ES2326530T3 - Citocinas modificadas para su utilizacion en la terapia del cancer. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de conjugación de TNF y un péptido que contiene el motivo NGR o un polinucleótido para su codificación, y una cantidad eficaz de IFN y o un polinucleótido para su codificación.
Description
Citocinas modificadas para su utilización en la
terapia del cáncer.
La presente invención se refiere a citocinas
modificadas para su utilización en el tratamiento del cáncer. Más
particularmente, la invención se refiere a derivados de citocinas
capaces de "albergar" vasos tumorales y células presentadoras
de antígenos. La presente invención se refiere asimismo a
combinaciones sinérgicas que comprenden una citocina modificada.
La actividad antitumoral de algunas citocinas es
bien conocida y se ha descrito. Algunas citocinas se han utilizado
ya terapéuticamente también en seres humanos (29). Por ejemplo,
citocinas tales como la interleucina-2
(IL-2) y el interferón \alpha(IFN\alpha)
han demostrado actividad antitumoral positiva en pacientes con
diferentes tipos de tumores, tales como el carcinoma renal
metastásico, la tricoleucemia, el sarcoma de Kaposi, el melanoma,
el melanoma múltiple y similares. Otras citocinas como IFN\beta,
el factor \alpha de la necrosis tumoral (TNF), TNF\beta,
IL-1, 4, 6, 12, 15 y los factores de estimulación de
colonias (CFS) han demostrado una cierta actividad antitumoral en
algunos tipos de tumores y por consiguiente son objeto de estudios
adicionales.
En general, la utilización terapéutica de
citocinas está muy limitada por su toxicidad generalizada. El TNF,
por ejemplo, fue originalmente descubierto por su capacidad de
provocar la necrosis hemorrágica de algunos tumores (1) y por su
efecto citotóxico in vitro en diferentes estirpes tumorales
(2), pero esto demostró posteriormente que tiene actividad
proinflamatoria fuerte, que puede, en caso de condiciones de
sobreproducción, afectar peligrosamente al cuerpo humano (3).
Ya que la toxicidad generalizada es un problema
fundamental en la utilización de cantidades farmacológicamente
activas de citocinas en los seres humanos, los nuevos derivados y
las estrategias terapéuticas están actualmente en evaluación, con
la intención de reducir los efectos tóxicos de esta clase de
efectores biológicos conservando su eficacia terapéutica.
Algunas nuevas estrategias se refieren a:
- a)
- el desarrollo de proteínas de fusión que pueden liberar TNF en el tumor y aumentar la concentración local. Por ejemplo, las proteínas de fusión constituidas por TNF y los anticuerpos específicos para el tumor se han producido (4);
- b)
- el desarrollo de mutantes de TNF que mantienen la actividad antitumoral y tienen una toxicidad generalizada reducida. Por consiguiente, mutantes capaces de reconocer selectivamente solamente un receptor (p55 o p75) se han preparado ya (5);
- c)
- la utilización de anticuerpos anti-TNF capaces de reducir algunos efectos tóxicos de TNF sin comprometer su actividad antitumoral. Dichos anticuerpos se han descrito ya en la bibliografía (30);
- d)
- la utilización de derivados de TNF con una vida media mayor (por ejemplo conjugados de TNF con polietilenglicol).
La preparación de derivados del TNF capaces de
dirigirse selectivamente a las zonas tumorales se ha descrito
recientemente. Por ejemplo, se ha descrito una proteína de fusión,
obtenida fusionando el gen de la cadena pesada de un mAb receptor
de anti-transferrina y el gen del TNF (4), o una
proteína de fusión del TNF con la zona "bisagra" de un
anticuerpo monoclonal contra el antígeno TAG72 asociado al tumor (6)
o una proteína de fusión Fv-TNF (6).
El documento EP 251 494 describe un sistema para
administrar un agente para diagnóstico o terapéutico, que
comprende: un anticuerpo conjugado con avidina o estreptavidina, un
agente capaz de acomplejar el anticuerpo conjugado y un compuesto
constituido por el agente para diagnóstico o terapéutico conjugado
con biotina, que se administran sucesivamente y están retardados de
manera adecuada, a fin de permitir la localización del agente
terapéutico o para diagnóstico mediante la interacción
biotina-estreptavidina en la célula diana reconocida
por el anticuerpo. Los agentes terapéuticos o para diagnóstico
descritos comprenden quelatos metálicos, en particular quelatos de
radionúclidos y agentes antitumorales de bajo peso molecular tales
como cis-platino, doxorrubicina, etc.
El documento EP 496 074 da a conocer un
procedimiento que proporciona la administración sucesiva de un
anticuerpo biotinilado, avidina o estreptavidina y un agente
biotinilado para diagnóstico o terapéutico. Aunque los agentes
citotóxicos como el ricino se mencionan genéricamente, la aplicación
relativa a los compuestos radiomarcados está descrita en su mayor
parte.
El documento WO 95/15979 da a conocer un
procedimiento para localizar agentes muy tóxicos en las dianas
celulares, basado en la administración de un primer conjugado que
comprende la molécula diana específica conjugada con un ligando o
un anti-ligando seguido de la administración de un
segundo conjugado constituido por el agente tóxico unido a un
anti-ligando o al ligando.
El documento WO98/10795 da a conocer unas
moléculas que alojan un tumor que comprenden los péptidos que
contienen la secuencia de aminoácidos NGR. No se describe ninguna
utilización del péptido para dirigir una citocina a un tumor.
El documento WO 99/13329 dan a conocer un
procedimiento para dirigir una molécula a los vasos angiogénicos
tumorales, basado en la conjugación de dicha molécula con ligandos
de receptores de NGR. Se han sugerido numerosas moléculas como
posibles candidatos, pero solamente la doxorrubicina está descrita
específicamente. No se da a conocer ninguna utilización de ligandos
de receptores de NGR como vehículos de citocinas para provocar
respuestas inmunitarias.
El documento WO01/61017 da a conocer un producto
de conjugación entre una citocina seleccionada de entre TNF o
IFN\gamma y un ligando del receptor CD13.
Se ha descubierto actualmente de manera
sorprendente que el TNF acoplado con un ligando del receptor CD13 e
IFN\gamma actúan de manera sinérgica de manera que puede
apreciarse la actividad antitumoral eficaz bajo coadministración a
dosis que son inferiores a las dosis eficaces individualmente.
Además, se ha descubierto que la actividad antitumoral de una
combinación del TNF modificado y otro agente antitumoral, tal como
la doxorruvbicina, es aumentada mediante la administración de
IFN\gamma.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad
eficaz de un producto de conjugación de TNF y un ligando del
receptor CD13, y una cantidad eficaz de IFN\gamma.
Se describirán a continuación varias
características y formas de realización preferidas de la presente
invención a título de ejemplo no limitativo.
La CD13 es una glucoproteína transmembranaria de
150 kDa muy conservada en varias especies. Se expresa en las
células normales así como en las estirpes tumorales mieloides, en el
endotelio angiógeno y en algunos epitelios. El receptor CD13 se
identifica normalmente como receptor "NGR". Los ligandos pueden
ser naturales o sintéticos. El término "ligando" hace asimismo
referencia a un ligando modificado químicamente. Los uno o más
dominios de unión del ligando pueden, por ejemplo, estar
constituidos por un ligando natural para el receptor, o un
fragmento de un ligando natural que retiene la afinidad de unión
para el receptor. Los ligandos sintéticos comprenden los ligandos
de diseño. Como es utilizado en la presente memoria, el término
"ligandos de diseño" hace referencia a los agentes que resulta
probable que se unan al receptor sobre la base de su forma
tridimensional en comparación con la del receptor.
El ligando es un un péptido lineal o cíclico que
comprende el motivo NGR, tales como CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG,
cicloGVLNGRMEC o cicloCNGRC, o, más preferentemente, el péptido
CNGRC. Dichos ligandos son descritos en el documento WO98/10795 que
se incorpora a la presente memoria como referencia. Los
procedimientos de identificación de los ligandos del receptor CD13
se dan a conocer en el documento WO99/13329 que se incorpora a la
presente memoria como referencia.
El término "péptido" como es utilizado en
la presente memoria comprende polipéptidos y proteínas. El término
"polipéptido" comprende moléculas de polipéptido de cadena
sencilla así como unos complejos multipolipeptídicos en los que los
polipéptidos constituyentes individuales están unidos por medios
covalentes o no covalentes. El término "polipéptido" comprende
péptidos de dos o más aminoácidos de longitud, presentando
típicamente más de 5, 10 ó 20 aminoácidos.
Debe apreciarse que las secuencias
polipeptídicas de utilización en la invención no están limitadas a
las secuencias particulares o sus fragmentos sino que comprenden
asimismo las secuencias homólogas obtenidas a partir de cualquier
fuente, por ejemplo proteínas víricas/bacterianas, homólogos
celulares y péptidos sintéticos relacionados.
Las secuencias polipeptídicas de la presente
invención comprenden asimismo los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos de la presente invención.
Las secuencias pueden ser modificadas para su
utilización en la presente invención. Típicamente, se realizan
modificaciones que mantienen la actividad de la secuencia. Por lo
tanto, en una forma de realización, pueden realizarse sustituciones
de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones
con la condición de que la secuencia modificada retenga por lo
menos de aproximadamente 25 a 50% de, o sustancialmente la misma
actividad. Sin embargo, en una forma de realización alternativa,
pueden realizarse de manera intencionada modificaciones de las
secuencias de aminoácidos de un polipéptido de la invención para
reducir la actividad biológica del polipéptido. Por ejemplo, pueden
resultar útiles los polipéptidos truncados que permanecen con la
capacidad de unirse a la molécula diana pero que carecen de dominios
efectores funcionales.
Generalmente, preferentemente menos de 20%, 10%
o 5% de los residuos de aminoácidos de un variante o derivado están
alterados en comparación con la región correspondiente representada
en los listados de secuencia.
Las sustituciones de aminoácidos pueden
comprender la utilización de los análogos que se producen de manera
no natural, por ejemplo para aumentar la vida media del plasma en
sangre de un polipéptido administrado terapéuticamente (ver a
continuación para más detalles sobre la producción de los derivados
peptídicos para su utilización en la terapia).
Pueden introducirse sustituciones conservadoras,
por ejemplo según la tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo
bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en
la tercera columna pueden ser sustituidos por mutuamente:
Los polipéptidos de la invención comprenden
asimismo fragmentos de los polipéptidos mencionados anteriormente y
sus variantes, comprendiendo los fragmentos de las secuencias. Los
fragmentos preferidos comprenden los que incluyen un epítopo o
dominio de unión. Los fragmentos adecuados serán por lo menos
aproximadamente 5, por ejemplo 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos de
longitud. Pueden ser asimismo inferiores a 200, 100 ó 50 aminoácidos
en longitud. Los fragmentos polipeptídicos de las proteínas y sus
variantes alélicas y de especie pueden contener una o más (por
ejemplo 2, 3, 5, o 10) sustituciones, deleciones o inserciones, que
comprenden las sustituciones conservadas. Cuando se han realizado
las sustituciones, deleciones y/o inserciones, por ejemplo mediante
tecnología recombinante, preferentemente menos de 20%, 10% o 5% de
los residuos de aminoácidos representados en los listados de
secuencias son modificados.
Los polipéptidos y los conjugados de la
invención son típicamente realizados por medios recombinantes, por
ejemplo como se describe a continuación. Sin embargo pueden estar
realizados por medios sintéticos utilizando técnicas que resultan
bien conocidas por los expertos en la materia tales como la síntesis
de fase sólida. Son examinadas diversas técnicas para la síntesis
química de péptidos por Borgia y Fields, 2000, Tib Tech 18:
243-251 y descritas en detalle en las referencias
contenidas.
El péptido puede acoplarse directamente a la
citocina o indirectamente mediante un espaciador, que puede ser un
solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos o un resto orgánico,
tal como
6-aminocapril-N-hidroxisuccinimida.
Los procedimientos de acoplamiento son conocidos por los expertos
en la materia y comprenden técnicas de ingeniería genética o de
síntesis química.
El ligando peptídico preferentemente está unido
al terminal N de la citocina minimizando de este modo cualquier
interferencia en la unión de la citocina modificada a su receptor.
Alternativamente, el péptido puede estar unido a restos de
aminoácido que son receptores de enlaces amido o carboxílico, que se
producen de forma natural en la molécula o artificialmente
insertados con técnicas de ingeniería genética. La citocina
modificada se prepara preferentemente mediante la utilización de un
ADNc que comprende una secuencia 5' contigua que codifica el
péptido.
Según las reivindicaciones, se proporciona un
producto de conjugación entre TNF y la secuencia CNGRC. Más
preferentemente, el terminal amino de TNF está unido al péptido
CNGRC mediante el espaciador G (glicina).
El producto resultante
(NGR-TNF), demostró ser más activo que el TNF en
modelos animales de linfoma RMA-T. Además, los
animales tratados con NGR-TNF fueron capaces de
rechazar más dosis tumorígenas de células RMA-T o
RMA. El aumento de la actividad antitumoral, en comparación con el
TNF normal, pudo observarse en animales inmunocompetitivos pero no
en animales inmunodeficientes. Esto indica que el aumento en la
actividad antitumoral de TNF conjugado con péptidos "NGR" es
debido a un aumento de la respuesta inmunitaria en lugar de a una
actividad citotóxica directa del conjugado.
Se ha demostrado también que los efectos
inmunitarios in vivo provocados por NGR-TNF
están relacionados directamente con el receptor CD13. Se ha
observado, por ejemplo, que el anticuerpo contra el receptor CD13
así como el ligando GNGRC compiten con NGR-TNF in
vivo, sugiriendo de este modo un mecanismo de dirección del
receptor por NGR-TNF.
El índice terapéutico de los conjugados del
ligando TNF/CD13 puede mejorarse más utilizando una forma mutante
de TNF capaz de unirse selectivamente a uno de los dos receptores de
TNF, p75TNFR y p55TNFR. Dicho mutante de TNF puede obtenerse por
mutagénesis dirigida a la zona (5; 7).
