ES2326458B1 - Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Compuestos fluorescentes para diagnóstico de
infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
La presente invención describe nuevos compuestos
fluorescentes análogos de alquilfosfolípidos, que contienen en su
estructura grupos fluorescentes de alta fotoestabilidad y que
emiten en la zona de longitudes de onda del espectro visible.
Dichos compuestos se incorporan fácilmente a microorganismos,
permitiendo la detección e identificación de estos organismos
mediante microscopia de fluorescencia. Asimismo, los nuevos
compuestos fluorescentes permiten diagnosticar de forma rápida y
sencilla la presencia de microorganismos patógenos caracterizados
por ser resistentes al tratamiento con alquilfosfolípidos.
Description
Compuestos fluorescentes para diagnóstico de
infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
Composiciones farmacéuticas para el diagnóstico
clínico de enfermedades infecciosas, preferentemente oculares y
para identificar la presencia de microorganismos.
La prevención y el correcto tratamiento de
algunas de las enfermedades que afectan al ojo requiere la
identificación de una gran variedad de microorganismos susceptibles
de producir infecciones en dicho órgano. Muchas de estas
infecciones oculares pueden tener consecuencias muy graves para la
visión del paciente infectado, si no se diagnostican y tratan
tempranamente. Con este fin es necesario en algunos casos llevar a
cabo la detección del agente infeccioso directamente en el órgano
infectado, extrayendo del ojo fragmentos representativos del tejido
susceptible de infección (biopsia) o analizando fluidos
fisiológicos en contacto con dichos tejidos (lágrima, en este
caso). Los métodos habituales para la detección de microorganismos
en las muestras citadas se basan, frecuentemente, en realizar
cultivos que incrementen la población del posible microorganismo
patógeno, para facilitar su posterior identificación. Estos cultivos
pueden requerir períodos de tiempo prolongados, de
1-4 días, durante los cuales no se puede tratar al
paciente con medicamentos específicos para su infección, al
desconocerse el organismo causal de la misma. Estos tiempos de
espera tan dilatados pueden llegar a tener consecuencias de extrema
gravedad para el órgano infectado, por lo que sería de gran
utilidad disponer de métodos alternativos de detección que
disminuyan considerablemente el tiempo necesario para realizar el
correcto diagnóstico.
Por otra parte, para la prevención de este tipo
de infecciones es muy importante que aquellos elementos que
eventualmente puedan estar en íntimo contacto con el ojo durante
largos períodos de tiempo, tales como las lentes de contacto y los
líquidos de lavado correspondientes, se conserven y utilicen en
condiciones de higiene elevada que aseguren su esterilidad. De forma
análoga a lo descrito más arriba, para poder obtener información
fiable sobre la posible contaminación de dichas prótesis oculares y
de los medios de conservación de las mismas, frecuentemente es
necesario recurrir a laboriosos métodos de cultivo de
microorganismos. La complejidad de las actuales técnicas de
diagnóstico de estos materiales, basadas en cultivos celulares
limitan en este caso tanto la frecuencia como la extensión de su
aplicación, con el consiguiente aumento del riesgo de infección
para los usuarios.
Asimismo, se han desarrollado técnicas
alternativas de detección de microorganismos infecciosos de tipo
fluorimétrico, basadas en el uso de un compuesto marcador
fluorescente que se adiciona directamente al medio donde se
sospecha la existencia del microorganismo. Si el compuesto marcador
fluorescente se incorpora al microorganismo infeccioso, es posible
determinar la presencia y morfología del mismo utilizando diversos
dispositivos de visualización de fluorescencia, tales como
microscopios o citómetros de flujo (Kawamoto, F., Rapid diagnosis
of malaria by fluorescence microscopy with light microscope and
interference filter. Lancet 1991, 337,
200-202). Como estos dispositivos permiten detectar
intensidades muy pequeñas de fluorescencia, en principio es posible
realizar un diagnóstico correcto con un número de células muy
reducido, disminuyendo de manera considerable el tiempo requerido
para dicha operación. Desgraciadamente, la utilización de este
método directo de marcado fluorescente para la detección de
infecciones en el ojo queda gravemente limitado por la falta de
especificidad en el marcado fluorescente, causado porque la
afinidad de los marcadores fluorescentes tradicionales por
numerosos microorganismos patógenos de interés oftalmológico es muy
similar a la afinidad por células y tejidos del ojo sano,
dificultando la discriminación de la fluorescencia correspondiente a
los organismos patógenos.
El objetivo de la presente invención consiste
precisamente en utilizar un nuevo método sencillo y económico que
permite aumentar la afinidad del marcador fluorescente por el
organismo infeccioso. El nuevo método se basa en utilizar un
marcador fluorescente unido a un tipo de compuestos de estructura
molecular relativamente simple, que muestran mucha más afinidad por
el organismo patógeno que por las células normales sanas del ojo.
Estos compuestos, que se utilizan en la presente invención para la
incorporación selectiva en el organismo patógeno del marcador
fluorescente, pertenecen a la familia de los alquilfosfolípidos, y
entre los mismos se encuentran por ejemplo miltefosina (MT),
edelfosina (ET) e ilmofosina (IM) (Croft, S. L.; Engel, J.,
Miltefosine-discovery of the antileishmanial
activity of phospholipid derivatives. Trans R Soc Trop Med
Hyg 2006, 100 Suppl 1, S4-8).
