ES2325726B1

ES2325726B1 - Uso del microrna-203 y de sistemas de expresion del mismo para fabricar medicamentos contra el cancer.

Info

Publication number: ES2325726B1
Application number: ES200800739A
Authority: ES
Inventors: Maria Jose Bueno; Ignacio Perez De Castro; Jose Fernandez Piqueras; Marcos Malumbres
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid; Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas CNIO
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid; Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas CNIO
Priority date: 2008-03-13
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2010-06-17
Anticipated expiration: 2028-03-13
Also published as: WO2009112625A1; ES2325726A1

Abstract

Uso del microRNA-203 y de sistemas de expresión del mismo para fabricar medicamentos contra el cáncer. La invención se refiere al uso del microRNA-203 y/o de sistemas de expresión a partir de los cuales se transcriban moléculas de RNA que. contengan la secuencia del microRNA-203 y que puedan madurar dando lugar al microRNA-203, para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer. Se prefiere que la forma de cáncer a tratar sea una alteración maligna hematopoyética, particularmente las que sobreexpresan el gen ABL1 o poseen un gen híbrido del que forma parte el gen ABL1 tal como BCR-ABL1 o NUP-ABL1. Se basa en el hecho de que ABL1 es una diana del microRNA-203 y de que el mismo está silenciado en neoplasias hematopoyéticas, así como en que el tratamiento de estas células tumorales con el microRNA-203 reduce la expresión de ABL1 y BCR-ABL1 y la proliferación de células tumorales.

Description

Uso del microRNA-203 y de sistemas de expresión del mismo para fabricar medicamentos contra el cáncer.

Campo técnico

La invención se refiere a la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer. Más concretamente, la invención se refiere al uso del microRNA-203, o de sistemas de expresión de fragmentos de DNA cuya transcripción dé lugar a moléculas de RNA que comprendan la secuencia del microRNA-203, para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

Los microRNAs (miRNAs) son RNAs no codificantes de una longitud de 18-25 nt que regulan diversos procesos biológicos mediante el silenciamiento de genes diana específicos (Ambros, 2004). El genoma de los mamíferos contiene varios cientos de microRNAs que regulan la expresión génica a través de la modulación de la traducción o degradación del mRNA diana. Los miRNAs están muy conservados a lo largo de la evolución y se ha estimado que alrededor de 250-600 miRNAs de los vertebrados se han conservado a lo largo de la evolución (Bentwich et al., 2005). También se han caracterizado en primates miRNAs adicionales no conservados, y se ha informado de que los seres humanos contienen alrededor de 800-1000 miRNAs (Bentwich et al., 2005; Zamore and Haley, 2005).

Se sabe poco acerca de cómo está regulada la expresión de los miRNAs en células de mamífero. En general, los miRNAs se transcriben como un RNA primario (pri-miR) de mayor longitud, que luego es procesado para dar lugar a un pre-miRNA de aproximadamente 70-90 nucleótidos que, habitualmente, forma una estructura en horquilla debido a apareamientos internos. Los transcritos primarios de los miRNA se generan mediante la polimerasa II y habitualmente están poliadenilados y llevan una caperuza en 5' (Kim and Nam, 2006). Algunos miRNAs están agrupados y se transcriben como transcritos primarios multicistrónicos, pero la mayoría de los miRNAs humanos no están agrupados y se transcriben independientemente (Ambros, 2004; He and Hannon, 2004). Una vez producido el pre-miRNA a partir de ellos, dicho pre-miRNA es transportado al citoplasma y procesado por la RNasa III Dicer para producir el miRNA maduro. Estos miRNAs pueden regular a la baja varios productos de genes mediante la represión de la traducción cuando están presentes secuencias parcialmente complementarias en las regiones no traducidas de 3' (3'-UTR) de los mRNAs diana o mediante degradación directa del mRNA, tras ser incorporados en complejos ribonucleoproteicos que incluyen eIF2C2 y que intervienen en el silenciamiento de genes mediado por RNAs de interferencia. Usando estos mecanismos de control postraduccional, los miRNAs de mamífero parecen estar dirigidos a diversas funciones celulares que incluyen la proliferación y la diferenciación celular (He and Hannon, 2004).

En los últimos años, se ha hecho evidente que la expresión de miRNAs está desregulada en el cáncer humano, lo que da como resultado eventos oncogénicos específicos (revisado en Croce and Calin, 2005; Esquela-Kerscher and Slack, 2006). Se ha demostrado que hay una correlación entre una sobreexpresión o subexpresión específica y tipos concretos de tumores (Lu et al., 2005; Volinia et al., 2006). Estos cambios en la expresión podrían modular oncogenes conocidos o supresores de tumores. Por ejemplo, let-7, un microRNA que inhibe la expresión de RAS, está regulado a la baja en el cáncer de pulmón, lo que conduce a niveles incrementados de la proteína RAS (Johnson et al., 2005). miR-17-5p y miR-20a, por otro lado, modulan el equilibrio entre muerte celular y proliferación a través del control del oncogén c-Myc (O'Donnell et al., 2005). En algunos casos, alteraciones genéticas tales como deleciones o traslocaciones afectan a microRNAs específicos que participan en la iniciación y progresión del cáncer. En unos pocos casos, se ha demostrado que los miRNAs son inactivados mediante alteraciones genéticas específicas. Así, miR-15a y miR-16-1 son inactivados mediante deleciones o traslocaciones específicas en sus regiones cromosómicas (Calin et al., 2002). De hecho, recientemente se ha informado de que los loci de los microRNAs están frecuentemente localizados en sitios frágiles y exhiben una alta frecuencia de cambios en las copias del DNA que están correlacionados con niveles alterados de expresión en diversas alteraciones malignas humanas (Caling et al., 2004; Zhang et al., 2006). La expresión alterada de miRNAs, además, puede servir para predecir la evolución clínica (Calin et al., 2005; Takamizawa et al., 2004; Yanaihara et al., 2006), lo que sugiere que los miRNAs juegan un papel importante en el cáncer humano. Sin embargo, a pesar del gran número de miRNA identificados en mamíferos, las dianas de gran parte de ellos siguen sin identificar y, con ello, sigue siendo desconocida la posible utilidad que podrían tener muchos de ellos en el tratamiento de tipos específicos de cáncer.

El cáncer supone una causa importante de mortalidad y morbilidad por todo el mundo. Por ello, se ha hecho un gran esfuerzo buscando tratamientos para combatirlo. Sin embargo, bajo la denominación de cáncer quedan abarcadas una gran variedad de enfermedades de diversas etiologías y diferente evolución, lo que ha dificultado encontrar tratamientos que sirvan para tratar grandes grupos de alteraciones malignas relacionadas. Bajo la denominación de "cáncer" quedan incluidas todas las enfermedades neoplásicas que cursan con transformación de células, que proliferan de manera anormal e incontrolada, dando lugar al crecimiento anormal de un tejido celular e incluso, a la invasión de otros órganos a nivel local o a distancia (metástasis). Se utiliza a menudo también como sinónimo de tumor maligno, una masa de células transformadas, con crecimiento y multiplicación anormales y que poseen carácter invasivo, pudiendo dar lugar a la formación de metástasis. Tal como se utiliza en esta invención, el término "alteración maligna" es sinónimo de cáncer.

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Además de las diferencias en la etiología y evolución de los distintos tipos de cáncer, incluso en un mismo tipo de cáncer pueden encontrarse muchas diferencias en las respuestas a un mismo tratamiento entre diferentes individuos, debido a variables que no están perfectamente dilucidadas y, en muchos casos, son desconocidas. Por ello, se continúan buscando tanto tratamientos que sirvan para una amplia variedad de tipos de cáncer con características comunes como tratamientos específicos para aquellos individuos aquejados de un tipo determinado de cáncer que no responden a los tratamientos actualmente conocidos.

Entre los distintos tipos de cáncer conocidos, los hay también que afectan a las células de la sangre. Las alteraciones malignas que afectan a estas células se agrupan bajo la denominación general de "alteraciones malignas hematopoyéticas". Dicha denominación abarca todas las alteraciones malignas que afectan a las células formadas por el procedimiento conocido como hematopoyesis, que es el proceso de formación, desarrollo y maduración de los elementos formes de la sangre (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) a partir de un precursor común e indiferenciado conocido como célula madre hematopoyética pluripotencial, unidad formadora de clones o hemocitoblasto. Las células madre que en el adulto se encuentran en la médula ósea son las responsables de formar todas las células y derivados celulares que circulan por la sangre.

Dentro del proceso de hematopoyesis, se distingue a veces entre la mielopoyesis, que se refiere a la formación de los elementos formes de la sangre de la estirpe mieloide (eritocitos, plaquetas, leucocitos granulares y monocitos-macrófagos), y la linfopoyesis, que se refiere a la formación de la estirpe linfoide, constituida por los linfocitos, tanto B como T. En consonancia con esta división, una de las posibles divisiones de las alteraciones malignas de la sangre son las que distinguen entre las que afecta a la estirpe linfoide, sea B o T, tales como la ALL (leucemia linfoblástica aguda), y las que afectan a la estipe mieloide, entre las que a su vez se distinguen los síndromes mieloproliferativos (como la leucemia mieloide crónica, CML, caracterizada por esplenomegalia, alto recuento de leucocitos, basofilia, células inmaduras en la sangre periférica, baja fosfatasa alcalina en leucocitos, expansión de la médula ósea con incremento de la subestirpe de los leucocitos granulares conocidos como neutrófilos), los síndromes mielodisplásicos (tales como la leucemia mielomonocítica crónica, CMML) o la leucemia mieloide aguda (AML, también conocida con la abreviatura ANLL, correspondiente a la traducción al inglés de leucemia no linfoblástica aguda, que se caracteriza por una proliferación masiva de precursores mieloides y que se subdivide en varios subtipos, M1 a M7, entre los que las M1 son mieloblásticas sin maduración y las M2 son mieloblásticas con maduración). Atendiendo a otro criterio, es frecuente también distinguir entre leucemias (que se originan en la médula ósea y fluyen a la sangre periférica) y linfomas (tumores sólidos que se originan en los nódulos linfáticos e invaden la médula ósea y la sangre). Dentro de todos estos tipos existen diversos subtipos.

