ES2326146T3

ES2326146T3 - Peptidos de union a hla y sus usos.

Info

Publication number: ES2326146T3
Application number: ES99928792T
Authority: ES
Inventors: Alessandro Sette; John Sidney; Scott Southwood
Original assignee: IDM Pharma Inc
Current assignee: IDM Pharma Inc
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2009-10-01
Anticipated expiration: 2019-06-17
Also published as: EP1089757B1; DE69940774D1; EP2036573A1; EP1089757A1; WO1999065522A1; EP1089757A4; ATE429247T1; AU4577899A; JP2010090167A; JP2002518346A; CA2330824A1

Abstract

Péptido inmunogénico aislado constituido por la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4).

Description

Péptidos de unión a HLA y sus usos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para prevenir, tratar o diagnosticar una serie de estados patológicos tales como enfermedades víricas y cánceres. En particular, proporciona péptidos novedosos capaces de unirse a moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y de inducir una respuesta inmunitaria.

Las moléculas de MHC se clasifican como moléculas de clase I o clase II. Las moléculas de MHC de clase II se expresan principalmente en células implicadas en la iniciación y el sostenimiento de respuestas inmunitarias, tales como linfocitos T, linfocitos B, macrófagos, etc. Las moléculas de MHC de clase II se reconocen por los linfocitos T cooperadores e inducen la proliferación de linfocitos T cooperadores y la amplificación de la respuesta inmunitaria al péptido inmunogénico particular que se exhibe. Las moléculas de MHC de clase I se expresan en casi todas las células nucleadas y se reconocen por linfocitos T citotóxicos (CTL), que destruyen entonces las células portadoras de antígeno. Los CTL son particularmente importantes en el rechazo de tumores y en el combate de infecciones víricas.

Los CTL reconocen el antígeno en forma de un fragmento peptídico unido a moléculas de MHC de clase I en lugar del mismo antígeno extraño intacto. El antígeno debe sintetizarse normalmente de forma endógena por la célula y se degrada una porción del antígeno proteico en fragmentos peptídicos pequeños en el citoplasma. Algunos de estos péptidos pequeños se trasladan a un compartimento pre-Golgi e interactúan con cadenas pesadas de clase I para facilitar un plegamiento apropiado y la asociación con la subunidad \beta2 de microglobulina. El complejo peptídico MHC de clase I se orienta entonces a la superficie celular para la expresión y el reconocimiento potenciales por CTL específicos.

Las investigaciones de la estructura cristalina de la molécula de MHC de clase I humana HLA-A2.1 indican que se crea un surco de unión peptídica mediante el plegamiento de los dominios \alpha1 y \alpha2 de la cadena pesada de clase I (Bjorkman y col., Nature 329: 506 (1987). Sin embargo, en estas investigaciones no se determinó la identidad de los péptidos unidos al surco.

Buus y col., Science 242: 1065 (1988) describieron por primera vez un procedimiento para la elución ácida de péptidos unidos a MHC. Posteriormente, Rammensee y sus colaboradores (Falk y col., Nature 351: 290 (1991) han desarrollado un enfoque para caracterizar a péptidos procesados naturalmente unidos a moléculas de clase I. Otros investigadores han conseguido exitosamente la secuenciación directa de aminoácidos de los péptidos más abundantes en diversas fracciones de HPLC mediante la secuenciación automatizada convencional de péptidos eluidos a partir de moléculas de clase I de tipo B (Jardetzky, y col., Nature 353: 326 (1991) y de tipo A2.1 mediante espectrometría de masas (Hunt, y col., Science 225: 1261 (1992). Se ha presentado una revisión de la caracterización de péptidos procesados naturalmente en MHC de clase I por Rötzschke y Falk (Rötzschke y Falk, Immunol. Today 12: 447 (1991).

Sette y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3296 (1989) mostraron que podían usarse motivos específicos de alelo de MHC para predecir la capacidad de unión a MHC. Schaeffer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4649 (1989) mostraron que la unión a MHC estaba relacionada con la inmunogenicidad. Varios autores (De Bruijn y col., Eur. J. Immunol., 21: 2963-2970 (1991); Pamer y col., Nature 353: 852-955 (1991)) han proporcionado pruebas preliminares de que los motivos de unión de clase I pueden aplicarse a la identificación de péptidos inmunogénicos potenciales en modelos animales. Los motivos de clase I específicos de una serie de alelos humanos de una clase dada de isotipo I están todavía por describir. Es deseable que las frecuencias combinadas de estos diferentes alelos sean suficientemente altas para cubrir una gran fracción o quizás la mayoría de la población cruzada humana.

A pesar de los desarrollos de la técnica, la técnica anterior tiene que proporcionar todavía una vacuna o agente terapéutico basado en péptido humano útil basado en este trabajo. La presente invención proporciona estas y otras ventajas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un péptido inmunogénico aislado que consiste en la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4). Se describen también en la presente memoria péptidos inmunogénicos que tienen motivos de unión específicos de alelo, tales como motivos de unión a moléculas HLA-A2.1. Los péptidos inmunogénicos que se unen al alelo de MHC apropiado son preferiblemente de 9 a 10 residuos de longitud y comprenden residuos conservados en ciertas posiciones tales como las posiciones 2 y 9. Además, los péptidos no comprenden residuos de unión negativa como se definen en la presente memoria en otras posiciones tales como las posiciones 1, 3, 6 y/o 7 en el caso de péptidos de 9 aminoácidos de longitud y en las posiciones 1, 3, 4, 5, 7, 8 y/o 9 en el caso de péptidos de 10 aminoácidos de longitud. La presente invención define las posiciones en un motivo que posibilitan la selección de péptidos que se unirán eficazmente a HLA A2.1.

Los motivos de los péptidos descritos en la presente memoria incluyen péptidos de 9 aminoácidos que tienen un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N seleccionado del grupo constituido por L, M, I, V, A, T y Q y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal seleccionado del grupo constituido por V, L, I, A, M y T. En una realización preferida, el péptido puede tener un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N seleccionado del grupo constituido por V, A, T o Q; y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal seleccionado del grupo constituido por L, M, I, V, A y T. Si el péptido tiene 10 residuos, contendrá un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N seleccionado del grupo constituido por L, M, I, V, A, T y Q; y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal seleccionado del grupo constituido por V, I, L, A, T y M; estando separados por 7 residuos los primer y segundo residuos conservados.

La presente invención proporciona también composiciones que comprenden el péptido inmunogénico constituido por la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4). La composición puede comprender adicionalmente un péptido inmunogénico adicional. Los péptidos inmunogénicos son típicamente de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos y comprenden residuos conservados implicados en la unión a proteínas codificadas por el alelo de MHC apropiado. Se han identificado una serie de motivos específicos de alelo.

Por ejemplo, el motivo de HLA-A3.2 comprende desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado de L, M, I, V, S, A, T, F, C, G o D en posición 2 y un segundo residuo conservado de K, R, Y, H, F o A en el extremo C-terminal. Los primer y segundo residuos conservados están preferiblemente separados por 6 a 7 residuos.

El motivo de HLA-A1 comprende desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado en posición 2 respecto al extremo N de T, S o M, y un segundo residuo conservado de Y en el extremo C. Como alternativa, el péptido puede tener un residuo conservado de D, E, A, S o T en posición 3 respecto al extremo N y un residuo conservado de Y en el extremo C.

El motivo de HLA-A11 comprende desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado de T, V, M, L, I, S, A, G, N, C D o F en posición 2 y un residuo conservado C-terminal de K, R, Y o H. El primer y segundo residuos conservados están preferiblemente separados por 6 ó 7 residuos.

El motivo de HLA-A24.1 comprende desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado de Y, F, W o M en posición 2 y un residuo conservado C-terminal de F, I, W o L. El primer y segundo residuos conservados están preferiblemente separados por 6 a 7 residuos.

Pueden identificarse los epítopos de una serie de proteínas diana inmunogénicas usando los péptidos de la invención. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de cáncer de próstata (PSA), antígenos de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs), antígenos de hepatitis C, antígenos de virus de Epstein-Barr, antígenos de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), herpesvirus de sarcoma de Kaposi (KSHV), papilomavirus humano (HPV), antígenos de virus Lassa, Mycobacterium tuberculosis (MT), p53, CEA, antígeno de superficie de tripanosoma (TSA) y Her2/neu. Por tanto, los péptidos son útiles en composiciones farmacéuticas para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico tanto in vivo como ex vivo.

Dibujos

No aplicable.

Definiciones

El término "péptido" se usa intercambiablemente con "oligopéptido" en la presente memoria descriptiva para designar una serie de residuos, típicamente L-aminoácidos, conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de aminoácidos adyacentes. Los oligopéptidos de la invención son de menos de aproximadamente 15 residuos de longitud y consisten habitualmente en entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos, preferiblemente 9 ó 10 residuos.

Un "péptido inmunogénico" es un péptido que comprende un motivo específico de alelo tal que el péptido se unirá a una molécula de MHC e inducirá una respuesta de CTL. Los péptidos inmunogénicos de la invención son capaces de unirse a una molécula de HLA-A2.1 apropiada e inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos contra el antígeno del que deriva el péptido inmunogénico.