Miltefosina (MT) se usa actualmente en el
tratamiento de metástasis cutáneas de cáncer de mama, y se
comercializa bajo el nombre de MILTEX. Además, miltefosina muestra
una potente actividad antiparasitaria, por lo que se utiliza para
tratamiento de la leishmaniasis humana (Soto, J.; Soto, P.,
Miltefosine: oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti
Infect Ther 2006, 4, (2), 177-85)
comercializándose bajo el nombre de IMPAVIDO (Zentaris S. A.) en
Colombia, India y Alemania. Recientemente se ha iniciado también la
utilización de MT para el tratamiento de leishmaniasis canina,
utilizándose con este fin la composición comercial MILTEFORAN
(Virbac). Por otro lado, se ha observado que la actividad
citotóxica de MT se extiende a otros protozoos, tales como
Trichomonas (Blaha, C.; Duchene, M.; Aspock, H.; Walochnik,
J., In vitro activity of hexadecylphosphocholine
(miltefosine) against metronidazole-resistant and
-susceptible strains of Trichomonas vaginalis. J
Antimicrob Chemother 2006, 57, (2),
273-8), Entamoeba histolytica (Seifert, K.;
Duchene, M.; Wernsdorfer, W. H.; Kollaritsch, H.; Scheiner, O.;
Wiedermann, G.; Hottkowitz, T.; Eibl, H., Effects of miltefosine
and other alkylphosphocholines on human intestinal parasite
Entamoeba histolytica. Antimicrob Agents Chemother
2001, 45, (5), 1505-10), amebas de vida
libre, como Acanthamoeba sp. o Naegleria sp. (Schuster, F.
L.; Guglielmo, B. J.; Visvesvara, G. S.,
In-vitro activity of miltefosine and
voriconazole on clinical isolates of free-living
amebas: Balamuthia mandrillaris, Acanthamoeba spp., and
Naegleria fowleri. J Eukaryot Microbiol 2006, 53,
(2), 121-6; Walochnik, J.; Duchene, M.; Seifert, K.;
Obwaller, A.; Hottkowitz, T.; Wiedermann, G.; Eibl, H.; Aspock, H.,
Cytotoxic activities of alkyiphosphocholines against clinical
isolates of Acanthamoeba spp. Antimicrob Agents
Chemother 2002, 46, (3), 695-701)
patógenas para el hombre así como a otros microorganismos patógenos
humanos, incluyendo hongos, levaduras (Obando, D.; Widmer, F.;
Wright, L. C.; Sorrell, T. C.; Jolliffe, K. A., Synthesis,
antifungal and antimicrobial activity of alkyiphospholipids.
Bioorg Med Chem 2007, 15, (15),
5158-65; Widmer, F.; Wright, L. C.; Obando, D.;
Handke, R.; Ganendren, R.; Ellis, D. H.; Sorrell, T. C.,
Hexadecylphosphocholine (miltefosine) has
broad-spectrum fungicidal activity and is
efficacious in a mouse model of cryptococcosis. Antimicrob Agents
Chemother 2006, 50, (2), 414-21) y
Streptococcus pneumoniae (Llull, D., Rivas, L., García, E.
In vitro bactericidal activity of the antiprotozoal drug
miltefosine against Streptococcus pneumoniae and other
pathogenic streptococci. Antimicrob Agents Chemother.
2007, 51,(5):1844-8).
Se conoce muy poco sobre el mecanismo detallado
mediante el cual miltefosina ejerce sus propiedades citotóxicas en
los organismos citados. Los estudios más recientes sobre algunos
parásitos específicos indican que posiblemente dicho mecanismo sea
del tipo multi-diana, ya que la concentración
intracelular de MT en los mismos es muy elevada, alcanzando en
Leishmania valores en el rango milimolar
(Luque-Ortega, J. R.; Rivas, L., Miltefosine
(hexadecylphosphocholine) inhibits cytochrome c oxidase in
Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob Agents
Chemother 2007, 51, (4), 1327-32;Saugar,
J. M.; Delgado, J.; Hornillos, V.; Luque-Ortega, J.
R.; Amat-Guerri, F.; Acuña, A. U.; Rivas, L.,
Synthesis and Biological Evaluation of Fluorescent Leishmanicidal
Analogues of Hexadecylphosphocholine (Miltefosine) as Probes of
Antiparasite Mechanisms. J Med Chem 2007, 50, (24),
5994-6003). Esta hipótesis también se apoya en la
aparición de cepas de Leishmania resistentes a MT que se
caracterizan porque dicha resistencia procede únicamente de defectos
funcionales en los translocadores específicos del fármaco en el
parásito (Seifert, K.; Perez-Victoria, F. J.;
Stettler, M.; Sanchez-Canete, M. P.; Castanys, S.;
Gamarro, F.; Croft, S. L., Inactivation of the miltefosine
transporter, LdMT, causes miltefosine resistance that is conferred
to the amastigote stage of Leishmania donovani and persists
in vivo. Int J Antimicrob Agents 2007, 30,
(3), 229-35; Perez-Victoria, F. J.;
Sanchez-Canete, M. P.; Seifert, K.; Croft, S. L.;
Sundar, S.; Castanys, S.; Gamarro, F., Mechanisms of experimental
resistance of Leishmania to miltefosine: Implications for clinical
use. Drug Resist Updat 2006, 9, (1-2),
26-39; Perez-Victoria, F. J.;
Sanchez-Canete, M. P.; Castanys, S.; Gamarro, F.,
Phospholipid translocation and miltefosine potency require both
L. donovani miltefosine transporter and the new protein
LdRos3 in Leishmania parasites. J Biol Chem 2006,
281, (33), 23766-75; Perez-Victoria,
F. J.; Gamarro, F.; Ouellette, M.; Castanys, S., Functional cloning
of the miltefosine transporter. A novel P-type
phospholipid translocase from Leishmania involved in drug
resistance. J Biol Chem 2003, 278, (50),
49965-71). Estos transportadores específicos
pertenecen a la familia de aminofosfolípido translocasas; sin
embargo la identificación precisa de dicho transportador sólo se ha
realizado en Leishmania donovani
(Perez-Victoria, F. J.; Gamarro, F.; Ouellette, M.;
Castanys, S., Functional cloning of the miltefosine transporter. A
novel P-type phospholipid translocase from
Leishmania involved in drug resistance. J Biol Chem
2003, 278, (50), 49965-71), como LdMT3, y en
Saccharomyces cerevisiae como Lem3 (Hanson, P. K.; Malone,
L.; Birchmore, J. L.; Nichols, J. W., Lem3p is essential for the
uptake and potency of alkylphosphocholine drugs, edelfosine and
miltefosine. J Biol Chem 2003, 278, (38),
36041-50). En Leishmania las mutaciones del
transportador suponen la aparición de resistencia a miltefosina y
edelfosina, cursando con una inhibición concomitante de la
incorporación de miltefosina radioactiva al parásito; sin embargo,
en el caso de pérdida de función de Lem3 de S. cerevisiae,
aparece inhibida la incorporación del fosfolípido fluorescente
NBD–PC, asociada a un fenotipo de resistencia a edelfosina, que se
debe a una incorporación defectuosa del fármaco, aunque tal efecto
no ha sido medido experimentalmente (Hanson, P. K.; Malone, L.;
Birchmore, J. L.; Nichols, J. W., Lem3p is essential for the uptake
and potency of alkylphosphocholine drugs, edelfosine and
miltefosine. J Biol Chem 2003, 278, (38),
36041-50).
