ES2325820T3 - Gen del sindrome qt largo que codifica kvlqt1 y su asociacion con mink. - Google Patents

Abstract

UN ASPECTO DE LA INVENCION SE REFIERE A LA IDENTIFICACION DE LA BASE MOLECULAR DEL SINDROME QT LARGO. MAS ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION HA IDENTIFICADO QUE KVLQT1 MUTADO CAUSA EL SINDROME QT LARGO. EL ANALISIS DE ESTE GEN PROPORCIONARA UN DIAGNOSTICO PRECOZ DE SUJETOS CON SINDROME QT LARGO. LOS METODOS DE DIAGNOSTICO COMPRENDEN EL ANALISIS DE LA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO DEL GEN KVLQT1 DE UN INDIVIDUO A ENSAYAR Y SU COMPARACION CON LA SECUENCIA AMINOACIDICA DEL GEN NATIVO NO VARIANTE. ALTERNATIVAMENTE, LA SECUENCIA AMINOACIDICA DE KVLQT1 PUEDE ANALIZARSE PARA MUTACIONES QUE CAUSAN EL SINDROME QT LARGO. EL DIAGNOSTICO PRESINTOMATICO DEL SINDROME QT LARGO PERMITIRA A LOS MEDICOS TRATAR ESTE TRASTORNO EMPLEANDO LA TERAPIA MEDICA REALMENTE EXISTENTE. UN SEGUNDO ASPECTO DE LA INVENCION SE REFIERE AL HECHO DE QUE KVLQT1 SE COENSAMBLA CON MINK PARA FORMAR UN CANAL DE POTASIO CARDIACO. ESTO PERMITE EL ENSAYO CON FARMACOS QUE INTERACCIONAN CON ESTE CANAL PARA IDENTIFICAR NUEVOS FARMACOS QUE SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DEL QT LARGO.

Description

Gen del síndrome QT largo que codifica KVLQT1 y su asociación con minK.

Antecedentes de la invención

La presente invención describe un gen y productos génicos asociados con el síndrome de QT largo (LQT) y se refiere a un proceso para la evaluación del riesgo para LTQ. El LQT se diagnostica analizando la secuencia de ADN del gen KVLQT1 de un individuo a ensayar y comparando la respectiva secuencia de ADN con la secuencia conocida de ADN de un gen KVLQT1 normal. Alternativamente, se puede explorar el gen KVLQT1 de un individuo a ensayar para mutaciones que provocan LQT. La predicción de LQT permitirá a los médicos prevenir este trastorno usando terapia médica existente. Adicionalmente se describe el descubrimiento de que las proteínas KVLQT1 y minK se coensamblan para formar un canal cardiaco de potasio I_{Ks}. Este conocimiento se puede usar para coexpresar estas dos proteínas en una célula y una célula transformada de este tipo se puede usar para la selección de fármacos que serán útiles para tratar o prevenir LQT.

Las arritmias cardiacas son una causa común de morbilidad y mortalidad, que explican aproximadamente el 11% de todas las muertes naturales (Kannel, 1987; Willich et al., 1987). En general, el diagnóstico presintomático y tratamiento de individuos con taquiarritmias ventriculares con peligro para la vida es malo y, en algunos casos, el tratamiento médico en realidad aumenta el riesgo de arritmia y muerte (New Engl. J. Med. 327, 227 (1992)). Estos factores hacen de la detección temprana de individuos con riesgo de arritmias cardiacas y la prevención de arritmias grandes prioridades.

Al riesgo de desarrollar arritmias cardiacas contribuyen factores tanto genéticos como adquiridos. El síndrome de QT largo (LQT) es una arritmia cardiaca hereditaria que provoca la pérdida repentina de consciencia, síncope, ataques y muerte súbita por taquiarritmias ventriculares, específicamente torsade de pointes y fibrilación ventricular (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975; Moss et al., 1991). Este trastorno se presenta habitualmente en individuos jóvenes, por lo demás sanos (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz, 1975). La mayoría de los portadores del gen de LQT manifiestan prolongación del intervalo QT en electrocardiogramas, un signo de repolarización cardiaca anormal (Vincent et al., 1992). Las características clínicas de LQT se producen por arritmias cardiacas episódicas, específicamente taquiarritmias ventriculares relacionadas con repolarización como torsade de pointes, denominadas por la naturaleza ondulante característica del electrocardiograma en esta arritmia y fibrilación ventricular (Schwartz et al., 1975; Moss y McDonald, 1970). La torsade de pointes puede degenerar en fibrilación ventricular, una arritmia particularmente mortal. Aunque el LQT no es un diagnóstico común, las arritmias ventriculares son muy comunes; más de 300.000 ciudadanos de los Estados Unidos mueren cada año súbitamente (Kannel, et al., 1987; Willich et al., 1987) y, en muchos casos, el mecanismo subyacente puede ser repolarización cardiaca aberrante. Por lo tanto, el LQT proporciona una oportunidad única para estudiar a nivel molecular arritmias cardiacas con peligro para la vida.

Se han definido las formas tanto hereditarias como adquiridas de LQT. El LQT adquirido y las arritmias secundarias pueden producirse por isquemia cardiaca, bradicardia y anormalidades metabólicas tales como baja concentración sérica de potasio o calcio (Zipes, 1987). El LQT también se puede producir por el tratamiento con determinadas medicaciones, incluyendo antibióticos, antihistamínicos, anestésicos generales y, mucho más comúnmente, medicaciones antiarrítmicas (Zipes, 1987). Las formas hereditarias de LQT se pueden producir por mutaciones en al menos tres genes diferentes. En estudios previos, los loci de LQT se mapearon en el cromosoma 11p15.5 (LQT1) (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), 7q35-36 (LQT2) y 3p21-24 (LQT3) (Jiang et al., 1994). De éstos, la causa más común de LQT hereditario es LQT1. Los datos indican que las mutaciones en este gen son responsables de más del 50% de LQT hereditario (Q. Wang, resultados no publicados). Recientemente, un cuarto locus de LQT (LQT4) se ha mapeado en 4q25-27 (Schott et al., 1995). El presente trabajo indica que minK, un gen localizado en el cromosoma 21, también está implicado en LQT.

Se han descrito formas autosómicas dominantes y autosómicas recesivas de este trastorno. El LQT autosómico recesivo (también conocido como síndrome de Jervell-Lange-Nielson) se ha asociado con sordera neural congénita; esta forma de LQT es rara (Jervell y Lange-Nielson, 1957). El LQT autosómico dominante (síndrome de Romano-Ward) es más común y no está asociado con otras anormalidades fenotípicas. Un trastorno muy similar a LQT hereditario también puede ser adquirido, habitualmente como resultado de terapia farmacológica (Schwartz et al., 1975; Zipes, 1987).

Los datos tienen implicaciones para el mecanismo de arritmias en LQT. Previamente se han propuesto dos hipótesis para LQT (Schwartz et al., 1994). Una sugiere que una predominancia de inervación autónoma izquierda provoca repolarización cardiaca anormal y arritmias. Esta hipótesis está respaldada por la observación de que se pueden inducir arritmias en perros por la eliminación del ganglio estrellado derecho. Adicionalmente, indicios anecdóticos sugieren que algunos pacientes con LQT se tratan de forma eficaz con agentes bloqueantes \beta-adrenérgicos y por ganglioectomía de estrellado izquierdo (Schwartz et al., 1994). La segunda hipótesis para arritmias relacionadas con LQT sugiere que mutaciones en genes de canal iónico específico de corazón o genes que modulan canales iónicos cardiacos provocan repolarización miocelular retardada. La repolarización miocelular retardada podría promover la reactivación de canales de calcio de tipo L, dando como resultado despolarizaciones secundarias (January y Riddle, 1989). Estas despolarizaciones secundarias son el mecanismo celular probable de arritmias de torsade de pointes (Surawicz, 1989). Esta hipótesis está respaldada por la observación de que el bloqueo farmacológico de canales de potasio puede inducir la prolongación de QT y arritmias relacionadas con repolarización en modelos humanos y animales (Antzelevitch y Sicouri, 1994). El descubrimiento de que una forma de LQT se produce por mutaciones en un gen de canal cardiaco de potasio respalda la hipótesis miocelular.

En 1991 se describió el ligamiento completo entre LQT autosómico dominante y un polimorfismo en HRAS (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). Este descubrimiento localizó LQT1 en el cromosoma 11p15.5 e hizo posible el diagnóstico presintomático en algunas familias. Previamente se pensaba que el LQT autosómico dominante era genéticamente homogéneo y las primeras siete familias que se estudiaron se ligaron a 11p15.5 (Keating et al., 1991b). En 1993 se observó que existía heterogeneidad de locus para LQT (Benhorin et al, 1993; Curran et al., 1993; Towbin et al., 1994). Posteriormente se identificaron dos loci adicionales de LQT, LQT2 en el cromosoma 7q35-36 (nueve familias) y LQT3 en 3p21-24 (tres familias) (Jiang et al., 1994). Varias familias permanecen no ligadas a los loci conocidos, indicando heterogeneidad de locus adicional para LQT. Este grado de heterogeneidad sugiere que distintos genes de LQT pueden codificar proteínas que interaccionan para modular la repolarización cardiaca y el riesgo de arritmia.

Aunque se conoce poco acerca de la fisiología de LQT, el trastorno está asociado con prolongación del intervalo QT en electrocardiogramas, un signo de repolarización cardiaca anormal. Esta asociación sugiere que genes que codifican canales iónicos, o sus moduladores, son candidatos razonables para LQT. HRAS, que se localizó en el cromosoma 11p15.5, se excluyó como un candidato para LQT1 basándose en análisis directos de secuencia de ADN (observaciones no publicadas) y por análisis de ligamiento (Roy et al., 1994). Un gen de canal de calcio neuroendocrino (CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) y un gen que codifica una proteína de unión a GTP que modula los canales de potasio (GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992) se convirtieron en candidatos para LQT3 basándose en su localización cromosómica. Sin embargo, los análisis de ligamiento posteriores han excluido estos genes (Wang y Keating, datos no publicados). Un canal de cloro de músculo esquelético (CLCN1; Koch et al., 1992) y un receptor muscarínico de acetilcolina cardiaco (CHRM2; Bonner et al., 1987) se convirtieron en candidatos para LQT2 basándose en su localización en el cromosoma 7q35-36, pero los análisis de ligamiento posteriores han excluido estos genes (Wang et al., presentado).

En teoría, las mutaciones en un gen de canal cardiaco de sodio podrían provocar LQT. Los canales de sodio regulados por voltaje median en la despolarización rápida en miocitos ventriculares y también conducen una pequeña corriente durante la fase de meseta del potencial de acción (Attwell et al., 1979). Las anormalidades sutiles de la función del canal de sodio (por ejemplo, inactivación retardada del canal de sodio o dependencia de voltaje alterada de la inactivación del canal) podrían retardar la repolarización cardiaca, conduciendo a prolongación de QT y arritmias. En 1992, Gellens y colaboradores clonaron y caracterizaron un gen de canal cardiaco de sodio, SCN5A (Gellens et al., 1992). La estructura de este gen era similar a los demás canales de sodio caracterizados previamente, codificando una gran proteína de 2016 aminoácidos. Estas proteínas de canal contienen cuatro dominios homólogos (DI-DIV), que contienen cada uno seis supuestos segmentos transmembrana (S1-S6). SCN5A se ha mapeado recientemente en el cromosoma 3p21, convirtiendo el mismo en un excelente gen candidato para LQT3 (George et al., 1995) y después se probó que este gen está asociado con LQT3 (Wang et al., 1995a).

En 1994, Warmke y Ganetzky identificaron un ADNc humano novedoso, gen relacionado con éter a-go-go humano (HERG, Warmke y Ganetzky, 1994). HERG se localizó en el cromosoma humano 7 por análisis por PCR de un panel híbrido de células somáticas (Warmke y Ganetzky, 1994) convirtiendo el mismo en un candidato para LQT2. La función de la proteína codificada por HERG no se conoce, pero tiene una homología predicha de secuencia de aminoácidos con canales de potasio. HERG se aisló de una genoteca de ADNc de hipocampo por homología con el gen éter a-go-go (eag) de Drosophila, que codifica un canal de potasio modulado por calcio (Bruggeman et al., 1993). HERG no es el homólogo humano de eag, sin embargo, solamente comparte \sim50% de homología de secuencia de aminoácidos. Se ha demostrado que HERG está asociado con LQT2 (Curran et al., 1995).

Ahora se ha descubierto un gen de canal de potasio novedoso que se denomina KVLQT1. En este documento se presentan datos que indican que KVLQT1 es LQT1. Se identificaron y caracterizaron dieciséis familias con mutaciones en KVLQT1 y se demostró que en las dieciséis familias había un ligamiento completo entre LQT1 y KVLQT1. KVLQT1 se mapeó en el cromosoma 11p15.5 convirtiendo el mismo en un gen candidato para LQT1. KVLQT1 codifica una proteína con características estructurales de canales de potasio y la expresión del gen como se mide por análisis de transferencia de Northern demostró que KVLQT1 se expresa con mayor intensidad en el corazón. En KVLQT1 se identificaron una deleción intragénica y diez mutaciones diferentes de sentido erróneo que provocan LQT. Estos datos definen KVLQT1 como un gen novedoso de canal cardiaco de potasio y muestran que las mutaciones en este gen provocan susceptibilidad a taquiarritmias ventriculares y muerte súbita.