Uno de los genes cuya expresión y/o localización se ha encontrado modificada en diversas alteraciones malignas hematopoyéticas es el oncogén que se abrevia como ABL o ABL 1 (homólogo 1 del oncogén de la leucemia vírica de Abelson v-abl) (Ren, 2005). ABL1 es una tirosina quinasa no receptora que se expresa en la mayor parte de los tejidos y participa en la transducción de señales de receptores de factores de crecimiento e implicados en adhesión desde la superficie celular para regular la estructura del citoesqueleto (Ren, 2005). ABL1 está implicada en el desarrollo del sistema hematopoyético y su sobreexpresión está implicada en el desarrollo de diversas alteraciones malignas hematopoyéticas (Lin et al., 2006; Ren, 2005). ABL1 está implicada en la señalización de células T (Zipfel et al., 2004), y media en la resistencia a la apoptosis de linfocitos T (Fuchs et al., 1995). La proteína ABL1 aparece sobreexpresada en diversas alteraciones malignas de células T (como, por ejemplo, las leucemias linfoblásticas agudas, ALL, o los linfomas de células T), en algunos casos como resultado de traslocaciones cromosómicas con amplificación, tal como se ha informado en la fusión NUP-ABL1 (Graux et al., 2004; Graux et al., 2006), una amplificación episomal del gen híbrido 5'NUP214-3'ABL1 que se localiza en 9q34 y que aparece en ALL de células T.

La traslocación del gen ABL1 se ha detectado en distintos tipos de leucemias. En la traslocación t(9;22)(g34;g11), el oncogén ABL1, situado en 9q34 en el genoma humano, se trasloca junto al oncogén BCR, situado en 22g11, produciendo un gen híbrido 5' BCR-3'ABL1 (al que se hará referencia en lo sucesivo como BCR-ABL1); el cromosoma 22 humano aparece más corto y se denomina cromosoma Philadelphia (Ph), y el gen híbrido resultante se transcribe como un mRNA de 8,5 kb (frente a las 6 a 7 kb del mRNA del ABL1 normal) que da lugar a una proteína de 210 kDa cuya vida media es superior a la de la proteína ABL1 normal y que presenta un incremento en la actividad como proteína quinasa. En ocasiones se ha detectado otra variante de traslocación que implica a un tercer cromosoma, como, por ejemplo, en la t(1;9;22); también se han detectado casos en los que está presente el gen híbrido BCR-ABL1 sin que se detecte el cromosoma Philadelphia. La fusión BCR-ABL1 es un hito de CML, pues todas las formas de esta leucemia lo presentan, al menos a nivel molecular, aunque no siempre se detecta en el cariotipo, que puede aparecer normal. La fusión BCR-ABL1, sin embargo, no es exclusiva de este tipo de leucemia, pues puede encontrarse en un porcentaje elevado de otras leucemias tales como ALL (leucemia linfoblástica aguda) y ANLL (leucemia no linfoblástica aguda) (especialmente en los casos de ANLL M1 ó M2). En cualquiera de los casos, cuando se detecta la traslocación t(9;22)(g34;g11), el pronóstico de evolución del paciente es malo, estimándose que sus probabilidades de supervivencia son reducidas. Por el contrario, los pacientes con CML que tienen niveles disminuidos de los transcritos de BCR-ABL1 tienen un riesgo significativamente menor de progresión de la enfermedad (Druker et al., 2006). Además, el reciente éxito en CML y otras enfermedades de algunas pequeñas moléculas inhibidoras de quinasas dirigidas a ABL1 (Baselga, 2006; Ren, 2005) ha sugerido que la inhibición de ABL1 es crítica para el tratamiento de tumores. Pero los inhibidores de quinasas tales como Gleevec® (mesilato de imatinib) no erradican del cuerpo por completo las células que expresan BCR-ABL1, y la resistencia emerge finalmente como consecuencia de mutaciones puntuales que vuelven resistentes algunas isoformas de ABL1 o mediante amplificación y sobreexpresión de la fusión BCR-ABL1 (Shannon, 2002).

Además de la traslocación t(9;22)(g34;g11), otras traslocaciones del gen ABL1 han sido detectadas también en casos de leucemia. Así, la traslocación t(9;12)(g34;p 12), que da lugar al gen híbrido ETV6-ABL1 (van Limbergen et al., 2001; Meyer-Monard et al., 2005) se ha detectado, aunque raramente, en la leucemia linfoblástica aguda y en trastornos mieloproliferativos. En casos aislados han sido detectadas también las traslocaciones t(9;14)(q34;q32) (que da lugar a un gen híbrido EML1-ABL1 y fue identificada en ALL de células T) (de Keersmaecker et al., 2005) y t(1;9)(g24;g34) (que da lugar a un gen híbrido RCSD1-ABL1 y fue identificada en ALL de células B) (de Braekeleer et al., 2007).

Dado el gran número de alteraciones malignas hematopoyéticas que existen, sería interesante encontrar algún compuesto que sirviera para tratar un amplio espectro de las mismas. Debido a que las alteraciones en la expresión o actividad de ABL1 se dan en varios tipos de estos tumores y la importancia que parece tener en el grado de malignidad del tumor, es particularmente interesante el hallazgo de compuestos que afecten a la expresión del gen ABL1 o a la fusión BCR-ABL1 o de fármacos basados en estos compuestos. En la presente memoria se presentan datos en los que se demuestran que un compuesto ya conocido puede ser utilizado para el tratamiento de diversas alteraciones malignas hematopoyéticas, entre ellas, aquellas en las que está implicado el gen ABL, suponiendo una alternativa al tratamiento con inhibidores de quinasas.

Breve descripción de la invención

La invención se refiere al uso del microRNA-203, o a sistemas de expresión de moléculas de RNA a partir de las cuales pueda generarse dicho microRNA en células transfectadas por dichos sistemas de expresión, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, con preferencia por las alteraciones malignas hematopoyéticas, en especial aquellas en las que haya sobreexpresión del gen ABL1 o de formas de fusión del mismo.

Así, un objeto de la invención es el uso del microRNA-203 (SEQ ID NO:2) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en seres humanos.

Otro objeto de la invención es el uso de un sistema de expresión de un fragmento de DNA cuya transcripción da lugar a una molécula de RNA que comprende la secuencia del microRNA-203 maduro (SEQ ID NO:2) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en seres humanos. Se prefiere el uso de sistemas en los que la transcripción del fragmento de DNA dé lugar a una molécula de RNA que comprenda la secuencia de SEQ ID NO:1. Una realización preferida de esta última es aquella en la que el fragmento de DNA está representado por SEQ ID NO:3. En cualquiera de los casos, se prefieren los sistemas en los que el fragmento de DNA cuya transcripción da lugar a una molécula de RNA que comprende la secuencia del microRNA-203 maduro está unido de forma operativa a un promotor que dirige la transcripción del fragmento de DNA en células de mamífero, con especial preferencia por los promotores de genes de virus que infectan células de mamíferos, entre los cuales se prefieren los promotores CMV, MSCV y MoMuLV, especialmente CMV y MoMuLV. En cuanto al sistema de expresión, son realizaciones posibles de la invención tanto aquellas en las que el sistema de expresión está basado en virus, con especial preferencia por los retrovirus recombinantes, como aquellas en las que el sistema de expresión es un plásmido, especialmente si el plásmido está basado en un vector retroviral y, muy especialmente, aquellos en los que la secuencia a transcribir está insertada bajo el control del promotor CMV, MSCV o MoMuLV, con especial preferencia por los promotores CMV y MoMuLV.

Independientemente de si el medicamento se fabrica con el miRNA203, o con un sistema de expresión que dé lugar a la transcripción de un RNA que comprenda dicho miRNA203 y/o que pueda dar lugar al mismo tras su procesamiento, se prefiere que el medicamento sea para el tratamiento de una alteración maligna hematopoyética. Se prefiere particularmente que el medicamento sea para el tratamiento de una alteración maligna hematopoyética en la que las células malignas sobreexpresen el gen ABL1 o posean un gen híbrido del que forme parte el gen ABL1, especialmente aquellas que presenten el gen híbrido BCR-ABL1. Entre las alteraciones malignas en las que las células sobreexpresan el gen ABL 1, se prefieren especialmente los linfomas de células T o las leucemias linfoblásticas agudas de células T (T-ALL). Entre las alteraciones malignas en las que las células poseen un gen híbrido del que forma parte el gen ABL1, se prefieren aquellas que presentan el gen híbrido BCR-ABL1, especialmente las leucemias CML, ALL o ANLL, muy especialmente CML y, particularmente, la CML resistente al tratamiento con Gleevec® (mesilato de imatinib). También son realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que el medicamento está destinado al tratamiento de una alteración maligna hematopoyética en la que las células presentan un gen híbrido diferente, tal como NUP-ABL1, especialmente en el caso de ALL de células T.

Descripción de las figuras

Fig. 1

Pérdidas cromosómicas en el cromosoma 12 de ratón mediante análisis de CGH y SSCP

A) Pérdidas de copias de DNA detectadas mediante CGH en los tumores murinos analizados. El perfil muestra el área más frecuentemente perdida (citobandas F1 y F2) en estas alteraciones malignas de células T. B) Análisis de pérdida de heterocigosidad mediante SSCP. Los diferentes marcadores utilizados a través del cromosoma 12 completo se muestran como flechas verticales. Las pérdidas de DNA en las citobandas D3 a F2 se muestran mediante cajas de tono gris oscuro, mientras que las cajas menos oscuras indican regiones ciegas entre los marcadores más próximos en sus inmediaciones. Las abreviaturas indicadas en la primera columna corresponden a las denominaciones de los distintos tumores analizados. C) La localización precisa de los microRNAs localizados en la región delecionada (107-114 Mb) se indican mediante líneas verticales. La agrupación "callypige" contiene 44 microRNAs adicionales cuyos nombres se han omitido por claridad.