Las conclusiones que se derivan de los
anteriores estudios y que son relevantes para la presente invención
se pueden resumir en la forma siguiente: i) MT y otros
alquilfosfolípidos similares se incorporan selectivamente a
eucariotas inferiores y a células transformadas; ii) la acción letal
de estos compuestos está asociada a una incorporación intracelular
masiva de dichos fármacos y iii) los mecanismos de resistencia a MT
que se han identificado hasta el presente en varios tipos de
parásitos están asociados exclusivamente a la acumulación
defectuosa de dicho fármaco a dichos organismos.
Recientemente se ha iniciado el empleo masivo de
MT en pacientes infectados por leishmaniasis visceral en la India y
Nepal, especialmente en pacientes infectados con cepas resistentes
al tratamiento con fármacos antimoniales (Sundar, S.; Chatterjee,
M., Visceral leishmaniasis - current therapeutic modalities.
Indian J Med Res 2006, 123, (3),
345-52); la misma estrategia se utiliza también en
varios países de América del Sur, en el tratamiento de la
leishmaniasis cutánea (Soto, J.; Soto, P., Miltefosine: oral
treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther
2006, 4, (2), 177-85). Debido a las
dificultades para el correcto control hospitalario del tratamiento
en estos entornos, es predecible la rápida aparición de cepas del
parásito resistentes a MT. Experimentos en modelos animales han
demostrado que la virulencia de los parásitos resistentes, debido a
la deficiencia en el translocador de MT, es la misma que la de los
parásitos sensibles al fármaco (Seifert, K.;
Perez-Victoria, F. J.; Stettler, M.;
Sanchez-Canete, M. P.; Castanys, S.; Gamarro, F.;
Croft, S. L., Inactivation of the miltefosine transporter, LdMT,
causes miltefosine resistance that is conferred to the amastigote
stage of Leishmania donovani and persists in vivo.
Int J Antimicrob Agents 2007, 30, (3),
229-35). La disponibilidad de un reactivo y de un
procedimiento rápido y manejable, como el que se propone en la
presente invención, permitirá detectar tempranamente y atajar la
aparición de cepas resistentes.
Por otro lado, el diagnóstico precoz de la
presencia en el ojo de Acanthamoeba, infección amebiana con
una incidencia especialmente elevada en usuarios de lentes de
contacto con hábitos de higiene defectuosos, se realiza actualmente
tras descartar previamente posibles infecciones por herpes y
fúngicas, con el consiguiente daño ocasionado por dicho retraso, que
lleva a veces a la pérdida irreversible de visión (Hammersmith, K.
M., Diagnosis and management of Acanthamoeba keratitis.
Curr Opin Ophthalmol 2006, 17, (4),
327-31).
La aplicación adicional de los compuestos
descritos en la presente invención en el control de calidad de los
líquidos de preservación y lavado de lentes de contacto, así como
de los medios de almacenamiento de córneas para trasplante, se basa
en los mismos principios. Recientemente, una contaminación por
Fusarium del líquido de preservación de lentes afectó
seriamente a un elevado número de pacientes, con las consiguientes
pérdidas económicas para el fabricante (Chang, D. C.; Grant, G. B.;
O'Donnell, K.; Wannemuehler, K. A.; Noble-Wang, J.;
Rao, C. Y.; Jacobson, L. M.; Crowell, C. S.; Sneed, R. S.; Lewis,
F. M.; Schaffzin, J. K.; Kainer, M. A.; Genese, C. A.; Alfonso, E.
C.; Jones, D. B.; Srinivasan, A.; Fridkin, S. K.; Park, B. J.,
Multistate outbreak of Fusarium keratitis associated with use of a
contact lens solution. JAMA 2006, 296, (8),
953-63; Centers for Disease Control and Prevention
(CDC), Update: Fusarium keratitis-United States,
2005-2006. MMWR Morb Mortal Wkly Rep
2006, 55, (20), 563-4).
