse técnicas inmunohistoquímicas estándares para detectar
proteína PAPP-A, usando tales anticuerpos. Están
disponibles anticuerpos que tienen afinidad para complejos
PAPP-A/proMBP. Véase, por ejemplo, Qin et
al., Clin. Chem., 1997, 43(12):2323-2332.
Pueden producirse por procedimientos estándares anticuerpos
monoclonales que tienen actividad de unión específica para
PAPP-A, pero no para complejos
PAPP-A/proMBP.
En general, puede producirse
PAPP-A no acomplejada a proMBP de diversas formas,
incluyendo recombinantemente, o puede purificarse a partir de una
muestra biológica, y usarse para inmunizar animales. Para producir
PAPP-A recombinante, una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica polipéptido de PAPP-A puede
ligarse a un vector de expresión y usarse para transformar una
célula hospedante bacteriana o eucariota. En general, las
construcciones de ácidos nucleicos incluyen una secuencia
reguladora enlazada operativamente a una secuencia de ácidos
nucleicos de PAPP-A. Las secuencias reguladoras no
codifican típicamente un producto génico, pero afectan en cambio a
la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. En sistemas
bacterianos, puede usarse una cepa de Escherichia coli tal
como BL-21. Los vectores de E. coli adecuados
incluyen la serie pGEX de vectores que producen proteínas de fusión
con glutationa S-transferasa (GST). Los E.
coli transformados se desarrollan típicamente exponencialmente,
y se estimulan después con isopropiltiogalactopiranósido (IPTG)
antes de cosechar. En general, tales proteínas de fusión son
solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas por
adsorción a perlas de glutationa-agarosa seguida
por elución en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX se
diseñan para incluir trombina o lugares de división por proteasa de
factor Xa, de modo que el producto génico objetivo clonado pueda
liberarse del resto de GST.
Pueden producirse linajes de células de
mamíferos que expresan establemente PAPP-A usando
vectores de expresión que contienen los elementos de control
apropiados y un marcador seleccionable. Por ejemplo, el vector de
expresión eucariota pCDNA.3.1+ (Invitrogen San Diego, CA) es
adecuado para expresión de PAPP-A en, por ejemplo,
células COS o células HEK293. Tras introducir el vector de
expresión por electroporación, DEAE dextrano, u otro procedimiento
adecuado, se seleccionan linajes de células estables. En un sistema
de expresión usando pCDNA3.1+ y células HEK293, la producción de la
proteína fue aproximadamente 51 g/ml. El producto segregado fue un
dímero exento de proMBP. Alternativamente, PAPP-A
puede transcribirse y traducirse in vitro usando extracto de
germen de trigo o lisado de reticulocitos de conejo.
En células hospedantes eucariotas, puede
utilizarse un cierto número de sistemas de expresión basados en
virus para expresar PAPP-A. Un ácido nucleico que
codifica PAPP-A puede clonarse en, por ejemplo, un
vector baculovírico y usarse después para transfectar células de
insectos. Alternativamente, el ácido nucleico que codifica
PAPP-A puede introducirse en un vector vírico de
SV40, retrovírico o basado en vaccinia y usarse para infectar
células hospedantes.
La PAPP-A recombinante
(rPAPP-A) es inmunorreactiva contra todos los
anticuerpos monoclonales disponibles en ELISA y en manchas de
Western. La PAPP-A recombinante se segrega como un
homodímero de aproximadamente 400 kDa y, después de reducirse,
produce monómeros de aproximadamente 200 kDa. La
rPAPP-A es activa y divide IGFBP-4
de una manera dependiente de IGF. La PAPP-A
recombinante es aproximadamente 100 veces más activa que el
complejo PAPP-A/proMBP en suero del embarazo.
La PAPP-A puede purificarse
usando técnicas de purificación de proteínas estándares. Por
ejemplo, puede purificarse PAPP-A a partir de
medios acondicionados haciéndola pasar sobre ácido iminodiacético
inmovilizado en Sepharose 6B cargado con Zn^{+2}. Después de
eluir las proteínas unidas con un gradiente de pH decreciente por
etapas, la fracción de pH 5,0 puede purificarse adicionalmente
haciéndola pasar sobre una columna de aglutinina de germen de
trigo. Las proteínas unidas pueden eluirse con una solución de
Tris-sal, y después mediante
N-acetilglucosamina. Alternativamente, puede usarse
una columna de heparina sepharose y se eluye PAPP-A
con un aumento de la concentración de sal hasta 1000 mM. Las
fracciones que contienen PAPP-A, medida con
anticuerpos específicos de PAPP-A o con un ensayo
de actividad de proteasa específico, pueden agruparse, concentrarse
y valorarse después por electroforesis en SDS gel de
poliacrilamida. En SDS/PAGE reductor, la masa molecular de monómero
de PAPP-A es aproximadamente 200 kDa.
Pueden inmunizarse diversos animales hospedantes
por inyección de PAPP-A. Los animales hospedantes
incluyen conejos, pollos, ratones, cobayas y ratas. Los diversos
coadyuvantes que pueden usarse para aumentar la respuesta
inmunológica dependen de la especie del hospedante e incluyen
coadyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales
tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales
como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos,
emulsiones de aceite, hemocianina de lapa ojo de cerradura y
dinitrofenol. Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpos que están contenidas en
los sueros de los animales inmunizados. Los anticuerpos
monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un
antígeno particular, pueden prepararse usando un polipéptido de
PAPP-A y tecnología de hibridomas estándar. En
particular, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por cualquier
técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo
por linajes celulares continuos en cultivo tal como se describe por
Kohler, G. et al., Nature, 256:495 (1975), la técnica de
hibridomas de células B humanas (Kosbor et al., Immunology
Today, 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:2026 (1993)), y la técnica de hibridomas de EBV (Cole et
al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R.