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Fig. 2

Análisis mediante microarrays de la expresión de microRNAs

A) Mapa que muestra la expresión de los miRNAs localizados en la región delecionada del cromosoma 12 de ratón (Cr. 12 ratón) en células T normales y en tumores de células T. B) El análisis de significancia de microarrays en estas muestras apunta a miR-203 como el único miRNA regulado a la baja de forma significativa (FDR < 0,0001) en muestras tumorales frente a muestras normales.

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Fig. 3

Análisis de la metilación del DNA de miR-203 en linfomas y leucemias de células T

A) Análisis de metilación específica (MS-PCR) de la región situada corriente arriba respecto a miR-203 en el cromosoma 12 de ratón. El porcentaje de nucleótidos C+G (CG%) y la densidad de dinucleótidos CpG se muestra para una región que abarca 4 kbp corriente arriba respecto a miR-203. Se diseñaron cebadores específicos para estas islas CpG (flechas convergentes) y se utilizaron para amplificar estos fragmentos de DNA en muestras normales y tumorales. Como control se utilizó miR-345, también localizado en el cromosoma 12. La metilación de las regiones situadas corriente arriba respecto a miR-203 es patente en la mayor parte de las muestras tumorales (asteriscos) pero no en células normales, mientras que en las regiones situadas corriente arriba respecto a miR-345 no se detecta metilación ni en linfocitos normales ni en muestras tumorales. T-CL, linfomas de células T; NL, linfocitos de timos normales; IVD, DNA metilado in vitro. H_{2}O, amplificación en la que se utilizó H_{2}O en lugar de DNA de linfocitos. B) Representación que muestra la homología entre humanos y ratón de la región genómica de miR-203. Las dos regiones con mayor homología corresponden al miR-203 y al sitio de comienzo de la transcripción (TSS). Las áreas sombreadas bajo las curvas indican la posición de la isla CpG. La densidad de los dinucleótidos CpG está por las áreas con sombreado oscuro representadas debajo del gráfico. C) Secuenciación con bisulfito de la región situada corriente arriba respecto a miR-203 en tumores de células T de ratón (T-CL-Tu) y linfocitos normales (NL). Ningún dinucleótido CpG está metilado en las muestras control, mientras que algunos tumores tales como 16CG63 y NRH5-2 están altamente metilados. C) Análisis similar en líneas celulares de leucemia de células T (T-CL-Ce) o tumores primarios (T-CL-Tu). Los dinucleótidos CpG no metilados se muestran mediante un círculo vacío, mientras que el metil-CpG se muestra mediante círculos rellenos. Se muestran todos los dinucleótidos CpG en una región de aproximadamente 350 pb situada corriente arriba respecto a miR-203. Para cada grupo se muestran tres muestras tumorales representativas.

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Fig. 4

Correlación entre la inactivación de miR-203 y la sobreexpresión de ABL1 en linfomas de células T

A) Análisis de la expresión de hipotéticas dianas de miR-203 mediante análisis de microarrays de cDNA. Sólo 22 de las dianas predichas de miR-203 (lista situada a la derecha de la figura), incluida Abl1, están reguladas al alza de forma significativa en estos linfomas de células T (T-CL-Tu) con respecto a las células T normales (NT), como se indica mediante el análisis de significación de microarrays (FDR < 0,001). B) Correlación entre la pérdida de miR-203 (detectada por RT-PCR cuantitativo) y la regulación al alza de Abl1 en estos tumores (T1 y T2) a nivel de las proteínas tal como se detecta mediante inmunoensayo. Se usó \alpha-tubulina como control de carga. C) Duplex predichos formados entre miR-203 y las regiones no traducidas de 3' (UTR) de ratones (M-Abl1 3'-UTR) y seres humanos (H-ABL1 3'-UTR) de ABL1. La región semilla está resaltada con una caja gris. La predicción se calculó utilizando el algoritmo PicTar (Krek et al., 2005).

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Fig. 5

Represión de ABL1 por miR-203.

A) Niveles de proteína ABL1 ena células KARPAS-45 que expresan GFP (GFP) o GFP + miR-203 (203), que indican una reducción de 3 veces de los niveles de ABL1 en presencia de miR-203. Se usó \alpha-tubulina como control de carga. Las señales de ABL1 y \alpha-tubulina se cuantificaron y su relación se normalizó con respecto a la de células no infectadas (NT). B) Tasa de crecimiento de células KARPAS-45 y PEER que expresan miR-203 (círculos rellenos negros), una mezcla de 4 RNAs interferentes para ABL 1 (ver Tabla 2 y representación de los vectores para su expresión en la Fig. 7E) (círculos grises) o el vector vacío (círculos abiertos). C) Actividad luciferasa en constructos de DNA que portan la 3'-UTR tipo silvestre de ABL1 o versiones mutadas corriente abajo con respecto al indicador luciferasa. Se cotransfectaron células 293 con pG-ABL 1 (que porta la quimera luciferasa-3'UTR-ABL1) y un plásmido que expresaba GFP o miR-203. La reducción en la actividad luciferasa inducida mediante la expresión de miR-203 se revierte después de la mutación de tres residuos específicos en la región semilla del sitio diana de miR-203 (señalados con flechas sobre la secuencia), como se demuestra en los experimentos realizados con el vector pG-ABL1^{mut} (parte derecha de la Fig. 5C), que contiene la secuencia mutada. La actividad luciferasa se normalizó con respecto a los niveles de transfección tal como se indica en los procedimientos experimentales. Los datos mostrados son representativos de ensayos separados a dos relaciones diferentes luciferasa/miRNA tal como está indicado. *, diferencias significativas a p<0,001; **, no halladas diferencias significativas. D) Mapa del vector pMSCV-203, con la secuencia correspondiente a SEQ ID NO:3 (miR-203). E) Mapa del vector pBABE-puro-miR203, que contiene la secuencia correspondiente a SEQ ID NO:3 (miR-203); puro: gen de puromicina.

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Fig. 6

Metilación específica de miR-203 en tumores positivos para el cromosoma Philadelphia (Ph)

Mapa de metilación de la región humana situada corriente arriba respecto a miR-203 en tumores positivos para Ph, incluyendo leucemias mielogénicas crónicas (CML) y leucemias linfoblásticas agudas de células B (B-ALL). Se observa la diferencia en la metilación con respecto a las células B normales (NBC). Los tumores negativos para esta translocación (Ph-) como leucemias mielógenas agudas (AML) u otras enfermedades mieloproliferativas crónicas (CMPDs) no presentan una metilación significativa del miR-203. Círculos vacíos: CpG no metilados; círculos rellenos: metil-CpG. Tu: Tumores primarios; CL: líneas celulares.

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Fig. 7

La re-expresión de miR-203 reprime ABL1 y BCR-ABL1 en células de leucemias

A) Las células K562 fueron transfectadas con vectores con GFP o miR-203. La sobreexpresión de miR-203 da como resultado una disminución de los niveles de las proteínas ABL1 y BCR-ABL I tal como se detecta mediante inmunoensayo de transferencias. Se usó \alpha-tubulina como control de carga. Las señales de ABL1 y \alpha-tubulina se cuantificaron y sus relaciones se normalizaron respecto a los niveles de proteína BCR-ABL1 en células que expresaban GFP. B) Tasa de crecimiento de células K562 que expresan: miR-203 (círculos rellenos), la mezcla de 4 RNAs interferentes para ABL1 (vectores pA70-shRNA ABL: ver Fig. 7E y Tabla 2) (círculos grises) o el vector vacío (círculos abiertos). C) Muerte apoptótica inducida por miR-203 o la mezcla de RNAs interferentes para ABLI. La sobreexpresión de miR-203 o la mezcla de 4 RNAs interferentes para ABL1 (vectores pA70-shRNA ABL: ver Fig. 7E y Tabla 2) provocan cierta muerte celular tal como se puede detectar después de teñir las células transfectadas con un anticuerpo anti-Anexina V, un marcador de membrana de la muerte apoptótica. D) Rescate parcial del efecto antiproliferativo de miR-203 mediante la sobre-expresión de BCR-ABL1 con su 3' UTR endógeno. Este rescate es completo si se elimina el 3' UTR ya que entonces se elimina el sitio diana de miR-203 y es por tanto inactivo sobre esas fusiones. El número de células se contó 3 días después de transfectar con los vectores indicados. E) Mapa de los vectores pA70-shRNA ABL: shRNA ABL representa cada una de las secuencias que permiten expresar los RNA de interferencia a los que se refiere la Tabla 2.

