ES2325578T3 - Antigeno p30 diseñado geneticamente, combinacion de antigenos mejorada y utilizaciones asociadas. - Google Patents
Antigeno p30 diseñado geneticamente, combinacion de antigenos mejorada y utilizaciones asociadas. Download PDFInfo
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Abstract
Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido, donde dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64.
Description
Antígeno P30 diseñado genéticamente, combinación
de antígenos mejorada y utilizaciones asociadas.
La presente invención hace referencia a un
antígeno P30 diseñado genéticamente que se puede utilizar en la
detección de anticuerpos IgM y/o IgG para Toxoplasma gondii.
Además, la presente invención también hace referencia a métodos de
utilización de este antígeno P30 diseñado genéticamente, un método
de producción de anticuerpos monoclonales originados contra este
antígeno P30 diseñado genéticamente, así como kits que contienen el
antígeno P30 diseñado genéticamente.
Toxoplasma gondii es un parásito
intracelular obligado que se clasifica en Coccidia. Este parásito
tiene una gama de anfitriones relativamente amplia infectando tanto
mamíferos como aves. El organismo es ubicuo en la naturaleza y
existe en tres formas: taquizoito, quiste, y oocisto (Remington,
J.S., McLeod, R., Desmonds, G., Infectious Diseases of the Fetus
and Newborn Infant (J.S. Remington y J.O. Klein, Eds.), págs.
140-267, Saunders, Philadelphia (1995)). Los
taquizoitos, encontrados durante la infección aguda, son la forma
invasiva capaz de invadir todas las células de mamíferos nucleadas.
Después de la fase aguda de la infección, se forman quistes
tisulares denominados bradizoitos en el interior de las células
anfitrionas y permanecen dentro del organismo anfitrión a lo largo
de la vida del anfitrión. Los quistes son importantes en la
transmisión de la infección, especialmente en seres humanos, ya que
la ingestión de carne cruda o poco cocinada puede dar como
resultado la ingestión de bradizoitos que pueden infectar al
individuo dando como resultado una infección aguda. Los oocistos
representan una fase de la reproducción sexual que se produce
solamente en la mucosa intestinal de la familia de los gatos de los
cuales son excretados en las heces.
Una infección por T. gondii adquirida a
través de carne contaminada o heces de gato en un adulto sano a
menudo es asintomática. En mujeres embarazadas y en pacientes
inmunodeprimidos, el resultado clínico puede ser muy grave. Una
infección aguda con T. gondii adquirida durante el embarazo,
especialmente durante el primer trimestre, puede dar como resultado
una transmisión intrauterina al feto no nacido produciendo
complicaciones fetales y neonatales graves, incluyendo retraso
mental y muerte del feto. La recrudescencia de una infección por
T. gondii previa o una infección aguda en un individuo
inmunodeprimido puede ser patogénica. La encefalitis toxoplásmica
es una causa principal de morbidez y mortalidad en pacientes con
SIDA. También se ha demostrado que la infección por Toxoplasma es
una causa significativa de coriorretinitis en niños y adultos.
La diagnosis de la infección con T.
gondii puede ser establecida mediante aislamiento de T.
gondii de la sangre o los fluidos corporales, demostración de
la presencia del organismo en la placenta o los tejidos del feto,
demostración de la presencia de antígeno mediante la detección de
secuencias de ácidos nucleicos específicas (p. ej., sondas de ADN),
o detección de inmunoglobulinas específicas de T. gondii
sintetizadas por el anfitrión en respuesta a la infección
utilizando ensayos serológicos.
La detección de anticuerpos específicos de T.
gondii y la determinación del título de anticuerpo son
herramientas importantes utilizadas en la diagnosis de la
toxoplasmosis. Los ensayos serológicos más ampliamente utilizados
para la diagnosis de la toxoplasmosis son la prueba de coloración de
Sabin-Feldman (Sabin, A.B. y Feldman, H.A. (1948)
Science 108, 660-663), la prueba de hemaglutinación
indirecta (IHA) (Jacobs, L. y Lunde, M. (1957) J. Parasitol. 43,
308-314), la prueba IFA (Walton, B.C. et al.
(1966) Am. J. Trop. Med. Hyg. 15, 149-152), la
prueba de aglutinación (Fondation Mérieux, Sérologie de I'Infection
Toxoplasmique en Particulier à Son Début: Méthodes et
Interprétation des Résultants, Lyon, 182 págs. (1975)) y ELISA
(Naot, Y. y Remington, J.S. (1980) J. Infect. Dis. 142,
757-766). La prueba ELISA es una de las pruebas más
sencillas de realizar, y se encuentran disponibles en el mercado
muchas pruebas serológicas automatizadas para la detección de IgM e
IgG específicas de Toxoplasma.
Las pruebas actuales para la detección de
anticuerpos IgM e IgG en individuos infectados pueden variar
ampliamente en su capacidad para detectar anticuerpos del suero.
Por lo tanto, existe una variación inter-análisis
significativa entre los kits disponibles en el mercado. Las
diferencias observadas entre los diferentes kits comerciales están
causadas principalmente por la preparación del antígeno utilizado
para la prueba serológica. La mayoría de los kits utilizan
taquizoitos completos o sometidos a sonicación desarrollados en
cultivos de tejidos o en ratones que contienen una elevada
proporción de material extra-parasítico, por
ejemplo, células de mamífero, componentes del cultivo de tejidos,
etc. Debido a la carencia de un antígeno normalizado, purificado o
un método normalizado para preparar el antígeno de taquizoito, no
es sorprendente que exista variabilidad
inter-análisis resultante de los diferentes
análisis que tienen diferentes características de funcionamiento en
término de sensibilidad y especificidad del análisis.
Dadas las limitaciones de las pruebas
serológicas que emplean el antígeno de taquizoito, como se ha
descrito antes, así como los problemas persistentes referentes a la
determinación del comienzo de la infección, los antígenos
recombinantes purificados obtenidos mediante la biología molecular
son una alternativa atractiva ya que pueden ser purificados y
normalizados. En la literatura, se han clonado y expresado numerosos
genes de Toxo en un anfitrión adecuado para producir antígenos de
Toxo recombinantes, inmunorreactivos. Por ejemplo, se han descrito
los antígenos de Toxo P22 (SAG2), P24 (GRA1), P25, P28 (GRA2), P29
(GRA7), P30 (SAG1), P35, P41 (GRA4), P54 (ROP2), P66 (ROP1), y P68
(Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43,
97-106; Cesbron-Delauw et
al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541;
Johnson et al. (1991) Gene 99, 127-132;
Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34,
3-13; Bonhomme et al. (1998) J. Histochem.
Cytochem. 46, 1411-1421; Burg et al. (1988)
J. Immunol. 141, 3584-3591; Knapp et al.
(1989) EPA 431541A2; Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem.
Parasitol. 56, 227-238; Saavedra et al.
(1991) J. Immunol. 147, 1975-1982); EPA 751
147).
Es plausible que un único antígeno de Toxo no
pueda remplazar al taquizoito en un inmunoanálisis de escrutinio
inicial para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo.
Esto puede ser debido a diversas razones. Primero, los anticuerpos
producidos durante la infección varían con la fase de la infección,
esto es, los anticuerpos producidos por un individuo infectado
varían con el tiempo reaccionando con diferentes epítopos. Segundo,
los epítopos presentes en un antígeno recombinante pueden ser
diferentes o menos reactivos que el antígeno nativo preparado a
partir del taquizoito dependiendo del anfitrión utilizado para la
expresión y del esquema de purificación empleado. Tercero, pueden
ser necesarias técnicas de recombinación diferentes para detectar
las diferentes clases de inmunoglobulinas producidas en respuesta a
una infección, p. ej., IgM, IgG, IgA e IgE.
Con el fin de superar las limitaciones del
antígeno de taquizoito en términos de especificidad y sensibilidad
del análisis, se realizó una búsqueda de antígenos de Toxo que
pudieran ser utilizados combinados para conFigurar nuevos análisis
para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo. Maine
et al. (en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.329.157
B1) describen cócteles de antígenos de Toxo recombinantes para la
detección de IgG e IgM específicas de Toxo. Se determinó que los
cócteles de antígenos de Toxo mencionados antes podían ser
mejorados y potenciados mediante la expresión de P30 de Toxo en
E. coli en forma de una proteína soluble con modificaciones
diseñadas genéticamente. Este antígeno P30 diseñado genéticamente se
describirá con mayor detalle más abajo.
La presente invención incluye un antígeno P30 de
Toxoplasma gondii diseñado genéticamente.
Este antígeno diseñado genéticamente puede ser
utilizado como reactivo de diagnóstico y el antígeno diseñado
genéticamente puede ser producido recombinantemente o
sintéticamente.
En particular, la presente invención incluye una
secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido, donde
el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64.
La presente invención también incluye un polipéptido purificado
codificado por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 63.
Adicionalmente, la presente invención incluye un
polipéptido purificado que tiene la secuencia de aminoácidos del
SEQ ID NO: 64.
Adicionalmente, la presente invención incluye un
método para detectar la presencia de anticuerpos IgM para
Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo que comprende las
etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo de la que se
sospecha que contiene los anticuerpos IgM con una composición que
comprende un polipéptido, donde el polipéptido comprende la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64; y b) detectar la
presencia de complejos polipéptido/anticuerpo IgM, donde la
presencia de los complejos indica la presencia de anticuerpos IgM
en la muestra de ensayo.
Por otra parte, la presente invención abarca un
método para detectar la presencia de anticuerpos IgG para
Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo que comprende las
etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo de la que se
sospecha que contiene los anticuerpos IgG con una composición que
comprende: 1) un polipéptido, donde el polipéptido comprende la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64 y 2) P35; y b) detectar
la presencia de complejos antígeno/anticuerpo IgG, indicando la
presencia de los complejos la presencia de dichos anticuerpos IgG
en la muestra de ensayo.
Asimismo, la invención incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos IgM para Toxoplasma
gondii en una muestra de ensayo que comprende una composición
que comprende un polipéptido, donde el polipéptido comprende la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64; y un producto conjugado
que comprende un anticuerpo anclado a un compuesto generador de
señal capaz de generar una señal detectable.
Asimismo, la presente invención incluye un kit
para determinar la presencia de anticuerpos IgG para Toxoplasma
gondii en una muestra de ensayo que comprende: una composición
que comprende 1) un polipéptido, donde el polipéptido comprende la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64 y 2) P35; y un producto
conjugado que comprende un anticuerpo anclado a un compuesto
generador de señal capaz de generar una señal detectable.
La presente invención también incluye un método
para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG para
Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo que comprende las
etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo que se
sospecha que contiene dichos anticuerpos IgM e IgG con una
composición que comprende 1) un polipéptido, donde dicho
polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64,
y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la
formación de complejos anticuerpo IgM e IgG/antígeno; b) añadir un
producto conjugado a los complejos de anticuerpo IgM/antígeno y a
los complejos de anticuerpo IgG/antígeno resultantes durante un
tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el producto
conjugado se una al anticuerpo IgM e IgG unido, donde el producto
conjugado comprende un anticuerpo anclado a un compuesto generador
de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar la
presencia de anticuerpos IgM e IgG que pueden estar presentes en
dicha muestra de ensayo detectando una señal generada por el
compuesto generador de la señal.
La presente invención también incluye un método
de producción de anticuerpos monoclonales para el polipéptido del
SEQ ID NO: 64 que comprende las etapas de inyectar a un mamífero no
humano un polipéptido, donde el polipéptido comprende la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 64; fusionar las células de bazo del
mamífero no humano con las células de mieloma con el fin de generar
hibridomas; y cultivar los hibridomas durante un tiempo y en
condiciones suficientes para que los hibridomas produzcan los
anticuerpos monoclonales.
La Figura 1 es un esquema de la construcción del
plásmido
pMBX-c2X-ToxoP30(52-336aa)
que no es una realización de la presente invención. (El intervalo
de aminoácidos entre paréntesis, indicado aquí y en toda la
solicitud, hace referencia a la secuencia de aminoácidos (p. ej.,
presente en el plásmido, proteína, etc.) que ha sido derivada del
antígeno P30 nativo).
Las Figuras 2, 2A, 2B, 2C y 2D representan la
secuencia de ADN [SEQ ID NO: 3] de los nucleótidos
1-7478 que codifican la secuencia de aminoácidos
[SEQ ID NO: 4] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30(52-336aa) del
plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa)
que no es una realización de la presente invención.
La Figura 3 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 5] de los nucleótidos 1-850 del gen
ToxoP30(52-336aa) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 6] de la proteína
ToxoP30(52-336aa) que no es una realización
de la presente invención.
La Figura 4 es un esquema de la construcción del
plásmido pMBP-p2X-ToxoP30
(52-336aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 5, 5A, 5B, 5C y 5D representan la
secuencia de ADN [SEQ ID NO: 7] de los nucleótidos
1-7553 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 8] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30(52-336aa) del
plásmido pMBP-p2X-ToxoP30
(52-336aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 6 es un esquema de la construcción del
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1
(52-324aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 7 es un esquema de la construcción del
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1C
(52-324aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 8, 8A, 8B, 8C y 8D representan la
secuencia de ADN [SEQ ID NO: 10] de los nucleótidos
1-7442 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 11] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del1C(52-324aa)
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1 C
(52-324aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 9 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 12] de los nucleótidos 1-819 del gen
ToxoP30del1C(52-324) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 13] de la proteína
ToxoP30del1C (52-324aa) que no es una realización
de la presente invención.
La Figura 10 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del2
(52-311aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 11, 11A, 11B, 11C y 11D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 15] de los nucleótidos
1-7403 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 16] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del2(52-311aa)
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del2
(52-311aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 12 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 17] de los nucleótidos 1-780 del gen
ToxoP30del2(52-311aa) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 18] de la proteína
ToxoP30del2 (52-311aa) que no es una realización de
la presente invención.
