ES2326535T3 - Fragmento de adn que contiene el gen biotina biosintetasa y utilizacion del mismo. - Google Patents
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Abstract
Un fragmento de ADN que contiene un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 2, 7, 11, 15 o 21, en el que dicho fragmento se puede obtener del microorganismo Sphingomonas sp.
Description
Fragmento de ADN que contiene el gen biotina
biosintetasa y utilización del mismo.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a un fragmento
de ADN que contiene un gen implicado en la biosíntesis de biotina, y
a su utilización.
La biotina es una vitamina esencial para los
seres humanos, animales, plantas y algunos microorganismos, y es
útil como aditivo alimentario para seres humanos o animales. Como
proceso para producir biotina usando microorganismos, es conocido
un proceso que usa un Streptomyces o una Micromonospora (documento
JP-B-41-21756), un
proceso que usa un Sporobolomyces (documento
JP-B-42-3074), un
proceso que usa un Bacillus, un Chromobacterium o un Pseudomonas
(documento
JP-A-56-160998), un
proceso que utiliza un Sphingomonas (documento
JP-A-6-133790),
etc. También se han propuesto procedimientos para mejorar un
microorganismo, en los que un gen implicado en la biosíntesis de
biotina, y aislado de un microorganismo capaz de producir biotina,
se introduce en otro microorganismo mediante una técnica de
ingeniería genética para favorecer la expresión del gen implicado en
la biosíntesis de biotina, con lo que se incrementa la actividad de
una enzima capaz de catalizar la reacción de biosíntesis de
biotina, para incrementar la productividad de biotina (documentos
JP-A-61-202686,
JP-A-2-27980,
JP-A-7-231789,
etc.).
Como genes implicados en la biosíntesis de
biotina en células de microorganismos, se conocen los genes bio A,
bio B, bio F, bio D, bio C y bio H, derivados de Escherichia
coli (Journal of Biological Chemistry, vol. 263,
19577-19585 (1988)). El gen bio A codifica una
enzima que tiene actividad
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa.
El gen bio B codifica una enzima que tiene actividad
biotina-sintetasa. El gen bio F codifica una enzima
que tiene actividad
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa.
El gen bio D codifica una enzima que tiene actividad
destiobiotina-sintetasa. El gen bio C participa en
una etapa de biosíntesis aguas arriba respecto a la
pimelil-Co-A, en la ruta
biosintética de la biotina. La acción del gen bio H no está clara.
En la ruta biosintética en Escherichia coli, la pimelil
Co-A intracelular se convierte en ácido
7-ceto-8-aminopelargónico
mediante la
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
este ácido
7-ceto-8-aminopelargónico
se convierte en ácido diaminopelargónico mediante la
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
este ácido diaminopelargónico se convierte en destiobiotina
mediante destiobiotina-sintetasa, esta destiobiotina
se convierte en biotina mediante biotina-sintetasa,
con lo que se sintetiza biotina. Cuando el gen bio C se deleciona,
la cantidad de biotina producida se reduce. Por tanto, se considera
que el gen bio C codifica una enzima que tiene actividad para
catalizar una reacción en una etapa de biosíntesis aguas arriba
respecto a la pimelil-Co-A
("Fermentation and Industry", 46, 102-111
(1988)). Las secuencias básicas de los genes de bio A, bio B, bio
F, bio D, bio C y bio H, derivados de Escherichia coli, ya se
han descrito. Se sabe que los genes bio A, bio B, bio F, bio D y
bio C forman un operón, cuya transcripción se controla mediante un
operador.