El índice farmacocinético de las citocinas
modificadas según la invención puede mejorarse preparando derivados
de polietilenglicol, que permiten ampliar la vida media plasmática
de las propias citocinas.
Una forma de realización adicional de la
invención es proporcionada por derivados bifuncionales en los que
las citocinas modificadas con el ligando CD13 están conjugadas con
anticuerpos, o sus fragmentos, contra los antígenos tumorales u
otros marcadores angiógenos tumorales, p. ej., integrinas \alphav,
metaloproteasas o el factor de crecimiento vascular, o anticuerpos
o fragmentos de los mismos dirigidos contra los componentes de la
matriz extracelular, tales como los anticuerpos
anti-tenascina o el dominio EDB de la
anti-fibronectina. Se ha descrito recientemente la
preparación de un producto de fusión entre TNF y la zona bisagra de
un mAb contra el antígeno TAG72 asociado al tumor expresado por el
adenocarcinoma gástrico y de ovario (6).
Una forma de realización adicional de la
invención es proporcionada por el predireccionamiento tumoral con
el sistema biotina/avidina. Según esta estrategia, se obtiene un
complejo ternario en la zona antigénica tumoral, en diferentes
etapas, que está formada por 1) mAb biotinilado, 2) avidina (o
estreptavidina) y 3) citocina bivalente modificada con el ligando
CD13 y biotina. Numerosos artículos demostraron que la estrategia de
predireccionamiento, en comparación con el direccionamiento
convencional con inmunoconjugados, puede aumentar realmente la
relación de molécula activa contenida en la diana a molécula activa
libre, reduciendo de este modo la toxicidad del tratamiento (11,
10, 9, 8). Esta estrategia produjo resultados favorables con el TNF
biotinilado, que fue capaz de provocar citotoxicidad in
vitro y disminuir el crecimiento de las células tumorales en
condiciones en las que el TNF normal era inactivo (14, 26). La
estrategia de predireccionamiento puede realizarse también con un
procedimiento en dos fases utilizando un anticuerpo biespecífico que
al mismo tiempo se une al antígeno tumoral y a la citocina
modificada. La utilización de un anticuerpo biespecífico dirigido
contra el antígeno carcionoembrionario y el TNF se ha descrito
recientemente como un medio para el predireccionamiento tumoral del
TNF (31).
Según una forma de realización adicional, la
invención comprende una molécula de TNF conjugada tanto con un
ligando CD13 como con un anticuerpo, o un fragmento de la misma
(directa o indirectamente mediante un puente
biotina-avidina), en diferentes subunidades de TNF,
donde el anticuerpo o sus fragmentos están dirigidos contra un
anticuerpo expresado en las células tumorales u otros componentes
del estroma tumoral, p. ej. el dominio EDB de tenascina y
fibronectina. Esto da como resultado una mejora adicional del tumor
que alberga las propiedades de la citocina modificada y en la
liberación lenta de este último en el micromedio tumoral mediante
las transiciones
trímero-monómero-trímero. Como se
demuestra en los trabajos anteriores, de hecho, las subunidades
modificadas de los conjugados de TNF pueden disociarse de los
complejos de direccionamiento y reasociarse con el fin de formar
moléculas de TNF triméricas inalteradas, que a continuación se
difunden en el microentorno del tumor. Se ha demostrado que la
liberación del TNF bioactivo se produce entre las 24 y 48 horas
después del direccionamiento (21).
Los péptidos de la presente invención pueden ser
administrados terapéuticamente a los pacientes. Resulta preferido
utilizar los péptidos que no están únicamente constituidos por
aminoácidos que se producen naturalmente sino que han sido
modificados, por ejemplo para reducir la inmunogenicidad, para
aumentar la vida media circulatoria en el cuerpo del paciente, para
mejorar la biodisponibilidad y/o para mejorar la eficacia y/o la
especificidad.
Han sido utilizados diversos enfoques para
modificar los péptidos para su aplicación terapéutica. Un enfoque
consiste en unir los péptidos o las proteínas a una variedad de
polímeros, tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol
(PPG) -ver por ejemplo las patentes US nº 5.091.176, 5.214.131 y US
nº 5.264.209.
Se puede utilizar la sustitución de los
aminoácidos que se producen naturalmente con una variedad de
aminoácidos modificados o no codificados tales como los
D-aminoácidos y los N-metil
aminoácidos para modificar los péptidos.
Otro enfoque consiste en utilizar agentes de
reticulación bifuncionales, tales como
N-succinimidil 3-(2 piridilditio) propionato,
succinimidil 6-[3-(2 piridilditio) propionamido] hexanoato, y
sulfosuccinimidil 6-[3-(2-piridilditio)
propionamido] hexanoato (ver la patente US nº 5.580.853).
Puede resultar deseable utilizar los derivados
de los péptidos de la invención que están limitados en su
conformación. La limitación en su conformación hace referencia a la
conformación preferida y la estabilidad de la forma tridimensional
adoptada por un péptido. Las limitaciones en la conformación
comprenden las limitaciones locales, que implican limitar la
movilidad en la conformación de un residuo sencillo de un péptido;
limitaciones regionales, que implican limitar la movilidad en la
conformación de un grupo de residuos, pudiendo dichos residuos
formar alguna unidad estructural secundaria; y limitaciones
globales, que implican la estructura del péptido total.
\newpage
La conformación activa del péptido puede ser
estabilizada mediante una modificación covalente, tal como la
ciclación o mediante la incorporación de
gamma-lactamo u otros tipos de puentes. Por ejemplo,
las cadenas laterales se pueden someter a ciclación para el
esqueleto de manera que se creen una porción de
L-gamma-lactamo en cada lado del
sitio de interacción. Ver, en general, Hruby et al.,
"Applications of Synthetic Peptides", en Synthetic Peptides: A
User's Guide: 259-345 (W. H. Freeman & Co.
1992). Se puede asimismo conseguir la ciclación, por ejemplo,
mediante la formación de puentes de cisteína, acoplando los grupos
terminales carboxi y amino de los aminoácidos termianales
respectivos, o acoplando el grupo amino de un residuo Lys o un
homólogo relacionado con un grupo carboxi de Asp, Glu o un homólogo
relacionado. Se puede asimismo realizar el acoplamiento del grupo
alfa-amino de un polipéptido con el grupo
épsilon-amino de un residuo de lisina utilizando
anhídrido yodoacético. Ver Wood y Wetzel, 1992, Int'l J. Peptide
Protein Res. 39: 533-39.
Otro enfoque descrito en la patente US nº
5.891.418 consiste en incluir un esqueleto de complejación de ión
metálico en la estructura del péptido. Típicamente, el esqueleto de
metal-péptido preferido está basado en el número
necesario de grupos de coordinación particulares necesarios para la
esfera de coordinación de un ión metálico de complejación dado.
Generalmente, la mayoría de los iones metálicos que pueden resultar
útiles presentan un número de coordinación de cuatro a seis. La
naturaleza de los grupos de coordinación en la cadena peptídica
comprenden los átomos de nitrógeno con funcionalidades amina, amida,
imdazol, o guanidina; átomos de azufre o tioles o disulfuros; y
átomos de oxígeno de funcionalidades hidroxi, fenólica, carbonilo, o
carboxilo. Además, la cadena peptídica o los aminoácidos
individuales pueden ser modificados químicamente para incluir un
grupo de coordinación, tal como por ejemplo oxima, hidrazino,
sulfhidrilo, fosfato, ciano, piridino, piperidino, o morfolino. El
constructo peptídico puede ser lineal o cíclico, sin embargo es
típicamente preferido un constructo lineal. Un ejemplo de un
péptido lineal pequeño es
Gly-Gly-Gly-Gly que
presenta cuatro nitrógenos (un sistema de complejación N_{4}) en
el esqueleto que puede complejar a un ión metálico con un número de
coordinación de cuatro.
Otra técnica para mejorar las propiedades de los
péptidos terapéuticos consiste en utilizar los peptidomiméticos no
peptídicos. Puede ser utilizada una amplia variedad de técnicas
útiles para establecer la estructura precisa de un péptido. Estas
técnicas comprenden la secuenciación de aminoácidos, la
cristalografía por rayos X, la espectroscopia de masas, la
espectroscopia de resonancia magnética nuclear, el modelado
molecular asistido por ordenador, el mapeo peptídico, y sus
combinaciones. El análisis estructural de un péptido proporciona
generalmente un cuerpo grande de datos que comprende la secuencia de
aminoácidos del péptido así como el posicionamiento tridimensional
de sus componentes atómicos. A partir de esta información, los
peptidomiméticos no peptídicos pueden estar concebidos de manera
que presenten las funcionalidades químicas necesarias para la
actividad terapéutica pero son más estables, por ejemplo
menos susceptibles a la degradación biológica. La patente US nº 5.811.512 proporciona un ejemplo de este enfoque.
menos susceptibles a la degradación biológica. La patente US nº 5.811.512 proporciona un ejemplo de este enfoque.
Las técnicas para sintetizar químicamente los
péptidos terapéuticos de la invención son descritas en las
referencias anteriores y examinadas asimismo por Borgia y Fields,
2000, TibTech 18: 243-251 y descritas con mayor
detalle en las referencias contenidas.
Para su utilización en terapia, las citocinas
modificadas de la invención se formularán de manera adecuada en
preparaciones farmacéuticas para administración oral o parenteral.
Se prefieren las formulaciones para administración parenteral, y
comprenden soluciones inyectables o suspensiones y líquidos para
infusiones. Para la preparación de las formas parenterales, se
disolverá o se pondrán en suspensión una cantidad eficaz del
ingrediente activo en un vehículo esterilizado, añadiendo
opcionalmente excipientes tales como disolventes, agentes de
isotonicidad, conservantes, estabilizantes, emulsionantes o agentes
dispersantes, y se distribuirá sucesivamente en viales sellados o
ampollas.
Con mayor detalle, los conjugados de la
invención, que comprenden polipéptidos y polinucleótidos, pueden
estar preferentemente combinados con varios componentes para
producir las composiciones de la invención. Preferentemente, las
composiciones son combinadas con un portador, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica (que puede ser de utilización humana o animal). Los
portadores y diluyentes adecuados comprenden las soluciones salinas
isotónicas, por ejemplo un medio salino tamponado con fosfato. Los
detalles de los excipientes pueden ser encontrados en The Handbook
of Pharmaceutical Excipients, 2^{nd} Edn, Eds Wade & Weller,
American Pharmaceutical Association. La composición de la invención
puede ser administrada por inyección directa. La composición puede
ser formulada para la administración parenteral, intramuscular,
intravenosa, subcutánea, intraocular, oral o transdérmica.
La composición se puede formular de manera que
la administración diaria, semanal o mensual proporcionará la dosis
diaria deseada. Se apreciará que la composición puede estar
convenientemente formulada para ser administrada con menor
frecuencia, como cada 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 horas.
Los polinucleótidos/vectores que codifican los
componentes polipeptídicos pueden ser administrados directamente
como un constructo de ácido nucleico desnudo, comprendiendo además
preferentemente las secuencias flanqueantes homólogas al genoma de
célula huésped.
La captación de los constructos de ácido
nucleico desnudo mediante las células de mamífero es aumentada
mediante varias técnicas de transfección conocidas por ejemplo las
que incluyen la utilización de los agentes de transfección. Los
ejemplos de estos agentes comprenden los agentes catiónicos (por
ejemplo el fosfato cálcico y el DEAE-dextrano) y
los lipofectantes (por ejemplo lipofectam^{TM} y
transfectam^{TM}). Típicamente, los constructos de ácido nucleico
están mezclados con el agente de transfección para producir una
composición.
Preferentemente, el polinucleótido o vector de
la invención está combinado con un diluyente o portador
farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica. Los diluyentes y portadores adecuados comprenden las
soluciones salinas isotónicas, por ejemplo el medio salino tamponado
con fosfato. La composición puede estar formulada para la
administración parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea,
intraocular o transdérmica.
Las vías de administración y los regímenes de
dosificación descritos se proporcionan únicamente como una guía dado
que el experto en la materia podrá determinar fácilmente la vía
óptima de administración y los regímenes de dosificación para
cualesquiera paciente y estado particulares.
La preparación de citocinas en forma de
liposomas puede mejorar la actividad biológica de las mismas. Se ha
observado, de hecho, que la acilación de los grupos amino del TNF
provoca un aumento en su hidrofobia sin pérdida de actividad
biológica in vitro. Además, se ha descrito que el TNF unido a
lípidos tiene citotoxicidad inalterada in vitro, efectos de
inmunomodulación y toxicidad reducida in vivo (12, 13).
La dosis máxima tolerada de TNF en inyección
intravenosa en embolada en seres humanos es de 218 a 410
\mug/m^{2} (32) aproximadamente 10 veces inferior a la dosis
eficaz en animales. Basándose en los datos de los modelos murinos
se cree que una dosis superior de por lo menos 10 veces es necesaria
para conseguir efectos antitumorales en seres humanos (15). En el
primer estudio clínico sobre perfusión hipertérmica aislada en las
extremidades, se obtuvieron cantidades altas de respuesta con la
dosis única de 4 mg de TNF en combinación con melfalán e interferón
\gamma (16). Otros trabajos demostraron que el interferón \gamma
puede omitirse y que incluso dosis inferiores de TNF pueden ser
suficientes para provocar una respuesta terapéutica (17, 18). Dado
que las dos citocinas ejercen efectos sinérgicos sobre las células
endoteliales, su direccionamiento combinado y selectivo en las
mismas es probable que produzca una actividad antitumoral más
potente permitiendo de este modo superar los problemas de toxicidad
generaliza encontrados normalmente en la terapia del cáncer con las
mismas citocinas utilizadas en combinación. Además, es sabido que el
TNF puede disminuir la función de barrera de los vasos con
recubrimiento endotelial, aumentando de este modo su permeabilidad a
las macromoléculas. Aprovechándose de la menor toxicidad del
tratamiento con las moléculas de TNF modificadas según la invención,
y sus vasos tumorales que contienen propiedades, una aplicación
alternativa consiste en su utilización para aumentar la
permeabilidad de los vasos tumorales a otros compuestos, para fines
terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo puede utilizarse el TNF
modificado para aumentar la absorción del tumor de los anticuerpos u
hormonas radiomarcados (compuestos para detección por la imagen del
tumor) en radioinmunoescintigrafía o radioinmunoterapia de los
tumores. Alternativamente, la absorción de fármacos
quimioterapéuticos, inmunotoxinas, liposomas que llevan fármacos o
genes, u otros fármacos anticancerosos podría aumentarse también, de
modo que sus efectos antitumorales aumenten.