Las poblaciones de protozoos de vida libre
constituyen organismos centinelas de la calidad del agua, así como
de la contaminación ambiental (Martin-Cereceda, M.;
Perez-Uz, B.; Serrano, S.; Guinea, A., Dynamics of
protozoan and metazoan communities in a full scale wastewater
treatment plant by rotating biological contactors. Microbiol
Res 2001, 156, (3), 225-38), por lo que
la detección y visualización de estos microorganismos mediante el
compuesto de la invención se facilitarían tras su concentración e
incorporación del análogo fluorescente.
Existen estudios previos en los que se han
sintetizado y utilizado análogos fluorescentes de
alquilfosfolípidos:
1.- Se han preparado previamente análogos de un
compuesto similar (edelfosina), marcados con grupos feniltetraeno,
y se ha observado que dicho marcador no altera sustancialmente la
bioactividad del fármaco original (Quesada, E.; Delgado, J.;
Gajate, C.; Mollinedo, F.; Acuña, A. U.;
Amat-Guerri, F., Fluorescent phenylpolyene
analogues of the ether phospholipid edelfosine for the selective
labeling of cancer cells. J Med Chem 2004, 47, (22),
5333-5).
2.- Se han preparado análogos de MT con dichos
grupos marcadores feniltetraeno o feniltrienino que mantienen las
propiedades antiparasitarias del fármaco original y, además, se
incorporan específicamente a parásitos procedentes de cepas de
Leishmania sensibles al fármaco, pero no a los procedentes
de cepas resistentes (Saugar, J. M.; Delgado, J.; Hornillos, V.;
Luque-Ortega, J. R.; Amat-Guerri,
F.; Acuña, A. U.; Rivas, L., Synthesis and Biological Evaluation of
Fluorescent Leishmanicidal Analogues of Hexadecylphosphocholine
(Miltefosine) as Probes of Antiparasite Mechanisms. J Med
Chem 2007, 50, (24), 5994-6003).
3.- Se ha utilizado el análogo fluorescente de
pentamidina DB-99 para la detección temprana de
organismos resistentes al tratamiento con fármacos arsenicales en
la tripanosomiasis africana (Stewart, M. L.; Krishna, S.;
Burchmore, R. J.; Brun, R.; de Koning, H. P.; Boykin, D. W.;
Tidwell, R. R.; Hall, J. E.; Barrett, M. P., Detection of arsenical
drug resistance in Trypanosoma brucei with a simple
fluorescence test. Lancet 2005, 366, (9484),
486-7). En Trypanosoma brucei, el
microorganismo causante de dicha infección, la entrada de
pentamidina y de DB99 al interior del parásito se realiza a través
del mismo transportador de fármacos arsenicales. En consecuencia, la
ausencia o disfunción de dicho transportador supone la inhibición
de la internalización de pentamidina y de DB-99 y,
por tanto, la inhibición del marcado fluorescente del mismo, así
como la aparición de un fenotipo de resistencia a fármacos
arsenicales.
Un aspecto de la invención lo constituye un
compuesto fluorescente útil para la identificación diferencial de
microorganismos, en adelante compuesto de la invención, que
comprende un análogo de un alquilfosfolípido con un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "análogo de alquilfosfolípido" se refiere a un
compuesto obtenido por síntesis y cuya estructura se parece a la de
un alquilfosfolípido. Tal como se utiliza en la presente invención
el término "alquilfosfolípido" se refiere a un compuesto que
incluye en su estructura un resto lipofílico, formado por
combinaciones lineales o cíclicas de átomos de carbono e hidrógeno
(parte alquílica) unido a un resto hidrofílico, formado por un
grupo fosfato esterificado o libre (fosfolípido). Entre los
alquilfosfolípidos se encuentran, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención: hexadecilfosfocolina
(miltefosina, MT),
1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina
(edelfosina, EF) y
1-S-hexadecil-2-metoximetil-rac-glicero-3-fosfocolina
(ilmofosina, IM). Ejemplos de análogos de alquilfosfolípidos son, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
todo-(E)-13-feniltrideca-6,8,10,12-tetraenilfosfocolina
y
todo-(E)-13-feniltrideca-8,10,12-trien-6-inilfosfocolina.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "microorganismo" se refiere a cualquier protozoo,
ameba, hongo, levadura y bacteria, perteneciente, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica, Acanthamoeba sp.,
Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium sp., Tetrahymena
pyriformis, Balamuthia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "grupo fluorescente" se refiere a un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible, entre los que se
encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas,
oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o
sin sustituyentes.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es miltefosina (MT), edelfosina (EF) o ilmofosina
(IM).
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es un análogo de miltefosina (MT), edelfosina
(EF) o ilmofosina (IM).
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el grupo
fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el derivado de
alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP
libre o sustituido.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye el compuesto de la invención BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención del compuesto de la
invención que comprende las siguientes etapas:
i) obtención del correspondiente
\alpha-H-pirrol sustituido a
partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,
ii) condensación del
\alpha-H-pirrol con el adecuado
\alpha-formilpirrol,
iii) reacción del dipirrometeno así formado con
eterato de trifluoruro de boro,
iv) introducción del grupo fosfocolina.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en la elaboración
de una composición farmacéutica útil para un procedimiento de
identificación de microorganismos.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye la composición farmacéutica de diagnóstico, en adelante
composición farmacéutica de diagnóstico de la invención, que
comprende un compuesto de la invención, por ejemplo el compuesto
BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Finalmente, otro aspecto particular de la
invención es el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de
la invención, en un procedimiento de identificación de
microorganismos.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en un procedimiento de diagnóstico ex vivo a
partir de muestras biológicas humanas o veterinarias de individuos
portadores de enfermedades infecciosas pertenecientes, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: queratitis oculares, leishmaniasis, tripanosomiasis
africana y americana, neumonía por Streptococcus pneumoniae,
amebiasis, trichomoniasis y micosis.