La Figura 13 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3
(52-300aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 14 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C
(52-300aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 15, 15A, 15B, 15C y 15D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 20] de los nucleótidos
1-7370 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 21] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del3C(52-300aa)
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C
(52-300aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 16 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 22] de los nucleótidos 1-747 de
ToxoP30del3(52-300aa) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 23] de la proteína
ToxoP30del3C (52-300aa) que no es una realización
de la presente invención.
La Figura 17 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4
(52-294aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 18 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 19, 19A, 19B, 19C y 19D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 25] de los nucleótidos
1-7352 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 26] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del4C(52-294aa)
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 20 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 27] de los nucleótidos 1-729 del gen
ToxoP30del4C(52-294aa) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 28] de la proteína
ToxoP30del4C (52-294aa) que no es una realización
de la presente invención.
La Figura 21 es un esquema de la construcción
del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4del8
(83-294aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 22, 22A, 22B, 22C y 22C representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 30] de los nucleótidos
1-7259 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 31] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del4del8(83-294aa)
del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4del8
(83-294aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 23 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 32] de los nucleótidos 1-636 del gen
ToxoP30del4del8(83-2944aa) y la
correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 33] de la
proteína ToxoP30del4del8 (83-294aa) que no es una
realización de la presente invención.
La Figura 24 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del10
(52-284aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 25, 25A, 25B, 25C y 25 representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 35] de los nucleótidos
1-7322 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 36] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del10(52-284aa)
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del10
(52-284aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 26 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 37] de los nucleótidos 1-699 del gen
ToxoP30del10(52-284aa) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 38] de la proteína
ToxoP30del10 (52-284aa) que no es una realización
de la presente invención.
La Figura 27 es un esquema de la construcción
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del11
(52-214aa) que no es una realización de la presente
invención.
Las Figuras 28, 28A, 28B, 28C y 28D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 40] de los nucleótidos
1-7112 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 41] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del11(52-214aa)
del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del11
(52-214aa) que no es una realización de la presente
invención.
La Figura 29 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 42] de los nucleótidos 1-489 del gen
ToxoP30del11(52-214aa) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 43] de la proteína
ToxoP30del11 (52-214aa) que no es una realización
de la presente invención.
La Figura 30 es un esquema de la construcción de
los plásmidos pMBP-c2X-ToxoP30MIX1,
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 que no es una
realización de la presente invención, y
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 que no es una
realización de la presente invención.
Las Figuras 31, 31A, 31B, 31C y 31D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 61] de los nucleótidos
1-7370 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 62] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30MIX1 del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1.
La Figura 32 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 63] de los nucleótidos 1-747 del gen
ToxoP30MIX1 y la correspondiente secuencia de aminoácidos
codificada [SEQ ID NO: 64] de la proteína ToxoP30MIX1.
Las Figuras 33, 33A, 33B, 33C y 33D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 66] de los nucleótidos
1-7370 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 67] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30MIX3 del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 que no es una
realización de la presente invención.
La Figura 34 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 68] de los nucleótidos 1-747 del gen
ToxoP30MIX3 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID
NO: 69] de la proteína ToxoP30MIX3 que no es una realización de la
presente invención.
Las Figuras 35, 35A, 35B, 35C y 35D representan
la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 71] de los nucleótidos
1-7370 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 72] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30MIX5 del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 que no es una
realización de la presente invención.
La Figura 36 representa la secuencia de ADN [SEQ
ID NO: 73] de los nucleótidos 1-747 del gen
ToxoP30MIX5 y la correspondiente secuencia de aminoácidos
codificada [SEQ ID NO: 74] de la proteína ToxoP30MIX5 que no es una
realización de la presente invención.
Las dificultades de los análisis conocidos para
la detección de anticuerpos IgG e IgM para T. gondii han sido
escritas, con detalle, más arriba. De este modo, existía la
necesidad de descubrir inmunoanálisis que pudieran detectar
exactamente la presencia de tales anticuerpos en suero o plasma
positivo, eliminando de ese modo el problema de los ensayos falsos
negativos o falsos positivos. La presente invención proporciona
tales inmunoanálisis y, en particular, un antígeno que detecta
exactamente la presencia de anticuerpos IgG y/o IgM en sueros
humanos.
En particular, la presente invención incluye una
versión diseñada genéticamente del antígeno P30 referida en la
presente memoria como "ToxoP30MIX1", que contiene deleciones
pequeñas y precisas en el extremo C que maximizan la
inmunorreactividad de IgG e IgM anti-Toxo del
antígeno P30 en un inmunoanálisis, así como cinco restos cisteína C
terminales cambiados a alanina.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
el antígeno ToxoP30MIX1 se muestra en la Figura 32 y está
representada por el SEQ ID NO: 63. La secuencia de aminoácidos de
este antígeno también se muestra en la Figura 32 y está
representada por el SEQ ID NO: 64.
Asimismo, se debe observar que la presente
invención abarca una secuencia de polipéptidos que tiene la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64.
Para los fines de la presente invención, la
"complementariedad" se define como el grado de relación entre
dos segmentos de ADN. Se determina midiendo la capacidad de la hebra
efectora de un segmento de ADN para hibridar con la hebra
antisentido del otro segmento de ADN, en condiciones apropiadas,
para formar una hélice doble. En la hélice doble, siempre que
aparece adenina en una hebra, aparece timina en la otra hebra. De un
modo similar, siempre que se encuentra guanina en una hebra, se
encuentra citosina en la otra. A mayor relación entre las
secuencias de nucleótidos de dos segmentos de ADN, mayor capacidad
para formar dúplex híbridos entre las hebras de los dos segmentos
de ADN.
El término "identidad" hace referencia a la
relación de dos secuencias nucleótido a nucleótido a lo largo de
una ventana o segmento de comparación concreto. De este modo, la
identidad se define como el grado de semejanza, la correspondencia
o la equivalencia entre las mismas hebras (ya sean efectoras o
antisentido) de dos segmentos de ADN (o dos secuencias de
aminoácidos). El "porcentaje de identidad de la secuencia" se
calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo
de una región concreta, determinando el número de posiciones en las
cuales aparece la base o aminoácido idéntico en ambas secuencias con
el fin de proporcionar el número de posiciones emparejadas,
dividiendo el número de tales posiciones por el número total de
posiciones del segmento que está siendo comparado y multiplicando
el resultado por 100. El alineamiento óptimo de secuencias se puede
realizar mediante el algoritmo de Smith y Waterman, Appl. Math.
2:482 (1981), mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol.
Biol. 48:443 (1970), mediante el método de Pearson y Lipman, Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988) y mediante programas de
ordenador que implementan los algoritmos relevantes (p. ej.,
Clustal Macaw Pileup
(http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf; Higgins
et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB
(Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical
Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research
25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer
Group, Madison, WI) o GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin
Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group,
Madison, WI). (Véase la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.912.120).
La "similitud" entre dos secuencias de
aminoácidos se define como la presencia de una serie de restos
aminoácido idénticos y conservados en ambas secuencias. A mayor
grado de similitud entre dos secuencias de aminoácidos, mayor
correspondencia, similitud o equivalencia de las dos secuencias. (La
"identidad" entre dos secuencias de aminoácidos se define como
la presencia de una serie de restos aminoácido exactamente iguales o
invariantes en ambas secuencias). Las definiciones de
"complementariedad", "identidad" y "similitud" son
bien conocidas por los expertos normales en la técnica.
"Codificado por" hace referencia a una
secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de
polipéptido, donde la secuencia de polipéptido o una de sus
porciones contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3
aminoácidos, más preferiblemente al menos 8 aminoácidos, e incluso
más preferiblemente al menos 15 aminoácidos de un polipéptido
codificado por la secuencia de ácido nucleico.
Una molécula de ácido nucleico es
"hibridable" a otra molécula de ácido nucleico cuando una forma
monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con
la otra molécula de ácido nucleico en condiciones apropiadas de
temperatura y fuerza iónica (véase Sambrook et al.,
"Molecular Cloning": A Laboratory Manual, Segunda Edición
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York)). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica
determinan lo "restrictivo" de la hibridación. La
"hibridación" requiere que dos ácidos nucleicos contengan
secuencias complementarias. Sin embargo, dependiendo de lo
restrictivo de la hibridación, se pueden producir emparejamientos
erróneos de bases. La restricción apropiada para la hibridación de
ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y
del grado de complementación. Tales variables son bien conocidas en
la técnica. Más específicamente, a mayor grado de similitud u
homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor valor de Tm
para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias.
Para los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han
derivado ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et
al., supra). Para la hibridación con ácidos nucleicos
más cortos, la posición de los emparejamientos erróneos es más
importante, y la longitud del oligonucleótido determina su
especificidad (véase Sambrook et al., supra).
Según se utiliza en la presente memoria, una
"secuencia de ácido nucleico aislada" es un polímero de ARN o
ADN que es monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente
bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas.
Los nucleótidos (encontrados normalmente en su
forma 5'-monofosfato) son referidos por su
designación de una sola letra como sigue: "A" para adenilato o
desoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para
citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o
desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para
desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G), "Y" para
pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T,
"I" para inosina, y "N" para cualquier nucleótido.
Los términos "homología", "homólogo",
"sustancialmente similar" y "sustancialmente
correspondiente" se utilizan indistintamente en la presente
memoria. Estos hacen referencia a fragmentos de ácido nucleico en
los que los cambios de una o más bases nucleotídicas no afectan a
la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la
expresión génica o producir un cierto fenotipo. Estos términos
también hacen referencia a modificaciones de los fragmentos de
ácido nucleico de la presente invención tales como la deleción o
inserción de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente
las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico
resultante con respecto al fragmento no modificado, inicial.
"Gen" hace referencia a un fragmento de
ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo
secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes 5')
y siguen (secuencias no codificantes 3') a la secuencia
codificante.
"Gen nativo" hace referencia a un gen como
se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias
reguladoras. En contraste, "constructo quimérico" hace
referencia a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que no
se encuentran normalmente juntos en la naturaleza. Por consiguiente,
un constructo quimérico puede comprender secuencias reguladoras y
secuencias codificantes que derivan de diferentes fuentes, o
secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la
misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente de la
encontrada normalmente en la naturaleza. (El término "aislado"
significa que la secuencia está separada de su entorno
natural).
El término "conectado operablemente" hace
referencia a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un
único fragmento de ácido nucleico de manera que la función de uno
está regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor está conectado
operablemente con una secuencia codificante cuando es capaz de
regular la expresión de esa secuencia codificante (esto es, la
secuencia codificante está bajo el control transcripcional del
promotor). Las secuencias codificantes pueden estar conectadas
operablemente a secuencias reguladoras en orientación efectora o
antisentido.
El término "expresión", según se utiliza en
la presente memoria, hace referencia a la producción de un producto
final funcional. La expresión de un gen implica la transcripción del
gen y la traducción del ARNm a una proteína precursora o madura. La
"inhibición antisentido" hace referencia a la producción de
transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de
la proteína diana. La "co-supresión" hace
referencia a la producción de transcritos de ARN efectores capaces
de suprimir la expresión de genes foráneos o endógenos idénticos o
sustancialmente similares (Patente de los Estados Unidos Núm.
5.231.020).
"Proteína" madura hace referencia a un
polipéptido procesado post-traduccionalmente; esto
es, uno del que se han separado cualquiera de los pre- o
pro-péptidos presentes en el producto de traducción
primario. Proteína "precursora" hace referencia al producto
primario de la traducción de ARNm; esto es, con pre- y
pro-péptidos todavía presentes. Los pre- y
pro-péptidos pueden ser, pero no están limitados a,
señales de localización intracelular.
Los mecanismos de ADN recombinante y de
clonación molecular convencionales utilizados en la presente memoria
son bien conocidos en la técnica y son descritos más completamente
por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. en Molecular
Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press:
Cold Spring Harbor, 1989 (en adelante "Sambrook").
El término "recombinante" hace referencia a
una combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otro
modo separados, p. ej., mediante síntesis química o mediante
manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante
técnicas e ingeniería genética.
La "PCR" o "Reacción en Cadena de la
Polimerasa" es un mecanismo para la síntesis de grandes
cantidades de segmentos de ADN específicos, y consiste en una serie
de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk,
CT). Típicamente, el ADN bicatenario se desnaturaliza por calor, los
dos cebadores complementarios a los límites 3' del segmento diana
se hibridan a baja temperatura y después se prolongan a una
temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas
consecutivas es referido como un ciclo.
La reacción en cadena de la polimerasa
("PCR") es un mecanismo poderoso utilizado para amplificar ADN
millones de veces, mediante la replicación repetida de un molde, en
un corto período de tiempo. (Mullis et al., Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich
et al., Solicitud de Patente Europea 50.424; Solicitud de
Patente Europea 84.796; Solicitud de Patente Europea 258.017,
Solicitud de Patente Europea 237.362; Mullis, Solicitud de Patente
Europea 201.184, Mullis et al., Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.683.202; Erlich, Patente de los Estados Unidos Núm.
4.582.788; y Saiki et al., Patente de los Estados Unidos Núm.
4.683.194). El procedimiento utiliza grupos de oligonucleótidos
sintetizados in vitro específicos para cebar la síntesis de
ADN. El diseño de los cebadores depende de las secuencias de ADN que
se deseen analizar. El mecanismo se puede llevar a cabo a través de
muchos ciclos (normalmente 20-50) de fusión del
molde a temperatura elevada, permitiendo que los cebadores se
hibriden con secuencias complementarias dentro del molde y
replicando después el molde con ADN polimerasa.
Adicionalmente, como se ha observado antes, la
presente invención también incluye el antígeno P30 diseñado
genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64. Este antígeno puede ser
producido recombinantemente o sintéticamente.
