ES2326500T3 - Pequeños peptidos y metodos para el tratamiento del asma y la inflamacion. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe- Phe y Phe-Tyr, siendo f N-formilo.

Description

Pequeños péptidos y métodos para el tratamiento del asma y la inflamación.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a pequeños péptidos con actividad inhibidora la de degranulación de mastocitos y a métodos para el tratamiento de la inflamación, y en concreto a péptidos N-formil-metionil útiles para el tratamiento de la inflamación. Más en particular, la invención se refiere a métodos para el tratamiento de enfermedades o estados que implican la degranulación de mastocitos, incluyendo por ejemplo asma, artritis reumatoide y anafilaxis.

Antecedentes de la invención

El asma es un trastorno complejo. En los ataques de asma y sus exacerbaciones inflamatorias están implicados factores tanto hereditarios como ambientales -alergias, infecciones virales, agentes irritantes. Más de la mitad de los asmáticos (adultos y niños) tienen alergias; en efecto, la alergia a los excrementos de los acáridos del polvo en las casas representa un importante factor en el desarrollo de la enfermedad y en la aparición de exacerbaciones. La infección por el virus sincitial respiratorio durante la infancia también está muy relacionada con el desarrollo del asma y, a menudo, las infecciones virales respiratorias desencadenan episodios agudos.

La introducción hace tres décadas de los agonistas broncodilatadores beta_{2}-agonistas adrenérgicos selectivos de los receptores beta_{2} revolucionó el tratamiento del asma. Estos agentes demostraron ser más potentes y de acción más prolongada (4-6 horas) que los agonistas de los receptores adrenérgicos no selectivos, tales como isoproterenol, que estimula los receptores adrenérgicos tanto alfa como beta. Los beta_{2}-agonistas producen un alivio sintomático rápido y protegen también contra la broncoconstricción aguda provocada por estímulos tales como el ejercicio o la inhalación de aire muy frío. La frecuencia de uso puede servir también de indicador para el control del asma. Recientemente, se ha introducido en Estados Unidos un beta_{2}-agonista-salmeterol de acción extremadamente prolongada (duración de hasta 12 horas). El salmeterol es tan potente que puede ocultar las señales inflamatorias; por tanto, debería utilizarse junto con un antiinflamatorio.

La teofilina es un broncodilatador relativamente débil con un margen terapéutico estrecho (se recomienda la comprobación de los niveles sanguíneos para evitar la toxicidad) y es propenso a interacciones medicamentosas (la competición de las enzimas metabolizantes de fármacos del citocromo hepático P450 altera los niveles plasmáticos de varios medicamentos importantes metabolizados por este mismo sistema).

El asma moderada se trata con corticosteroides antiinflamatorios de inhalación diaria o con un inhibidor de mastocitos (cromolina sódica o nedocromil) más un beta_{2}-agonista inhalado según sea necesario (3-4 veces al día) para aliviar el avance de los síntomas del asma inducida por alergenos o por el ejercicio. La cromolina sódica y el nedocromil bloquean el broncoespasmo y la inflamación, pero normalmente sólo son eficaces para el asma relacionada con alérgenos o con el ejercicio y, por ello, típicamente sólo para asmáticos juveniles. Los corticosteroides inhalados mejoran la inflamación, la hiperreactividad de las vías aéreas, así como la obstrucción, y reducen el número de crisis agudas. Sin embargo, se necesita un mes para que los efectos sean evidentes y hasta un año para que se produzca una notable mejora. Los efectos secundarios más frecuentes son la ronquera y la candidiasis oral. Se han indicado efectos secundarios más graves -supresión adrenal parcial, inhibición del crecimiento y formación ósea reducida- pero sólo con el uso de dosis más altas. La beclometasona, la triamcinolona y la flunisolida tienen probablemente una potencia mg-por-mg similar; las nuevas autorizaciones para la budesonida y la fluticasona son más potentes y, según los informes recibidos, tienen menos efectos secundarios sistémicos.

Incluso los pacientes enfermos leves muestran inflamación de las vías aéreas, incluyendo infiltraciones de la mucosa y del epitelio por células T activadas, mastocitos y eosinófilos. Las células T y los mastocitos liberan citocinas, que favorecen el crecimiento de los eosinófilos y la maduración y la producción de anticuerpos IgE, y éstos, a su vez, aumentan la permeabilidad microvascular, rompen el epitelio y estimulan los reflejos neurales y las glándulas segregadoras de mucosidad. El resultado es una hiperreactividad de las vías aéreas, broncoconstricción e hipersecreción, manifestadas por una respiración jadeante, tos y disnea.

Tradicionalmente, el asma se ha tratado con broncodilatadores orales e inhalados. Estos agentes alivian los síntomas del asma, pero no tienen efecto en la inflamación subyacente. El reconocimiento en los últimos 10 años de la importancia de la inflamación en la etiología del asma ha llevado a un aumento del uso de corticosteroides, pero muchos pacientes siguen padeciendo un asma incontrolada.

Los científicos han determinado que los leucotrienos (de los cuales existen los subtipos A, B, C, D y E) desempeñan un papel crucial en el asma. Provocan espasmos en los músculos lisos de las vías aéreas, un aumento de la permeabilidad vascular, edemas, un aumento de la producción de mucosidad, una reducción del transporte mucociliar y la quimiotaxis de los leucocitos.

Al igual que los compuestos de prostaglandina relacionados, los leucotrienos son sintetizados a partir del ácido araquidónico en la membrana celular. El ácido araquidónico en los mastocitos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y basófilos se forma a partir de los fosfolípidos de la membrana mediante la activación de la fosfolipasa A2. Después de su formación, el ácido araquidónico experimenta un metabolismo a través de dos vías mayores: la vía de la ciclooxigenasa (que produce varias prostaglandinas y tromboxanos) y la vía 5-lipooxigenasa (que produce leucotrienos). Se muestra un esquema del metabolismo del ácido araquidónico en la Fig. 4. Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos se conocen colectivamente como eicosanoides.

Los antileucotrienos son elementos de una clase heterogénea de agentes antiasmáticos con la posibilidad de interferir en los pasos iniciales de la cascada inflamatoria. Los leucotrienos son sustancias inflamatorias relacionadas con las prostaglandinas; ambas se generan a partir del ácido araquidónico en las membranas celulares. Después de que se forme el ácido araquidónico en los mastocitos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y basófilos, es metabolizado a través de dos importantes vías: (1) una vía de la ciclooxigenasa (que produce prostaglandinas y tromboxanos) y (2) la vía 5-lipooxigenasa que produce leucotrienos en el citoplasma. Los leucotrienos son bien conocidos en medicina como sustancia de reacción lenta de anafilaxis ("SRS-A"). Los leucotrienos desempeñan un papel importante en la inflamación bronquial. Inducen la migración, la adhesión y la agregación de diversos glóbulos blancos (por ejemplo neutrófilos, eosinófilos y monocitos) en los vasos sanguíneos, aumentan la permeabilidad capilar y provocan la constricción de los músculos lisos bronquiales y de los vasos. Los resultados incluyen edema intersticial, quimiotaxis de los leucocitos, producción de mucosidad, disfunción mucociliar y broncoespasmo en los pulmones. Ciertas clases de leucotrienos, por ejemplo los leucotrienos cisteinilo (LTD_{4}), son broncoconstrictores particularmente potentes, siendo aproximadamente de 100 a 1.000 veces más activos que las histaminas. Los leucotrienos, incluidos los leucotrienos cisteinilo, son liberados de los mastocitos durante la degranulación.

Se están investigando y utilizando comercialmente diversos antileucotrienos que bloquean los receptores de leucotrienos o que impiden la síntesis de los leucotrienos bloqueando la enzima 5-lipooxigenasa. Los inhibidores de leucotrienos son de acción heterogénea: algunos bloquean la 5-lipooxigenasa directamente, otros inhiben la proteína que activa la 5-lipooxigenasa y algunos desplazan el araquidonato de su sitio de unión a la proteína. Los antagonistas de los leucotrienos, por el contrario, bloquean los receptores mismos que son mediadores en la hiperactividad, la broncoconstricción y la hipersecreción de las vías aéreas.