Los péptidos inmunogénicos se identifican convenientemente usando los algoritmos descritos en la presente memoria. Los algoritmos son procedimientos matemáticos que producen una puntuación que posibilita la selección de péptidos inmunogénicos. Típicamente, se usa la puntuación algorítmica con un "umbral de unión" para posibilitar la selección de péptidos que tienen una alta probabilidad de unirse con una cierta afinidad y que serán a su vez inmunogénicos. El algoritmo está basado en los efectos sobre la unión a MHC de un aminoácido particular en una posición particular de un péptido o en los efectos sobre la unión de una sustitución particular en un péptido que contiene un motivo.

Un "residuo conservado" es un aminoácido que aparece con una frecuencia significativamente mayor de lo que se esperaría por una distribución aleatoria en una posición particular en un péptido. Típicamente, un residuo conservado es aquel en que la estructura de MHC puede proporcionar un punto de contacto con el péptido inmunogénico. Al menos uno a tres o más, preferiblemente dos, residuos conservados en un péptido de longitud definida definen un motivo de un péptido inmunogénico. Estos residuos están típicamente en estrecho contacto con el surco de unión peptídica, con sus cadenas laterales enterradas en bolsillos específicos del surco mismo. Típicamente, un péptido inmunogénico comprenderá hasta tres residuos conservados, más habitualmente dos residuos conservados.

Como se usa en la presente memoria, "residuos de unión negativa" son aminoácidos que si están presentes en ciertas posiciones (por ejemplo, las posiciones 1, 3 y/o 7 de un péptido de 9 unidades) darán como resultado un péptido que no se une o se une mal y a su vez no consigue ser inmunogénico, concretamente, inducir una respuesta de CTL.

El término "motivo" designa el patrón de residuos en un péptido de longitud definida, habitualmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 11 aminoácidos, que se reconoce por un alelo de MHC particular. Los motivos peptídicos son típicamente diferentes para cada alelo de MHC humano y difieren en el patrón de residuos altamente conservados y residuos negativos.

El motivo de unión de un alelo puede definirse con grados crecientes de precisión. En un caso, están presentes todos los residuos conservados en las posiciones correctas en un péptido y no hay residuos negativos en las posiciones 1,3 y/o 7.

Las frases "aislado" o "biológicamente puro" designan material que está sustancial o esencialmente exento de componentes que lo acompañan normalmente cuando se encuentra en su estado nativo. Por tanto, los péptidos de esta invención no contienen materiales asociados normalmente con su entorno in situ, por ejemplo, moléculas de MHC I sobre células presentadoras de antígeno. Incluso cuando se ha aislado una proteína en una banda homogénea o dominante, hay trazas de contaminantes en el intervalo de 5-10% de la proteína nativa que se copurifican con la proteína deseada. Los péptidos aislados de esta invención no contienen dicha proteína copurificada endógena.

El término "residuo" designa un aminoácido o mimético aminoacídico incorporado a un oligopéptido mediante un enlace amida o mimético de enlace amida.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a la determinación de motivos peptídicos específicos de alelo para subtipos alélicos de MHC de clase I humano (a veces designados como HLA). Estos motivos se usan entonces para definir epítopos de linfocitos T de cualquier antígeno deseado, particularmente aquellos asociados a enfermedades víricas, cánceres o enfermedades autoinmunitarias humanos, para los que es conocida la secuencia aminoacídica del antígeno potencial o dianas autoantigénicas.

Pueden identificarse de esta manera epítopos en una serie de proteínas diana potenciales. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA), antígenos de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs), antígenos de hepatitis C, antígenos de virus de Epstein-Barr, antígenos de melanoma (por ejemplo, MAGE-1), antígenos de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), antígenos de papilomavirus humano (HPV), de virus Lassa, de Mycobacterium tuberculosis (MT), p53, CEA, antígeno de superficie de tripanosoma (TSA) y Her2/neu.

Se sintetizan péptidos que comprenden los epítopos de estos antígenos y se ensaya entonces su capacidad de unirse a moléculas de MHC apropiadas en ensayos que usan, por ejemplo, moléculas de clase I purificadas y péptidos radioyodados y/o células que expresan moléculas de clase I vacías, por ejemplo, mediante tinción inmunofluorescente y microfluorometría de flujo, ensayos de ensamblaje de clase I dependientes de péptido e inhibición del reconocimiento de CTL mediante competición peptídica. En aquellos péptidos que se unen a la molécula de clase I, se evalúa adicionalmente su capacidad de servir como dianas para CTL derivados de individuos infectados o inmunizados, así como su capacidad de inducir respuestas de CTL primarias in vitro o in vivo que puedan dar lugar a poblaciones de CTL capaces de reaccionar con células diana infectadas víricamente o células tumorales como agentes terapéuticos potenciales.

Los antígenos de MHC de clase I están codificados por los loci HLA-A, B y C. Los antígenos de HLA-A y B se expresan en la superficie celular a densidades aproximadamente iguales, mientras que la expresión de HLA-C es significativamente menor (quizás como máximo 10 veces menor). Cada uno de estos loci tiene una serie de alelos. Los motivos de unión a péptido de la invención son relativamente específicos de cada subtipo alélico.

Para vacunas basadas en péptido, los péptidos comprenden preferiblemente un motivo reconocido por una molécula de MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana. Puesto que los alelos de MHC aparecen con diferentes frecuencias en diferentes grupos étnicos y razas, la elección del alelo de MHC diana puede depender de la población diana. La Tabla 1 muestra la frecuencia de diversos alelos en los productos del locus HLA-A entre diferentes razas. Por ejemplo, la mayoría de la población caucásica puede estar cubierta por péptidos que se unen a cuatro subtipos alélicos de HLA-A, específicamente HLA-A2.1, A1, A3.2 y A24.1. De forma similar, la mayoría de la población asiática está comprendida con la adición de péptidos que se unen a un quinto alelo de HLA-A11.2.

TABLA 1

1

2

Tabla recopilada a partir de DuPont, "Immunobiology of HLA", Vol. 1, "Histocompatibility Testing" 1987, Springer-Verlag, Nueva York 1989.

* N - negroide; A = asiático; C = caucásico. Los números entre paréntesis representan el número de individuos incluidos en el análisis.

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La nomenclatura usada para describir compuestos peptídicos sigue la práctica convencional en la que el grupo amino se presenta a la izquierda (extremo N) y el grupo carboxilo a la derecha (extremo C) de cada residuo aminoacídico. En las fórmulas que representan realizaciones específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino- y carboxiterminales, aunque no mostrados específicamente, están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológicos, a menos que se especifique otra cosa. En las fórmulas estructurales aminoacídicas, cada residuo se representa generalmente por las designaciones estándar de tres o una letra. La forma L de un residuo aminoacídico se representa mediante una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D de aquellos aminoácidos que tienen formas D se representa por una sola letra minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de carbono asimétrico y se designa simplemente como "Gly" o G.

Los procedimientos usados para identificar péptidos de la presente invención siguen generalmente los procedimientos dados a conocer en Falk y col., Nature 351: 290 (1991). Brevemente, los procedimientos implican el aislamiento a gran escala de moléculas de MHC de clase I, típicamente mediante inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad, a partir de la célula o línea celular apropiada. Los ejemplos de otros procedimientos para el aislamiento de la molécula de MHC deseada igualmente conocidos por el experto incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en lectina, exclusión por tamaño, cromatografía de ligando de alta resolución y una combinación de todas las técnicas anteriores.

En el caso típico, se usa la inmunoprecipitación para aislar el alelo deseado. Pueden usarse una serie de protocolos dependiendo de la especificidad de los anticuerpos usados. Por ejemplo, los reactivos de mAb específicos de alelo pueden usarse para la purificación por afinidad de las moléculas de HLA-A, HLA-B1 y HLA-C. Están disponibles varios reactivos de mAb para el aislamiento de moléculas de HLA-A (véase la Tabla 2). Por tanto, para cada uno de los alelos de HLA-A orientados, están disponibles reactivos que pueden usarse para el aislamiento directo de las moléculas de HLA-A. Se usan exitosamente columnas de afinidad preparadas con estos mAb usando técnicas estándar para purificar los productos alélicos de HLA-A respectivos.

Además de mAb específicos de alelo, podrían usarse mAb anti-HLA-A, B y C ampliamente reactivos tales como W6/32 y B9.12.1, y un mAb anti-HLA-B, C, B 1.23.2, en protocolos de purificación por afinidad alternativos como se describen en aplicaciones anteriores.

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TABLA 2

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Los péptidos unidos al surco de unión peptídica de las moléculas de MHC aisladas se eluyen típicamente usando tratamiento ácido. Los péptidos pueden disociarse también de moléculas de clase I mediante una variedad de medios desnaturalizantes estándar tales como calor, pH, detergentes, sales, agentes caotrópicos o una combinación de los mismos.