La presente invención también incluye métodos de
detección de IgM y/o IgG utilizando el antígeno descrito antes. Más
específicamente, existen dos tipos básicos de análisis, competitivos
y no competitivos (p. ej., inmunométricos y sándwich). En ambos
análisis, los anticuerpos o antígenos reactivos están anclados
covalentemente o no covalentemente a la fase sólida. Los agentes
conectores para el anclaje covalente son conocidos y pueden ser
parte de la fase sólida o se pueden derivatizar para ello antes del
recubrimiento. Los ejemplos de las fases sólidas utilizadas en los
inmunoanálisis son materiales porosos y no porosos, partículas de
látex, partículas magnéticas, micropartículas, cuentas, membranas,
pocillos de microtitulación y tubos de plástico. La selección del
material de la fase sólida y del método de marcaje del antígeno o el
anticuerpo reactivos se determinan basándose en las características
de funcionamiento del formato de análisis deseadas. Para algunos
inmunoanálisis, no se requiere marca. Por ejemplo, si el antígeno
está sobre una partícula detectable tal como un glóbulo rojo, se
puede establecer la reactividad basándose en la aglutinación.
Alternativamente, una reacción antígeno-anticuerpo
puede dar como resultado un cambio visible (p. ej., inmunodifusión
radial). En la mayoría de los casos, uno de los anticuerpos o
antígenos reactivos utilizados en el inmunoanálisis es anclado a un
compuesto generador de señal o "marca". Este compuesto
generador de señal o "marca" es detectable por sí mismo o se
puede hacer reaccionar con uno o más compuestos adicionales para
generar un producto detectable (véase también la Patente de los
Estados Unidos Núm. 6.395.472 B1). Los ejemplos de tales compuestos
generadores de señal incluyen cromógenos, radioisótopos (p. ej.,
I^{125}, I^{131}, P^{32}, H^{3}, S^{35}, y C^{14}),
compuestos fluorescentes (p. ej., fluoresceína, rodamina),
compuestos quimioluminiscentes, partículas (visibles o
fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes complejantes, o
catalizadores tales como enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina,
fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano picante,
beta-galactosidasa, y ribonucleasa). En el caso de
utilizar enzima, la adición de un sustrato cromo-, fluoro-, o
luminogénico da como resultado la generación de una señal
detectable. Otros sistemas de detección tales como la fluorescencia
de resolución con el tiempo, la fluorescencia de reflexión interna,
la amplificación (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa) y la
espectroscopía Raman también son útiles.
Un formato general comúnmente utilizado para
controlar el título y el tipo del anticuerpo específico en seres
humanos es el siguiente: se presenta un antígeno sobre una fase
sólida, como se ha descrito antes, el fluido biológico humano que
contiene los anticuerpos específicos se deja reaccionar con el
antígeno, y después se detecta el anticuerpo unido al antígeno con
un anti-anticuerpo humano acoplado a un compuesto
generador de señal.
En este formato, el reactivo
anti-anticuerpo puede reconocer todas las clases de
anticuerpo, o alternativamente, puede ser específico para una clase
o subclase concreta de anticuerpo, dependiendo del propósito
pretendido del análisis. Se pretende que este formato de análisis
así como otros formatos conocidos estén dentro del alcance de la
presente invención y sean bien conocidos por los expertos normales
en la técnica.
En particular, dos ejemplos ilustrativos de un
inmunoanálisis basado en la captura de anticuerpos inmunométrico
son los análisis de anticuerpo Toxo IgM y Toxo IgG IMx fabricados
por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). Ambos análisis son
Inmunoanálisis de Enzimas con Micropartículas automatizados (MEIA)
que miden los anticuerpos para Toxoplasma gondii (T.
gondii) en suero o plasma humano (Safford et al. (1991)
J. Clin. Pathol. 44:238-242). Un análisis mide
cualitativamente los anticuerpos IgM, indicativos de exposición
reciente o de infección aguda, y el otro análisis mide
cuantitativamente la IgG, indicativa de infección crónica o pasada.
Estos análisis utilizan micropartículas recubiertas con antígenos
de T. gondii en forma de fase sólida. En particular, el
espécimen se añade a las micropartículas recubiertas para permitir
que los anticuerpos específicos para T. gondii se unan. Con
posterioridad, se añade un anti-IgM humano (o
anti-IgG humano) conjugado con fosfatasa alcalina
que se une específicamente a los anticuerpos de clase IgM (o IgG)
complejados con los antígenos de T. gondii. Después de la
adición de un sustrato adecuado (p. ej., fosfato de
4-metilumbeliferilo), se controla la velocidad de
recambio catalizado por enzima basándose en la fluorescencia.
Se puede utilizar una mezcla de P30 diseñado
genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64 y P35 en el inmunoanálisis
de IgG de Abbott, y se puede utilizar el P30 diseñado genéticamente
que tiene el SEQ ID NO: 64 solo en el inmunoanálisis de Abbott con
IgM. Adicionalmente, se puede utilizar una mezcla de P30 diseñado
genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64 y P35 en cualquier
análisis, si se desea. Además, se debe observar que también se
pueden utilizar otros análisis no de Abbott o plataformas, con cada
antígeno o combinación de antígenos para los fines de la presente
invención.
De este modo, la presente invención incluye un
método de detección de anticuerpos IgM en una muestra de ensayo que
comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo
que se sospecha que contiene los anticuerpos IgM con P30 diseñado
genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64; (b) detectar la presencia
de anticuerpos IgM presentes en la muestra de ensayo. En este
análisis, se puede detectar la IgG sustituyendo el antígeno P30
diseñado genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64 por una mezcla de
antígeno P30 diseñado genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64 y
P35. Asimismo se utilizará el anti-anticuerpo
específico para IgG. Adicionalmente, si se desea detectar los
anticuerpos tanto IgM como IgG, se pueden utilizar P30 diseñado
genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64 y P35 en el
inmunoanálisis. Más específicamente, la presente invención incluye
un método de detección de los anticuerpos IgM e IgG en una muestra
de ensayo que comprende las etapas de (a) poner en contacto la
muestra de ensayo que se sospecha que contiene los anticuerpos IgM e
IgG con una mezcla de P30 diseñado genéticamente que tiene el SEQ
ID NO: 64 y P35 durante un tiempo y en condiciones suficientes para
permitir la formación de complejos de anticuerpo IgM e IgG/antígeno;
(b) añadir un producto conjugado a los complejos de anticuerpo IgM
e IgG/antígeno resultantes durante un tiempo y en condiciones
suficientes para permitir que el producto conjugado se una al
anticuerpo, comprendiendo el producto conjugado un anticuerpo
anclado a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal
detectable; (c) detectar la presencia del anticuerpo IgM e IgG que
puede estar presente en la muestra de ensayo detectando la señal
generada por el compuesto generador de señal. También se puede
utilizar un control o calibrador que se una a este antígeno.
También se debe observar que todos los métodos
anteriores pueden ser utilizados para detectar anticuerpos IgA (con
un producto conjugado específico de alfa) y/o anticuerpos IgE (con
un producto conjugado específico de épsilon) cuando se desee tal
detección.
Los kits también están incluidos dentro del
alcance de la presente invención. Más específicamente, la presente
invención incluye kits para determinar la presencia de IgG y/o IgM.
En particular, un kit para determinar la presencia de IgM en una
muestra de ensayo comprende a) P30 diseñado genéticamente que tiene
el SEQ ID NO: 64; y b) un producto conjugado que comprende un
anticuerpo (dirigido contra IgM) anclado a un compuesto generador
de señal capaz de generar una señal detectable. El kit también puede
contener un control o calibrador que comprende un reactivo que se
une a P30 diseñado genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64.
De nuevo, si se desea detectar IgG, en lugar de
IgM, el kit comprenderá una mezcla de P30 diseñado genéticamente
que tiene el SEQ ID NO: 64 y P35, en lugar de P30 diseñado
genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64, así como un anticuerpo
dirigido contra IgG. Si se desea detectar tanto IgM como IgG, el kit
comprenderá P30 diseñado genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 64 y
P35.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención puede ser ilustrada
mediante el uso de los siguientes ejemplos no limitantes:
Las enzimas de restricción, la ADN Ligasa de T4,
y el Sistema de Fusión y Purificación de Proteína pMAL® se
adquirieron de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA).
Los patrones de peso molecular de ADN y
proteína, los kits de miniprep de plásmidos, el bromuro de etidio,
y los geles de poliacrilamida pre-formados, fueron
adquiridos de BioRad Laboratories (Richmond, CA).
La maltosa se adquirió de Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MO).
El kit de Purificación por PCR QIAquick y el kit
de Extracción en Gel QIAquick fueron adquiridos de Qiagen, Inc.
(Valencia, CA).
Los oligonucleótidos sintéticos fueron
adquiridos de Sigma Genosys (The Woodlands, TX).
Las células de E. coli supercompetentes
EPICURIAN Coli® XL-1 BLUE (recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac [F' proAB lacI^{q} ZDM15 Tn10
(Tet^{r})]) se obtuvieron de Stratagene Cloning Systems, Inc. (La
Jolla, CA).
El kit de reactivos GeneAmp® y la ADN polimerasa
AmpliTaq® se adquirieron de Perkin-Elmer Cetus
(Norwalk, CT).
Se adquirió agarosa GTG SeaKem de BioWhittaker
Molecular Applications (Rockland, ME).
La Triptona Bacto, el Extracto de Levadura
Bacto, el agar-ampicilina Bacto, los tampones, el
isopropil-\beta-D-tiogalactosido
(IPTG), la albúmina de suero bovino (BSA), Sephacryl
S-300, el suero de ternera fetal (libre de
anticuerpos de Toxo), la sacarosa, la azida de sodio, la urea, el
EDTA, el Triton X-100, la
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAC), el ácido
2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES), las
sales inorgánicas, el dodecilsulfato de sodio (SDS), el Tween 20,
el glicerol, el fosfato de 4-metilumbeliferilo
(MUP), el tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris),
los reactivos de análisis AxSYM Toxo IgG e IgM, los calibradores, y
los controles, las micropartículas derivatizadas con sulfato, la
leche en polvo desnatada, Nipasept, A56620, Brij-35,
el suero de ratón, el manitol, el aparato AxSYM, los reactivos, y
las materias primas fueron adquiridos de Abbott Manufacturing, Inc.
(Abbott Park, IL).
"Superbroth II" contenía 11,25 g/L de
triptona, 22,5 g/L de extracto de levadura, 11,4 g/L de fosfato de
potasio dibásico, 1,7 g/L de fosfato de potasio monobásico, 10 ml/L
de glicerol, pH ajustado a 7,2 con hidróxido de sodio.
Todas las digestiones enzimáticas del ADN se
realizaron de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Se
utilizaron al menos 5 unidades de enzima por microgramo de ADN, y se
permitió un tiempo de incubación suficiente para una digestión
completa del ADN. Se siguieron los protocolos del fabricante para
los diversos kits utilizados en la manipulación del ADN y la
transformación del ADN en E. coli, para la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), y para la purificación de la proteína de
unión a maltosa (MBP) y las proteínas de fusión a MBP. Se
utilizaron procedimientos convencionales para la preparación de
productos lisados de E. coli que contenían
CMP-KDO sintetasa (CKS) (Patente de los Estados
Unidos Núm. 6.329.157 B1), análisis de restricción de ADN en geles
de agarosa, purificación de fragmentos de ADN a partir de los geles
de agarosa, y ligación de los fragmentos de ADN con ADN ligasa de
T4. (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva
York, 1989)). El análisis de la secuencia de ADN se realizó por medio de Lark Technologies, Inc. (Houston, TX).
York, 1989)). El análisis de la secuencia de ADN se realizó por medio de Lark Technologies, Inc. (Houston, TX).
(Comparativo)
Con el fin de mejorar la inmunorreactividad de
los cócteles de antígeno de Toxo descritos en la Patente de los
Estados Unidos Núm. 6.329.157 B1 en un inmunoanálisis, se adquirió
un sistema de expresión de proteínas heterólogo adecuado que
permitiera la producción de P30 de Toxo soluble en E. coli.
Se ha descubierto que el sistema de fusión y purificación de la
proteína de unión a maltosa de E. coli (MBP) descrito en la
Patente de los Estados Unidos Núm. 5.643.758 es útil para la
producción y purificación de proteínas de fusión solubles en E.
coli. (En particular, los vectores descritos allí tienen
secuencias que codifican el sitio de reconocimiento de una proteasa
específica (p. ej., Factor Xa, enteroquinasa o Genenasa®) de manera
que la proteína de interés puede ser escindida de MBP). La fusión
de proteínas con MBP intensifica su solubilidad en E. coli
(Kapust y Waugh (1999) Protein Science 8,
1668-1674). Se elaboraron varios constructos
diferentes tomando en consideración la observación de que el P30 de
Toxo nativo es escindido post-traduccionalmente
antes de la inserción en la membrana del taquizoito (Burg et
al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591). Se
desconocen los sitios de escisión exactos para P30 de Toxo.
Se utilizó el plásmido pToxo-P30
descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.329.157 B1 como
ADN molde para una serie de reacciones de PCR para generar
fragmentos de ADN que contienen diferentes porciones del gen P30 de
Toxo. El ADN del plásmido pToxo-P30 se preparó
utilizando métodos normalizados. Los plásmidos
pMAL-c2X (vector de expresión citoplásmica) y
pMAL-p2X (vector de expresión periplásmica) fueron
adquiridos de New England Biolabs, Beverly MA y fueron digeridos
con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII como preparación
para la subclonación de los fragmentos del gen P30 de Toxo.
Etapa
A
El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa)
fue construido clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de
Toxo, obtenido mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo
contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 1). El plásmido
pMAL-c2X fue digerido con EcoRI/HindIII y el
esqueleto del vector fue purificado con un kit de purificación por
PCR Qiaquick. Se sintetizaron un cebador efector, que empezaba en
el nucleótido 464 del gen P30 que contenía un sitio EcoRI y un
cebador antisentido que contenía un sitio HindIII, que empezaba en
el nucleótido 1318 del gen P30 (Burg et al. (1988) J.
