ES2324780T3 - Composiciones para la inhibicion de la proliferacion e infiltracion de celulas tumorales cerebrales mediante la expresion de la subunidad del receptor de glutamato de tipo ampa. - Google Patents
Composiciones para la inhibicion de la proliferacion e infiltracion de celulas tumorales cerebrales mediante la expresion de la subunidad del receptor de glutamato de tipo ampa. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de un gen que codifica para una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) para la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación e invasión in vivo de células tumorales cerebrales regulando la permeabilidad al Ca 2+ mediante una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) que se expresa en una célula tumoral cerebral animal en desarrollo, en la que el gen utilizado en la preparación del medicamento codifica para GluR2(R) sin corrección de ARN adicional.
Description
Composiciones para la inhibición de la
proliferación e infiltración de células tumorales cerebrales
mediante la expresión de la subunidad de receptor de glutamato de
tipo AMPA.
La presente invención se refiere a composiciones
para inhibir la proliferación e invasión de células tumorales
cerebrales regulando la permeabilidad al Ca^{2+} en células
tumorales cerebrales animales en desarrollo, en particular, a una
composición para inhibir la proliferación e invasión de células
tumorales cerebrales regulando la permeabilidad al Ca^{2+}
mediante una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA, y a
un procedimiento para medir la actividad de proliferación/invasión
de células tumorales cerebrales detectando/midiendo la expresión de
una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA en células
tumorales cerebrales animales en desarrollo.
El ácido glutámico es un neurotransmisor
excitador importante en el sistema nervioso central de animales
superiores y los receptores de glutamato, que son receptores de
ácido glutámico, desempeña un papel primordial en la transmisión
sináptica excitadora en el sistema nervioso central. Además, es
conocido que los receptores de glutamato están implicados en la
plasticidad sináptica que se cree que es una base a nivel celular de
la memoria y el aprendizaje, y la plasticidad sináptica durante el
periodo de desarrollo, en otras palabras, la formación dependiente
de la experiencia de la red neural. Además, se sugiere que los
receptores de glutamato están implicados en la muerte de células
neuronales en estados patológicos tales como isquemia.
Los receptores de glutamato se clasifican en
líneas generales, por su estructura y mecanismo de señalización, en
receptores de glutamato ionotrópicos, que presentan un canal iónico
para una rápida transmisión sináptica, y receptores de glutamato
metabotrópicos, que transmiten señales de manera indirecta mediante
la conjugación a proteínas G. Los receptores de glutamato
ionotrópicos son complejos de receptor-canal iónico
que abren sus canales catiónicos en respuesta a la unión de ácido
glutámico, y son responsables de la rápida transmisión sináptica
excitadora en el sistema nervioso central (SNC) de animales
superiores.
Según su reactividad con agonistas o
antagonistas específicos y las propiedades electrofisiológicas de
los canales iónicos que contienen, los receptores ionotrópicos se
clasifican en líneas generales en receptores de NMDA (ácido
N-metil-D-aspártico)
que son sensibles al NMDA, y receptores no de NMDA que son
insensibles al NMDA. Cuando los agonistas se unen a ellos, los
receptores de NMDA permiten que el Na^{+}, K^{+} y Ca^{2+}
pasen a través de ellos. Según la diferencia en sus reactividades
con los receptores de cainato y con el AMPA (ácido
\alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico),
los receptores no de NMDA se clasifican en subtipos de receptores
de cainato y receptores de AMPA, y cuando los agonistas se unen a
ellos, permiten que el Na^{+} y el K^{+} pasen a través de
ellos.
Los receptores de glutamato de tipo AMPA (AMPAR)
median en la neurotransmisión rápida en casi todas las sinapsis
excitadoras en el sistema nervioso central (SNC) (Trends Neurosci.,
16, 359-365, 1993; Annu. Rev. Neurosci., 17,
31-108, 1994; Prog. Neurobiol., 54,
581-618, 1998). De manera convencional, se ha creído
que los receptores existen sólo en las neuronas, pero recientemente
se ha revelado que también se expresan en la mayoría de las células
de la glía (Trends Pharmacol. Sci., 21, 252-258,
2000).
Es conocido que los receptores de AMPA (AMPAR)
están compuestos por subunidades seleccionadas de un conjunto de
cuatro proteínas GluR1 a GluR4. La permeabilidad al Ca^{2+} de los
AMPAR depende de la composición de sus subunidades.
Los receptores que poseen subunidades GluR2
muestran poca permeabilidad al Ca^{2+}, mientras que los que
carecen de GluR2 muestran una alta permeabilidad al Ca^{2+}. Se ha
demostrado que la abundancia de la subunidad GluR2 reduce la
permeabilidad al Ca^{2+} (Trends Neurosci., 16,
359-365, 1993; Annu. Rev. Neurosci., 17,
31-108, 1994; Prog. Neurobiol., 54,
581-618, 1998). El origen de las propiedades únicas
de GluR2 puede encontrarse en un residuo de un solo aminoácido en
el segundo segmento hidrófobo (M2). Este residuo es la arginina (R)
en GluR2, mientras que el sitio correspondiente está ocupado por
glutamina (Q) en las otras subunidades. Cuando la arginina en este
sitio crítico (sitio Q/R) se sustituye por glutamina, los receptores
homoméricos constituidos a partir de la GluR2 (Q) mutante muestran
una alta permeabilidad al Ca^{2+}.
Es conocido un mecanismo en el que un residuo de
aminoácido en un segmento hidrófobo (M2) de GluR2, entre las
subunidades de AMPAR, se sustituye por arginina (R) en organismos
vivos, como un fenómeno que se produce tras la transcripción génica
denominada "corrección de ARN". En otras palabras, una base se
sustituye tras haberse transcrito un gen (ADN) a ARNm, dando como
resultado que un residuo de aminoácido se sustituya también a nivel
de proteína. Es un fenómeno peculiar en el que se codifica ácido
glutámico (Q) en un gen, pero en realidad, se sustituye por
arginina (R). Sin embargo, esta conversión reduce la permeabilidad
al Ca^{2+}.
Tal como se mencionó anteriormente, debido a que
los receptores de glutamato actúan como receptor para
neurotransmisores, los estudios de receptores de glutamato se han
realizado de manera profunda principalmente con respecto a un
trastorno psicológico, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y en
el campo de la memoria/el aprendizaje, y se han obtenido diversos
hallazgos y se han desarrollado fármacos terapéuticos, etc. Como
resultado de tal investigación y desarrollo, se han desarrollado
procedimientos para identificar genes implicados en enfermedades
neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson, corea de
Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple,
enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o epilepsia, y
fármacos terapéuticos para tratar animales que padecen enfermedades
neurodegenerativas, etc.
Por otro parte, el glioblastoma,
oligodendroglioma, meningioma, etc., son bien conocidos como tumores
cerebrales. En particular, el glioblastoma el tumor más común y más
maligno en el sistema nervioso central (SNC). Es conocido que esta
clase de tumor es altamente migratoria e invasiva (Pathology and
Genetics of Tumours of the Nervous Systems, 29-39,
2000 (IARC press, Lyon, Francia)). Dado que las células migratorias
muestran un movimiento preferencial a lo largo de una ruta densa y
mielinizada, y se propagan ampliamente en el SNC (Neurol. Med.
Chir., 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir., 33,
425-428, 1993; Neuropathology, 17,
186-188, 1997), los procedimientos quirúrgicos no
han aportado buenos resultados.
Además, la proliferación y migración celulares,
que son las dos características principales del glioma maligno, se
encuentran también en las células progenitoras neurales a partir de
las que se origina el glioma (Glial Cell Development,
209-220, 1996 (BIOS Scientific Publishers, Oxford,
UK); Glia, 15, 222-230, 1995). Dado que las células
de glioma responden a diversos estímulos externos tales como
neurotransmisores, hormonas y factores de crecimiento (Trends
Pharmacol. Sci., 21, 252-258, 2000), las
características malignas del glioblastoma pueden controlarse por lo
menos parcialmente a través de la activación de receptores de
superficie.
Recientemente, se ha notificado que los
receptores de glutamato se expresan no sólo en las células
progenitoras neurales sino también en el glioma (J. Neurosci., 17,
227-240, 1997; Glia, 10, 149-153,
1994; J. Neurosci., 16, 519-530, 1996; Eur. J.
Neurosci., 10, 2153-2162, 1998; J. Neurosci. Res.,
46, 164-178, 1996). Sin embargo, la mayoría de su
significación fisiopatológica sigue siendo poco clara.
En relación al posible tratamiento de tumores,
por ejemplo un neuroblastoma, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2001,
vol. 98, 6372-6377, da a conocer la utilización de
antagonistas de glutamato, por ejemplo GYKI52466, un antagonista de
AMPA.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar una composición para inhibir la proliferación e
invasión de células tumorales cerebrales regulando la permeabilidad
al Ca^{2+} en células tumorales cerebrales animales en
desarrollo, en particular, una composición para inhibir la
proliferación e invasión de células tumorales cerebrales regulando
la permeabilidad al Ca^{2+} mediante una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA y, además, un procedimiento para medir la
actividad de proliferación/invasión de células tumorales cerebrales
detectando/midiendo la expre-
sión de una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA en células tumorales cerebrales animales en desarrollo.
sión de una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA en células tumorales cerebrales animales en desarrollo.