Se separan adicionalmente las fracciones peptídicas de las moléculas de MHC mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa y se secuencian. Los péptidos pueden separarse mediante una variedad de otros medios estándar bien conocidos por el experto, incluyendo filtración y ultrafiltración, electroforesis, cromatografía por tamaño, precipitación con anticuerpos específicos, cromatografía de intercambio iónico, isoelectroenfoque y
similares.

La secuenciación de los péptidos aislados puede efectuarse según técnicas estándar tales como degradación de Edman (Hunkapiller, y col., Methods Enzymol. 91, 399 (1983)). Otros procedimientos adecuados para secuenciar incluyen secuenciación por espectrometría de masas de péptidos individuales como se describe anteriormente (Hunt, y col., Science 225: 1261 (1992)). La secuenciación aminoacídica de péptidos heterogéneos brutos (por ejemplo, fracciones de HPLC combinadas) de diferentes moléculas de clase I revela típicamente un motivo de secuencia característico para cada alelo de clase I.

La definición de motivos específicos de diferentes alelos de clase I permite la identificación de epítopos peptídicos potenciales de una proteína antigénica cuya secuencia aminoacídica es conocida. Típicamente, la identificación de epítopos peptídicos potenciales se lleva a cabo inicialmente usando un ordenador para explorar en la secuencia aminoacídica de un antígeno deseado la presencia de motivos. Se sintetizan entonces las secuencias epitópicas. Se mide la capacidad de unirse a moléculas de MHC de clase I con una variedad de modos diferentes. Un modo es un ensayo de unión a molécula de clase I como se describe en las solicitudes relacionadas, observadas anteriormente. Otras alternativas descritas en la bibliografía incluyen la inhibición de la presentación de antígeno (Sette, y col., J. Immunol. 141: 3893 (1991), ensayos de ensamblaje in vitro (Townsend, y col. Cell 62: 285 (1990) y ensayos basados en FACS que usan células mutadas tales como RMA-S (Melief, y col., Eur. J. Immunol. 21: 2963
(1991)).

A continuación, se ensaya en los péptidos que se muestran positivos en el ensayo de unión a MHC de clase I la capacidad de los péptidos de inducir respuestas de CTL específicas in vitro. Por ejemplo, puede ensayarse en células presentadoras de antígeno que se han incubado con un péptido la capacidad de inducir respuestas de CTL en poblaciones celulares sensibles. Las células presentadoras de antígeno pueden ser células normales tales como células mononucleares de sangre periférica o células dendríticas (Inaba, y col., J. Exp. Med. 166: 182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol. 18: 219 (1988)).

Como alternativa, se usan convenientemente líneas celulares mamíferas mutantes que son deficientes en su capacidad de cargar moléculas de clase I con péptidos procesados internamente, tales como las líneas celulares de ratón RMA-S (Kärre, y col. Nature, 319: 675 (1986); Ljunggren, y col., Eur. J. Immunol. 21: 2963-2970 (1991)) y el híbrido de linfocitos T somáticos humanos T-2 (Cerundolo, y col., Nature 345: 449-452 (1990)), y que se han transfectado con los genes de clase I humanos apropiados, cuando se añade péptido a los mismos, para ensayar la capacidad del péptido de inducir respuestas primarias de CTL. Otras líneas celulares eucarióticas que podrían usarse incluyen diversas líneas celulares de insecto tales como de larvas de mosquito (líneas celulares ATCC CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), gusano de seda (ATTC CRL 8851), gusano cogollero (TCC CRL 1711), polilla (ATCC CCL 80) y líneas celulares de Drosophila tales como la línea celular Schneider (véase Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365
(1927)).

Se aíslan convenientemente linfocitos de sangre periférica después de una sencilla venopunción o leucocitaféresis de donantes normales o pacientes y se usan como fuentes de células sensibles de precursores de CTL. En una realización, se incuban las células presentadoras de antígeno apropiadas con 10-100 \muM de péptido en medio exento de suero durante 4 horas en condiciones de cultivo apropiadas. Se incuban entonces in vitro las células presentadoras de antígeno cargadas con péptido con las poblaciones de células sensibles durante 7 a 10 días en condiciones de cultivo optimizadas. Puede determinarse la activación positiva de CTL ensayando en los cultivos la presencia de CTL que matan las células diana radiomarcadas, tanto dianas con pulsos de péptido específico como células diana que expresan la forma procesada endógenamente del antígeno vírico o tumoral relevante del que derivaba la secuencia
peptídica.

Se determinan la especificidad y restricción de MHC de los CTL ensayando frente a diferentes péptidos células diana que expresan MHC de clase I humano apropiado o inapropiado. Los péptidos que se muestran positivos en los ensayos de unión a MHC y dan lugar a respuestas de CTL específicas se designan en la presente memoria como péptidos inmunogénicos.

Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse sintéticamente o mediante tecnología de ADN recombinante o a partir de fuentes naturales tales como virus o tumores enteros. Aunque el péptido estará preferiblemente exento de otras proteínas de célula hospedadora de origen natural y fragmentos de las mismas, en algunas realizaciones los péptidos pueden estar conjugados sintéticamente con fragmentos o partículas nativos.

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Los polipéptidos o péptidos pueden ser de una variedad de longitudes, en su forma neutra (no cargada) o en formas que son sales, y exentas de modificaciones tales como glucosilación, oxidación de cadena lateral o fosforilación, o conteniendo estas modificaciones, sujetos a la condición de que la modificación no destruya la actividad biológica de los polipéptidos como se describen en la presente memoria.

Deseablemente, el péptido será lo menor posible manteniendo sustancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando sea posible, puede ser deseable optimizar los péptidos de la invención a una longitud de 9 a 10 residuos aminoacídicos, proporcionados en tamaño con péptidos víricos procesados endógenamente o péptidos de célula tumoral que están unidos a moléculas de MHC de clase I sobre la superficie celular.

Los péptidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse según sea necesario para proporcionar ciertos atributos deseados, por ejemplo características farmacológicas mejoradas, aumentando o al menos reteniendo sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado de unirse a la molécula de MHC deseada y activar el linfocito T apropiado. Por ejemplo, los péptidos pueden someterse a diversos cambios, tales como sustituciones, conservativas o no conservativas, pudiendo proporcionar dichos cambios ciertas ventajas en su uso, tales como una unión a MHC mejorada. Por sustituciones conservativas se entiende reemplazar un residuo aminoacídico por otro que sea biológica y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrófobo por otro, o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg y Phe, Tyr. El efecto de sustituciones aminoacídicas individuales puede sondearse también usando D-aminoácidos. Dichas modificaciones pueden hacerse usando procedimientos de síntesis peptídica bien conocidos como se describen, por ejemplo, en Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany & Merrifield, "The Peptides", Gross & Meienhofer, ed. (N.Y., Academic Press), pág. 1-284 (1979); y Stewart & Young, "Solid Phase Peptide Síntesis", (Rockford, III., Pierce), 2ª Ed. (1984).

Los péptidos pueden modificarse también extendiendo o reduciendo la secuencia aminoacídica del compuesto, por ejemplo, mediante la adición o deleción de aminoácidos. Los péptidos o análogos pueden modificarse también alterando el orden o la composición de ciertos residuos, apreciándose fácilmente que ciertos residuos aminoacídicos esenciales para la actividad biológica, por ejemplo aquellos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, generalmente no pueden alterarse sin un efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no tienen que limitarse a los de origen natural en proteínas, tales como L-\alpha-aminácidos o sus D-isómeros, sino que pueden incluir aminoácidos no naturales también tales como \beta- y -\delta-aminoácidos, así como muchos derivados de L-\alpha-aminoácidos.

Típicamente, se emplea una serie de péptidos con sustituciones aminoacídicas individuales para determinar el efecto de la carga electrostática, hidrofobicidad, etc. sobre la unión. Por ejemplo, se prepara una serie de sustituciones aminoacídicas cargadas positivamente (por ejemplo, Lys o Arg) o cargadas negativamente (por ejemplo, Glu) a lo largo del péptido, revelando diferentes patrones de sensibilidad frente a diversas moléculas de MHC y receptores de linfocitos T. Además, pueden emplearse sustituciones múltiples que usan restos pequeños relativamente neutros tales como Ala, Gly, Pro o residuos similares. Las sustituciones pueden ser homoligoméricas o heteroligoméricas. El número y tipo de residuos que se sustituyen o añaden dependen del espaciado necesario entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que son buscados (por ejemplo, hidrofobicidad frente a hidrofilicidad). Puede conseguirse también una afinidad de unión aumentada por una molécula de MHC o receptor de linfocito T mediante dichas sustituciones, en comparación con la afinidad del péptido original. En cualquier caso, dichas sustituciones deben emplear residuos aminoacídicos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, la interferencia estérica y de carga que podría desestabilizar la unión.

Las sustituciones aminoacídicas son típicamente de residuos individuales. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden combinarse para llegar a un péptido final. Las variantes de sustitución son aquellas en las que se ha retirado al menos un residuo de un péptido y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Dichas sustituciones se preparan generalmente según la siguiente Tabla 3 cuando se desea modular finamente las características del péptido.