Por consiguiente, las citocinas de la invención
pueden utilizarse en preparaciones combinadas, por separado o
sucesivas, asimismo con otras sustancias para diagnóstico o
terapéuticas, en el tratamiento o en el diagnóstico del cáncer.
La presente invención se refiere a la
utilización de una combinación del TNF modificado, y el IFN\gamma.
Esta combinación puede ser utilizada en preparaciones secuenciales,
separadas o combinadas. Ventajosamente, la combinación es asimismo
con otras sustancias terapéuticas o de diagnóstico, en el
tratamiento o el diagnóstico del cáncer, tal como la doxorrubicina
y el mefalán. Por lo tanto la presente invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende una combinación del TNF
modificado y el INF\gamma, y opcionalmente otra sustancia
terapéutica antitumoral o de diagnóstico tumoral. De nuevo, esta
combinación se puede utilizar en preparaciones secuenciales,
separadas o combinadas.
En la solicitud de patente número PCT/IB03/02187
de los presentes inventores, se ha descubierto que el suministro
dirigido de dosis de picogramo de citocinas aumenta la penetración
de los fármacos quimioterapéuticos, proporcionando una nueva e
inesperada estrategia para aumentar el índice terapéutico de los
fármacos quimioterapéuticos. La solicitud de patente número
PCT/IB03/02187 se incorpora a la presente memoria en su totalidad
como referencia. Con mayor detalle, se ha descubierto que el
suministro de dosis muy bajas de citocinas a los tumores y al
entorno asociado a los tumores que comprende la vasculatura tumoral
representa un nuevo enfoque para evitar los mecanismos de
retroalimentación negativa y para mantener su capacidad para
modificar las barreras de penetración de fármaco.
La composición de la presente invención puede
estar formulada para la administración parenteral, intramuscular,
intravenosa, subcutánea, intraocular, oral o transdérmica. En una
forma de realización de este aspecto de la presente invención, se
puede administrar un conjugado de la presente invención a una dosis
comprendida en el intervalo de 0,5 a 500 ng/kg, preferentemente en
el intervalo de 1 a 50 ng/kg, más preferentemente en el intervalo de
5 a 15 ng/kg.
En una forma de realización alternativa de este
aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica
que comprende un conjugado de la presente invención en combinación
con IFN\gamma, en la que el conjugado está presente en una
cantidad tal que el conjugado o un metabolito del mismo está
previsto en el plasma sanguíneo del sujeto que debe ser tratado en
una cantidad no superior a aproximadamente 35.000 ng/día,
preferentemente aproximadamente 3.500 ng/día, más preferentemente
aproximadamente 1.000 ng/día.
La dosis anterior se refiere a una dosis para un
sujeto de 70 kg. Un experto en la materia podrá fácilmente modificar
la dosis para un sujeto que presente una masa diferente a 70 kg.
Las vías de administración y los regímenes de
dosificación descritos se proporcionan únicamente como guía dado que
un experto en la materia podrá determinar fácilmente la vía de
administración y los regímenes de administración óptimos para
cualesquiera paciente y estado.
Otro aspecto de la invención con respecto al
ADNc que codifica las citocinas conjugadas dadas a conocer en la
presente memoria, que pueden prepararse a partir del ADNc de
citocinas por adición de una secuencia de ADN contigua a 5' ó 3'
que codifica el ligando CD13 preferentemente para los péptidos de
autoguiado descritos anteriormente. El ADNc combinado puede
utilizarse como tal o tras la inserción en vectores para terapia
génica. La preparación de aplicaciones terapéuticas de vectores
adecuados se da a conocer en (19), que está incorporado a la
presente memoria como referencia.
Los polinucleótidos de utilización en la
invención comprenden las secuencias de ácido nucleico que codifican
el conjugado de polipéptido de la invencinón. Resultará evidente
para el experto en la materia que varios polinucleótidos diferentes
pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la
degeneración del código genético. Además, debe apreciarse que los
expertos en la materia, utilizando las técnicas de rutina, pueden
realizar sustituciones de nucleótidos que no afectan a la secuencia
polipeptídica codificada por los polinucleótidos de la invención
para reflejar el uso del codón de cualquier organismo huésped
particular en el que los polipéptidos de la invención van a ser
expresados.
Los polinucleótidos de la invención pueden
comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios.
Pueden ser asimismo polinucleótidos que comprenden en su interior
nucleótidos sintéticos o modificados. Son conocidos en la técnica
varios tipos diferentes de modificación para los oligonucleótidos.
Comprenden los esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, la
adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o
5' de la molécula. En el contexto de la presente invención, debe
apreciarse que los polinucleótidos descritos en la presente memoria
pueden ser modificados mediante cualquier procedimiento disponible
en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse con el fin
de mejorar la actividad in vivo o el periodo de vida de los
polinucleótidos de la invención.
Los polinucleótidos de la invención se pueden
incorporar a un vector replicable recombinante. El vector puede ser
utilizado para replicar el ácido nucleico en una célula huésped
compatible. Por lo tanto, en otra forma de realización, la
invención proporciona un procedimiento para preparar los
polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de
la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una
célula huésped compatible, y cultivando la célula huésped en
condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede
ser recuperado de la célula huésped. Las células húesped adecuadas
comprenden bacterias tales como E. coli, levadura, líneas
celulares de mamífero y otras líneas celulares eucariotas, por
ejemplo las células de insecto Sf9.
Preferentemente, un polinucleótido de la
invención en un vector está unido de manera funcional a una
secuencia de control que puede proporcionar la expresión de la
secuencia de codificación mediante la célula huésped, es decir el
vector es un vector de expresión. La expresión "unido de manera
funcional" hace referencia a que los componentes descritos están
en una relación que permite su funcionamiento deseado. Una secuencia
reguladora "unida de manera funcional" a una secuencia de
codificación está unida de tal manera que la expresión de la
secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con
las secuencias de control.
Las secuencias de control pueden ser
modificadas, por ejemplo mediante la adición de elementos
reguladores de transcripción para aumentar la sensibilidad del nivel
de transcripción dirigida por las secuencias de control a los
moduladores de transcripción.
Los vectores de la invención pueden ser
transformados o transfectados en una célula huésped adecuada como
se describe a continuación para proporcionar la expresión de una
proteína de la invención. Este procedimiento puede comprender el
cultivo de una célula huésped transformada con un vector de
expresión como se ha descrito anteriormente en condiciones que
proporcionen la expresión por un vector de una secuencia de
codificación que codifica la proteína, y opcionalmente recuperar la
proteína expresada.
Los vectores pueden ser por ejemplo, vectores
virales o plasmídicos provistos de un origen de replicación,
opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido
y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden
contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un
gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido
bacteriano o un gen de resistencia a la neomicina para un vector de
mamífero. Los vectores pueden ser utilizados, por ejemplo, para
transfectar o transformar una célula huésped.
Las secuencias de control unidas de manera
funcional a las secuencias que codifican la proteína de la invención
comprenden promotores/potenciadores y otras señales de regulación
de la expresión. Estas secuencias de control pueden ser
seleccionadas para resultar compatibles con la célula huésped para
la que el vector de expresión está concebido para su utilización.
El término "promotor" es bien conocido en la técnica y
comprende las regiones de ácidos nucleicos comprendidos en tamaño y
complejidad entre los promotores mínimos y los promotores que
incluyen potenciadores y elementos corriente arriba.
El promotor es típicamente seleccionado de entre
los promotores que resultan funcionales en las células de mamífero,
aunque pueden ser utilizados los promotores procariotas y los
promotores funcionales en otras células eucariotas. El promotor es
típicamente obtenido a partir de las secuencias de promotor o los
genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede ser un promotor
obtenido a partir del genoma de una célula en la que la expresión
se va a producir. Con respecto a los promotores eucariotas, pueden
ser promotores que funcionan de manera ubicua (tales como los
promotores de a-actina, b-actina,
tubulina) o, alternativamente, de manera específica para tejidos
(tales como los promotores de los genes para la piruvato quinasa).
Los promotores específicos para tejidos específicos para
determinadas células pueden asimismo ser utilizados. Pueden asimismo
ser promotores que responden a estímulos específicos, por ejemplo
promotores que unen los receptores hormonales esteroideos. Los
promotores virales pueden ser asimismo utilizados, por ejemplo el
promotor de repetición terminal larga del virus de la leucemia
murina de Moloney (MMLVLTR), el promotor del virus del sarcoma de
Rous (RSV) LTR o el promotor del citomegalovirus humano (CMV)
IE.
Puede asimismo resultar ventajoso para los
promotores poder ser inducidos de manera que los niveles de
expresión del gen heterólogo puedan ser regulados durante la vida
de la célula. Que puedan ser inducidos hace referencia a que los
niveles de expresión obtenidos utilizando el promotor pueden ser
regulados.
Además, cualquiera de estos promotores puede ser
modificado mediante la adición de otras secuencias reguladoras, por
ejemplo secuencias potenciadoras. Los promotores quiméricos pueden
ser asimismo utilizados comprendiendo los elementos de secuencia a
partir de dos o más promotores diferentes descritos
anteriormente.
Los vectores y polinucleótidos de la invención
pueden ser introducidos en las células huésped con el fin de
replicar los vectores/polinucleótidos y/o expresar las proteínas de
la invención codificadas por los polinucleótidos de la invención.
Aunque las proteínas de la invención pueden ser producidas
utilizando células procariotas como células huésped, resulta
preferida la utilización de las células eucariotas, por ejemplo,
células de levadura, insecto o mamífero, en particular células de
mamífero.
Los vectores/polinucleótidos de la invención
pueden ser introducidos en células huésped adecuadas utilizando una
variedad de técnicas conocidas en la materia, como la transfección,
la transformación y la electroporación. Cuando los
vectores/polinucleótidos de la invención deben ser administrados a
los animales, resultan conocidas varias técnicas en la materia, por
ejemplo la infección con vectores virales recombinantes tales como
retrovirus, virus del herpes simple y adenovirus, la inyección
directa de ácidos nucleicos y la transformación biolística.
Las células huésped que comprenden los
polinucleótidos de la invención pueden ser utilizadas para expresar
los conjugados de la invención. Las células huésped pueden ser
cultivadas en condiciones adecuadas que permiten la expresión de
los polipéptidos y conjugados de la invención. La expresión de los
productos de la invención pueden ser constitutivos de manera que
son producidos de manera continua, o inducibles, requiriendo un
estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión
inducible, la producción de proteínas puede ser iniciada cuando
resulte necesaria mediante, por ejemplo, la adición de una sustancia
inductora al medio de cultivo, por ejemplo dexametasona o IPTG.
Los conjugados de la invención pueden ser
extraídos de las células huésped mediante una variedad de técnicas
conocidas en la materia, que incluyen la lisis enzimática, química
y/u osmótica y la ruptura física.
Figura 1: Efecto del TNF y
NGR-TNF sobre el crecimiento de linfomas
RMA-T (a y b) y sobre el peso del animal (c y d)
Se trataron 5 animales/grupo con una única dosis
de TNF o NGR-TNF (i.p.), 10 días después de la
implantación del tumor. Los valores del área tumoral el día 14 en
función de la dosis (b) y la pérdida de peso después del tratamiento
(media de los días 11 y 12) (d), se interpolaron en curvas
logarítmicas. Los efectos antitumorales provocados por 1 \mug o 9
\mug de NGR-TNF el día 14 fueron mayores que los
provocados por cantidades comparables de TNF (P = 0,024 y P = 0,032,
respectivamente), mientras que la pérdida de peso después de estos
tratamientos fue similar. Las flechas indican dosis extrapoladas de
TNF y NGR-TNF que provocan efectos comparables.
Figura 2: Efecto del mAb R3-63 y
de CNGRC sobre la actividad antitumoral de NGR-TNF
(a) y TNF (b)
Se mezclaron mAb R3-63 o CNGRC
con NGR-TNF o TNF y se administraron a animales con
tumor RMA-T, 12 días después de la implantación del
tumor (n = 5 animales/grupo). En un experimento por separado (c) TNF
y NGR-TNF se administraron conjuntamente con CNGRC o
CARAC (péptido de referencia) a animales que llevan tumores de 11
días (n = 5). El efecto antitumoral de 1 \mug de
NGR-TNF fue más potente que el de 9 \mug de TNF (P
= 0,009, prueba de la t el día 20) y fue inhibido de manera
significativa por CNGRC (P = 0,035) y por mAb R3-63
(P = 0,011).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Figura 3: Efecto de la digestión tríptica
limitada de NGR-TNF y de TNF sobre su masa (a) y
actividad antitumoral (b)
Se preparó tripsina-agarosa
acoplando 1 mg de tripsina a 1 ml de CH Sepharosa activada
(Pharmacia-Upjohn), según las instrucciones del
fabricante. Se mezclaron NGR-TNF y TNF (170 \mug
de cada uno en 300 \mul de cloruro sódico 0,15 M, fosfato sódico
0,05 M, pH 7,3) con 15 \mul de suspensión de resina (1:4) o tampón
solo y se hizo girar en un tambor vertical a 37ºC durante el tiempo
indicado. Se filtraron los cuatro productos a través de un
dispositivo Spin-X de 0,22 \mum (Costar,
Cambridge, MA) y se almacenaron a -20ºC hasta su utilización. (a)
Análisis de espectrometría de masas con electroatomización. Los
valores de la masa molecular y los productos correspondientes
(secuencias N-terminales) están indicados en cada
pico. Las flechas en las secuencias indican la zona de escisión. (b)
Efecto de 1 ó 3 \mug de NGR-TNF y TNF, incubados
sin (paneles superiores) o con (paneles inferiores) tripsina, sobre
el crecimiento de tumores RMA-T y el peso del animal
(media \pm SE de grupos tratados con dosis de 1 a 3 \mug). Se
trataron los animales 13 días después de la implantación del tumor
(n = 5 animales/grupo).