Los mastocitos de pulmón humano producen el factor de necrosis tumoral (TNF), IL-4 e IL-5 después del estímulo de IgE in vitro (Chest 1997; 112:523-29). El análisis inmunohistoquímico en especímenes de biopsia endobronquial ha confirmado esto, además de la producción de IL-6. Además, los recuentos de mastocitos y el TNF son estadísticamente más significativos en los asmáticos en comparación con sujetos normales. El TNF e IL-4 pueden potenciar la sobrerregulación de la expresión de la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) -molécula de adhesión de la superfamilia de las inmunoglobulinas- en la capa endotelial de la vasculatura bronquial. Los eosinófilos, basófilos y células mononucleares muestran la integrina antígeno 4 de activación muy tardía (VLA-4) en sus superficies celulares, que interactúa con la VCAM-1. Así, a través de la interacción VLA-4/VCAM-1, TNF e IL-4 facilitan el reclutamiento de leucocitos circulantes. La capacidad de los mastocitos para liberar las citocinas preformadas (TNF) ante el estímulo mediado por IgE o para sintetizar rápidamente otras (IL-4, IL-5) podría ser el evento inicial que lleva a la inflamación bronquial. De hecho, la inducción y la activación de los clones TH2, a través de otra producción de citocinas, facilita la activación y el reclutamiento de los eosinófilos, que actúan como efectores terminales de la reacción inflamatoria. A su vez, las citocinas producidas por los leucocitos (células TH2, en particular) afectan profundamente al desarrollo, la activación y el cebado de los mastocitos mucosales, favoreciendo así un bucle proinflamatorio positivo. Los descubrimientos recientes de que los mastocitos humanos producen IL-8 y de que los mastocitos pulmonares murinos expresan tanto las quimiocinas, proteína-1 quimioatractiva de monocitos como la proteína 1 inflamatoria de macrófagos. Esto sugiere que, aparte de las citocinas clásicamente implicadas en el reclutamiento de leucocitos (IL-4, IL-5, TNF), los mastocitos generan también factores quimioatractivos adicionales potentes en las vías aéreas, actuando en los eosinófilos y leucocitos polimorfonucleares (IL-8). Además, debido a que las quimiocinas que actúan como factores liberadores de histamina provocan la degranulación de mastocitos, pueden soportar además un bucle de activación autocrino.

Los mastocitos también desempeñan un papel clave en el crecimiento de células-B (como los basófilos) para proporcionar el contacto celular necesario, junto con IL-4, para la síntesis de IgE in vitro, lo que sugiere que los mastocitos pueden regular directamente la producción de IgE independientemente de las células-T, y pueden, con la reticulación de IgE, generar una cantidad suficiente de IL-4 para iniciar una respuesta local de TH2, considerándose que el subconjunto de células-T desempeña un papel central en el asma atópica. Además, los mastocitos pueden actuar también como células presentadoras de antígenos para los linfocitos-T, lo que sugiere un papel aun más importante para los mastocitos en la red inmune del asma.

Se ha informado de la inhibición de la degranulación de mastocitos por N-formil-metionil-leucil-fenilalanina en Inflammation, Vol. 5, Nº 1, pp. 13-17. Allí se indica que dos péptidos quimiotácticos estructuralmente diferentes, a saber pepstatina y N-formil-metionil-leucil-fenilalanina, inhiben el aumento de la permeabilidad vascular producido por una inyección intradérmica 40/80 de suero anti-IgE de rata o el factor de permeabilidad aniónica macromolecular aislado del tejido pulmonar en crías de rata. Se ha indicado también que parece que estos péptidos actúan directamente sobre los mastocitos.

Además, el informe revisado de Casale, T.B. y col. en Annals of Allergy, Vol. 51, Nº 1, pp. 2-6, ofrece un resumen de los trabajos que investigan el papel de los mediadores de los mastocitos en la patogénesis del asma alérgica.

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Kermode, J.C. y col., en Journal of Leucocyte Biology, Vol. 43, pp. 420-428 (1988) y en Biochemistry Journal, Vol. 276, pp. 715-723 (1991) publicaron un estudio de unión in vitro de pequeños péptidos formilo a los receptores en neutrófilos en conejos. El primer estudio indicó que f-Met-Leu-Phe-Phe se une rápidamente y de forma saturable a los mismos receptores de los neutrófilos como f-Met-Leu-Phe y f-Nle-Leu-Phe. En el segundo estudio, se descubrió que mientras la mayoría de los péptidos formilo quimiotácticos se unen a su receptor de neutrófilos de una manera heterogénea, aquellos con mayor potencia muestran un modelo de unión homogéneo.

Anderson, R.P. y col., en Digestive Diseases and Sciences, Vol. 37, No. 2, pp. 248-256 (1992), publicaron un estudio sobre la actividad de la estructura in vivo con referencia a la excreción hepatobiliar de pequeños péptidos. Se descubrió que los péptidos no acilados sólo muestran poca excreción en comparación con los péptidos N-acilo.

Además, Ferry, D.M. y col., en Gastroenterology, Vol. 97, pp. 61-67 (1989) publicaron un estudio in vivo referente a pequeños péptidos con respecto a la barrera de la mucosa intestinal. En esta publicación se investigó la absorción intestinal y la circulación enterohepática de f-Met-Leu-^{125}I-Tyr, análogo sintético de f-Met-Leu-Phe.

Debido a la importancia de tratar las enfermedades inflamatorias en seres humanos, particularmente, por ejemplo, el asma, artritis y la anafilaxis, se buscan continuamente nuevos compuestos bioactivos que tengan menos efectos secundarios. La inhibición de la degranulación de mastocitos mediante la intervención de los nuevos péptidos de la presente invención en el contexto del proceso inflamatorio del asma se describe visualmente en la Fig. 4.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevas composiciones farmacéuticas que contienen, en un soporte farmacológico adecuado, un péptido N-formil-metionil-leucil ("f-Met-Leu") con actividad inhibidora de la degranulación de mastocitos. Estos péptidos particularmente útiles son aquellos de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr. Estos péptidos son útiles para el tratamiento de la inflamación y, en particular, para el tratamiento de la inflamación relacionada con el asma, la artritis y la anafilaxis. Estos péptidos son también útiles para tratar la enfermedad de obstrucción pulmonar crónica y la enfermedad inflamatoria crónica del intestino.

De acuerdo con la presente invención, un método para tratar la inflamación en un mamífero comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz antiinflamatoria de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr. Para tratar la inflamación relacionada con el asma, un modo preferente de administración es por inhalación. Para tratar la inflamación relacionada con la artritis, un modo preferente de administración es la aplicación tópica o la inyección intradérmica, utilizando un soporte farmacológico adecuado.