Liss, Inc., págs. 77-96 (1983)). Tales anticuerpos
pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG,
IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de ellas. El hibridoma que
produce los anticuerpos monoclonales de la invención puede
cultivarse in vitro e in vivo.
Pueden generarse por técnicas conocidas
fragmentos de anticuerpos que tienen afinidad de unión específica
para polipéptido de PAPP-A. Por ejemplo, tales
fragmentos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fragmentos
F(ab')2, que pueden producirse por digestión con pepsina de
la molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab que pueden generarse
reduciendo los puentes disulfuro de 2 fragmentos F(ab').
Alternativamente, pueden construirse genotecas de expresión de Fab.
Véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246:1275 (1989).
Una vez producidos, se ensaya en los anticuerpos o fragmentos de
ellos reconocimiento de PAPP-A por procedimientos de
inmunoensayo estándares que incluyen técnicas ELISA,
radioinmunoensayos y manchas de Western. Véase Short Protocols in
Molecular Biology, Capítulo 11, Green Publishing Associates y John
Wiley & Sons, redactado por Ausubel F.M. et al., 1992.
Se identifican en una selección positiva anticuerpos que tienen
afinidad para PAPP-A. Los anticuerpos identificados
en tal selección pueden seleccionarse negativamente frente a
PAPP-A/proMBP, para identificar anticuerpos que
tienen actividad de unión específica para epítopes de
PAPP-A que no son accesibles en el complejo
específico de PAPP-A y proMBP.
Puede detectarse un mensaje de
PAPP-A, por ejemplo, mediante un ensayo de reacción
en cadena de polimerasa (PCR). En general, PCR se refiere a
multiplicación de un ácido nucleico objetivo, usando información de
secuencias de los extremos de la región de interés o más allá para
diseñar cebadores de oligonucleótidos que sean de secuencia
idéntica o similar a cadenas opuestas de la plantilla a multiplicar.
Puede usarse PCR para multiplicar secuencias específicas de ADN así
como ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o ARN celular
total. Los cebadores tienen típicamente de 14 a 40 nucleótidos de
longitud, pero pueden variar de 10 nucleótidos a cientos de
nucleótidos de longitud. Se describe PCR, por ejemplo, en PCR
Primer: A Laboratory Manual, red. por Dieffenbach, C. y Dveksler,
G., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Los ácidos nucleicos
pueden multiplicarse también por reacción en cadena de ligasa,
multiplicación por desplazamiento de cadena, replicación de
secuencia auto-sostenida o multiplicación basada en
secuencias de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Lewis, R.,
Genetic Engineering News, 12(9):1 (1992); Guatelli et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878
(1990); y Weiss, R., Science, 254:1292 (1991).
Por ejemplo, los niveles de mARN de
PAPP-A pueden detectarse usando ensayo de
transcripción inversa-reacción en cadena de
polimerasa (RT-PCR). Véase, por ejemplo, el
documento WO 00/54806. En particular, puede comultiplicarse cADN de
PAPP-A con una variante de supresión del mismo que
se usa como patrón interno (IS). La cantidad de
PAPP-A se normaliza frente a la cantidad total de
mARN en la muestra, determinada como la cantidad de mARN de
é-actina. Se ha mostrado que RT-PCR es
1.000-10.000 veces más sensible que las técnicas de
manchas de ARN tradicionales, y puede detectar y cuantificar mARN
de PAPP-A y proMBP en muestras de tejidos.
Pueden cuantificarse productos de PCR
competitiva por cromatografía de intercambio iónico en un sistema de
HPLC, un método preciso que implica un mínimo de manipulación
post-PCR. Alternativamente, puede efectuarse PCR
cuantitativa en tiempo real usando, por ejemplo, el Sistema de
Detección de Secuencias ABI PRISM 7700 y sondas fluorógenas Taqman,
o el instrumento LightCycler^{TM} de Roche. Puede usarse una
referencia interna, tal como multiplicación del ARN 28S con
concentración de cebador limitante. Este procedimiento permite
cuantificación hasta aproximadamente 500 copias de la secuencia
objetivo.
Alternativamente, puede hacerse rutinariamente
ensayo de presencia de mARNs específicos en diferentes tejidos por
técnicas de manchas de ARN tales como Northern o manchas de puntos o
mediante tecnología de microdisposición.
La actividad de PAPP-A puede
detectarse examinando la actividad proteolítica de
IGFBP-4 en una muestra biológica. Por ejemplo,
puede incubarse un sustrato marcado detectablemente en presencia de
la muestra biológica en condiciones estables, y se detectan después
los productos proteolíticos. El sustrato puede ser, por ejemplo,
IGFBP-4 o un fragmento del mismo. En general, la
reacción puede realizarse a 37ºC en un tampón tal como CaCl_{2} 2
mM/Tris 50 mM (pH 7,5), incluyendo IGF-II o
fragmentos del mismo, o cualquier otro activador de proteasa.