Se conoce que un componente del canal I_{Ks} es minK, una proteína de 130 aminoácidos con un único supuesto dominio transmembrana (Takumi et al., 1988; Goldstein y Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang y Goldstein, 1995; Wang et al., 1996). El tamaño y la estructura de esta proteína hacen que sea improbable que minK sola forme canales funcionales (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993). Se presentan indicios de que KVLQT1 y minK se coensamblan para formar el canal cardiaco de potasio I_{Ks}. La disfunción de I_{Ks} es una causa de arritmia cardiaca.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a un método para evaluar el riesgo en un sujeto humano para síndrome de QT largo de acuerdo con las reivindicaciones 1-4. La base molecular del síndrome de QT largo está demostrada. Más específicamente, la presente invención ha determinado que variantes moleculares del gen KVLQT1 provocan o están implicados en la patogenia de LQT. Los análisis genotípicos muestran que KVLQT1 está ligado completamente a LQT1 en dieciséis familias no relacionadas. El análisis del gen KVLQT1 proporcionará un diagnóstico temprano de sujetos con LQT. El método de diagnóstico comprende analizar la secuencia de ADN del gen KVLQT1 de un individuo a ensayar y comparar la misma con la secuencia de ADN del gen nativo, no variante. En una segunda realización, el gen KVLQT1 de un individuo a ensayar se explora para mutaciones que provocan LQT. La capacidad de predecir LQT permitirá a los médicos prevenir la enfermedad con terapia médica tal como agentes beta bloqueantes.

Se ha demostrado adicionalmente que KVLQT1 y minK se coensamblan para formar un canal cardiaco de potasio I_{Ks}. La disfunción de I_{Ks} es una causa de arritmia cardiaca. El conocimiento de que estas dos proteínas se coensamblan para formar el canal I_{Ks} es útil para desarrollar un ensayo para seleccionar fármacos que sean útiles para tratar o prevenir LQT1. Coexpresando ambos genes en una célula tal como un ovocito es posible seleccionar fármacos que tengan un efecto sobre el canal I_{Ks} en sus formas tanto de tipo silvestre como mutadas. Este conocimiento también es útil para el análisis del gen minK para un diagnóstico temprano de sujetos con LQT. Los métodos de diagnóstico se realizan como se ha señalado anteriormente para KVLQT1.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructura del árbol genealógico para una porción del tronco familiar 1523 con LQT. Los individuos afectados se muestran como círculos (mujeres) o cuadrados (hombres) rellenos, los individuos no afectados como símbolos vacíos y los individuos con fenotipos equívocos con un punteado. Los genotipos para marcadores del cromosoma 11 se indican debajo de cada símbolo y se muestran como haplotipos. El orden de marcador (de parte superior a inferior) es: Tel-HRAS-D11S922-TH-D11S1318-D11S454-D11S860-D11S12-Cen. La precisión de los haplotipos se garantizó usando genotipos de marcadores adicionales del cromosoma 11p15.5 (Q. Wang, resultados no publicados). Los genotipos inferidos se muestran entre paréntesis. Los cromosomas de enfermedad se indican por casillas y los acontecimientos de recombinación se indican con líneas horizontales continuas. Los acontecimientos de recombinación que afectan a cromosomas de enfermedad se presentan en los individuos: IV-22, IV-25, V-6, V-17, V-24, V-34, VI-13, VI-14 y VI-16. No se indican los acontecimientos de recombinación que se presentan en cromosomas que no son de enfermedad. KVLQT1 es un confórmero de SSCP dentro de KVLQT1 identificado por los cebadores 5 y 6; este confórmero solamente se identificó en K1532 y representa una mutación asociada con enfermedad (el alelo 2 es el alelo mutante). Los análisis de haplotipo indican que KVLQT1 se localiza entre los marcadores flanqueantes D11S922 y D11S454.

Figura 2. Mapa físico de la región de LQT1. Ideograma de cromosoma 11 indica la localización aproximada de LQT1 (11p15.5). La localización de marcadores polimórficos y algunos cósmidos se indica por líneas verticales en el mapa. El mapeo genético refinado coloca LQT1 entre TH y D11S454. Se estimó la distancia entre TH y D11S454 por análisis en gel de campo pulsado como <700 kb. Se muestra un mapa físico del ajuste mínimo de clones YAC y P1 solapantes. Se indican las localizaciones del ADNc de KVLQT1 y exones capturados. Las líneas discontinuas en YAC indican quimerismo.

Figuras 3A y 3B. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de KVLQT1 (no incluyen la región que codifica los primeros 34 aminoácidos). (A) Se muestra la secuencia compuesta de KVLQT1. La secuencia de nucleótidos es la SEC ID Nº: 15. La secuencia de aminoácidos es la SEC ID Nº: 16. Se indican seis supuestos segmentos transmembrana (de S1 a S6) y una supuesta región de poro (Poro). Un sitio potencial de glucosilación (N160) se pone en cursiva. Se indican en negrita dos señales consenso de poliadenilación en la región no traducida 3'. Las secuencias compuestas de ADNc para KVLQT1 se obtuvieron por secuenciación de extremos de clones de ADNc solapantes y por paseo con cebador. A las secuencias de KVLQT1 se ha asignado el número de acceso de GenBank U40990. (B) Alineamiento de la región S1-S6 de KVLQT1 con canal de potasio Shaker de Drosophila, DMSHAKE1 (SHA) (Pongs et al., 1988). Se indican la identidad (I) y similitud (:). Los 3 fragmentos separados de KVLQT1 son en orden: SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18 y SEC ID Nº: 19. Los 3 fragmentos separados de DMSHAKE1 son en orden: SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21 y SEC ID Nº: 22.

Figura 4. Patrón de expresión tisular de KVLQT1. Los análisis de Northern mostraron un ARNm de KVLQT1 de 3,2 kb en riñón, pulmón, placenta y corazón humanos con niveles máximos en el corazón.

Figuras 5A-5D. Las mutaciones de sentido erróneo de KVLQT1 cosegregan con LQT en los troncos familiares K1532 (Figura 5A), K2605 (Figura 5B), K1723 (Figura 5C) y K1807 (Figura D). Los resultados de análisis de SSCP con el par de cebadores 5-6 (K1532), par de cebadores 9-10 (K1723, K1807) y par de cebadores 11-12 (K2605) se muestran debajo de cada árbol genealógico. Los confórmeros aberrantes de SSCP (indicados por *) cosegregan con LQT en cada tronco familiar. Para K1532, solamente se muestran ocho de los 217 individuos; los resultados de los análisis de SSCP en miembros adicionales de K1532 se muestran en la Figura 1 (alelo 2 de KVLQT1). Debido a que los confórmeros aberrantes de SSCP que cosegregan con LQT en K161 y K162 eran idénticos al confórmero aberrante definido en K1807, no se muestran los resultados para estos troncos familiares. Los resultados de análisis de secuencia de
ADN de los confórmeros normales (izquierda) y aberrantes (derecha) se muestran debajo de cada árbol genealógico.

Figuras 6A-6G. Deleciones intragénicas y mutaciones de sentido erróneo de KVLQT1 asociadas con LQT en los troncos familiares K13216 (Figura 6A), K1777 (Figura 6B), K20925 (Figura 6C), K2557 (Figura 6D), K13119 (Figura 6E), K20926 (Figura 6F) y K15019 (Figura 6G). Los resultados de análisis de SSCP con el par de cebadores 1-2 (K13216, K2557, K13119, K15019), par de cebadores 7-8 (K1777, K20926) y par de cebadores 9-10 (K20295) se muestran debajo de cada árbol genealógico. Debido a que los confórmeros aberrantes de SSCP que cosegregan con LQT en K2050, K163 y K164 eran idénticos a los confórmeros aberrantes definidos en K1723 y K1807, no se muestran los resultados para estos troncos familiares. Los resultados de los análisis de secuencia de ADN de los confórmeros normales (izquierda) y aberrantes (derecha) se muestran debajo de cada árbol genealógico. Las secuencias mostradas son en la cadena antisentido.

Figura 7. Representación esquemática de la topología predicha de la proteína KVLQT1 y localización de mutaciones de KVLQT1.

Figuras 8A y 8B. Estructura de KVLQT1 humano y de Xenopus y patrón de expresión tisular de KVLQT1 humano. A) Comparación de secuencia de aminoácidos de KVLQT1 humano y una parcial de Xenopus. Las líneas verticales indican restos idénticos. La secuencia de aminoácidos de Xenopus es la SEC ID Nº: 23 y la secuencia de aminoácidos humana es la SEC ID Nº: 24. B) Análisis de Northern que indica la expresión de KVLQT1 en corazón, placenta, pulmón, riñón y páncreas humanos.

Figuras 9A-9E. Coexpresión de KVLQT1 y hminK en células CHO induce una corriente prácticamente idéntica a I_{Ks} cardiaca. A) Corrientes de KVLQT1 registradas durante pulsos de despolarización de 1 s a potenciales de membrana de -50 a +40 mV, aplicados a partir de un potencial basal de -80 mV. Las corrientes de cola se midieron a -70 mV. B) Curvas de activación isocrónica normalizadas para células transfectadas con KVLQT1 (n = 6; pulsos de 1 s) o KVLQT1 y hminK (n = 7; pulsos de 7,5 s). C-E) Corrientes registradas durante pulsos de 7,5 s a -40, -20, -10, 0, +20 y +40 mV en células transfectadas con hminK (C), KVLQT1 (D) o KVLQT1 y hminK (E). Las corrientes de cola se midieron a -70 mV en D y a -50 mV en C y E. La amplitud de corriente de KVLQT1 de estado de equilibrio a +40 mV fue 0,37 \pm 0,14 nA (n = 6). En células cotransfectadas con KVLQT1 y hminK, la corriente dependiente del tiempo durante un pulso de 7,5 s a +40 mV fue 1,62 \pm 0,39 nA (n = 7).

Figuras 10A-10C. Expresión de KVLQT1 en ovocitos de Xenopus. A) Corrientes registradas en un ovocito inyectado con 12,5 ng de ARNc de KVLQT1. Los pulsos se aplicaron en incrementos de 10 mV de -70 a +40 mV. B) Curva de activación isocrónica (1 s) para corriente de KVLQT1. El V_{1/2} fue -14,0 \pm 0,2 mV y el factor de pendiente fue 11,2 \pm 0,2 mV (n = 9). C) La relación de E_{rev} frente a [K^{+}]_{e} se ajustó con una función lineal y tenía una pendiente de 49,9 \pm 0,4 mV (n = 6-7 ovocitos por punto). Las corrientes de cola se midieron a varios voltajes después de prepulsos de 1,6 s a +10 mV.

Figuras 11A-11E. La coexpresión de KVLQT1 y hminK sugiere la presencia de un homólogo de KVLQT1 en ovocitos de Xenopus. Las corrientes se registraron a -40, -20, 0, +20 y +40 mV en ovocitos inyectados con 5,8 ng de KVLQT1 (Figura 11A), 1 ng de hminK (Figura 11B) o co-inyectados con ambos ARNc (Figura 11C). La Figura 11D muestra relaciones de corriente-voltaje medidas usando pulsos de 2 s para KVLQT1 y pulsos de 7,5 s para hminK o KVLQT1 y hminK (n = 20 células para cada condición). Para ovocitos inyectados con 60 pg o 1 ng de ARNc de hminK, I_{sK} a +40 mV fue 2,11 \pm 0,12 \muA y 2,20 \pm 0,18 \muA. La Figura 11E muestra curvas de activación isocrónica normalizadas para ovocitos inyectados con hminK (V½ = 2,4 \pm 0,3 mV; pendiente = 11,4 \pm 0,3 mV; n = 16) o co-inyectados con ARNc de KVLQT1 y hminK (V½ = 6,2 \pm 0,3 mV; pendiente = 12,3 \pm 0,2 mV; n = 2).

Figuras 12A-12D. Se muestran la secuencia de nucleótidos para ADNc de KVLQT1 y su producto de traducción.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la determinación de que LQT se mapea en el gen KVLQT1 y que variantes moleculares de este gen de acuerdo con la sec ID Nº 15 provocan o están implicadas en la patogenia de LQT. Se describe la determinación de que KVLQT1 y minK se coensamblan para formar canales cardiacos de potasio I_{Ks}. Más específicamente, la presente invención se refiere a mutaciones en el gen KVLQT1 y su uso en el diagnóstico de LQT. La presente invención se refiere adicionalmente a métodos para explorar seres humanos para la presencia de variantes del gen KVLQT1 que provocan LQT. Ya que el LQT se puede detectar ahora más tempranamente (es decir, antes de que aparezcan los síntomas) y más definitivamente, estarán disponibles mejores opciones de tratamiento en aquellos individuos identificados como que tienen LQT. También se describen métodos para seleccionar fármacos útiles para tratar o prevenir LQT1.

La presente invención proporciona métodos para explorar el gen KVLQT1 para identificar mutaciones. Tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de amplificar una porción del gen KVLQT1 y pueden incluir adicionalmente una etapa de proporcionar un conjunto de polinucleótidos que son cebadores para la amplificación de dicha porción del gen KVLQT1. El método es útil para identificar mutaciones para el uso en el pronóstico de LQT.

El síndrome de QT largo es un trastorno hereditario que provoca muerte súbita por arritmias cardiacas, específicamente torsade de pointes y fibrilación ventricular. El LQT se mapeó previamente en tres loci: LQT1 en el cromosoma 11p15.5, LQT2 en 7q35-36 y LQT3 en 3p21-24. Es un descubrimiento de la presente invención que existe un ligamiento genético entre LQT1 y polimorfismos dentro de KVLQT1, un gen de canal cardiaco de potasio.