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Fig. 8

Reexpresión de miR-203 y regulación a la baja de ABL1 tras el tratamiento de células CML con drogas epigenéticas

A) El tratamiento de células K562 y KCL-22 con 5-azacitidina (Aza) + PBA da como resultado la desmetilación de la región situada corriente arriba respecto a miR-203 tal como se detecta mediante MS-PCR en células KCL-22 y K562: Mapa de metilación de la región situada corriente arriba respecto a miR-203 en muestras de estas células antes y después del tratamiento. B) Regulación al alza de miR-203 (deducida a partir de la detección de los niveles de miR203 mediante RT-PCR cuantitativa: parte superior de la Fig. 8B) y regulación a la baja simultánea de los niveles de las proteínas ABL1 y BCR-ABL1 tras el tratamiento con 5-aza + PBA en estas células (parte inferior de la Fig. 8B). Se utilizó \alpha-tubulina como control de carga para los niveles de proteínas. Las señales de ABL1 y \alpha-tubulina se cuantificaron y sus relaciones se normalizaron respecto a los niveles de proteína BCR-ABL1 en células no tratadas.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que el microRNA-203 (miR-203) está silenciado en neoplasias hematopoyéticas, silenciamiento que se produce mediante la combinación de mecanismos genéticos y epigenéticos, así como en el hallazgo de que el conocido oncogén ABL1 (que está sobreexpresado en muchas alteraciones malignas hematopoyéticas, entre las que se incluyen los tumores que portan la proteína de fusión BCR-ABL1) es una diana de miR-203. El tratamiento de estas células tumorales con vectores que expresan miR-203, o con drogas epigenéticas que restauran la expresión de miR-203, reduce la expresión de ABL1 y BCR-ABL1 y la proliferación de células tumorales. Así, miR-203 funciona como un gen supresor de tumores inactivado tanto por mecanismos genéticos como epigenéticos. Por ello, las terapias epigenéticas que restauran la función de este microRNA tendrían efectos beneficiosos en pacientes aquejados de leucemia que sobreexpresan ABL1 o variantes de traslocación tales como la proteína de fusión BCR-ABL1. Igualmente, la administración de medicamentos que contengan miR-203 o sistemas de expresión de dicho microRNA tendrán efectos beneficiosos en todas aquellas alteraciones malignas en las que se haya producido el silenciamiento de miR-203. Por ello, la presente invención proporciona el uso de miR-203, o de sistemas de expresión del mismo, para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer, con preferencia por las alteraciones malignas hematopoyéticas y con especial preferencia por todas aquellas en las que se sobreexprese el oncogén ABL o expresen una fusión de ABL1 con otro gen, con especial preferencia por la fusión BCR-ABL1, como puede ser CML o, en otros casos, ALL y ANLL.

En el estudio que se describe en la presente descripción y en los ejemplos que la siguen, los inventores describen cómo han identificado una región del cromosoma 12 de ratón (región F2, conservada en el cromosoma humano 14q32) que frecuentemente se pierde en las alteraciones malignas de células T. Esta región cromosómica es especialmente rica en microRNAs y contiene una densidad sorprendentemente alta de ellos, puesto que contiene varias agrupaciones de microRNAs y expresa 52 microRNAs maduros. Alrededor del 12% del genoma conocido de los mamíferos que corresponde a miRNAs, el llamado miRNoma, está localizado en esta posición. La mayor parte de estos miRNAs se agrupan en varios transcritos, incluidos seis miRNAs en el transcrito antiPeg11 que participa en la regulación en trans del gen Rtl1/Peg11 (Davis et al., 2005). Aproximadamente 30 miRNAs adicionales se expresan en aproximadamente cuatro transcritos diferentes corriente abajo respecto a la región callipyge, aunque todos estos transcritos parecen expresarse de forma materna y estar controlados por impronta genómica (Seitz et al., 2004; Seitz et al., 2003). La presencia de este gran número de miRNAs podría conferir una susceptibilidad específica a la escisión de los cromosomas, puesto que se ha sugerido previamente que las grandes agrupaciones de miRNAs producen sitios frágiles (Calin
et al., 2004).

Posteriormente, los presentes inventores acotaron el sitio frágil a un región de aproximadamente 7 Mb que rodea al locus callipyge, una región cromosómica del cromosoma 12 de ratón y 14 humano conocida por estar regulada mediante impronta genómica (Davis et al., 2005) y que contiene algunos genes objeto de impronta implicados en la regulación de la biología del músculo y de la grasa (Georges et al., 2003). La pérdida de heterocigosidad en esta región es relativamente frecuente (alrededor del 50% de los tumores ensayados) en linfomas de células T inducidos por radiación y, un modelo de neoplasia que se parece a los linfomas de células T periféricas humanas (Meléndez
et al., 2003).

Tras averiguar el perfil de expresión de miRNAs, los presentes inventores detectaron un silenciamiento específico de uno de estos miRNAs, el microRNA-203 (miR-203), en varios tumores hematopoyéticos analizados. miR-203, localizado aproximadamente 2 Mb corriente abajo respecto a la región callipyge, es la única secuencia que está regulada a la baja de forma significativa en los linfomas de células T analizados. El miR-203 de Homo sapiens (hsa-mir-203) es un microRNA cuya existencia y secuencia se predijo en principio mediante ordenador a partir de la secuencia de su homólogo en ratón (Lim et al., 2003), confirmándose posteriormente su expresión en seres humanos (Landgraf et al., 2007). Deriva de un pre-miRNA que presenta un fragmento de secuencia (SEQ ID NO:1, código de acceso MI0000283 en la base de microRNAs de Sanger) que forma la siguiente horquilla:

1

pre-miRNA que da lugar al siguiente microRNA maduro:

2

formado a partir de los nucleótidos subrayados en el fragmento de la horquilla y cuyo código de acceso en la base de microRNAs de Sanger es MIMAT0000264.

Puesto que estos tumores pierden habitualmente sólo una copia de esta región de DNA, los inventores estudiaron si la expresión de miR-203 está regulada a la baja mediante mecanismos epigenéticos. Así, se ha demostrado que miR-203 se silencia por la pérdida de un alelo e hipermetilación de regiones CpG del promotor en la copia restante de DNA, tanto en células T tumorales de ratón como de seres humanos. La regulación específica a la baja por medios epigenéticos señala a miR-203 como un gen supresor de tumores. El estudio de los inventores ha demostrado que en el desarrollo de tumores de células T se seleccionan deleciones específicas en la región cercana al locus callipyge, en la que miR-203 está específicamente silenciado por medios epigenéticos. Así, los mecanismos genéticos y epigenéticos inactivan de forma coordinada algunos miRNAs específicos tales como miR-203 en estas neoplasias.

La expresión de miR-203 parece estar restringida a tipos celulares específicos. Así, miR-203 se expresa de forma significativa en las células del folículo piloso pero no en otras células de la piel (Yi et al., 2006). En estas células, la deleción condicional de la enzima de procesamiento del miRNA Dicer da como resultado una disminución en la expresión de miR-203 al mismo tiempo que la de otros miRNAs y provoca alteraciones en el desarrollo de la matriz del pelo y la organización epidérmica (Yi et al., 2006). miR-203 no se expresa ni en fibroblastos primarios ni en muchas otras líneas celulares (observaciones no publicadas). Es más, la inhibición de la expresión de miR-203 induce un incremento en la proliferación celular (Cheng et al., 2005), lo que sugiere una función antiproliferativa de este miRNA.

Los análisis bioinformáticos predicen que los miRNAs conservados en vertebrados tienen como dianas más de 100-400 genes reguladores. Entre las hipotéticas dianas de miR-203, los presentes inventores han identificado ABL1 como una diana relevante, al menos en células hematopoyéticas. La 3'-UTR de ABL1 contiene un sitio que es diana específica de miR-203. El silenciamiento de miR-203 por medios genéticos y epigenéticos parece conducir a una regulación al alza de los oncogenes ABL 1 y BCR-ABL1 en diversas alteraciones malignas hematopoyéticas. Así, en correlación con la inactivación de miR-203 mediante mecanismos genéticos y epigenéticos, los niveles de la proteína Abl1 están incrementados en linfomas de células T inducidos por radiación y, así como en células leucémicas positivas para Ph (denominadas como Ph+). Todas estas enfermedades están acompañadas de metilación del promotor de miR-203 (Figs. 3 y 6), mientras que otras leucemias que no expresan la proteína de fusión BCR-ABL 1 (las llamadas Philadelphia-negativas o Ph-) no silencian miR-203 (Fig. 6), lo que sugiere que el silenciamiento de miR-203 es una ventaja desde el punto de vista de la proliferación en estas células tumorales que dependen de ABLI. También es interesante señalar que la región 14q32 del cromosoma humano 14 donde reside este miRNA se pierde frecuentemente en crisis linfoblásticas de pacientes con CML (Dastugue et al., 1986; Sercan et al., 2000). Por ello, en la presente invención se propone que la transformación aguda y la progresión de esta enfermedad puede estar acompañada por la inactivación de genes supresores de tumores en esta región, incluidos miRNAs tales como miR-203.

En los ensayos realizados, los niveles de la proteína ABL1 disminuyeron tras la reexpresión de miR-203. La restitución del miR-203 mediante transfección exógena o drogas epigenéticas da como resultado una regulación a la baja de ABL1 y BCR-ABL1 y una disminución de la proliferación de células tumorales. El reciente éxito en CML y otras enfermedades de algunas pequeñas moléculas inhibidoras de quinasas dirigidas a ABL1 (Baselga, 2006; Ren, 2005) ha sugerido que la inhibición de ABL1 es crítica para el tratamiento de tumores en estos pacientes. De hecho, los pacientes con CML que tienen niveles disminuidos de los transcritos de BCR-ABL1 tienen un riesgo significativamente menor de progresión de la enfermedad (Druker et al., 2006). El hecho de que algunos miRNAs tales como miR-203 puedan modular los niveles de ABL1 sugiere que la restauración de la expresión de miR-203 puede ser beneficiosa para los pacientes aquejados de ALL o CML que portan las fusiones NUP214-ABL o BCR-ABL. Dado que los transcritos oncogénicos de estas traslocaciones contienen el sitio diana de miR-203, los resultados aquí expuestos indican que la restauración de la función del microRNA-203 y las drogas epigenéticas tales como los inhibidores de metilación pueden proporcionan efectos beneficiosos a los pacientes resistentes a Gleevec®.

Así, la presente invención proporciona el uso del microRNA-203 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, preferiblemente, alteraciones malignas hematopoyéticas y, más preferiblemente, linfomas de células T, CML, ALL o ANLL, particularmente aquellas en las que hay sobreexpresión de ABL como tal o por formación de un gen híbrido de fusión.