Figura 4: SDS-PAGE y actividad
antitumoral de NGR-TNF humano antes y después de
desnaturalización/replega-
miento
miento
SDS-PAGE en condiciones no
reductoras (A) de TNF humano (a), antes de NGR-TNF
(b) y después de (c) el proceso de desnaturalización/replegamiento
descrito en el Ejemplo V.
Efecto de TNF y NGR-TNF sin
replegar sobre el crecimiento de los linfomas RMA-T
(B) y sobre el peso corporal (C). El efecto de TNF humano (D) y de
NGR-TNF replegado (constituido por >95% de
trímeros con disulfuros dentro de la cadena) (E) sobre el
crecimiento del tumor. Se trataron animales (15 ó 5 ratones/grupo
como se indica en cada panel) con una dosis i.p. de TNF o de
NGR-TNF, 10 días después de la implantación del
tumor.
Figura 5: Efecto de un anticuerpo
anti-mIFN\gamma neutralizante (AN18) sobre la
actividad antitumoral de NGR-m TNF y la
doxorrubicina en los tumores B16F1 en los ratones C57BL6.
Figura 6: Efecto de NGR-TNF y la
doxorrubicina en ratones con inactivación génica de IFN\gamma.
Figura 7: Efecto de NGR-m TNF,
mIFN\gamma y doxorrubicina, (solo o en combinación) en los tumores
B16F1 en ratones desnudos.
Figura 8: Efecto de NGR-TNF y la
doxorrubicina en ratones desnudos.
Figura 9: Efecto de NGR-m TNF,
mIFN\gamma y doxorrubicina, en tumores B16F1 en ratones
inmunocompetentes (C57BL6).
Figura 10: IFN\gamma aumenta la penetración de
doxorrubicina en tumores cuando combinan con NGR-TNF
en ratones con inactivación génica de IFN\gamma.
Los ejemplos siguientes ilustran con mayor
detalle la invención.
TNF murino recombinante y
Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF
(NGR-TNF) se produjeron por expresión del ADNc
citoplásmico en E. coli. La codificación del ADNc para
Met-TNF_{1-156} murino (20) se
preparó por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
inversa (RT-PCR) en el ARNm aislado de células de
monocito-macrófago RAW-264.7
murinas estimuladas por lipopolisacáridos, utilizando
5'-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3'
y
5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3'
como cebadores 3' y 5'.
El fragmento ampliado se digirió con Nde I y Bam
HI (New England Biolabs, Beverly, MA) y se clonaron en el
pET-11b (Novagen, Madison, WI), digeridos
previamente con las mismas enzimas (pTNF).
El ADNc que codifica
Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF_{1-156}
fue ampliado por PCR en pTNF, utilizando
5'-GCA
GATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' como cebador 5' y el cebador 3' anterior. El fragmento ampliado se digirió y se clonó en el pET-11b como se describió anteriormente y se utilizó para transformar células BL21(DE3) de E. coli (Novagen). Se provocó la expresión de TNF y de NGR-TNF con isopropilo-\beta-D-tiogalactósido, según las instrucciones del fabricante del pET11b. Se recuperaron TNF y NGR-TNF solubles de los cultivos de dos litros por tratamiento con ultrasonidos de las bacterias en ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 seguido de centrifugación (15.000 \times g, 20 min., 4ºC). Se mezclaron ambos extractos con sulfato amónico (25% de saturación, se dejaron durante 1 h. a 4ºC y se centrifugaron más, como anteriormente. El sulfato amónico en los sobrenadantes se llevó a continuación al 65% de saturación, se dejó a 4ºC durante 24 h. y se centrifugó más. Se disolvió cada sedimento en 200 ml de sulfato amónico 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y se purificó por cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, que contiene sulfato amónico 1 M; tampón B: glicerol al 20%, metanol al 5%, fosfato sódico 50 mM, pH 8,0). Las fracciones que contenían material inmunorreactivo TNF (por inmunotransferencia Western) se mezclaron, se dializaron frente a ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y se purificaron más por cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; tampón B: cloruro sódico 1 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0). Se mezclaron las fracciones que contenían inmunorreactividad a TNF y se purificaron por cromatografía con filtración en gel en Sephacryl-S-300 HR (Pharmacia-Upjohn), se equilibraron previamente y se eluyeron con cloruro sódico 150 mM, tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,3 (PBS). Se agruparon las fracciones correspondientes a los productos de p.m. 40.000 a 50.000, se tomaron alícuotas y se almacenaron congeladas a -20ºC. Todas las soluciones empleadas en las etapas cromatográficas se prepararon con agua esterilizada y exenta de endotoxinas (Salf, Bérgamo, Italia). Los rendimientos finales fueron de 45 mg de TNF y 34,5 mg de NGR-TNF.
GATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' como cebador 5' y el cebador 3' anterior. El fragmento ampliado se digirió y se clonó en el pET-11b como se describió anteriormente y se utilizó para transformar células BL21(DE3) de E. coli (Novagen). Se provocó la expresión de TNF y de NGR-TNF con isopropilo-\beta-D-tiogalactósido, según las instrucciones del fabricante del pET11b. Se recuperaron TNF y NGR-TNF solubles de los cultivos de dos litros por tratamiento con ultrasonidos de las bacterias en ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 seguido de centrifugación (15.000 \times g, 20 min., 4ºC). Se mezclaron ambos extractos con sulfato amónico (25% de saturación, se dejaron durante 1 h. a 4ºC y se centrifugaron más, como anteriormente. El sulfato amónico en los sobrenadantes se llevó a continuación al 65% de saturación, se dejó a 4ºC durante 24 h. y se centrifugó más. Se disolvió cada sedimento en 200 ml de sulfato amónico 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y se purificó por cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, que contiene sulfato amónico 1 M; tampón B: glicerol al 20%, metanol al 5%, fosfato sódico 50 mM, pH 8,0). Las fracciones que contenían material inmunorreactivo TNF (por inmunotransferencia Western) se mezclaron, se dializaron frente a ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y se purificaron más por cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; tampón B: cloruro sódico 1 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0). Se mezclaron las fracciones que contenían inmunorreactividad a TNF y se purificaron por cromatografía con filtración en gel en Sephacryl-S-300 HR (Pharmacia-Upjohn), se equilibraron previamente y se eluyeron con cloruro sódico 150 mM, tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,3 (PBS). Se agruparon las fracciones correspondientes a los productos de p.m. 40.000 a 50.000, se tomaron alícuotas y se almacenaron congeladas a -20ºC. Todas las soluciones empleadas en las etapas cromatográficas se prepararon con agua esterilizada y exenta de endotoxinas (Salf, Bérgamo, Italia). Los rendimientos finales fueron de 45 mg de TNF y 34,5 mg de NGR-TNF.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El peso molecular del TNF y
NGR-TNF purificados se midieron por espectrometría
de masas con electroatomización. Se midió el contenido en proteínas
utilizando un kit de análisis de proteínas comercial (Pierce,
Rockford, IL). El contenido en endotoxinas de
NGR-TNF y de TNF fue de 0,75 unidades/\mug y de
1,38 unidades/\mug, respectivamente, medidas por la prueba
cromógena Lymulus Amoebocyte Lysate (LAL) (BioWhittaker).
Se llevaron a cabo electroforesis en gel de
dodecilsulfato sódico-poliacrilamida
(SDS-PAGE) y análisis de inmunotransferencia Western
utilizando geles de poliacrilamida al 12,5 ó 15%, por los
procedimientos habituales.
Una pequeña cantidad de TNF y de
NGR-TNF se purificó más por cromatografía por
afinidad en el receptor soluble p55-TNF
(sTNF-R1)-Sepharosa de la forma
siguiente: se prepararon 5 mg de sTNF-RI
recombinante tal como se describe (22) y se acopló a 2 ml de
CH-Sepharose activada (Pharmacia), según las
instrucciones del fabricante. Se lavaron extensamente dos columnas
por separado (de un ml cada una), con soluciones esterilizadas y
exentas de endotoxinas, se cargaron con TNF o
NGR-TNF purificados en PBS y se desabsorbieron por
elución con gradiente (1 h., tampón A: PBS; tampón B: cloruro
sódico 0,5 M, glicina-HCl 0,2 M). Las fracciones que
contienen TNF-antígeno se neutralizaron y se
dializaron frente a la solución fisiológica esterilizada. Se añadió
albúmina de suero humano exenta de endotoxinas antes del análisis
(0,5 mg/ml) para evitar la adsorción de proteínas en las membranas.
El contenido de TNF en cada fracción se determinó por ELISA y
análisis citolítico.
SDS-PAGE no reductor del TNF
presentaba una sola banda de 17 a 18 kDa, como cabía esperar para el
TNF monomérico (no mostrado). En desacuerdo, la
SDS-PAGE no reductora y el análisis por
transferencia Western de NGR-TNF presentaron
diferentes formas inmunorreactivas de 18, 36 y 50 kDa probablemente
correspondientes a monómeros, dímeros y trímeros. En condiciones
reductoras la mayoría de las bandas de 50 y 36 kDa se convirtieron
en la forma de 18 kDa, apuntando la presencia de moléculas
NGR-TNF con puentes disulfuro dentro de la cadena.
La banda de 18 kDa contaba con aproximadamente 2/3 del material
total, mientras que la de 36 kDa totalizaba la mayoría de la parte
restante. Estos modelos electroforéticos sugieren que
NGR-TNF era una mezcla de trímeros preparada por
tres subunidades monoméricas con sulfuros correctos dentro de la
cadena (por lo menos el 50%) y la mayor parte restante por trímeros
con uno o más disulfuros dentro de la cadena. La banda de 36 kDa
todavía observada reduciendo SDS-PAGE sugiere que
NGR-TNF contenía también un dímero desnaturalizado
irreversible (aproximadamente 10% del total).
Las masas moleculares de los monómeros de TNF y
de NGR-TNF fueron de 17.386,1\pm2,0 Da y de
17.843,7+2,5 Da, respectivamente, por espectrometría de masas con
electroatomización. Estos valores corresponden muy bien a la masa
esperada para Met-TNF_{1-156}
(17.386,7 Da) y para
CNGRCG-TNF_{1-156} (17.844,2
Da).
Se estimó por análisis citolítico normal la
bioactividad de TNF y NGR-TNF basándose en
fibroblastos de ratón L-M (ATCC CCL1.2) como se
describe (23). Se determinó la actividad citolítica de TNF y
NGR-TNF en células RMA-T en
presencia de 30 ng/ml de actinomicina D. Cada muestra se analizó por
duplicado a tres diluciones diferentes. Los resultados se expresan
como media \pm SD de dos a tres análisis independientes.
La actividad citotóxica in vitro de TNF y
NGR-TNF fue (1,2+0,14) \times 10^{8} unidades/mg
y de (1,8\pm0,7) \times 10^{8} unidades/mg, respectivamente,
por análisis citolítico normal con células L-M.
Estos resultados indican que los restos CNGRCG en la molécula
NGR-TNF no impiden el plegamiento, la
oligomerización ni la fijación a receptores de TNF.
En un estudio anterior los autores demostraron
que las células RMA-T pueden ser destruidas por TNF
en presencia de 30 ng/ml de actinomicina D, mientras que en
ausencia de inhibidores de transcripción estas células son
resistentes a TNF, incluso después de varios días de incubación. La
actividad citotóxica in vitro de NGR-TNF
sobre las células RMA-T en presencia de actinomicina
D fue de (1,4\pm0,8) \times 10^{8} unidades/mg, medida
utilizando TNF ((1,2\pm0,14) \times 10^{8} unidades/mg) como
patrón. De este modo, las actividades citotóxicas de
NGR-TNF y de TNF fueron similares tanto en células
L-M como RMA-T.
El linfoma RMA provocado por el virus de
Rauscher de origen C57BL/6 se mantuvo in vitro en RPMI 1640,
5% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B,
glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 50 \muM.
RMA-T procedía de la estirpe de células RMA por
transfección con un montaje que codifica el alelo Thy 1.1 y se
cultivó como se describe (14).
Se cultivaron B16F1 de melanoma en RPMI 1640,
FBS al 5%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina,
0,25 \mug/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, MEM al 1% de
aminoácidos no esenciales (BioWhittaker Europa, Verviers,
Bélgica).
El Comité Ético del Instituto Científico del H.
San Raffaele aprobó estudios in vivo en modelos animales y
se llevaron a cabo según las directrices prescritas. C57BL/6
(Charles River Laboratories, Calco, Italia) (16 a 18 g) se
sometieron a la prueba de provocación con 5 \times 10^{4}
células vivas RMA-T o B16F1, respectivamente, s.c.
en el flanco izquierdo. Diez a doce días después de la implantación
del tumor, se trataron los ratones, i.p. con 250 \mul de
soluciones de TNF o NGR-TNF, diluidas con cloruro
sódico al 0,9% exento de endotoxinas. Los experimentos preliminares
demostraron que la actividad antitumoral no cambió por adición de
albúmina de suero humano a soluciones de TNF y
NGR-TNF, como vehículo. Se realizó cada experimento
en 5 ratones por grupo. El crecimiento del tumor se controló a
diario midiendo el tamaño del tumor con calibres. Se estimó el área
del tumor calculando r_{1}\timesr_{2}, mientras que el volumen
del tumor se estimó calculando
r_{1}\timesr_{2}\timesr_{3}\times4/3, donde r_{1} y
r_{2} son los radios longitudinal y lateral y r_{3} es el
espesor de los tumores que sobresalen de la superficie de la piel
normal. Se sacrificaron los animales antes de que el tumor
alcanzase un diámetro entre 1,0 y 1,3 cm. Los tamaños del tumor se
presentan como media \pm SE (5 a 10 animales por grupo como se
indica en las leyendas de la figura) y se compararon por la prueba
de la t.