Típicamente, el sustrato se marca radioactivamente con isótopos
tales como ^{125}I o ^{32}P, o se marca no radioactivamente con
biotina, digoxigenina o un fluoróforo. Se detecta la proteolisis de
IGFBP-4, por ejemplo, examinando productos de
proteolisis, tales como los productos de reacción de 18 y 14 kDa de
IGFBP-4. Pueden separarse proteínas radioactivas
reduciendo 15% de SDS/PAGE y visualizarse por autorradiografía. Los
productos de división proteolítica también pueden detectarse por
inmunomanchas.
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La actividad de PAPP-A puede
detectarse también después de capturar PAPP-A con
anticuerpos policlonales o moclonales inmovilizados, por ejemplo,
en un pocillo de una placa de microtitulación. Después de separar
por lavado proteína no unida de la muestra biológica, la actividad
de PAPP-A puede medirse con un sustrato sintético
de bajo peso molecular que libere un producto coloreado que pueda
detectarse espectrofotométricamente. Puede añadirse con el sustrato
IGF-II u otro activador de
PAPP-A.
Adicionalmente, la actividad de
PAPP-A puede detectarse incubando la muestra en un
pocillo que contenga sustrato inmovilizado, por ejemplo,
IGFBP-4. El sustrato se marca específicamente, es
decir, radioactiva o no radioactivamente. Por división proteolítica
del sustrato, se liberan en la fase líquida fragmentos marcados y
pueden detectarse. El sustrato puede inmovilizarse, por ejemplo,
revistiendo con anticuerpos o IGF-II.
También puede conseguirse el marcado usando
IGFBP-4 expresado con diferentes etiquetas en el
término N o el término C de la proteína, por ejemplo, una etiqueta
FLAG N-terminal y una etiqueta c-myc
C-terminal. Esto permite inmovilizarse
IGFBP-4 con un anticuerpo monoclonal que se una a
una de estas etiquetas. La detección de IGFBP-4
unido puede lograrse por metodología ELISA estándar usando, por
ejemplo, un anticuerpo monoclonal conjugado a peroxidasa que
reconozca la otra etiqueta. También puede inmovilizarse y detectarse
IGFBP-4 usando anticuerpos monoclonales que
reconozcan el término N y el término C, respectivamente. La
actividad proteolítica producirá una señal disminuida, dependiente
de la magnitud de actividad de proteinasa y el tiempo de
incubación.
Los estados inflamatorios síndrome coronario
agudo y artritis reumatoide también pueden diagnosticarse
administrando a un paciente una cantidad de un anticuerpo que tiene
afinidad de unión específica para PAPP-A eficaz
para visualizar PAPP-A in vivo. Además, la
visualización de PAPP-A permitiría identificar
lugares en el cuerpo de acumulaciones anormales, tales como placas
que sean potencialmente vulnerables. Se han descrito antes
anticuerpos adecuados y procedimientos para fabricar anticuerpos.
El anticuerpo está típicamente marcado, y se usa la formación de
imagen de diagnóstico para detectar anticuerpo unido a
PAPP-A. La diagnosis del estado inflamatorio se
basa en el aumento de PAPP-A como se ha descrito
antes. Puede fijarse el umbral en cualquier nivel, de modo que
pueda detectarse un nivel sobre el normal. Así, puede hacerse
diagnosis en base a la presencia o ausencia de anticuerpo unido a
PAPP-A.
Las marcas típicas que son útiles incluyen
radioisótopos usados para procedimientos de formación de imagen en
seres humanos. Los ejemplos no limitativos de marcas incluyen
radioisótopos tales como ^{123}I (yodo), ^{18}F (flúor),
^{99m}Tc (tecnecio), ^{111}In (indio) y ^{67}Ga (galio).
Pueden marcarse anticuerpos mediante técnicas estándares. Por
ejemplo, pueden yodarse anticuerpos usando cloramina T o
1,3,4,6-tetracloro-3a,6a-difenilglicourilo.
Pueden marcarse anticuerpos con ^{18}F mediante, por ejemplo,
4-[^{18}F]fluorobenzoato de
N-succinimidilo. Véanse Muller Gartner, H., TIB
Tech., 16:122-130 (1998); Saji, H., Crit. Rev. Ther.
Drug Carrier Syst., 16(2):209-244 (1999); y
Vaidyanathan y Zalutsky, Bioconjug. Chem.
5(4):352-6 (1994) para un examen de marcado
de anticuerpos con tales radioisótopos.
Los anticuerpos marcados se formulan con un
excipiente aceptable farmacéuticamente y se administran al paciente.
En general, los anticuerpos se administran intravenosamente (i.v.),
aunque pueden usarse también otras vías parenterales de
administración, incluyendo subcutánea, intramuscular, intrarterial,
intracarótida e intratecal. Las formulaciones para administración
parenteral pueden contener excipientes aceptables farmacéuticamente
tales como agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles
tales como polietilenglicol, aceites vegetales, naftalenos
hidrogenados y similares.
La dosificación de anticuerpo marcado a
administrar será determinada por el médico que atienda teniendo en
cuenta diversos factores conocidos para modificar la acción de
fármacos. Estos incluyen estado de salud, peso corporal, sexo,
dieta, tiempo y vía de administración, otras medicaciones y
cualesquiera otros factores clínicos relevantes.