No es necesario proporcionar el microRNA-203 como tal, sino que también es posible que el medicamento se prepare con un vector de expresión que contenga una secuencia de DNA cuya transcripción dé lugar a una molécula de RNA que comprenda la secuencia del microRNA-203 maduro y que, al ser procesado por las células del organismo en el que se transcriba el vector de expresión, dé lugar al microRNA-203 maduro. De esta manera, puede facilitarse la administración del microRNA-203 al organismo, preferiblemente un ser humano. Por ello, la presente invención proporciona también el uso de un sistema de expresión de un fragmento de ADN cuya transcripción dé lugar a una molécula de RNA que comprenda la secuencia del microRNA-203 (SEQ ID NO:2) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en seres humanos. Se prefiere que la transcripción del fragmento de DNA dé lugar a un RNA que comprenda la secuencia de la horquilla del pre-miRNA a partir de cual, de forma natural, se genera la secuencia madura del microRNA, por lo que una realización preferida de la invención es aquella en la que la transcripción del fragmento de DNA comprendido en el vector de expresión da lugar a una molécula de RNA que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1. Dicho fragmento de DNA puede ser, por ejemplo, el representado por SEQ ID NO:3, que es un fragmento de 479 pb de la secuencia del gen humano (hsa-mir203) cuya transcripción da lugar al mRNA a partir del cual, de forma natural, se genera el miR-203, pues dicho fragmento de 479 pb ha sido utilizado en los ejemplos que aparecen posteriormente en la presente memoria y ha demostrado su utilidad para disminuir la tasa de proliferación de líneas de CML transfectadas con un vector de expresión que contenía dicho fragmento de
DNA.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende por "sistema de expresión de DNA" a cualquier sistema que, una vez introducido en las células deseadas, dé lugar a la transcripción de dicho DNA, es decir, a la formación de una molécula de RNA. Para ello el fragmento de DNA cuya transcripción se desea deberá estar unido de forma operativa a un promotor. Para que dicho promotor sea adecuado para los objetivos de la presente invención, dicho promotor deberá se capaz de dirigir la transcripción del fragmento de DNA unido de forma operativa al promotor en células de mamíferos, particularmente en células de seres humanos. La transcripción de fragmentos de DNA en células hospedadoras de mamífero puede controlarse, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus capaces de infectar a dichos mamíferos tales como poliomavirus, adenovirus, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B o el virus 40 de simio (SV40) o, también, a partir de promotores de genes heterólogos a aquel al que corresponde el fragmento de DNA que se desea transcribir, tales como el promotor de la actina o promotores de inmunoglobulinas, siempre y cuando los promotores sean compatibles con las células en las que se desee que se transcriba la molécula de DNA. La mayoría de estos promotores son válidos en el caso de las células del sistema hematopoyético. En la presente invención, se prefiere el uso del promotor CMV (promotor temprano inmediato de citomegalovirus), el promotor MSCV (promotor de la LTR del virus de células madre murinas) y el MoMuLV (promotor de la LTR del virus de la leucemia murina de Moloney), con especial preferencia por los promotores CMV y MoMuLV.

En cuanto al sistema de expresión en sí, el fragmento de DNA que se desea transcribir y el promotor unido al mismo de forma operativa pueden formar parte de una molécula de DNA desnudo tal como un plásmido o puede formar parte de un sistema de expresión más complejo tal como los basados en virus, aquellos en los que la molécula de DNA que contiene el fragmento de DNA que se desea transcribir forma parte de una estructura análoga a la de una partícula vírica, en cuya forma natural la molécula de DNA constituiría el genoma del virus. Esto permite aprovechar los sistemas naturales de penetración en las células del virus e, incluso, aprovechar su tropismo para dirigirlos a células concretas. En algunos casos, como es el de los retrovirus, su genoma puede integrarse en el genoma de la célula infectada, transformándola de manera que, si parte del genoma del virus se sustituye por un gen exógeno de interés, los retrovirus pueden ser una herramienta eficaz para terapia génica. Es corriente también el uso de plásmidos que contienen las regiones de los extremos del genoma de los retrovirus, las LTR, separadas por fragmentos de secuencia en los que se inserta un gen de interés: tal como se utiliza en la invención, la expresión "vectores retrovirales" hace referencia a este tipo de plásmidos. En ellos, los genes virales gag, pol y env del retrovirus son reemplazados por el transgén de interés el cual, si se coloca bajo el control de un promotor adecuado, podrá expresarse a partir del plásmido. La presencia de las LTR permitiría la integración de la secuencia situada entre ellas en células en división. La expresión del transgén se puede estar controlada bien por la región promotora/potenciadora de la LTR de 5', o por cualquier promotor alternativo viral (CMV, por ejemplo) o celular. Los vectores retrovirales están basados a menudo en el virus de la leucemia murina de Moloney, MoMuLV, que es un virus anfotrófico, capaz de infectar tanto células de ratón como humanas, lo que facilita su utilización para el tratamiento de seres humanos.

En la presente invención, se prefieren los sistemas de expresión (transcripción) que son plásmidos basados en vectores retrovirales. Se prefieren especialmente aquellos en los que la secuencia a transcribir (el fragmento de DNA cuya transcripción dé lugar a una molécula de RNA que comprenda la secuencia del microRNA-203 maduro) pueda insertarse bajo el control del promotor CMV, MSCV o MoMuLV, con especial preferencia por los promotores CMV y MoMuLV, tales como los que tienen la estructura del pMSCVpuro (promotor CMV) o pBabe-puro (MoMuLV). Se prefiere también que el fragmento de DNA cuya transcripción dé lugar a una molécula de RNA que comprenda la secuencia del microRNA-203 maduro inserto en el vector retroviral sea la de SEQ ID NO:3, como sucede en los plásmidos pMSCV-203 o pBabe-puro-203 que se utilizan más adelante en los Ejemplos de la presente memoria.

Como en el caso del uso del microRNA-203, es una realización preferida del uso de un sistema de expresión de una molécula de RNA que comprenda su secuencia para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer aquella en el que el cáncer es una alteración maligna hematopoyética, particularmente aquellas en las que las células malignas hematopoyéticas sobreexpresen el gen ABL1 o posean un gen híbrido del que forme parte el gen ABL1. Entre las alteraciones malignas en las que las células sobreexpresan el gen ABL1, se prefieren especialmente los linfomas de células T o las leucemias linfoblásticas agudas (ALL) de células T (T-ALL). Entre las alteraciones malignas en las que las células poseen un gen híbrido del que forma parte el gen ABL1, se prefieren aquellas que presentan el gen híbrido BCR-ABL1, especialmente las leucemias CML, ALL o ANLL, muy especialmente CML y, particularmente, la CML resistente al tratamiento con Gleevec® (mesilato de imatinib). También son realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que el medicamento está destinado al tratamiento de una alteración maligna hematopoyética en la que las células presentan un gen híbrido diferente, tal como NUP-ABL1, especialmente en el caso de ALL de células T.

Tanto si el medicamento a cuya preparación se refiere la presente invención contiene el microRNA-203 como tal, como si contiene un sistema de expresión del mismo, el medicamento podrá contener adicionalmente excipientes y vehículos farmacéuticos adecuados para su administración, que será preferiblemente por vía intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, por ejemplo en un medio estéril en el que, dependiendo de la concentración y los vehículos adicionales, el microRNA-203 o su sistema de expresión podrá estar en suspensión o en disolución. Así, el medicamento, en especial el que contiene la molécula de microRNA-203, puede comprender además vehículos de administración tales como por ejemplo liposomas en los que se encapsule el microRNA-203, para su administración al sujeto. Pueden formar parte de las formulaciones farmacéuticas correspondientes distintos vehículos y diluyentes y sus sales. Entre los vehículos en los que puede incorporarse la molécula de microRNA-203 pueden citarse polímeros biodegradables, microesferas de ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o vectores proteináceos. La molécula de microRNA-203 puede también incorporarse al medicamento formando complejos con agentes capaces de alterar la estructura de la membrana celular y/o con moléculas lipídicas.

Los ejemplos que vienen a continuación sirven para ilustrar con más detalle realizaciones preferidas de la presente invención.

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Ejemplos

Los ejemplos que se detallan a continuación se llevaron a cabo utilizando los siguientes procedimientos experimentales:

- Colonia de ratones e inducción de tumores

Los ratones híbridos C57BL/6J y RF/J F1 y los animales puros C57BL/6J se mantuvieron en los animalarios del CNIO siguiendo las recomendaciones éticas apropiadas de dicha institución.

Para la inducción de tumores, ratones de ambos sexos de 4 semanas de edad se expusieron semanalmente a 4 dosis de 1,75 Gy/dosis de radiación gamma ionizante (Guerrero et al., 1984). Los ratones tratados se observaron diariamente hasta que parecieron estar moribundos; entonces, fueron sacrificados y se les realizó la autopsia. Los tejidos normales y tumorales se procesaron para realizar análisis histológico (embebiéndolos en parafina y tiñéndolos con hematoxilina y eosina) siguiendo protocolos normalizados. El DNA, RNA y las proteínas se aislaron de estas muestras como se describe más adelante.

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- Hibridación Genómica Comparativa

Para la preparación del DNA, se cortaron tejidos de timo normales y de linfoma, se desmenuzaron en trozos pequeños y se colocaron en un tubo de microfuga que contenía 0,5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 25 mM, SDS 0,5%, NaCl 0,1M). Se añadió proteinasa K a una concentración final de 100 mg/ml y se incubó a 55ºC durante toda la noche. El usado se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25 : 24 : 1, v/v) (Gibco- BRL). El DNA se precipitó mediante la adición de un volumen igual de isopropanol y se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y EDTA 1 mM).