Está demostrado que minK en el cromosoma 21 también está implicado en LQT. La proteína minK y KVLQT1 se coensamblan para formar un canal de K^{+}. Por tanto, se describen métodos para explorar el gen minK para identificar mutaciones. Tales métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de amplificar una porción del gen minK y pueden incluir adicionalmente una etapa de proporcionar un conjunto de polinucleótidos que son cebadores para la amplificación de dicha porción del gen minK. El método es útil para identificar mutaciones para el uso en el diagnóstico de LQT o el pronóstico de LQT.

Finalmente, se describe un método para seleccionar fármacos candidatos para identificar fármacos útiles para tratar o prevenir LQT. La selección de fármacos se realiza coexpresando genes mutantes KVLQT1 y/o minK en células, tales como ovocitos, células de mamífero o animales transgénicos y ensayando el efecto de un fármaco candidato en el canal I_{Ks}. El efecto se compara con la actividad del canal I_{Ks} en los genes KVLQT1 y minK de tipo silvestre.

La prueba de que el gen KVLQT1 está implicado en la causa de LQT se obtiene encontrando secuencias en ADN extraído de miembros de troncos familiares afectados que crean productos anormales del gen de KVLQT1 o niveles anormales de los productos génicos. Tales alelos de susceptibilidad a LQT cosegregarán con la enfermedad en troncos familiares grandes. También estarán presentes con una frecuencia mucho mayor en individuos no emparentados con LQT que en individuos en la población general. La clave es encontrar mutaciones que sean lo suficientemente graves para provocar una alteración obvia en la función normal del producto génico. Estas mutaciones pueden adoptar varias formas. Las formas más graves serían mutaciones de la fase de lectura o grandes deleciones que provocarían que el gen codificara una proteína anormal o una que alteraría significativamente la expresión de proteínas. Las mutaciones perjudiciales menos graves incluirían pequeñas deleciones en fase y sustituciones de pares de bases no conservativas que tendrían un efecto significativo sobre la proteína producida, tales como cambios en o de un resto de cisteína, de un aminoácido básico a uno ácido o viceversa, de un aminoácido hidrófobo a hidrófilo o viceversa u otras mutaciones que afectarían a la estructura secundaria o terciaria de la proteína. Generalmente, no se esperaría que las mutaciones silenciosas o las que dan como resultado sustituciones conservativas de aminoácidos alteraran la función proteica.

De acuerdo con el método de pronóstico de la presente invención, se detecta la alteración del gen KVLQT1 de tipo silvestre. Además, el método se puede realizar detectando el gen KVLQT1 de tipo silvestre y confirmando la ausencia de una causa de LQT como resultado de este locus. La "alteración de un gen de tipo silvestre" incluye todas las formas de mutaciones incluyendo deleciones, inserciones y mutaciones puntuales en las regiones codificantes y no codificantes. Las deleciones pueden ser de todo el gen o de solamente una porción del gen. Las mutaciones puntuales pueden dar como resultado codones de terminación, mutaciones de la fase de lectura o sustituciones de aminoácidos. Las mutaciones somáticas son las que solamente tienen lugar en ciertos tejidos y no se heredan en la línea germinal. Las mutaciones de línea germinal se pueden encontrar en cualquiera de los tejidos de un cuerpo y son hereditarias. Los acontecimientos de mutación puntual pueden tener lugar en regiones reguladoras, tales como en el promotor del gen, conduciendo a pérdida o disminución de expresión del ARNm. Las mutaciones puntuales también pueden suprimir el procesamiento apropiado del ARN, conduciendo a pérdida de expresión del producto génico de KVLQT1 o a una disminución en la estabilidad o eficacia de traducción del ARNm.

La presencia de LQT se puede determinar ensayando cualquier tejido de un ser humano para mutaciones del gen KVLQT1 o el gen minK. Para facilitar la consulta, la siguiente descripción se dirigirá al gen KVLQT1. Sin embargo, la descripción es igualmente aplicable al gen minK para ensayar mutaciones. Por ejemplo, una persona que ha heredado una mutación de KVLQT1 de línea germinal sería propensa a desarrollar LQT. Esto se puede determinar ensayando el ADN de cualquier tejido del cuerpo de la persona. De forma más simple, se puede sacar sangre y extraer ADN de las células de la sangre. Adicionalmente, el diagnóstico prenatal se puede conseguir ensayando células fetales, células placentarias o células amnióticas para mutaciones del gen KVLQT1. La alteración de un alelo de KVLQT1 de tipo silvestre, sea, por ejemplo, por mutación puntual o deleción, se puede detectar mediante cualquiera de los medios analizados en este documento.

Existen varios métodos que se pueden usar para detectar variación de secuencia de ADN. La secuenciación directa de ADN, secuenciación manual o secuenciación fluorescente automatizada, puede detectar variación de secuencia. Otra estrategia es el ensayo de polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) (Orita et al., 1989). Este método no detecta todos los cambios de secuencia, especialmente si el tamaño del fragmento de ADN es mayor de 200 pb, pero se puede optimizar para detectar la mayor parte de la variación de secuencia de ADN. La sensibilidad de detección reducida es una desventaja, pero el rendimiento aumentado posible con SSCP hace que sea una alternativa atractiva, viable a la secuenciación directa para la detección de mutación en una base de investigación. Después, los fragmentos que tienen movilidad cambiada en geles de SSCP se secuencian para determinar la naturaleza exacta de la variación de secuencia de ADN. Otras estrategias basadas en la detección de apareamientos erróneos entre las dos cadenas complementarias de ADN incluyen electroforesis en gel desnaturalizante con (CDGE) (en inglés "clamped denaturing gel electrophoresis") (Sheffield et al., 1991), análisis de heterodúplex (HA) (White et al., 1992) y escisión química de apareamiento erróneo (CMC) (Grompe et al., 1989). Ninguno de los métodos que se han descrito anteriormente detectará grandes deleciones, duplicaciones o inserciones ni detectará ninguna mutación reguladora que afecte a la transcripción o traducción de la proteína. Otros métodos que pueden detectar estas clases de mutaciones tales como un ensayo de truncamiento de proteína o el ensayo asimétrico, solamente detectan tipos específicos de mutaciones y no detectarían mutaciones de sentido erróneo. Una revisión de los métodos disponibles actualmente para detectar variación de secuencia de ADN se puede encontrar en una revisión reciente por Grompe (1993). Una vez que se conoce una mutación, se puede utilizar una estrategia de detección específica de alelos tal como hibridación de oligonucleótido
específico de alelo (ASO) para explorar rápidamente grandes números de otras muestras para esa misma mutación.

Se puede realizar un análisis preliminar rápido para detectar polimorfismos en secuencias de ADN observando una serie de transferencias de Southern de ADN cortado con una o más enzimas de restricción, preferiblemente con un gran número de enzimas de restricción. Cada transferencia contiene una serie de individuos normales y una serie de casos de LQT. Las transferencias de Southern que muestran fragmentos de hibridación (que difieren en longitud del ADN de control cuando se sondan con secuencias próximas o que incluyen el locus de KVLQT1) indican una posible mutación. Si se usan enzimas de restricción que producen fragmentos de restricción muy grandes, entonces se emplea electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

La detección de mutaciones puntuales se puede conseguir por clonación molecular del alelo de KVLQT1 y secuenciando el alelo usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Existen seis métodos bien conocidos para un ensayo más completo, aunque todavía indirecto, para confirmar la presencia de un alelo de susceptibilidad: 1) análisis de conformación de cadena única (SSCP) (Oria et al., 1989); 2) electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) ensayos de protección de RNasa (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) olignucleótidos específicos de alelo (ASO) (Conner et al., 1983); 5) el uso de proteínas que reconocen apareamientos erróneos de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. coli (Modrich, 1991); y 6) PCR específica de alelo (Rano y Kidd, 1989). Para PCR específica de alelo se usan cebadores que hibridan en sus extremos 3' con una mutación de KVLQT1 particular. Si la mutación particular no está presente, no se observa ningún producto de amplificación. También se puede usar el Sistema de Mutación Resistente a Amplificación (ARMS), como se describe en la Solicitud de Patente Europea Publicación Nº 0332435 y en Newton et al., 1989. También se pueden detectar las inserciones y deleciones de genes por clonación, secuenciación y amplificación. Adicionalmente, se pueden usar sondas de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para el gen o los genes marcadores circundantes para puntuar la alteración de un alelo o una inserción en un fragmento polimórfico. Un método de este tipo es particularmente útil para explorar parientes de un individuo afectado para la presencia de la mutación observada en ese individuo. Se pueden usar otras técnicas para detectar inserciones y deleciones como se conocen en la técnica.

En los primeros tres métodos (SSCP, DGGE y ensayo de protección de RNasa) aparece una nueva banda electroforética. El SSCP detecta una banda que migra de forma diferencial debido a que el cambio de secuencia provoca una diferencia en el emparejamiento de bases intramolecular monocatenario. La protección de RNasa implica escisión del polinucleótido mutante en dos o más fragmentos menores. La DGGE detecta diferencias en las velocidades de migración de secuencias mutantes en comparación con secuencias de tipo silvestre, usando un gel de gradiente desnaturalizante. En un ensayo de oligonucleótido específico de alelo se diseña un oligonucleótido que detecta una secuencia específica y el ensayo se realiza detectando la presencia o ausencia de una señal de hibridación. En el ensayo mutS, la proteína solamente se une a secuencias que contienen un apareamiento erróneo de nucleótidos en un heterodúplex entre secuencias mutantes y de tipo silvestre.

Los apareamientos erróneos, de acuerdo con la presente invención, son dúplex de ácido nucleico hibridados en los que las dos cadenas no son complementarias al 100%. La ausencia de homología total puede deberse a deleciones, inserciones, inversiones o sustituciones. La detección de apareamiento erróneo se puede usar para detectar mutaciones puntuales en el gen o en su producto de ARNm. Aunque estas técnicas son menos sensibles que la secuenciación, son más simples de realizar en un gran número de muestras. Un ejemplo de una técnica de escisión de apareamiento erróneo es el método de protección de RNasa. En la práctica de la presente invención, el método implica el uso de una ribosonda marcada que es complementaria a la secuencia codificante del gen KVLQT1 de tipo silvestre humano. La ribosonda y ARNm o ADN aislado de la persona se aparean (hibridan) entre sí y se digieren posteriormente con la enzima RNasa A que es capaz de detectar algunos apareamientos erróneos en una estructura de ARN dúplex. Si se detecta un apareamiento erróneo por RNasa A, escinde en el sitio del apareamiento erróneo. Por tanto, cuando la preparación de ARN apareada se separa en una matriz de gel electroforético, si se ha detectado un apareamiento erróneo y escindido por RNasa A, se observará un producto de ARN que es menor que el ARN dúplex de longitud completa para la ribosonda y el ARNm o ADN. La ribosonda no tiene que ser la longitud completa del ARNm o gen pero puede ser un segmento de cualquiera de los mismos. Si la ribosonda comprende solamente un segmento del ARNm o gen, será deseable usar varias de estas sondas para explorar toda la secuencia de ARNm para apareamientos erróneos.

De un modo similar se pueden usar sondas de ADN para detectar apareamientos erróneos, mediante escisión enzimática o química. Véase, por ejemplo, Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativamente se pueden detectar apareamientos erróneos por cambios en la movilidad electroforética de dúplex apareados erróneamente con respecto a dúplex apareados. Véase, por ejemplo, Cariello, 1988. Con ribosondas o sondas de ADN, el ARNm o ADN celular que puede contener una mutación se puede amplificar usando PCR (véase más adelante) antes de la hibridación. Los cambios en el ADN del gen KVLQT1 también se pueden detectar usando hibridación de Southern, especialmente si los cambios son redisposiciones generales, tales como deleciones e inserciones.

Las secuencias de ADN del gen KVLQT1 que se han amplificado mediante el uso de PCR también se pueden explorar usando sondas específicas de alelo. Estas sondas son oligómeros de ácido nucleico, que contienen cada uno una región de la secuencia génica que aloja una mutación conocida. Por ejemplo, un oligómero puede tener aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, correspondientes a una porción de la secuencia génica. Mediante el uso de una batería de tales sondas específicas de alelo se pueden explorar los productos de amplificación por PCR para identificar la presencia de una mutación identificada previamente en el gen. La hibridación de sondas específicas de alelo con secuencias de KVLQT1 amplificadas se puede realizar, por ejemplo, sobre un filtro de nylon. La hibridación con una sonda particular en condiciones de hibridación rigurosas indica la presencia de la misma mutación en el tejido que en la sonda específica de alelo.

El ensayo más definitivo para mutaciones en un locus candidato es comparar directamente secuencias genómicas de KVLQT1 de pacientes con las de una población de control. Alternativamente, se podría secuenciar el ARN mensajero después de la amplificación, por ejemplo, mediante PCR, eliminando de este modo la necesidad de determinar la estructura de exones del gen candidato.

Las mutaciones de pacientes que no se incluyen en la región codificante de KVLQT1 se pueden detectar examinando las regiones no codificantes, tales como intrones y secuencias reguladoras cerca o dentro de los genes. Una indicación temprana de que las mutaciones en regiones no codificantes son importantes puede provenir de experimentos de transferencia de Northern que muestran moléculas de ARN mensajero de tamaño o abundancia anormal en pacientes en comparación con individuos de control.