Otra realización más particular lo constituye el
uso de la composición farmacéutica de la invención en el que la
enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma
brucei, Trypanosoma cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica,
Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium
sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.
Otra realización más particular de la invención
lo constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención en el que el procedimiento de diagnóstico se lleva
a cabo sobre una muestra biológica de origen ocular, por ejemplo,
obtenida por un raspado corneal.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en el que el procedimiento se corresponde con la
identificación de microorganismos en muestras no humanas ni
animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de
contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de
preservación de córneas.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que análogos bioactivos de
alquilfosfolípidos, como por ejemplo los compuestos
BDP-MT o Et-BDP-MT,
que contienen en su estructura grupos fluorescentes de alta
fotoestabilidad y que emiten en la zona de longitudes de onda del
espectro visible de 400-700 nm (Slavik, J.,
Fluorescent Probes in Cellular and Molecular Biology 1ed.;
CRC Press: Boca Raton, FL, 2004; p 320), se incorporan fácilmente a
microorganismos, y que esta incorporación es detectable con
microscopios de fluorescencia convencionales. Así, un experto en
diagnóstico visual podría identificar fácilmente la presencia de
microorganismos, por ejemplo hongos, protozoos, e incluso
determinadas bacterias, como Streptococccus pneumoniae etc.,
capaces de incorporar dichos compuestos. Asimismo, una vez
identificada la especie, el experto podría deducir la posible
resistencia a un tratamiento con alquilfosfolípidos, que se
relacionaría directamente con una deficiente incorporación del
compuesto y un fenotipo de resistencia a la acción citotóxica de
alquilfosfolípidos.
Con este fin es suficiente añadir el análogo
fluorescente al medio o tejido en el que se sospecha la presencia
de microorganismos. Por ejemplo, mediante la aplicación directa
sobre la córnea de la composición farmacéutica que comprende el
compuesto. En caso afirmativo, dichos microorganismos se marcan
rápidamente con el análogo fluorescente, permitiendo su
identificación visual mediante los métodos habituales de
observación microscópica. Además, si los organismos contienen el
transportador específico del fármaco original MT, se observa la
rápida aparición de fluorescencia en el interior del mismo. Por el
contrario, si el organismo es resistente al fármaco MT, en las
mismas condiciones no se observa fluorescencia en el interior del
parásito. De esta forma se dispone de un método de diagnóstico
rápido y sencillo de la presencia de dichos microorganismos y/o de
su resistencia al fármaco MT.
Más concretamente, y como ejemplo particular de
la invención, se han sintetizado y ensayado biológicamente una
serie de análogos fluorescentes de MT, caracterizados porque
incorporan un grupo fluorescente borodipirrometeno (BDP) a la
cadena alifática de dicho compuesto (ver ejemplos). Cuando se
adicionan dichos análogos emisores a un medio fisiológico en el que
están presentes trofozoítos de Acanthamoeba e hifas y
conidios de hongos, se incorporan rápidamente a ambos tipos de
organismos, permitiendo su correcta visualización y la consiguiente
identificación individual, basada en sus características
morfológicas. Este método facilitaría el diagnóstico diferencial de
microorganismos en el ojo, ya que es posible aplicar dichos
compuestos en forma de colirio a dicho órgano, para la observación
directa. Asimismo, el método mencionado es aplicable al diagnóstico
de la presencia de dichos organismos en muestras procedentes de
tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo raspados corneales, o
para el análisis de líquidos de preservación de trasplantes de
córnea o de líquidos de preservación e higiene de lentes de
contacto.
A continuación se mencionan aplicaciones
posibles de estos compuestos, fundamentadas en los estudios
realizados hasta el momento y resumidos en el estado de la
técnica:
1.- Diagnóstico rápido y fiable de enfermedades
de la visión, como queratitis oculares provocadas por infecciones
fúngicas o amebianas (Acanthamoeba sp).
2.- Diagnóstico rápido y fiable de posibles
contaminaciones en prótesis oculares (lentes de contacto, etc.),
líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de preservación
de córneas, a partir de la detección de la presencia de organismos
patógenos en dichos medios.
3.- Diagnóstico rápido de pacientes y animales
(perro) infectados con cepas de Leishmania resistentes al
fármaco antiparasitario miltefosina, a partir de la detección de
parásitos resistentes, tanto en fluidos fisiológicos, incluyendo
sangre periférica, como en muestras y biopsias de tejidos
procedentes de dichos pacientes.
4.- Diagnóstico rápido del grado de higiene
medioambiental, a partir de la identificación de protozoos de vida
libre en medios acuosos de relevancia medioambiental.
5.- Investigación a nivel macroscópico y
molecular, mediante técnicas de bioimagen, de propiedades
farmacológicas y biológicas de miltefosina y alquilfosfolípidos
similares, tanto en estudios celulares como en animales de
experimentación, basados en la identificación diferencial de la
fluorescencia de dichos análogos en los diferentes órganos y
tejidos del animal de experimentación.