Alrededor de 3000 clones BAC de ratón con un espaciado medio de 1 Mb, que cubrían los cromosomas de ratón 1 a 19 y el cromosoma X (Chung et al., 2004), se dejaron impresos sobre superficies de protaobjetos de vidrio hidrófobo utilizando una máquina de impresión de arrays Omni Grid 100 (BioRobotics). El espaciado medio entre las posiciones en el mapa lineal de esta colección 3K de clones BAC (calculada como la distancia entre las posiciones de los puntos medios de dos BACs consecutivos) es de aproximadamente 0,9 Mb (Chung et al., 2004). Para llevar a cabo la hibridación genómica comparativa de estos microarrays de BACs, se amplificó primero 1 \mug de DNA normal o tumoral y se marcó con aminoalil-dUTP (Sigma, St Louis, USA) utilizando el kit de iniciación al azar Bioprime (Gibco) y luego se sometieron a un marcaje adicional con ésteres de NHS monorreactiva y Cy3 o Cy5 (Amersham, Piscataway, NJ, EE.UU.). Muestras de DNA de 6 ratones C57BL/6J no tratados se mezclaron y se utilizaron como control normal. Las muestras tumorales de animales macho se hibridaron con mezclas de hembras y viceversa para tener un control interno de ganancias y pérdidas de DNA en los cromosomas X e Y. En todos los casos, 1 \mug de DNA tumoral amplificado y marcado y una cantidad igual de DNA control normal marcado de forma diferencial se mezclaron con 200 \mug de DNA Cot I (Gibco), disuelto en un tampón de hibridación basado en formamida que contenía formamida al 50%, SSC 2X, SDS al 2% y dextran-sulfato al 10%, desnaturalizado por calor y apareado a 37ºC para bloquear las repeticiones y luego hibridado con los arrays de BACs. La hibridación se llevó a cabo en un incubador con agitación a 37ºC durante 16-20 h. Los arrays se lavaron en SSC 2X, SDS 0,1% a 45ºC durante 60 min e inmediatamente se escanearon después de lavarlos con agua desionizada. Las imágenes de los arrays se cuantificaron utilizando el escáner de microarrays de DNA G2565BA (Agilent).

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- Análisis de pérdida de heterocigosidad

El análisis de LOH se llevó a cabo comparando patrones de electroforesis de DNA tumoral y control. Se utilizaron los siguientes marcadores del cromosoma 12 de acuerdo con las secuencias de las que se informa en la Base de Datos del Genoma de Ratón (Mouse Build 36, de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov): D12Mit136 (posición 30,8 Mb), D12Mit154 (39,8 Mb), D12Mit64 (51,5 Mb), D12Mitl10 (52,9 Mb), D12Mit4 (80,0 Mb), D12Mit239 (89,8 Mb), D12Mit132 (108,2 Mb), D12Mit122 (108,4 Mb), D12Mit53 (108,6 Mb), D12Mit123 (110,0 Mb), D12Mit240 (112,1 Mb), D 12Mit 18 (114,4 Mb), D 12Mit 150 (117,1 Mb) y D 12Mit 144 (120,2 Mb; todas las posiciones se refieren a la base de datos de NCBI M37; Abril 2007; ENSEMBL REL. 48, DEc. 2007), utilizando los cebadores de PCR de SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:31. Además, se utilizó un polimorfismo específico del gen Bcl11b en la posición 108,3 Mb (región amplificada mediante los cebadores de SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37), así como dos SNPs diferentes de esta región (rs3700933 y rs3683037), estos últimos amplificados mediante los cebadores de SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:35. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 3%, poliacrilamida al 10% para llevar a cabo un análisis de Polimorfismos Conformacionales de una Sola Cadena (SSCP).

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- Análisis de la expresión de microRNA y cDNA

Los perfiles de expresión de microRNAs se llevaron a cabo esencialmente tal como se ha descrito previamente (Liu et al., 2004). Brevemente, se utilizó Trizol (Invitrogen) para aislar RNA tumoral de los linfomas inducidos por radiaciones \gamma generados para el experimento de hibridación genómica comparativa (CGH) y se utilizaron 5 \mug de RNA para las hibridaciones. Los microarrays de microRNA se han descrito previamente (Volinia et al., 2006). Estos microarrays se hibridaron en SSPE 6x (NaCl 0,9 M/NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O 60 mM/EDTA 8 mM, pH 7,4)/formamida al 30% a 25ºC durante 18 h, se lavaron en 0,75x TNT (Tris\cdotHCl/NaCl/Tween 20) a 37ºC durante 40 min, y se procesaron utilizando un método de detección directa de los transcritos que contenían biotina mediante el conjugado estreptavidina-Alexa Fluor 647. Los portaobjetos procesados se escanearon utilizando un escáner de microarrays, con el equipo de láser a 635 nm, con un ajuste fijo del tubo fotomultiplicador (PMT), y una resolución de escaneo de 10 mm. La herramienta SAM (Statistical Analysis of Microarray: Análisis Estadístico del Microarray) incluida en el paquete TM4 (http://www.tm4.org/mev.html) se utilizó para analizar la significación estadística de los datos de expresión de microRNA.

Los experimentos de microarrays de cDNA se llevaron a cabo utilizando el RatonChip 23K (v3) del CNIO. Este chip contiene tanto los juegos de clones NIA15K como 7.4K del National Institute on Aging (Instituto Nacional del Envejecimiento) http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/cDNA.html, más 800 clones adicionales específicamente asociados con cáncer, angiogénesis, apoptosis, transducción de señales y procesos de estrés, obtenidos o de la colección Fantom1 (RIKEN) o del I.M.A.G.E. Consortium (Research Genetics, Huntsville, AL). Alrededor de 3.000 clones se duplicaron para alcanzar un total de 27.648 puntos, que incluían 166 puntos que contenían DNA no murino como controles negativos. El RNA total se extrajo por combinación del reactivo Trizol (Invitrogen) y purificación utilizando el kit RNeasy Protectt (Qiagen, Hilden). La calidad del RNA se evaluó utilizando el sistema BioAnalyzer (Agilent). 25 \mug de los RNAs de ensayo o de referencia se marcaron con Cy5 y Cy3 fluorescentes (Amhersam, Sunnyvale), respectivamente utilizando el kit SupertScript II Rnase H Reverse Transcriptase (Invitrogen, EE.UU.). Las hibridaciones se llevaron a cabo a 55ºC durante 17 h utilizando el tampón de hibridación para microarrays SlideHyb (Ambion). En todos los experimentos con microarrays, cada muestra se cohibridó con una mezcla de RNAs obtenidos del Universal Mouse RNA (Stratagene, La Jolla, CA), utilizado como referencia. Después de lavar, los portaobjetos se escanearon en un escáner G2565BA de Agilent. Las imágenes se analizaron luego con GenePix 5.1 (Axon Instruments, Inc., Union City, CA) y los softwares de TM4.

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- Análisis de metilación del DNA

Se diseñaron oligonucleótidos específicos utilizando el software MethPrimer (Li and Dahiya, 2002) para amplificar las regiones de los promotores correspondientes al miR-203, tanto de ratones (mmu-miR-203) como de seres humanos (hsa-miR-203), metilados y no metilados. Como control se realizó el mismo análisis en el miR-345 de ratón (mmu-miR-345). El análisis de la metilación de DNA mediante MS-PCR (PCR específica para metilación, en la que se amplifica específicamente DNA no metilado (U) o metilado (M) después del tratamiento con bisulfito, tratamiento frente al cual las citosinas metiladas están protegidas, mientras que las no metiladas se convierten en uracilos, detectables mediante PCR o secuenciación) o secuenciación mediante bisulfito se llevó a cabo esencialmente como ha sido descrito previamente (Saito et al., 2006). Brevemente, se modificó el DNA genómico (1 \mug) con bisulfito sódico tal como se ha comunicado previamente (Frommer et al., 1992). Después de la amplificación del DNA modificado con bisulfito, se analizaron los niveles de metilación secuenciando las regiones de los promotores modificadas mediante bisulfito.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los cebadores utilizados para la secuenciación mediante bisulfito (BS) o para la MS-PCR se muestran en la siguiente Tabla:

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TABLA 1 Oligonucleótidos utilizados para el análisis de la región situada corriente arriba respecto al miR-203 en muestras de ratones y seres humanos

3

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- Transducción de células con moléculas precursoras de miR-203

Las líneas T derivadas de leucemias Jurkat, MOLT-4, KARPAS-45, PEER y KCL-22, se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), mientras que la línea K562 se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC).. También se obtuvieron células T primarias adicionales de tumores (501T1, 3020201 y 220T), ALL de células B (06CG664, 06CG630 y 60344), CMLs (51226, 60514, 60515, 07CG1139, 07CG1187, 07CG1212, 07CG1257 y 08B0061), leucemias mieloides agudas (AMLs: 07B1590, 07CG1192 y 07CG1198) y enfermedades mieloproliferativas crónicas (CMPDs: 07CG1165, 07CG1155 y 07CG1197). Las células en cultivo se mantuvieron en crecimiento logarítmico en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, y 100 unidades/ml tanto de penicilina G como de estreptomicina. Para analizar el efecto de la desmetilación del DNA, las células se incubaron durante tres días con 1-5 \muM 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y/o ácido 4-fenilbutírico 1-3 mM (PBA; Sigma-Aldrich).

Para reexpresar miR-203 en células linfoides o mieloides, se utilizaron vectores retrovirales que expresaban GFP o puromicina y que contenían una región genómica de 479 pb (SEQ ID NO:3) alrededor del gen hsa-miR-203 bajo el control de los promotores CMV (vector retroviral pMSCV-203 (Fig. 5D), generado a partir del vector pMSCVpuro de Clontech) o MoMuLV (vector pBabe-puro-203 (Fig. 5E), generado a partir del vector pBabe-puro, el plásmido 1764 de Addgene) (para detalles sobre los vectores retrovirales, consultar http://www.addgene.org). Estos vectores se transfectaron en células 293T y los virus resultantes se incubaron en las células de leucemias. Así mismo, se transfectaron células leucémicas directamente con los vectores pMSCV-203 y pBabe-puro-203 mediante electroporación usando un nucleofector (Amaxa; http://www.amaxa.com). Tres días después de la infección o transfección, se aislaron células positivas para GFP mediante citometría (Becton-Dickinson) y las células seleccionadas se utilizaron para ensayos de proliferación celular o inmunoensayos sobre transferencias de lisados de proteínas.