Immunol. 141:3584-3591) como se muestra más
abajo:
Los cebadores efector y antisentido fueron
añadidos a una mezcla de reacción para PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y la
purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de
PCR Qiaquick, se digirió la mezcla de reacción con EcoRI y HindIII,
y el fragmento de ADN de 855 pares de bases que contenía P30 de
Toxo se purificó con un kit de purificación de PCR Qiaquick. El
fragmento de 855 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. Se preparó el ADN de la miniprep a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 por medio de análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa)
contenía el gen P30 de Toxo P30 clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID
NO: 3] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa)
se muestra en la Fig. 2 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 4] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30(52-336aa)
también se muestra en la Fig. 2, donde los restos aminoácido
392-676 del SEQ ID NO: 4 corresponden a los
aminoácidos 52-336 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 5] de
ToxoP30(52-336aa) se muestra en la Fig. 3, y
la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 6] de la
proteína ToxoP30(52-336aa) también se
muestra en la Fig. 3, donde los restos aminoácido
1-285 del SEQ ID NO: 6 corresponden a los
aminoácidos 52-336 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii.
Etapa
B
El plásmido
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
se construyó clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo,
obtenido mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo
contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-p2X (Fig. 4). El plásmido
pMAL-p2X fue digerido con EcoRI/HindIII, y el
esqueleto del vector se purificó con un kit de purificación de PCR
Qiaquick. Se sintetizaron un cebador efector, empezando en el
nucleótido 464 del gen P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador
antisentido que contenía un sitio HindIII, empezando en el
nucleótido 1318 del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol.
141:3584-3591) como se muestra más abajo:
Se añadieron los cebadores efector y antisentido
a una mezcla de reacción para PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y la
purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de
PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII,
y se purificó el fragmento de ADN de 855 pares de bases que
contenía P30 de Toxo con un kit de purificación de PCR Qiaquick. El
fragmento de 855 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-p2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
contenía el gen P30 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-p2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID NO:
7] del plásmido
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
se muestra en la Fig. 5, y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 8] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30P(52-336aa) se
muestra en la Fig. 5, donde los restos aminoácido
417-701 del SEQ ID NO: 8 corresponden a los
aminoácidos 52-336 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii.
Etapa
C
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa),
un intermedio en la construcción del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1C, clonando un
fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido mediante
amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en el
plásmido pToxb-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X (Fig. 6). El plásmido
pMAL-c2X fue digerido con EcoRI/HindIII y el
esqueleto del vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se
sintetizaron un cebador efector, que empezaba en el nucleótido 464
del gen P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido
que contenía un sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 1282
del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol.
141:3584-3591) como se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción para PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y la
purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de
PCR Qiaquick, se digirió la mezcla de reacción con EcoRI y HindIII,
y se purificó el fragmento de ADN de 819 pares de bases que
contenía Toxo P30del1 sobre un gel de agarosa. El fragmento de 819
pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa)
contenía el gen P30del1 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X.
El análisis de la secuencia de ADN del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa)
y el análisis de la correspondiente secuencia de aminoácidos
revelaron cambios de bases en el gen P30 dando como resultado dos
cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia publicada (Burg
et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591).
Estas mutaciones fueron localizadas aguas abajo del sitio EcoRI
sintético (nucleótido 464) y aguas arriba de un sitio BanI
(nucleótido 1100) siguiendo la numeración convencional de Burg
et al., citado antes. Las mutaciones en el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa)
fueron corregidas como sigue: Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa)
clonando un fragmento EcoRI/BanI del plásmido
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa),
que contenía la porción 5' corregida del gen P30 de Toxo, y un
fragmento BanI/HindIII del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa),
que contenía la porción 3' del gen P30del1 de Toxo, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 7). Se digirió el
plásmido pMAL-c2X con EcoRI/HindIII, y el esqueleto
del vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se prepararon los
ADN plasmídicos
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
y
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa)
mediante métodos generales. Se digirieron los plásmidos
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
y
pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa)
con EcoRI/HindIII y los fragmentos de 855 y 819 pares de bases, que
contenían el gen P30 de Toxo, se purificaron sobre un gel de
agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 855 pares de bases se
digirió con BanI y el fragmento EcoRI/BanI de 637 pares de bases,
que contenía la porción 5' corregida del gen P30 de Toxo, se
purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 819
pares de bases se digirió con BanI y el fragmento BanI/HindIII de
182 pares de bases, que contenía la porción 3' del gen P30del1 de
Toxo, se purificó sobre un gel de agarosa. Los fragmentos de 637 y
182 pares de bases purificados se ligaron a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. Se preparó el ADN de la miniprep a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1C
(52-324aa) contenía el gen P30del1C de Toxo en los
sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de
ADN completa [SEQ ID NO: 10] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa)
se muestra en la Fig. 8 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 11] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del1C(52-324aa)
también se muestra en la Fig. 8, donde los restos aminoácido
392-664 del SEQ ID NO: 11 corresponden a los
aminoácidos 52-324 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 12] de
ToxoP30del1C(52-324aa) se muestra en la Fig.
9 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 13] de
la proteína ToxoP30del1C(52-324aa) también
se muestra en la Fig. 9, donde los restos aminoácido
1-273 del SEQ ID NO: 13 corresponden a los
aminoácidos 52-324 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii.
\newpage
Etapa
D
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa)
clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en el
plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X (Fig. 10). Se digirió el plásmido
pMAL-c2X con EcoRI/HindIII y el esqueleto del
vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se sintetizaron un
cebador efector, que empezaba en el nucleótido 464 del gen P30 que
contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un
sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 1243 del gen P30 (Burg
et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591) como
se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción para PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y la
purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación
por PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y
HindIII, y el fragmento de ADN de 780 pares de bases que contenía
P30del2 de Toxo se purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento de
780 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa)
contenía el gen P30del2 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID
NO: 15] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa)
se muestra en la Fig. 11, y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 16] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del2(52-311aa)
también se muestra en la Fig. 11, donde los restos aminoácido
392-651 del SEQ ID NO: 16 corresponden a los
aminoácidos 52-311 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 17] de
ToxoP30del2(52-311aa) se muestra en la Fig.
12 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 18] de
la proteína ToxoP30del2(52-311aa) también se
muestra en la Fig. 12, donde los restos aminoácido
1-260 del SEQ ID NO: 18 corresponden a los
aminoácidos 52-311 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii.
Etapa
E
El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa),
un intermedio en la construcción del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa),
fue construido clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de
Toxo, obtenido mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo
contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 13). El plásmido
pMAL-c2X fue digerido con EcoRI/HindIII, y el
esqueleto del vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se
sintetizaron un cebador efector, que empezaba en el nucleótido 464
del gen P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido
que contenía un sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 1210
del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol.
141:3584-3591) como se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción para PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de
la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación
de PCR Qiaquick, se digirió la mezcla de reacción con EcoRI y
HindIII, y el fragmento de ADN de 747 pares de bases que contenía
P30del3 de Toxo se purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento de
747 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa)
contenía el gen P30del3 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X.
El análisis de la secuencia de ADN del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa)
y el análisis de la correspondiente secuencia de aminoácidos
revelaron un único cambio de base en el gen P30 que dio como
resultado la sustitución de un aminoácido por un codón de
terminación, conduciendo a una terminación prematura de la cadena de
la proteína P30. Esta mutación estaba localizada aguas abajo del
sitio EcoRI sintético (nucleótido 464) y aguas arriba de un sitio
BanI (nucleótido 1100) siguiendo la numeración convencional de Burg
et al. La mutación en el plásmido
pMHP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa)
fue corregida como sigue:
El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa)
se construyó clonando un fragmento EcoRI/BanI del plásmido
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa),
que contenía la porción corregida 5' del gen P30 de Toxo, y un
fragmento BanI/HindIII del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa),
que contenía la porción 3' del gen P30del3 de Toxo, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 14). El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa)
se depositó en la ATCC 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, bajo los términos del Tratado de
Budapest, y se acordó el Número de Acceso ATCC 4722.
El plásmido pMAL-c2X se digirió
con EcoRI/HindIII y el esqueleto del vector se purificó sobre un gel
de agarosa. Los ADN plasmídicos
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
y
pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa)
se prepararon mediante métodos generales. Los plásmidos
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
y
pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa)
se digirieron con EcoRI/HindIII y los fragmentos de 855 y 747 pares
de bases, que contenían el gen P30 de Toxo, se purificaron sobre un
gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 855 pares de bases se
digirió con BanI y el fragmento EcoRI/BanI de 637 pares de bases,
que contenía la porción 5' corregida del gen P30 de Toxo, se
purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 747
pares de bases se digirió con BanI y el fragmento BanI/HindIII de
110 pares de bases, que contenía la porción 3' del gen P30del3 de
Toxo, se purificó sobre un gel de agarosa. Los fragmentos de 637 y
110 pares de bases se ligaron a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la secuencia
de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C
(52-300aa) contenía el gen ToxoP30del3C clonado en
los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia
de ADN completa [SEQ ID NO: 20] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa)
se muestra en la Fig. 15 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 21] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del3C(52-300aa)
también se muestra en la Fig. 15, donde los restos aminoácido
392-640 del SEQ ID NO: 21 corresponden a los
aminoácidos 52-300 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 22] de
ToxoP30del3C(52-300aa) se muestra en la Fig.
16 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 23] de
la proteína ToxoP30del3C(52-300aa) también se
muestra en la Fig. 16, donde los restos aminoácido
1-249 del SEQ ID NO: 23 corresponden a los
aminoácidos 52-300 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii.
Etapa
F
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa),
un intermedio en la construcción del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa),
clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en
el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X (Fig. 17). El plásmido
pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y el esqueleto
del vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se sintetizaron un
cebador efector, que empezaba en el nucleótido 464 del gen P30 que
contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un
sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 1192 del gen P30 (Burg
et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591)
como se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de
la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación
de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y
HindIII, y el fragmento de ADN de 729 pares de bases que contenía
P30del4 de Toxo se purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento de
729 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa)
contenía el gen P30del4 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X.
El análisis de la secuencia de ADN del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa)
y el análisis de la correspondiente secuencia de aminoácidos
revelaron cambios de bases en el gen P30 que daban como resultado
dos cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia publicada
(Burg et al. (1988) J. Immunol.
141:3584-3591). Estas mutaciones estaban
localizadas aguas abajo del sitio EcoRI sintético (nucleótido 464) y
aguas arriba de un sitio BanI (nucleótido 1100) siguiendo el
convenio de numeración de Burg et al. Las mutaciones del
plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa)
se corrigieron como sigue:
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
clonando un fragmento EcoRI/BanI del plásmido
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa),
que contenía la porción corregida 5' del gen P30 de Toxo, y un
fragmento BanI/HindIII del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa),
que contenía la porción 3' del gen ToxoP30del4, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 18). El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
se depositó en ATCC 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, bajo los términos del Tratado de
Budapest el 26 de Sept., 2002, y se acordó el Número de Acceso ATCC
4723.
El plásmido pMAL-c2X se digirió
con EcoRI/HindIII y el esqueleto del vector se purificó sobre un gel
de agarosa. Se prepararon los ADN de los plásmidos
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
y
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa)
mediante métodos generales. Los plásmidos
pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
y
pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa)
se digirieron con EcoRI/HindIII y los fragmentos de 855 y 729 pares
de bases, que contenían el gen P30 de Toxo, se purificaron sobre un
gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 855 pares de bases se
digirió con BanI y el fragmento EcoRI/BanI de 637 pares de bases,
que contenía la porción 5' corregida del gen P30 de Toxo, se
purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 729
pares de bases se digirió con BanI y el fragmento BanI/HindIII de
92 pares de bases, que contenía la porción 3' del gen P30del4 de
Toxo, se purificó sobre un gel de agarosa. Los fragmentos de 637 y
92 pares de bases purificados se ligaron a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la secuencia
de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa) contenía el gen P30del4C de Toxo clonado
en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La
secuencia de ADN completa [SEQ ID NO:25] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
se muestra en la Fig. 19 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO:26] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del4C(52-294aa)
también se muestra en la Fig. 19, donde los restos aminoácido
392-634 del SEQ ID NO: 26 corresponden a los
aminoácidos 52-294 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 27] de
ToxoP30del4C(52-294aa) se muestra en la Fig.
20 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 28] de
la proteína ToxoP30del4C(52-294aa) también se
muestra en la Fig. 20, donde los restos aminoácido
1-243 del SEQ ID NO: 28 corresponden a los
aminoácidos 52-294 del antígeno P30 de
Toxoplasma gondii.
Etapa
G
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa)
clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en el
plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X (Fig. 21). Se digirió el plásmido
pMAL-c2X con EcoRI/HindIII y el esqueleto del
vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se sintetizaron un
cebador efector, que empezaba en el nucleótido 557 del gen P30 que
contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un
sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 1192 del gen P30 (Burg
et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591) como
se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de
la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación
de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y
HindIII, y el fragmento de ADN de 636 pares de bases que contenía
P30del4del8 de Toxo se purificó sobre un gel de agarosa. El
fragmento de 636 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa)
contenía el gen ToxoP30del4del8 clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID
NO: 30] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa)
se muestra en la Fig. 22 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 31] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del4del8(83-294aa)
también se muestra en la Fig. 22, donde los restos aminoácido
392-603 del SEQ ID NO: 31 corresponden a los
aminoácidos 83-294 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 32] de
ToxoP30del4del8(83-294aa) se muestra en la
Fig. 23 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO:
33] de la proteína ToxoP30del4del8(83-294aa)
también se muestra en la Fig. 23, donde los restos aminoácido
1-212 del SEQ ID NO: 33 corresponden a los
aminoácidos 83-294 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii.