Las técnicas de formación de imagen que pueden
usarse para detectar PAPP-A in vivo incluyen
tomografía de emisión de positrones (PET), escintigrafía gamma,
formación de imagen de resonancia magnética (MRI), formación de
imagen de resonancia magnética funcional (FMRI), tomografía
informatizada de emisión de fotones simple (SPECT) y ultrasonido
intravascular.
Pueden combinarse anticuerpos que tengan
afinidad de unión específica para PAPP-A con
material de envasado y venderse como un juego para diagnosticar
estados inflamatorios. Los componentes y procedimientos para
producir artículos fabricados son muy conocidos. Los artículos de
fabricación pueden combinar uno o más anticuerpos
anti-PAPP-A o fragmentos de ellos
como se describe en la presente memoria. Además, los artículos
fabricados incluyen anticuerpos que tienen afinidad de unión
específica con el polipéptido particular o anticuerpos secundarios.
También pueden incluirse en tales juegos instrucciones que describan
cómo son eficaces los diversos reactivos para diagnosticar estados
inflamatorios. Los polipéptidos que pueden ser útiles para medir en
combinación con PAPP-A incluyen marcadores
polipéptidos de inflamación, marcadores que se correlacionan con un
riesgo aumentado de angina inestable o infarto de miocardio (por
ejemplo, homocisteína), marcadores de daño cardiaco y otros
marcadores de inflamación no específicos. Por ejemplo, pueden
valorarse interleuquina-1 (IL-1),
IL-6 o neopterina en combinación con
PAPP-A como marcador para inflamación. Los
marcadores cardiacos y marcadores no específicos de inflamación
incluyen, por ejemplo, troponina I o T, hs-CRP,
creatina quinasa (CK), CK-MB, creatinina, mioglobina
y fibrinógeno.
Las combinaciones particulares de polipéptidos
que pueden usarse para diagnosticar un paciente con síndrome
coronario agudo incluyen, por ejemplo, PAPP-A,
troponina I y CK-MB; PAPP-A,
troponina I y hs-CRP; PAPP-A,
CK-MB y mioglobina; PAPP-A y
mioglobina; PAPP-A y hs-CRP;
PAPP-A y troponina I o T; y PAPP-A y
CK-MB. En general, mioglobina no es específica
cardiaca, pero se libera de miocardio infartado en una fase temprana
(aproximadamente 2-3 horas post infarto) y vuelve a
normal en aproximadamente 24 horas. Las isoformas cardiacas de
troponina I y troponina T son específicas, pero aparecen en la
circulación después que la mioglobina (5 a 48 horas post infarto).
El tejido de miocardio contiene una isoforma de
CK-MB, mientras que el tejido esquelético tiene
diferentes isoformas. Están disponibles comercialmente anticuerpos
que tienen afinidad de unión específica para tales marcadores
cardiacos.
El anticuerpo
anti-PAPP-A puede estar en un
recipiente tal como un vaso de plástico, polietileno, polipropileno,
etileno o propileno que es un tubo tapado o una botella. Son
ejemplos no limitativos de otros reactivos que pueden incluirse en
el juego, por ejemplo, anticuerpos secundarios marcados que se unen
al anticuerpo anti-PAPP-A y
tampones para lavado o que detectan PAPP-A. Pueden
incluirse en recipientes separados o pueden incluirse en una fase
sólida reactivos para medir niveles de otros polipéptidos con
anticuerpo anti-PAPP-A, por ejemplo,
un dispositivo de mano para ensayo de cabecera que incluye
anticuerpo anti-PAPP-A y uno o más
anticuerpos que tengan afinidad de unión específica para marcadores
de inflamación o, en particular, daño cardiaco.
La invención se describirá adicionalmente en los
siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención
descrita en las reivindicaciones.
Los grupos de estudio consistían en 17 pacientes
con infarto de miocardio agudo, 20 con angina inestable, 19 con
angina estable y 13 pacientes testigo de edad semejante sin
evidencia clínica o angiográfica de aterosclerosis coronaria. Se
definió el infarto de miocardio agudo como dolor de pecho
prolongado acompañado por elevación o depresión del segmento
ST-T evolucionando a inversión de la onda Q o la
onda T patológica, confirmada por una elevación de la fracción
CK-MB de más de dos veces el límite superior del
normal, y troponina I > 0,5 ng/ml. La angina inestable se definió
como malestar de pecho en reposo con depresión del segmento
ST-T (mayor que o igual a 0,1 mv) o inversión de la
onda T en 2 o más registros electrocardiográficos contiguos,
fracción CK-MB dentro del límite normal, y
enfermedad de arterias coronarias confirmada angiográficamente. La
angina por esfuerzo estable crónica se diagnosticó como dolor de
pecho de una duración de al menos seis meses, evidencia de
enfermedad de arterias coronarias grave en angiografía coronaria y
episodios isquémicos no evidentes clínicamente durante la semana
anterior. Los criterios de exclusión fueron fallo de riñón o hígado
avanzado, fallo de corazón abierto y cirugía de intervención grave
o trauma durante el mes anterior. Se excluyeron también los
pacientes con trastornos trombóticos sistémicos conocidos o
sospechados (distintos de los de origen coronario), enfermedades
inflamatorias o embarazo. La enfermedad de arterias coronarias
grave angiográfica se definió como una o más estenosis con una
reducción de diámetro \geq 70% en cualquier arteria coronaria
principal. Para identificar una posible asociación entre niveles de
PAPP-A y la extensión y gravedad de enfermedad de
arterias coronarias descubierta en angiografía, se obtuvo la
puntuación de Jenkins de cada paciente. Jenkins et al., Br.