En el proceso de analizar el papel de los
receptores de AMPA permeables al calcio en las células de la glía
utilizando un sistema de cultivo establecido de células cerebrales,
los presentes inventores han descubierto e informado de que la
formación de procesos celulares se promueve cuando se fuerza la
expresión de genes de GluR2 (Q) que presentan una fuerte
permeabilidad al calcio, mientras que los procesos se revierten y
las células se aplanan cuando se introducen genes de GluR2 (GluR2
(R)) que presentan impermeabilidad al calcio (NeuroReport 12,
(2001), 745-748).
Además, los presentes inventores sospechaban que
los AMPAR (receptores de AMPA) permeables al calcio están
implicados en la propiedad de invasión de las células tumorales,
basándose en el hecho de que los AMPAR se expresan en las células
de glioma humano y además, las células fusiformes en las que se
fuerza la expresión de genes de GluR2 (Q) son morfológicamente
similares a las células de glioma que migran mientras se
estratifican en un frasco de cultivo, y a las células tumorales que
atraviesan las fibras de mielina en la sustancia blanca, que se
encuentran frecuentemente en muestras extirpadas. Además, como
resultado de un análisis adicional, los presentes inventores han
descubierto que (1) las subunidades GluR1 y/o GluR4 se expresan de
manera ubicua en las célula de glioblastoma humano, y actúan como
AMPAR permeable al Ca^{2+}, (2) cuando los genes de GluR2 (GluR2
(R)) se introducen en las células de glioblastoma y los AMPAR
permeables al Ca^{2+} endógenos de este tipo se convierten en
AMPAR impermeables al Ca^{2+}, se inhibe la migración en células
tumorales y se induce la apoptosis, y (3) por el contrario, cuando
se sobreexpresan AMPAR permeables al Ca^{2+}, no sólo aumenta la
proliferación de células tumorales sino también el comportamiento
migratorio, y se ha completado la presente invención.
En otras palabras, la presente invención está
relacionada con la inhibición de la proliferación e invasión de
células tumorales cerebrales regulando la permeabilidad al Ca^{2+}
en células tumorales cerebrales animales en desarrollo mediante
subunidades del receptor de glutamato. La regulación de la
permeabilidad al Ca^{2+} mediante subunidades del receptor de
glutamato puede realizarse introduciendo un gen de una subunidad del
receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 en una célula tumoral
cerebral. Además, la presente invención proporciona un
procedimiento para medir la actividad de proliferación/invasión de
células tumorales cerebrales detectando/midiendo la expresión de
subunidades del receptor de glutamato en células tumorales
cerebrales animales en desarrollo.
La presente invención se refiere a una
composición para inhibir la proliferación e invasión de células
tumorales cerebrales regulando la permeabilidad al Ca^{2+}
mediante una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA que
se expresa en una célula tumoral cerebral animal en desarrollo
("1"), la composición para inhibir la proliferación e invasión
de células tumorales cerebrales según "1", en la que la
regulación de la permeabilidad al Ca^{2+} mediante una subunidad
del receptor de glutamato se realiza introduciendo un gen de una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) en una
célula tumoral cerebral animal en desarrollo y expresando el gen
("2"), la composición para inhibir la proliferación e invasión
de células tumorales cerebrales según "2", en la que el gen de
una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) es un
ADNc de una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2
(R) ("3"), la composición para inhibir la proliferación e
invasión de células tumorales cerebrales según "2" o "3",
en la que el gen de una subunidad del receptor de glutamato de tipo
AMPA GluR2 (R) se introduce en una célula tumoral cerebral animal en
desarrollo mediante un vector de expresión, y se expresa
("4"), la composición para inhibir la proliferación e invasión
de células tumorales cerebrales según "4", en la que el vector
de expresión es un vector que utiliza un adenovirus ("5"), y
la composición para inhibir la proliferación e invasión de células
tumorales cerebrales según cualquiera de "1" a "5", en la
que la célula tumoral cerebral es un glioblastoma ("6").
También se describen en la presente memoria un
vector de expresión de genes para tratar un tumor cerebral en el
que un gen de una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA
GluR2 (R) se incorpora en un vector de expresión/introducción de
genes para una célula tumoral cerebral ("7"), el vector de
expresión de genes para tratar un tumor cerebral según "7", en
el que el vector de expresión es un vector adenoviral ("8"), y
un kit de introducción de genes para tratar un tumor cerebral que
contiene el vector de expresión de genes para tratar un tumor
cerebral según "7" u "8" ("9").
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para medir la actividad de proliferación/invasión de
células tumorales cerebrales en el que se detecta/mide la expresión
de una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA (GluR2 (R))
en una célula tumoral cerebral animal en desarrollo ("10"), y
al procedimiento para medir la actividad de proliferación/invasión
de células tumorales cerebrales según "10", en el que la
detección/medición de la subunidad del receptor de glutamato es la
detección/medición de una subunidad del receptor de glutamato de
tipo AMPA GluR2 (R) ("11").
La figura 1 es un conjunto de fotografías que
muestran la expresión de receptores de AMPA en células de
glioblastoma humano en la presente invención.
La figura 2 es un conjunto de fotografías que
muestran el cambio de [Ca^{2+}]_{i} inducido por AMPA en
células tumorales cultivadas en la presente invención.
La figura 3 es un conjunto de fotografías que
muestran el efecto de la expresión de subunidades del receptor de
AMPA mediada por adenovirus en la presente invención.
La figura 4 es un conjunto de vistas que
muestran el efecto de la expresión de GluR2 y GluR2 (Q) sobre la
migración de células en la presente invención.
La figura 5 es un conjunto de fotografías que
muestran el efecto de la expresión de GluR2 sobre el trasplante
tumoral en la presente invención.
La figura 6 es un conjunto de vistas que
muestran el efecto de la manipulación de receptores de AMPA sobre
el crecimiento tumoral en la presente invención.
La presente invención comprende composiciones
para la inhibición de la proliferación e invasión de células
tumorales cerebrales regulando la permeabilidad al Ca^{2+} en
células tumorales cerebrales animales en desarrollo expresando
subunidades del receptor de glutamato. Los ejemplos de la célula
tumoral cerebral animal en desarrollo incluyen glioblastoma,
oligodendroglioma y meningioma. La regulación de la permeabilidad al
Ca^{2+} mediante subunidades del receptor de glutamato puede
realizarse introduciendo un gen de una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) en una célula tumoral cerebral
animal en desarrollo, y expresando el gen. Como gen de una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R), puede
utilizarse ADNc de una subunidad del receptor de glutamato de tipo
AMPA GluR2 (R), pero el gen ya se conoce (Science 249,
1580-1585, 1990), y la secuencia de bases del gen
puede recuperarse de la base de datos GenBank con el número de
registro M38061.
Para la introducción de un gen de una subunidad
del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) en células
tumorales cerebrales animales en desarrollo en la presente invención
pueden utilizarse procedimientos de introducción de genes
apropiados y conocidos. Puede utilizarse un vector de expresión de
adenovirus para los procedimientos de introducción preferidos. Como
un vector de expresión de adenovirus de este tipo se muestra a
título de ejemplo un vector adenoviral utilizado para la expresión
transitoria (Science, 259, 988-990, 1993). Los
vectores adenovirales presentan una afinidad extremadamente alta
por células de la glía en el sistema nervioso central (SNC), y
cuando se inyectan en la corteza cerebelosa, pueden expresar un gen
de GluR2 en la glía de Bergmann de manera selectiva. Además, como
para los vectores adenovirales, pueden utilizarse vectores de
introducción de genes que emplean un sistema de control de la
expresión Cre/loxP (Nucl. Acids Res., 23, 3816-3821,
1995). Uno de los motivos para utilizar el sistema Cre/loxP es el
siguiente: dado que Cre no existe en una infección sólo con
AxCALNLGluR2, puede crearse un estado en el que no se expresa nada
de GluR2 (R), y tal estado puede utilizarse como control para
excluir la influencia de la infección viral.
En la presente invención, un gen de una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) puede
incorporarse en un vector de expresión de genes tal como vectores
adenovirales para preparar un kit de introducción de genes para
tratar tumores cerebrales, y tal kit puede utilizarse para el
tratamiento de tumores cerebrales.
Como otra forma de realización de la presente
invención, el procedimiento de la presente invención hace posible
medir la actividad de proliferación/invasión de células tumorales
cerebrales detectando/midiendo la expresión de subunidades del
receptor de glutamato en células tumorales cerebrales animales en
desarrollo. En tumores cerebrales tales como glioblastoma en el
sistema nervioso central (SNC) se expresan subunidades compuestas
por un conjunto de cuatro proteínas GluR1\sim4, y la permeabilidad
o impermeabilidad al Ca^{2+} de las células depende de la
composición de las subunidades que se expresan. Esta permeabilidad o
impermeabilidad al Ca^{2+} de las células da como resultado la
diferencia en la actividad de proliferación/invasión de células
tumorales cerebrales. La expresión de las subunidad GluR1 o GluR4
convierte las células en permeables al Ca^{2+} y promueve la
proliferación/invasión de células tumorales cerebrales, mientras que
la expresión de la subunidad GluR2 (R) convierte las células en
impermeables al Ca^{2+} e inhibe la proliferación/invasión de
células tumorales cerebrales.