Etapa
H
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa)
clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en el
plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X (Fig. 24). El plásmido
pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y el esqueleto
del vector se purificó sobre un gel de agarosa. Se sintetizaron un
cebador efector, que empezaba en el nucleótido 464 del gen P30 que
contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un
sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 1162 del gen P30 (Burg
et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591) como
se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de
la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación
de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y
HindIII, y el fragmento de ADN de 699 pares de bases que contenía
P30del10 de Toxo se purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento
de 699 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa)
contenía el gen P30del10 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID
NO:35] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa)
se muestra en la Fig. 25 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 36] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del10(52-284aa)
también se muestra en la Fig. 25, donde los restos aminoácido
392-624 del SEQ ID NO: 36 corresponden a los
aminoácidos 52-284 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii, con la excepción de que el resto aminoácido 546 del SEQ
ID NO: 36 es glicina en lugar de ácido glutámico. La secuencia de
ADN [SEQ ID NO: 37] de ToxoP30del10(52-284aa)
se muestra en la Fig. 26 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 38] de la proteína
ToxoP30del10(52-284aa) también se muestra en
la Fig. 26, donde los restos aminoácido 1-233 del
SEQ ID NO: 38 corresponden a los aminoácidos 52-284
del antígeno P30 de Toxoplasma gondii, con la excepción de
que el resto aminoácido 155 del SEQ ID NO: 38 es glicina en lugar
de ácido glutámico.
Etapa
I
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa)
clonando un fragmento de ADN que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante amplificación por PCR de ADN de P30 de Toxo contenido en el
plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X (Fig. 27). El plásmido
pMAL-c2X fue digerido con EcoRI/HindIII y el
esqueleto del vector purificó sobre un gel de agarosa. Se
sintetizaron un cebador efector, que empezaba en el nucleótido 464
del gen P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido
que contenía un sitio HindIII, que empezaba en el nucleótido 952
del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol.
141:3584-3591) como se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido
pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de
la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación
de PCR Quiaquick la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y
HindIII, y el fragmento de ADN de 489 pares de bases que contenía
P30del11 de Toxo se purificó sobre un gel de agarosa. El fragmento
de 489 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la
secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa)
contenía el gen P30del11 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII
de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID
NO: 40] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa)
se muestra en la Fig. 28 y la correspondiente secuencia de
aminoácidos [SEQ ID NO: 41] de la proteína de fusión
MBP-ToxoP30del11(52-214aa)
también se muestra en la Fig. 28, donde los restos aminoácido
392-554 del SEQ ID NO: 41 corresponden a los
aminoácidos 52-214 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 42] de
ToxoP30del11(52-214aa) se muestra en la Fig.
29 y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 43] de
la proteína ToxoP30del11(52-214aa) también se
muestra en la Fig. 29, donde los restos aminoácido
1-163 del SEQ ID NO: 43 corresponden a los
aminoácidos 52-214 del antígeno P30 de Toxoplasma
gondii.
(Comparativo)
Etapa
A
Se prepararon los clones bacterianos
pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa),
pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa),
pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-
214aa) que expresaban las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), rpMBP-c2X-ToxoP30
del1C(52-324aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-Toxo
P30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-
c2X-ToxoP30del11(52-214aa) del Ejemplo 2 en medio "SUPERBROTH II" que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta la fase log, y se indujo la síntesis de las proteínas de fusión MBP-ToxoP30 mediante la adición de IPTG como se ha descrito previamente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31:629-635). A las 4 horas de la inducción, se cosecharon las células, y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de la proteína.
pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-
214aa) que expresaban las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), rpMBP-c2X-ToxoP30
del1C(52-324aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-Toxo
P30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-
c2X-ToxoP30del11(52-214aa) del Ejemplo 2 en medio "SUPERBROTH II" que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta la fase log, y se indujo la síntesis de las proteínas de fusión MBP-ToxoP30 mediante la adición de IPTG como se ha descrito previamente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31:629-635). A las 4 horas de la inducción, se cosecharon las células, y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de la proteína.
Etapa
B
Se purificaron las proteínas de fusión solubles
rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-Toxo
P30del11(52-214aa) después de la lisis de la pasta celular siguiendo el manual es instrucciones de New England Biolabs pMAL Protein Fusion and Purification. Después de la lisis y la centrifugación, se cargaron los sobrenadantes brutos que contenían las proteínas de fusión sobre una columna de afinidad de amilosa. Después de lavar la columna, se hicieron eluir las proteínas de fusión de la columna con maltosa, se reunieron las fracciones apropiadas de la columna y se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mu, y después se almacenaron a 2-8ºC hasta el recubrimiento de las micropartículas.
(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-Toxo
P30del11(52-214aa) después de la lisis de la pasta celular siguiendo el manual es instrucciones de New England Biolabs pMAL Protein Fusion and Purification. Después de la lisis y la centrifugación, se cargaron los sobrenadantes brutos que contenían las proteínas de fusión sobre una columna de afinidad de amilosa. Después de lavar la columna, se hicieron eluir las proteínas de fusión de la columna con maltosa, se reunieron las fracciones apropiadas de la columna y se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mu, y después se almacenaron a 2-8ºC hasta el recubrimiento de las micropartículas.
\newpage
(Comparativo)
Etapa
A
Antes de recubrir las micropartículas, se
diluyeron los antígenos
rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa),
rpMBP-
c2X- ToxoP30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa) a una concentración de 1 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Después de la etapa de tratamiento térmico, se recubrieron por separado las micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato con los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 (1-5% de sólidos) en un recipiente que contenía tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a la temperatura ambiente, en un aparato giratorio de volteo. Las micropartículas recubiertas se recogieron después mediante centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos, y los sobrenadantes se descartaron. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón para el almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5, EDTA, cloruro de sodio, Tween 20, suero de ternera fetal (sin anticuerpos de Toxo), azida de sodio, y sacarosa utilizando una jeringa y una aguja. Las micropartículas se diluyeron después con tampón para el almacenamiento de micropartículas a una concentración final de 0,1-0,3% de sólidos y se cargaron en botellas de plástico.
c2X- ToxoP30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa) a una concentración de 1 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Después de la etapa de tratamiento térmico, se recubrieron por separado las micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato con los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 (1-5% de sólidos) en un recipiente que contenía tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a la temperatura ambiente, en un aparato giratorio de volteo. Las micropartículas recubiertas se recogieron después mediante centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos, y los sobrenadantes se descartaron. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón para el almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5, EDTA, cloruro de sodio, Tween 20, suero de ternera fetal (sin anticuerpos de Toxo), azida de sodio, y sacarosa utilizando una jeringa y una aguja. Las micropartículas se diluyeron después con tampón para el almacenamiento de micropartículas a una concentración final de 0,1-0,3% de sólidos y se cargaron en botellas de plástico.
Etapa
B
El paquete de reactivos para el análisis AxSYM
Toxo IgG v2 automatizado se diseña para la detección de IgG
anti-Toxo humana y consiste en los siguientes
componentes. La botella número uno contiene micropartículas
recubiertas con antígenos de Toxo recombinantes purificados (Ejemplo
4A) En un tampón de almacenamiento de micropartículas. Con el fin
de evitar que los anticuerpos anti-MBP o
anti-CKS humanos ocasionen una reacción falsa
positiva en el análisis, se puede añadir MBP o CKS purificados al
tampón de almacenamiento de micropartículas. La botella número dos
contiene el producto conjugado preferido, un producto conjugado con
fosfatasa alcalina anti-IgG humana de cabra. Este
producto conjugado se titula para determinar una concentración de
trabajo de 0,1-5 \mug/ml. El producto conjugado
se diluye en un diluyente del producto conjugado que contiene tampón
Tris, pH 7,4, sodio, calcio, magnesio, y cloruro de cinc, Nipasept,
A56620, leche en polvo desnatada, Brij-35, suero de
ratón, y manitol. La botella número tres contiene el diluyente de
análisis preferido para minimizar la unión no específica a las
micropartículas y la matriz de análisis. Este diluyente de análisis
en un tampón Tris, pH 7,5 que contiene cloruro de sodio, sal de
sódica de EDTA, leche en polvo desnatada, Nipasept, A56620, y Tween
20. La botella número cuatro contiene un diluyente genérico de
tampón fosfato.
Los seis Calibradores del Análisis marcados como
A-F derivan de reservas de plasma positivas para IgG
de Toxo o anticuerpos IgG anti-Toxo humanos
policlonales y son requeridos para calibrar el análisis AxSYM® Toxo
IgG v2. Estos calibradores están ajustados con calibradores
previamente ajustados al Patrón Internacional de la OMS
TOX-S. El intervalo de concentración de estos
calibradores es de 0-300 UI/ml. Se requieren
controles Positivos y Negativos para evaluar la calibración del
análisis y establecer la validez del análisis. El Control Positivo
se prepara a partir de reservas de plasma positivo para IgG de Toxo
o anticuerpos monoclonales anti-IgG de Toxo
humanos. El Control Negativo se prepara a partir de reservas de
plasma negativas para IgG de Toxo. El panel 6 es una reserva de
unidades de plasma positivo para IgG e IgM de Toxo de donantes de
sangre con una toxoplasmosis aguda.
El disquete de análisis para el análisis AxSYM®
Toxo IgG v2 contiene el soporte lógico para el protocolo de
análisis necesario para realizar el inmunoanálisis automatizado en
el aparato "AxSYM®" de Abbott (Abbott Laboratories, Abbott
Park, IL). Además del reactivo AxSYM® Toxo IgG v2 Reagent Pack, los
Calibradores del análisis, y los Controles descritos antes, se
requieren los siguiente componentes de análisis en el aparato para
realizar el análisis: Copas para la Muestra, Diluyente Generico
AxSYM®, tampón MEIA, Recipientes de Reacción, MUP, y Células
Matriz. La secuencia de eventos del análisis automatizado es la
siguiente: La sonda de pipeteado del kit libera la muestra del
paciente y el diluyente genérico al pocillo de la muestra del
recipiente de reacción; la sonda de pipeteado equipa después los
volúmenes apropiados de diluyente de análisis, diluyente genérico,
y producto conjugado requeridos para el análisis a partir del
paquete de reactivos en los pocillos del recipiente de reacción
designados; esta sonda libera después las micropartículas
recubiertas con el antígeno de Toxo recombinante del paquete de
reactivos y una alícuota de la muestra diluida en el pocillo del
recipiente de reacción designado; el recipiente de reacción se
transfiere después al carrusel del procedimiento; los anticuerpos
específicos de Toxo se unen a las micropartículas recubiertas con el
antígeno recombinante de Toxo formando un complejo
antígeno-anticuerpo; se añade el diluyente de
análisis a la mezcla de reacción y las células de la matriz y
después se transfiere una alícuota de la mezcla de reacción a la
matriz de fibra de vidrio del carrusel auxiliar; las
micropartículas se unen irreversiblemente a la matriz; la matriz se
lava con tampón MEIA y diluyente genérico para separar los
anticuerpos no unidos; se añade producto conjugado con fosfatasa
alcalina de anti-IgG humana de cabra a la matriz y
se une a la IgG específica de Toxo capturada por los antígenos
recombinantes de Toxo; después se lava la matriz con tampón MEIA
para separar cualquier producto conjugado de
enzima-anticuerpo no unido; se añade a la matriz el
sustrato de la enzima MUP; la enzima fosfatasa alcalina presente en
la matriz anclada a anti-IgG humana de cabra
cataliza la hidrólisis del radical fosforilo de MUP, produciendo un
producto altamente fluorescente que se mide mediante el sistema
óptico AxSYM MEIA; la intensidad de la señal (recuentos de
velocidad) es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgG
específicos de Toxo presentes en la muestra.
Etapa
C
El paquete de reactivos para el análisis AxSYM
Toxo IgM v2 automatizado se diseña para la detección de IgM
anti-Toxo humana y consiste en los siguientes
componentes. La botella número uno contiene micropartículas
recubiertas con antígenos de Toxo recombinantes purificados (Ejemplo
4A) en un tampón de almacenamiento de micropartículas. Con el fin
de evitar los anticuerpos anti-MBP o
anti-CKS humanos que ocasionan una reacción falsa
positiva en el análisis, se pueden añadir MBP o CKS purificados al
tampón de almacenamiento de micropartículas. La botella número dos
contiene el producto conjugado preferido, un producto conjugado con
fosfatasa alcalina anti-IgM humana de cabra. Este
producto conjugado es titulado para determinar una concentración de
trabajo de 0,1-5 \mug/ml. El producto conjugado
se diluye en un diluyente de producto conjugado que contiene tampón
Tris, pH 7,4, sodio, calcio, magnesio, y cloruro de cinc, Nipasept,
A56620, leche en polvo desnatada, Brij-35, suero de
ratón y manitol. La botella número tres contiene el diluyente de
análisis preferido para minimizar la unión no específica a las
micropartículas y a la matriz de análisis. Este diluyente de
análisis consiste en tampón Tris, pH 7,5 que contiene cloruro de
sodio, sal sódica de EDTA, leche en polvo desnatada, Nipasept,
A56620, y Tween 20. La botella número cuatro contiene diluyente
genérico de tampón fosfato o Tampón de Neutralización RF.
El Calibrador del Índice deriva de reservas de
plasma positivo para IgM de Toxo o anticuerpos monoclonales IgM
anti-Toxo humanos y se requiere para calibrar el
análisis AxSYM® Toxo IgM v2. Se requieren controles Positivos y
Negativos para evaluar la calibración del análisis y establecer la
validez del análisis. El Control Positivo se prepara a partir de
reservas de plasma positivo para IgM de Toxo o anticuerpos
monoclonales anti-IgM de Toxo humanos. El Control
Negativo se prepara a partir de reservas de plasma negativo para IgM
de Toxo.