La presente invención también proporciona un método para inhibir la degranulación de mastocitos. El método comprende la puesta en contacto de los mastocitos con una cantidad inhibidora de la degranulación del péptido con fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

Además, la presente invención proporciona asimismo un método para la inhibición de la liberación de citocinas, histaminas y leucotrienos. El método para inhibir la liberación de citocinas comprende la administración al paciente de una cantidad inhibidora eficaz de la liberación de citocinas de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr. El método para inhibir la liberación de histaminas comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz inhibidora de la liberación de histaminas de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr. El método para inhibir la liberación de leucotrienos comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz inhibidora de la liberación de leucotrienos de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

De acuerdo con otra realización, la invención proporciona un método para reducir la adhesión, la migración y la agregación de los linfocitos, eosinófilos y neutrófilos a un sitio de inflamación en un paciente. El método comprende la administración al paciente de una cantidad inhibidora terapéuticamente eficaz de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

Igualmente, la invención proporciona un método para reducir la producción de anticuerpos IgE y la reducción o bloqueo de la reticulación de IgE en el sitio de inflamación en un paciente. El método comprende la administración al paciente de una cantidad inhibidora eficaz de la producción de anticuerpos IgE de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

Además, la presente invención proporciona un método para inhibir el aumento de la permeabilidad vascular en el sitio de inflamación en un paciente. El método comprende la administración al paciente de una cantidad inhibidora eficaz de la permeabilidad vascular de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

En ciertas realizaciones preferentes de la presente invención, los pacientes con inflamación crónica pueden beneficiarse de la administración del péptido de la presente invención en combinación con otro ingrediente activo. Otros ingredientes activos particularmente útiles para esta combinación de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, antileucotrienos, beta_{2}-agonistas, corticosteroides y similares.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: curva logarítmica dosis-respuesta que ilustra la zona de permeabilidad capilar para diversas concentraciones del Compuesto 48/80.

Fig. 2: curva dosis-respuesta para la inhibición de la permeabilidad capilar por diversas concentraciones de f-Met-Leu-Phe.

Fig. 3: curva dosis-respuesta para la inhibición de la permeabilidad capilar por diversas concentraciones de un péptido preferente de la presente invención.

Fig. 4: esquema ilustrativo de las vías metabólicas más importantes del ácido araquidónico, ilustrando además la inhibición de la degranulación de los mastocitos.

Fig. 5A y 5B esquemas ilustrativos de los distintos protocolos Standard (5A) y Resolución (5B) utilizados en el Modelo de Asma Bronquial inducida por OVA en ratones.

Fig. 6A-6D: micrografías que ilustran la histopatología comparativa de un tratamiento con un compuesto de la presente invención que inhibe el asma inducida por OVA en ratones tratados y ratones control.

Fig. 7: histograma que muestra los resultados para el tratamiento de acuerdo con la presente invención sobre la formación de tapones de mucosidad en un modelo de asma murina.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que ciertos pequeños péptidos de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr, sorprendentemente tienen la actividad de inhibir la degranulación de mastocitos. Como consecuencia, estos péptidos inhiben la liberación de las citocinas (tales como, por ejemplo, TNF), así como de las histaminas y leucotrienos, y son útiles para el tratamiento de la inflamación que puede resultar de varias indisposiciones, tales como, por ejemplo, asma, artritis y anafilaxis. Estos péptidos son útiles también para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la enfermedad inflamatoria crónica del intestino.

De acuerdo con las realizaciones preferentes de la presente invención, los péptidos también pueden reducir la infiltración de eosinófilos, basófilos y neutrófilos en los tejidos inflamatorios. Los linfocitos, eosinófilos y neutrófilos no muestran quimiotaxis en respuesta a los péptidos preferentes de la presente invención. Además, los compuestos preferentes de la presente invención no muestran toxicidad hacia órganos vitales tales como corazón, hígado y
pulmones.

Los péptidos de esta invención se pueden preparar mediante técnicas convencionales de la química de pequeños péptidos. Los péptidos, cuando se utilizan para la administración, se preparan en condiciones asépticas con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Las dosis de las composiciones farmacéuticas varían dependiendo del sujeto y de la vía particular de administración utilizada. Las dosificaciones pueden oscilar de 0,1 a 100.000 \mug/kg al día, especialmente de 1 a 10.000 \mug/kg. Las dosificaciones especialmente preferentes oscilan entre aproximadamente 1 y 100 \mug/kg, en particular entre aproximadamente 1 y 10 \mug/kg de peso corporal. Las dosificaciones se administran típicamente una vez al día cada 4-6 horas, dependiendo de la gravedad de la condición. Para los estados agudos, es preferente administrar el péptido cada 4-6 horas. Para el mantenimiento o uso terapéutico, puede resultar preferente una administración de sólo una o dos veces al día. Preferentemente, se administran de aproximadamente 0,18 a aproximadamente 16 mg de péptido por día, dependiendo de la vía de administración y de la gravedad de la condición. Los intervalos de tiempo deseados para el suministro de múltiples dosis de una composición particular pueden ser determinados por un especialista medio en la técnica mediante una experimentación rutinaria.

La administración se realiza por vía oral, parenteral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica, por inyección directa, etc. En una realización preferente, los péptidos de esta invención se administran al paciente en una cantidad antiinflamatoria eficaz o en una dosificación que inhibe la degranulación de los mastocitos. Una composición farmacéutica típica es una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de acuerdo con la presente invención que proporciona un efecto antiinflamatorio o que inhibe la degranulación de los mastocitos, normalmente incluyendo un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" tal como se emplea aquí, y descrito de forma más completa a continuación, incluye una o más sustancias encapsulantes o diluyentes de carga sólidos o líquidos compatibles adecuados para la administración a un humano o animal. En la presente invención, el término "vehículo" indica por tanto un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual se combinan las moléculas de la invención para facilitar su aplicación. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es aquella cantidad de las presentes composiciones farmacéuticas que produce un resultado deseado o que ejerce una influencia deseada sobre la condición particular que se esté tratando. Se pueden utilizar diversas concentraciones para preparar las composiciones que incorporen el mismo ingrediente con el fin de prever la posibilidad de variaciones en la edad del paciente a tratar, la gravedad de su estado, la duración del tratamiento y el modo de administración.

El vehículo también debe ser compatible. El término "compatible" tal como se emplea aquí significa que los componentes de las composiciones farmacéuticas pueden mezclarse con los pequeños péptidos de la presente invención y entre sí de un modo tal que no se perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Los pequeños péptidos de la invención se utilizan típicamente en sí mismos (solos). Sin embargo, se pueden administrar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Estas sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluensulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico y bencenosulfónico. Asimismo, se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales sódicas, potásicas o cálcicas del grupo ácido carboxílico. Así, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para uso médico que comprenden los péptidos de la invención junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables de los mismos y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico.

Las composiciones incluyen aquellas para la administración oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica o parenteral, pudiendo utilizarse todas ellas como vías de administración utilizando los materiales de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos de la presente invención contienen también uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, que pueden incluir excipientes tales como estabilizantes (para favorecer el almacenamiento a largo plazo), emulsionantes, agentes de unión, agentes espesantes, sales, conservantes, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares. La utilización de estos medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas es bien conocida en la técnica. Excepto en la medida en que algún medio o agente convencional sea incompatible con el péptido de esta invención, se contempla aquí su uso en preparaciones farmacéuticas. Se pueden incorporar también ingredientes activos adicionales en las composiciones de la presente invención.

Para el tratamiento del asma son preferentes aquellas composiciones adecuadas para la administración oral. Típicamente, estas composiciones se preparan como aerosol de inhalación, vahos, jarabes o tabletas. Para el tratamiento de la artritis son preferentes aquellas composiciones adecuadas para la administración tópica, aunque pueden resultar adecuadas composiciones orales. Típicamente, estas composiciones tópicas se preparan como cremas, ungüentos o soluciones.

Las composiciones se pueden presentar apropiadamente en forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas por medio de cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Los métodos incluyen típicamente el paso de poner los ingredientes activos de la invención en relación con un vehículo, el cual constituye uno o más ingredientes adicionales.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración por inhalación pueden presentarse, por ejemplo, como aerosoles o soluciones para inhalación. Un ejemplo de una típica composición en aerosol consiste en la cantidad deseada del péptido microcristalino suspendido en una mezcla de tricloromonofluorometano y diclorodifluorometano más ácido oleico. Un ejemplo de solución típica se compone de la cantidad deseada del péptido disuelto o suspendido en una solución salina estéril (opcionalmente un 5% en volumen/volumen aproximadamente de dimetilsulfóxido ("DMSO") para la solubilidad), cloruro de benzalconio y ácido sulfúrico (para ajustar el pH).