Por tanto, la actividad de
proliferación/invasión de células tumorales cerebrales puede medirse
detectando/midiendo las subunidades del receptor de glutamato
expresadas en células tumorales cerebrales. Para la
detección/medición de subunidades del receptor de glutamato, pueden
utilizarse de manera apropiada medios conocidos de
detección/medi-
ción. Con el fin de medir los genes de subunidades puede utilizarse una sonda para detectar un gen de cada subunidad. En la detección/medición de la expresión de subunidades, resulta preferido construir y utilizar un anticuerpo que se une específicamente a cada subunidad. Como anticuerpo que se une específicamente a una subunidad del receptor de glutamato puede utilizarse un anticuerpo o bien policlonal o bien monoclonal, y tales anticuerpos pueden prepararse mediante procedimientos ordinarios.
ción. Con el fin de medir los genes de subunidades puede utilizarse una sonda para detectar un gen de cada subunidad. En la detección/medición de la expresión de subunidades, resulta preferido construir y utilizar un anticuerpo que se une específicamente a cada subunidad. Como anticuerpo que se une específicamente a una subunidad del receptor de glutamato puede utilizarse un anticuerpo o bien policlonal o bien monoclonal, y tales anticuerpos pueden prepararse mediante procedimientos ordinarios.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto a partir de los ejemplos, pero el alcance técnico de
la presente invención no se limita a estos ejemplos.
Los presentes inventores examinaron la expresión
de la subunidad de AMPAR GluR1 en un estudio de hibridación in
situ de muestras quirúrgicas (véase la figura 1). La figura 1a
muestra la histología representativa de una muestra quirúrgica de
glioblastoma, que demuestra células tumorales invasivas. Las señales
hibridadas con la ribosonda antisentido de GluR1 se detectaron en
células no diferenciadas en migración y proliferación (figura 1b).
En la sección seriada, la expresión de proteína GluR1 inmunoteñida
mediante el anticuerpo de GluR1 purificado por afinidad se detectó
en células tumorales (figura 1c).
Los presentes inventores examinaron además la
expresión de subunidades de AMPAR en muestras quirúrgicas de
glioblastoma incrustadas en parafina (n = 16) mediante tinción
inmunohistoquímica con anticuerpos seleccionados frente a GluR1,
GluR2 (R), GluR2/3 y GluR4 (tabla 1). Se encontró expresión de
proteína GluR1 en todas las muestras quirúrgicas examinadas (n =
16). En estas muestras, se expresó la proteína GluR1 en la mayoría
de las células tumorales (52 \pm 21%, n = 16). En 14 de 16
muestras quirúrgicas de glioblastoma se observó expresión de GluR2
(R) en la menor parte de las células (21 \pm 7%, n = 14). Se
observó la tinción con anticuerpo anti-GluR2/3 en
14 de 16 muestras quirúrgicas (31 \pm 5%, n = 14). Las células
tumorales también eran positivas para GluR4 en todas las muestras
quirúrgicas (55 \pm 7%, n = 16).
Las figuras 1d a g muestran un ejemplo de
secciones seriadas de una muestra quirúrgica original tratada con
anticuerpos frente a GluR1, GluR2 (R) y GluR4. En estas secciones,
las células de glioblastoma en migración se acumularon mucho en la
zona por debajo de la piamadre de la corteza cerebral. Estas células
expresaban tanto GluR1 como GluR4, pero GluR2 (R) sólo débilmente
(figuras 1d, e, f y g). En los tejidos cerebrales adyacentes
(figuras 1h, i, j, y k), las células tumorales no diferenciadas
invasoras expresaban GluR1 y GluR4 (figuras 1i y k), mientras que
las neuronas normales expresaban GluR2 (R) abundantemente (figura
1j). Las células tumorales fusiformes que invadían la sustancia
blanca expresaban vimentina, un marcador de astrocitos inmaduros, y
GluR1, pero expresaban muy poco GluR2 (R).
Los presentes inventores prepararon cultivos
primarios de células de glioblastoma a partir de muestras
quirúrgicas y examinaron la expresión de subunidades de AMPAR
(tabla 1). En estos cultivos, la mayoría de las células mostraban
inmunorreactividad frente a GFAP, lo que indica que tenían origen en
células de la glía, y no existía contaminación por neuronas o
células de la microglía tal como se valoró por la ausencia de
inmunorreactividades frente a la proteína de los neurofilamentos
(NFP) (Nature, 298, 277-279, 1982; Acta
Neuropathol., 64, 30-36, 1984), un marcador
neuronal, y Ki-MlP (Pathol. Int., 46,
15-23, 1996), un marcador de las células de la
microglía, respectivamente.
En inmunofluorescencia doble utilizando
anticuerpos frente a GluR1 y GluR4, la mayoría de las células
cultivadas expresaban ambas proteínas simultáneamente (figuras 1l,
m y n). Sin embargo, en inmunofluorescencia doble utilizando
anticuerpos frente a GluR1 y GluR2 (R) o anticuerpos frente a GluR4
y GluR2 (R), sólo una menor parte de las células que expresaban
GluR1 o GluR4 mostraron inmunorreactividades frente a GluR2 (R)
(figuras 1o, p y q).
Los presentes inventores establecieron 4 líneas
celulares de glioblastoma a partir de las muestras quirúrgicas.
Tres de ellas expresaban GluR1 más GluR4, GluR1 más GluR3, y GluR3
más GluR4, respectivamente. Una línea celular no expresaba ninguna
subunidad de AMPAR. Los presentes inventores también examinaron la
expresión de subunidades de AMPAR en una línea celular de
glioblastoma humano disponible comercialmente U87 MG. Esta línea
celular expresaba predominantemente GluR1 y GluR3, y GluR2
débilmente (tabla 1).
Para confirmar la expresión de las subunidades
GluR1\sim4 en células de glioblastoma, los presentes inventores
realizaron a continuación estudios de reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)
(Neuron, 12, 383-388, 1994). Se llevó a cabo una
transcripción inversa en 3 muestras quirúrgicas, 4 células de
cultivo primario y 5 líneas celulares, seguido por amplificación por
PCR con cebadores específicos para GluRl-4. Se
investigaron a continuación los productos amplificados mediante
análisis de restricción con enzimas específicas para cada fragmento
GluR1\sim4 (Neuron, 12, 383-388, 1994). La figura
1r muestra un resultado representativo obtenido en un cultivo
primario de células tumorales. En este caso, se detectó la expresión
de todos los ARNm de GluRl-4. En tejidos cerebrales
control adyacentes al tumor también se detectó la expresión del ARNm
de GluR1\sim4 (figura 1s). En lo que respecta a la expresión del
ARNm de GluRl-4, los resultados obtenidos mediante
RT-PCR concordaban completamente con los obtenidos
inmunohistoquímicamente (tabla 1).
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\newpage
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Estos resultados indicaban que las subunidades
de AMPAR se expresan en células de glioblastoma humano y que las
subunidades GluR1 y GluR4 se expresan de manera más abundante y
consistente que las subunidad GluR2 (R). Sugieren firmemente que se
forman en estas células AMPAR permeables al Ca^{2+} constituidos
sin GluR2 (R).
Para examinar la expresión funcional de AMPAR
permeables al Ca^{2+} en células de glioblastoma en cultivo
primario, los presentes inventores midieron los cambios inducidos
por AMPA en la [Ca^{2+}]_{i} intracelular (concentración
de Ca^{2+}), utilizando fura-2 AM (véase la figura
2). La aplicación de AMPA 200 \muM junto con ciclotiazida (CTZ)
100 \muM, que reduce la desensibilización de los AMPAR, aumentó la
[Ca^{2+}]_{i} de las células cultivadas (figuras 2a, b y
c). El aumento en [Ca^{2+}]_{i} desde 80 \pm 21 hasta
285 \pm 120 nM (n = 150) se detectó en el 65 \pm 15% de las
células en 16 placas de cultivo diferentes. Se observó
ocasionalmente un aumento de [Ca^{2+}]_{i} prominente en
las células con procesos largos que se ubicaron en la periferia del
explante (figuras 2d, e y f).
El aumento en [Ca^{2+}]_{i} se detuvo
de manera selectiva mediante el antagonista de AMPA, o bien
2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo(F)-quinoxalina
(NBQX) 20 \muM o bien ácido
[2,3-dioxo-7-(1H-imidazol-1-il)-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidroquinoxalin-1-il]
acético monohidratado (YM872) 10 \muM (J. Pharm. Pharmacol., 50,
795-801, 1998). En estas células cultivadas, el
K^{+} 100 mM no aumentó la [Ca^{2+}]_{i}, lo que indica
que los canales de Ca^{2+} dependientes de voltaje no estaban
implicados en este aumento de [Ca^{2+}]_{i}. Se detectó
la expresión tanto de vimentina como de GluR1 en las células de
cultivo primario utilizadas para la medición de
[Ca^{2+}]_{i} (figuras 2g, h e i).