La alteración de la expresión de ARNm de KVLQT1 se puede detectar mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Éstas incluyen análisis de transferencia de Northern, amplificación por PCR y protección de RNasa. La expresión disminuida de ARNm indica una alteración del gen de tipo silvestre. La alteración de genes de tipo silvestre también se puede detectar explorando para alteración de proteína KVLQT1 de tipo silvestre. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con KVLQT1 para explorar un tejido. La ausencia de antígeno afín indicaría una mutación. También se podrían usar anticuerpos específicos para productos de alelos mutantes para detectar producto génico mutante. Tales ensayos inmunológicos se pueden realizar en cualquier formato conveniente conocido en la técnica. Éstos incluyen transferencias de Western, ensayos inmunohistoquímicos y ensayos ELISA. Se puede usar cualquier medio para detectar una proteína KVLQT1 alterada para detectar la alteración del gen KVLQT1 de tipo silvestre. Se pueden usar ensayos funcionales, tales como determinaciones de unión a proteína. Adicionalmente se pueden usar ensayos que detectan la función bioquímica de KVLQT1. El hallazgo de un producto génico de KVLQT1 mutante indica alteración de un gen KVLQT1 de tipo silvestre.

Un gen o producto génico de KVLQT1 mutante también se puede detectar en otras muestras del cuerpo humano, tales como suero, heces, orina y esputo. Se pueden aplicar las mismas técnicas que se han discutido anteriormente para la detección de genes o productos génicos mutantes en tejidos a otras muestras corporales. Se puede conseguir un diagnóstico temprano simple para LQT explorando tales muestras corporales.

Los pares de cebadores que se han descrito en este documento son útiles para la determinación de la secuencia de nucleótidos de un alelo de KVLQT1 o minK particular usando PCR. Los pares de cebadores de ADN monocatenario para KYLQT1 se pueden aparear con secuencias dentro o que circundan el gen KVLQT1 en el cromosoma 11 para cebar la síntesis de ADN de amplificación del propio gen. Los pares de cebadores de ADN monocatenario para minK se pueden aparear con secuencias dentro o que rodean el gen minK en el cromosoma 21 para cebar la síntesis de ADN de amplificación del propio gen. Un conjunto completo de estos cebadores permite la síntesis de todos los nucleótidos de las secuencias codificantes del gen, es decir, los exones. El conjunto de cebadores permite preferiblemente la síntesis de secuencias tanto de intrón como de exón. También se pueden usar cebadores específicos de alelo. Tales cebadores solamente se aparean con alelos mutantes de KVLQT1 particulares y, por tanto, solamente amplificarán un producto en presencia del alelo mutante como un molde.

Para facilitar la clonación posterior de secuencias amplificadas, los cebadores pueden tener secuencias de sitio de enzima de restricción unidos a sus extremos 5'. Por tanto, todos los nucleótidos de los cebadores se obtienen de la secuencia de KVLQT1 o secuencias adyacentes a KVLQT1, excepto por los pocos nucleótidos necesarios para formar un sitio de enzima de restricción. Tales enzimas y sitios se conocen bien en la técnica. Los propios cebadores se pueden sintetizar usando técnicas que se conocen bien en la técnica. Generalmente, los cebadores se pueden preparar usando máquinas de síntesis de oligonucleótidos que están disponibles en el mercado. Dada la secuencia de KVLQT1, el diseño de cebadores particulares está dentro de la especialidad de la técnica.

Las sondas de ácido nucleico proporcionadas en este documento son útiles para varios propósitos. Se pueden usar en hibridación de Southern de ADN genómico y en el método de protección de RNasa para detectar mutaciones puntuales que ya se han analizado anteriormente. Las sondas se pueden usar para detectar productos de amplificación por PCR. También se pueden usar para detectar apareamientos erróneos con el gen KVLQT1 o ARNm usando otras técnicas.

Se ha descubierto que individuos con el gen KVLQT1 de tipo silvestre no tienen LQT. Sin embargo, las mutaciones que interfieren con la función del producto génico de KVLQT1 están implicadas en la patogenia de LQT. Por tanto, la presencia de un gen KVLQT1 alterado (o uno mutante) que produce una proteína que tiene una pérdida de función, o función alterada, provoca directamente LQT que aumenta el riesgo de arritmias cardiacas. Para detectar una mutación del gen de KVLQT1, se prepara una muestra biológica y se analiza para una diferencia entre la secuencia del alelo que se está analizando y la secuencia del alelo de tipo silvestre. Los alelos KVLQT1 mutantes se pueden identificar inicialmente mediante cualquiera de las técnicas que se han descrito anteriormente. Después, los alelos mutantes se secuencian para identificar la mutación específica del alelo mutante particular. Alternativamente, se pueden identificar alelos mutantes inicialmente identificando proteínas mutantes (alteradas), usando técnicas convencionales. Después, los alelos mutantes se secuencian para identificar la mutación específica para cada alelo. Después, las mutaciones, especialmente las que conducen a una función alterada de la proteína, se usan para los métodos de pronóstico de la presente invención.

También se ha descubierto que la proteína KVLQT1 se coensambla con la proteína minK. Por tanto, las mutaciones en minK que interfieren en la función del producto génico de minK están implicadas en la patogenia de LQT. Por tanto, la presencia de un gen minK alterado (o uno mutante) que produce una proteína que tiene una pérdida de función, o función alterada, provoca directamente LQT que aumenta el riesgo de arritmias cardiacas. Para detectar una mutación del gen minK, se prepara una muestra biológica y se analiza para una diferencia entre la secuencia del alelo que se está analizando y la secuencia del alelo de tipo silvestre. Los alelos minK mutantes se pueden identificar inicialmente mediante cualquiera de las técnicas que se han descrito anteriormente. Después, los alelos mutantes se secuencian para identificar la mutación específica de las proteínas mutantes (alteradas) particulares, usando técnicas convencionales. Después, los alelos mutantes se secuencian para identificar la mutación específica para cada alelo. Después, las mutaciones, especialmente las conducen a una función alterada de la proteína, se usan para los métodos de pronóstico de la presente invención.

Definiciones

La presente invención emplea las siguientes definiciones:

"Sondas". Se detectan polimorfismos de polinucleótidos asociados con alelos de KVLQT1 que predisponen a LQT por hibridación con una sonda polinucleotídica que forma un híbrido estable con la de la secuencia diana, en condiciones de hibridación y lavado de rigurosas a moderadamente rigurosas. Si se espera que las sondas sean perfectamente complementarias a la secuencia diana, se usarán condiciones rigurosas. La rigurosidad de hibridación se puede disminuir si se espera cierto apareamiento erróneo, por ejemplo, si se esperan variantes con el resultado de que la sonda no será completamente complementaria. Se seleccionan condiciones que imposibilitan uniones no específicas/adventicias, es decir, que minimizan el ruido. Ya que tales indicaciones identifican polimorfismos de ADN neutros así como mutaciones, estas indicaciones necesitan análisis adicional para demostrar la detección de un alelo de susceptibilidad de KVLQT1.

Las sondas para alelos de KVLQT1 se pueden obtener de las secuencias de la región de KVLQT1 o su ADNc. Las sondas pueden ser de cualquier longitud adecuada, que abarcan todo o una porción de la región de KVLQT1 y que permiten la hibridación específica con la región. Si la secuencia diana contiene una secuencia idéntica a la de la sonda, las sondas pueden ser cortas, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 8-30 pares de bases, ya que el híbrido será relativamente estable incluso en condiciones rigurosas. Si se espera cierto grado de apareamiento erróneo con la sonda, es decir, si se sospecha que la sonda hibridará con una región variante, se puede emplear una sonda más larga que hibride con la secuencia diana con la especificidad requerida.

Las sondas incluirán un polinucleótido aislado unido a un marcador o una molécula indicadora y se pueden usar para aislar otras secuencias polinucleotídicas, que tienen similitud de secuencia por métodos comerciales. Para técnicas para preparar y marcas sondas véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992. Se pueden seleccionar otros polinucleótidos similares usando polinucleótidos homólogos. Alternativamente, se pueden sintetizar o seleccionar polinucleótidos que codifican éstos o polipéptidos similares mediante el uso de la redundancia en el código genético. Se pueden introducir diversas sustituciones de codón, por ejemplo, por cambios silenciosos (produciendo de este modo diversos sitios de restricción) o para optimizar la expresión para un sistema particular. Se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, quizás para cambiar la degradación o tasa de renovación de polipéptido.

Las sondas que comprenden oligonucleótidos sintéticos u otros polinucleótidos descritos en este documento se pueden obtener de polinucleótidos mono- o bicatenarios de origen natural o recombinantes o se pueden sintetizar químicamente. Las sondas también se pueden marcar por traslado de mella, reacción de relleno de Klenow u otros métodos conocidos en la técnica.

Como sondas se prefieren porciones de la secuencia polinucleotídica que tienen al menos aproximadamente ocho nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos y menos de aproximadamente 6 kb, habitualmente menos de aproximadamente 1,0 kb, de una secuencia polinucleotídica que codifica KVLQT1. Las sondas también se pueden usar para determinar si el ARNm que codifica KVLQT1 está presente en una célula o un tejido.

"Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias que están normalmente dentro de 100 kb de la región codificante de un locus, pero también pueden estar más separadas de la región codificante, .que afectan a la expresión del gen (incluyendo transcripción del gen y traducción, corte y empalme, estabilidad o similares del ARN mensajero).

"Homología o similitud sustancial". Un ácido nucleico o fragmento del mismo es "sustancialmente homólogo" ("o sustancialmente similar") a otro si, cuando se alinea óptimamente (con inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay una identidad de secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente el 60% de las bases de nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente el 70%, más habitualmente al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95-98% de las bases de nucleótidos.

Alternativamente, existe homología o (similitud) sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo hibridará con otro ácido nucleico (o una cadena complementaria del mismo) en condiciones de hibridación selectivas, con una cadena o con su complemento. Existe selectividad de hibridación cuando tiene lugar hibridación que es sustancialmente más selectiva que la ausencia total de especificidad. Típicamente, tendrá lugar hibridación selectiva cuando haya al menos aproximadamente el 55% de homología a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente el 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 75% y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%. Véase, Kanehisa, 1984. La longitud de la comparación de homología, como se describe, puede ser a lo largo de tramos más largos y en determinadas realizaciones a menudo será a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferiblemente al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos.

La hibridación de ácido nucleico se verá afectada por condiciones tales como concentración de sales, temperatura o disolventes orgánicos, además de la composición de bases, longitud de las cadenas complementarias y el número de los apareamientos erróneos de bases de nucleótidos entre los ácidos nucleicos de hibridación, como se determinará fácilmente por los especialistas en la técnica. Las condiciones de temperatura rigurosas generalmente incluirán temperaturas superiores a 30ºC, típicamente superiores a 37ºC y preferiblemente superiores a 45ºC. Las condiciones rigurosas de sales serán normalmente inferiores a 1000 mM, típicamente inferiores a 500 mM y preferiblemente inferiores a 200 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur & Davidson, 1968.

La secuencias de sondas también pueden hibridar específicamente con ADN dúplex en determinadas condiciones para formar tríplex u otros complejos de ADN de orden superior. La preparación de tales sondas y las condiciones de hibridación adecuadas se conocen bien en la técnica.

Preparación de ácidos nucleicos recombinantes o sintetizados químicamente; vectores, transformación, células hospedadoras

Se pueden producir grandes cantidades de los polinucleótidos descritos en este documento por replicación en una célula hospedadora adecuada. Los fragmentos polinucleotídicos naturales o sintéticos que codifican un fragmento deseado se incorporarán en construcciones polinucleotídicas recombinantes, habitualmente construcciones de ADN, con capacidad de introducción y replicación en una célula procariota o eucariota. Habitualmente, las construcciones polinucleotídicas serán adecuadas para replicación en un hospedador unicelular, tal como levaduras o bacterias, pero también pueden tener por objeto la introducción en (con y sin integración en el genoma) líneas celulares cultivadas de mamífero o planta u otras células eucariotas. La purificación de ácidos nucleicos producidos por los métodos descritos en este documento se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992.

Los polinucleótidos también se pueden producir por síntesis química, por ejemplo, por el método de fosforamidita descrito por Beaucage & Carruthers, 1981 o el método de triéster de acuerdo con Matteucci y Caruthers, 1981 y se puede realizar en sintetizadores de oligonucleótidos comerciales, automatizados. Se puede obtener un fragmento bicatenario a partir del producto monocatenario de síntesis química sintetizando la cadena complementaria y apareando la cadena entre sí en condiciones apropiadas o añadiendo la cadena complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Las construcciones polinucleotídicas preparadas para la introducción en un hospedador procariota o eucariota pueden comprender un sistema de replicación reconocido por el hospedador, incluyendo el fragmento polinucleotídico pretendido que codifica el polipéptido deseado y también incluirán preferiblemente secuencias reguladoras de inicio de la transcripción y traducción unidas operativamente al segmento que codifica el polipéptido. Los vectores de expresión pueden incluir, por ejemplo, un origen de replicación o secuencia de replicación autónoma (ARS) y secuencias de control de la expresión, un promotor, un potenciador y sitios de información de procesamiento necesarias, tales como sitios de unión a ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias de estabilización del ARNm. Tales vectores se pueden preparar mediante técnicas recombinantes convencionales bien conocidas en la técnica y discutidas, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992.

Se seleccionará un promotor apropiado y otras secuencias de vector necesarias para ser funcionales en el hospedador y pueden incluir, cuando sea apropiado, las asociadas naturalmente con el gen KVLQT1 o minK. Los ejemplos de combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión se describen en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992; véase también, por ejemplo, Metzger et al., 1988. Se conocen muchos vectores útiles en la técnica y se pueden obtener a partir de proveedores tales como Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech y otros. En hospedadores procariotas se pueden usar promotores tales como el trp, lac y promotores de fagos, promotores de ARNt y promotores de enzima glucolítica. Los promotores de levadura útiles incluyen regiones de promotor para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas tales como enloasa o gluceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, enzimas responsables de utilización de maltosa y galactosa y otras. Los vectores y promotores adecuados para el uso en expresión en levadura se describen adicionalmente en Hitzeman et al., documento EP 73.675A. Los promotores de mamífero no nativos apropiados pueden incluir los promotores temprano y tardío de SV40 (Fiers et al., 1978) o promotores obtenidos del virus de leucemia de Molony murino, virus de tumor de ratón, virus de sarcoma aviar, adenovirus II, virus de papiloma bovino o polioma. Adicionalmente, la construcción se puede unir a un gen amplificable (por ejemplo, DHFR) de tal forma que se pueden preparar múltiples copias del gen. Para secuencias apropiadas de potenciador y otras de control de la expresión, véase también Enhacers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).