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral se pueden presentar también como unidades individuales, tales como cápsulas, pastillas, tabletas o grageas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del péptido de la invención, o que puedan estar contenidas en liposomas o como suspensión en un licor acuoso o en un líquido acuoso tal como un jarabe, un elixir o una emulsión. Un ejemplo de formulación base en forma de tableta incluye almidón de maíz, lactosa y estearato de magnesio como ingredientes inactivos. Un ejemplo de formulación base en forma de jarabe incluye ácido cítrico, tinte colorante, agente aromatizante, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarina, benzoato de sodio, citrato de sodio y agua purificada.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden apropiadamente una preparación acuosa estéril de la molécula de la invención que preferentemente es isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa se puede formular de acuerdo con métodos conocidos utilizando aquellos agentes dispersantes o humectantes adecuados, así como agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear, se encuentran agua, solución Ringer y una solución isotónica de cloruro sódico. En las soluciones acuosas se puede utilizar hasta aproximadamente un 10% en volumen/volumen de DMSO o Trappsol para mantener la solubilidad de ciertos péptidos. Asimismo, se pueden emplear convencionalmente aceites estériles no volátiles como disolventes o medios de suspensión. Con este propósito, se puede emplear una cantidad de aceites no volátiles, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar ácidos grasos (tales como ácido oleico o ácidos grasos neutros) en la preparación de inyectables. Además, los copolímeros Pluronic en bloque se pueden formular con lípidos a 4ºC para la inyección compuesta en base a un tiempo de liberación de la forma sólida a 37ºC durante un período de tiempo de semanas o meses.

Las composiciones adecuadas para la administración tópica se pueden presentar como una solución del péptido en Trappsol o DMSO, o en crema, ungüento o loción. Típicamente, se incorpora en la base o vehículo de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 2,5% de ingrediente activo. Un ejemplo de formulación base en forma de crema incluye agua purificada, petrolato, alcohol de bencilo, alcohol de estearilo, propilenglicol, miristato de isopropilo, polioxil 40 estearato, carbómero 934, lauril sulfato de sodio, acetato de disodio, hidróxido de sodio y opcionalmente DMSO. Un ejemplo de formulación base en forma de ungüento incluye petrolato blanco y opcionalmente aceite mineral, sesquioleato de sorbitano y DMSO. Un ejemplo de formulación base para lociones incluye carbómero 940, propilenglicol, polisorbato 40, estearato de propilenglicol, colesterol y esteroles asociados, miristato de isopropilo, palmitato de sorbitano, alcohol de acetilo, trietanolamina, ácido ascórbico, simeticona y agua purificada.

Modelo de Piel de Rata para la Determinación de la Inhibición de Degranulación de Mastocitos

El asma inducida por alergia resulta de la exposición a sustancias (alérgenos) a las cuales un organismo se ha vuelto hipersensible. La exposición a un alérgeno resulta en la degranulación de los mastocitos en el pulmón, liberando leucotrienos e histaminas. En respuesta a la liberación de leucotrienos e histaminas, la permeabilidad capilar aumenta sorprendentemente y el plasma sanguíneo sale de los capilares en los tejidos circundantes. Los síntomas respiratorios que derivan de este nivel de exposición son desde suaves (picazón y estornudos) a potencialmente mortales (asma), incluyendo en los casos crónicos extremos la muerte por anafilaxis.

Para demostrar este fenómeno de forma experimental, se sustituye el pulmón por piel de rata. En este modelo, el plasma sanguíneo de la rata experimental se marca con un colorante azul de tripano. Este colorante soluble es llevado en la sangre como marcador pasivo del plasma mismo y está excluido de las células vivas. En circunstancias normales, los vasos sanguíneos intactos, incluido el sistema capilar, conservan este colorante. Se inyecta en la piel un compuesto que induce la degranulación de los mastocitos (que resulta en la liberación de leucotrienos e histaminas) para simular una degranulación inducida por alérgenos. En estos experimentos se utilizó con este propósito el Compuesto 48/80. Como consecuencia de la liberación de leucotrienos e histaminas, aumenta la permeabilidad capilar, y el plasma, teñido de azul, sale de los capilares y colorea de azul la piel que rodea el lugar de inyección. La zona azulada es una medida de la cantidad del Compuesto 48/80 inyectada.

Se puede ensayar un compuesto en busca de la actividad "anti-leucotrieno" y/o "anti-histamina" mediante su mezcla con el Compuesto 48/80 antes de la inyección. Si el compuesto de prueba inhibe la liberación de leucotrienos o histaminas, se observa una zona azulada de diámetro más pequeño en comparación con un lugar de inyección en la misma rata donde se ha inyectado el Compuesto 48/80 sin ningún compuesto de prueba. En el caso de una alta actividad anti-leucotrieno y anti-histamina, el azulado puede ser realmente inhibido en su totalidad.

Ensayos

Se llevó a cabo y validó un modelo de piel de rata. Se sometieron a prueba varios péptidos a una dosis predeterminada en busca de la actividad anti-leucotrieno y/o anti-histamina. La dosis seleccionada permitió una comparación general con f-Met-Leu-Phe, que era el compuesto estándar para la comparación.

Se llevó a cabo una valoración "dosis-respuesta" de varios compuestos y se comparó con el compuesto estándar. La observación de una disminución de la permeabilidad capilar en serie en las zonas tratadas utilizando dosis en serie más pequeñas del compuesto inhibidor putativo valida la inhibición de la liberación de leucotrienos y/o histaminas observada en la prueba inicial con una dosis predeterminada.

Materiales y métodos

Se obtuvieron los reactivos de Sigma o Aldrich, con excepción de la cetamina, anestésico veterinario, que se obtuvo de varios suministradores veterinarios. Las ratas utilizadas eran machos de raza Sprague-Dawley, de 220-240 g en el momento de la compra a B&K International.

Para la reacción de la piel de rata, se anestesiaron las ratas con 0,25 ml de cetamina a 10 mg/ml. Se administró en una vena de la cola 1,0 ml de azul de tripano en solución salina (estéril filtrada) y se afeitó el lomo de la rata. Se utilizaron para la prueba y para las inyecciones control cuatro puntos de inyección intradérmica.

Se preparó el compuesto 48/80 como una solución stock de 1,5 mg/ml en solución salina. Se descubrió que este material era potencialmente inestable en la solución acuosa y se preparó nueva todos los días. Se prepararon diluciones seriales en la solución salina hasta los niveles de aplicación justo antes de la inyección de cada rata.

Se prepararon los péptidos como una solución stock 23 mM en DMSO y se almacenaron a -20ºC entre experimentos. En el momento de su uso, se descongelaron las soluciones stock congeladas y se añadieron partes alícuotas apropiadas a las diluciones del Compuesto 48/80, junto con cantidades adecuadas de DMSO, para que resultara en una proporción de 5 \mul de DMSO con respecto a 0,1 ml de Compuesto 48/80 acuoso. Esto resultó en una solución al 5% de DMSO, necesaria para mantener la solubilidad de ciertos péptidos. Los experimentos de control demostraron que el efecto del DMSO al 5% era nulo.

Para las inyecciones, 0,1 ml del Compuesto 48/80, +/- los compuestos de prueba se inyectaron intradérmicamente en ratas anestesiadas, teñidas y afeitadas. Después de 15 minutos de incubación, se sacrificaron las ratas por dislocación cervical, se extrajo la piel dorsal y se colocó en una caja de iluminación. Se digitalizó una imagen de la piel retroiluminada utilizando una vídeo cámara de captura CCD y un hardware/software compatible. Se analizó la imagen digitalizada utilizando un paquete de software para análisis científico de gráficos, se integraron las zonas de permeabilidad capilar (azuladas) y se obtuvieron los valores digitales para otro análisis.