Para aclarar la significación fisiopatológica de
los AMPAR permeables al Ca^{2+} en células de glioblastoma, los
presentes inventores intentaron en primer lugar convertir los AMPAR
permeables al Ca^{2+} en receptores impermeables al Ca^{2+}
mediante la transferencia mediada por adenovirus de ADNc de GluR2
(Science, 292, 926-929, 2001; NeuroReport, 12,
745-748, 2001). Los siguientes experimentos se
llevaron a cabo principalmente en una línea celular de glioblastoma
establecida (figura 3), denominada CGNH-89, que
posee AMPAR permeables al Ca^{2+} constituido a partir de las
subunidades GluR1 y/o GluR4.
Para introducir el ADNc de GluR2 (R) en la
célula cultivada, los presentes inventores construyeron dos
adenovirus recombinantes; uno era para expresar Cre recombinasa
(AxCANCre) y otro era para expresar GluR2 (R), que portaban una
unidad de cambio para regular la expresión de GluR2 (R) mediante
Cre, que consistía en el promotor CAG, un par de secuencias loxP,
un gen de relleno y ADNc de GluR2 (R) (AxCALNLGluR2). Los presentes
inventores también construyeron un adenovirus recombinante que
portaba ADNc de proteína fluorescente verde (GFP) (AxCAGFP), que se
utilizó como marcador de células infectadas por adenovirus. En la
figura 3a, las células cultivadas que expresaban proteína GluR1
(figura 3b) se infectaron con AxCAGFP. Se detectó fluorescencia de
GFP en la mayoría de las células que expresaban GluR1 2 días tras
la infección (figura 3c). Cuando se infectaron las células con 3
clases de adenovirus recombinantes, AxCANCre, AxCALNLGluR2 (R) y
AxCAGFP, se detectó proteína GluR2 (R) en casi todas las células
que emiten fluorescencia de GFP 2 días tras la infección (figuras
3d, e y f).
Como resultado, los presentes inventores
observaron un cambio notable en la morfología de las células que
expresaban GluR2 (R) (figura 3d, e y f). Los somas celulares se
agrandaron y aplanaron gradualmente. Los procesos citoplasmáticos
se revirtieron en el plazo de 4 días tras la infección viral. Estos
cambios característicos no se observaron cuando las células se
infectaron con AxCALNLGluR2 (R) y/o AxCAGFP, que no indujeron
ninguna expresión de GluR2 (R). El valor medio del área superficial
del cuerpo celular era de 360 \pm 133 \mum^{2} (n = 30) en
células control infectadas con AxCALNLGluR2 (R) y/o AxCAGFP,
mientras que aumentó hasta 1230 \pm 350 \mum^{2} (n \approx
30) en las células que expresaban GluR2 (R) (P < 0,05).
Los presentes inventores observaron que el
citoesqueleto de las células que expresaban GluR2 (R) estaba
desorganizado (célula control en la figura 3g frente a célula que
expresaba GluR2 (R) en la figura 3h), y que las células mostraban
signos de apoptosis tales como la formación de vesículas nucleares y
la formación de cuerpos apoptóticos (figura 3i). Estos cambios
característicos no se producían nunca cuando se sobreexpresaban
AMPAR permeables al Ca^{2+} mediante la introducción de ADNc de o
bien GluR1 o bien GluR2 (Q). En su lugar, los presentes inventores
observaron una característica común en los cultivos celulares que
sobreexpresaban AMPAR permeables al Ca^{2+} porque las células
fusiformes agrandadas a menudo con procesos largos proliferaban a
alta densidad (figuras 3j, k y l).
Los cambios anteriores inducidos en las células
CGNH-89 mediante la expresión mediada por adenovirus
de GluR2 (R) o GluR2 (Q) también se observaron en las células U87
MG. La introducción del gen de GluR2 (R) agrandó y aplanó los somas
de las células U87 MG, mientras que la del gen de GluR2 (Q) aumentó
el número de células fusiformes con procesos largos (figuras 3m, n
y o).
En las figuras 3p a x, los presentes inventores
confirmaron cambios en la permeabilidad al Ca^{2+} inducidos
mediante la introducción mediada por adenovirus de GluR2 (R) o GluR2
(Q) en células CGNH-89. La aplicación de AMPA 200
\muM junto con CTZ 100 \muM aumentó la [Ca^{2+}]_{i}
desde 97 \pm 21 hasta 275 \pm 50 nM (n = 350) en el 52 \pm
14% de las células control en 10 placas de cultivo (figuras 3p, q y
r). El mismo tratamiento no tuvo efecto sobre la
[Ca^{2+}]_{i} en las células que expresaban GluR2
(figuras 3s, t y u) en 4 placas de cultivo, mientras que provocó un
aumento marcado en la [Ca^{2+}]_{i} desde 77 \pm 21
hasta 1185 \pm 240 nM (n = 40) en las células que expresaban GluR2
(Q) en 2 placas de cultivo (figuras 3v, w y x).
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Los presentes inventores examinaron si las
células CGNH-89 que expresaban GluR2 (R) podían
aumentar la [Ca^{2+}]_{i} en un grado similar al de las
células control en respuesta al ATP, que es conocido que median en
la señalización de Ca^{2+} en las células de la glía (J.
Neurosci., 18, 8794-8804, 1998). La aplicación de
ATP 25 \muM aumentó la [Ca^{2+}]_{i} desde 70 \pm 24
hasta 1438 \pm 174 nM (n = 50) en células que expresaban GluR2
(R) en 5 placas de cultivo. Este aumento era casi similar al
detectado en células control, en las que el mismo tratamiento
aumentó la [Ca^{2+}]_{i} desde 77 \pm 28 hasta 1574
\pm 161 nM (n = 50). Esto indicaba que las células en las que se
introdujo el gen de GluR2 (R) podían responder al estímulo
externo.
Los presentes inventores estimaron a
continuación el índice apoptótico en células CGNH-89
que expresaban GluR2 (R) utilizando el procedimiento de marcaje de
los extremos cortados por dUTP mediado por la desoxinucleotidil
transferasa terminal (TdT) (TUNEL) (Science, 267,
1445-1449, 1995) y compararon este valor con el de
las células infectadas sólo con AxCALNLGluR2 (control). El índice
apoptótico se definió como el número de células positivas para
TUNEL dividido entre el número total de núcleos positivos para
yoduro de propidio (PI) por campo microscópico. Para obtener el
valor medio en cada placa de cultivo, se tomaron muestras de 10 a 15
campos elegidos aleatoriamente. Este índice era del 20,2 \pm 4,3%
en células que expresaban GluR2 (R) (n = 4), que era
significativamente mayor que en los controles (5,2 \pm 1,2%, n =
4, P < 0,05).
Los presentes inventores también examinaron la
actividad de proliferación de las células que expresaban GluR2 (R)
calculando el índice de tinción con Ki-67 (el número
de células positivas para Ki-67 dividido entre el
número total de núcleos positivos para PI por campo microscópico
(Lab. Invest., 70, 125-129, 1994). Este índice era
del 12,3 \pm 2,3% en el control y el de las células que expresaban
GluR2 (R) era de < 0,1% (n = 4, P < 0,001). Por el contrario,
la introducción de ADNc de GluR2 (Q) (NeuroReport, 12,
745-748, 2001) para la sobreexpresión de AMPAR
permeables al Ca^{2+} aumentó significativamente el índice de
tinción con Ki-67 hasta el 28,3 \pm 4,8% (n = 4,
P < 0,01), aunque no se detectó ningún cambio significativo en el
índice apoptótico (el 4,3 \pm 1,3%). Cuando se sobreexpresó GluR1
mediante la transferencia mediada por adenovirus del gen de GluRl
para la sobreexpresión de AMPAR permeables al Ca^{2+}, el índice
apoptótico y el índice de tinción con Ki-67 fueron
del 5,3 \pm 2,3% y del 26,3 \pm 4,5%, respectivamente. No hubo
cambios significativos en estos 2 índices entre las células que
expresaban GluR2 (Q) y las que sobreexpresaban GluR1.
Los resultados anteriores sugieren firmemente
que el bloqueo del influjo de Ca^{2+} a través de AMPAR permeables
al Ca^{2+} provoca cambios apoptóticos en células de
glioblastoma. Por tanto, los presentes inventores examinaron los
efectos de los antagonistas de AMPAR sobre la forma de la célula y
los índices apoptóticos y de tinción con Ki-67 en
células CGNH-89. La aplicación de NBQX 20 \muM o
YM872 10 \muM durante 2 días provocó cambios en la morfología de
las células, concretamente, la reversión de procesos
citoplasmáticos, somas agrandados y aplanados, similares a los
observados tras la expresión de GluR2 (R). Además, NBQX y YM872
aumentaron significativamente el índice apoptótico desde el 3,0
\pm 1,8% hasta el 13,0 \pm 2,0% (n = 4, P < 0,01), y desde el
3,8 \pm 2,3% hasta el 18,0 \pm 2,5% (n = 4, P < 0,01),
respectivamente. Redujeron notablemente el índice de tinción con
Ki-67 desde el 18,5 \pm 3,0% hasta el 2,0 \pm
1,0% (n = 4, P < 0,01) y desde el 16,4 \pm 3,5% hasta <
0,1% (n = 4, P < 0,01), respectivamente.