Aunque tales vectores de expresión se pueden replicar de forma autónoma, también se pueden replicar insertándose en el genoma de la célula hospedadora, mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión y de clonación contendrán probablemente un marcador de selección, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el desarrollo de una célula hospedadora transformada con el vector. La presencia de este gen garantiza el desarrollo solamente de las células hospedadoras que expresan los insertos. Los genes de selección típicos codifican proteínas que a) confieren resistencia a antibióticos u otras sustancias tóxicas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, etc., b) complementan deficiencias auxótrofas o c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli. La elección del marcador de selección apropiado dependerá de la célula hospedadora y en la técnica se conocen bien los marcadores apropiados para diferentes hospedadores.

Los vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés se pueden transcribir in vitro y el ARN resultante se puede introducir en la célula hospedadora mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, mediante inyección (véase, Kubo et al., 1988) o los vectores se pueden introducir directamente en células hospedadoras mediante métodos bien conocidos en la técnica, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular, que incluyen electroporación; transfección empleando cloruro cálcico, cloruro de rubidio fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; infección (donde el vector es un agente infeccioso, tal como un genoma retroviral); y otros métodos. Véase de forma general, Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1992. La introducción de los polinucleotídicos en la célula hospedadora mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, los que se han descrito anteriormente, se denominará en este documento "transformación". Las células en las que se tienen que introducir los ácidos nucleicos que se han descrito anteriormente también tienen por objeto incluir la progenie de tales células.

Se pueden preparar grandes cantidades de los ácidos nucleicos y polipéptidos expresando el ácido nucleico de KVLQT1 o minK o porciones de los mismos en vectores u otros vehículos de expresión en células hospedadoras procariotas o eucariotas compatibles. Los hospedadores procariotas usados más comúnmente son cepas de Escherichia coli, aunque también se pueden usar otros procariotas, tales como Bacillus subtilis o Pseudomonas.

Las células hospedadoras de mamífero u otras eucariotas, tales como las de levaduras, hongos filamentosos, plantas, insecto o especies de anfibios o aviares, también pueden ser útiles para la producción de las proteínas descritas en este documento. La propagación de células de mamífero en cultivo en sí es conocida. Véase, Jakoby y Pastan (eds.), 1979. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero usadas comúnmente son células VERO y HeLa, células de ovario hámster Chino (CHO) y líneas celulares WI38, BHK y CHO, aunque el médico especialista entenderá que pueden ser apropiadas otras líneas celulares, por ejemplo, para proporcionar mayor expresión, patrones de glucosilación deseables u otras características.

Los clones se seleccionan usando marcadores dependiendo del modo de la construcción del vector. El marcador puede estar en la misma molécula de ADN o una diferente, preferiblemente la misma molécula de ADN. En hospedadores procariotas, el transformante se puede seleccionar, por ejemplo, por resistencia a ampicilina, tetraciclina u otros antibióticos. La producción de un producto particular basada en la sensibilidad a temperatura también puede servir como un marcador apropiado.

Las células procariotas o eucariotas transformadas con los polinucleótidos no solamente serán útiles para la producción de los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en este documento, sino también, por ejemplo, para estudiar las características del polipéptido KVLQT1 o minK.

Las sondas y los cebadores basados en la secuencia génica de KVLQT1 descritos en este documento se usan para identificar secuencias génicas de KVLQT1 homólogas y proteínas en otras especies. Estas secuencias génicas y proteínas se usan en los métodos de diagnóstico/pronóstico, terapéuticos y de selección de fármacos descritos en este documento para las especies de las que se han aislado.

Métodos de Uso: Selección de Fármacos

La descripción en este documento es particularmente útil para seleccionar compuestos usando proteínas KVLQT1 y minK en células transformadas, ovocitos transfectados o animales transgénicos. Ya que las mutaciones en la proteína KVLQT1 o minK pueden alterar el funcionamiento del canal cardiaco de potasio I_{Ks}, los fármacos candidatos se seleccionan para efectos sobre el canal usando células que contienen una proteína KVLQT1 o minK normal y una proteína minK o KVLQT1 mutante, respectivamente, o una proteína KVLQT1 mutante y una minK mutante. El fármaco se añade a las células en cultivo o se administra a un animal transgénico y se compara el efecto en la corriente inducida del canal de potasio I_{Ks} con la corriente inducida de una célula o un animal que contiene el KVLQT1 y minK de tipo silvestre. Los fármacos candidatos que alteran la corriente inducida hasta un nivel más normal son útiles para tratar o prevenir LQT.

Métodos de Uso: Diagnóstico con Ácido Nucleico y Kits de Diagnóstico

Para detectar la presencia de un alelo de KVLQT1 o minK que predispone a un individuo a LQT, se prepara una muestra biológica tal como sangre y se analiza para presencia o ausencia de alelos de susceptibilidad de KVLQT1 o minK. Para detectar la presencia de LQT o como un indicador de pronóstico, se prepara una muestra biológica y se analiza para presencia o ausencia de alelos mutantes de KVLQT1 o minK. Los resultados de estos ensayos y la información interpretativa se devuelven al asistente sanitario para la comunicación al individuo ensayado. Tales diagnósticos se pueden realizar por laboratorios de diagnóstico o, alternativamente, se fabrican kits de diagnóstico y se venden a asistentes sanitarios o a individuos privados para autodiagnóstico.

Inicialmente, el método de exploración implica la amplificación de las secuencias de KVLQT1 o minK pertinentes. En otra realización preferida de la invención, el método de exploración implica una estrategia no basada en PCR. Tales métodos de exploración incluyen metodologías de amplificación de marcador de dos etapas que se conocen bien en la técnica. Las estrategias de exploración basadas tanto en PCR como no basadas en PCR pueden detectar secuencias diana con un alto nivel de sensibilidad.

El método más popular usado actualmente es la amplificación de diana. En este caso, la secuencia de ácido nucleico diana se amplifica con polimerasas. Un método particularmente preferido que usa amplificación dirigida por polimerasa es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa y otros ensayos de amplificación dirigidos por polimerasa pueden conseguir un aumento de más de un millón de veces en el número de copias mediante el uso de ciclos de amplificación dirigidos por polimerasa. Una vez amplificado, el ácido nucleico resultante se puede secuenciar o usar como un sustrato para sondas de ADN.

Cuando las sondas se usan para detectar la presencia de las secuencias diana en la muestra biológica a analizar, tal como sangre o suero, se puede tratar, si se desea, para extraer los ácidos nucleicos. El ácido nucleico de muestra se puede preparar de diversos modos para facilitar la detección de la secuencia diana, por ejemplo, desnaturalización, digestión por restricción, electroforesis o transferencia puntual. La región dirigida del ácido nucleico analito habitualmente tiene que ser al menos parcialmente monocatenario para formar híbridos con la secuencia de dirección de la sonda. Si la secuencia es monocatenaria de forma natural, no se requerirá la desnaturalización. Sin embargo, si la secuencia es bicatenaria, probablemente se necesitará desnaturalizar la secuencia. La desnaturalización se puede realizar mediante diversas técnicas conocidas en la técnica.

El ácido nucleico analito y la sonda se incuban en condiciones que promueven la formación de híbridos estables de la secuencia diana de la sonda con la supuesta secuencia dirigida en el analito. La región de las sondas que se usa para unirse al analito se puede hacer completamente complementaria a la región dirigida del cromosoma humano 11 para KVLQT1. Por lo tanto, son deseables condiciones de alta rigurosidad para evitar falsos positivos. Sin embargo, solamente se usan condiciones de alta rigurosidad si las sondas son complementarias a regiones del cromosoma que son únicas en el genoma. La rigurosidad de la hibridación se determina por varios factores durante la hibridación y durante el procedimiento del lavado, que incluyen temperatura, fuerza iónica, composición de bases, longitud de sonda y concentración de formamida. Estos factores se resumen, por ejemplo, en Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989. En ciertas circunstancias, se puede desear la formación de híbridos de orden superior, tales como tríplex, cuádraplex, etc. para proporcionar los medios para detectar secuencias diana.

La detección, si la hay, del híbrido resultante se consigue habitualmente mediante el uso de sondas marcadas. Alternativamente, la sonda puede estar no marcada, pero puede ser detectable por unión específica con un ligando que está marcado, directamente o indirectamente. Los marcadores adecuados y los métodos para marcar sondas y ligandos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos que se pueden incorporar por métodos conocidos (por ejemplo, traslado de mella, cebado aleatorio o fosforilación), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, particularmente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos y similares. Las variaciones de este esquema básico se conocen en la técnica e incluyen las variaciones que facilitan la separación de los híbridos a detectar de materiales extraños y/o que amplifican la señal del resto marcado. Varias de estas variaciones se revisan, por ejemplo, en Matthews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Patente de Estados Unidos Nº 4.688.105 y en la Publicación EPO Nº 225.807.

Como se ha señalado anteriormente, en esta invención también se consideran ensayos de exploración no basados en PCR. Este procedimiento hibrida una sonda de ácido nucleico (o un análogo tal como una cadena principal de metil fosfonato que sustituye el fosfodiéster normal) con la diana de ADN de nivel bajo. Esta sonda puede tener una enzima unida covalentemente a la sonda, de tal forma que el enlace covalente no interfiere con la especificidad de la hibridación. Después, este complejo de conjugado de enzima-sonda-ácido nucleico diana se puede aislar del conjugado libre de sonda enzima y se añade un sustrato para la detección de enzima. Se observa la actividad enzimática como un cambio en el desarrollo de color o salida luminiscente dando como resultado un aumento de 10^{3}-10^{6} en la sensibilidad. Para un ejemplo relacionado con la preparación de conjugados de oligodesoxinucleótido-fosfatasa alcalina y su uso como sondas de hibridación, véase Jablosnki et al., 1986.

En la técnica se conocen metodologías de amplificación de marcador de dos etapas. Estos ensayos trabajan sobre el principio de que un pequeño ligando (tal como digoxigenina, biotina o similares) está unido a una sonda de ácido nucleico capaz de unirse específicamente a KVLQT1. También se consideran sondas específicas de alelo dentro del alcance de este ejemplo y las sondas específicas de alelo ilustrativas incluyen sondas que abarcan las mutaciones de predisposición de esta solicitud de patente.

En un ejemplo, el pequeño ligando unido a la sonda de ácido nucleico se reconoce específicamente por un conjugado de anticuerpo-enzima. En una realización de este ejemplo, la digoxigenina está unida a la sonda de ácido nucleico. La hibridación se detecta por un conjugado de anticuerpo-fosfatasa alcalina que convierte un sustrato quimioluminiscente. Para métodos para marcar sondas de ácido nucleico de acuerdo con esta realización, véase Martin et al, 1990. En un segundo ejemplo, el pequeño ligando se reconoce por un conjugado de segundo ligando-enzima que es capaz formar complejos específicamente con el primer ligando. Una realización bien conocida de este ejemplo es el tipo de interacciones de biotina-avidina. Para métodos para marcar sondas de ácido nucleico y su uso en ensayos basados en biotina-avidina véase Rigby et al., 1977 y Nguyen et al., 1992.

Los ensayos de sonda de ácido nucleico emplearán un cóctel de sondas de ácido nucleico capaces de detectar KVLQT1 o minK. Por tanto, en un ejemplo para detectar la presencia de KVLQT1 en una muestra celular, se emplea más de una sonda complementaria al gen y en particular, el número de sondas diferentes es alternativamente dos, tres o cinco secuencias diferentes de sonda de ácido nucleico. En otro ejemplo, para detectar la presencia de mutaciones en la secuencia del gen KVLQT1 en un paciente, se emplea más de una sonda complementaria a estos genes, donde el cóctel incluye sondas capaces de unirse a las mutaciones específicas de alelo identificadas en poblaciones de pacientes con alteraciones en KVLQT1. Se puede usar cualquier número de sondas e incluirá preferiblemente sondas correspondientes a las mutaciones génicas principales identificadas como las que predisponen a un individuo a LQT.

Métodos de Uso: Diagnosis con Péptidos y Kits de Diagnóstico

La presencia de LQT también se puede detectar basándose en la alteración de KVLQT1 de tipo silvestre de acuerdo con la Sec ID. Nº 15 o polipéptido minK. Tales alteraciones se pueden determinar por análisis de secuencia de acuerdo con técnicas convencionales. Más preferiblemente, se usan anticuerpos (policlonales o monoclonales) para detectar diferencias en, o la ausencia de péptidos KVLQT1 o minK. Las técnicas para generar y purificar anticuerpos se conocen bien en la técnica y cualquiera de tales técnicas se puede seleccionar para conseguir las preparaciones descritas en este documento. En una realización preferida de la invención, los anticuerpos inmunoprecipitarán proteínas KVLQT1 o minK de solución y reaccionarán con estas proteínas en Western o inmunotransferencias de geles de poliacrilamida. En otra realización preferida, los anticuerpos detectarán proteínas KVLQT1 o minK en secciones tisulares en parafina o congeladas, usando técnicas inmunocitoquímicas.