Med. J., 1978, 2:388-391. Se tomaron muestras de
sangre en angiografía coronaria, se pusieron en hielo y se
centrifugaron en 30 minutos a 1.600 g durante 5 minutos. Todas las
muestras se analizaron sin conocimiento de los datos clínicos. El
tiempo medio desde el último episodio isquémico hasta la toma de
muestras de sangre fue 8,4 \pm 3 horas en infarto de miocardio y
9,4 \pm 3,9 horas en angina inestable.
El estudio se aprobó por el Institutional Review
Board de la Mayo Clinic and Foundation, y todos los pacientes
dieron consentimiento informado.
Se recogieron arterias ateroscleróticas en la
autopsia de 8 pacientes dentro de las 24 horas desde la muerte
súbita. La muerte cardiaca súbita se definió como se describe por
Burke et al., N. Engl. J. Med., 1997,
336:1276-1282. La rotura de placas aguda, la erosión
de placas y las características de placas estables se definieron
también como se describe por Burke et al., anteriormente.
La coloración inmunohistoquímica se efectuó en
secciones de parafina de 5 mm de espesor usando un procedimiento de
estreptavidina-biotina marcadas con peroxidasa. Se
desparafinaron platinas y se rehidrataron mediante las siguientes
soluciones: xileno dos veces durante 5 minutos, etanol del 100% dos
veces durante 1 minuto y etanol del 95% dos veces durante 1 minuto.
La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó diez minutos a
temperatura ambiente (RT) en 1,5% de H_{2}O_{2}/50% de metanol
y se enjuagó en agua de grifo corriente. Los lugares de unión de
proteína no específica se bloquearon aplicando suero de cabra normal
al 5% diluido en PBS/0,05% de Tween 20 (pH 7,2-7,4)
a platinas durante diez minutos a RT. Se secó el suero y se aplicó
el anticuerpo primario en las diluciones indicadas y se incubó una
hora a RT en una cámara de humedad. El anticuerpo primario se
enjuagó en H_{2}O de grifo y se manchó, y se incubó después en las
platinas durante 30 minutos a RT IgG anti ratón de cabra biotinada,
diluida 1/400. Las platinas se enjuagaron en H_{2}O de grifo
corriente, se mancharon y se aplicó
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante diluidas
1/500 en PBS/0,05% de Tween 20 + 1% de suero de cabra normal e
incubó 30 minutos a RT. Las platinas se revelaron con
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) y contracolorearon con hematoxilina. Se usó anticuerpo de
PAPP-A humano monoclonal (234-5) en
una concentración de 20 mg/ml (Qin et al., Clin. Chem. 1997,
43:2323-32). Se colorearon también secciones con
anticuerpos para \alpha-actina de músculo liso
(clon 1A4, Dako; 1/50) o anticuerpos para macrófago CD68 (clon
KP-1, Dako; 1/200). Se colorearon testigos
negativos omitiendo el anticuerpo primario. Se evaluaron el área de
placas total y el porcentaje de área de placas que se colorearon
para PAPP-A. El análisis cuantitativo de
inmunohistoquímica se efectuó usando un sistema de análisis de
imagen de color cuantitativo (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling
Heights, MI).
Se midió PAPP-A mediante un
ELISA multiplicado de biotina-tiramida sandwich
(sensibilidad 0,03 mUI/l; unidades de WHO IRP 78/610) usando
anticuerpos policlonales de PAPP-A para captura y
una combinación de anticuerpos monoclonales de
PAPP-A para detección. Véase Oxvig et al.
(1994) Biochim. Biophys. Acta 1201:415-423 y Qin
et al. (1997) Clin. Chem. 43:2323-2332 para
tener una descripción de los anticuerpos policlonales y
monoclonales, respectivamente.
La determinación cuantitativa de CRP se
consiguió mediante ensayo inmunoturbidimétrico aumentado de
partículas de látex (Kamiya Biomedical Corp., Seattle, WA). Las
partículas de látex revestidas con anticuerpos anti CRP humana en
presencia de CRP del suero formando complejos inmunes. Los complejos
inmunes formados causan turbidez aumentada (medida a 572 nm) que es
proporcional a la concentración de CRP en el suero.
El IGF-I total se midió mediante
un ensayo disponible comercialmente (DSL-5600 Active
IGF-I, Diagnostic Systems Laboratories Inc.,
Webster, TX). El ensayo de IGF-I del plasma es
complicado por la presencia de proteínas de unión a
IGF-I, que pueden secuestrar IGF-I
de la mezcla de reacción. Daughaday y Rotwein (1989) Endocrin. Rev.
10:68-91. El procedimiento emplea un ensayo
inmunorradiométrico de dos lugares (IRMA) que incluye una etapa de
extracción simple en la que se separa IGF-I de su
proteína de unión en suero. Powell et al. (1986) J. Clin.
Endocrinol. Metab. 63:1186-1192. Se ensayó
IGF-I libre por un juego de IRMA de tubo revestido
disponible comercialmente (DSL-9400 Active free
IGF-I, DSL Inc., Webster, TX). El IRMA de
IGF-I libre es un ensayo no competitivo usado para
medir la fracción disociable de IGF-I. Frystyk et
al. (1994) 348:185-191.
Se midieron isoenzima CK-MB y
troponina I cardiaca (cTnI) con un ensayo inmunoquimioluminométrico
(Chiron Corp., Emeryville, Ca).