TABLA 3

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Se hacen cambios sustanciales en la función (por ejemplo, afinidad por moléculas de MHC o receptores de linfocitos T) seleccionando sustituciones que sean menos conservativas que las de la Tabla 3, concretamente, seleccionando residuos que difieran más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal peptídica en la zona de sustitución, por ejemplo, en conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera que produzcan en general mayores cambios en las propiedades del péptido serán aquellas en que (a) un residuo hidrófilo, por ejemplo serilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenlalanilo, valilo o alanilo; (b) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, se sustituye por (o mediante) una que no tiene cadena lateral, por ejemplo glicina.

Los péptidos pueden comprender también isoésteres de dos o más residuos en el péptido inmunogénico. Un isoéster como se define en la presente memoria es una secuencia de dos o más residuos que pueden estar sustituidos por una segunda secuencia porque la conformación estérica de la primera secuencia se ajusta a un sitio de unión específico de la segunda secuencia. El término incluye específicamente modificaciones de la cadena principal peptídica bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el carbono \alpha o el carbonilo de amida, el reemplazo completo del enlace amida, extensiones, deleciones o reticulaciones de la cadena principal. Véase, en general, Spatola, "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", Vol. VII (Weinstein ed., 1983).

Las modificaciones de péptidos con diversos miméticos de aminoácidos o aminoácidos no naturales son particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido in vivo. La estabilidad puede ensayarse de una serie de modos. Por ejemplo, se han usado para ensayar la estabilidad peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero humano. Véase, por ejemplo, Verhoef y col., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11: 291-302 (1986). Se determina convenientemente la semivida de los péptidos de la presente invención usando un ensayo de suero humano al 25% (v/v). El protocolo es generalmente el siguiente. Se deslipida suero humano combinado (tipo AB, no termoinactivado) mediante centrifugación antes del uso. Se diluye entonces el suero al 25% con medio de cultivo de tejido RPMI y se usa para ensayar la estabilidad del péptido. Se retira una pequeña cantidad de disolución de reacción a intervalos de tiempo predeterminados y se añade ácido tricloroacético acuoso al 6% o etanol. Se enfría la muestra de reacción turbia (4ºC) durante 15 minutos y se centrifuga entonces para sedimentar las proteínas séricas precipitadas. Se determina entonces la presencia de los péptidos mediante HPLC en fase inversa usando condiciones de cromatografía específicas de estabilidad.

Son conocidas y están fácilmente disponibles un gran número de células con moléculas de MHC definidas, particularmente moléculas de MHC de clase I. Por ejemplo, las líneas de linfocitos B transformadas con EBV humanas se ha mostrado que son fuentes excelentes para el aislamiento preparativo de moléculas de MHC de clase I y clase II. Están disponibles líneas celulares bien caracterizadas a partir de fuentes privadas y comerciales, tales como American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," 6ª edición (1988) Rockville, Maryland, EE.UU.); National Institute of General Medical Sciences 1990/1991 Catalog of Cell Lines (NIGMS) Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, NJ; y ASHI Repository, Brigham and Women's Hospital, 75 Francis Street, Boston, MA 02115. La Tabla 4 enumera algunas líneas de linfocitos B adecuadas para uso como fuentes de alelos de HLA-A. Todas estas líneas celulares pueden cultivarse en grandes lotes y son por lo tanto útiles para la producción a gran escala de moléculas de MHC. Un experto reconocerá que éstas son simplemente líneas celulares ejemplares y que pueden emplearse muchas otras fuentes celulares. Las líneas de linfocitos B EBV homocigóticas de HLA-B y HLA-C similares podrían servir como fuentes de alelos de HLA-B y HLA-C, respectivamente.

TABLA 4

5

Los péptidos o análogos de los mismos que tienen actividad estimulante de CTL pueden modificarse para proporcionar atributos deseados distintos de una semivida sérica mejorada. Por ejemplo, puede potenciarse la capacidad de los péptidos de inducir actividad de CTL mediante ligamiento a una secuencia que contiene al menos un epítopo que es capaz de inducir una respuesta de linfocito T cooperador. Los conjugados de péptidos inmunogénicos/cooperadores T inmunogénicos particularmente preferidos se ligan mediante una molécula espaciadora. El espaciador comprende típicamente moléculas neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos aminoacídicos, que están sustancialmente no cargadas en condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan típicamente, por ejemplo, de Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no tiene que comprender los mismos residuos y por tanto puede ser un hetero- u homoligómero. Cuando está presente, el espaciador será habitualmente de al menos 1 ó 2 residuos, más habitualmente 3 a 6 residuos. Como alternativa, el péptido de CTL puede estar ligado al péptido cooperador T sin un espaciador.

El péptido inmunogénico puede estar ligado al péptido cooperador T directamente o mediante un espaciador en el extremo amino o carboxi del péptido CTL. El extremo amino del péptido inmunogénico o del péptido cooperador T puede estar acilado. Los péptidos cooperadores T ejemplares incluyen toxoide del tétanos 830-843, gripe 307-319, circunsporozoíto de malaria 382-398 y 378-389.

En algunas realizaciones, puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que ayude a cebar CTL. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de ayudar a cebar CTL in vivo frente a antígenos víricos. Por ejemplo, pueden fijarse residuos de ácido palmítico a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo de Lys y ligarse después, por ejemplo mediante uno o más residuos de ligamiento tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser o similares, con un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede inyectarse entonces directamente en forma micelar, incorporarse a un liposoma o emulsionarse en un coadyuvante, por ejemplo, coadyuvante incompleto de Freund. En una realización preferida, un inmunógeno particularmente eficaz comprende ácido palmítico fijado a los grupos amino alfa y épsilon de Lys, que está fijado mediante ligador, por ejemplo Ser-Ser, con el extremo amino del péptido inmunogénico.

Como otro ejemplo de cebado lípídico de respuestas de CTL, pueden usarse lipoproteínas de E. coli tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilserilserina (P3CSS) para cebar CTL específicos de virus cuando están fijados covalentemente a un péptido apropiado. Véase Deres y col., Nature 342: 561-564 (1989). Los péptidos pueden acoplarse con P3CSS, por ejemplo, y administrarse el lipopéptido a un individuo para cebar específicamente una respuesta de CTL al antígeno diana. Adicionalmente, ya que la inducción de anticuerpos neutralizantes puede cebarse también con P3CSS conjugada con un péptido que exhibe un epítopo apropiado, pueden combinarse las dos composiciones para desencadenar más eficazmente respuestas a la infección tanto humorales como mediadas por célula.

Además, pueden añadirse aminoácidos adicionales a los extremos de un péptido para proporcionar un fácil ligamiento de péptidos entre sí, para acoplar a un soporte portador o péptido mayor, para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido u oligopéptido, o similares. Pueden introducirse aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico o similares en el extremo C o N del péptido u oligopéptido. La modificación en el extremo C puede alterar en algunos casos las características de unión del péptido. Además, las secuencias peptídicas u oligopeptídicas pueden diferir de la secuencia natural modificándose mediante acilación NH_{2} terminal, por ejemplo, mediante acetilación con alcanoílo C_{1}-C_{20} o tioglicol, amidación carboxiterminal, por ejemplo con amoniaco, metilamina, etc. En algunos casos, estas modificaciones pueden proporcionar sitios para ligar a un soporte u otra molécula.

Pueden prepararse péptidos que incluyen SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 14) en una amplia variedad de modos. Debido a su tamaño relativamente corto, los péptidos pueden sintetizarse en disolución o sobre un soporte sólido según técnicas convencionales. Están disponibles comercialmente diversos sintetizadores automáticos y pueden usarse según protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart & Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2ª. ed., Pierce Chemical Co. (1984).

Como alternativa, puede emplearse la tecnología de ADN recombinante, en la que se inserta una secuencia nucleotídica que codifica un péptido inmunogénico de interés en un vector de expresión, se transforma o se transfecta en una célula hospedadora apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para expresión. Estos procedimientos son generalmente conocidos en la técnica, como se describen en general en Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982). Por tanto, pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias peptídicas de la invención para presentar el epítopo de linfocito T apropiado.

Ya que la secuencia de codificación de péptidos de la longitud contemplada en la presente memoria puede sintetizarse mediante técnicas químicas, por ejemplo, el procedimiento de fosfotriéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981), puede hacerse la modificación sustituyendo simplemente la(s) base(s) apropiada(s) por aquellas que codifican la secuencia peptídica nativa. Pueden proporcionarse entonces a la secuencia de codificación ligadores apropiados y ligarse a vectores de expresión disponibles normalmente en la técnica, y usarse los vectores para transformar hospedadores adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Están ahora disponibles una serie de dichos vectores y sistemas hospedadores adecuados. Para la expresión de proteínas de fusión, se proporcionarán a la secuencia de codificación codones de inicio y terminación ligados operativamente, regiones promotoras y terminadoras y habitualmente un sistema de replicación para proporcionar un vector de expresión para la expresión en el hospedador celular deseado. Por ejemplo, se proporcionan secuencias promotoras compatibles con hospedadores bacterianos en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia de codificación deseada. Los vectores de expresión resultantes se transforman en hospedadores bacterianos adecuados. Por supuesto, pueden usarse también hospedadores celulares de levadura o mamífero, empleando vectores y secuencias de control adecuados.