En las otras 3 líneas celulares que expresaban
AMPAR permeables al Ca^{2+} (CGNH-NM,
MRCH-92 y U87 MG en la tabla 1), tanto la expresión
de GluR2 (R) como la aplicación de NBQX o YM872 provocaron cambios
morfológicos similares en células cultivadas, aumentaron el índice
apoptótico y redujeron el índice de tinción con
Ki-67. La aplicación de estos antagonistas de AMPAR
a células en las que se había introducido el gen de GluR2 (R) no
provocó cambios adicionales en las formas de las células y estos 2
índices en las 4 líneas celulares sometidas a prueba, lo que indica
que la expresión mediada por virus de GluR2 (R) y los antagonistas
de AMPAR actúan sobre la misma diana.
Las células tumorales migratorias en la
sustancia blanca en el cerebro mostraban una morfología fusiforme y
a menudo presentaban procesos celulares largos. Estas formas de las
células tumorales parecían ser adecuadas para la migración celular.
De hecho, la migración celular se inhibía notablemente cuando la
expresión de GluR2 (R) en las células tumorales provocaba que éstas
adoptaran una forma aplanada y revertían sus procesos. Por el
contrario, la sobreexpresión de AMPAR permeables al Ca^{2+}
mediante la introducción mediada por adenovirus de GluR2 (Q)
prolongaba los procesos celulares y parecía promover su
comportamiento migratorio. Para estimar el grado de migración
celular cuantitativamente, los presentes inventores realizaron 2
experimentos (figura 4).
En primer lugar, los presentes inventores
utilizaron una placa de cultivo de doble cámara Transwell para
estimar la actividad motriz en la dirección del eje Z. Esta placa
de cultivo presentaba las cámaras superior e inferior separadas por
una membrana porosa con múltiples poros de 8 \mum de diámetro.
Cuando las células en la cámara superior se infectaban con AxCAGFP
y AxCALNLGluR2 (R) sin AxCANCre (control), una pequeña parte de las
células se movía a la parte inferior a través de la membrana porosa
en el plazo de 24 h. El valor medio de células migradas contadas en
diez campos con un objetivo 20 X bajo el microscopio era de 4,2
\pm 2,3 en 5 experimentos independientes (figura 4a). Sin
embargo, ninguna célula viable que expresaba GluR2 (R) se movió
hacia abajo y sólo se observaron fragmentos de las células
alteradas en la cámara inferior (figura 4b). Por el contrario, la
introducción de GluR2 (Q) aumentó el número de células que se movían
a la cámara inferior (31,2 \pm 8,3, n = 5, P < 0,02) (figura
4c).
Los presentes inventores examinaron a
continuación la actividad motriz utilizando un aro de clonación (7
mm de diámetro) en el centro de la placa de cultivo. Se cultivaron
las células dentro del aro que se retiró 48 h tras la infección
viral. Entonces se contó el número de células que atravesaron el
borde del aro de clonación durante las siguientes 24 h. El número
medio de células en los 5 experimentos fue de 43,2 \pm 5,3, 15,0
\pm 3,3 y 250,2 \pm 50,3 en las células que expresaban GFP,
GluR2 (R) y GluR2 (Q), respectivamente (figuras 4d, e y f). Por
tanto, la expresión de GluR2 (R) reprimía significativamente la
motilidad celular (P < 0,002), mientras que la de GluR2 (Q) la
promovió (P < 0,01).
Se observó un efecto inhibidor similar de
migración tumoral mediante la aplicación de YM872 10 \muM. La
introducción del gen de GluR2 (R) y la aplicación de YM872 también
inhibió la migración celular en las otras 3 líneas celulares que
expresaban AMPAR permeables al Ca^{2+}.
Los presentes inventores finalmente examinaron
si la expresión de GluR2 (R) afectaba a la migración y proliferación
del glioblastoma in vivo (figura 5). Con este fin, los
presentes inventores utilizaron en primer lugar un modelo de ratón
de glioblastoma humano en el que 2 X 10^{5} células
CGNH-89 marcadas con GFP utilizando AxCAGFP se
injertaron en la subcorteza cerebral de ratones desnudos. Estas
células injertadas formaron agrupaciones de células, invadieron la
ruta mielinizada del cuerpo calloso tal como se observa en muestras
quirúrgicas humanas y se propagaron ampliamente por todo el cerebro
en los 15 ratones desnudos sometidos a prueba. La histología de las
muestras de xenoinjerto de ratones desnudos mostró rasgos
característicos de glioblastoma humano; es decir, pleomorfismo
(figura 5a), necrosis con pseudoempalizada (figura 5b) y
proliferación microvascular (figura 5c).
La figura 5b muestra una agrupación de células
tumorales formada en la zona subcortical 9 días tras el injerto de
2 X 10^{5} células infectadas con AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (R) para
la expresión de GFP solo. Las células tumorales, cuyos núcleos
celulares se tiñeron con PI, estaban empaquetadas densamente, y se
detectó GFP en células en la región inoculada (figura 5e). Por el
contrario, cuando se inoculó el mismo número de células tras
haberse infectado con AxCALNLGluR2 (R) más AxCANCre junto con
AxCAGFP para la expresión tanto de GluR2 (R) como de GFP, no se
formó ninguna agrupación sólida de células tumorales en ninguno de
los 13 ratones desnudos sometidos a prueba (figura 5f). Las células
tumorales dejaron de proliferar y pasaron a ser apoptóticas tal
como se determinó mediante morfología nuclear tras tinción con PI
(figura 5g).
Para estimar adicionalmente de manera
cuantitativa si la manipulación de AMPAR permeables al Ca^{2+}
altera el crecimiento tumoral in vivo, los presentes
inventores examinaron los efectos de la expresión de GluR2 (R) y
GluR2 (Q) y/o la aplicación del antagonista de AMPAR YM872 sobre el
crecimiento del tumor producido injertando células
CGNH-89 en el tejido subcutáneo de ratones desnudos
(figura 6)-(figuras 6a y b). La expresión mediada por adenovirus de
GluR2 (R) redujo significativamente la tasa de crecimiento tumoral
así como el tamaño del tumor 22 días tras el injerto, en
comparación con el caso en el que se infectó el tumor con
AxCALNLGluR2 (R) sin AxCANCre (n = 12, P < 0,001). La expresión
de GluR2 (Q) tendió a acelerar el crecimiento tumoral, aunque no
aumentó el tamaño del tumor 22 días tras el injerto. La aplicación
intraperitoneal de YM872 redujo significativamente el tamaño del
tumor, en comparación con el tratamiento con el vehículo (solución
salina tamponada con fosfato; PBS) (n = 12, P < 0,001). También
inhibió el crecimiento del tumor que expresaba GluR2 (Q) (n = 12, P
< 0,001), pero no presentó efectos inhibidores adicionales sobre
el tumor que expresaba GluR2 (R).
El análisis histológico reveló la presencia de
numerosas células mitóticas en tejidos tumorales tratados con el
vehículo solo (figura 6c). En los tejidos tumorales tratados con
YM872 (figura 6d) o que expresaban GluR2 (R) (figuras 6e y f)
apenas se detectaron células mitóticas. En su lugar se observó un
gran número de células apoptóticas. La proliferación de células
tumorales que expresaban GluR2 (Q) se inhibió mediante la aplicación
de YM872 (figuras 6g, h y i). El tratamiento con YM872 no provocó
una inhibición adicional de la proliferación de tumores en células
que expresaban GluR2 (R) (figura 6j).
En las muestras quirúrgicas obtenidas de
pacientes con glioblastoma, las células migratorias en la ruta
mielinizada mostraban morfologías fusiformes o bipolares y
expresaban las proteínas GluR1 y/o GluR4 abundantemente. Las
células en migración ubicadas en la periferia de cultivos por
explante derivados de las muestras quirúrgicas también presentaban
una morfología fusiforme a menudo con procesos celulares largos, y
expresaban GluR1. La sobreexpresión de AMPAR permeables al
Ca^{2+} mediante la transferencia mediada por adenovirus de GluR1
o GluR2 (Q) aumentó el número de células migratorias con morfología
fusiforme con procesos celulares largos. Por el contrario, la
motilidad de las células tumorales se reprimió notablemente tras
haberse transformado la morfología celular a una forma poligonal o
aplanada mediante la expresión de GluR2 (R). Parece probable que la
morfología fusiforme y los procesos prolongados sean adecuados para
la migración celular, porque la morfología fusiforme haría posible
que las células tumorales invadieran las rutas mielinizadas
compactas o el espacio estrecho en los tejidos del SNC.
Se considera que la prolongación de los procesos
celulares es la primera etapa para la migración celular, que va
seguida de la translocación de somas celulares y la reversión de
procesos posteriores (Cell, 84, 371-379, 1996). Con
respecto a la relación causal entre la morfología de las células de
la glía y los AMPAR permeables al Ca^{2+}, los presentes
inventores han mostrado anteriormente que la expresión de GluR2 (R)
provoca una reversión notable de los procesos gliales, mientras que
la sobreexpresión de GluR2 (Q) provoca su prolongación en células
cultivadas similares a la glía de Bergmann derivadas de cerebelo de
ratón (NeuroReport, 12, 745-748, 2001). Sin
embargo, sigue debiendo aclararse el mecanismo detallado responsable
de la prolongación de los procesos gliales mediados por AMPAR
permeables al Ca^{2+}.