Se generó una curva dosis-respuesta utilizando el Compuesto 48/80 a varias dosis desde aprox. 0,01 \mug hasta aprox. 15 \mug. Se muestran los resultados en la Fig. 1. Se observó una amplia variabilidad en el diámetro de las zonas de permeabilidad capilar para cada dosis del Compuesto 48/80 basada en variaciones de una rata a otra (por ejemplo el espesor de la piel). Se seleccionó una dosis de 0,15 \mug del Compuesto 48/80 para realizar otras pruebas.

Ejemplo 1

Se preparó una curva dosis-respuesta para el compuesto estándar, f-Met-Leu-Phe, utilizando la dosis seleccionada de 0,15 \mug del Compuesto 48/80. Se sometieron a prueba dosis de 0 a aproximadamente 230 nM de f-Met-Leu-Phe y se muestran los resultados en la Fig. 2. Se mostró claramente la inhibición de la degranulación inducida por el Compuesto 48/80.

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Ejemplos 2-11

Se sometieron a prueba varios péptidos f-Met-Leu en busca de la inhibición de la degranulación inducida en el modelo de piel de rata mediante la utilización de 100 nanomoles del péptido de prueba y una dosis de 0,15 \mug del Compuesto 48/80. Se incluyó en cada rata, para cada experimento, una dosis control 48/80 con cero péptidos, y el % de inhibición se expresó en términos relativos con respecto a este control (0% de inhibición). Se determinó también el porcentaje de degranulación de mastocitos producida por 48/80. Los resultados se exponen en la tabla siguiente.

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TABLA 1

1

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Ejemplo 12

Se preparó una curva dosis-respuesta para f-Met-Leu-Phe-Phe utilizando la dosis seleccionada de 0,15 \mug del Compuesto 48/80. Se sometieron a prueba dosis de 0 a aproximadamente 230 nM de f-Met-Leu-Phe-Phe y se muestran los resultados en la Fig. 3. Sorprendentemente, se mostró claramente la inhibición notable de la degranulación inducida por el Compuesto 48/80. La inhibición de la degranulación inducida para f-Met-Leu-Phe-Phe era inesperada y sustancialmente mejor que la del compuesto estándar f-Met-Leu-Phe.

Modelo de Ratón con Asma Bronquial inducida por OVA para la Inhibición de la Degranulación de Mastocitos

El asma es una enfermedad compleja que se caracteriza por la exacerbación espontánea de la obstrucción de las vías aéreas y una hiperrespuesta bronquial persistente. La infiltración crónica con T-linfocitos activados, eosinófilos y macrófagos/monocitos de la submucosa de las vías aéreas es otra característica establecida. Los mecanismos inflamatorios, con expresión de las citocinas, así como la liberación de mediadores inflamatorios, sirven de base a la patogénesis de la broncoconstricción y la hiperrespuesta bronquial. Sin embargo, gran parte del mecanismo patogénico sigue sin estar claros, por ejemplo, los mecanismos que inducen la persistencia de los síntomas y la inflamación crónica, así como las intervenciones necesarias para controlar y prevenir la enfermedad.

Se ha reconocido durante mucho tiempo que una sola exposición a un alérgeno inhalado puede provocar un aumento agudo de la capacidad de respuesta de la vía aérea en algunos individuos y modelos animales. Sin embargo, repetidas inhalaciones de alérgenos han demostrado incrementos más pronunciados, consistentes y prolongados en la capacidad de respuesta de las vías aéreas. Este modelo de ratón de inhalaciones repetidas de alérgenos durante mucho tiempo ha sido utilizado para estudiar el efecto a largo plazo de las enfermedades alérgicas en el pulmón y para describir las células, mecanismos, moléculas y mediadores implicados en la inducción de la hiperrespuesta de las vías aéreas del pulmón en humanos.

Materiales y Métodos

Reactivos: Se obtuvo OVA cristalina de Pierce Chem. Co. (Rockford, IL), sulfato de aluminio y potasio (alumbre) de Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO), agua destilada libre de pirógenos de Baxter, Healthcare Corporation (Deerfield, IL), cloruro sódico al 0,9% (solución salina normal) de Lymphomed (Deerfield, IL) y Trappsol^{TM} HPB-L100 (hidroxipropil-beta-ciclodextrina acuosa; solución acuosa al 45% en peso/volumen) de Cyclodextrin Technologies Development, Inc. (Gainesville, FLA). Se mezcló la OVA (500 \mug/ml en solución salina normal) con volúmenes iguales de alumbre al 10% (peso/volumen) en agua destilada. La mezcla (pH 6,5 utilizando NaOH 10N), después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, se sometió a centrifugación a 750 g durante 5 minutos; el gránulo se resuspendió hasta el volumen original en agua destilada y se utilizó en una hora.

El inhibidor selectivo de la 5-lipoxigenasa, Zileuton (N-[1-benzo[b]tien-2-iletil]-N-hidroxiurea; J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991; 256: 929-937), fue amablemente proporcionado por los doctores Bell y George W. Carter (Abbott Laboratories, Abbott Part, IL). Se disolvió el Zileuton en Trappsol^{TM}, Histatek Inc. (Seattle, WA) suministró el inhibidor de degranulación de mastocitos, f-Met-Leu-Phe-Phe ("HK-X").

Se alojaron ratones hembra BALB/c juntos (6-8 semanas de edad a la compra; D and K, Seattle WA) bajo condiciones convencionales para los estudios.

Protocolos de Inmunización/Exposición a Alérgenos: Los ratones recibieron una inyección i.p. de 0,2 ml (100 \mug) de OVA con alumbre según los distintos protocolos de Standard (Fig. 5A) y Resolución (Fig. 5B) (J. Exp. Med. 1996; 184: 1483-1494). De acuerdo con los distintos protocolos, se anestesiaron los ratones con 0,2 ml i.p. de cetamina (0,44 mg/ml)/xilazina (6,3 mg/ml) en solución salina normal antes de recibir una dosis intranasal (i.n.) de 100 \mug de OVA en 0,05 ml de solución salina normal y una dosis i.n. de 50 \mug de OVA en 0,05 ml de solución salina normal separadamente en distintos días. Se utilizaron dos grupos de control. En consecuencia, el primer grupo recibió la solución salina normal con alumbre i.p. y la solución salina normal sin alumbre i.n.; el segundo grupo recibió OVA con alumbre i.p., OVA sin alumbre i.n. y la solución salina normal sola.

Histología

La tráquea y el pulmón izquierdo (se utiliza el pulmón derecho para el lavado broncoalveolar ("BAL")) se obtuvieron y fijaron en una solución de formaldehído neutro al 10%, a temperatura ambiente, durante 6-15 horas. Después de su introducción en parafina, se cortaron los tejidos en secciones de 5 \mum y se procesaron luego con las distintas tinciones o inmunomarcajes. Se empleó la coloración de Discombe de eosinófilos para el recuento del número de células con la contracoloración azul de metileno. El número de eosinófilos por unidad de área de las vías aéreas (2.200 \mum^{2}) se determinó por morfometría (J. Pathol. 1992; 166: 395-404; Am. Rev. Respir. Dis. 1993; 147: 448-456). La fibrosis fue identificada con la tinción tricrómica de Masson. La mucosidad de las vías aéreas se identificó por el siguiente método de tinción: azul de metileno, hematoxilina y eosina, mucicarmina, azul alciano, y reacción de azul alciano/ácido peryódico-Schiff (PAS) (Troyer, H., "Carbohydrates" in Principles and Techniques of Histochemistry, Little, Brown and Company, Boston, MA, 1980: 89-121; Sheehan, D.C., y col., "Carbohydrates" in Theory and Practice of Histotechnology, Battle Press, Columbus, OH, 1980: 159-179). Se tiñó la mucina con una solución de mucicarmina; se empleó la contracoloración amarillo de metanilo. La mucina ácida y las mucosustancias sulfatadas se colorearon con azul alciano, pH 2,5; se utilizó la contracoloración rojo nuclear rápido. Las mucosustancias neutras y ácidas se identificaron con azul alciano, pH 2,5 y reacción de PAS. El grado de taponamiento por mucosidades de las vías aéreas (0,5-0,8 mm de diámetro) fue evaluado también por morfometría. El porcentaje de oclusión del diámetro de las vías aéreas por la mucosidad se clasificó en una escala semicuantitativa de 0 a 4+ tal como se describe en las Leyendas de las Figuras. Los análisis histológicos y morfométricos fueron realizados por individuos ciegos al diseño de los protocolos.