El disquete del análisis para el análisis AxSYM®
Toxo IgM v2 contiene el soporte lógico para el protocolo de
análisis necesario para realizar el inmunoanálisis automatizado en
el aparato "AxSYM" Abbott (Abbott Laboratories, Abbott Park,
IL). Además del paquete de Reactivos AxSYM® Toxo IgM v2, el
Calibrador del Índice, y los Controles descritos antes, se
requieren los siguientes componentes de análisis localizados en el
aparato para realizar el análisis: Copas para la Muestra, Diluyente
Genérico de AxSYM®, tampón, Recipientes de Reacción, MUP, y Células
Matriz. La secuencia de eventos para el análisis automatizado es la
siguiente: La sonda de pipeteado del kit libera la muestra del
paciente y el diluyente genérico en el pocillo para la muestra del
recipiente de reacción; la sonda de pipeteado equipa después los
volúmenes de diluyente de análisis apropiados, diluyente genérico o
Tampón de Neutralización RF, y producto conjugado requeridos para el
análisis a partir del paquete de reactivos en los pocillos del
recipiente de reacción designados; después esta sonda libera las
micropartículas recubiertas con antígeno de Toxo recombinante del
paquete de reactivos y una alícuota de la muestra diluida en el
pocillo del recipiente de reacción designado; el recipiente de
reacción es transferido después al carrusel del procedimiento; los
anticuerpos específicos de Toxo se unen a las micropartículas
recubiertas con antígeno recombinante de Toxo formando un complejo
antígeno-anticuerpo; se añade diluente de análisis a
la mezcla de reacción y a la célula matriz y después se transfiere
una alícuota de la mezcla de reacción a la matriz de fibra de
vidrio del carrusel auxiliar; las micropartículas se unen
irreversiblemente a la matriz; la matriz se lava con tampón MEIA y
diluyente genérico o Tampón de Neutralización RF para separar los
anticuerpos no unidos; se añade el producto conjugado con fosfatasa
alcalina anti-IgM humana de cabra y se une a la IgM
específica de Toxo capturada por los antígenos recombinantes de
Toxo; la matriz se lava después con tampón MEIA para separar
cualquier producto conjugado enzima-anticuerpo no
unido; el sustrato de la enzima MUP se añade a la matriz; la enzima
fosfatasa alcalina presente en la matriz anclada a la
anti-IgM humana de cabra cataliza la hidrólisis del
radical fosforilo de MUP, produciendo un producto altamente
fluorescente que se mide por medio del sistema óptico AxSYM® MEIA;
la intensidad de la señal (recuentos de velocidad) es proporcional a
la cantidad de anticuerpos IgM específicos de Toxo presentes en la
muestra.
Etapa
D
Se ensamblaron los paquetes de reactivos de IgG
e IgM AxSYM® Toxo como se describe en los Ejemplos 4B y 4C
utilizando las micropartículas recubiertas con los antígenos de Toxo
descritos en el Ejemplo 4A. Los calibradores A y F de IgG de Toxo
(Acal y Fcal) y el Panel 6 (PNL6) se sometieron a ensayo con los
paquetes de reactivos AxSYM Toxo IgG v2 y el Control Negativo (NC)
de IgM de Toxo (NC), el Calibrador del Índice (IC), y el Panel 6
(PNL6) se sometieron a ensayo con los paquetes de reactivos AxSYM®
Toxo IgM v2. Los resultados se muestran más abajo en las Tablas 1 y
2.
Como se puede observar en ambas Tablas 1 y 2, se
obtuvo un resultado sorprendente. En particular, la deleción de
aminoácidos del extremo C del antígeno P30 de Toxo dio como
resultado una inmunorreactividad de IgG e IgM especificas de Toxo
mejorada, medida mediante recuentos de velocidad para el Panel 6
mejorados y razones del recuentos de velocidad para Fcal/Acal,
Panel 6/Acal, y Panel 6/NC mejorados, hasta una deleción de 42
aminoácidos (comparar la proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
con la proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa)
en las Tablas 1 y 2). La proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
diseñada genéticamente produjo recuentos de velocidad máximos para
el Panel 6 y razones de recuentos de velocidad máximas en ambos
análisis. Estos resultados sugieren que pequeñas deleciones del
extremo C de P30 de Toxo revelan o hacen asequibles nuevos epítopos
para la unión de IgG e IgM específicas de Toxo que están ocluidos
en la proteína completa. La deleción de aminoácidos
C-terminales adicionales (comparar la proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa)
y
rpMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa)
con la proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
en las Tablas 1 y 2) dio como resultado una reducción de la
inmunorreactividad, sugiriendo la pérdida de epítopos de IgG e IgM
con deleciones C-terminales más grandes. En
contraste, la introducción de una pequeña deleción de 30
aminoácidos en el extremo N de la proteína óptima
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C, que
generaba la proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa),
abolió completamente la inmunorreactividad de IgG e IgM específica
de Toxo. Estos resultados sugieren que algunos de los restos
cisteína presentes en la porción C-terminal de la
proteína P30 de Toxo son indispensables para una inmunorreactividad
óptima de IgG e IgM de Toxo. Por ejemplo, la proteína óptima
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
contiene 11 restos cisteína y la proteína
rpMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa),
que demostró una reactividad buena pero no óptima, contiene 7 restos
cisteína.
Basándose en los resultados obtenidos del
análisis de deleción del gen P30 de Toxo del Ejemplo 4D, se
construyó una nueva serie de proteínas de fusión
MBP-ToxoP30. Puesto que existen 12 restos cisteína
presentes en la proteína P30 de Toxo madura (Burg et al.
(1988) J. Immunol. 141:3584-3591;
Velge-Roussel et al. (1994) Molec. Biochem.
Parasitol. 66:31-38), existen matemáticamente
2^{12} o 4.096 proteínas p30 de Toxo diferentes que pueden ser
construidas que contienen varias combinaciones de cambio de uno o
más de los doce restos cisteína a alanina. Sería ciertamente
imposible probar las 4.096 combinaciones de cisteína a alanina
diferentes para optimizar adicionalmente la inmunorreactividad del
antígeno P30 de Toxo. Por tanto, los resultados del Ejemplo 4D se
utilizaron para estrechar el número de genes P30 de Toxo mutantes
diferentes a construir que tienen el potencial de mejorar la
inmunorreactividad de IgG e IgM de Toxo en un inmunoanálisis
automatizado. Los oligonucleótidos mutantes se diseñaron para la
síntesis in vitro de tres genes P30 de Toxo que contienen
mutaciones que cambian los restos cisteína a alanina, y también
introducen la misma deleción 3' en el gen P30 de Toxo presente en
ToxoP30del3C(52-300aa) (SEQ ID NO: 22 y Fig.
16).
La síntesis de cada gen P30 de Toxo requirió la
síntesis y ensamblaje de 16 oligonucleótidos solapantes. Estos
oligonucleótidos oscilaban de 67-72 bases de
longitud con nucleótidos limítrofes que se solapaban en
20-23 restos. Los genes P30 se ensamblaron por
medio de PCR recurrente seguida de amplificación por PCR de los
genes ensamblados (Withers-Martinez et al.
(1999) Protein Engr. 12:1113-1120; Prytulla et
al. (1996) FEBS Lett. 399:283-289; Kataoka
et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm.
250:409-413) utilizando un cebador efector P30 que
contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un
sitio HindIII. Después de la amplificación por PCR, el gen P30 fue
digerido con EcoRI y HindIII, purificado sobre un gel de agarosa, y
ligado al esqueleto del vector pMAL-c2X que había
sido digerido por medio de EcoRI y HindIII como se muestra
esquemáticamente en la Fig. 30.
Etapa
A
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 clonando un
fragmento de ADN sintético que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante la síntesis y ensamblaje de 16 oligonucleótidos, en los
sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Figura 30). Este
plásmido difiere del plásmido
pMBP-c2X-Tox6P30del3C(52-300aa)
del Ejemplo 2E en que la secuencia de ADN de P30 de Toxo del
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 ha
sido cambiada de manera que cinco de los doce restos cisteína de
P30 de Toxo (cisteínas núms. 8-12) han sido
cambiados por alanina. El plásmido pMAL-c2X se
digirió con EcoRI/HindIII y el esqueleto del vector se purificó
sobre un gel de agarosa. Se sintetizaron los siguientes
oligonucleótidos para la construcción del gen ToxoP30MIX1:
En la primera etapa de la síntesis del gen, se
mezclaron 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron
utilizando una PCR recurrente como sigue: 1 ciclo a 95ºC durante 5
minutos seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante
2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos
seguido de un ciclo de empapado a 4ºC. En la segunda etapa de la
síntesis del gen, se sintetizaron un cebador efector, que empezaba
en el nucleótido 464 del gen P30 que contenía un sitio EcoRI, y un
cebador antisentido que contenía un sitio HindIII, que empezaba en
el nucleótido 1210 del gen P30 (Burg et al. (1988) J.
Immunol. 141:3584-3591) como se muestra más
abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía los oligonucleótidos
ensamblados de la primera etapa de síntesis del gen. Después de la
amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción
con un kit de purificación de PCR Quiaquick la mezcla de reacción se
digirió con EcoRI y HindIII, y el fragmento de ADN de 747 pares de
bases purificado que contenía P30MIX1 de Toxo se purificó sobre un
gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se
ligó a pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a
16ºC. La mezcla de ligación se transformó en células
XL-1 Blue competentes. El ADN de la miniprep se
preparó a partir de los transformantes y se escrutó en busca de la
presencia de la secuencia sintética de ADN de P30 mediante análisis
con enzimas de restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 contenía el gen
P30MIX1 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID
NO:61] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 se muestra en
la Fig. 31, y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID
NO:62] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX1
también se muestra en la Fig. 31, donde los restos aminoácido
cisteína localizados en 555, 570, 578, 625, 635 del SEQ ID NO: 21
son ahora restos aminoácido alanina localizados en 555, 570, 578,
625, 635 del SEQ ID NO: 62. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 se depositó en
la ATCC 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, bajo los términos del Tratado de
Budapest el 25 de Sept. de 2002, y se acordó el Núm. de Acceso ATCC
4721. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 63] de ToxoP30MIX1 se muestra
en la Fig. 32, y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID
NO: 64] de la proteína ToxoP30MIX1 también se muestra en la Fig.
32, donde los restos aminoácido cisteína localizados en 164, 179,
187, 234, 244 del SEQ ID NO: 23 son ahora aminoácidos alanina
localizados en 164, 179, 187, 234, 244 del SEQ ID NO: 64.
Etapa
B
(Comparativo)
El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 fue construido
clonando un fragmento de ADN sintético que contenía P30 de Toxo,
obtenido mediante la síntesis y ensamblaje de 16 oligonucleótidos,
en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Figura
30). Este plásmido difiere del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa)
del Ejemplo 2E en que la secuencia de ADN de P30 de Toxo del
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 ha
sido cambiada de manera que seis de los doce restos cisteína de P30
de Toxo (cisteínas núms. 7-12) han sido cambiados
por alanina. El plásmido pMAL-c2X se digirió con
EcoRI/HindIII, y el esqueleto del vector se purificó sobre un gel de
agarosa. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos para la
construcción del gen P30MIX3 de Toxo:
En la primera etapa de síntesis del gen, se
mezclaron 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron
utilizando una PCR recurrente como sigue: 1 ciclo a 95ºC durante 5
minutos seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante
2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos
seguido de un ciclo de empapado a 4ºC. En la segunda etapa de
síntesis del gen, se sintetizaron un cebador efector, que empezaba
en el nucleótido 464 del gen P30 que contenía un sitio EcoRI, y un
cebador antisentido que contenía un sitio HindIII, que empezaba en
el nucleótido 1210 del gen P30 (Burg et al. (1988) J.
Immunol. 141:3584-3591) como se muestra más
abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía los oligonucleótidos
ensamblados de la primera etapa de síntesis del gen. Después de la
amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción
con un kit de purificación de PCR Quiaquick la mezcla de reacción se
digirió con EcoRI y HindIII, y el fragmento de ADN de 747 pares de
bases que contenía P30MIX3 de Toxo se purificó sobre un gel de
agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se ligó a
pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a 16ºC. La
mezcla de ligación se transformó en células XL-1
Blue competentes. El ADN de la miniprep se preparó a partir de los
transformantes y se escrutó en busca de la presencia de la secuencia
de ADN sintética de P30 mediante análisis con enzimas de
restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 contenía el gen
P30MIX3 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID NO:
66] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 se muestra en
la Fig. 33, y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID
NO: 67] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX3
también se muestra en la Fig. 33, donde los restos aminoácido
cisteína localizados en 530, 555, 570, 578, 625, 635 del SEQ ID NO:
21 son ahora aminoácidos alanina localizados en 530, 555, 570, 578,
625, 635 del SEQ ID NO: 67. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 68] de
ToxoP30MIX3 se muestra en la Fig. 34, y la correspondiente
secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 69] de la proteína ToxoP30MIX3
también se muestra en la Fig. 34, donde los restos aminoácido
cisteína localizados en 139, 164, 179, 187, 234, 244 del SEQ ID NO:
23 son ahora aminoácidos alanina localizados en 139, 164, 179, 187,
234, 244 del SEQ ID NO: 69.