Los datos histológicos se presentan como media
\pm desviación típica. Se compararon placas erosionadas y rotas
con placas estables mediante ensayo de t de Student. Se compararon
diferencias de características demográficas y angiográficas entre
grupos usando análisis de varianza o tabulación cruzada de doble
entrada con X2 cuando fue apropiado. Los datos sobre
PAPP-A, IGF-I libre,
IGF-I total y proteína reactiva con C, que no se
distribuían normalmente, se resumieron por medianas y gráficos de
bloques, y se compararon entre grupos por el ensayo de
Kruskal-Wallis. Cuando éste mostró diferencias de
grupos significativas, se hicieron comparaciones de grupos por
parejas usando la estadística de suma de rangos de Wilcoxon. Se
valoraron asociaciones entre niveles circulantes de estas proteínas
por coeficiente de correlación de rangos de Spearman. Se valoraron
asociaciones de PAPP-A con factores de riesgo de
pacientes, y comparaciones de grupos de PAPP-A
ajustadas para estos factores de riesgo usando regresión lineal
múltiple con logaritmo de PAPP-A como variable
dependiente. Se efectuó análisis de característica de funcionamiento
del receptor (ROC) en PAPP-A y proteína reactiva
con C para infarto de miocardio y angina inestable. Se compararon
las áreas bajo la curva entre PAPP-A y proteína
reactiva con C por el procedimiento de DeLong et al.
(Biometrics, 1988, 44:837-845). Valores de p
menores de 0,05 se consideraron significativos estadísticamente.
Se identificaron cuatro placas rotas y cuatro
erosiones de placas como placas inestables culpables en la serie de
autopsias. Se caracterizaron también cuatro placas estables. No se
identificaron diferencias significativas estadísticamente en carga
de placas entre placas rotas (7,1 \pm 1,4 mm^{2}), erosionadas
(8,0 \pm 3,7 mm^{2}) y estables (5,7 \pm 2,1 mm^{2}). En
placas con grandes núcleos de lípidos y rotura de tapas,
PAPP-A coloreó principalmente en la región de
hombro inflamatorio, en áreas que rodeaban el núcleo de lípido y se
co-localizaba con células positivas en CD68. En
placas fibrosas con erosión superficial, se identificó
PAPP-A dentro de células de músculo liso con forma
de huso, en la matriz extracelular y en células endoteliales no
erosionadas. Por análisis de imagen cuantitativo, la expresión de
PAPP-A en placas erosionadas fibrosas (28,3 \pm
16,8%) superaba la de en placas rotas (18,5 \pm 8%) sin alcanzar
significación estadística (p = 0,34). PAPP-A se
expresaba sólo mínimamente en placas estables. Por análisis
cuantitativo, la expresión de PAPP-A en placas
estables (3,2 \pm 1,9%) era significativamente más baja que en
placas rotas (p = 0,01) y erosionadas (p = 0,02).
Para determinar si una expresión de
PAPP-A en tejidos abundante en placas inestables se
traduciría en niveles circulantes elevados, se midieron niveles de
PAPP-A en pacientes con síndromes coronarios agudos
(infarto de miocardio y angina inestable) y en pacientes estables
(angina estable y testigos no ateroscleróticos). La Tabla 1 muestra
edad, sexo, perfil del factor de riesgo, terapia de línea de base y
resultados angiográficos de los cuatro grupos estudiados. Los
pacientes con angina estable tenían enfermedad de tres vasos más a
menudo que los pacientes con infarto de miocardio (p = 0,004), pero
no se observaron diferencias estadísticas entre los tres grupos
enfermos (angina estable, angina inestable e infarto de miocardio)
con relación a carga aterosclerótica coronaria evaluada mediante la
puntuación angiográfica de Jenkins (p = 0,88). Los testigos normales
tendían a tener niveles más bajos de los diversos factores de
riesgo que los tres grupos de enfermedad, pero los tres grupos eran
comparables entre ellos.
Los datos de grupos en niveles de
PAPP-A se muestran como gráficos de bloques en la
Figura 1. El ensayo de Kruskal-Wallis indicó
diferencias de grupos altamente significativas (p < 0,0001). Los
niveles de PAPP-A en suero medianos en pacientes
testigo fueron 7,4 mUI/l (intervalo de 3,8 a 11,3 mUI/l), y no
significativamente diferentes de los observados en angina estable
(mediana 8,3 mUI/l; intervalo de 4,4 a 22,5 mUI/l) (p = 0,068). En
angina inestable, los niveles de PAPP-A medianos
fueron 15,0 mUI/l (intervalo de 4,4 a 22,5 mUI/l),
significativamente más altos que los observados para pacientes
testigo (p < 0,0001) y con angina estable (p = 0,0002). En
infarto de miocardio agudo, los niveles de PAPP-A
fueron 20,6 mUI/l (intervalo de 9,2 a 46,6 mUI/l),
significativamente más altos que los observados para pacientes
testigo (p < 0,0001) y con angina estable (p < 0,0001). La
distribución de PAPP-A no fue significativamente
diferente entre pacientes con angina inestable y con infarto de
miocardio (p = 0,75). En este estudio, los niveles de troponina I y
CK-MB no estaban asociados con
PAPP-A en pacientes con síndromes coronarios
agudos, indicando que la respuesta de PAPP-A no es
inducida por necrosis de miocardio.