- RNAs de interferencia contra ABL1

Se diseñaron cuatro oligonucleótidos diferentes para generar RNAs capaces de formar horquillas cortas (shRNAs) dirigidos a las secuencias de ABL1 que se indican en la siguiente tabla:

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TABLA 2 Secuencias de ABL1 a las que se dirigen los RNA de interferencia

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Estos oligonucleótidos se diseñaron para cubrir la secuencia diana, flanqueda por el promotor H1/u6 y un poliA tal como se ha hecho previamente en vectores pSuperRetro (Brummelkamp et al., 2002). El fragmento promotor H1/U6-diana-pA se subclonó en un vector pENTRY (Invitrogen) y luego se integró en la estructura del vector retroviral pSuperRetro.puro (OligoEngine) utilizando la recombinasa Clonase (Invitrogen) para generar cuatro vectores diferentes productores de shRNA contra diferentes dianas en el gen humano ABL1, que se designaron bajo la denominación genérica pA70-shRNA ABL (ver Fig. 7E).

- Análisis de proteínas y ensayos de luciferasa

Se obtuvieron lisados de proteínas de tejidos o células utilizando el tampón de lisis de células RIPA Cell Lysis buffer (NaCl 150 mM, Tris HCl 50 mM pH 8, Desoxiclorato sódico al 0,5%, dodecilsulfato sódico al 0,1% y Triton X-100 al 1%, EDTA 1 mM y EGTA 1 mM) y las cantidades recomendadas de cóctel de inhibidores de proteasas, cóctel 2 de inhibidores de fosfatasas (Sigma, St.Luis, Mo) y Benzonasa (Novagen, Darmstadt, Alemania). Las muestras se centrifugaron a 20.000 x g a 4ºC durante 15 minutos, y el sobrenadante se almacenó a -80ºC o se cuantificó de inmediato utilizando un ensayo de proteínas (Bio-Rad). Setenta \mug de lisados de proteínas se cargaron en geles de SDS-poliacrilamida al 8%. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA) y se ensayaron con anticuerpos para ABL1 (Calbiochem, Darmstadt, Alemania). Además, se utilizó como control de carga un anticuerpo anti-\alpha-tubulina (Sigma, St. Louis, MO). Después del lavado, las transferencias se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados acoplados a Alexa Fluor 680 y 800 nm (Invitrogen). Posteriormente, la membrana se escaneó en el Sistema de Obtención de Imágenes por Infrarrojos Odyssey (Li-Cor Biosciences).

Los constructos de la luciferasa se prepararon tras la amplificación de la 3'-UTR de ABL1 y su subclonaje en un vector pGL3-Control modificado (Promega). Se transfectaron células 293 o HeLa con 0,3 \mug del vector indicador con luciferasa de luciérnaga que contenía la 3'-UTR de ABL1 y 0,3 \mug del vector control pRL-CMV (Promega) que contenía la luciferasa de Renilla, utilizando Effectene (Qiagen). Para analizar el efecto de la expresión del microRNA en la señal de la luciferasa se utilizaron 3 \mug del vector retroviral pMSCV-203 o del vector pMSCV vacío (pMSCVpuro, de Clontech). Los ensayos de la luciferasa se llevaron a cabo 48 h después de la transfección utilizando el Sistema de Ensayo del Indicador Luciferasa Dual (Promega). La luciferasa de luciérnaga se normalizó con referencia a la actividad de la luciferasa de Renilla.

Ejemplo 1 Una región del cromosoma 12 del ratón se pierde frecuentemente en linfomas de células T irradiadas

Para identificar alteraciones en el número de copias de DNA a lo largo del genoma tumoral, se llevó a cabo hibridación genómica comparativa (CGH) de linfomas inducidos por radiaciones \gamma frente a tejidos de tipo silvestre de ratones C57BL/6J. Las pérdidas más consistentes se observaron en la región centromérica del cromosoma 11 (6 muestras; 50% de los tumores tratados con radiación \gamma) y el extremo telomérico del cromosoma 12 (5 tumores; 42%). El análisis por CGH de la región telomérica del cromosoma 12 (Fig. lA) no proporcionó suficiente resolución como para analizar posibles candidatos a genes supresores de tumores. Por ello, se realizó un análisis más fino de esta región utilizando el análisis específico de polimorfismos conformacionales específicos en una sola hebra (SSCP) en 44 muestras adicionales tumorales de ratones F1 generados por cruces entre ratones endogámicos puros C57BL/6J y RF/J. Estos estudios indicaron que el fragmento de DNA perdido con mayor frecuencia en estos tumores corresponde a la región cromosómica situada entre los marcadores D12Mit132 y D 12Mit 18 (posiciones 107.4 a 113.7 Mb del cromosoma 12; Fig. 1B y 1C). Esta región contiene aproximadamente 80 genes codificantes de proteínas, incluido Bcl11b, un candidato a potencial supresor de tumores en esta región (Wakabayashi et al., 2003).

De forma interesante, además de estos genes, esta región cromosómica contiene 52 microRNAs (véase la Fig. 1), que suponen aproximadamente un 12% de los microRNAs conocidos del genoma del ratón (depósito miRBase de Sanger, Salida 8.1; Mayo 2006) (Griffiths-Jones et al., 2006). Estos microRNAs incluyen varias agrupaciones localizadas en el locus callipyge, y otros microRNAs no agrupados.

Ejemplo 2 Alteraciones genéticas y epigenéticas de miR-203

Para analizar si alguno de estos miRNAs estaba silenciado en alteraciones malignas de células T, se llevaron a cabo estudios del perfil de expresión utilizando microarrays de miRNAs (Fig. 2). El análisis en condiciones de alta astringencia de estos linfomas de células T inducidos por radiación \gamma indicó que sólo uno de estos miRNAs, el denominado miR-203, está silenciado de forma significativa en linfomas de células T (FDR < 0,000; \Delta = 1,4).

Puesto que estos linfomas de células T murinas perdían la expresión de miR- 203, a pesar de mantener un alelo normal, se analizó si este miRNA podía estar silenciado mediante mecanismos epigenéticos. miR-203 presenta una isla CpG clara en la región cromosómica situada corriente arriba, similar a la presente en muchos genes supresores de tumores (Fig. 3A). Como control se utilizó miR-345, puesto que también presenta una isla CpG clara en su región cromosómica situada corriente arriba y ambos están localizados en la región del cromosoma 12 que está delecionada en este tipo de alteraciones malignas de células T. Después de modificar con bisulfito el DNA genómico de estas muestras, no se pudo detectar ninguna metilación en la isla CpG del miR-345, ni en linfocitos normales ni en muestras tumorales. De forma similar a lo que sucedía con miR-345, miR-203 no estaba metilado en absoluto en linfocitos normales. Sin embargo, estaba significativamente metilado en 7 de cada 8 muestras tumorales (Fig. 3A). El análisis detallado mediante secuenciación tras tratamiento con bisulfito indicó que la mayor parte de los dinucleótidos CpG de esta isla CpG estaban metilados en algunos tumores pero no en linfocitos normales (Fig. 3C).

Para ensayar si este silenciamiento epigenético de miR-203 también estaba presente en tumores humanos, se analizaron cuatro líneas celulares de tumores de células T humanas y cuatro de leucemias de células T: KARPAS-45 (ALL de células T, número de acceso ACC 105 en la colección de DSMZ), PEER (ALL de células T; número de acceso ACC 6 en la colección de DSMZ; porta el gen de fusión NUP214-ABL1), JURKAT (ALL de células T, número de acceso ACC 282 en la colección de DSMZ) y MoLT-4 (ALL de células T, número de acceso ACC 362). Como se muestra en la Fig. 3D, estos tumores contenían islas metiladas corriente arriba respecto al miR-203 humano, mientras que esta región no estaba metilada en linfocitos T humanos normales.

Ejemplo 3 miR-203 regula directamente la expresión de ABL1

La predicción por ordenador de las dianas del miRNA tanto humano como de ratón (TARGETSCANS y PICTAR; revisado en (Rajewsky, 2006)) sugiere que miR-203 puede modular más de 300 genes. Para seleccionar con más detalle una diana funcional de miR-203, se llevó a cabo un análisis masivo de la expresión de mRNA de estos linfomas de células T con miR-203 silenciado para identificar posibles dianas reguladas al alza en estos tumores. Veintidós de las posibles dianas de miR-203 estaban sobreexpresadas de forma significativa en estos linfomas de células T (Fig. 4A), incluido el homólogo murino de ABL1, un conocido oncogén de alteraciones malignas hematopoyéticas (Ren, 2005). De hecho, Abl1 está sobreexpresado en estos tumores de células T tal como se detecta mediante análisis de proteínas (Fig. 4B), lo que indica que hay una correlación entre la sobreexpresión de Abl1 y la pérdida de miR-203 en estas células tumorales. Las 3'-UTR de los genes ABL1 tanto humano como murino contienen secuencias diana para miR-203 con una energía libre calculada por ordenador de -28,8 kcal/mol y -21,0 kcal/mol, respectivamente (Fig. 4C). Una región que permite el apareamiento con la porción 5' del microRNA está conservada en la secuencia 3'-UTR de estos organismos así como en otros vertebrados, lo que sugiere que miR-203 puede controlar los niveles de ABL1 en diversos organismos.

Para validar experimentalmente que miR-203 tiene como diana ABL1, se analizaron los niveles de proteína ABL1 en líneas celulares de tumores de células T humanas después de la reexpresión de miR-203. Se infectaron células KARPAS-45 o PEER -que contienen ambas un promotor de miR-203 metilado (véase la Fig. 3)- con vectores retrovirales que expresaban GFP o co-expresaban GFP y miR-203 (Fig. 5). Se aislaron células positivas para GFP por citometría y se analizaron mediante inmunotransferencia. Tal como se indica en la Fig. 5B, la reexpresión de miR-203 da como resultado un crecimiento decelarado comparado con las células control infectadas con el retrovirus vacío, siendo la decelaración del crecimiento similar en las células infectadas con vectores retrovirales productores de RNAs dirigidos contra el gen ABL1 humano y que daban lugar a horquillas cortas (shRNA: short hairpin RNA). Esta respuesta antiproliferativa está acompañada de una dramática reducción (de aproximadamente 70%) en los niveles de ABL1 en estos linfocitos tumorales en ambas líneas celulares, PEER (no mostrado) y KARPAs-45 (Fig. 5A).