La actividad antitumoral y la toxicidad de
NGR-TNF se compararon con las de TNF utilizando los
modelos de linfoma RMA-T y de melanoma B16F1 en
ratones C57BL6. Dado que el modelo RMA-T se ha
caracterizado y utilizado anteriormente para estudiar la actividad
antitumoral de TNF con diferentes protocolos de direccionamiento
(26), los autores decidieron utilizar este modelo también en este
estudio.
El TNF murino administrado a animales que llevan
tumores de RMA-T s.c. probados, produce 24 horas
después una reducción en la masa del tumor y necrosis hemorrágica
en la parte central del tumor, seguido de un retardo de crecimiento
significativo durante pocos días (26). Un solo tratamiento con TNF
no provoca la regresión completa de este tumor, incluso a dosis
próximas a la LD_{50}, ya que las células vivas que permanecen
alrededor del área necrótica vuelven a surgir para crecer pocos
días después del tratamiento.
En una primera serie de experimentos los autores
investigaron el efecto de varias dosis (i.p.) de TNF o de
NGR-TNF en la supervivencia animal. Para impedir
sufrimiento excesivo, los animales se sacrificaron cuando el
diámetro del tumor era mayor de 1 a 1,3 cm. La letalidad del TNF y
de NGR-TNF, 3 días después del tratamiento, fue
similar (LD_{50}, 60 \mug y 45 \mug, respectivamente) mientras
que su actividad antitumoral fue notablemente diferente (Tabla
1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, 1 ó 3 \mug de
NGR-TNF retardaron el crecimiento del tumor más
eficazmente que 27 \mug de TNF, lo que indica que
NGR-TNF era por lo menos un orden de magnitud más
activo. Significativamente, algunos animales se curaron con dosis
de NGR-TNF inferiores a las de la LD_{50},
mientras que ningún animal se curó con TNF. Los animales curados
rechazaron más pruebas de provocación con dosis tumorígenas de
células RMA-T o RMA naturales, lo que sugiere que
un solo tratamiento con NGR-TNF era capaz de
provocar inmunidad protectora. Es digno de mención que aumentando
la dosis de TNF o de NGR-TNF aproximadamente 9 a 27
\mug aumentó notablemente la toxicidad y escasamente o nada la
actividad terapéutica.
\newpage
La pérdida de peso consiguiente al tratamiento
con TNF es un signo bien conocido de toxicidad generalizada (26).
De este modo, para comparar más la relación eficacia/toxicidad de
TNF y de NGR-TNF se controló el crecimiento del
tumor y el peso del animal después del tratamiento. El efecto de 1
\mug de NGR-TNF sobre el crecimiento del tumor
fue similar o mayor que el de 9 \mug de TNF (Fig. 1a), mientras
que la pérdida de peso uno a dos días después del tratamiento fue
comparable a la de 1 \mug de TNF (Fig. 1c). Cuando se interpola
los datos en una curva logarítmica en una representación de la
respuesta a la dosis los autores descubrieron que el efecto
terapéutico de 9 \mug de TNF el día 14 puede obtenerse con apenas
0,6 \mug de NGR-TNF (Fig. 1b). En cambio, fueron
necesarios 8,5 \mug para provocar un efecto tóxico comparable
(Fig. 1d). De este modo, la relación eficacia/toxicidad calculada
de NGR-TNF en estas condiciones es 14 veces mayor
que la de TNF.
Se obtuvieron resultados similares con el modelo
de melanoma B16F1. El tratamiento con 1 \mug de
NGR-TNF el día 11 y el día 17, provocó una
respuesta antitumoral el día 19 superior a la obtenida con 4 \mug
de TNF y similar a la obtenida con 12 \mug de TNF (datos no
mostrados). En cambio, la pérdida de peso producida por 1 \mug de
NGR-TNF fue notablemente inferior que la producida
por 4 y 12 \mug de TNF. El tratamiento con 12 \mug de
NGR-TNF produjo un efecto antitumoral aún más
potente, mientras que el efecto tóxico fue similar al de 12 \mug
de TNF.
Cuando se puso una tercera inyección el día 19
se produjeron algunas muertes de animales 1 a 2 días después en
todos los grupos (2 de cada 5 en el grupo tratado con solución
salina y 12 \mug de NGR-TNF y 1 de cada 5 en los
grupos restantes). A destacar que, un animal tratado con 12 \mug
de NGR-TNF rechazó completamente el tumor. Cuando
este animal se sometió a la prueba de provocación con una segunda
dosis tumorígena de células B16F1, se desarrolló un tumor palpable
tras 18 días, mientras que los animales de referencia desarrollaron
un tumor a los 6 a 7 días.
Estos resultados, en conjunto, sugieren que la
eficacia de NGR-TNF en la inhibición del crecimiento
del tumor es 10 a 15 veces mayor que la del TNF mientras la
toxicidad es similar. Sin embargo, NGR-TNF puede
provocar respuestas inmunoprotectoras con más eficacia que TNF.
El mAb R3-63 de CD13
anti-ratón se purifico en fluidos ascíticos por
cromatografía en proteína-G Sefarosa
(Pharmacia-Upjohn, Uppsala, Suecia) y se dializó
frente a cloruro sódico al 0,9%.
El antisuero policlonal de conejo se adquirió en
Primm srl (Milán, Italia) y se purificó por cromatografía de
afinidad en proteína-A-Sefarosa
(Pharmacia-Upjohn). Se prepararon los péptidos CNGRC
y CARAC como se describió anteriormente (28).
Para proporcionar pruebas de que la actividad
mejorada de NGR-TNF depende del direccionamiento del
tumor por el resto NGR los autores han investigado si la actividad
in vivo de NGR-TNF puede ser parcialmente
competida por CNGRC. Hasta este extremo los autores han
administrado NGR-TNF (1 \mug) a ratones con tumor
RMA-T, con o sin un exceso molar de CNGRC. En
paralelo, se trataron otros animales con TNF (3 ó 9 \mug), otra
vez con o sin CNGRC. Como era de esperar, CNGRC disminuyó
significativamente la actividad antitumoral de
NGR-TNF (Fig. 2a) pero no la de TNF (Fig. 2b). En
desacuerdo, un péptido de referencia (CARAC) fue incapaz de producir
una disminución significativa de la actividad de
NGR-TNF (Fig. 2c). Estos resultados sugieren que
CNGRC compite por la fijación de NGR-TNF a un
receptor de CNGRC, y apoya la hipótesis de un mecanismo de
direccionamiento para la actividad mejorada. A destacar que CNGRC
fue incapaz de disminuir la actividad citotóxica in vitro de
NGR-TNF (datos no mostrados).
Como se ha descrito recientemente que la
aminopeptidasa N (CD13) es un receptor para los péptidos CNGRC, los
autores investigaron a continuación la contribución de este receptor
en el mecanismo de direccionamiento de NGR-TNF.
Hasta este extremo, los autores estudiaron el efecto de un mAb
anti-CD13 (R3-63) sobre la actividad
antitumoral de NGR-TNF y TNF. El mAb
R3-63 inhibió de manera significativa la actividad
antitumoral de NGR-TNF (Fig. 2a) pero no la del TNF
(Fig. 2b) lo que indica que CD13 está de hecho críticamente
implicado en la actividad antitumoral de NGR-TNF.
No se observó ninguna expresión de CD13 sobre la superficie de las
células RAM-T por análisis FACS de las células
cultivadas con el mAb R3-63 (no mostrado), lo que
sugiere que otras células fueron reconocidas por el anticuerpo in
vivo.
Aunque estos datos indican que CD13 es un
receptor importante para NGR-TNF, no se puede
excluir completamente que la fijación a otros receptores de NGR no
identificados todavía contribuye también, no obstante en menor
extensión, al mecanismo de direccionamiento.
Los experimentos preliminares de la proteólisis
parcial demostraron que el enlace Arg-Ser en el
segmento N-terminal de TNF (restos 2 a 3) es muy
sensible a la tripsina, mientras que el resto de la molécula es
mucho más resistente. De este modo, para proporcionar más pruebas
de que la actividad mejorada de NGR-TNF está
relacionada con su resto NGR, los autores trataron de escindir el
dominio NGR en la zona N-terminal de la muteína
mediante digestión parcial con tripsina inmovilizada. Este
tratamiento convirtió tanto a NGR-TNF como a TNF en
una molécula correspondiente al fragmento TNF3-156
(masa esperada 16986,2 Da; véase la Fig. 3a para la masa medida y
las secuencias esperadas).
Aunque la digestión no disminuyó la actividad
citolítica in vitro de NGR-TNF sobre las
células L-M (2,3\pm1,4)\times10^{8}
U/mg) su actividad antitumoral in vivo disminuyó hasta el
nivel del TNF (Fig. 3b). A destacar que la toxicidad de
NGR-TNF y de TNF eran similares tanto antes como
después de la digestión, como se interpreta a partir de la pérdida
de peso del animal un día después del tratamiento (Fig. 3b, panel
derecho), lo que sugiere que el mecanismo de direccionamiento
dependiente de NGR no altera la toxicidad.
Se prepararon TNF y NGR-TNF
recombinantes humanos (constituidos por TNF1-157
humano fusionado con el terminal C de CNGRCG) por tecnología de ADN
recombinante y se purificaron esencialmente como se describe para
TNF y NGR-TNF murinos. La codificación del ADNc
para NGR-TNF humano fue preparada por PCR en el
plásmido pET11b/hTNF que contenía la secuencia de codificación hTNF
(33), utilizando los cebadores siguientes:
- -
- NGR-hTNF/1 (transcrito): 5'A TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3'.
- -
- NGR-hTNF/2 (complementario): 5'TCA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC 3'.
El fragmento ampliado se digirió y se clonó en
el pET11b (Nde I/BamH I) y se utilizó para transformar las células
BL21 (DE3) de E. coli (Novagen). La expresión de
NGR-hTNF fue provocada con
isopropilo-\beta-D-tiogalactósido,
según la instrucción del fabricante del pET11b. Se recuperó el
NGR-TNF soluble de los cultivos de dos litros por
tratamiento con ultrasonidos de las bacterias en ácido
etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH
8,0, seguido de centrifugación (15.000 \times g, 20 min.,
4ºC).
El extracto se mezcló con sulfato amónico (35%
de saturación), se dejó durante 1 h. a 4ºC y se centrifugó más,
como anteriormente. El sulfato amónico en los sobrenadantes se llevó
a continuación hasta el 65% de saturación, se dejó a 4ºC durante 24
h. y se centrifugó más. Se disolvió cada sedimento en sulfato
amónico 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y se purificó
por cromatografía de interacción hidrófoba en
Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow
(Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón
A: fosfato sódico 100 mM, pH 8,0, que contiene sulfato amónico 1 M;
tampón B: etilenglicol al 70%, metanol al 5%, fosfato sódico 100
mM, pH 8,0). Las fracciones que contenían material inmunorreactivo
de TNFh (por ELISA) se mezclaron, se dializaron frente a
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y se purificaron más por
cromatografía de intercambio iónico en
DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Upjohn)
(elución con gradiente, tampón A: Tris-HCl 20 mM,
pH 8,0; tampón B: cloruro sódico 1 M, Tris-HCl 20
mM, pH 8,0). Todas las soluciones empleadas en las etapas
cromatográficas se prepararon con agua esterilizada y exenta de
endotoxinas (Salf, Bérgamo, Italia).
En este punto, aproximadamente 30 mg de TNF y 32
mg de NGR-TNF se recuperaron de los cultivos de dos
litros. SDS-PAGE no reductor presentó bandas
correspondientes a los monómeros, dímeros y trímeros, lo que sugiere
que también NGR-TNF humano era una mezcla de
trímeros con disulfuros en el interior de la cadena correctos y
trímeros con uno o más puentes de disulfuro dentro de la cadena
(Fig. 4A, banda b), observados con NGR-TNF
murino.
Se aislaron trímeros con puentes disulfuro
dentro de la cadena correctos a partir de esta mezcla mediante un
proceso de desnaturalización por replegamiento en cuatro etapas de
la manera siguiente: se desnaturalizó NGR-TNF
humano purificado con urea 7 M y se filtró en gel a través de una
columna HR Sephacryl S-300 (1025 ml) (Pharmacia)
equilibrada previamente con urea 7 M, Tris-HCl 100
mM, pH 8,0. Se mezclaron las fracciones correspondientes al TNF
monomérico, se ultrafiltraron a través de una membrana YM MWCO de 10
kDa (Amicon) y se replegaron por diálisis frente a 33 volúmenes de
urea 2,33 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8 a 4ºC (140 min.)
seguido de urea 1,55 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8 (140
min.) y urea 1 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8 (140 min.).
Por último se dializó el producto frente a 80 volúmenes de
Tris-HCl 100 mM (16 h.), se centrifugó a 13.000
\times g (30 min.), se filtró a través de una membrana SFCA de
0,45 \mum (Nalgene) y se filtró en gel a través de una columna HR
Sephacryl S-300 (1020 ml) equilibrada previamente
con cloruro sódico 0,15 M, fosfato sódico 0,05 M (PBS). Se
recuperaron aproximadamente 23 mg de la proteína replegada.
El producto final era en su mayor parte
monomérico después de SDS-PAGE no reductor (Fig. 4A,
banda c), tenía un volumen hidrodinámico similar al del TNF humano
trimérico por HPLC analítica con filtración en gel en una columna
Superdex 75 HR (no mostrada) y tenía una masa molecular de 17937,8 +
1,8 Da (esperada para
CNGRCG-TNF1-157, 17939,4 Da) por
espectrometría de masas con electroatomización. Las actividades
citolíticas in vitro de NGR-TNF sin replegar
y replegado sobre las células L-M de ratón fueron
(6,11 \times 107) + 4,9 y (5,09 \times 107) + 0,3 unidades/mg
respectivamente, mientras que la del TNF humano purificado fue de
(5,45 \times 107) + 3,1 unidades/mg. Estos resultados sugieren
que el proceso de desnaturalización por replegamiento no afectó la
interacción de NGR-TNF humano con el receptor p55
murino.