Usando modelos de regresión múltiples, los
niveles de PAPP-A no estaban asociados con edad,
sexo, factores de riesgo o medicaciones. Entre los tres grupos de
enfermedad, los niveles de PAPP-A estaban asociados
inversamente de manera significativa con aterosclerosis evaluada
como número de vasos con estenosis de la abertura significativa
(enfermedad de 1 a 3 vasos) (p = 0,037), pero no estaban asociados
con la puntuación de Jenkins (p = 0,27). Esto refleja la
coexistencia en el árbol coronario de placas ateroscleróticas
inactivas con placas activas, vulnerables o fisuradas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El análisis de Kruslcal-Wallis
para CRP indicó diferencias de grupos altamente significativas (p =
0,0015). Los niveles de CRP eran significativamente elevados en
pacientes con infarto de miocardio en comparación con angina
inestable y estable (p = 0,018 y p = 0,001, respectivamente) (Figura
2), y eran ligera pero significativamente elevados en pacientes con
angina inestable en comparación con estable (p = 0,0445) (Tabla 2).
Los niveles de CRP del grupo testigo eran sólo significativamente
más bajos que los niveles con infarto de miocardio (p = 0,0057).
CRP estaba asociada significativamente con PAPP-A en
pacientes con síndromes coronarios agudos (Ñ = 0,61, p < 0,0001)
(Figura 3A). Los niveles de CRP no estaban asociados con edad, sexo,
factores de riesgo, medicaciones o carga aterosclerótica
coronaria.
La correlación significativa entre
PAPP-A y CRP muestra que todos los pacientes con
síndromes coronarios agudos y niveles de hs-CRP
> 0,3 ng/ml (niveles asociados con riesgo aumentado de
desarrollar infarto de miocardio [véase Haverkate et al.,
(1997) Lancet, 349:462-466) tenían niveles de
PAPP-A elevados > 8,9 mUI/l. Sin embargo, 13
pacientes con síndromes coronarios agudos (35,1%) (5 pacientes con
infarto de miocardio y 8 pacientes con angina inestable) mostraron
niveles de CRP < 0,3 ng/ml y altos niveles de
PAPP-A.
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Se midió IGF-I libre para
determinar el nivel circulante bioactivo de IGF-I.
Se supuso que niveles de PAPP-A aumentados
producirían niveles de IGF-I libre aumentados por
proteolisis de IGFBP-4. No se encontraron
diferencias estadísticas en niveles de IGF-I libre
entre grupos, pero se observó una correlación débil, aunque
significativa, con niveles de PAPP-A (Ñ = 0,39; p =
0,018; Figura 3B) en pacientes con síndromes coronarios agudos. La
fracción libre de IGF-I circulante y sintetizado
localmente induce migración de células de músculos lisos vasculares,
y es importante para quimiotaxis de monocitos, activación y
liberación de citoquina dentro de la lesión aterosclerótica. No se
encontraron diferencias para niveles de IGF-I total
entre pacientes inestables y estables, y no se observó asociación
con niveles de PAPP-A (Tabla 2).
Los niveles de CK-MB no
aumentaron en muestras de sangre obtenidas de pacientes con angina
inestable, y sólo 3 de 20 pacientes con angina inestable tenían
niveles de troponina I por encima de lo normal (1,6\pm0,7 ng/ml).
Los niveles de troponina I y CK-MB de pico en
pacientes con infarto de miocardio ascendieron a 60,9 ng/ml
(intervalo 1,3 a 368 ng/ml) y 76,3 ng/ml (intervalo 4,4 a 341
ng/ml), respectivamente. En estos pacientes, no hubo correlaciones
significativas entre troponina I (Ñ = 0,34, p = 0,19) o
CK-MB (Ñ = 0,24; p = 0,36) y niveles de
PAPP-A (Figuras 4A y 4B). Incluso cuando se
combinaban pacientes con angina inestable e infarto de miocardio,
no hubo una asociación significativa entre niveles de troponina I (Ñ
= 0,07, p = 0,69) o CK-MB (Ñ = 0,10, p = 0,57) y
PAPP-A. Por tanto, los niveles de
PAPP-A elevados en estos pacientes no pueden
atribuirse a necrosis de miocardio.
\vskip1.000000\baselineskip
El área bajo la curva (AUC) de análisis de ROC
para PAPP-A fue 0,94 en infarto de miocardio (error
típico = 0,03) y 0,88 (error típico = 0,05) en angina inestable,
agrupando pacientes con angina estable y testigos como grupo
estable. En un análisis paralelo, la proteína reactiva con C tenía
un AUC de 0,81 (error típico = 0,07) en infarto de miocardio, y de
0,67 (error típico = 0,08) en angina inestable. Estas diferencias de
AUCs entre los dos marcadores fueron significativas para infarto de
miocardio (p = 0,026) y para angina inestable (p = 0,011) (Figuras
5A y 5B, respectivamente). Estos datos sugieren que
PAPP-A es un marcador valioso, significativamente
mejor que proteína reactiva con C, para la identificación de
pacientes con síndromes coronarios agudos.