Por lo tanto, un aspecto de la invención lo
constituye un compuesto fluorescente útil para la identificación
diferencial de microorganismos, en adelante compuesto de la
invención, que comprende un análogo de un alquilfosfolípido con un
grupo fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona
de longitudes de onda del espectro visible.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "análogo de alquilfosfolípido" se refiere a un
compuesto obtenido por síntesis y cuya estructura se parece a la de
un alquilfosfolípido. Tal como se utiliza en la presente invención
el término "alquilfosfolípido" se refiere a un compuesto que
incluye en su estructura un resto lipofílico, formado por
combinaciones lineales o cíclicas de átomos de carbono e hidrógeno
(parte alquílica) unido a un resto hidrofílico, formado por un
grupo fosfato esterificado o libre (fosfolípido). Entre los
alquilfosfolípidos se encuentran, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención: hexadecilfosfocolina
(miltefosina, MT),
1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina
(edelfosina, EF) y
1-S-hexadecil-2-metoximetil-rac-glicero-3-fosfocolina
(ilmofosina, IM). Ejemplos de análogos de alquilfosfolípidos son, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
todo-(E)-13-feniltrideca-6,8,10,12-tetraenilfosfocolina
y
todo-(E)-13-feniltrideca-8,10,12-trien-6-inilfosfocolina.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "microorganismo" se refiere a cualquier protozoo,
ameba, hongo, levadura y bacteria, perteneciente, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica, Acanthamoeba sp.,
Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium sp., Tetrahymena
pyriformis, Balamuthia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "grupo fluorescente" se refiere a un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible, entre los que se
encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas,
oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o
sin sustituyentes.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es miltefosina (MT), edelfosina (EF) o ilmofosina
(IM).
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es un análogo de miltefosina (MT), edelfosina
(EF) o ilmofosina (IM).
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el grupo
fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el derivado de
alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP
libre o sustituido.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye el compuesto de la invención BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención del compuesto de la
invención que comprende las siguientes etapas:
i) obtención del correspondiente
\alpha-H-pirrol sustituido a
partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,
ii) condensación del
\alpha-H-pirrol con el adecuado
\alpha-formilpirrol,
iii) reacción del dipirrometeno así formado con
eterato de trifluoruro de boro,
iv) introducción del grupo fosfocolina.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en la elaboración
de una composición farmacéutica útil para un procedimiento de
identificación de microorganismos.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye la composición farmacéutica de diagnóstico, en adelante
composición farmacéutica de diagnóstico de la invención, que
comprende un compuesto de la invención, por ejemplo el compuesto
BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Finalmente, otro aspecto particular de la
invención es el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de
la invención, en un procedimiento de identificación de
microorganismos.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en un procedimiento de diagnóstico ex vivo a
partir de muestras biológicas humanas o veterinarias de individuos
portadores de enfermedades infecciosas pertenecientes, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: queratitis oculares, leishmaniasis,
tripanosomiasis africana y americana, neumonía por Streptococcus
pneumoniae, amebiasis, trichomoniasis y micosis.
Otra realización más particular lo constituye el
uso de la composición farmacéutica de la invención en el que la
enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma
brucei, Trypanosoma cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica,
Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium
sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.
Otra realización más particular de la invención
lo constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención en el que el procedimiento de diagnóstico se lleva
a cabo sobre una muestra biológica de origen ocular, por ejemplo,
obtenida por un raspado corneal.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en el que el procedimiento se corresponde con la
identificación de microorganismos en muestras no humanas ni
animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de
contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de
preservación de córneas.
Figura 1.- Síntesis de los análogos
fluorescentes de BDP-MT y Et-BDP-
MT, a través de los intermedios 1 a 5.
Figura 2.- Detección diferencial de
resistencia a miltefosina en promastigotes de L. donovani
(cepa MHOM/ET/67/ L82). Promastigotes de L.
donovani sensibles (WT) (fila superior) o resistentes a MT (R40)
(fila inferior) se incubaron con BDP-MT 7.5 \muM
durante 2 h a 26ºC, se lavaron con seroalbúmina bovina (BSA) tres
veces, y se examinaron por microscopía confocal utilizando 488 nm
como longitud de excitación y 502-555 nm como
entorno de lectura de la emisión.
Figura 3.- Tinción diferencial de las dos
formas diferenciales de Acanthamoeba castellanii por
BDP-MT. Quistes (a) y trofozoítos (b) de A.
castellanii se incubaron a 32ºC con 5 \muM
BDP-MT durante 15 min, se lavaron con una
disolución de BSA (10 mg/mL) y se observaron en un microscopio
confocal, utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
detectando la emisión en el intervalo 502-555
nm.
Figura 4.- Tinción simultánea diferencial por
BDP-MT de Fusarium y las dos formas de
Acanthamoeba castellanii . Trofozoítos (a) y quistes (b)
de A. castellanii conjuntamente con Hifas de Fusarium
sp. (c) se incubaron 15 minutos con 5 \muM
BDP-MT y se lavaron con BSA. Se observaron en un
microscopio confocal utilizando 488 nm como longitud de onda de
excitación y detectando la emisión en el intervalo
502-555 nm.
Figura 5.- Tinción simultánea diferencial por
Et-BDP-MT de Fusarium y las dos
formas de Acanthamoeba castellanii . Trofozoítos (a) y
quistes (b) de A. castellanii conjuntamente con hifas de
Fusarium sp (c) se incubaron 15 minutos a 30ºC con 5 \muM
Et-BDP-MT y se lavaron con BSA. La
fluorescencia se observó mediante un microscopio de
epifluorescencia con cámara CCD, y filtro de emisión de
480-520 nm.
Figura 6.- Tinción por BDP-MT
de Tetrahymena pyriformis, como protozoo de vida libre.