Pruebas de la Función Pulmonar

Al día 28, 24 horas después de la última administración i.n. de la solución salina u OVA, se determinó in vivo la mecánica pulmonar con respecto a la infusión intravenosa de metacolina en ratones mediante un método pletismográfico modificado a partir del descrito previamente (10, 1958; 192: 364-368; J. Appl. Physiol. 1988; 64: 2318-2323; J. Exp. Med. 1996; 184: 1483-1494). A la finalización de las pruebas de la función pulmonar, cada ratón fue exanguinado por punción cardiaca y se obtuvo tejido pulmonar con tráquea para otros análisis.

Lavado Broncoalveolar

Después de desconectar el pulmón izquierdo en el bronquio principal, se lavó el pulmón derecho tres veces con 0,4 ml de una solución salina normal. Las células broncoalveolares del fluido de lavado (BAL) a partir de una parte alícuota de 0,05 ml de la muestra conjunta se contaron con un hemocitómetro y el fluido restante se centrifugó a 4ºC durante 10 minutos a 200 g. Se almacenó el sobrenadante a -70ºC hasta que se realizara el análisis de eicosanoides. Después de la resuspensión del gránulo celular en una solución salina normal que contenía seroalbúmina bovina al 10% ("BSA"), se realizaron frotis celulares del BAL en placas de vidrio. Para teñir los eosinófilos, se colorearon las placas secas con el fluido de dilución de Discombe (eosina acuosa al 0,05% y acetona al 5% (volumen/volumen) en agua destilada; J. Exp. Med. 1970; 131: 1271-1287) durante 5-8 minutos, se aclararon con agua durante 0,5 minutos y se contracolorearon con azul de metileno al 0,07% durante 2 minutos.

Ensayo de Glicoproteínas de la Mucosidad de las Vías Aéreas

Las glicoproteínas de la mucosidad en el fluido BAL se sometieron a ensayo mediante Slot Blotting y tinción PAS (Anal. Biochem. 1989; 182: 160-164; Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995; 12: 296-306). Se humedecieron membranas de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,2 \mum; Schleicher & Schuell, Keene, NH) en agua destilada y después en una solución salina normal antes de colocarlas en un equipo slot blot de 72 pocillos Manifold II (Schleicher & Schuell). Muestras del fluido BAL (0,05 ml) y partes alícuotas (0,05-0,751) de una solución stock (2 \mum/ml) de glicoproteína de mucina respiratoria humana (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991; 5: 71-79) se secaron sobre las membranas de nitrocelulosa a vacío por succión de agua y se visualizaron las glicoproteínas de la mucosidad por reacción PAS. Se realizó una densitometría de reflectancia para cuantificar la tinción de PAS. Se analizaron entonces las imágenes mediante un sistema de procesamiento de imágenes descrito más adelante. La intensidad integrada de la reactividad de PAS de las muestras de BAL fue cuantificada mediante la comparación con la curva estándar para la mucina respiratoria humana.

Inmunocitoquímica

Anticuerpo monoclonal: se utilizaron CD11c (método DAB) y Mac1 (Beringer Mannheim, método ABC con Kit Hitomouse, Zymed) para identificar los tipos de células inflamatorias, por ejemplo células dendríticas, macrófagos y linfocitos en/alrededor de zonas de vasculatura, vías aéreas y fibrosis.

Morfometría y Análisis de Imágenes

Todas las imágenes fueron capturadas y digitalizadas mediante un Escáner ScanJetIICX con software HP DeskScan II (Microsoft® Versión Windows^{TM}) (Hewlett Packard, Palo Alto, CA). Este sistema se conectó a un ordenador Dell Dimension XPS P90 (Dell Corporation, Austin, TX) que emplea el software Image-Pro® Plus, versión 1.1 para Windows^{TM} (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Las imágenes se evaluaron en una escala de 256 niveles de grises utilizando un monitor Dell Ultrascan 17ES en modo de gráfico de resolución extra alta (1.280 x 1.024 píxeles, 78,9-kHz de frecuencia de escaneo horizontal, 72 Hz de frecuencia de escaneo vertical).

Estudios del Inhibidor de Leucotrienos

Para evaluar el papel de los productos 5-lipoxigenasa en la inflamación de las vías aéreas, se administró i.p. el inhibidor de 5-lipoxigenasa Zileuton, (35 mg/kg) 30 minutos antes de cada exposición i.n. en los días según la Fig. 5. En un grupo de animales se administró también el Zileuton antes de la OVA i.p. El Zileuton a 35 mg/kg inhibe la liberación de los leucotrienos cisteinilo en un -95% en ratas pasivamente sensibilizadas con el antígeno BSA administrado i.p. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991; 256: 929-937).

Compuesto HK-X de la Invención

Se administró el Compuesto HK-X a 5 mg/kg y 10 mg/kg utilizando el mismo procedimiento que el descrito anteriormente.

Análisis Estadísticos

Se evaluaron los datos sobre la función pulmonar mediante análisis de variancia (ANOVA) utilizando el método de diferencia mínima significativa protegida (Statview II, Abacus Concepts, Berkeley, CA). Este método utiliza una estadística múltiple t para evaluar todas las comparaciones posibles por pares y es aplicable tanto a tamaños de pares iguales como desiguales. Los demás datos se indican como promedio \pm SE de los experimentos combinados. Se analizaron las diferencias en busca de la significancia (P < 0,05) mediante wel ensayo t de Student de dos colas para medios independientes.

1. Eosinófilos (Tablas 2A-2B)

El número de eosinófilos de la vía aérea en los ratones tratado con OVA del grupo de 1, 2 y 3 meses se redujo notablemente del 44,83% al 37,40% y 19,15% respectivamente (P < 0,025). Aun así, el conteo de eosinófilos es mucho más alto en el grupo tratado con OVA que en los otros dos grupos en un mismo lapso de tiempo (P < 0,025). El Zileuton ha podido reducir los eosinófilos en general en 1-3 meses. Sin embargo, el compuesto HK-X de la presente invención redujo los eosinófilos comparativamente al mes, pero de forma mucho más provechosa a los dos y tres meses.

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TABLA 2A Influjo de Eosinófilos en las Vías Aéreas

2

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TABLA 2B Porcentaje de Eosinófilos en el Tejido de las Vías Aéreas

3

2. Otras células inflamatorias

Otras células inflamatorias indican una respuesta inflamatoria no-específica después de la introducción en la vía aérea de una proteína extraña. Se reclutaron linfocitos en las vías aéreas pero que estaban virtualmente ausentes en los grupos de control. Se reclutaron neutrófilos después de la exposición a OVA en ratones sham-boot sensibilizados y sensibilizados con OVA, aunque se presentaron mayores números en las vías aéreas del grupo sensibilizado con OVA. Se observaron ocasionalmente células gigantes multinucleadas peculiares (macrófagos fusionados) con núcleos en semiluna alrededor de la periferia de su citoplasma extensivo. Tanto las células gigantes de Langhans como los leucocitos o glóbulos se observaron solamente en animales sensibilizados y expuestos a OVA. Normalmente estaban presentes en el tejido conectivo asociado a vías aéreas más grandes. Se observaron ocasionalmente células plasmáticas en la proximidad de las vías aéreas y en tejidos linfoides locales.

3. Taponamiento de las Vías Aéreas (Tabla 3)

Mucina: No existía diferencia alguna entre los tres grupos con el mismo tratamiento, sino un lapso de tiempo diferente (P > 0,05). El grupo tratado con OVA tenía un importancia mayor que el de los grupos tratados con la solución salina, Zileuton (P < 0,05) y el Compuesto HK-X.