El péptido de la presente invención y las composiciones farmacéuticas y de vacuna que comprenden dicho péptido son útiles para administración a mamíferos, particularmente seres humanos, para tratar y/o prevenir infección vírica y cáncer. Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse o prevenirse usando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata, hepatitis B, hepatitis C, infección por HPV, SIDA, carcinoma renal, carcinoma de cuello uterino, linfoma, CMV, malaria y condiloma acuminado.

Las vacunas que contienen un cantidad inmunogénicamente eficaz del péptido de la invención y opcionalmente otros péptidos como se describen en la presente memoria son una realización adición de la invención. Una vez se han definido apropiadamente los epítopos inmunogénicos, pueden clasificarse y suministrarse por diversos medios, designados en la presente memoria como composiciones "de vacuna". Dichas composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (Vitiello, A. y col., J. Clin. Invest. 95: 341, 1995), composiciones peptídicas encapsuladas en microesferas de poli(DL-lactida-co-glicolida) ("PLG") (véanse, por ejemplo, Eldridge, y col., Molec. Immunol. 28: 287-294 (1991); Alonso y col., Vaccine 12: 299-306, 1994; Jones y col., Vaccine 13: 675-681 (1995)), composiciones peptídicas contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOMS) (véanse, por ejemplo, Takahashi y col., Nature 344: 873-875 (1990); Hu y col., Clin. Exp. Immunol. 113: 235-243 (1998)), sistemas peptídicos de múltiples antígenos (MAP) (véanse, por ejemplo, Tarn, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413 (1988); Tam, J. Immunol. Methods 196: 17-32 (1996)), vectores de suministro vírico (Perkus, y col., en: "Concepts in vaccine development", Kaufmann, ed., pág. 379 (1996); Chakrabarti, y col., Nature 320: 535 (1986); Hu, y col., Nature 320: 537 (1986); Kieny, y col., AIDS Bio/Technology 4: 790 (1986); Top y col., J. Infect. Dis. 124: 148 (1971); Chanda, y col., Virology 175: 535 (1990)), partículas de origen vírico o sintético (Kofler, y col., J. Immunol. Methods 192: 25 (1996); Eldridge, y col., Sem. Hematol. 30: 16 (1993); Falo y col., Nature Med. 7: 649 (1995)), coadyuvantes (Warren, y col., Annu. Rev. Immunol. 4: 369 (1986); Gupta y col., Vaccine 11: 293 (1993)), liposomas (Reddy y col., J. Immunol. 148: 1585 (1992); Rock, Immunol. Today 17; 131 (1996)) o ADNc desnudo o absorbido en partículas (Ulmer y col., Science 59: 1745 (1993); Robinson I., Vaccine 11: 957 (1993); Shiver y col., en: "Concepts in vaccine development", Kaufmann, ed., pág. 423, (1996); Cease & Berzofsky, Annu. Rev. Immunol. 12: 923 (1994) y Eldridge y col., Sem, Hematol. 30:16 (1993)). Pueden usarse también tecnologías de suministro orientadas a toxina, también conocidas como orientación mediada por receptor, tales como las de Avant Immunotherapeutics. Inc. (Needham, Massachusetts).

Además, las vacunas según la invención comprenden composiciones que comprenden el péptido reivindicado. El péptido puede estar ligado individualmente a su propio portador; como alternativa, el péptido puede existir en forma de un homopolímero o heteropolímero de unidades peptídicas activas. Dicho polímero tiene la ventaja de una reacción inmunológica aumentada y, cuando se usan diferentes epítopos peptídicos para configurar el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de una o múltiples proteínas del organismo patogénico o péptido relacionado con tumor orientado a una respuesta inmunitaria.

Los portadores útiles que pueden usarse con vacunas de la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como seroalbúmina humana, toxoide del tétanos, poliaminoácidos tales como poli-L-lisina, poli(ácido glutámico), gripe, proteína de núcleo del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (concretamente aceptable) tal como agua o disolución salina, preferiblemente disolución salina tamponada con fosfato. Las vacunas incluyen típicamente también un coadyuvante. Los coadyuvantes tales como coadyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alúmina son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, como se da a conocer en la presente memoria, las respuestas de CTL pueden cebarse conjugando péptidos de la invención con lípidos tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilserilserina (P3CSS).

Como se da a conocer con mayor detalle en la presente memoria, tras la inmunización con una composición peptídica según la invención, mediante inyección, aerosol, vía oral, transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otra adecuada, el sistema inmunitario del hospedador responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL específicos del antígeno deseado. En consecuencia, el hospedador se convierte en al menos parcialmente inmune a una infección posterior, o al menos parcialmente resistente al desarrollo de una infección crónica continua, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno estaba asociado a tumor.

En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas de péptido de clase I con vacunas que inducen o facilitan respuestas de anticuerpos neutralizantes al antígeno diana de interés, particularmente a antígenos de cubierta vírica. Una composición preferida comprende epítopos de clase I y II según la invención. Una alternativa de dicha composición comprende un epítopo de clase I y/o II según la invención junto con una molécula PADRE^{TM} (Epimmune, San Diego, CA) (descrita en la patente de EE.UU. nº 5.736.142). Adicionalmente, puede administrarse cualquiera de éstas en una modalidad mediada por ácido nucleico.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido inmunogénico de la invención pueden administrarse a un individuo que padece ya un cáncer o está infectado por el virus de interés. Aquellos en la fase de incubación o la fase aguda de la infección pueden tratarse con los péptidos inmunogénicos separadamente o en combinación con otros tratamientos, según sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, se administran las composiciones a un paciente en una cantidad suficiente para desencadenar una respuesta de CTL eficaz al antígeno vírico o tumoral y para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas y/o complicaciones. Se define una cantidad adecuada para conseguir esto como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición peptídica, del modo de administración, de la etapa y gravedad de la enfermedad que se esté tratando, del peso y estado general de salud del paciente y del criterio del médico a cargo, pero generalmente están en el intervalo para inmunización inicial (es decir, para administración terapéutica o profiláctica) de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000 \mug de péptido para un paciente de 70 kg, seguido de dosificaciones de recuerdo de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 10.000 \mug de péptido de acuerdo con un régimen de recuerdo durante semanas a meses, dependiendo de la respuesta y condición del paciente, midiendo la actividad de CTL específica en la sangre del paciente. Debe recordarse que el péptido y las composiciones de la presente invención pueden emplearse generalmente en estados patológicos graves, es decir, situaciones de peligro de muerte o peligro de muerte potencial. En dichos casos, con vistas a la minimización de sustancias extrañas y a la naturaleza relativamente no tóxica del péptido, es posible y puede parecer deseable para el médico a cargo administrar excesos sustanciales de estas composiciones peptídicas.

Para uso terapéutico, la administración debería empezar a la primera señal de infección vírica o la detección o retirada quirúrgica de tumores o poco después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto es seguido por dosis de recuerdo al menos hasta que los síntomas remitan sustancialmente y durante un periodo después de ello. En infección crónica, pueden requerirse dosis de carga seguidas de dosis de recuerdo.

El tratamiento de un individuo afectado con las composiciones de la invención puede acelerar la resolución de la infección en individuos afectados agudamente. Para aquellos individuos propensos (o predispuestos) a desarrollar infección crónica, las composiciones son particularmente útiles en procedimientos para prevenir la evolución desde infección aguda a crónica. Cuando los individuos propensos se identifican antes o durante la infección, por ejemplo como se describe en la presente memoria, la composición puede orientarse a ellos, minimizando la necesidad de administración a una población mayor.

Las composiciones peptídicas pueden usarse también para el tratamiento de infección crónica y para estimular el sistema inmunitario para eliminar células infectadas por virus en portadores. Es importantes proporcionar una cantidad de péptido inmunopotenciadora en una formulación y con un modo de administración suficiente para estimular eficazmente una respuesta de linfocitos T citotóxicos. Por tanto, para el tratamiento de infección crónica, una dosis representativa está en el intervalo de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000 \mug, preferiblemente de aproximadamente 5 \mug a 10.000 \mug para un paciente de 70 kg por dosis. Pueden requerirse dosis inmunizadoras seguidas de dosis de recuerdo a intervalos establecidos, por ejemplo de una a cuatro semanas, posiblemente durante un periodo de tiempo prolongado para inmunizar eficazmente un individuo. En caso de infección crónica, la administración debe continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o ensayos de laboratorio indiquen que la infección vírica se ha eliminado o ha remitido sustancialmente y durante un periodo después de ello.

Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico se pretenden para administración parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Por tanto, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una disolución de péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,9%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtración. Las disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para uso como tales o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración de péptidos estimulantes de CTL de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, concretamente, de menos de aproximadamente 0,1%, habitualmente de o al menos aproximadamente 2% hasta 20% a 50% o más en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo de administración particular seleccionado.