Finalmente, para analizar si miR-203 tiene a ABL1 como diana de forma directa tal como se predijo mediante el alineamiento, se subclonó la 3'UTR de ABL1 en un vector, pG-ABL1, colocando la UTR corriente abajo con respecto al gen indicador portado por el vector, el de la luciferasa. La región 3'UTR se amplificó utilizando como cebadores los oligonucleótidos de H-ABL1-3UTR-2F (SEQ ID NO:58) y H-ABL1-3UTR-WT-2R (SEQ ID NO:59).

En células 293 cotransfectadas con pG-ABL1 y un plásmido que expresaba miR-203 o GFP, se observa que miR-203, pero no GFP, es capaz de reducir la actividad de la luciferasa de este constructo en un 30% (Fig. 5C), lo que indica que este microRNA puede tener como diana la 3'-UTR de forma directa.

Esta reducción se ve abolida mediante una 3'-UTR que contiene mutaciones específicas en la región semilla de la secuencia diana de miR-203 (parte derecha de la Fig. 5C). Los experimentos realizados con el plásmido que contiene dicha 3'-UTR mutada, pG-ABL1^{mut}, amplificada mediante el cebador inverso H-ABL1-3UTR-MT-2R (SEQ ID NO:60), indican que miR-203 puede influir de forma directa sobre los niveles de la proteína ABL1 a través de la unión específica a su 3'-UTR.

Ejemplo 4 Modulación de la expresión de ABL1 y BCR-ABL1 mediante miR-203 y drogas epigenéticas

Para investigar con más detalle la relevancia de miR-203 en la actividad oncogénica de ABL1, analizamos a continuación el silenciamiento epigenético de miR-203 en tumores humanos que portan un cromosoma Philadelphia (Ph). Esta alteración produce una proteína de fusión BCR-ABL1 que dirige el desarrollo de tumores en varias alteraciones malignas, incluidas algunas leucemias linfoblásticas agudas de células B (ALL de células B) en niños y leucemias mielogénicas crónicas (CML). Como se indica en la Fig. 6, la región situada corriente arriba respecto al miR-203 humano está altamente hipermetilada en la mayor parte de los tumores positivos para Ph, incluidas las ALL de células B y tanto las CML primarias como las líneas celulares en cultivo de CML. Sin embargo, esta región no está metilada en leucemias que no portan el chromosoma Philadelphia (Ph-) como leucemias mieloides agudas (AML) u otras enfermedades mieloproliferativas crónicas (CMPDs) (Fig. 6), mostrando una especificidad en la inactivación de miR-203 en los tumores Ph+.

Tal como puede observarse en la Fig. 7, la reintroducción de miR-203 en la línea celular de CML K562 (número de acceso en la Colección Americana de Cultivos Tipo CCL-243) da como resultado la restauración de la expresión de miR-203 y la reducción simultánea de los niveles de la proteína ABL1. Esta línea celular también expresaba la proteína de fusión BCR-ABL1 que resulta de la traslocación del cromosoma Philadelphia. Es interesante que la reexpresión de miR-203 también da como resultado niveles reducidos de BCR-ABL1 (Fig. 7A), probablemente debido a la presencia de la 3'-UTR de ABL1 en el transcrito de la fusión BCR-ABL1. Esta reducción en los niveles de las proteínas ABL1 y BCR-ABL1 está acompañada por una disminución significativa de la tasa de proliferación de estas células de CML (Fig. 7B).

Puesto que la metilación del promotor se puede revertir utilizando drogas epigenéticas específicas, se trataron dos líneas celulares de CML positivas para Ph, K562 y KCL-22 (número de acceso en la DSMZ ACC 519), con una mezcla de 5-azacitidina (Aza) y forbol (PBA). Tal como se indica en la Fig. 8, este tratamiento da como resultado una desmetilación parcial pero eficaz de la región situada corriente arriba respecto a miR-203 que restaura la expresión de miR-203. La reexpresión de este miRNA está estrechamente correlacionada con una reducción significativa de los niveles de las proteínas tanto ABL 1 como BCR-ABL 1 (Fig. 8B), lo que sugiere que las drogas epigenéticas puede restaurar la función del miRNA y bloquear la expresión de oncogenes.

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<120> USO DEL MICRORNA-203 Y DE SISTEMAS DE EXPRESIÓN DEL MISMO PARA FABRICAR MEDICAMENTOS CONTRA EL CÁNCER

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> P-100663

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<160> 60

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

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<212> RNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> bucle_horquilla

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(110)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Bucle de horquilla origen del microRNA-203 humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_ miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucléotidos 109 a 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con el nucleótido 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con el nucleótido 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucleótidos 98 a 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucleótidos 97 a 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucleótidos 84 a 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucleótidos 74 a 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)..(45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucleótidos 69 a 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47)..(51)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con los nucleótidos 65 a 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52)..(52)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con el nucleótido 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (55)..(55)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Apareamiento interno con el nucleótido 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> RNA_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (65)..(86)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> microRNA-203 humano maduro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> RNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> RNA_misceláneo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MicroRNA-203 humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 479

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (169)..(278)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región que da lugar al pre-miRNA203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (233)..(254)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región cuya secuencia se corresponde con la del miRNA-203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit132

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCT para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCT para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: Marcador D12Mit53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12mit123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12mit123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit150

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: marcador D12Mit150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: SNP rs3700933

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: SNP rs3700933

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: SNP rs3683037

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: SNP rs3683037

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de PCR para análisis de heterocigosidad: polimorfismo Bcl11b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de PCR para análisis de heterocigosidad: polimorfismo Bcl11b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de secuenciación mediante bisulfito del locus mmu-miR-203: mmu-mir-203.F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de secuenciación mediante bisulfito del locus mmu-miR-203: mmu-mir-203.R2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de MS-PCR para DNA no metilado del locus mmu-miR-203: mmu-mir-203.UF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA no metilado del locus mmu-miR-203: mmu-mir-203.UR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de MS-PCR para DNA metilado del locus mmu-miR-203: mmu-mir-203.MF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA metilado del locus mmu-miR-203: mmu-mir-203.MR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de secuenciación mediante bisulfito del locus hsa-miR-203: hsa-mir-203.F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial; BS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de secuenciación mediante bisulfito del locus hsa-miR-203: hsa-mir-203.R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de MS-PCR para DNA no metilado del locus hsa-miR-203: mmu-mir-203.UF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA no metilado del locus hsa-miR-203: mmu-mir-203.UR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de MS-PCR para DNA metilado del locus hsa-miR-203: mmu-mir-203.MF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA metilado del locus hsa-miR-203: mmu-mir-203.MR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA no metilado del locus mmu-miR-345: mmu-mir-345.UF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA no metilado del locus mmu-miR-345: mmu-mir-345.UR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo de MS-PCR para DNA metilado del locus mmu-miR-345: mmu-mir-345.MF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm650

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso de MS-PCR para DNA metilado del locus mmu-miR-345: mmu-mir-345.MR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana del shRNA Hs_ABL1.136: con inicio en el nucleótido 136 del tránscrito de referencia NM_005157. 3; ENST00000318560

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana del shRNA Hs_ABL1.263 Con inicio en el nucleótido 263 del tránscrito de referencia
NM_005157.3; ENST00000318560

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana del shRNA Hs_ABL1.1486: Con inicio en el nucleótido 1486 del transcrito de referencia
NM_005157.3; ENST00000318560

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana del shRNA Hs_ABL1.3369: con inicio en el nucleótido 3369 del transcrito de referencia
NM_005157.3; ENST00000318560

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo para la amplificación de la región UTR de 3' del gen humano ABL1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador inverso para la amplificación de la región UTR de 3' del gen humano ABL1

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<400> 59

\hskip1cm72

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<210> 60

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<211> 37

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso para la amplificación de la región UTR de 3' mutada del gen humano ABL1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm73

Claims

1. Uso del microRNA-203 (SEQ ID NO:2) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en seres humanos.

2. Uso de un sistema de transcripción de un fragmento de DNA cuya transcripción da lugar a una molécula de RNA que comprende la secuencia del microRNA-203 maduro (SEQ ID NO:2) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en seres humanos.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que la transcripción del fragmento de DNA da lugar a una molécula de RNA que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que el fragmento de DNA está representado por SEQ ID NO:3.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el fragmento de DNA que contiene la secuencia del microRNA-203 está unido de forma operativa a un promotor que permite la transcripción del fragmento de DNA en células de mamífero.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que el promotor se selecciona de entre los promotores CMV, MSCV o MoMuLV.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el sistema de transcripción es un plásmido.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el plásmido es un vector retroviral.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la secuencia a transcribir está insertada en el plásmido bajo el control del promotor CMV o MoMuLV.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que la secuencia a transcribir insertada en el vector retroviral es la representada por SEQ ID NO:3.

11. Uso según la reivindicación 10, en la que el plásmido es pMSCV-203 o pBABE-puro-203.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el sistema de transcripción está basado en un virus.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que el virus es un retrovirus recombinante.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es para el tratamiento de una alteración maligna hematopoyética.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que las células malignas hematopoyéticas sobreexpresan el gen ABL1.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la alteración maligna hematopoyética es un linfoma de células T o una leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL).

17. Uso según la reivindicación 14, en el que las células malignas hematopoyéticas poseen un gen híbrido del que forma parte el gen ABL1.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que el gen híbrido es BCR-ABL1.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que la alteración maligna hematopoyética es CML, ALL ó ANLL.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que la alteración maligna hematopoyética es ALL de células B.

21. Uso según la reivindicación 19, en el que la ANLL es M1 ó M2.

22. Uso según la reivindicación 19, en el que la alteración maligna hematopoyética es CML.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la CML es resistente al tratamiento con mesilato de imanitib.

24. Uso según la reivindicación 17, en el que el gen híbrido es NUP-ABL1.

25. Uso según la reivindicación 19, en el que la alteración maligna hematopoyética es ALL de células T.