Etapa
C
(Comparativo)
Se construyó el plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 clonando un
fragmento de ADN sintético que contenía P30 de Toxo, obtenido
mediante síntesis y ensamblaje de 16 oligonucleótidos, en los sitios
EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Figura 30). Este
plásmido difiere del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa)
del Ejemplo 2E en que la secuencia de ADN de P30 de Toxo del
plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 ha
sido cambiada de manera que seis de los doce restos cisteína de P30
de Toxo (cisteínas núms. 2 y 8-12) han sido
cambiados a alanina. Se digirió el plásmido pMAL-c2X
con EcoRI/HindIII y el esqueleto del vector se purificó sobre un
gel de agarosa. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos
para la construcción del gen P30MIX5 de Toxo:
En la primera etapa de síntesis del gen, se
mezclaron 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron
utilizando una PCR recurrente como sigue: 1 ciclo a 95ºC durante 5
minutos seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante
2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos
seguido de un ciclo de empapado a 4ºC. En la segunda etapa de
síntesis del gen, se sintetizaron un cebador efector, que empezaba
en el nucleótido 464 del gen P30 que contenía un sitio EcoRI, y un
cebador antisentido que contenía un sitio HindIII, que
empeza-
ba en el nucleótido 1210 del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591) como se muestra más abajo:
ba en el nucleótido 1210 del gen P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141:3584-3591) como se muestra más abajo:
Los cebadores efector y antisentido se añadieron
a una mezcla de reacción de PCR que contenía los oligonucleótidos
ensamblados de la primera etapa de la síntesis del gen. Después de
la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de
reacción con un kit de purificación de PCR Quiaquick la mezcla de
reacción se digirió con EcoRI y HindIII, y el fragmento de ADN de
747 pares de bases que contenía P30MIX5 de Toxo se purificó sobre
un gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se
ligó a pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante la noche a
16ºC. La mezcla de ligación se transformó en células
XL-1 Blue competentes. El ADN de la miniprep se
preparó a partir de los transformantes y se escrutó en busca de la
presencia de la secuencia de ADN sintética de P30 mediante análisis
con enzimas de restricción. El plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 que contenía el
gen P30MIX5 de Toxo clonado en los sitios EcoRI/HindIII de
pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEQ ID NO:
71] del plásmido
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 se muestra en
la Fig. 35, y la correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID
NO: 72] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX5
también se muestra en la Fig. 35, donde los restos aminoácido
cisteína localizados en 422, 555, 570, 578, 625, 635 del SEQ ID NO:
21 son ahora aminoácidos alanina localizados en 422, 555, 570, 578,
625, 635 del SEQ ID NO: 72. La secuencia de ADN [SEQ ID NO: 73] de
ToxoP30MIX5 se muestra en la Fig. 36, y la correspondiente
secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 74] de la proteína ToxoP30MIX5
también se muestra en la Fig. 36, donde los restos aminoácido
cisteína localizados en 31, 164, 179, 187, 234, 244 del SEQ ID NO:
23 son ahora aminoácidos alanina localizados en 31, 164, 179, 187,
234, 244 del SEQ ID NO: 74.
Etapa
A
Se hicieron crecer los clones bacterianos
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1,
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativo),
y pMBP-c2X-ToxoP30MIX 5
(comparativo) que expresaban las proteínas de fusión con MBP
rpMBP-c2X-ToxoP30
MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativo), y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativo) del Ejemplo 5 en medio "SUPERBROTH II" que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta la fase log, y se indujo la síntesis de proteínas de fusión MBP-ToxoP30MIX mediante la adición de IPTG como se ha descrito previamente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31:629-635). A las 4 horas de la inducción, las células se cosecharon, y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de proteínas.
MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativo), y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativo) del Ejemplo 5 en medio "SUPERBROTH II" que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta la fase log, y se indujo la síntesis de proteínas de fusión MBP-ToxoP30MIX mediante la adición de IPTG como se ha descrito previamente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31:629-635). A las 4 horas de la inducción, las células se cosecharon, y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de proteínas.
Etapa
B
Se purificaron las proteínas de fusión solubles
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1,
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3, y
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 después de la
lisis de la pasta celular siguiendo el manual de instrucciones New
England Biolabs pMAL Protein Fusion and Purification. Después de la
lisis y centrifugación, se cargaron los sobrenadantes brutos que
contenían las proteínas de fusión en una columna de afinidad de
amilosa. Después de lavar la columna, se hicieron eluir las
proteínas de fusión de la columna con maltosa, se reunieron las
fracciones apropiadas de la columna y se filtraron a través de un
filtro de 0,2 \mu, y después se almacenaron a
2-8ºC hasta el recubrimiento de las
micropartículas.
Etapa
A
Antes de recubrir las micropartículas, se
diluyeron los antígenos
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1,
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3
(comparativo), y
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativo)
a una concentración de 1 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24
horas. Después de la etapa de tratamiento con calor, se aplicaron
como recubrimiento los antígenos
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX por separado
sobre las micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato
(1-5% de sólidos) en un recipiente que contenía
tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a la temperatura
ambiente, en un aparato giratorio de volteo. Las micropartículas
recubiertas se recogieron después por centrifugación a 14.000 x g
durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Las
micropartículas se resuspendieron en un tampón para el
almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5,
EDTA, cloruro de sodio, Tween 20, suero de ternera fetal (libre de
anticuerpos de Toxo), azida de sodio, y sacarosa utilizando una
jeringa y una aguja. Después se diluyeron las micropartículas con
tampón de almacenamiento de micropartículas a una concentración
final de 0,1-0,3% de sólidos y se cargaron en
botellas de plástico.
\newpage
Etapa
B
Se ensamblaron los paquetes de reactivos AxSYM®
Toxo IgG e IgM como se describe en los Ejemplos 4B y 4C utilizando
las micropartículas recubiertas con antígenos de Toxo descritas en
el Ejemplo 7A. Se sometieron a ensayo los calibradores A y F de IgG
de Toxo (Acal y Fcal) y el Panel 6 (PNL6) con los paquetes de
reactivos AxSYM Toxo IgG v2 y Toxo IgM y se sometieron a ensayo el
Control Negativo (NC), el Calibrator de Indice (IC), y el Panel 6
(PNL6) con los paquetes de reactivos AxSYM Toxo IgM v2. Los
resultados se muestran más abajo en las Tablas
3 y 4.
3 y 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede observar en las Tablas 3 y 4, el
antígeno rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1
diseñado genéticamente, que contenía cinco restos cisteína
C-terminales sustituidos por alanina, produjo la
mejor inmunorreactividad de IgG e IgM de Toxo como se mide mediante
los recuentos de velocidad más altos para el Panel 6 y las razones
de recuento de velocidad más altas para Fcal/Acal, Panel 6/Acal, y
Panel 6/NC. Además, el antígeno
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 produjo los
recuentos de velocidad más elevados para el Panel 6 y la razón de
recuento de velocidad Panel 6/NC más elevada en el análisis Toxo
IgM v2 para cualquier antígeno
rpMBP-c2X-ToxoP30 sometido a ensayo
(véanse las Tablas 1 y 2). El antígeno
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5, que contenía
cinco restos cisteína C-terminales sustituidos por
restos alanina más la sustitución de la cisteína núm. 2 por alanina,
no fúe inmunorreactivo en ningún análisis. Este resultado coincidió
con los resultados obtenidos con el antígeno
rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa)
(véanse las Tablas 1 y 2), en los que la deleción de los dos
primeros restos cisteína de P30 de Toxo dio como resultado una
pérdida completa de inmunorreactividad. De este modo, se obtuvo el
sorprendente resultado de que la sustitución de diversos restos
cisteína en la mitad C-terminal de P30 de Toxo por
alanina produce una inmunorreactividad del antígeno de Toxo con IgG
e IgM superior mientras la sustitución de una única cisteína por
alanina en la mitad N-terminal de P30 de Toxo anula
completamente la inmunorreatividad.
El antígeno rpToxoP35S descrito en la Patente de
los Estados Unidos Núm. 6.329.157 B1 fue expresado en E.
coli, y la pasta celular fue cosechada como se describe en el
Ejemplo 6A. Este antígeno fue purificado después de la pasta
celular y utilizado como recubrimiento sobre las micropartículas
como se describe más abajo.
Etapa
A
Se expresó el antígeno rpToxoP35S en E.
coli en forma de una proteína de fusión insoluble. Después de la
lisis de la pasta celular, se lavaron los cuerpos de inclusión que
contenían el antígeno rpToxoP35S con agua, tampón fosfato, Triton
X-100, y urea. Después se solubilizó el antígeno
rpToxoP35S en un tampón SDS/DTT y se aplicó a una columna de
Sephacryl S-300. Se reunieron las fracciones de la
columna apropiadas, se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml y
se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mu, y después se
almacenaron a -80ºC hasta el recubrimiento.
Etapa
B
Se descongeló el antígeno rpToxoP35S y se llevó
a solución mediante calentamiento suave seguido de centrifugación
para separar la materia particulada. Este antígeno se sometió a
diálisis después frente a tres cambios de tampón MES, pH 6,2 a la
temperatura ambiente durante la noche y después se aplicó como
recubrimiento sobre micropartículas de poliestireno derivatizadas
con sulfato (1-5% de sólidos) en un recipiente que
contenía tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a la
temperatura ambiente, en un aparato giratorio de volteo. Las
micropartículas recubiertas se recogieron después mediante
centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos y se descartó el
sobrenadante. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón
para almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH
7,5, EDTA, cloruro de sodio, Tween 20, suero de ternera fetal (libre
de anticuerpos de Toxo), azida de sodio, y sacarosa utilizando una
jeringa y una aguja. Las micropartículas se diluyeron después con
tampón para almacenamiento de micropartículas a una concentración
final de 0,1-0,3% de sólidos y se cargaron en
botellas de plástico.
Después de lograr una mejora significativa en la
inmunorreactividad de IgG e IgM para Toxo del antígeno P30 por
medio de la ingeniería genética (Ejemplos 4 y 7), se realizó una
re-evaluación preliminar de las micropartículas
recubiertas con los antígenos de Toxo descritas en la Patente de los
Estados Unidos Núm. 6.329.157 B1 en los análisis AxSYM® Toxo IgG v2
e IgM v2. La evaluación de estas micropartículas recubiertas con
antígeno junto con las micropartículas recubiertas con los
antígenos P30 rpMBP-c2X-ToxoP30del3C
(52-300aa) (comparativo),
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa) (comparativo), y
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 sugirió que
una nueva combinación del antígeno
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C
(52-300aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa),
o rpMBP-c2X-ToxoP30MIXl con el
antígeno rpToxoP35S podría mejorar el funcionamiento del análisis
AxSYM® Toxo IgG v2. Además, los antígenos
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa),
o rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 solos
podrían mejorar el funcionamiento del análisis AxSYM® Toxo IgM v2.
Con el fin de demostrar la utilidad diagnóstica de los antígenos
P30 diseñados genéticamente y del nuevo cóctel de antígeno P30/P35
diseñado genéticamente, se sometieron a ensayo sueros humanos
negativos para anticuerpos de Toxo y sueros recogidos de pacientes
con una toxoplasmosis aguda o crónica en el análisis AxSYM® Toxo
IgG v2 e IgM v2 como se describe más abajo.
\newpage
Etapa
A
Se recubrieron micropartículas con los antígenos
de Toxo purificados
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa),
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa),
rpMHP-c2X-ToxoP30MIX1, y rpToxoP35S
como se ha descrito previamente en los Ejemplos 4A y 7A. Después las
micropartículas se diluyeron a una concentración final de 0,2% de
sólidos y se elaboraron las siguientes tres combinaciones de
micropartículas: micropartículas recubiertas con una combinación 2:1
v/v de
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa):rpToxoP35S
(marcadas como P30del3/P35); micropartículas recubiertas con una
combinación 2:1 v/v de
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa):rpToxoP35S
(marcadas como P30del4/P35); y micropartículas recubiertas con una
combinación 2:1 v/v de
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1:rpToxoP35S
(marcada como P30MIX1/P35). Estas tres combinaciones de
micropartícula se cargaron en botellas de plástico, se ensamblaron
en kits de reactivos AxSYM® Toxo IgG v2 individuales como se
describe en el Ejemplo 4B, y se marcaron como P30del3C/35,
P30del4C/P35, y P30MIX1/P35.
Etapa
B
Se recubrieron micropartículas con los antígenos
de Toxo purificados
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C
(52-300aa) (comparativo),
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa) (comparativo),
rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 y rpToxoP35S
como se ha descrito previamente en los Ejemplos 4A y 7A. Después se
diluyeron las micropartículas a una concentración final de 0,2% de
sólidos y se cargaron en botellas de plástico. Se ensamblaron los
kits AxSYM® Toxo IgM v2 con cada micropartícula recubierta como se
describe en el Ejemplo 4C y se marcaron como P30del3C, P30del4C, y
P30MIX1.
Etapa
C
En esta evaluación se sometieron a ensayo tres
grupos de sueros humanos de una población francesa: Grupo 1 (n=100)
sueros humanos negativos para anticuerpos IgG e IgM de Toxo mediante
los análisis Abbott IMx® Toxo IgG e IgM, respectivamente (Abbott
Laboratories, Abbott Park, IL); Grupo 2 (n=56) sueros humanos
positivos para anticuerpos IgG de Toxo y negativos para IgM de Toxo
mediante los análisis Abbott IMx® Toxo IgG e IgM, respectivamente;
Grupo 3 (n=52) sueros humanos positivos para anticuerpos IgG de Toxo
mediante un análisis de aglutinación directa de alta sensibilidad
(HSDA) (Desmonts, G. y Remington, J.S. (1980) J. Clin. Microbiol.
11:562-568) y positivos para anticuerpos IgM de Toxo
mediante un análisis de inmunocaptura de IgM (IC-M)
(Pouletty et al. (1985) J. Immunol. Methods
76:289-298). Los calibradores y los controles de
análisis para los análisis AxSYM® Toxo IgG v2 y Toxo IgM v2 se
hicieron funcionar como se ha descrito previamente en los Ejemplos
4B-D. Se incluyeron los análisis Abbott AxSYM® Toxo
IgG e IgM (Abbott Laboratories Abbott Park, IL), que utilizan el
antígeno de taquizoitos para la detección de IgG e IgM específicas
de Toxo, como análisis de referencia durante el ensayo de los
especímenes.
Etapa
D
Todos los especímenes de los Grupos
1-3 se sometieron a ensayo mediante los análisis
AxSYM® Toxo IgG v2 (P30del3C/35, P30del4C/P35, y P30MIX1/P35) y
mediante el análisis AxSYM® Toxo IgG. Se empleó el mismo corte de
análisis de 3 UI/ml para el análisis AxSYM Toxo IgG para los
análisis AxSYM® Toxo IgG v2, con una zona ambigüa de
2-3 UI/ml. El funcionamiento de los en los análisis
AxSYM® Toxo IgG v2 basados en el antígeno recombinante se comparó
con el análisis AxSYM® Toxo IgG basado en el antígeno del taquizoito
y se muestra en las Tablas 5-7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede observar a partir de las Tablas
5-7, el análisis AxSYM® Toxo IgG v2 que utilizaba la
combinación de un antígeno P30 diseñado genéticamente (P30del3C,
P30del4C, o P30MIX1) con el antígeno P35 es un análisis sensible y
específico para la detección de IgG específica de Toxoplasma como se
demuestra mediante la elevada sensibilidad diagnóstica relativa
global (100%), especificidad (100%), y concordancia (100%). Los tres
análisis AxSYM® Toxo IgG v2 tenían una excelente concordancia
cuantitativa con el análisis AxSYM® Toxo IgG, medida mediante los
coeficientes de correlación, todos los cuales fueron de 0,95 o
mayores. El cóctel de antígeno recombinante de Toxo formado por el
antígeno P30 de Toxo diseñado genéticamente (P30del3C, P30del4C, o
P30MIX1) y el antígeno P35, combinado con el análisis AxSYM® Toxo
IgG v2, es necesario y suficiente para remplazar el taquizoito para
la detección del anticuerpo IgG específico de Toxoplasma.