El péptido de la invención puede administrarse también mediante liposomas, que orientan los péptidos a un tejido celular particular tal como tejido linfoide. Los liposomas son también útiles para aumentar la semivida de los péptidos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones fosfolipídicas, capas lamelares y similares. En estas preparaciones, se incorpora el péptido a suministrar como parte de un liposoma, solo o en combinación con una molécula que se une, por ejemplo, a un receptor prevalente entre células linfoides tal como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. Por tanto, los liposomas rellenos con un péptido de la invención deseado pueden dirigirse al sitio de células linfoides, donde los liposomas suministran entonces las composiciones de péptido terapéutico/inmunogénico seleccionadas. Los liposomas para uso en la invención se forman a partir de lípidos formadores de vesícula estándar, que incluyen generalmente fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol tal como colesterol. La selección del lípido está guiada generalmente por la consideración, por ejemplo, del tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Están disponibles una variedad de procedimientos para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka y col., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980), patentes de EE.UU. nº 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Para orientar a células inmunitarias, un ligando a incorporar al liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos de determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmunitario deseadas. Una suspensión de liposoma que contiene un péptido puede administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis que varía según, entre otras cosas, el modo de administración, el péptido que se esté suministrando y la etapa de la enfermedad que se esté tratando.

Para composiciones sólidas, pueden usarse portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, purezas farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable incorporando cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como aquellos portadores enumerados anteriormente, y generalmente 10-95% del ingrediente activo, es decir, uno o más péptidos de la invención, y más preferiblemente a una concentración de 25-75%.

Para administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos se suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propelente. Los porcentajes típicos de péptidos son de 0,01%-20% en peso, preferiblemente 1%-10%. El tensioactivo, por supuesto, debe ser no tóxico y preferiblemente soluble en el propelente. Son representativos de dichos agentes los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol alifático polihidroxílico o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir 0,1%-20% en peso de la composición, preferiblemente 0,25-5%. El resto de la composición es normalmente propelente. Puede incluirse también un portador, según se desee, como, por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.

Tras la inmunización con una composición peptídica como se describe en la presente memoria mediante inyección, aerosol, vía oral, transdérmica u otra, el sistema inmunitario del hospedador responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL específicos del antígeno deseado, y el hospedador se vuelve al menos parcialmente inmune a una infección posterior, o resistente al desarrollo de infección crónica.

Las composiciones de vacuna que contienen el péptido de la invención se administran a un paciente propenso o con riesgo de otro modo de infección vírica o cáncer para desencadenar una respuesta inmunitaria contra el antígeno y potenciar así las capacidades de respuesta inmunitaria propias del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis inmunogénicamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud del paciente y el peso, del modo de administración, de la naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente están en el intervalo de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000 \mug por paciente de 70 kg, más habitualmente de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 10.000 \mug por 70 kg de peso corporal.

En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas peptídicas de la invención con vacunas que inducen respuestas de anticuerpo neutralizante frente al virus de interés, particularmente antígenos de cubierta vírica.

Con fines terapéuticos o de inmunización, pueden administrarse también al paciente ácidos nucleicos que codifican el péptido de la invención y opcionalmente uno o más de los péptidos descritos en la presente memoria. Se usan convenientemente una serie de procedimientos para suministrar los ácidos nucleicos al paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede suministrarse directamente, en forma de "ADN desnudo". Este enfoque se describe, por ejemplo, en Wolff y col., Science 247: 1465-1468 (1990), así como en las patentes de EE.UU. nº 5.580.859 y 5.589.466. Los ácidos nucleicos pueden administrarse también usando suministro balístico como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.204.253. Pueden administrarse partículas que comprenden solamente ADN. Como alternativa, el ADN puede estar adherido a partículas tales como partículas de oro.

Los ácidos nucleicos pueden suministrarse también complejados a compuestos catiónicos, tales como lípidos catiónicos. Se describen procedimientos de suministro génico mediado por lípido, por ejemplo, en los documentos WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988); Rose, patente de EE.UU. nº 5.279.833; WO 91/06309 y Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987).

El péptido de la invención puede expresarse también mediante hospedadores víricos atenuados tales como virus Vaccinia o de viruela aviar. Este enfoque implica el uso de virus Vaccinia como vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican el péptido de la invención. Tras la introducción en un hospedador infectado aguda o crónicamente o en un hospedador no infectado, el virus Vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico y desencadena así una respuesta de CTL del hospedador. Se describen vectores de Vaccinia y procedimientos útiles en protocolos de inmunización, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.722.848. Es otro vector el de BCG (bacilo de Calmette-Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover y col. (Nature 351: 456-460 (1991)). Resultarán evidentes una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de Salmonella typhi y similares, a partir de la descripción de la presente memoria.

Un medio preferido de administración de ácidos nucleicos que codifican el péptido de la invención usa constructos minigénicos que codifican múltiples epítopos. Para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopos de CTL seleccionados (minigen) para expresión en células humanas, se traducen de forma inversa las secuencias aminoacídicas de los epítopos. Se usa una tabla de uso de codón humano para guiar la elección de codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifica epítopo se añaden directamente, creando una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse elementos adicionales al diseño de minigen. Los ejemplos de secuencia aminoacídica que podrían traducirse de forma inversa e incluirse en la secuencia minigenica incluyen: linfocito T cooperador, epítopos, una secuencia líder (señal) y una señal de retención de retículo endoplasmático. Además, la presentación en MHC de epítopos de CTL puede mejorarse incluyen secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo polialanina) o de origen natural adyacentes a los epítopos de CTL.

Se convierte la secuencia minigenica en ADN ensamblando oligonucleótidos que codifican las cadenas codificante y no codificante del minigen. Se sintetizan oligonucleótidos superpuestos (30-100 bases de longitud), se fosforilan, se purifican y se asocian en condiciones apropiadas usando técnicas bien conocidas. Se unen los extremos de los oligonucleótidos usando ADN ligasa T4. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido epitópico de CTL, puede clonarse entonces en un vector de expresión deseado.

Se incluyen secuencias reguladoras estándar bien conocidas por los expertos en la materia para asegurar la expresión en las células diana. Son necesarios varios elementos vectoriales: un promotor con un sitio de clonación cadena abajo para la inserción del minigen, una señal de poliadenilación para una terminación eficaz de la transcripción, un origen de replicación de E. coli y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, resistencia a ampicilina o kanamicina). Pueden usarse con este fin numerosos promotores, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus humano (hCMV). Véanse las patentes de EE.UU. nº 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras adecuadas.

Pueden desearse modificaciones vectoriales adicionales para optimizar la expresión e inmunogenicidad del minigen. En algunos casos, se requieren intrones para una expresión génica eficaz, y podrían incorporarse uno o más intrones sintéticos o de origen natural a la región transcrita del minigen. La inclusión de secuencias de estabilización del ARNm puede considerarse también para aumentar la expresión del minigen. Se ha propuesto recientemente que las secuencias inmunoestimulantes (ISS o CpG) desempeñan un papel en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Estas secuencias podrían incluirse en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigen, si se encontrara que potencian la inmunogenicidad.

En algunas realizaciones, puede usarse un vector de expresión bicistrónico para permitir la producción de epítopos codificados por el minigen e incluirse una segunda proteína para potenciar o reducir la inmunogenicidad. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían potenciar beneficiosamente la respuesta inmunitaria si se coexpresan incluyen citocinas (por ejemplo, IL2, IL12, GM-CSF), moléculas inductoras de citocinas (por ejemplo, LeIF) o moléculas coestimulantes. Podrían unirse epítopos cooperadores (HTL) a señales de orientación intracelular y expresarse separadamente de los epítopos de CTL. Esto permitiría dirigir los epítopos de HTL a un compartimento celular diferente de los epítopos de CTL. En caso necesario, esto podría facilitar una entrada más eficaz de los epítopos de HTL en la ruta de MHC de clase II, mejorando la inducción de CTL. En contraposición con la inducción de CTL, reducir específicamente la respuesta inmunitaria mediante la coexpresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo, TGF-\beta) puede ser beneficioso en ciertas enfermedades.

Una vez se selecciona el vector de expresión, se clona el minigen en la región de poliligador cadena abajo del promotor. Se transforma este plásmido en una cepa de E. coli apropiada y se prepara el ADN usando técnicas estándar. La orientación y secuencia del ADN del minigen, así como todos los demás elementos incluidos en el vector, se confirman usando cartografía de restricción y análisis de secuencia de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden almacenarse en forma de banco de células maestras y banco de células de trabajo.

Se producen cantidades terapéuticas de ADN de plásmido mediante fermentación en E. coli, seguida de purificación. Se usan alícuotas del banco de células de trabajo para inocular medio de fermentación (tal como caldo Terrific) y se cultivan hasta saturación en matraces agitados o un biorreactor según técnicas bien conocidas. El ADN de plásmido puede purificarse usando tecnologías de bioseparación estándar tales como resinas de intercambio aniónico en fase sólida suministradas por Qiagen. En caso necesario, puede aislarse ADN superenrrollado a partir de las formas circular abierta y lineal usando electroforesis en gel u otros procedimientos.