En este experimento, los presentes inventores
mostraron que la conversión de AMPAR permeables al Ca^{2+} en
receptores impermeables al Ca^{2+} aumentó el índice apoptótico y
reprimió la actividad de proliferación de las células tumorales.
Por tanto, el influjo de Ca^{2+} a través de estos receptores
parece ser necesario para la estimulación de la cascada de
señalización antiapoptótica. Esta noción se apoya en el hallazgo
anterior de que una cantidad moderada de influjo de Ca^{2+} es
indispensable para la supervivencia de diversas células cultivadas
tales como células granulares de cerebelo y células de neuroblastoma
NB108 (J. Neurosci., 7, 2203-2213, 1987; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6421-6425, 1989; Nature,
396, 584-587, 1998). Yano et al. (Nature,
396, 584-587, 1998) han demostrado que en células de
neuroblastoma NB108 el Ca^{2+} suministrado mediante la entrada
de Ca^{2+} a través de los receptores de
N-metil-D-aspartato
(NMDA) activa la cinasa de proteína cinasa dependiente de
Ca^{2+}/calmodulina (CaM-KK), que a su vez
fosforila una serina/treonina cinasa, Akt (proteína cinasa B). Se
sabe que la activación de Akt libera una variedad de señales
antiapoptóticas, facilitando así la supervivencia celular (Nature,
396, 584-587, 1998).
El agonista endógeno para AMPAR es el glutamato.
El medio de cultivo en este experimento se complementó con suero
bovino fetal (FCS) y contenía glutamato hasta 100 \muM. La
presencia de glutamato era esencial para el mantenimiento de la
morfología fusiforme así como la proliferación de las células
tumorales. Cuando se cultivaron las células en medio sin glutamato
complementado con FCS dializado al 10% durante 4\sim5 días,
pasaron a presentar una forma poligonal y aumentó el número de
células apoptóticas. Estos cambios se restablecieron mediante la
adición de glutamato 100 \muM. Una cuestión obvia es si una
concentración suficiente de glutamato para activar los AMPAR
permeables al Ca^{2+} se suministra realmente a las células
tumorales en proliferación y en migración en el cerebro. Se ha
mostrado que las células de glioma implantadas continúan secretando
glutamato, dando como resultado una elevación detectable del
glutamato extracelular, y que los gliomas con alta liberación de
glutamato presentan una ventaja de crecimiento distinto (Nature
Med., 7, 1010-1015, 2001). Es probable que las
células de glioblastoma secreten glutamato de manera autocrina de
forma similar a los astrocitos que secretan diversas citocinas y
factores de crecimiento (Nature, 391, 281-285, 1998;
J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57, 653-663,
1998).
Se ha mostrado que los antagonistas de
receptores tanto NMDA como AMPA inhiben la proliferación y migración
de diversos tipos de células tumorales incluyendo las células de
glioma y neuroblastoma (Nature Med., 7, 1010-1015,
2001; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6372-6377,
2001). En este estudio, los presentes inventores mostraron que los
AMPAR permeables al Ca^{2+} desempeñan papeles críticos para
facilitar la migración y proliferación de las células de
glioblastoma humano, y que el bloqueo de los AMPAR permeables al
Ca^{2+} mediante YM872 o la expresión de GluR2 (R) reprimen
eficazmente el crecimiento tumoral. Por tanto, los receptores de
glutamato permeables al Ca^{2+} pueden ser una diana terapéutica
para el tratamiento de tumores cerebrales.
Dieciséis muestras quirúrgicas examinadas en
este experimento se diagnosticaron histológicamente como
glioblastoma multiforme según la clasificación de la OMS. Se
prepararon cultivos celulares tal como se describió anteriormente
(Acta Neuropathol., 94, 425-435, 1997; J. Neurosci.
Res., 51, 526-535, 1998). Entre las 4 líneas
celulares de glioblastoma, CGNH-89 mostró una alta
tumorigenicidad y se utilizó para el heterotrasplante en ratones
desnudos. Se cultivaron células en medio Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) complementado con FCS al 10% y
glutamato 2 mM. La concentración de glutamato en este
medio determinada mediante ciclación enzimática era de 107 \pm 5
\muM (n = 4) (Brain Res., 573, 197-203, 1992).
Los presentes inventores construyeron los
siguientes adenovirus recombinantes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93, 1320-1324, 1996; Nucl. Acids Res., 23,
3816-3821, 1995).
(1) AxCALNLGluR1, AxCALNLGluR2 (R) y
AxCALNLGluR2 (Q): las unidades de expresión-cambio
para la expresión de las subunidades GluR1, GluR2 (R) y GluR2 (Q)
de rata, respectivamente, que consistían en el promotor CAG, una
secuencia loxP, un gen de relleno (gen de resistencia a neomicina),
una señal de poli (A), un segundo sitio loxP, la secuencia que
codifica para GluR1, GluR2 (R) o GluR2 (Q), y otra señal de poli (A)
(Mol. Brain Res., 65, 176-185, 1999). Los ADNc de
GluR2 y GluR1 de rata fueron amables obsequios de los Drs. S.
Heinemann y M. Hollmann.
(2) AxCANCre y AxCAGFP: adenovirus recombinantes
para la expresión de Cre recombinasa y EGFP (Clontech),
respectivamente. Se infectaron las células con una multiplicidad de
infección (MOI) de 5 con cada uno de los adenovirus recombinantes
2-5 días antes de los experimentos.
Se llevó a cabo tinción inmunohistoquímica con
anticuerpos selectivos frente a GluR1, GluR2, GluR2/GluR3, GluR4
(Chemicon), GFAP (Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol., 405,
299-310, 1985) y vimentina (V9, Dakopatts A/S) tal
como se describió anteriormente (NeuroReport, 12,
745-748, 2001; ActaNeuropathol., 94,
425-435, 1997). Se visualizaron las
inmunorreactividades con diaminobencidina. Para la
inmunofluorescencia doble se utilizaron anticuerpos secundarios
marcados con FITC, rodamina y Alexa 594 (Molecular Probe) para
visualizar los anticuerpos unidos. Se observaron las células teñidas
con un microscopio confocal de barrido láser
(MRC-1024E, Bio-Rad). Se realizó la
hibridación in situ con el mismo procedimiento descrito por
Kondo et al (J. Neurosci., 17, 1570-1581,
1997).
Las alícuotas de 100 ng de ARN preparadas a
partir de muestras se sometieron a transcripción inversa con
hexámeros al azar (Roche Diagnostics) y se sometió el producto de
RT a 35 ciclos de PCR (desnaturalización durante 20 s a 94ºC,
hibridando durante 20 s a 50ºC, extensión durante 20 s a 72ºC), con
cebadores que amplificaron simultáneamente GluR1\simGluR 4
(Neuron, 12, 383-388, 1994) (cebador sentido:
5'-CCTTTGGCCTATGAGATCTGGATGTG-3'
(SEC ID nº 1), cebador antisentido:
5'-TCGTACCACCATTTGTTTTTCA-3' (SEC ID
nº 2)).
Se llevó a cabo una segunda PCR (35 ciclos) para
la amplificación específica de subunidades con los cebadores
sentido específicos para cualquiera de GluR1 (secuencia base a
1712\sim1733:
5'-AAGAGGGACGAGACCAGACAAC-3' (siendo
la posición 1 el primer nucleótido de la secuencia codificante; SEC
ID nº 3)), GluR2 (R) (secuencia base a 1732\sim1755:
5'-GAAGATGGAAGAGAAACACAAAGT-3' (SEC
ID nº 4)), GluR3 (secuencia base a 1749\sim1771:
5'-GGAAGACAACAATGAAGAACCTC-3' (SEC
ID nº 5)), o GluR4 (secuencia base a 1747\sim1766:
5'-GAAGGACCCAGCGACCAGCC-3' (SEC ID
nº 6)) y el cebador antisentido común utilizado para la primera
amplificación. Se digirieron los productos de esta segunda
amplificación (637 pb para GluR1, 638 pb para GluR2, 657 pb para
GluR3 y 626 pb para GluR4) mediante enzimas de restricción
específicas para GluR1 (Bgl I), GluR2 (R) (Bsp1286 I), GluR3 (Ava I)
y GluR4 (Pvu II).
Se cargaron las células con fura
2-AM (Dojin) a temperatura ambiente durante 40 min.
Se obtuvieron imágenes de fluorescencia a una longitud de onda de
excitación de 340 y 380 nm utilizando el sistema Argus/HiSCA
(Hamamatsu Photonics). Se convirtió la razón de fluorescencia
340/380 nm en [Ca^{2+}]_{i} tal como se describió
anteriormente (Cell, 88, 49-55, 1997).
Para los ensayos de TUNEL y proliferación
celular se sembraron en placas las células a una densidad de 2 X
10^{4}/pocillo en portaobjetos de vidrio de 4 pocillos
Lab-Tek rellenos con el medio de cultivo
convencional. A las 6 h tras la siembra en placa, se sustituyó el
medio por medio sin glutamato y se infectaron las células con los
adenovirus. A las 48 h tras la siembra en placa se añadió glutamato
(100 \muM) al medio y se fijaron las células a los 5 días tras la
infección. Se llevó a cabo el ensayo de TUNEL con un kit de
detección de muerte celular in situ (MBL). El ensayo de
proliferación celular se llevó a cabo con índices de tinción con
anticuerpo monoclonal anti-Ki-67
(Dako). El ensayo de migración se llevó a cabo en una cámara
Transwell (tamaño de poro de 8 \mum) (Corning Corstar Corp.).