Además, existen numerosas ventajas del cóctel de
antígeno recombinante sobre el antígeno de taquizoito para su uso
en la detección de anticuerpos IgG. Primero, se purifican los
antígenos, y se puede determinar exactamente y normalizar la
cantidad de cada antígeno cargada en el inmunoanálisis, p. ej.,
concentración de proteína. Esto minimiza las diferencias entre
lotes observadas comúnmente en los kits fabricados con diferentes
lotes de antígeno de taquizoito. Por tanto, los diferentes lotes de
kits fabricados con lotes de cóctel de antígeno diferentes serán
muy coincidentes entre lote y lote. Segundo, se utilizan anticuerpos
monoclonales de ratón o humanos para los antígenos de Toxo
recombinantes individuales para controlar el recubrimiento de la
fase sólida con las proteínas. Esto asegura adicionalmente que cada
lote producido es constante. Tercero, la auténtica sensibilidad
clínica del análisis utilizando los antígenos purificados será
superior en virtud del hecho de la actividad específica superior de
los antígenos purificados. Finalmente, los kits fabricados con el
cóctel de antígeno son más estables durante el almacenamiento a lo
largo del tiempo, y el funcionamiento del análisis utilizando estos
antígenos permanece constante durante la vida en el estante del
análisis. Los kits fabricados con el antígeno de taquizoito no son
tan estables y su funcionamiento puede variar con el tiempo.
Adicionalmente, existen muchas ventajas en la
utilización de un cóctel sobre el uso de un único antígeno solo.
Por ejemplo, la respuesta inmunitaria a una infección varía por
individuos. Algunos individuos producen anticuerpos para P35 y no
para P30 al principio de la infección (toxoplasmosis aguda),
mientras algunos individuos producen anticuerpos para P30 y no para
P35 más tarde en la infección (toxoplasmosis crónica). De este modo,
el cóctel de antígeno de la presente invención detectará ambos
grupos de individuos.
Por otra parte, las respuestas inmunitarias
varían con el tiempo. Por ejemplo, un individuo puede producir
anticuerpos contra P35 primero y después, más tarde producir
anticuerpos solamente para P30. De este modo, el presente cóctel
detectará ambos tipos de individuos "positivos".
Además, los individuos pueden ser afectados por
diferentes serotipos, cepas o productos aislados de Toxo. De este
modo, la respuesta inmunitaria puede ser tal que se necesiten
múltiples antígenos para detectar la presencia de todos los
anticuerpos que están siendo producidos. De nuevo, el presente
cóctel permite semejante detección.
Asimismo, se sabe a partir de experimentos de
Transferencia Western con proteínas de taquizoitos que la respuesta
inmunitaria al Toxoplasma está dirigida contra diversos antígenos.
Una vez más, el presente cóctel de antígenos permitirá la detección
de todos los anticuerpos producidos en respuesta a estos
antígenos.
Etapa
E
Todos los especímenes de los Grupos
1-3 se sometieron a ensayo mediante los análisis
AxSYM® Toxo IgM v2 (P30del3C, P30del4C, y P30MIX1) y mediante el
análisis AxSYM® Toxo IgM. Se utilizó un operador receptor
característico (ROC) para ayudar a la determinación del corte
preliminar para los análisis AxSYM® Toxo IgM v2 (Valor del Índice
\geq 0,6) (Zweig, HM (1993) Clin. Chem.
39:561-577). Además, se introdujo una zona ambigua
de valor de Índice 0,500-0,599 para representar la
imprecisión del análisis. El funcionamiento de los análisis AxSYM®
Toxo IgM v2 basados en antígenos recombinantes se comparó con el
análisis AxSYM® Toxo IgM basado en antígeno de taquizoito y se
muestra en las Tablas 8-10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede observar a partir de las Tablas
8-10, el análisis AxSYM® Toxo IgM v2 que utiliza el
antígeno diseñado genéticamente antígeno P30 (P30del3C, P30del4C, o
P30MIX1) es un análisis tanto sensible como específico para la
detección de IgG específica de Toxoplasma como se demuestra mediante
la elevada sensibilidad diagnóstica relativa global (intervalo =
97,2%-100%), especificidad (intervalo 94,5%-95,7%), y concordancia
(intervalo = 95,4%-96,4%). El antígeno P30 recombinante de Toxo
diseñado genéticamente (P30del3C, P30del4C, o P30MIX1), combinado
con el análisis AxSYM® Toxo IgM v2, es necesario y suficiente para
remplazar el taquizoito para la detección de anticuerpo IgM
específico de Toxoplasma.
Además, existen diversas ventajas del antígeno
P30 de Toxo recombinante diseñado genéticamente sobre el antígeno
de taquizoito para su uso en la detección de anticuerpos IgM.
Primero, el antígeno está purificado, y la cantidad de antígeno
cargada en el inmunoanálisis puede ser determinada exactamente y
normalizada, p. ej., la concentración de proteína. Esto minimiza
las diferencias de lote a lote observadas comúnmente en los kits
fabricados con diferentes lotes de antígeno de taquizoito. Por
tanto, los diferentes lotes de kits fabricados con diferentes lotes
de antígeno recombinante serán muy constantes de lote a lote.
Segundo, los anticuerpos monoclonales de ratón o humanos para el
antígeno de Toxo recombinante se utilizan para controlar el
recubrimiento con las proteínas de la fase sólida. Esto asegura
adicionalmente que cada lote producido sea constante. Tercero, la
sensibilidad clínica real del análisis utilizando los antígenos
purificados será mayor en virtud del hecho de la actividad
específica superior del antígeno purificado. Finalmente, los kits
fabricados con el antígeno recombinante son más estables durante el
almacenamiento a lo largo del tiempo, y el funcionamiento del
análisis utilizando este antígeno permanece constante a lo largo de
la vida en el estante del análisis. Los kits fabricados con el
antígeno de taquizoito no son tan estables y su funcionamiento puede
variar a lo largo del tiempo.
<110> Abbott Laboratories
\hskip1cmMaine, Gregory T.
\hskip1cmPatel, Chandu B.
\hskip1cmGinsburg, Sanford R.
\hskip1cmBliese, Timothy R.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTÍGENO P30 DISEÑADO GENÉTICAMENTE,
CÓCTEL DE ANTÍGENO MEJORADO, Y SUS USOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6984WOO1
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No recibido todavía
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-10-02
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10/263,153
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-10-02
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión FastSEQ para Windows 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgaattcc ttgttgccaa tcaagttgtc acc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctgaagct ttcacgcgac acaagctgcg a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3555)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30
(52-336aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30
(52-336aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 855
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(855)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30
(52-336aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30
(52-336aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3630)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-p2X-ToxoP30
(52-336aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 701
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-p2X-ToxoP30
(52-336aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtcaagc tttcacacca tggcaaaaat ggaaacgtg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3519)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del1C
(52-324aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 664
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del1C
(52-324aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(819)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del1C
(52-324aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del1C
(52-324aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtcaagc tttcaagccg attttgctga ccctgcagcc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)... (3480)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del2
(52-311aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 651
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del2
(52-311aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 780
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(780)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del2
(52-311aa)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del2
(52-311aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill36
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7370
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1528)...(3447)
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<223>
pMBP-c2X-Toxo30del3C
(52-300aa)
\newpage
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<400> 20
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-Toxo30del3C
(52-300aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(747)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Toxo30del3C
(52-300aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 23
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<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Toxo30del3C
(52-300aa)
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
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<211> 7352
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3429)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\newpage
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 634
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del4C
(52-294aa)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(729)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del4C
(52-294aa)
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\hskip1cm
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<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del4C
(52-294aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
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<210> 29
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
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<211> 7259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADS .
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3336)
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<223>
pMBP-c2X-ToxoP30de14de18
(83-294aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del4del8
(83-294aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(636)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del4del8
(83-294aa)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del4del8
(83-294aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
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<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3399)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del10
(52-284aa)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 624
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del10
(52-284aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(699)
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<223> ToxoP30del10
(52-284aa)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del10
(52-284aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtcaagc tttcacacga gggtcattgt agtggg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3189)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del11
(52-214aa)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30del11
(52-214aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(489)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del11
(52-214aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30del11
(52-214aa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.007
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.008
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.010Ala8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.011AlaBAla9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.012Ala9Ala10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.013
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.014
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.015AlallAlal2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.016Alal2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtcaagc tttcactcca gtttcacggt agcgtg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3447)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30MIX1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(747)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30MIX1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30MIX1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> P30.009Ala7 Primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3447)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30MIX3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(747)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30MIX3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30MIX3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador P30.002Ala2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1528)...(3447)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
pMBP-c2X-ToxoP30MIX5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (747)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30MIX5
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ToxoP30MIX5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (9)
1. Una secuencia de nucleótidos aislada que
codifica un polipéptido, donde dicho polipéptido tiene la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 64.
2. Un polipéptido purificado codificado por la
secuencia de nucleótido del SEQ ID NO: 63.
3. Un polipéptido purificado que tiene la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64.
4. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos IgM para Toxoplasma gondii en una muestra de
ensayo que comprende las etapas de: a) poner en contacto dicha
muestra de ensayo que se sospecha que contiene dichos anticuerpos
IgM con una composición que comprende un polipéptido, donde dicho
polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:
64; y b) detectar la presencia de complejos de
polipéptido/anticuerpo IgM, donde la presencia de dichos complejos
indica la presencia de dichos anticuerpos IgM en dicha muestra de
ensayo.
5. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos IgG para Toxoplasma gondii en una muestra de
ensayo que comprende las etapas de: a) poner en contacto dicha
muestra de ensayo que se sospecha que contiene dichos anticuerpos
IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, donde
dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID
NO: 64 y 2) P35; y b) detectar la presencia de complejos
antígeno/anticuerpo IgG, indicando la presencia de dichos complejos
la presencia de dichos anticuerpos IgG en dicha muestra de
ensayo.
6. Un kit para determinar la presencia de
anticuerpos IgM para Toxoplasma gondii en una muestra de
ensayo que comprende:
a) una composición que comprende un polipéptido,
donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del
SEQ ID NO: 64; y
b) un producto conjugado que comprende un
anticuerpo anclado a un compuesto generador de señal capaz de
generar una señal detectable.
7. Un kit para determinar la presencia de
anticuerpos IgG para Toxoplasma gondii en una muestra de
ensayo que comprende:
a) una composición que comprende: 1) un
polipéptido, donde dicho polipéptido comprende la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 64 y 2) P35; y
b) un producto conjugado que comprende un
anticuerpo anclado a un compuesto generador de señal capaz de
generar una señal detectable.
8. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos IgM e IgG para Toxoplasma gondii en una muestra
de ensayo que comprende las etapas de:
a) poner en contacto dicha muestra de ensayo que
se sospecha que contiene dichos anticuerpos IgM e IgG con una
composición que comprende 1) un polipéptido, donde dicho polipéptido
comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64, y 2) P35,
durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de
complejos anticuerpo IgM/antígeno y complejos anticuerpo
IgG/antígeno; b) añadir un producto conjugado a los complejos de
anticuerpo IgM/antígeno y de anticuerpo IgG/antígeno durante un
tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho
producto conjugado se una al anticuerpo IgM e IgG unido, donde dicho
producto conjugado comprende un anticuerpo anclado a un compuesto
generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c)
detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG que pueden estar
presentes en dicha muestra de ensayo detectando una señal generada
por dicho compuesto generador de señal.
9. Un método de producción de anticuerpos
monoclonales para el polipéptido del SEQ ID NO: 64 que comprende
las etapas de:
a) inyectar a un mamífero no humano un
polipéptido, donde dicho polipéptido comprende la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 64;
b) fusionar células de bazo de dicho mamífero no
humano con células de mieloma con el fin de generar hibridomas
y
c) cultivar dichos hibridomas durante un tiempo
y en condiciones suficientes para que dichos hibridomas produzcan
dichos anticuerpos monoclonales.
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|---|---|
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| ATE53862T1 (de) | 1982-01-22 | 1990-06-15 | Cetus Corp | Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel. |
| US4683194A (en) | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| CA1284931C (en) | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| CA1338457C (en) | 1986-08-22 | 1996-07-16 | Henry A. Erlich | Purified thermostable enzyme |
| US5643758A (en) | 1987-03-10 | 1997-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Production and purification of a protein fused to a binding protein |
| US5231020A (en) | 1989-03-30 | 1993-07-27 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
| US5912120A (en) | 1992-04-09 | 1999-06-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, | Cloning, expression and diagnosis of human cytochrome P450 2C19: the principal determinant of s-mephenytoin metabolism |
| FR2722508B1 (fr) * | 1994-07-13 | 1996-10-04 | Transgene Sa | Cassette d'expression d'une proteine p30 de toxoplasma gondii |
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| CA2333598C (en) * | 1998-05-28 | 2009-10-13 | Abbott Laboratories | Toxoplasma gondii antigens, p35, and uses thereof |
| US6329157B1 (en) * | 1998-05-28 | 2001-12-11 | Abbott Laboratories | Antigen cocktails and uses thereof |
| AU4510299A (en) * | 1998-06-12 | 2000-01-05 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Recombinant production of toxoplasma sag1 antigen |
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