TABLA 3 Importancia del Tapón de Mucosidad en las Vías Aéreas

4

El asma es una condición inflamatoria crónica de las vías aéreas. En los humanos, una vez establecida, la hiperrespuesta de la vía aérea puede permanecer estable durante años. Persiste aparentemente en ausencia de inhalación de alérgenos, inflamación detectable de las vías aéreas o descamación epitelial. Por tanto, puede convertirse en permanente debido a alteraciones irreversibles (o al menos lentamente reversibles) en la ultraestructura de las vías
aéreas.

En los asmáticos leves, estos episodios o "ataques" son relativamente poco frecuentes y bien tratados (invertidos) con broncodilatadores inocuos. La intensidad de una inflamación subyacente, característica y crónica de las vías aéreas está asociada, y aparentemente vinculada, a ataques más frecuentes, intensos y prolongados, que son menos reversibles por los broncodilatadores. Las razones de ello se han ido aclarando en los últimos años. La inflamación, que se compone principalmente de un infiltrado activado o iniciado de los linfocitos Th2, eosinófilos, mastocitos y posiblemente plaquetas, provocan una dilatación de los espacios perivasculares (intersticiales) y la liberación de los factores mediadores/de crecimiento, lo que origina el espesamiento de la membrana basal, daño epitelial y propagación, producción de mucosidad viscosa e hiperplasia, iniciando igualmente la constricción parcial del músculo liso de las vías aéreas. Todas estas consecuencias aluden a un aumento de la capacidad de respuesta de las vías aéreas, lo que baja el umbral de respuesta a los estímulos ambientales, provocando así que los ataques sean más frecuentes y fuertes.

Todos los cambios morfológicos anteriores afectarán directa y fuertemente a las funciones pulmonares. En experimentos basados en el modelo de ratón asmático grave y el modelo de ratón asmático de larga duración se han observado que los cambios patofisiológicos significativos de las funciones pulmonares soportan los cambios morfológicos anteriores. Se descubrió que la inhalación de alérgenos aumenta la expresión de los eosinófilos y mastocitos en el endotelio y epitelio alveolar y de las vías aéreas, e induce asimismo la expresión de la selección E solamente en el endotelio de las vías aéreas, y tanto la infiltración como el aumento de eosinófilos en la capacidad de respuesta de las vías aéreas, y los demás tipos de células inflamatorias (leucocitos o glóbulos y células gigantes multinucleadas (macrófagos fusionados) del tipo Langhans), lo que indica una reacción inflamatoria no específica dentro de los pulmones asmáticos.

El Compuesto HK-X inhibe la acumulación de mucosidad en la vía aérea de los ratones tratados con OVA (OVA) y de control. La distribución de la oclusión por mucosidad de las vías aéreas se determinó en ratones sham-sensibilizados y expuestos a solución salina (solución salina, n=4) y ratones sensibilizados/expuestos a OVA en ausencia (OVA, n=4) o presencia (HK-X/OVA, n=8) de tratamiento con HK-X. La oclusión por mucosidad del diámetro de las vías aéreas se sometió a ensayo morfométrico como sigue: 0, ninguna mucosidad; +, \sim10% de oclusión; ++, 30% de oclusión; +++,
-60% de oclusión; ++++, -80% de oclusión. Se evaluaron morfométricamente 10 vías aéreas distribuidas aleatoriamente por los pulmones de cada ratón en busca de oclusión por mucosidad.

Las Fig. 6A-6D proporcionan la evidencia histológica visual de la capacidad del Compuesto HK-X para inhibir la degranulación de los mastocitos en ratas inducidas de asma utilizando OVA y, con ello, el efecto del tratamiento del asma con el Compuesto HK-X. La Fig. 6A muestra abundante mucosidad segregada en el lumen de la vía aérea (AW) de los ratones sensibilizados/expuestos a OVA. La Fig. 6B muestra la infiltración masiva del tejido intersticial por los eosinófilos y otras células inflamatorias (indicadas por flechas). La Fig. 6C muestra que la liberación de mucosidad de la vía aérea en el lumen de la vía aérea (AW) se reduce notablemente cuando se administra el compuesto inhibidor HK-X antes de la OVA vía i.n. La infiltración del tejido intersticial por los eosinófilos se reduce también después del tratamiento con el Compuesto HK-X comparado con la exposición a OVA sola (comparar la Fig. 6C con las Fig. 6A y 6B). La Fig. 6D muestra que la vía aérea (AW) está libre de mucosidad y de células en los ratones control tratados con la solución salina. El epitelio bronquial se infiltra con células de tejido conectivo, pero no se encuentran leucocitos en el espacio intersticial peribronquial.

Los macrófagos de las vías aéreas mostraron señales de una gran activación que se parecían a las indicadas en los macrófagos recuperados en el fluido BAL procedentes de pulmones de asmáticos expuestos a alérgenos (Am. Rev. Respir. Dis. 1987; 135: 433-440). Los macrófagos y células dendríticas funcionan como las células que presentan antígenos en el pulmón y pueden llevar, directa o indirectamente, a la secreción de citocinas capaces de iniciar cambios fenotípicos en el epitelio de la vía aérea y sus lugares periféricos. El estímulo de la inflamación crónica de la vía aérea puede provocar directamente la proliferación de epitelio y fibroblastos de la vía aérea, y el depósito subsiguiente de colágeno alrededor de estas zonas. Los macrófagos y células dendríticas activados siguen siendo altos en la zona en comparación con las demás células inflamatorias durante las exposiciones de la última etapa.

El epitelio de la vía aérea se espesó debido en gran parte a una hiperplasia marcada de las células caliciformes, particularmente en las vías aéreas más grandes, pero también en los bronquiolos pequeños e incluso terminales. La proporción de células caliciformes con respecto a las células normales columnares ciliadas aumentó mucho en comparación con los grupos control. Aunque las vías aéreas de control (tanto pequeñas como grandes) tenían sólo células caliciformes ocasionales, la sección procedente de los pulmones expuestos a OVA mostró que el 100% de las grandes vías aéreas y parte de las pequeñas vías aéreas contenían células caliciformes hasta un 88% de las células epiteliales totales de las vías aéreas. En los pulmones que no habían sido sometidos a lavado, se pudo observar mucosidad dentro de la célula caliciforme y en algunas vías aéreas, ocasionalmente obstruyendo completamente el lumen. El residuo celular se enredó en estos tapones de mucosidad. No se observó hiperplasia de las células caliciformes en los grupos control y, por tanto, no podría haberse visto debido a un efecto "no alérgico" de la OVA, o a la técnica de dosificación intratraqueal. Algunas de las células caliciformes en las pequeñas vías aéreas están exentas de esta característica, indicando quizás que la distribución de OVA dentro del árbol respiratorio no había sido uniforme.

La Fig. 7 es un histograma de los resultados referidos al tratamiento con el Compuesto HK-X a unas dosis de 5 \mug/kg y 10 \mug/kg en cuanto a la formación de tapones de mucosidad en este modelo de asma murino. Ambas dosis reducen notablemente la producción de mucosidad en las pequeñas vías aéreas.

Modelo de Ratón con Artritis Inducida por Colágeno de Tipo II

Se utiliza un modelo de ratón para evaluar el efecto de los compuestos de la presente invención sobre la aparición histológica, radiográfica y clínica de una artritis inducida por colágeno de tipo II.

Las enfermedades autoinmunes provocan una morbilidad e incapacidad crónicas y significativas. La artritis en sus numerosas formas es representativa de una familia de enfermedades autoinmunes. En el terreno clínico, la artritis reumatoide (RA) es la forma más común de la enfermedad artrodisplástica severa. Todos los médicos reconocen que la RA es una enfermedad progresiva.