Se sembraron en placa las células a una densidad
de 5 X 10^{4}/pocillo en la cámara superior. A las 6 h tras la
siembra en placa se infectaron las células con los adenovirus
recombinantes en medio sin glutamato complementado con FCS
dializado al 10%. A las 48 h tras la infección se añadió glutamato
(100 \muM) al medio. Se cultivaron las células durante 24 h más y
se contó el número de células que migró a través de la membrana
porosa con un objetivo de 20 bajo el microscopio.
En otra serie de ensayo de migración se colocó
un cilindro de clonación de vidrio (7 mm de diámetro) cubierto en
un extremo con grasa de silicona en el centro de una placa de
cultivo. Se sembraron en placa 2 X 10^{4} células dentro del
cilindro. A las 48 h tras la infección se retiró el aro de clonación
y se cultivaron las células durante 24 h más. Entonces se contó el
número de células que atravesaban el borde del aro de clonación.
Se suspendieron células CGNH-89
a1 X 10^{7}/100 \mul en medio de cultivo. Las alícuotas de 2
\mul de la suspensión infectada con AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (R)
con o sin AxCANCre se inyectaron estereotácticamente en los
cerebros de ratones desnudos bajo anestesia con éter. Se examinaron
los tejidos cerebrales de 9 a 14 días tras la inyección.
Además, el efecto de la expresión mediada por
adenovirus de GluR2 (R) y GluR2 (Q) sobre el crecimiento tumoral se
evaluó cuantitativamente en tumores subcutáneos con o sin aplicación
de YM872, un antagonista para receptores de glutamato de tipo AMPA.
Se inyectaron por vía subcutánea suspensiones celulares (1 X
10^{7}/100 \mul) en la ijada de ratones desnudos de 5\sim6
semanas de edad (peso corporal, 18-20 g). Se
administraron por vía intratumoral adenovirus (1 X 10^{7} PFU,
diluidas en un total de 100 \mul de PBS) una vez 5 días tras la
inoculación del tumor con una aguja de calibre 27. Se administró
AxCALNLGluR2 (R) sin AxCANCre para el control.
YM872, un amable obsequio de Yamanouchi
Pharmaceutical Company, se disolvió en pbS. Se observó la inhibición
dependiente de la dosis de crecimiento tumoral tras la inyección
intraperitoneal diaria de YM872 (comenzando un día tras el implante
del tumor) a dosis de 10, 50 y 100 mg/kg durante 2 semanas. En esta
serie de experimentos se utilizaron 100 mg/kg de YM872. Se
administró por vía intraperitoneal pbS (100 \mul) para el control.
Se calculó el volumen del tumor según la fórmula (longitud X
anchura^{2})/2. Al final de cada experimento se sometieron los
tejidos tumorales a un análisis histológico.
Los datos se expresan como las medias \pm el
error estándar de las medias. Se llevaron a cabo comparaciones
estadísticas mediante la prueba de la t para datos independientes o
análisis de la varianza de una vía (ANOVA: prueba de Scheffe para
la comparación a posteriori).
Figura
1
a \sim c; Secciones seriadas a partir de una
muestra quirúrgica original. a; Acumulación por debajo de la
piamadre de células tumorales invasoras teñidas con
hematoxilina-eosina (HE). b; Expresión de ARNm de
GluR1 detectado mediante hibridación in situ (cloruro de
nitroazul de tetrazolio, azul). c; Se muestra una imagen de
inmunofluorescencia para GluR1 (rodamina, rojo).
d \sim g; Secciones seriadas a partir de una
muestra quirúrgica (GNS-3148). d; Se muestra la
acumulación por debajo de la piamadre de células tumorales
invasoras (tinción con HE). e; Inmunotinción con anticuerpo
anti-GluR1. f; Inmunotinción con anticuerpo
anti-GluR2. g; Inmunotinción con anticuerpo
anti-GluR4.
h \sim k; Un tejido adyacente de las mismas
muestras de "d" \sim "g". h; Células tumorales invasoras
en la corteza cerebral (tinción con HE). i, j y k; Inmunotinciones
con anticuerpos anti-GluRl,
anti-GluR2 y anti-GluR4,
respectivamente.
l \sim n; Se muestran la inmunotinción con
anticuerpo anti-GluR1 (Alexa 594, rojo) (l) y
anticuerpo anti-GluR4 (FITC, verde) (m), y su
imagen combinada (n) en células tumorales en cultivo primario.
o \sim q; Se muestran la inmunotinción con
anticuerpo anti-GluR1 (Alexa 594, rojo) (o) y
anticuerpo anti-GluR2 (FITC, verde) (p), y su
imagen combinada (q) en células tumorales. La barra de escala en
"q" representa 100 \mum para "a" \sim "g" y 50
\mum para "h" \sim "q".
r \sim s; Análisis por RT-PCR
con cebadores específicos para GluR1\sim4 en células tumorales en
cultivo primario (r) y en tejido cerebral normal adyacente al tumor
antes de la resección (s). Tanto en "r" como en "s", los
4 carriles de la izquierda y de la derecha (R1\simR4) muestran
electroforesis de productos de PCR antes y tras la digestión
mediante enzimas de restricción específicas para cada ADN de
GluR1\sim4, respectivamente. El tamaño de los fragmentos
digeridos en los carriles de la derecha es de: 189 y 448 pb para
GluR1 cortada mediante Bgl I, 368 y 270 pb para GluR2 cortada
mediante Bsp1286 I, 420 y 237 pb para GluR3 cortada mediante Ava I,
379 y 247 pb para GluR4 cortada mediante Pvu II. El carril \varphi
muestra el marcador de tamaño de ADN con la banda de 500 pb
densa.
Figura
2
a \sim c; Se muestra el aumento inducido por
AMPA en [Ca^{2+}]_{i} en células tumorales en cultivo
primario cargadas con fura-2 AM. Se muestran la
imagen de fluorescencia en la longitud de onda de excitación de 340
nm (a) e imágenes en pseudocolor de la razón 340/380 nm antes (b) y
durante (c) la exposición a AMPA 200 \muM y CTZ 100 \muM.
d \sim f; Se muestra el aumento inducido por
AMPA en [Ca^{2+}]_{i} en las células en monocapa que se
movieron fuera del cultivo por explante. Se tomaron las imágenes en
la misma disposición que en "a" \sim "c".
g \sim i; Se muestran la inmunofluorescencia
doble para vimentina (g, FITC, verde), y GluR1 (h, rodamina, rojo)
y su imagen combinada (i). La barra de escala en "f" representa
20 \mum para "d" a "f" y aquélla en "i" 100 \mum
para "a" \sim "c" y "g" \sim "i".
Figura
3
a \sim c; Control. Se infectaron células
cultivadas (CGNH-89) con AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (R)
sin Ax-CANCre. Fluorescencia de GFP (a),
inmunofluorescencia para GluR1 (b) y su imagen combinada (c).
d \sim f; Células que expresan GluR2. Se
infectaron con AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (R) junto con
Ax-CANCre. Fluorescencia de GFP (d),
inmunofluorescencia para GluR2 (e) y su imagen combinada (f).
g; Células infectadas con AxCALNLGluR2 (R) solo
para el control y teñidas doblemente para determinar vimentina
(FITC, verde) y con yoduro de propidio (PI) (rojo).
h; Células infectadas con AxCALNLGluR2 (R) junto
con AxCANCre y teñidas doblemente para determinar vimentina (FITC,
verde) y GluR2 (rodamina, rojo). Obsérvense filamentos de vimentina
alterados en una célula que expresa proteína GluR2 (R).
i; Células infectadas con AxCAGFP y AxCALNLGluR2
(R) junto con AxCANCre, y teñidas con PI. Obsérvense cuerpos
apoptóticos y formación de vesículas nucleares.
j \sim l; Células que sobreexpresan GluRl. Se
infectaron con AxCALNLGluR1 junto con AxCANCre. Se muestran la
inmunofluorescencia para vimentina (j, FITC, verde) y GluR1 (k,
rodamina, rojo) y su imagen combinada (1).
m \sim o, Células U87-MG
infectadas con AxCAGFP (m), AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (R) junto con
AxCANCre (n), y AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (Q) junto con AxCANCre (o).
Se tiñeron para determinar GluR2 (R) (rodamina, rojo). Se muestran
las imágenes combinadas de inmunofluorescencia de GFP y GluR2. La
barra de escala en "i" representa 100 \mum para "a"
\sim "f" y "j" \sim "o", y 20 \mum para
"g" \sim "i".
p \sim x; Se muestran los resultados de la
medición de [Ca^{2+}]_{i} utilizando
fura-2AM. Células CGNH-89 control
(p\simr) y células que expresan GluR2 (R) (s\simu) y GluR2 (Q)
(v\simx). De izquierda a derecha, imágenes de fluorescencia a la
longitud de onda de excitación de 340 nm, imágenes en pseudocolor de
la razón 340/380 nm antes y durante la exposición a AMPA 200 \muM
y CTZ 100 \muM.