Tetrahymena pyriformis se incubó con 5 \muM
BDP-MT durante 4 h, y se lavó y se fijó con
paraformaldehído al 2%, para evitar movimientos durante el proceso
de adquisición de imágenes. Las células se observaron en un
microscopio confocal utilizando 488 nm como longitud de onda de
excitación y detectando la emisión en el intervalo
502-555 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos dos análogos fluorescentes con el
cromóforo borodipirrometeno (BDP) se obtienen por un procedimiento
similar en dos pasos, partiendo de los pirroles correspondientes
(Figura 1). Así, se condensa el \alpha-H pirrol 3
con
2-formil-3,5-dimetil-1H-pirrol
o con
2-formil-3,5-dimetil-4-etil-1H-pirrol
en presencia de oxicloruro de fósforo (reacción de MacDonald). Los
correspondientes dipirrometenos formados se convierten in
situ en los respectivos colorantes BDP sustituidos 4 y 5
mediante reacción con eterato de trifluoruro de boro en presencia
de trietilamina. En un último paso sintético se introduce el grupo
fosfocolina por reacción con
2-cloro-1,3,2-dioxafosfolano-2-óxido
en presencia de trimetilamina. Los precursores se obtienen como
sigue: el dicetoalcohol 1 se alcanza por monoalquilación de
acetilacetona con
11-bromo-1-undecanol
en acetona, en presencia de carbonato potásico y el éter corona
18-crown-6; el etoxicarbonilpirrol 2
se prepara en dos pasos: 1) acetoacetato de etilo se trata con
nitrito sódico, y 2) el hidroxi-imino compuesto
obtenido se reduce con zinc/ácido acético (síntesis de
Johnson-Knorr) en presencia de 1. El
\alpha-H pirrol 3 se obtiene por descarboxilación
de 2 por tratamiento con hidróxido sódico en agua/etanol.
2-Formil-3,5-dimetil-1H-pirrol
es un producto comercial, mientras que su homólogo
2-formil-4-etil-3,5-dimetil-1H-pirrol
se obtiene por formilación de
2,5-dimetil-3-etil-1H-pirrol
(kriptopirrol) con oxicloruro de fósforo en dimetilformamida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los promastigotes de L. donovani cepa
MHOM/ET/67/L82 y su cepa resistente a miltefosina fueron
proporcionados por el Prof Simon Croft (London School of Tropical
Hygiene and Medicine, Londres, UK) y se cultivaron conforme a
métodos habituales: 26ºC en medio RPMI suplementado con 10% suero
fetal bovino inactivado, gentamicina, penicilina y 2 mM glutamina.
La cepa resistente a MT se creció de forma idéntica a la parental
sensible a MT, excepto por la adición de 40 \muM MT en el medio
de crecimiento. Ambos tipos de parásitos se recogieron en fase
estacionaria, se lavaron con medio RPMI 1640 carente de rojo fenol,
y se incubaron en dicho medio durante 2 horas a 26ºC a una densidad
de 2 x 10^{6} parásitos/mL, al que se adicionó 7.5 \muM
BDP-MT. A continuación se sometieron a tres lavados
con dicho medio en presencia de BSA libre de ácidos grasos, a 10
mg/mL, y finalmente se detectaron in vivo en un microscopio
confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la
emisión.
Se puede observar en la Figura 2 que los
parásitos de la cepa sensible muestran una intensa fluorescencia
intracelular, mientras que los que proceden de la cepa resistente
muestran una débil fluorescencia, debido a la escasa incorporación
del análogo marcador BDP-MT.
Los trofozoítos y quistes de A.
castellanii fueron proporcionados por la Dra Carmen del Águila,
Universidad San Pablo CEU, Madrid. Los trofozoítos se crecieron en
medio CDC suplementado con suero fetal bovino al 5% a 27ºC,
posteriormente se lavaron en dicho medio en ausencia de suero fetal
bovino y se incubaron en el mismo medio durante 15 minutos a una
densidad de 7 x 10^{5} trofozoítos a 32ºC con 5 \muM
BDP-MT. Tras dicha incubación, se lavaron en el
mismo medio con 10 mg/mL de BSA y se observaron in vivo en un
microscopio confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la
emisión.
Se puede observar en la Figura 3 que los
trofozoítos de A. castellanii, que constituyen la forma
metabólicamente activa del parásito, muestran un intenso marcado
fluorescente intracelular debido a la elevada incorporación de
BDP-MT. En el caso de los quistes, se observa en
dicha figura que la tinción fluorescente se concentra en la
superficie. Como este experimento se llevó a cabo con organismos
vivos, existen pequeñas diferencias de posición entre las imágenes
consecutivas de transmisión y de fluorescencia, debidas a la
movilidad de los trofozoítos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las hifas del hongo Fusarium se
mantuvieron en agarosa con medio de Saboroud. La expansión celular
se realizó a 32ºC en medio RPMI 1640 con antibióticos y sin
suplementar con suero fetal bovino. Tras lavado, las hifas se
resuspendieron durante 15 minutos a 32ºC en idéntico medio sin rojo
fenol y en presencia de BDP-MT 5 \muM. A
continuación, se lavaron tres veces con BSA y se observaron in
vivo en un microscopio confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la emisión.
Las imágenes fluorescentes que se observan tras la incorporación de
BDP-MT son muy diferentes para las tres formas,
hifas, trofozoítos y quistes. En el caso de las hifas, se aprecia
nítidamente su morfología alargada característica, mientras que en
el caso de trofozoítos de A. castellanii, de tamaño
considerablemente menor, se observan formas irregulares; en ambos
casos se aprecia la incorporación intracelular del análogo
fluorescente. En el caso de los quistes de A. castellanii, de
forma esencialmente esférica, se observa el marcado fluorescente
únicamente en la superficie del organismo, como ya se comentó en el
ejemplo anterior.