El poder discriminante (sensibilidad y
especificidad combinadas) para síndromes coronarios agudos fue mejor
en niveles de PAPP-A de 10 mUI/l. La sensibilidad y
especificidad de niveles de PAPP-A > 10 mUI/l
para identificar síndromes coronarios agudos fueron 89,2% y 81,3%,
respectivamente. Para infarto de miocardio, la sensibilidad de
niveles de PAPP-A > 10 mUI/l fue 94,1% y para
angina inestable 85,0%, respectivamente. En testigos no
ateroscleróticos, sólo 1 de 13 pacientes (7,7%) mostró niveles de
PAPP-A > 10 mUI/l, y 5 de 19 pacientes (26,3%)
con angina estable tenían niveles de PAPP-A > 10
mUI/l.
Se valoraron los niveles de
PAPP-A en muestras de suero de 16 pacientes con
artritis reumatoide. Los valores variaron de 3 a > 2000 mUI/l. En
13 de 16 pacientes, los niveles de PAPP-A fueron
> 119 mUI/ml (119 a > 2000). Como comparación, sujeros
normales (n = 30) tienen un nivel de PAPP-A de 4,32
\pm 1,54 mUI/ml). La Tabla 3 contiene los valores individuales
para los 16 pacientes con artritis reumatoide.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ha de entenderse que, aunque la invención se ha
descrito conjuntamente con la descripción detallada de la misma, se
pretende que la descripción anterior ilustre y no limite el alcance
de la invención, que se define por el alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (20)
1. Un procedimiento ex vivo para
diagnosticar un estado inflamatorio seleccionado del grupo
constituido por síndrome coronario agudo y artritis reumatoide,
comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- medir el nivel de proteína-A de plasma asociada a embarazo (PAPP-A) en una muestra biológica de un paciente no embarazado;
- b)
- comparar dicho nivel con el de sujetos testigo; y
- c)
- diagnosticar dicho estado inflamatorio si el nivel de PAPP-A está aumentado con relación al de sujetos testigo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho síndrome coronario agudo es angina inestable, muerte
cardiaca súbita o infarto de miocardio agudo.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho nivel de PAPP-A se mide usando un
inmunoensayo.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que dicho inmunoensayo es un ELISA.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que se captura PAPP-A con anticuerpos
policlonales anti-PAPP-A.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que se captura PAPP-A con un anticuerpo
monoclonal anti-PAPP-A.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo constituido
por sangre completa, plasma y suero.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el procedimiento comprende además medir el nivel de un
polipéptido seleccionado del grupo constituido por proteína reactiva
con C de alta sensibilidad, creatina quinasa MB, troponina I,
troponina T, creatina quinasa, creatinina, fibrinógeno,
interleuquina-1 e interleuquina-6,
y en el que dicha etapa de diagnóstico se basa en el nivel de dicho
polipéptido y dicho nivel de PAPP-A con relación al
de sujetos testigo.
9. Un artículo de fabricación para diagnosticar
un estado inflamatorio en un paciente no embarazado, en el que
dicho estado inflamatorio se selecciona del grupo constituido por
síndrome coronario agudo o artritis reumatoide, comprendiendo dicho
artículo de fabricación anticuerpos para medir niveles de una
pluralidad de polipéptidos en una muestra biológica de dicho
paciente, en el que dicha pluralidad de polipéptidos incluye
PAPP-A y uno o más de los polipéptidos seleccionados
del grupo constituido por proteína reactiva con C de alta
sensibilidad, creatina quinasa MB, troponina I, troponina T,
creatina quinasa, creatinina,. fibrinógeno,
interleuquina-1 e
interleuquina-6.
10. El artículo fabricado de la reivindicación
9, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo
constituido por sangre completa, plasma y suero.
11. Un anticuerpo para uso en diagnosis de un
estado inflamatorio seleccionado del grupo constituido por síndrome
coronario agudo y artritis reumatoide, en el que el anticuerpo tiene
afinidad de unión específica para PAPP-A y en el
que el anticuerpo está marcado.
12. El uso de un anticuerpo que tiene afinidad
de unión específica para PAPP-A y cuyo anticuerpo
está marcado, en la fabricación de una composición de diagnóstico
para la diagnosis de un estado inflamatorio seleccionado del grupo
constituido por síndrome coronario agudo y artritis reumatoide.
13. Un anticuerpo para el uso según la
reivindicación 11, en el que dicha diagnosis comprende la formación
de imagen de diagnóstico.
14. Un anticuerpo para el uso según la
reivindicación 13, en el que dicha formación de imagen de
diagnóstico comprende tomografía de emisión de positrones,
escintigrafía gamma, tomografía informatizada de emisión de fotones
simple, formación de imagen de resonancia magnética, ultrasonido
intravascular o formación de imagen de resonancia magnética
funcional.
15. Un anticuerpo para el uso según las
reivindicaciones 11 o 13-14, en el que dicha marca
es un radioisótopo.
16. Un anticuerpo para el uso según la
reivindicación 15, en el que dicho radioisótopo se selecciona del
grupo constituido por I, F, In, Ga y mTc.
17. Un anticuerpo para el uso según las
reivindicaciones 11 o 13 a 16, en el que dicho anticuerpo se
administra intravenosamente.
18. Un anticuerpo para el uso según las
reivindicaciones 11 o 13 a 17, en el que dicho síndrome coronario
agudo es angina inestable, muerte cardiaca súbita o infarto de
miocardio agudo.
19. Un anticuerpo para el uso según una
cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 a 18, en el que el
anticuerpo puede usarse para medir niveles de
PAPP-A en una muestra biológica.
20. Un anticuerpo para el uso según la
reivindicación 19, en el que dicha muestra biológica se selecciona
del grupo constituido por sangre completa, plasma y suero.
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