La actividad antitumoral in vivo de 1
\mug de NGR-TNF humano (sin replegar) fue superior
a la de 10 \mug de TNF (Fig. 4B) mientras que la toxicidad,
interpretada por la pérdida de peso del animal, fue
significativamente inferior (Fig. 4C). Después del replegamiento de
0,3 \mug de NGR-TNF fue suficiente para provocar
un efecto antitumoral más fuerte que el conseguido con 10 \mug de
TNF (Fig. 4D, 4E).
Estos resultados indican que la actividad
antitumoral del NGR-TNF humano es mayor que la del
TNF humano.
Además, los autores han observado que el
NGR-TNF humano replegado y de ratón pueden provocar
efectos antitumorales significativos en los ratones con
RMA-T incluso a dosis muy bajas (1 a 10 ng/ratón)
sin pruebas de efectos tóxicos, mientras que TNF fue incapaz de
provocar efectos significativos a estas dosis (no mostrado).
Se preparó interferón murino recombinante
(IFN)\gamma fusionado con CNGRCG
(NGR-IFN\gamma) por tecnología de ADN
recombinante, esencialmente como se describe para el
NGR-TNF. El dominio de CNGRC se fusionó con el
terminal C de IFN\gamma. Además la cisteína en la posición 134 se
sustituyó con una serina; se introdujo una metionina en la posición
-1 para la expresión en las células de E. coli. Los cebadores
de PCR utilizados para la producción del ADNc de
NGR-IFN\gamma fueron: 5'-A TAT CTA
CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C (transcrito) y
5'-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG
ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC. Se clonó el ADNc en el
pET-11b (Nde I/BamH I) y se utilizó para transformar
células BL21 (DE3) de E. coli (Novagen). Se provocó la
expresión de la proteína con
isopropilo-\beta-D-tiogalactósido,
según la instrucción del fabricante del pET11b. El producto se
purificó a partir de los extractos de E. coli por
cromatografía de inmunoafinidad utilizando un mAb (AN18) de
IFN\gamma anti-ratón inmovilizado en agarosa,
según las técnicas habituales. La SDS-PAGE
reductora y no reductora del producto final presentaba una sola
banda de 16 kDa. La espectrometría de masas con electroatomización
presentaba un peso molecular de 16223 + 3,6 Da (esperado, 1625,5 Da)
correspondiente al
Met-IFN\gamma1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFN\gamma)
murino.
La capacidad de NGR-IFN\gamma
y NGR-TNF para competir en la fijación de un
anticuerpo anti-CD13 con el tumor asociado a los
vasos sanguíneos fue investigada utilizando un método
inmunohistoquímico.
Muestras quirúrgicas recientes de carcinoma de
células renales humanas se obtuvieron en el Departamento de
Histopatología del San Raffaele H Scientific Institute. Se
prepararon secciones (5 a 6 \mum de espesor) de muestras
empapadas en parafina fijadas en Bouin (4 a 6 h.) y se adsorbieron
en portaobjetos recubiertos con polilisina. Se detectaron antígenos
CD13 utilizando el procedimiento del complejo
avidina-biotina de la manera siguiente: las
secciones de tejido se rehidrataron utilizando xilenos y series de
alcohol graduado, según procedimientos habituales. Las secciones de
tejido se colocaron en un vaso que contenía EDTA 1 mM y se
hirvieron durante 7 min. utilizando una estufa a microondas (1.000
W). El recipiente se rellenó a continuación con EDTA 1 mM y se
hirvió de nuevo durante 5 min. Las secciones de tejido se dejaron
enfriar y se incubaron en PBS que contenía peróxido de hidrógeno al
0,3% durante 15 min., para enfriar la peroxidasa endógena. Las
muestras se a continuación y se enjuagaron con PBS y se incubaron
con 100 a 200 \mul de PBS-BSA (1 h. a temperatura
ambiente) seguido del mAb WM15 (anti-CD13h), solo o
mezclado con varios agentes competitivos (véase la Tabla 2) en
PBS-BSA (durante la noche a 4ºC). Los portaobjetos
se lavaron a continuación tres veces (3 min. cada uno) con PBS y se
incubaron con PBS-BSA que contenía suero de caballo
normal al 2% (PBS-BSA-NHS) (Vector
Laboratories, Burlingame, CA) durante 5 min. La solución se
sustituyó a continuación por 3 \mug/ml de IgG (H+L)
anti-ratón de caballo biotinilado (Vector
Laboratories, Burlingame, CA) en
PBS-BSA-NHS y se incubaron durante
1 h. más a temperatura ambiente. Se lavaron los portaobjetos de
nuevo y se incubaron durante 30 min. con reactivo Vectastain Elite
(Vector Laboratories, Burlingame, CA) diluido 1:100 en PBS. Se
disolvió a continuación un comprimido de
3,3'-diamino-benzidina-tetrahidrocloruro
(Merck, Darmstadt, Alemania) en 10 ml de agua desionizada que
contenía peróxido de hidrógeno al 0,03%, filtrado a través de una
membrana de 0,2 \mum y cubierto sobre las secciones de tejido
durante 5 a 10 min. Los portaobjetos se lavaron como anteriormente
y se tiñeron por contraste con hematoxilina de Harris. Se
identificaron los vasos asociados al tumor mediante secciones en
serie de tinción del tejido con un mAb anti-CD31
(mAb JC/70A, CD31 anti-humano, IgG1, de DAKO,
Copenhague, Dinamarca).
En la Tabla 2 se resumen los resultados. Como se
muestra, la fijación de WM15 a los vasos asociados al tumor fue
inhibida por un exceso de NGR-TNF,
NGR-IFN\gamma y CNGRC, pero no por otros reactivos
de control que carecen del motivo NGR. Esto sugiere que el punto de
fijación de NGR en CD13 se solapa estéricamente con el epítopo
WM15. En cambio, NGR-TNF fue incapaz de competir por
la fijación de 13C03 con las células epiteliales.
Los autores llegan a la conclusión de que el
resto NGR de NGR-IFN\gamma y
NGR-TNF puede interactuar con la forma CD13
reconocida por el mAb WM15 en los vasos asociados al tumor. Además,
estos resultados indican que el motivo CNGRC es funcional cuando se
une al terminal N o al terminal C de una citocina.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo siguiente, ilustra la posibilidad de
"doble" direccionamiento de TNF, basándose en la combinación de
un anticuerpo que contiene el tumor y un péptido CNGRC.
Se preparó un conjugado de
biotina-NGR-TNF mezclando
NGR-TNF con el éster
N-hidroxisuccinimida del ácido
D-biotinil-6-aminocaproico
(Societá Prodotti Antibiotici S.p.A., Milán, Italia), en tampón de
carbonato sódico 1 M, pH 6,8 (3 h. a temperatura ambiente) (21). Se
bloqueó la reacción con Tris-HCl 1 M, pH 7,5.
Se caracterizó el conjugado por espectrometría
de masas y se encontró que contenía 1 biotina/trímero (de
promedios). Los C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Italia)
se sometieron a continuación a la prueba de provocación con células
vivas 5 \times 10^{4} RMA-T, s.c. en el costado
izquierdo. Cuando el área del tumor alcanzó 40 mm^{2}, se
trataron los ratones con inyecciones sucesivas de anticuerpo
biotinilado, avidinas y biotina-TNF según un
protocolo de "tres días" como se describió anteriormente (26).
Se inyectó: 40 \mug de biotina-mAb19E12 (i.p.,
etapa I), 60 \mug de avidina y 60 \mug de estreptavidina después
de 18 y 19 h., respectivamente (i.p., etapa II), 3 \mug de
biotina-NGR-TNF, 24 h. después
(i.p., etapa III). Se diluyó cada compuesto con una solución
esterilizada de cloruro sódico al 0,9%. En el experimento de
referencia, se omitieron la avidina y la estreptavidina. Cada
experimento se realizó con 5 ratones/grupo. Se controló el
crecimiento del tumor a diario midiendo el tamaño del tumor con
calibres. Las áreas del tumor antes y 10 días después del
tratamiento fueron 39\pm4 mm^{2} y 8\pm5 mm^{2},
respectivamente, en el grupo tratado con mAb
19E12-biotina/avidina/estreptavidina/biotina-NGR-TNF
(5 animales, media\pmSE). En el grupo de referencia (tratado con
mAb
19E12-biotina/biotina-NGR-TNF
solo) las áreas del tumor antes y 10 días después del tratamiento
fueron 40\pm4 mm^{2} y 20\pm6 mm^{2} respectivamente, lo que
indica que el direccionamiento previo con el anticuerpo que
contiene el tumor y avidina ha aumentado la actividad de
NGR-TNF.
Las células de melanoma de B16F1 de ratón fueron
cultivadas como se describió anteriormente (Curnis et al.,
2000; Moro et al., 1997).
El anticuerpo monoclonal
anti-IFNgamma neutralizante AN18 fue amablemente
suministrado por P. Dellabona, Milan, Italia). La doxorrubicina
(Adriblastina) se adquirió en Pharmacia-Upjohn
(Milan, Italia). El IFN\gamma múrido recombinante se adquirió en
Peprotech Inc. (USA) (contenido en endotoxinas: < 1
unidades/\mug). Las células TS/A de un adenocarcinoma de mamífero
espontáneo BALB/c se cultivaron en medio RPMI 1640, suero bovino
fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B, 2 mM de glutamina
y medio esencial mínimo al 1% con aminoácidos no esenciales
(BioWhittaker Europe, Verviers, Belgium).
El TNF múrido y el TNF-NGR
(constituido por TNF fusionado con el C-terminal de
CNGRCG) fueron preparados con tecnología de ADN recombinante y
purificados a partir de extractos de células de E. coli, como
se ha descrito (Cumis, et al., 2000). Todas las soluciones
utilizadas en las etapas cromatográficas se prepararon con agua
libre de endotoxinas y estéril (Salf, Bergamo, Italia). La
concentración de proteínas se midió con un kit de ensayo de
cuantificación de proteínas comercial (Pierce, Rockford, IL). La
actividad citolítica de NGR-m TNF fue 9,1 x
10^{7} unidades/mg. El volumen hidrodinámico de
NGR-mTNF fue similar al de TNF, una proteína
homotrimérica (Smith y Baglioni, 1987), mediante cromatografía de
filtración de gel en una columna Superdex 75 HR (Pharmacia,
Suecia). El contenido de endotoxinas de NGR-m TNF
fue de 0,082 unidades/\mug.
Las manipulaciones de ADN se realizaron mediante
procedimientos de ADN recombinante estándares. La codificación de
ADNc para el IFN\gamma múrido se preparó mediante PCR en ADNc
obtenido a partir de linfocitos múridos estimulados con forbol
12-miristato 13-acetato, utilizando
los cebadores siguientes: 5'
AGAATTCATGAACGCTACACACT
GCATCTTGGC 3' (cebador directo); 5' TATATTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCCGC 3' (cebador inverso). Los cebadores están concebidos para amplificar la secuencia de ADNc que codifica el IFN\gamma de ratón de longitud total, comprendiendo la secuencia líder. Comprenden el sitio de restricción HindIII y EcoRI (subrayado) para la clonación en el vector de expresión de mamífero pRS1-neo, para generar pRS1neo-INF\gamma. Se preparó a continuación pRS1 neo-IFN\gamma utilizando el Kit Plasmid Maxi (Qiagen Inc. -Diagen, GmbH, Alemania) y se diluyó a 1 mg/ml en agua libre de endotoxinas y estéril (S.A.L.F. Laboratorio Farmacologico SpA, Bergamo, Italia). Se mezcló pRS1 neo-IFN\gamma (3 \mug) con 100 \mul de 0,03 mg/ml de reactivo Lipofectina (Gibco Brl) en RPMI 1640 y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. La mezcla se añadió a continuación a células TS/A depositadas en placas de microtitulación de 24 pocillos 1 día antes (4 x 10^{4} células por pocillo en 200 \mul de medio de cultivo). Tras la incubación a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 h, se añadieron 2 ml de medio de cultivo a cada pocillo. Tras 48 h de la incubación el medio de cultivo fue modificado con RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de glutamina y que contiene 1 mg/ml de geneticina. Tras una semana, las células que sobrevivieron a la selección se clonaron mediante dilución limitante en placas de microtitulación de 96 pocillos en presencia de geneticina. Los sobrenadantes de cada clon se sometieron a ensayo mediante IFN\mu-ELISA. Se obtuvieron diez clones que secretan IFN\gamma. Se seleccionó y se utilizó para los experimentos in vivo un clon, denominado TS/A-IFN\gamma, que produce 1,13 \mug de IFN\gamma por ml de medio de cultivo.
GCATCTTGGC 3' (cebador directo); 5' TATATTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCCGC 3' (cebador inverso). Los cebadores están concebidos para amplificar la secuencia de ADNc que codifica el IFN\gamma de ratón de longitud total, comprendiendo la secuencia líder. Comprenden el sitio de restricción HindIII y EcoRI (subrayado) para la clonación en el vector de expresión de mamífero pRS1-neo, para generar pRS1neo-INF\gamma. Se preparó a continuación pRS1 neo-IFN\gamma utilizando el Kit Plasmid Maxi (Qiagen Inc. -Diagen, GmbH, Alemania) y se diluyó a 1 mg/ml en agua libre de endotoxinas y estéril (S.A.L.F. Laboratorio Farmacologico SpA, Bergamo, Italia). Se mezcló pRS1 neo-IFN\gamma (3 \mug) con 100 \mul de 0,03 mg/ml de reactivo Lipofectina (Gibco Brl) en RPMI 1640 y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. La mezcla se añadió a continuación a células TS/A depositadas en placas de microtitulación de 24 pocillos 1 día antes (4 x 10^{4} células por pocillo en 200 \mul de medio de cultivo). Tras la incubación a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 h, se añadieron 2 ml de medio de cultivo a cada pocillo. Tras 48 h de la incubación el medio de cultivo fue modificado con RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de glutamina y que contiene 1 mg/ml de geneticina. Tras una semana, las células que sobrevivieron a la selección se clonaron mediante dilución limitante en placas de microtitulación de 96 pocillos en presencia de geneticina. Los sobrenadantes de cada clon se sometieron a ensayo mediante IFN\mu-ELISA. Se obtuvieron diez clones que secretan IFN\gamma. Se seleccionó y se utilizó para los experimentos in vivo un clon, denominado TS/A-IFN\gamma, que produce 1,13 \mug de IFN\gamma por ml de medio de cultivo.