El método de marcado fluorescente de organismos
patógenos demostrado más arriba, en el que se utilizaba el
compuesto BDP-MT, puede llevarse a cabo también
utilizando otros análogos, en los que, alterando la estructura del
grupo fluorescente, se consigue que tanto la longitud de onda de
excitación como la de emisión aparezcan en otras zonas diferentes
del espectro visible. Para ilustrar esta extensión en el presente
ejemplo se utiliza el análogo
Et-BDP-MT, en el que tanto la
excitación como la emisión ocurren a longitudes de onda desplazadas
hacia el rojo, en comparación con las del análogo
BDP-MT. Los tres paneles de la Figura 5 contienen
ejemplos representativos de organismos teñidos con
Et-BDP-MT, y allí se muestran
trofozoítos de Acanthamoeba castellanii (A), quistes de
Acanthamoeba castellanii (B), e hifas de Fusarium
(C). En todos los casos los microorganismos se marcaron
manteniéndolos en presencia del análogo
Et-BDP-MT, 5 \muM, durante 30
minutos. A continuación se lavaron con medio conteniendo BSA 10
mg/mL y se fotografiaron utilizando una Cámara CCD Digital Leica
DFC350FX acoplada a un microscopio Zeiss de epifluorescencia, con
un filtro de emisión de 480-520 nm.
En todos los casos se observa un patrón de
fluorescencia muy similar al obtenido para BDP-MT;
los trofozoítos de A. castellanii con marcado intracelular,
los quistes del mismo microorganismo no dañados con marcado tenue
superficial, y marcado de hifas de Fusarium, lo que demuestra
que los datos obtenidos para BDP-MT son fácilmente
extrapolables a otros compuestos estructuralmente similares.
Células del protozoo Tetrahymena
pyriformis se multiplicaron en el medio Proteasa Peptona
Glucosa Medium, y se recogieron por centrifugación a una densidad
de 10^{4} células/mL. A continuación se incubaron con
BDP-MT 5 \muM durante 4 h, se lavaron y fijaron
con paraformaldehído al 2% durante 30 minutos y se observaron con
un microscopio confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la
emisión.
Como puede observarse en la Figura 6, el
microorganismo incorpora una gran cantidad de compuesto
fluorescente, lo que permite su identificación y localización,
incluso a concentraciones celulares muy bajas.
Claims (17)
1. Compuesto fluorescente útil para la
identificación diferencial de microorganismos caracterizado
porque comprende un derivado de alquilfosfolípido y un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible.
2. Compuesto fluorescente según la
reivindicación 1 caracterizado porque el análogo de
alquilfosfolípido es la miltefosina (MT), edelfosina (EF) o
ilmofosina (IM).
3. Compuesto fluorescente según la
reivindicación 1 caracterizado porque el análogo de
alquilfosfolípido es un análogo de la miltefosina (MT), edelfosina
(EF) o ilmofosina (IM).
4. Compuesto fluorescente según reivindicación
1 caracterizado porque el grupo fluorescente es un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible, entre los que se
encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas,
oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o
sin sustituyentes.
5. Compuesto fluorescente según las
reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque el grupo
fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido
caracterizado por la fórmula general:
en
donde:
R^{1} = H, alquilo (lineal, no lineal, libre o
sustituido), arilo o heteroarilo (libre o sustituido), y R^{2} =
alquil-, alquenil- o alquinil-fosfolípido.
6. Compuesto fluorescente según reivindicación
5 caracterizado porque R' es un hidrógeno o un etilo.
7. Compuesto fluorescente según las
reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque el análogo de
alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP
libre o sustituido, caracterizado por la fórmula general:
en
donde:
R^{1} = H, alquilo (lineal, no lineal, libre o
sustituido), arilo o heteroarilo (libre o sustituido).
8. Compuesto fluorescente según reivindicación
7 caracterizado porque R^{1} es un hidrógeno (compuesto
BDP-MT) o un radical etilo (compuesto
Et-BDP-MT).
9. Procedimiento de obtención de un compuesto
fluorescente caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
i) obtención del correspondiente
\alpha-H-pirrol sustituido a
partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,
ii) condensación del
\alpha-H-pirrol con el adecuado
\alpha-formilpirrol,
iii) reacción del dipirrometeno así formado con
eterato de trifluoruro de boro,
iv) introducción del grupo fosfocolina.
10. Uso de un compuesto fluorescente según
reivindicaciones 1 a 8 en la elaboración de una composición
farmacéutica útil para un procedimiento de identificación de
microorganismos.
11. Composición farmacéutica de diagnóstico
caracterizada porque comprende un compuesto según
reivindicaciones 1 a 8.
12. Composición farmacéutica de diagnóstico
según la reivindicación 11 caracterizada porque comprende,
al menos, uno de los siguientes compuestos: BDP-MT
y Et-BDP-MT.
13. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según las reivindicaciones 11 y 12 en un procedimiento
de identificación de microorganismos.
14. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 13 en un procedimiento de
diagnóstico ex vivo a partir de muestras biológicas humanas
o veterinarias de individuos portadores de enfermedades infecciosas
pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: queratitis oculares,
leishmaniasis, tripanosomiasis africana y americana, neumonía por
Streptococcus pneumoniae, amebiasis, trichomoniasis y
micosis.
15. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 14 caracterizado porque la
enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo
perteneciente al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma
brucei, Trypanosoma cruzi Trichomonas sp., Entamoeba histolytica,
Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium
sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.
16. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 14 en un procedimiento de
diagnóstico sobre una muestra biológica de origen ocular, por
ejemplo, obtenida por un raspado corneal.
17. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 13 en un procedimiento de
identificación de microorganismos en muestras no humanas ni
animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de
contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de
preservación de córneas.
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