Puede prepararse para inyección ADN de plásmido purificado usando una variedad de formulaciones. La más simple de éstas es la reconstitución de ADN liofilizado en disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Se han descrito una variedad de procedimientos y pueden ponerse a disposición nuevas técnicas. Como se observa anteriormente, los ácidos nucleicos se formulan convenientemente con lípidos catiónicos. Además, podrían complejarse también con ADN de plásmido purificado glicolípidos, liposomas fusogénicos, péptidos y compuestos designados colectivamente como protectores interactivos no condensadores (PINC), para influir en variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular o tráfico a órganos o tipos celulares específicos.

Puede usarse la sensibilización de células diana como ensayo funcional para la expresión y presentación en MHC de clase I de epítopos de CTL codificados por el minigen. Se introduce el ADN de plásmido en una línea celular mamífera que sea adecuada como diana para ensayos de liberación de cromo por CTL estándar. El procedimiento de transfección usado dependerá de la formulación final. Puede usarse electroporación para ADN "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permiten dirigir la transfección in vitro. Puede cotransfectarse un plásmido que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) para permitir el enriquecimiento de células transfectadas usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se marcan entonces estas células con cromo-51 y se usan como células diana para líneas de CTL específicas de epítopo. La citólisis, detectada mediante la liberación de ^{51}Cr, indica la producción de presentación en MHC de epítopos de CTL codificados por el minigen.

La inmunogenicidad in vivo es un segundo enfoque para el ensayo funcional de formulaciones de ADN de minigen. Se inmunizan ratones transgénicos que expresan moléculas de MHC humanas apropiadas con el producto de ADN. La dosis y vía de administración dependen de la formulación (por ejemplo, IM para ADN en PBS, IP para ADN complejado con lípido). 24 horas después de la inmunización, se recogen los esplenocitos y se reestimulan durante 1 semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se está ensayando. Se ensaya en estas células efectoras (CTL) la citólisis de células diana marcadas con cromo-51 cargadas con péptido usando técnicas estándar. La lisis de células diana sensibilizadas mediante la carga en MHC de péptidos correspondientes a epítopos codificados por el minigen demuestra la función de vacuna de ADN para la inducción in vivo de CTL.

Pueden usarse péptidos antigénicos para desencadenar CTL ex vivo también. Los CTL resultantes pueden usarse para tratar infecciones crónicas (víricas o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responderán a un enfoque de terapia de vacuna peptídica. Las respuestas de CTL ex vivo ante un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno tumoral) se inducen incubando el cultivo de tejido células precursoras de CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente 1-4 semanas), en el que se activan las CTLp, maduran y se expanden a CTL efectoras, se introducen por infusión de nuevo al paciente, en el que destruirán su célula diana específica (una célula infectada o célula tumoral). Para optimizar las condiciones in vitro para la generación de linfocitos T citotóxicos, se mantiene el cultivo de células estimulantes en un medio exento de suero apropiado.

Antes de la incubación de las células estimulantes con las células a activar, por ejemplo células CD8+ precursoras, se añade una cantidad de péptido antigénico al cultivo de células estimulantes, en cantidad suficiente para cargarse en moléculas de clase I humanas para expresar sobre la superficie de las células estimulantes. En la presente invención, una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permitirá que aproximadamente 200 o más moléculas de MHC de clase I humanas se carguen con el péptido a expresar sobre la superficie de cada célula estimulante. Preferiblemente, las células estimulantes de incuban con >20 \mug/ml de péptido.

Se incuban entonces células CD8+ en reposo o precursoras en cultivo con células estimulantes apropiadas durante un periodo de tiempo suficiente para activar las células CD8+. Preferiblemente, las células CD8+ se activan de manera específica de antígeno. La relación de células CD8+ en reposo o precursoras (efectoras) a células estimulantes puede variar de individuo a individuo y puede depender adicionalmente de variables tales como la sensibilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo y la naturaleza y gravedad de la afección patológica u otra afección para la que se use la modalidad de tratamiento aquí descrita. Preferiblemente, sin embargo, la relación de linfocitos:células estimulantes está en el intervalo de aproximadamente 30:1 a 300:1. El cultivo de efectores/estimulantes puede mantenerse durante todo el tiempo necesario para estimular un número utilizable o eficaz terapéuticamente de células CD8+.

La inducción de CTL in vitro requiere el reconocimiento específico de péptidos que están unidos a moléculas de MHC de clase I específicos de alelo sobre APC. El número de complejos de MHC/péptido específicos por APC es crucial para la estimulación de CTL, particularmente en respuestas inmunitarias primarias. Aunque son suficientes pequeñas cantidades de complejos de péptido/MHC por célula para volver a una célula susceptible a la lisis por CTL, o para estimular una respuesta de CTL secundaria, la activación exitosa de un precursor de CTL (pCTL) durante la respuesta primaria requiere un número significativamente alto de complejos de MHC/péptido. La carga peptídica de moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor vacías sobre células permite la inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos primarios.

Puesto que no existen líneas celulares mutantes para cada alelo de MHC humano, es ventajoso usar una técnica para retirar péptidos asociados a MHC endógenos de la superficie de APC, seguido de la carga de las moléculas de MHC vacías resultantes con los péptidos inmunogénicos de interés. El uso de células no transformadas (no tumorigénicas) no infectadas y preferiblemente autólogas de pacientes como APC es deseable para el diseño de protocolos de inducción de CTL dirigidos hacia el desarrollo de terapias de CTL ex vivo. Esta solicitud da a conocer procedimientos para extraer los péptidos asociados a MHC endógenos de la superficie de APC seguido de la carga de péptidos
deseados.

Es una molécula de MHC de clase I estable un complejo trimérico formado por los siguientes elementos: 1) un péptido de habitualmente 8-10 residuos, 2) una proteína polimórfica pesada transmembrana que porta el sitio de unión a péptido en sus dominios \alpha1 y \alpha2, y 3) una cadena ligera no polimórfica no covalentemente asociada de \beta2-microglobulina. Retirar los péptidos unidos y/o disociar la \beta2-microglobulina del complejo vuelve a las moléculas de MHC de clase I no funcionales e inestables, dando como resultado una degradación rápida. Todas las moléculas de MHC de clase I aisladas a partir de PBMC tienen péptidos endógenos unidos a las mismas. Por lo tanto, la primera etapa es retirar todos los péptidos endógenos unidos a moléculas de MHC de clase I sobre las APC sin causar su degradación antes de que puedan añadirse a las mismas péptidos exógenos.

Dos posibles modos de liberar a moléculas de MHC de clase I de los péptidos unidos incluyen reducir la temperatura de cultivo de 37ºC a 26ºC durante una noche para desestabilizar la \beta2-microglobulina y extraer los péptidos endógenos de la célula usando un tratamiento ácido suave. Los procedimientos liberan los péptidos unidos anteriormente al entorno extracelular, permitiendo a nuevos péptidos exógenos unirse a las moléculas de clase I vacías. El procedimiento de incubación a temperatura fría posibilita que los péptidos exógenos se unan eficazmente al complejo de MHC, pero requiere una incubación de una noche a 26ºC que puede retardar la tasa metabólica celular. También es probable que las células que no sintetizan activamente moléculas de MHC (por ejemplo, PBMC en reposo) no produzcan altas cantidades de moléculas de MHC de superficie vacías mediante el procedimiento a temperatura fría.

La extracción ácida fuerte implica la extracción de los péptidos con ácido trifluoroacético, pH 2, o la desnaturalización ácida de los complejos de clase I-péptido purificados por inmunoafinidad. Estos procedimientos no son factibles para la inducción de CTL, puesto que es importante retirar los péptidos endógenos conservando la viabilidad de APC y un estado metabólico óptimo que es crítico para la presentación de antígeno. Se han usado disoluciones ácidas débiles de pH 3 tales como tampones de glicina o citrato-fosfato para identificar péptidos endógenos y para identificar epítopos de linfocitos T asociados a tumor. El tratamiento es especialmente eficaz porque sólo se desestabilizan las moléculas de MHC de clase I (y péptidos asociados liberados) mientras que otros antígenos de superficie permanecen intactos, incluyendo moléculas de MHC de clase II. Lo más importante, el tratamiento de células con las disoluciones ácidas débiles no afecta a la viabilidad de la célula ni al estado metabólico. El tratamiento ácido débil es rápido, puesto que la extracción de los péptidos endógenos ocurre en 2 minutos a 4ºC y los APC están listos para efectuar su función después de cargar los péptidos apropiados. La técnica se utiliza en la presente memoria para preparar APC específicas de péptido para la generación de CTL específicos de antígeno primarios. Las APC resultantes son eficaces para la inducción de CTL CD8+ específicos de péptido.

Las células CD8+ activadas puede separarse eficazmente de las células estimulantes usando una variedad de procedimientos conocidos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales específicos de células estimulantes para los péptidos cargados en las células estimulantes o para las células CD8+ (o un segmento de las mismas) para unir su ligando complementario apropiado. Pueden extraerse entonces las moléculas marcadas con anticuerpo de la mezcla de células estimulantes-efectoras mediante medios apropiados, por ejemplo, mediante procedimientos bien conocidos de inmunoprecipitación o inmunoensayo.