Las realizaciones preferidas relacionadas con métodos para detectar KVLQT1 o minK o sus mutaciones incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos sándwich usando anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Los ensayos sándwich ilustrativos se describen por David et al., en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.376.110 y 4.486.530.

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Ejemplo 1 Métodos para Evaluación Fenotípica

Para estos estudios se estudiaron seis troncos familiares grandes con LQT (K1532, K1723, K2605, K1807, K161 y K162) así como algunos troncos familiares pequeños y casos esporádicos. Los pacientes con LQT se identificaron en clínicas médicas por todo América del Norte y Europa. Se tuvieron en cuenta dos factores para el fenotipado: 1) datos del historial (la presencia de síncope, el número de episodios de síncope, la presencia de ataques, la edad de aparición de los síntomas y la existencia de muerte súbita); y 2) el intervalo QT en electrocardiogramas corregido para frecuencia cardiaca (QT_{c}) (Bazzett, 1920). Para evitar clasificar erróneamente a los individuos, se usó la misma estrategia conservativa de asignación fenotípica que fue exitosa en estudios previos (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). Se obtuvo un consentimiento informado de cada individuo, o sus tutores, de acuerdo con directrices de comisión de revisión institucional local. Los datos fenotípicos se interpretaron sin conocimiento del genotipo. Los individuos sintomáticos con un intervalo QT corregido (QT_{c}) de 0,45 segundos o más y los individuos asintomáticos con un QT_{c} de 0,47 segundos o más se clasificaron como afectados. Los individuos asintomáticos con un QT_{c} de 0,41 segundos o menos se clasificaron como no afectados. Los individuos asintomáticos con QT_{c} entre 0,41 y 0,47 segundos y los individuos sintomáticos con QT_{c} de 0,44 segundos o menos se clasificaron con inciertos.

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Ejemplo 2 Genotipado y Análisis de Ligamiento

Se preparó ADN genómico a partir de linfocitos de sangre periférica o líneas celulares obtenidas de linfocitos transformados con virus de Epstein-Barr usando procedimientos convencionales (Anderson y Gusella, 1984). Para análisis genotípicos se usaron cuatro polimorfismos de repetición pequeña en tándem (STR) que se mapearon previamente en el cromosoma 11p15.5: D11S922, TH, D11S1318 y D11S860 (Gyapay et al., 1994). El genotipado de marcadores RFLP (HRAS1, D11S454 y D11S12) se realizó como se ha descrito previamente (Keating et al., 1991a).

Se realizó el análisis de ligamiento por pares usando MLINK en LINKAGE v5.1 (Lathrop et al., 1985). Se usaron valores asumidos de 0,90 para penetrancia y 0,001 para frecuencia del gen de LQT. Se asumió que la frecuencia génica era igual entre hombres y mujeres. Se consideró que las frecuencias de recombinación de hombres y mujeres eran iguales. Las frecuencias de alelo de STR eran 1/en, donde n=número de alelos observados. Aunque la puntuación LOD máxima para D11S454 se identificó con una fracción de recombinación de 0, la presencia de un recombinante no obligado (individuo VI-14, Figura 1) pone este gen de LQT telomérico a D11S454.

Ejemplo 3 Mapeo Físico

Los cebadores se diseñaron basándose en secuencias de los loci TH-INS-IGFII y D11S454 y se usaron para identificar y aislar clones de genotecas de YAC de CEPH usando la técnica basada en PCR (Green y Olson, 1990; Kwiatowski et al., 1990). Las secuencias terminales de YAC se determinaron por PCR inversa como se ha descrito (Ochman et al., 1988) y se usaron como STS.

Se aislaron clones P1 usando sondas de copia única a partir de los cósmidos identificados previamente cosQW22 (este estudio), cCI11-469 (D11S679), cCI11-385 (D11S551), cCI11-565 (D11S601), cCI11-237 (D11S454) (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991; Sternberg, 1990). Los P1 recién aislados se mapearon en el cromosoma 11p15 por FISH o análisis de Southern. Se generaron ribosondas específicas de extremo a partir de P1 recién aislados y se usaron para identificar clones adyacentes adicionales (Riboprobe Gemini Core System Kit; Promega). Se preparó ADN para P1 y clones de cósmido usando aislamiento de plásmido por lisis alcalina y se purificó por centrifugación en equilibrio en gradientes de CsCl-bromuro de etidio como se ha descrito (Sambrook et al., 1989). Se determinaron las secuencias terminales del inserto de P1 por secuenciación cíclica como se ha descrito (Wang y Keating, 1994). Se generaron STS basándose en estas secuencias terminales de inserto. Se calculó el solapamiento entre P1 y cósmidos sumando en común los fragmentos de restricción.

Ejemplo 4 Aislamiento y Caracterización de Clones de KVLOT1

Se sembró una genoteca de ADNc cardiaco humano adulto (Stratagene) y se seleccionaron 1 x 10^{6} placas usando el exón capturado 4181 A como la sonda. Las secuencias de exón capturado 4181 A se usaron para diseñar sondas oligonucleotídicas para la exploración de la genoteca de ADNc. Se usó el Sistema de Selección Positiva de ADNc GENETRAPPER^{TM} para explorar 1 x 10^{11} clones de una genoteca de ADNc de corazón humano (Life Technologies, Inc.). Las secuencias de los oligonucleótidos de captura y reparación fueron 5'-CAGATCCTGAGGATGCT-3' (SEC ID Nº: 1) y 5'-GTACCTGGCTGAGAAGG-3' (SEC ID Nº: 2).

Se obtuvieron secuencias de ADNc compuestas para KVLQT1 por secuenciación de extremo de clones de ADNc solapantes y por paseo con cebador. Se realizó la secuenciación automáticamente, usando secuenciadores automatizados A.L.F. de Pharmacia o manualmente, usando un Kit de Secuenciación de ADN de Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical, Inc.). Los análisis de bases de datos y análisis de secuencia se realizaron usando el programa de software GCG, programa de software IG y el servicio de red BLAST del Centro Nacional para Información Biotecnológica.

La estructura genómica parcial (del dominio transmembrana S2 a S6) de KVLQT1 se determinó por secuenciación cíclica de P1 18B12 como se ha descrito (Wang y Keating, 1994). Los cebadores se diseñaron basándose en la secuencia de ADNc de KVLQT1 y se usaron para secuenciación cíclica.

Ejemplo 5 Análisis de Mutación

Se realizó SSCP como se ha descrito previamente (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). Se aislaron productos normales y aberrantes de SSCP, se secuenciaron directamente como se ha descrito (Wang y Keating, 1994) o se subclonaron en pBluescript (SK+; Stratagene) usando el método de vector T (Marchuk et al., 1990). Cuando se usó el último método, se secuenciaron varios clones por el método didesoxi de terminación de cadena usando la Versión 2.0 de Sequenase^{TM} (United States Biochemicals, Inc.).

Ejemplo 6 Análisis de Northern

Un filtro de Northern para múltiples tejidos (transferencia 1 de MTN humano, Clontech) se sondó con una sonda de ADNc de KVLQT1 marcada con ^{32}P como se ha descrito anteriormente (Curran et al., 1995).

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Ejemplo 7 Localización Genética y Física Refinada de LQT1

La localización precisa de LQT1 se determinó por análisis genotípicos en el tronco familiar 1532 (K 1532), una gran familia de Utah de descendencia del norte de Europa (Figura 1). Este tronco familiar se había usado en el estudio inicial que ligaba el primer gen de LQT, LQT1, al cromosoma 11p15.5 (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). Se identificaron miembros adicionales de la familia y se fenotiparon para un tamaño total de muestra de 217 individuos. Se realizó la determinación fenotípica como se ha descrito previamente (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). Los análisis genotípicos preliminares que usaron marcadores como HRAS, TH, D11S454 y D11S12 incluyeron todos los miembros determinados de K1532. Estos experimentos identificaron ramas informativas de esta familia. Se realizaron análisis genotípicos adicionales usando tres marcadores altamente polimórficos del cromosoma 11p15.5: D11S922, D11S1318 y D11S860 (Gyapay et al., 1994). Los genotipos y las puntuaciones LOD por pares para cada marcador se muestran en la Figura 1 y Tabla 1. De estos marcadores, TH y D11S1318 estaban completamente ligados. La recombinación se identificó con todos los demás marcadores ensayados, incluyendo HRAS, pero en cada caso se identificó una puntuación LOD positiva (+3 o superior) estadísticamente significativa. Estos datos indican que LQT1 está completamente ligado a TH y D11S1318 en este tronco familiar y que el gen de enfermedad se localiza centromérico de HRAS.

Para refinar la localización de LQT1, se realizaron análisis de haplotipo de K1532 (véase la Figura 1). Se identificaron nueve cromosomas que llevaban acontecimientos de recombinación informativos. Se observaron acontecimientos de recombinación teloméricos en el individuo no afectado IV-22 (entre D11S922 y TH), el individuo afectado IV-25 (entre D11S922 y TH), el individuo no afectado V-6 (entre HRAS y DIIS922) y el individuo afectado V-24 (entre HRAS y D11S922). Los acontecimientos de recombinación centroméricos se identificaron en el individuo no afectado V-17 (entre D11S860 y D11S454), el individuo afectado V-24 (entre D11S860 y DIIS454), el individuo no afectado V-34 (entre D11S860 y D11S454), el individuo no afectado VI-13 (entre D11S860 y D11S454), el individuo no afectado VI-14 (entre D11S454 y D11S318) y el individuo afectado VI-16 (entre D11S860 y D11S454). Estos datos indican que LQT1 se localiza entre D11S922 y D11S454. Junto con estudios recientes que ponen a LQT1 centromérico de TH (Russell et al., 1995), estos datos ponen a LQT1 en el intervalo entre TH y D11S454.

Se estimó el tamaño de la región que contiene LQT1 usando análisis de gel de campo pulsado con sondas genómicas del cromosoma 11P15.5. Las sondas de TH, D11S551 y D11S454 hibridaron con un fragmento de restricción de Mlu I de 700 kb (Figura 2). Estos datos sugirieron que la región que contiene LQT1 es inferior a 800 kb. La representación física de esta región se consiguió explorando genotecas de cromosoma artificial de levadura (YAC) y P1 con sondas de la región (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991). El orden de estos clones se confirmó usando análisis de hibridación in situ fluorescente (FISH) como: telómero-TH-D11S551-D11S679-D11S601-D11S454-centrómero. Los clones identificados en experimentos iniciales se usaron después para identificación de clones adyacentes, solapantes. El conjunto mínimo de clones del intervalo de LQT1 se muestra en la Figura 2.

TABLA 1 Puntuaciones LOD por pares entre marcadores de LQT1 y 11p15.5

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Ejemplo 8 Identificación y Caracterización de KVLQT1

La amplificación de exones con clones del mapa físico se realizó para identificar genes candidatos para LQT1. La captura de exones se realizó usando pSPL3B (Burn et al., 1995) en clones P1 genómicos como se ha descrito previamente (Buckler et al., 1991; Church et al., 1994). Inicialmente se caracterizó un mínimo de 128 exones capturados de cada clon P1 clasificando por tamaño los productos de PCR. De éstos, 400 clones se analizaron adicionalmente por secuenciación didesoxi usando un secuenciador automatizado A.L.F. (Pharmacia). Los análisis de secuencia de ADN y base de datos mostraron ocho posibles exones con similitud predicha de secuencia de aminoácidos con canales iónicos. La máxima similitud se obtuvo para un exón capturado de 238 pares de bases (4181A), con un 53% de similitud con proteínas de canal de potasio de múltiples especies, incluyendo similitud con una porción de una supuesta región de poro. Se usaron análisis de PCR para mapear 4181 A en el brazo corto del cromosoma 11 y en dos P1 del mapa físico (118A10, 18B12). Estos datos sugirieron que 4181A era parte de un gen de canal de potasio en el cromosoma 11p15.5.

Se usaron dos métodos diferentes de exploración de genoteca de ADNc para determinar si el exón capturado 4181A era parte de un gen. La hibridación en filtro de placa tradicional con una genoteca de ADNc cardiaco humano adulto condujo a la identificación de un único clon positivo. Se usó una variación de selección de ADNc para explorar una segunda genoteca de ADNc cardiaco (el Sistema de Selección Positiva de ADNc GENETRAPPER^{TM}, Life Technologies, Inc.) y se recuperaron doce clones independientes. Los análisis de secuencia de ADN mostraron alineamiento completo con secuencias obtenidas de 4181A y los demás exones capturados que se han descrito anteriormente. La secuencia compuesta de estos clones de ADNc se muestra en la Figura 3A. La fase de lectura abierta más larga incluye 1654 pares de bases. Se identificaron dos señales consenso de poliadenilación cadena arriba de la cola poli(A) en la región no traducida 3'. La identidad del codón de iniciación todavía no está determinada.

Este ADNc predijo una proteína con características estructurales de canales de potasio. Los análisis de hidropatía sugirieron una topología de seis regiones hidrófobas principales que pueden representar hélices \alpha transmembrana. Estas regiones comparten similitud de secuencia con dominios transmembrana S1-S6 de canal de potasio. En la Figura 3B se muestra una comparación de la secuencia predicha de aminoácidos obtenida del gen identificado y el canal de potasio Shaker (SHA) (Pongs et al., 1998). En la región que contiene S1-S6, la identidad de secuencia de aminoácidos fue del 30% y la similitud fue del 59%. La secuencia localizada 3' de S1-S6 no tenía similitud significativa con ninguna proteína conocida. Debido a que este gen tiene una alta similitud con genes de canal de potasio regulado por voltaje y se convirtió en un fuerte candidato para LQT1, se denominó KVLQT1.