Figura
4
a \sim c; Un conjunto de vistas que muestran
la motilidad de las células tumorales examinadas con una cámara
doble Transwell. Vistas con microscopio confocal de las células en
la cámara inferior bajo la membrana porosa. Se tiñeron las células
con anticuerpos anti-GluR2 (rodamina, rojo) y
anti-vimentina (FITC, verde). a; Células infectadas
con AxCALNLGluR2 (R) sin AxCANCre. Algunas células que expresan
vimentina migraron a través de la membrana porosa durante 24 h. b;
Células infectadas con AxCANCre y AxCALNLGluR2 (R) para la expresión
de GluR2 (R). Sólo se observaron fragmentos de las células
alteradas en la cámara inferior tras 24 h. c; Células infectadas
con AxCANCre y AxCALNLGluR2 (Q) para la expresión de GluR2 (Q). Un
mayor número de células tumorales que en "a" migraron a través
de la membrana porosa durante 24 h.
d \sim f; Se muestra la motilidad de las
células tumorales examinadas con un aro de clonación. Se muestra la
migración de las células infectadas con AxCALNLGluR2 (R) solo (d,
control), células que expresan GluR2 (R) (e) y células que expresan
GluR2 (Q) (f) en el plazo de 24 h tras la retirada del aro de
clonación. Se tiñeron las células con anticuerpos
anti-vimentina y anti-GluR2. Las
líneas blancas indican el borde del aro de clonación. La barra de
escala en "f" representa 50 \mum para "a" \sim
"c" y 100 \mum para "d" \sim "f".
Figura
5
a \sim c; Se muestra la histopatología del
tumor formado mediante el trasplante de células de glioblastoma
cultivadas en la región subcutánea del ratón desnudo. El tumor se
caracterizaba por pleomorfismo (a), necrosis con pseudoempalizada
(b) y proliferación microvascular (c). En la figura, "v" indica
los vasos del tumor (tinción con HE).
d; Se muestra la formación del tumor a los 9
días tras el trasplante de 2 X 10^{5} células de glioblastoma
cultivadas en la zona subcortical del cerebro del ratón desnudo. Las
células cultivadas se habían infectado con AxCAGFP y AxCALNLGluR2
(R) cada una con una MOI de 5 para la expresión de GFP (verde) 2
días antes del trasplante y se tiñeron mediante PI (rojo). e; Vista
con más aumentos de la zona recuadrada en "d".
f; Células a los 14 días tras el trasplante de 2
X 10^{5} células de glioblastoma cultivadas. Las células
cultivadas se habían infectado con AxCAGFP y AxCALNLGluR2 (R) junto
con AxCANCre cada uno a una MOI de 5 para la expresión tanto de GFP
como de GluR2 (R) 2 días antes del trasplante.
g; Vista con más aumentos de la zona recuadrada
en "f". Obsérvese la morfología nuclear apoptótica provocada
por la expresión de GluR2 (R). La barra de escala en "g"
representa 50 \mum para "a", "e" y "g", 100 \mum
para "b",
75 \mum para "c", 1500 \mum para "d", y 1000 \mum para "f".
75 \mum para "c", 1500 \mum para "d", y 1000 \mum para "f".
\newpage
Figura
6
a; Efectos de diversos tratamientos sobre la
tasa de crecimiento de tumores injertados en el tejido subcutáneo
de ratones desnudos: inyección de pbS (vehículo como control para la
aplicación de YM872, triángulos invertidos); expresión de GluR2 (Q)
(cuadrados en blanco); inyección de AxCALNLGluR2 sin AxCANCre
(vector como control para la expresión de GluR2 y GluR2 (Q),
círculos rellenos); expresión de GluR2 (Q) más aplicación de YM872
(triángulos en blanco); expresión de GluR2 (R) (rombos rellenos);
aplicación de YM872 (cuadrados rellenos); y expresión de GluR2 (R)
más aplicación de YM872 (triángulos rellenos). Para cada tratamiento
se utilizaron 12 animales. Cada representación gráfica representa
la media \pm error estándar de la media (n = 12) del volumen del
tumor.
b; Se muestran las representaciones gráficas de
los volúmenes de los tumores medidos 22 días tras la inoculación.
Para cada tratamiento se representaron gráficamente los datos sin
procesar obtenidos de 12 animales. * indica una diferencia
significativa en p < 0,001 con respecto al control (o
bien vehículo o bien vector).
c \sim f; Se muestran la histología de los
tejidos tumorales tratados con el vehículo (c) y YM872 (d), y de
aquellos a los se les suministró el gen de GluR2 (R) (e, f). c, d y
e; Tinción con HE. f; Inmunotinción con anticuerpo
anti-GluR2.
g \sim h; Tinción con HE (g) e inmunotinción
con anticuerpo anti-GluR2 (h) en tejidos tumorales a
los que se les suministró el gen de GluR2 (Q).
i; Se muestra la tinción con HE de tejidos
tumorales que expresan GluR2 (Q) y tratados con YM872.
j; Se muestra la tinción con HE de tejidos
tumorales que expresan GluR2 (R) y tratados con YM872. Los tejidos
en "c" \sim "j" se tomaron 22 días tras la inoculación
del tumor. La barra de escala en "j" representa 50 \mum para
"c" \sim "j".
La presente invención hace posible inhibir la
proliferación e invasión de células tumorales cerebrales regulando
la permeabilidad al Ca^{2+} mediante subunidades del receptor de
glutamato de tipo AMPA en células tumorales cerebrales animales en
desarrollo. En particular, la presente invención hace posible
regular la permeabilidad al Ca^{2+} en células tumorales
cerebrales introduciendo un gen de una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) en una célula tumoral cerebral, e
inhibir la proliferación e invasión de células tumorales cerebrales
y, por tanto, la presente invención sirve como medio eficaz para
tratar tumores cerebrales tales como glioblastoma, que se sabe que
es el tumor más maligno y altamente migratorio e invasivo. Además,
dado que la presente invención hace posible medir la actividad de
proliferación/invasión de células tumorales cerebrales
detectando/midiendo la expresión de subunidades del receptor de
glutamato de tipo AMPA en células tumorales cerebrales animales en
desarrollo, puede encontrarse el grado de malignidad del tumor
cerebral utilizando el procedimiento, y la presente invención sirve
como un medio potente para el diagnóstico, la prevención o el
tratamiento de tumores cerebrales.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Japan Science and Technology
Agency
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inhibición de la proliferación e
infiltración de células tumorales cerebrales provocada mediante la
expresión de la subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P022437EP CTH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP03784615.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 08/08/2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP P2002-232086
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 08/08/2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP03/10143
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 08/08/2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipcctttggcct atgagatctg gatgtg
\hfill26
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<211> 22
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<223> Cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskiptcgtaccacc atttgttttt ca
\hfill22
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<210> 5
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipggaagacaac aatgaagaac ctc
\hfill23
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipgaaggaccca gcgaccagcc
\hfill20
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Claims (13)
1. Utilización de un gen que codifica para una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) para la
preparación de un medicamento para inhibir la proliferación e
invasión in vivo de células tumorales cerebrales regulando
la permeabilidad al Ca^{2+} mediante una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) que se expresa en una célula
tumoral cerebral animal en desarrollo, en la que el gen utilizado
en la preparación del medicamento codifica para GluR2(R) sin
corrección de ARN adicional.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el gen que codifica para una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) se introduce en una célula tumoral
cerebral animal en desarrollo y se expresa.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el gen que codifica para una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) es un ADNc de una subunidad del
receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R).
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el gen que codifica para una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) se
introduce en una célula tumoral cerebral animal en desarrollo
mediante un vector de expresión, y se expresa.
5. Utilización según la reivindicación 4, en la
que el vector de expresión es un vector que utiliza un
adenovirus.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que la célula tumoral cerebral es un
glioblastoma.
7. Procedimiento para medir la actividad de
proliferación/invasión de células tumorales cerebrales, en el que
se detecta/mide la expresión de una subunidad del receptor de
glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) en una célula tumoral cerebral
animal en desarrollo.
8. Gen que codifica para una subunidad del
receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) para su utilización en
la inhibición de la proliferación e invasión in vivo de
células tumorales cerebrales regulando la permeabilidad al
Ca^{2+} mediante una subunidad del receptor de glutamato de tipo
AMPA GluR2 (R) que se expresa en una célula tumoral cerebral animal
en desarrollo, en el que el gen codifica para GluR2(R) sin
corrección de ARN adicional.
9. Gen para su utilización según la
reivindicación 8, en el que el gen que codifica para una subunidad
del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) se introduce en
una célula tumoral cerebral animal en desarrollo y se expresa.
10. Gen para su utilización según la
reivindicación 8 ó 9, en el que el gen que codifica para una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) es un
ADNc de una subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2
(R).
11. Gen para su utilización según cualquiera de
las reivindicaciones 8 a 10, en el que el gen que codifica para una
subunidad del receptor de glutamato de tipo AMPA GluR2 (R) se
introduce en una célula tumoral cerebral animal en desarrollo
mediante un vector de expresión, y se expresa.
12. Gen para su utilización según la
reivindicación 11, en el que el vector de expresión es un vector que
utiliza un adenovirus.
13. Gen para su utilización según cualquiera de
las reivindicaciones 8 a 12, en el que la célula tumoral cerebral es
un glioblastoma.
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