La histopatología de las lesiones artríticas que ocurren en CIA murina comparten enormes similitudes con la de RA en pacientes humanos. Por tanto, la CIA murina es un modelo aceptado para estudiar tratamientos terapéuticos potenciales de la RA.

Materiales y Métodos

Ratones: se utilizan para este trabajo ratones macho DBA/1(2) que pesan 25 gramos (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME or B&K Universal, Kent WA). Esta raza de ratón se predispone a la CIA mediante la inyección de colágeno heterólogo de tipo II. Se pueden obtener Colágeno Bovino (BC), Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (ICFA) de Sigma Chemical. El antígeno para la inmunización se procesa en ácido acético 0,1M y se formula con CFA o ICFA.

Inducción de la Artritis

Protocolo de inmunización: se inyectan a los ratones 100 \mug de colágeno de tipo II en CFA a intervalos predeterminados durante el período de estudio.

Se examinan los ratones a intervalos predeterminados para el desarrollo de la artritis. La presunta evidencia de artritis incluye inflamación y eritema de al menos una articulación de dedo en la pata delantera y/o trasera en dos observaciones consecutivas.

Diagnóstico de confirmación de la artritis

Examen histológico de las articulaciones: Las articulaciones de los dedos de los animales sacrificados a intervalos adecuados se retiran, se fijan, se descalcifican, se introducen en parafina, se cortan y se tiñen para observar las características celulares y estructurales generales y para detectar la matriz cartilaginosa del panículo de cada articulación, como conviene. El grado de celularidad y las zonas de inflamación se cuantifican utilizando la digitalización de fotomicrografías histológicas y aplicando técnicas estándar de recuento por zona y punto tal como se ha descrito anteriormente.

Se lleva a cabo una evaluación radiográfica de las articulaciones de los dedos para detectar la incidencia de los cambios en las articulaciones después de la inmunización con colágeno de tipo II. Para este trabajo, se ha modificado un sistema de imágenes por mamografía. La zona media de tejido blando (panículo) de la articulación se determina mediante el análisis de las radiografías digitalizadas por ordenador, junto con los cambios en la densidad de los tejidos duros adyacentes mediante la comparación con los estándares internos incluidos con cada radiografía. Como control para la línea base del cambio de densidad de los tejidos duros y zonas de los panículos, se utilizan ratones adicionales durante el mismo período y se comparan los datos sobre densidad y zona. El significado de las diferencias en densidad y zona para el control y los ratones experimentales se evalúa mediante ensayos T por pares en cada punto de tiempo.

Evaluación de la Artritis

Se observa diariamente el principio de una artritis en los animales. Se obtiene un índice de artritis graduando la severidad de implicación de cada pata en una escala del 0 al 4. La puntuación se basa en el grado de eritema y edema periarticular, así como en la deformidad de las articulaciones. La inflamación de las patas traseras se cuantifica también midiendo el espesor del tobillo desde el malleus (martillo) lateral al medial con un calibrador de tensión constante.

Diseño Experimental

Para evaluar el efecto antiartrítico del Compuesto HK-X, se seleccionan las vías de administración en base a la experiencia con pacientes humanos con respecto al(a los) mecanismo(s) de suministro más apropiado(s).

Dosis de HK-X y Prednisolona: Se colocan dosificaciones que representan niveles divergentes y putativamente terapéuticos de péptido en sitios localizados, tanto por vía transcutánea (TC) (absortiva) como por inyección en el pié. Es demasiado probable que la inyección directa en el espacio intraarticular produzca artefactos traumáticos. Por tanto, la inyección del medicamento en la almohadilla plantar (FP) adyacente al espacio intraarticular es la metodología elegida. Se inyecta también a los ratones control Prednisolona (potente antiinflamatorio documentado en el tratamiento de enfermedades experimentales y clínicas autoinmunes) como control positivo.

En primer lugar, se inyecta diariamente durante 50 días a cada ratón en un grupo de diez (más los controles) colágeno. Los días 3 y 18, se inyecta al ratón 5 ó 10 \mug/kg del Compuesto HK-X en una solución de ácido acético 0,1M a 1 mg/ml. El día 50, el ratón es exanguinado para los estudios histológicos.

Entonces, ocho grupos (A-I) de diez ratones cada uno son tratados de acuerdo con el siguiente protocolo específico.

Se inmuniza al Grupo A con 1º CFA más BC, 2º ICFA más BC y no se da ningún tratamiento (control).

Se inmuniza al Grupo B con 1º CFA más BC, 2º ICFA más BC y se administra prednisolona a 5 mg/kg empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días.

Se inmuniza al Grupo C con 1º CFA más BC, 2º ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a 4 mg/kg (dosis alta) empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días.

Se inmuniza al Grupo D con 1º CFA más BC, 2º ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a 0,4 mg/kg (dosis baja) empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días.

Se inmuniza al Grupo E con 1º CFA más BC, 2º ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a 4 mg/kg (dosis alta) empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días.

Se inmuniza al Grupo F con 1º CFA más BC, 2º ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a 0,4 mg/kg (dosis baja) empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días.

Se inmuniza al Grupo G con 1º CFA, 2º ICFA y se administran TC 10 ml de DMSO empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días (control).

Se inmuniza al Grupo H con 1º CFA, 2º ICFA y se administran FP 10 ml de DMSO empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días (control).

Se inmuniza al Grupo I con 1º CFA, 2º ICFA y se administran FP 10 ml de solución salina empezando el día después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días (control).

Se someten los animales de cada grupo a rayos-X inmediatamente después de la 2º inmunización e inmediatamente antes de sacrificarlos. Después de su sacrificio, se retiran las patas según convenga y se procesan para su examen histológico. Se descubre que el tratamiento con el Compuesto HK-X reduce el grado de artritis.

Se ha descrito la invención detalladamente con referencia a las realizaciones preferentes de la misma. Sin embargo, se apreciará que, al considerar la presente descripción y las figuras, los especialistas en la técnica puedan realizar modificaciones y mejoras dentro del alcance de esta invención tal como viene definido por las reivindicaciones.

Claims (12)

1. Composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr, siendo f N-formilo.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho péptido es f-Met-Leu-Phe-Phe o caracterizada porque dicho péptido es f-Met-Leu-Tyr.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona dicho vehículo para la administración oral del péptido o porque se selecciona dicho vehículo para la administración por inhalación del péptido.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha composición es una composición en aerosol.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona dicho vehículo para la administración tópica del péptido o caracterizada porque se selecciona dicho vehículo para la administración en tabletas del péptido.

6. Utilización de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la inflamación, seleccionándose X de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

7. Utilización de un péptido según la reivindicación 6, caracterizada porque la inflamación es controlada por la inhibición de la degranulación de los mastocitos.

8. Utilización de un péptido según la reivindicación 6, caracterizada porque la inflamación es asma, artritis reumatoide y anafilaxis o caracterizado porque la inflamación es una consecuencia del asma, la artritis reumatoide o la anafilaxis.

9. Utilización de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el asma, caracterizada porque X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr.

10. Utilización de un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades controladas por cualquiera de las siguientes condiciones:

inhibición de la liberación de citocinas, histaminas y leucotrienos en un paciente,

mediante la reducción de la adhesión, migración y agregación de los linfocitos, eosinófilos y neutrófilos a un lugar de inflamación en un paciente,

mediante la reducción de los anticuerpos IgE en el lugar de inflamación en un paciente,

mediante la reducción de la reticulación de IgE en un lugar de inflamación en un paciente, o

mediante la inhibición de la permeabilidad vascular incrementada en un lugar de inflamación en un paciente.

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11. Utilización de una cantidad antiinflamatoria eficaz de (i) un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr y (ii) otro ingrediente activo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la inflamación crónica en un paciente.

12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el otro ingrediente activo se selecciona de entre el grupo consistente en antileucotrienos, beta_{2}-agonistas y corticosteroides.