Se usaron análisis de transferencia de Northern para determinar la distribución tisular de ARNm de KVLQT1. Las sondas de ADNc de KVLQT1 detectaron un transcrito de 3,2 kb en corazón, riñón, pulmón y placenta humanos, pero no en músculo esquelético, hígado o cerebro (Figura 4). El corazón mostró niveles máximos de ARNm de KVLQT1.

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Ejemplo 9 Caracterización del ADNc de KVLQT1 Completo

Los estudios que se han descrito anteriormente dieron como resultado la clonación y caracterización de un ADNc incompleto para KVLQT1. La secuencia de este ADNc incompleto predijo una proteína con seis hélices \alpha transmembrana hidrófobas (S1-S6) y una secuencia distintiva de poro de canal de K+ típica (Heginbotham et al., 1994). Sin embargo, este ADNc parecía carecer del dominio amino terminal y no se expresaba funcionalmente. Para definir la secuencia completa de KVLQT1 se exploraron varias genotecas de ADNc y se aisló un nuevo clon. La exploración se realizó radiomarcando un ADNc de KVLQT1 parcial con ^{32}P y explorando varias genotecas de ADNc obtenidas de Clontech. Se aisló un clon de 1,2 kb de una genoteca pancreática y se subclonó en pBluescript II y se secuenció. Este clon incluía un supuesto sitio de inicio de la traducción y una secuencia ATG en fase con los clones de KVLQT1 originales. Estos nuevos datos de secuencia se combinaron con los anteriores datos de secuencia para proporcionar la secuencia de ADNc que codifica la proteína completa. Esta secuencia de ADNc así como las regiones no traducidas 5' y 3' se muestran en las Figuras 12A-12D. La nueva secuencia de ADNc predice una proteína de 581 aminoácidos con un dominio S1 completo y una región N-terminal de 27 aminoácidos. Esto se muestra en la Figura 8A. Para garantizar que esta nueva secuencia era parte del gen KVLQT1 ligado al cromosoma 11p15.5, se usó un fragmento de restricción de XhoI de 135 pares de bases de esta región en experimentos de hibridación con ADN de un panel híbrido de células somáticas. El nuevo extremo 5' se mapeó en el brazo corto del cromosoma 11. El análisis de Northern mediante el uso de la nueva secuencia de KVLQT1 indicó hibridación con un único ARN mensajero de 3,2 kb en páncreas, corazón, riñón, pulmón y placenta humanos, pero no en cerebro, hígado o músculo esquelético (Figura 8B). Los análisis de Northern se realizaron usando un filtro Northern para múltiples tejidos (transferencia 1 de MTN humano, Clontech), como se describe por Curran et al., 1995.

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Ejemplo 10 Caracterización de Función de KVLQT1

Para definir la función de KVLQT1, se transfectaron células de ovario de hámster Chino (CHO) con el ADNc completo que se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9. El ADNc de KVLQT1 se subclonó en pCEP4 (InVitrogen). Las células CHO se cultivaron en medio F-12 de Ham y se transfectaron de forma temporal usando Lipofectamine (Gibco BRL). Las células se transfectaron durante 18 horas en placas de 35 mm que contenían 6 \mul de lipofectamine, 0,5 \mug de proteína verde fluorescente (pGreen Lantern-1, Gibco BRL) y 1,5 \mug de KVLQT1 en pCEP4. Las células fluorescentes se sometieron a pinzamiento de voltaje usando un amplificador de pinzamiento zonal Axopatch 200 (Axon Instruments) de 48 a 78 horas después de la transfección. La solución de baño contenía, en mM: NaCl 142, KCl 2, MgCl_{2} 1,2, CaCl_{2} 1,8, glucosa 11,1, tampón HEPES 5,5 (pH 7,4, 22-25ºC). La solución de pipeta contenía, en mM; glutamato potásico 110, KCl 20, MgCl_{2} 1,0, EGTA 5, K_{2}ATP 5, HEPES 10 (pH 7,3). La adquisición y los análisis de datos se realizaron usando pCLAMP6 (Axon Instruments). La dependencia de voltaje de la activación de corriente se determinó ajustando la relación entre corrientes de cola (determinada por extrapolación de fase de desactivación de corriente al final del pulso de ensayo) y potencial de ensayo con una función de Boltzmann. Las corrientes de cola se normalizaron con respecto al mayor valor para cada ovocito.

Se observó una corriente de K^{+} de salida, dependiente de voltaje después de la despolarización de la membrana a potenciales superiores a -60 mV (Figura 9A). Esta corriente alcanzó un estado de equilibrio en el intervalo de 1 segundo a +40 mV. La activación de la corriente estaba precedida por un breve retraso y la repolarización a -70 mV suscitó una corriente de cola con un aumento inicial de amplitud (un gancho) antes de la desactivación. Se observaron previamente ganchos de corriente de cola similares para canales de K^{+} de HERG y se atribuyeron a la recuperación de canales de la inactivación a una velocidad más rápida que la desactivación (Sanguinetti et al., 1995; Smith et al., 1996; Spector et al., 1996). La curva de activación para corriente de KVLQT1 era la mitad del máximo (V_{1/2}) a -11,6 \pm 0,6 mV y tenía un factor de pendiente de 12,6 \pm 0,5 mV (n = 6; Figura 9B).

Las propiedades biofísicas de KVLQT1 eran distintas de otras corrientes cardiacas de K^{+} conocidas. Se planteó la hipótesis de KVLQT1 se puede coensamblar con otra subunidad para formar un canal cardiaco conocido. La corriente de K^{+} de rectificación retardada de activación lenta, I_{Ks}, modula la repolarización de potenciales de acción cardiacos. A pesar del estudio intensivo, la estructura molecular del canal I_{Ks} no se comprende. Los datos fisiológicos sugieren que un componente del canal I_{Ks} es minK (Goldstein y Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang y Goldstein, 1995; Wang et al., 1996), una proteína de 130 aminoácidos con un único supuesto dominio transmembrana (Takumi et al., 1988). Sin embargo, el tamaño y la estructura de esta proteína han conducido a dudar de que minK sola forme canales funcionales (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993).

Para ensayar esta hipótesis, se cotransfectaron células CHO con ADNc de KVLQT1 y minK humano (hminK). Se subclonó un ADNc de hminK en pCEP4 (InVitrogen) y se realizó la transfección como se ha descrito anteriormente para KVLQT1 solo. Para la introducción por transfección de KVLQT1 y hminK se usaron 0,75 \mug de cada ADNc. Como se ha descrito previamente (Lesage et al., 1993), la transfección de células CHO con hminK solo no indujo ninguna corriente detectable (n = 10, Figura 9C). La introducción por transfección de hminK con KVLQT1 indujo una corriente de rectificación retardada de activación lenta que era mucho mayor que la corriente en células transfectadas con KVLQT1 solo (Figuras 9D y 9E). La activación lenta de corriente en células CHO cotransfectadas estaba precedida por un retraso que duró varios cientos de ms, indicando que no estaba presente ninguna corriente de canal de KVLQT1 homomérico significativa. La corriente no se saturó durante pulsos de despolarización largos y requirió una función triexponencial para describir del mejor modo el retraso inicial y dos fases de activación de corriente. Durante un pulso de despolarización de 30 s a +40 mV, la corriente se activó con constantes de tiempo de 0,68 \pm 0,18, 1,48 \pm 0,16 y 8,0 \pm 0,6 s (n = 4). La curva de activación isocrónica (7,5 s) para corriente tenía un V_{1/2} de 7,5 \pm 0,9 mV y un factor de pendiente de 16,5 \pm 0,8 mV (n = 7; Figura 9B). Por comparación, el V_{1/2} y la pendiente de la curva de activación de I_{Ks} cardiaco humano son 9,4 mV y 11,8 mV (Li et al., 1996). Ya que KVLQT1 y hminK se coexpresan en células CHO, la activación de I_{Ks} cardiaco es extremadamente lenta y se describió del mejor modo por una función triexponencial (Balser et al., 1990; Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990). La quinidina (50 \muM) bloqueó corrientes de cola en células CHO cotransfectadas en el 30 \pm 8% (n = 5), de forma similar a su efecto (bloqueo del 40-50%) en I_{Ks} en miocitos aislados (Balser et al., 1991). Por tanto, la coexpresión de KVLQT1 y hminK en células CHO indujo una corriente de K^{+} con propiedades biofísicas prácticamente idénticas a I_{Ks} cardiaco.

Para caracterizar adicionalmente las propiedades de hminK y KVLQT1, estos canales se expresaron por separado y de forma conjunta en ovocitos de Xenopus. Los ovocitos de Xenopus laevis se aislaron e inyectaron con ARNc como se describe por Sanguinetti et al., 1995. El ADNc de KVLQT1 se subclonó en pSP64 (Promega). El ADNc de hminK fue un obsequio de R. Swanson. Se usaron concentraciones aproximadamente equimolares de ARNc de KVLQT1 (5,8 ng por ovocito) y ARNc de hminK (1 ng por ovocito) para los experimentos de co-inyección. La solución de baño contenía, en mM: NaCl 98, KCl 2, MgCl_{2} 2, CaCl_{2} 0,1 y HEPES 5 (pH 7,6, 22-25ºC). Para experimentos de potencial de inversión se mantuvo la osmolaridad por sustitución equimolar de KCl por NaCl externo. Las corrientes se registraron usando técnicas convencionales de pinzamiento de voltaje con dos microelectrodos 3 días después de la inyección de ovocitos con ARNc (Sanguinetti et al., 1995). Las corrientes se filtraron a 0,5 kHz y se digitalizaron a 2 kHz. Los datos se presentan como media \pm e.t.m.

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Los ovocitos inyectados con ARN complementario de KVLQT1 expresaron una corriente de K^{+} de salida de activación rápida con una dependencia de voltaje de activación prácticamente idéntica a células CHO transfectadas con ADNc de KVLQT1 (Figuras 10A y 10B). La selectividad de K^{+} de canales de KVLQT1 se determinó midiendo el potencial de inversión (E_{rev}) de corrientes de cola en diferentes concentraciones de K extracelular ([K^{+}]_{e}). La pendiente de la relación entre E_{rev} y log[K^{+}]_{e} fue 49,9 \pm 0,4 mV (n = 7; Figura 10C), significativamente inferior a la predicha por la ecuación de Nernst (58 mV) para un canal de K^{+} perfectamente selectivo. La co-inyección de ovocitos con ARNc de KVLQT1 y hminK indujo una corriente similar a I_{Ks} (Figura 11C). La pendiente de la relación entre E_{rev} y log[K^{+}]_{e}
para ovocitos co-inyectados fue 49,9 \pm 4 mV (n = 6), similar a KVLQT1 solo y a I_{Ks} cardiaco de cobaya (49 mV) (Matsuura et al., 1987). La curva de activación isocrónica (7,5 s) para ovocitos co-inyectados tenía un V_{1/2} de 6,2 mV y una pendiente de 12,3 mV (Figura 11E), similar a I_{Ks} cardiaco.

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Ejemplo 11 Identificación de un Gen KVLQT1 en Xenopus

Al contrario que células CHO, hminK fue capaz de someterse a expresión funcional en ovocitos de Xenopus (Figura 11B). La corriente inducida (I_{sK}) fue menor que la corriente inducida en ovocitos co-inyectados, pero la cinética y la dependencia de voltaje de la activación eran similares (Figura 11A-E). Dos observaciones han conducido a la hipótesis de que I_{sK} en ovocitos de Xenopus se produce como resultado de canales formados por el coensamblaje de minK con una subunidad no identificada, expresada constitutivamente. En primer lugar, la magnitud de I_{sK} se satura después de la inyección de cantidades muy pequeñas de ARNc de minK (Figura 11D), sugiriendo que se requiere un componente endógeno de cantidad limitada para la expresión funcional (Wang y Goldstein, 1995; Cui et al., 1994). En segundo lugar, la expresión heteróloga de minK en células de mamífero no induce corriente detectable (Lesage et al., 1993) (Figura 9C), sugiriendo que minK no es suficiente para formar canales funcionales. Se planteó la hipótesis de que esta subunidad no identificada puede ser un homólogo de KVLQT1. Para ensayar esta hipótesis, se exploró una genoteca de ADNc de ovocito de Xenopus (Clontech) con un clon de ADNc de KVLQT1 que incluía los dominios S3-S5. Se aisló un clon parcial de 1,6 kb (XKVLQT1, Figura 8A). XKYLQT1 tiene una identidad del 88% a nivel de aminoácidos con la región correspondiente de KVLQT1 (Figura 8A). Estos datos sugieren que I_{sK} se produce por el coensamblaje de las proteínas XKVLQT1 y minK.

Se concluyó que KVLQT1 y hminK se coensamblan para formar el canal I_{Ks} cardiaco. Dos corrientes de K^{+} de rectificación retardada, I_{Kr} e I_{Ks}, modulan la duración del potencial de acción en miocitos cardiacos (Li et al., 1996; Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990). Estudios previos han implicado la disfunción de canales I_{Kr} en el síndrome de QT largo (Sanguinetti et al., 1995; Curran et al., 1995; Sanguinetti et al., 1996). La observación de que mutaciones de KVLQT1 también provocan este trastorno (Wang et al., 1996) y el descubrimiento de que KVLQT1 forma parte del canal I_{Ks}, indica que la disfunción de ambos canales cardiacos de K^{+} de rectificación retardada contribuye al riesgo de muerte súbita por arritmia cardiaca.