Las cantidades citotóxicas eficaces de células CD8+ activadas pueden variar entre los usos in vitro e in vivo, así como con la cantidad y tipo de células que son la diana última de estas células destructoras. La cantidad variará también dependiendo de la afección del paciente y deberá determinarse mediante la consideración de todos los factores apropiados por el facultativo. Preferiblemente, sin embargo, se utilizan aproximadamente 1 X 10^{6} a aproximadamente 1 X 10^{12}, más preferiblemente aproximadamente 1 X 10^{8} a aproximadamente 1 X 10^{11}, y aún más preferiblemente aproximadamente 1 X 10^{9} a aproximadamente 1 X 10^{10} células CD8+ activadas para adultos humanos, en comparación con aproximadamente 5 X 10^{6} - 5 X 10^{7} células usadas en ratones.

Preferiblemente, como se expone anteriormente, las células CD8+ activadas se recogen del cultivo celular antes de la administración de las células CD8+ al individuo que se esté tratando. Sin embargo, es importante observar que, al contrario que otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas, el presente procedimiento usa un sistema de cultivo celular que es no tumorigénico. Por lo tanto, si no se consigue la separación completa de células estimulantes y células CD8+ activadas, no se conoce un riesgo inherente asociado a la administración de un pequeño número de células estimulantes, mientras que la administración de células promotoras de tumores en mamíferos puede ser extremadamente peligrosa.

Son conocidos en la técnica procedimientos para reintroducir componentes celulares e incluyen procedimientos tales como los ejemplificados en la patente de EE.UU. nº 4.844.893 de Honsik, y col. y la patente de EE.UU. nº 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, es apropiada la administración de células CD8+ activadas mediante infusión intravenosa.

El péptido inmunogénico de esta invención puede usarse también para preparar anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos pueden ser útiles como agentes de diagnóstico o terapéuticos potenciales.

El péptido puede encontrar uso también como reactivo de diagnóstico. Por ejemplo, puede usarse un péptido para determinar la sensibilidad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplea el péptido o péptidos relacionados, y por tanto puede ser útil para modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar el pronóstico para un individuo afectado. Además, los péptidos pueden usarse también para predecir cuáles individuos tendrán un riesgo sustancial de desarrollar infección crónica.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse proporcionando resultados esencialmente similares.

Ejemplo 1

Se llevó a cabo el aislamiento de antígeno de clase I como se describe en las solicitudes relacionadas observadas anteriormente. Se aislaron entonces péptidos procesados naturalmente y se secuenciaron como se describe allí. Se determinaron un motivo específico de alelo y algoritmos y se llevaron a cabo ensayos de unión cuantitativos.

Usando los motivos identificados anteriormente para HLA-2.1, se analizó en las secuencias aminoacídicas alélicas de una serie de antígenos la presencia de estos motivos. La Tabla 5 proporciona los resultados de estas búsquedas.

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TABLA 5

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Para identificar péptidos, se llevó a cabo el aislamiento de antígeno de clase I y el aislamiento y secuenciación de péptidos procesados naturalmente como se describe en las solicitudes relacionadas. Se usaron entonces estos péptidos para definir motivos de unión específica para cada uno de los siguientes alelos A3.2, A1, A11 y A24.1. Se describen estos motivos anteriormente. Los motivos descritos en las Tablas 6-9 siguientes se definen a partir de los datos de secuenciación combinados de péptidos procesados naturalmente como se describe en las solicitudes relacionadas.

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TABLA 6 Motivo específico del alelo HLA-A3.2

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TABLA 7 Motivo específico del alelo HLA-A1

10

TABLA 8 Motivo específico del alelo HLA-A11

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TABLA 9 Motivo específico del alelo HLA-24.1

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Ejemplo 2

Usando los motivos identificados anteriormente, se analizó la presencia de estos motivos en diversas secuencias aminoacídicas alélicas de MHC de clase I de diversos patógenos y proteínas relacionadas con tumores. Se llevó a cabo el examen descrito en las solicitudes relacionadas. La Tabla 10 proporciona los resultados de búsqueda de los antígenos.

TABLA 10

13

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5736142 A [0068]: \bullet WO 9618372 A [0083]

\bullet WO 9324640 A [0083]: \bullet US 4235871 A [0075]

\bullet US 5279833 A, Rose [0083]: \bullet US 4501728 A [0075]

\bullet WO 9106309 A [0083]: \bullet US 4837028 A [0075]

\bullet US 4722848 A [0084]: \bullet US 5019369 A [0075]

\bullet US 4844893 A, Honsik [0106]: \bullet US 5580859 A [0082]

\hskip0.2cm

[0087]

\bullet US 4690915 A, Rosenberg [0106]: \bullet US 5589466 A [0082]

\hskip0.2cm

[0087]

\bullet US 5204253 A [0082]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bulletBJORKMAN et al. Nature, 1987, vol. 329, 506 [0004]

\bulletBUUS et al. Science, 1988, vol. 242, 1065 [0005]

\bulletFALK et al. Nature, 1991, vol. 351, 290 [0005] [0033]

\bulletJARDETZKY et al. Nature, 1991, vol. 353, 326 [0005]

\bulletHUNT et al. Science, 1992, vol. 225, 1261 [0005] [0038]

\bulletRÖTZSCHKE; FALK. Immunol. Today, 1991, vol. 12, 447 [0005]

\bulletSETTE et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 3296 [0006]

\bulletSCHAEFFER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 4649 [0006]

\bullet DE BRUIJN et al. Eur. J. Immunol., 1991, vol. 21, 2963-2970 [0006]

\bulletPAMER et al. Nature, 1991, vol. 353, 852-955 [0006]

\bullet Istocompatibility Testing. DUPONT. Immunobiology of HLA. Springer-Verlag, 1987, vol. 1 [0031]

\bulletHUNKAPILLER et al. Methods Enzymol., 1983, vol. 91, 399 [0038]

\bulletSETTE et al. J. Immunol., 1991, vol. 141, 3893 [0039]

\bulletTOWNSEND et al. Cell, 1990, vol. 62, 285 [0039]

\bulletMELIEF et al. Eur. J. Immunol., 1991, vol. 21, 2963 [0039]

\bulletINABA et al. J. Exp. Med., 1987, vol. 166, 182 [0040]

\bulletBOOG. Eur. J. Immunol, 1988, vol. 18, 219 [0040]

\bulletKÄRRE et al. Nature, 1986, vol. 319, 675 [0041]

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Claims

1. Péptido inmunogénico aislado constituido por la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4).

2. Composición que comprende el péptido de la reivindicación 1.

3. Composición de la reivindicación 2, que comprende un péptido inmunogénico adicional que tiene un motivo de unión específico de alelo, seleccionándose dicho péptido inmunogénico del grupo constituido por los péptidos enumerados en la Tabla 5 y la Tabla 10.

4. Composición de la reivindicación 2, en la que el péptido inmunogénico está ligado a un péptido cooperador T.

5. Composición de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una molécula de PADRE.

6. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente un lípido.

7. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente un liposoma.

8. Composición de la reivindicación 2, en la que dicho péptido está ligado a una molécula espaciadora.

9. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente un portador.

10. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente una célula presentadora de antígeno.

11. Ácido nucleico aislado que codifica el péptido de la reivindicación 1.

12. Ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico codifica adicionalmente un péptido inmunogénico que tiene un motivo de unión específico de alelo HLA, seleccionándose dicho péptido inmunogénico del grupo constituido por los péptidos enumerados en la Tabla 5 y la Tabla 10.

13. Ácido nucleico aislado de la reivindicación 11, en el que dicho ácido nucleico codifica adicionalmente un péptido cooperador T.

14. Ácido nucleico aislado de la reivindicación 11, en el que dicho ácido nucleico codifica adicionalmente una molécula de PADRE.

15. Ácido nucleico aislado de la reivindicación 12, que comprende un constructo minigénico que codifica el péptido de la reivindicación 1 y que codifica adicionalmente un péptido inmunogénico que tiene un motivo de unión específico de alelo HLA, seleccionándose dicho péptido inmunogénico del grupo constituido por los péptidos enumerados en la Tabla 5 y la Tabla 10.

16. Ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, en el que dicho constructo minigénico comprende un epítopo de linfocito T cooperador, una secuencia señal y/o una señal de retención de retículo endoplasmático.

17. Un vector de expresión bicistrónico que comprende el minigen de la reivindicación 15 y una secuencia que codifica al menos una proteína o polipéptido incluido para potenciar o reducir la inmunogenicidad.

18. Composición que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 o el vector de la reivindicación 17.

19. Composición de la reivindicación 18, que comprende adicionalmente un lípido catiónico.

20. Composición de la reivindicación 18, que comprende adicionalmente un portador.

21. Uso del péptido de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de cáncer.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que se generan células CTL ex vivo usando dicho péptido en combinación con células precursoras de CTL del paciente.

23. Uso del ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 11-16 o del vector de la reivindicación 18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

24. Péptido según la reivindicación 1 para uso en la prevención o el tratamiento del cáncer.

25. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 o un vector según la reivindicación 17 para uso en la prevención o tratamiento del cáncer.