Las placas de microtitulación de PVC (Becton
Dickinson, cod. 3912) se recubrieron con 5 \mug/ml de mAb AN18 en
PBS (16 a 4ºC). Las placas se lavaron tres veces con PBS y se
bloquearon con albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en PBS
(PBS-BSA, 1 h a 37ºC). Las placas se lavaron
entonces tres veces con PBS incubado con sobrenadantes de cultivo
celular o soluciones estándares de IFN\gamma de ratón diluidas en
PBS-BSA. Las placas se lavaron ocho veces con PBS
que contiene Tween-20 (Merck) al 0,05%
(PBS-TW) y se incubaron con mAb XMG1,bio (0,2
\mug/ml en PBS, 1 h a 37ºC). Las placas se lavaron de nuevo con
PBS-TW y se incubaron durante 1 h a 37ºC con
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Sigma)
diluida 1:3.000 en PBS-BSA. Tras el lavado con
PBS-TW, la peroxidasa ligada se detectó con un
sustrato de peroxidasa de dihidrocloruro de
o-fenilenodiamina (Sigma). La reacción cromogénica
se bloqueó tras 30 min mediante la adicción de ácido sulfúrico al
10%. El A_{490} se midió con un lector de microplacas ELISA
(Biorad).
Los estudios de modelos de animales fueron
aprobados por el Ethical Committee del San Raffaele H Scientific
Institute y se realizaron según las directrices recomendadas. Los
ratones C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Italia) de un
peso de 16 a 18 g se expusieron a inyección subcutánea en el lado
izquierdo de células vivas B16F1 o 5 x 10^{4}; 5 días más tarde,
los ratones fueron tratados con soluciones de
NGR-mTNF y mIFN\gamma (100 \mul) seguido 2 h
por la administración de una solución de doxorrubicina (100 \mul).
Todos los fármacos se administraron intraperitonealmente (i.p.).
Los fármacos se diluyeron con cloruro sódico al 0,9%, que contiene
100 \mug/ml de albúmina de suero humano libre de endotoxinas
(Farma-Biagini, Lucca, Italia), con la excepción de
la doxorrubicina, que se diluyó con cloruro sódico al 0,9% solo. El
crecimiento tumoral se controló diariamente midiendo los tumores
con calibradores como se ha descrito anteriormente (Gasparri et
al., 1999). Los animales se sacrificaron antes de que los
tumores alcanzasen un diámetro de 1,0 a 1,5 cm. Los tamaños
tumorales se representan como \pm SE promedio (5
animales/grupo).
Se ha demostrado anteriormente que
NGR-mTNF y doxorrubicina desempeñan efectos
sinérgicos en ratones inmunocompetentes portadores de tumor
B16-F1, siendo la actividad antitumoral de la
doxorrubicina significativamente aumentada mediante la
preadministración de 0,1 ng de NGR-mTNF
(anteriormente y Curnis et al., 2002). Por lo tanto, la
administración de cantidades bajas de NGR-mTNF (0,1
ng) en combinación con doxorrubicina (80 \mug) a ratones
portadores de tumor B16-F10 indujo unos efectos
antitumorales más potentes que los obtenidos con la doxorrubicina
sola (figura 5). Estos fármacos actúan sinérgicamente, ya que
NGR-TNF solo resulta poco activo cuando es utilizado
en bajas dosis (0,1 ng) (Curnis et al., 2002).
Para evaluar la importancia funcional del
mIFN\gamma endógeno en la actividad antitumoral de
NGR-mTNF en los ratones inmunocompetentes, se
estudió el efecto de un anticuerpo anti-mIFN\gamma
neutralizante (mAb AN18) sobre la actividad antitumoral de
NGR-mTNF/doxorrubicina en ratones C57BL6.
Cuando este anticuerpo se administró 24 horas
antes que NGR-mTNF, se suprimió el efecto sinérgico
entre NGR-mTNF y la doxorrubicina (figura 5),
avalando la hipótesis de que el mIFN\gamma endógeno desempeña un
rol importante en la actividad antitumoral de
NGR-mTNF.
\newpage
Para respaldar además el rol del IFN\gamma en
la respuesta terapéutica a estos fármacos se realizaron en el
contexto de la presente invención otros experimentos in vivo
utilizando ratones con "inactivación génica" BALB/c
IFN\gamma^{/-}, portadores de tumores de adenocarcinoma
mamario-TS/A de ratón subcutáneos. Paralelamente,
se realizaron en el contexto de la presente invención experimentos
similares utilizando ratones BALB/c IFN\gamma^{+/+} de tipo
salvaje. NGR-TNF/doxorrubicina redujo
significativamente la masa tumoral en los ratones BALB/c
IFN\gamma^{+/+} (figura 6, barras en negro), pero no en los
ratones BALB/c IFN\gamma^{/-} (barras en blanco). Especialmente,
la administración de IFN\gamma exógeno (300 ng) en combinación
con NGR-TNF y doxorrubicina a ratones BALB/c
IFN\gamma^{/-}, restituyó la sinergia entre estos fármacos
(figura 6, barras en blanco). Estos resultados confirman la
hipótesis que consiste en que IFN\gamma resulta necesario para la
actividad sinérgica de NGR-TNF/doxorrubicina. La
coadministración de IFN\gamma y doxorrubicina sin
NGR-TNF no indujo unos efectos antitumorales
significativos en los ratones BALB/c IFN\gamma^{/-}, (figura 6,
barras en blanco) indicando que esta citocina actúa sinérgicamente
con NGR-TNF, y poco o nada con la doxorrubicina.
Las linfocitos T y las células NK son las
fuentes principales del IFN\gamma en los ratones
inmunocompetentes. Para analizar la importancia de los linfocitos T
como fuente del IFN\gamma en la terapia combinada de
NGR-TNF/doxorrubicina se analizó el efecto de estos
fármacos en los ratones nu/nu portadores de tumor B16F1, que
carecen de los linfocitos T. En este modelo, la actividad sinérgica
de NGR-TNF/doxorrubicina se perdió (figura
7A-C). Sin embargo, estos fármacos se administraron
en combinación con IFN\gamma, apreciándose de nuevo el efecto
sinérgico (figura 7D). Es probable que la cantidad de IFN\gamma
endógeno en estos animales no resultara suficiente para activar la
sinergia NGR-TNF/doxorrubicina, mientras que la
administración del IFN\gamma exógeno restauró la sinergia.
Los resultados de los experimentos in
vivo con ratones inmunocompetentes y nu/nu pueden indicar
que los linfocitos T presentes en la masa tumoral de los ratones
inmunocompetentes, pero no de los ratones nu/nu, producen
cantidades suficientes de IFN\gamma para estimular una respuesta
sinérgica entre NGR-TNF y la quimioterapia. Para
valorar si la producción de IFN\gamma en el microentorno tumoral
podría restaurar el efecto sinérgico en los ratones nu/nu,
se transfectaron las células TS/A con el ADNc de IFN\gamma múrido
(figura 8). Se seleccionó un clon que puede secretar IFN\gamma en
el medio de cultivo y se denominó TS/A-IFN. El
TS/A-IFN y las células TS/A de tipo salvaje fueron
a continuación implantadas, subcutáneamente, en los ratones
nu/nu. Como era de esperar,
NGR-TNF/doxorrubicina ejerció unos efectos
antitumorales significativos contra TSA-IFN, pero
no contra los tumores TS/A, indicando de manera convincente que el
IFN\gamma producido localmente resulta en efecto de importancia
fundamental para la sinergia
NGR-TNF/doxorrubicina.
En conclusión, estos resultados y los anteriores
indican que la actividad terapéutica de
NGR-TNF/doxorrubicina depende plenamente de la
producción local de IFN\gamma, probablemente secretado por los
linfocitos de infiltración
tumoral.
tumoral.
La actividad terapéutica de
NGR-TNF y la doxorrubicina, en combinación con el
IFN\gamma exógeno, (300 ng) se evaluó a continuación utilizando
ratones C57B16 portadores de tumores B16F1. Como se ha representado
en la figura 9, la actividad antitumoral de la triple combinación
fue superior que la de NGR-TNF/doxorrubicina. Así,
la administración del IFN\gamma exógeno, junto con
NGR-TNF/doxorrubicina, indujo asimismo un efecto
antitumoral más potente en los ratones inmunocompetentes.
Se ha mostrado anteriormente que un mecanismo
importante para la sinergia NGR-TNF/doxorrubicina
está relacionado con la alteración de una función de barrera
endotelial mediante NGR-TNF y la penetración
aumentada de la doxorrubicina, en los tumores. Así, se examinó si
IFN\gamma resulta de importancia fundamental para este efecto. Con
este fin se midió el efecto del IFN\gamma exógeno sobre la
penetración de la doxorrubicina en los tumores TS/A (figura 10).
Este experimento aprovecha el hecho de que la doxorrubicina es un
compuesto fluorescente y de que la intensidad de la fluorescencia
de las células tumorales, recuperadas de los animales tras el
tratamiento, indica la cantidad de doxorrubicina que ha penetrado
en los tumores. El experimento se realizó en ratones nu/nu
para reducir el efecto del IFN\gamma endógeno. Cuando los ratones
portadores de tumor fueron tratados con NGR-TNF y,
tras 2 h, con doxorrubicina, no se apreció un aumento significativo
de la doxorrubicina en las células tumorales, en comparacion con
los controles sin tratar. Sin embargo, la administración de
IFN\gamma en combinación con NGR-TNF aumentó la
penetración de la doxorrubicina en los tumores. Esto indica que
IFN\gamma resulta de importancia fundamental para la penetración
inducida por TNF de los fármacos quimimoterapéuticos.
Los resultados de este estudio indican que el
IFN\gamma endógeno resulta de importancia fundamental para la
actividad sinérgica de NGR-TNF/doxorrubicina y que
el mIFN\gamma exógeno junto con NGR-mTNF inducen
un efecto antitumoral más potente en los ratones inmunodeficientes
e inmunocompetentes. Esta opinión resulta respaldada por las
observaciones anteriores que consisten en a) un anticuerpo anti-
IFN\gamma neutralizante inhibe notablemente la actividad
sinérgica NGR-TNF/doxorrubicina en los ratones
inmunocompetentes y b) no se produce sinergia en los ratones que
carecen del gen IFN\gamma (ratones IFN\gamma^{-/-}).
\newpage
Ya que los linfocitos T y las células NK son las
fuentes principales del IFN\gamma en los ratones inmunocompetentes
y que los ratones nu/nu atímicos carecen de los linfocitos
T, los resultados anteriores indican de manera convincente que los
linfocitos T son la principal fuente del IFN\gamma necesario para
la actividad NGR-TNF/doxorrubicina. De acuerdo con
este planteamiento está el descubrimiento de que el IFN\gamma
exógeno o endógeno (producido por células tumorales transfectadas
con ADNc de IFN\gamma) restablece la actividad sinérgica
NGR-TNF/doxorrubicina en los ratones
nu/nu.
Estos resultados indican un rol crucial para el
IFN\gamma en el direccionamiento vascular tumoral con
NGR-TNF y la doxorrubicina.
La carencia de los efectos terapéuticos del
IFN\gamma en combinación con la doxorrubicina (sin
NGR-TNF) indica que esta citocina muestra actividad
sinérgica con NGR-TNF, y poca o ninguna con la
doxorrubicina. Considerando que los fármacos quimioterapéuticos
deben atravesar la pared de los vasos y migrar a través del
intersticio para alcanzar las células cancerosas, resulta muy
probable que el sitio de acción de IFN\gamma y
NGR-TNF sea el revestimiento endotelial de los
vasos. Resulta bien conocido que el TNF puede inducir, en las
células endoteliales, la alteración de la actina citoesquelética y
la fomación de los espacios intercelulares que comportan la
permeabilidad aumentada a las macromoléculas. En las mismas células
el TNF puede inducir las moléculas de adhesión leucocitaria, las
citocinas proinflamatorias, el depósito de fibrina, la producción
de óxido nítrico, y la apoptosis. Así, se descubrió que la
permeabilidad in vitro de las monocapas celulares
endoteliales a la peroxidasa de rábano picante fue potenciada
mediante la exposición al TNF en combinación con IFN\gamma en
comparación con el TNF solo. No se puede descartar que, en vista de
los efectos diversos que TNF e IFN\gamma pueden ejercer sobre las
células endoteliales, la alteración de la permeabilidad vascular
in vivo pueda asimismo ser consecuencia de los efectos
indirectos relacionados con la liberación local de otras moléculas
inflamatorias importantes que afectan a la permeabilidad
endotelial.
Estos descubrimientos pueden asimismo presentar
otras implicaciones importantes. Varios estudios en modelos
animales y en pacientes mostraron que el TNF puede afectar y dañar
de manera selectiva a los vasos tumorales, pero no a los vasos
asociados a los tejidos normales. Así, la micro- y macrovasculatura
de los tumores, pero no la del tejido normal, se ha apreciado que
resultan muy dañadas después de que se proporcionara a los pacientes
una perfusión de miembro aislado con TNF en combinación con
melfalán. La base molecular de esta selectividad no está clara. Se
ha planteado como hipótesis que las diferencias estructurales en los
vasos tumorales y/o la presencia de "factores de
sensibilización" derivados de los tumores podrían ser
responsables de la selectividad vascular de TNF. Los presentes
resultados indican que la producción local de IFN\gamma podría ser
uno de esos factores de sensibilización.