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Ejemplo 12 Cosegregación de Mutaciones de Sentido Erróneo de KVLQT1 con LQT en Seis Familias Grandes

Para ensayar la hipótesis de que KVLQT1 es LQT1, se usaron análisis de polimorfismo conformacional de cadena única (SSCP) para explorar para mutaciones funcionales en miembros afectados de K1532, la mayor familia con LQT que mostró ligamiento al cromosoma 11. Se realizó SSCP como se ha descrito previamente (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). Se aislaron productos normales y aberrantes de SSCP y se secuenciaron directamente como se ha descrito (Wang y Keating, 1994) o se subclonaron en pBluescript (SK+) (Strategene) usando el método del vector T (Marchuk et al., 1990). Cuando se usó el último método, varios clones se secuenciaron por el método didesoxi de terminación de cadena usando la Versión 2.0 de Sequenase^{TM} (United States Biochemicals, Inc.). Los análisis se centraron en la región entre S2 y S6 ya que estas regiones pueden ser importantes para la función de KVLTQ1. Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos basados en secuencias de ADNc y estos cebadores se usaron para reacciones de secuenciación cíclica con el P1 que contenía KVLQT1, 18B12 (Wang y Keating, 1994). Estos experimentos definieron secuencias intrónicas que flanqueaban exones que codifican S2-S6. Después se generaron cebadores adicionales a partir de estas secuencias intrónicas y se usaron para análisis de SSCP (Tabla 2).

Los análisis de SSCP identificaron un confórmero anómalo en los 70 miembros afectados de K1532 (Figura 5). Este confórmero aberrante no se observó en los 147 miembros no afectados de este tronco familiar o en ADN genómico de más de 200 individuos de control no relacionados (Q. Wang, resultados no publicados). La puntuación LOD de dos puntos para ligamiento entre esta anormalidad y LQT fue 14,19 a una fracción de recombinación de 0 (Tabla 1). No se observó recombinación entre KVLQT1 y LQT1, indicando que estos loci están completamente ligados. Los análisis de secuencia de ADN de los confórmeros normales y aberrantes de SSCP mostraron una sustitución de una única base, una transición de G a A, en el primer nucleótido del codón Val-125 (Figura 5 y Tabla 3). Esta mutación da como resultado una sustitución de valina a metionina en el dominio intracelular predicho entre S4 y S5.

Para ensayar adicionalmente la hipótesis de que mutaciones en KVLQT1 provocan LQT, se estudiaron muestras de ADN de miembros afectados de cinco grandes troncos familiares con LQT adicionales. Los análisis de ligamiento con marcadores polimórficos de esta región habían mostrado que el fenotipo de enfermedad estaba ligado al cromosoma 11 en estas familias (Q. Wang, resultados no publicados). Se identificaron confórmeros aberrantes de SSCP en miembros afectados de K1723, K2605, K1807 (Figura 5), K161 y K162 (Q. Wang, resultados no publicados). Las anormalidades de SSCP identificadas en K161 y K162 eran idénticas a las observadas en K1807 (Q. Wang, resultados no publicados). El confórmero aberrante de SSCP no se observó en miembros no afectados de estos troncos familiares o en muestras de ADN de más de 200 individuos de control no relacionados (Figura 5; Q. Wang, resultados no publicados). Se secuenciaron los confórmeros normales y aberrantes identificados en cada familia. El cambio de nucleótidos, el efecto codificante y la localización de cada mutación se resumen en la Tabla 3.

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TABLA 2 Cebadores de PCR usados para definir mutaciones de KVLQT1

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TABLA 3 Sumario de mutaciones de KVLQT1

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Ejemplo 13 Una Deleción Intragénica de KVLQT1 y Nueve Mutaciones de Sentido Erróneo Asociadas con LQT en Familias Pequeñas y Casos Esporádicos

Para identificar mutaciones adicionales asociadas con LQT en KVLQT1, se realizaron análisis de SSCP adicionales para pequeños troncos familiares y casos esporádicos. El SSCP mostró un confórmero aberrante en el tronco familiar 13216 (Figura 6). Los análisis de más de 200 individuos de control no relacionados no consiguieron mostrar esta anomalía (Q. Wang, resultados no publicados). Este confórmero aberrante se clonó y secuenció, mostrando una deleción de tres pares de bases que incluye los codones 38 y 39. Esta mutación da como resultado una sustitución de fenilalanina a triptófano y deleción de una glicina en el supuesto dominio S2 (Tabla 3).

Se identificaron los confórmeros aberrantes de SSCP en miembros afectados de nueve troncos familiares adicionales: K1777, K20925, K13119, K20926, K15019 (Figura 6), K2050, K163 y K163 (Q. Wang, resultados no publicados). Un confórmero aberrante de SSCP identificado en K2050 era idéntico al de K1723 y los confórmeros aberrantes identificados en K163 y K164 eran idénticos a los observados en K 1807. Ninguno de los confórmeros aberrantes se identificó en muestras de ADN de más de 200 individuos de control (Q. Wang, resultados no publicados). En cada caso, se secuenciaron los confórmeros normales y aberrantes. Estos datos se muestran en la Figura 6 y se resumen en la Tabla 3. En total, se identificaron mutaciones de KVLQT1 asociadas con LQT en 16 familias o casos esporádicos (Figura 7), proporcionando fuertes indicios de genética molecular de que las mutaciones en KVLQT1 provocan la forma ligada al cromosoma 11 de LQT.

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Ejemplo 14 Generación de Anticuerpo Policlonal frente a KVLQT1

Los segmentos de secuencia codificante de KVLQT1 se expresan como proteína de fusión en E. coli. La proteína sobreexpresada se purifica por elución en gel y se usa para inmunizar conejos y ratones usando un procedimiento similar al descrito por Harlow y Lane, 1988. Se ha demostrado que este procedimiento genera Ab frente a diversas proteínas adicionales (por ejemplo, véase Kraemer et al., 1993).

En resumen, un tramo de secuencia codificante de KVLQT1 se clona como una proteína de fusión en el plásmido PET5A (Novagen, Inc. Madison, WI). Después de la inducción con IPTG, la sobreexpresión de una proteína de fusión con el peso molecular esperado se verifica por SDS/PAGE. La proteína de fusión se purifica del gel por electroelución. La identificación de la proteína como el producto de fusión de KVLQT1 se verifica por secuenciación de proteína en el extremo N. A continuación, la proteína purificada se usa como un inmunógeno en conejos. Los conejos se inmunizan con 100 \mug de la proteína en adyuvante completo de Freund y se refuerzan dos veces en intervalos de 3 semanas, en primer lugar con 100 \mug de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund seguido de 100 \mug de inmunógeno de PBS. Dos semanas después se recoge suero que contiene anticuerpos.

Este procedimiento se repite para generar anticuerpos frente a las formas mutantes del gen KVLQT1. Estos anticuerpos, junto con anticuerpos contra el KVLQT1 de tipo silvestre, se usan para detectar la presencia y el nivel relativo de las formas mutantes en diversos tejidos y fluidos biológicos.

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Ejemplo 15 Generación de Anticuerpos Monoclonales Específicos para KVLQT1

Se generan anticuerpos monoclonales de acuerdo con el siguiente protocolo. Se inmunizan ratones con un inmunógeno que comprende KVLQT1 intacto o péptidos KVLQT1 (de tipo silvestre o mutante) conjugado con hemocianina de lapa californiana usando glutaraldehído o EDC como se conoce bien.

El inmunógeno se mezcla con un adyuvante. Cada ratón recibe cuatro inyecciones de 10 a 100 \mug de inmunógeno y después de la cuarta inyección se toman muestras de sangre de los ratones para determinar si el suero contiene anticuerpo frente al inmunógeno. Se determina el título sérico por ELISA o RIA. Los ratones con sueros que indican la presencia de anticuerpo frente al inmunógeno se seleccionan para producción de hibridoma.

Se eliminan los bazos de ratones inmunes y se prepara una suspensión de una sola célula (véase Harlow y Lane, 1988). Las fusiones celulares se realizan esencialmente como se describe por Kohler y Milstein, 1975. En resumen, células de mieloma P3.65.3 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD) se fusionan con células esplénicas inmunes usando polietilenglicol como se describe por Harlow y Lane, 1988. Las células se siembran a una densidad de 2x10^{5} células/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Los pocillos individuales se examinan para desarrollo y los sobrenadantes de los pocillos con desarrollo se ensayan para la presencia de anticuerpos específicos para KVLQT1 por ELISA o RIA usando la proteína diana KVLQT1 de tipo silvestre o mutante. Las células en pocillos positivos se expanden y subclonan para establecer y confirmar la monoclonalidad.

Los clones con las especificidades deseadas se expanden y desarrollan como ascitis en ratones o en un sistema de fibra hueca para producir suficientes cantidades de anticuerpo para caracterización y desarrollo de ensayo.

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Ejemplo 16 Ensayo Sándwich para KVLQT1

Se une una anticuerpo monoclonal a una superficie sólida tal como una placa, un tubo, una perla o una partícula. Preferiblemente, el anticuerpo se une a la superficie del pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. Se añaden 100 \mul de muestra (por ejemplo, suero, orina, citosol tisular) que contiene el péptido/proteína KVLQT1 (de tipo silvestre o mutantes) al anticuerpo en fase sólida. La muestra se incuba durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación se decanta el fluido de la muestra y la fase sólida se lava con tampón para eliminar material no unido. Se añaden 100 \mul de un segundo anticuerpo monoclonal (a un determinante diferente del péptido/proteína KVLQT1) a la fase sólida. Este anticuerpo se marca con una molécula detectora (por ejemplo, 125-I, enzima, fluoróforo o un cromóforo) y la fase sólida con el segundo anticuerpo se incuba durante dos h a temperatura ambiente. El segundo anticuerpo se decanta y la fase sólida se lava con tampón para eliminar material no unido.

Se cuantifica la cantidad de marcador unido, que es proporcional a la cantidad de péptido/proteína KVLQT1 presente en la muestra. Se realizan ensayos por separado usando anticuerpos monoclonales que son específicos para el KVLQT1 de tipo silvestre, así como anticuerpos monoclonales específicos para cada una de las mutaciones identificadas en KVLQT1.

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Ejemplo 17 Ensayo para Seleccionar Fármacos que Afectan al Canal de K^{+} de KVLQT1 y minK

Con el conocimiento de que KVLQT1 y minK se coensamblan para formar un canal cardiaco de potasio I_{Ks}, actualmente es posible idear un ensayo para seleccionar fármacos que tendrán un efecto sobre este canal. Los dos genes, KVLQT1 y minK, se introducen por cotransfección en ovocitos o células de mamífero y se coexpresan como se ha descrito anteriormente. La cotransfección se realiza usando cualquier combinación de KVLQT1 y minK de tipo silvestre o mutado específicamente. Cuando uno de los genes usado para la cotransfección contiene una mutación que provoca LQT, se observa un cambio en la corriente inducida en comparación con la cotransfección solamente con los genes de tipo silvestre. Se añade un fármaco candidato a la solución de baño de las células transfectadas para ensayar los efectos de los fármacos candidatos sobre la corriente inducida. Un fármaco candidato que altera la corriente inducida de tal forma que es más próxima a la corriente observada con células cotransfectadas con KVLQT1 y minK de tipo silvestre es útil para tratar LQT.

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Solicitud PCT publicada WO 93/07282.

Patente US 4.376.110

Patente US 4.486.530.

Patente US 4.868.105.

Patente US 5.252.479.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

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Documentos de patentes citados en la descripción

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1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Fundación de Investigación de la Universidad de Utah

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: KVLQT1 - UN GEN DE SÍNDROME DE QT LARGO QUE CODIFICA KVLQT1 QUE SE COENSAMBLA CON mink PARA FORMAR CANALES CARDIACOS DE POTASIO I_{Ks}

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Venable, Baetjer, Howard & Civiletti, LLP

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1201 New York Avenue, N. W., Suite 1000

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: DC

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20005

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Word para Windows 6.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: WO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-DIC-1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Ihnen, Jeffrey L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 28.957

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19780-116871-WO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 202-962-4800

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 202-962-8300

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligómero sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATCCTGA GGATGCT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligómero sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCTGGCT GAGAAGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATCGTGC TGGTGGTGTT CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCCTGGTC TGGAAACCTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTCCCTG GGGCCCTGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCGGGGGAG CTTGTGGCAC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCATCCGC TTCCTGCAGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGGCCCCT ACCCTAACCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGGAGCC CGAACTGTGT GT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTCCTGCCC ACTCCTCAGC CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAGGACC CCAGCTGTCC AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTGACCA CTGTCCCTCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGGCAGTG GCCTGTGTGG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGTGACC AAAATGACAG TGAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2633 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..1642

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 547 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 61 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 137 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 58 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 376 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Xenopus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 581 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2821 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 88..1830

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 581 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

26

27

28

Claims (4)

1. Método para evaluar un riesgo del síndrome de QT largo en un sujeto humano que comprende cribar dicho sujeto para una mutación en un gen KVLQT1 comparando la secuencia del gen KVLQT1 o sus productos de expresión aislados de una muestra tisular de dicho sujeto con un gen KVLQT1 de tipo salvaje o sus productos de expresión, en el que el gen KVLQT1 de tipo salvaje tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 15 y en el que una mutación en la secuencia del sujeto es indicativa de un riesgo de síndrome de QT largo.

2. Método de la reivindicación 1, en el que dicho producto de expresión se selecciona del grupo que consiste en ARNm del gen KVLQT1 y un polipéptido KVLQT1 codificado por el gen KVLQT1.

3. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que se comparan el ADN o ARN que codifica los aminoácidos 38-39 del polipéptido KVLQT1 de la SEC ID Nº: 16 o los aminoácidos 38-39 del polipéptido KVLQT1 de la SEC ID Nº: 16.

4. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ADN o ARN se compara con las mutaciones mostradas en la Tabla 3.