Aunque la invención se ha descrito haciendo
referencia a las formas de realización preferidas específicas, debe
apreciarse que la invención reivindicada no está limitada a dichas
formas de realización específicas. De hecho, resultarán evidentes
diversas modificaciones de los modos de poner en práctica la
invención a los expertos en biología molecular o los campos
relacionados que están comprendidas dentro del alcance de las
reivindicaciones siguientes.
1. Carswell, E. A., et al., An
endotoxin-induced serum factor that causes necrosis
of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975.
72:3666-70.
2. Helson, L., et al., Effect of
tumor necrosis factor on cultured human melanoma cells.
Nature 1975. 258:731-732.
3. Tracey, K. J., and A. Cerami.
Tumor necrosis factor, other cytokines and disease. Ann. Rev.
Cell Biol, 1993. 9:317-43.
4. Hoogenboom, H. R., et al.,
Construction and expression of antibody-tumor
necrosis factor fusion proteins. Mol. Immunol. 1991.
28:1027-37.
5. Loetscher, H., et al., Human
tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive
specificity for the 55-kDa or 75kDa TNF receptors.
J. Biol. Chem. 1993. 268:26350-7.
6. Yang, J., et al., A genetically
engineered single-chain FV/TNF molecule possesses
the anti-tumor immunoreactivity of FV as well as the
cytotoxic activity of tumor necrosis factor. Mol. Immunol.
1995. 32:873-81.
7. Van Ostade, X., et al., Human
TNF mutants with selective activity on the p55 receptor.
Nature 1993. 361:266-9.
8. Paganelli, G., et al.,
Three-step monoclonal antibody tumor targeting in
carcinoembryonic antigenpositive patients. Cancer Res.
1991. 51:5960-6.
9. Paganelli, G., et al., Clinical
application of the avidin-biotin system for tumor
targeting. In D. Goldenberg (Ed.Cancer therapy with radiolabeled
antibodies. CRC Press, Boca Raton, 1995. P.
239-253.
10. Modorati, G., et al.,
Immunoscintigraphy with three step monoclonal pretargeting technique
in diagnosis of uveal melanoma: preliminary results. Br. J.
Ophtalm. 1994. 78:19-23.
11. Colombo, P., et al.,
Immunoscintigraphy with anti-chromogranin A
antibodies in patients with endocrine/
neuroendocrine tumors. J. Endocr. Invest. 1993. 16:841-3.
neuroendocrine tumors. J. Endocr. Invest. 1993. 16:841-3.
12. Debs, R. J., et al.,
Liposome-associated tumor necrosis factor retains
bioactivity in the presence of neutralizing
anti-tumor necrosis factor antibodies. J.
Immunol. 1989. 143:1192-7.
13. Debs, R. J., et al.,
Immunomodulatory and toxic effects of free and
liposome-encapsulated tumor necrosis factor alpha in
rats. Cancer Res. 1990. 50:375-80.
14. Moro, M., et al., Tumor cell
targeting with antibody-avidin complexes and
biotinylated tumor necrosis factor alpha. Cancer Res.
1997. 57:1922-8.
15. Schraffordt Koops, et al.,
Hyperthermic isolated limb perfusion with tumour necrosis factor and
melphalan as treatment of locally advanced or recurrent soft tissue
sarcomas of the extremities. Radiothepray & Oncology
1998. 48:1-4.
16. Lienard, D., et al., In
transit metastases of malignant melanoma treated by high dose rTNF
alpha in combination with interferon-gamma and
melphalan in isolation perfusion. World Journal of Surgery
1992. 16:234-40.
17. Hill, S., et al.,
Low-dose tumour necrosis factor alpha and melphalan
in hyperthermic isolated limb perfusion. Br. J. Sugr.
1993. 80:995-7.
18. Eggermont, A. M., et al.,
Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan for
limb salvage in 186 patients with locally advanced soft tissue
extremity sarcomas. The cumulative multicenter European experience.
Ann. Surg. 1996. 224:756-65.
19. Mizuguchi, H., et al., Tumor
necrosis factor alpha-mediated tumor regression by
the in vivo transfer of genes into the artery that leads to
tumor. Cancer Res. 1998.
58:5725-30.
20. Pennica, D., et al., Cloning
and expression in Escherichia coli of the cDNA for murine
tumor necrosis factor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1985.
82:6060-4.
21. Corti, A., et al., Tumor
targeting with biotinylated tumor necrosis factor alpha: Structure
activity relationships and mechanism of action on avidin pretargeted
tumor cells. Cancer Res. 1998.
58:3866-3872.
22. Corti, A., et al.,
Up-regulation of p75 Tumor Necrosis Factor alpha
receptor in Mycobacterium avium-infected mice.
Infect. Immun. 1999, 67:5762-5767.
23. Corti, A., et al., Tumor
necrosis factor (TNF) alpha quantification by ELISA and bioassay:
effects of TNF alphasoluble TNF receptor (p55) complex dissociation
during assay incubations. J. Immunol. Meth. 1994.
177:191-198.
24. Ljunggren, H. G., and K.
Karre. Host resistance directed selectively against
H-2-deficient lymphoma variants.
Analysis of the mechanism. J. Exp. Med. 1985.
162:1745-59.
25. Celik, C., et al.,
Demonstration of immunogenicity with the poorly immunogenic B16
melanoma. Cancer Res. 1983.
43:3507-10.
26. Gasparri, A., et al., Tumor
pretargeting with avidin improves the therapeutic index of
biotinylated tumor necrosis factor alpha in mouse models. Cancer
Res. 1999. 59:2917-23.
27. Palladino, M. A., Jr., et al.,
Characterization of the antitumor activities of human tumor necrosis
factor-alpha and the comparison with other
cytokines: induction of tumor-specific immunity.
J. Immunol. 1987. 138:4023-32.
28. Arap, W., et al., Cancer
treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse
model. Science 1998. 279:377-80.
29. Fiers, W. Biologic therapy with TNF:
preclinical studies. In V. De Vita, S. Hellman, and S. Rosenberg
Eds). Biologic therapy of cancer: principles and practice. J.B.
Lippincott Company, Philadelphia, 1995. P.
295-327.
30. Rathjen, D. A., et al.,
1992. Selective enhancement of the tumour necrotic activity
of TNF alpha with monoclonal antibody. Brit. J. Cancer
65:852.
31. Robert, B., et al.,
1996. Cytokine targeting in tumors using a bispecific
antibody directed against carcinoembryonic antigen and tumor
necrosis factor alpha. Cancer Res. 56:4758.
\newpage
32. Fraker, D.L., Alexander, H.R.
& Pass, H.I., 1995. Biologic therapy with TNF:
systemic administration and isolationperfusion. In Biologic therapy
of cancer: principles and practice, De Vita, V., Hellman, S. &
Rosenberg, S. (eds) páginas 329-345. J.B. Lippincott
Company: Philadelphia.
33. Pennica, D., et al.,
1984. Human tumor necrosis factor: precursor, structure,
expression and homology to lymphotoxin. Nature, 321,
724-729.
34. Curnis, F., Sacchi, A.,
Borgna, L., Magni, F., Gasparri, A., y
Corti, A. (2000). Nat. Biotechnol. 18,
1185-90.
35. Curnis, F., Sacchi, A., y
Corti, A. (2002). Journal of Clinical
Investigation, 110: 475-82.
36. Gasparri, A., Moro, M.,
Curnis, F., Sacchi, A., Pagano, S.,
Veglia, F., Casorati, G., Siccardi, A. G.,
Dellabona, P., y Corti, A. (1999). Cancer
Research 59, 2917-23.
37. Moro, M., Pelagi, M.,
Fulci, G., Paganelli, G., Dellabona, P.,
Casorati, G., Siccardi, A. G., y Corti, A.
(1997).
38. Smith, R. A., y Baglioni, C.
(1987). Journal of Biological Chemistry 262,
6951-4.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Fondazione Centro San Raffaele del
Monte Tabor
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<120> Citocinas modificadas para su
utilización en la terapia del cáncer
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<130> modcyt
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artificial: cebador para PCR
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<400> 7
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Claims (18)
1. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz de un producto de conjugación de TNF y un péptido
que contiene el motivo NGR o un polinucleótido para su codificación,
y una cantidad eficaz de IFN\gamma o un polinucleótido para su
codificación.
2. Composición según la reivindicación 1, junto
con los portadores y los excipientes farmacéuticamente
aceptables.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicho TNF es TNF\alpha o TNF\beta.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho péptido se selecciona de
entre el grupo constituido por CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, ciclo
CVLNGRMEC, CNGRC lineal y CNGRC cíclico.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el TNF está unido al péptido
mediante un espaciador.
6. Composición según la reivindicación 5, en la
que dicho péptido es CNGRC lineal o cíclico y en la que el amino
terminal de TNF está unido a CNGRC mediante el espaciador G.
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el TNF se modifica con
polietilenglicol o un resto acilo.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el TNF está conjugado además
con un compuesto seleccionado de entre el grupo constituido por un
anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y biotina, en la que dicho
anticuerpo o fragmento del mismo está dirigido contra un compuesto
seleccionado de entre el grupo constituido por un antígeno tumoral,
un marcador angiógeno tumoral o un componente de la matriz
extracelular.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que el TNF está conjugado a un péptido que contiene el motivo NGR y
a un compuesto seleccionado de entre el grupo constituido por un
anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y biotina.
10. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en forma de solución o suspensión
inyectable o un líquido para infusiones.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en forma de liposomas.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además otro agente
antitumoral o un compuesto para el diagnóstico por imagen del
tumor.
13. Composición según la reivindicación 12, en
la que el otro agente antitumoral es la doxorrubicina.
14. Utilización de una cantidad eficaz de un
producto de conjugación de TNF y un péptido que contiene el motivo
NGR o un polinucleótido para su codificación, y una cantidad eficaz
de IFN\gamma o un polinucléotido para su codificación, para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento o al
diagnóstico de un paciente de cáncer.
15. Utilización según la reivindicación 14, que
comprende además administrar otros agentes antitumorales o
compuestos para el diagnóstico por imagen del tumor.
16. Utilización según la reivindicación 14 ó 15,
en la que el producto de conjugación es como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9.
17. Productos que comprenden una cantidad eficaz
de un producto de conjugación de TNF y el péptido que contiene el
motivo NGR o un polinucleótido para su codificación, y una cantidad
eficaz de IFN\gamma o un polinucleótido para su codificación, para
su utilización terapéutica en administración combinada, separada o
secuencial.
18. Productos para su utilización según la
reivindicación 17, en los que el producto de conjugación es como se
ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7612194B2 (en) * | 2001-07-24 | 2009-11-03 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof |
| GB0209896D0 (en) | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| GB0209893D0 (en) * | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| GB0312309D0 (en) * | 2003-05-29 | 2003-07-02 | Gaslini Children S Hospital G | Targeted liposome |
| JP2008525424A (ja) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | モルメド エスピーエー | 複合生成物 |
| GB0803076D0 (en) * | 2008-02-20 | 2008-03-26 | Univ Ghent | Mucosal Membrane Receptor and uses thereof |
| AU2009248105B2 (en) * | 2008-05-13 | 2013-10-31 | Molmed S.P.A. | Conjugates for the treatment of mesothelioma |
| CN111592601A (zh) * | 2011-07-06 | 2020-08-28 | 江苏靶标生物医药研究所有限公司 | 一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用 |
| JP7608336B2 (ja) | 2018-11-30 | 2025-01-06 | フォンダッツィオーネ・セントロ・サン・ラッファエーレ | 中枢神経系原発リンパ腫の併用治療 |
| EP3882257A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-22 | Ospedale San Raffaele S.r.l. | Ngr conjugates and uses thereof |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3423234A1 (de) | 1984-06-23 | 1986-02-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor |
| US4650674A (en) | 1984-07-05 | 1987-03-17 | Genentech, Inc. | Synergistic cytotoxic composition |
| US4863713A (en) | 1986-06-23 | 1989-09-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. | Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents |
| IT1245748B (it) | 1990-12-21 | 1994-10-14 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Preparazione includente anticorpi monoclonali biotinilati, avidina e biotina, per la diagnosi di affezioni tumorali e suo impiego |
| US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5258517A (en) | 1992-08-06 | 1993-11-02 | Sepracor, Inc. | Method of preparing optically pure precursors of paroxetine |
| EP1346730A1 (en) | 1993-12-07 | 2003-09-24 | Neorx Corporation | Pretargeting methods and novel pretargeting conjugates |
| US5888814A (en) | 1994-06-06 | 1999-03-30 | Chiron Corporation | Recombinant host cells encoding TNF proteins |
| US5811388A (en) * | 1995-06-07 | 1998-09-22 | Cibus Pharmaceutical, Inc. | Delivery of drugs to the lower GI tract |
| EP0927045B1 (en) | 1996-09-10 | 2005-12-14 | The Burnham Institute | Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same |
| US6576239B1 (en) * | 1996-09-10 | 2003-06-10 | The Burnham Institute | Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom |
| US6759509B1 (en) | 1996-11-05 | 2004-07-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Branched peptide linkers |
| WO1999013329A1 (en) | 1997-09-10 | 1999-03-18 | The Burnham Institute | Methods of identifying molecules that home to angiogenic vasculature in tumors |
| US6180084B1 (en) | 1998-08-25 | 2001-01-30 | The Burnham Institute | NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same |
| IT1317835B1 (it) | 2000-02-15 | 2003-07-15 | San Raffaele Centro Fond | Citochine modificate per uso nella terapia del cancro. |
-
2003
- 2003-04-30 US US10/426,019 patent/US7109303B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-05 AT AT03775680T patent/ATE431742T1/de not_active IP Right Cessation
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-
2006
- 2006-01-25 US US11/338,842 patent/US7622105B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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