Como genes implicados en la biosíntesis de
biotina, y derivados de microorganismos que pertenecen a otros
géneros distintos del género Escherichia, se han descrito genes
derivados de Serratia marcescens (Nº de acceso de la base de
datos GenBank D17468) y genes derivados de Bacillus subtilis
(documento
JP-A-7-231789). Se
ha descrito la secuencia básica de cada uno de estos genes. Se sabe
que, aunque las secuencias básicas de estos genes son diferentes de
las de los genes de Escherichia coli, las funciones de los
productos génicos y la ruta biosintética en el caso de los primeros
genes son sustancialmente las mismas que en el caso de los últimos
genes (Escherichia coli). Por otra parte, se han descrito
genes implicados en la biosíntesis de biotina y derivados de
Bacillus sphaericus (Ohsawa et al., Gene 80,
39-48 (1989), Gloeckler et al., Gene 87,
63-70 (1990)). Los genes de Bacillus
sphaericus son distintos de los de Escherichia coli en
los siguientes aspectos: genes implicados en una etapa de
biosíntesis aguas arriba respecto a la
pimelil-Co-A, el orden y la
formación de agrupaciones de biogenes, etc. (Gloeckler et
al., Gene 87, 63-70 (1990)).
Sin embargo, en lo que respecta a genes
implicados en la biosíntesis de biotina y derivados de un
microorganimso perteneciente al género Sphingomonas, sus secuencias
básicas y su estructura o las funciones de sus productos génicos,
no se conoce nada. Por tanto, no ha existido ninguna técnica para
utilizar un gen implicado en la biosíntesis de biotina y derivado
de un microorganismo perteneciente al género Sphingomonas, para
mejorar un microorganismo productor de biotina mediante ingeniería
genética.
En tales circunstancias, los presentes
inventores investigaron afanosamente y, consecuentemente,
descubrieron que se pueden preparar transformantes usados para
producir biotina o un precursor de biotina, aislando un fragmento
de ADN que contiene un gen implicado en la biosíntesis de biotina de
un microorganismo perteneciente al género Sphingomonas, insertando
el fragmento de ADN en un vector y, a continuación, introduciendo el
vector en células hospedadoras. Por tanto, se ha conseguido la
presente invención.
La presente invención proporciona lo
siguiente:
- (1)
- Un fragmento de ADN que contiene un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 2, 7, 11, 15 o 21, en la que dicho fragmento de ADN se puede obtener del microorganismo Sphingomonas sp.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (2)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho gen se selecciona del grupo formado por un gen de 7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa, un gen de 7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa, un gen de destiobiotina-sintetasa, y un gen de biotina-sintetasa.
- (3)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho gen es un gen que codifica 7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa, y que tiene la secuencia básica de ácido nucleico representada como SEQ ID NO: 4 ó 5.
- (4)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 2, y que tiene actividad 7-ceto-8-aminopelargonato sintetasa.
- (5)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho gen es un gen que codifica 7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa y que tiene la secuencia básica de ácido nucleico representada como SEQ ID NO: 9.
- (6)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 7, que tiene actividad 7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa.
- (7)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho gen es un gen que codifica destiobiotina-sintetasa y que tiene la secuencia básica de ácido nucleico representada como SEQ ID NO: 13.
- (8)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 11 y tiene actividad destiobiotina-sintetasa.
- (9)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho gen es un gen que codifica biotina-sintetasa y tiene la secuencia básica de ácido nucleico representada como SEQ ID NO: 17.
- (10)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 15, que tiene actividad biotina-sintetasa.
- (11)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho gen es un gen 7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa, un gen 7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa, un gen destiobiotina-sintetasa o un gen biotina-sintetasa.
- (12)
- El fragmento de ADN del punto (1), en el que dicho fragmento comprende adicionalmente una región reguladora de la expresión de un gen.
- (13)
- El fragmento de ADN del punto (12), en el que dicho gen es un gen 7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa, un gen 7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa, un gen destiobiotina-sintetasa o un gen biotina-sintetasa.
- (14)
- Un fragmento de ADN que tiene la secuencia básica representada como SEQ ID NO: 25, que se puede obtener del microorganismo Sphingomonas sp.
- (15)
- El fragmento de ADN de uno cualquiera de los puntos (1) a (14), en el que el microorganismo es Sphingomonas sp SC42405.
- (16)
- Un vector que contiene el fragmento de ADN de uno cualquiera de los puntos (1) a (15).
- (17)
- Un método de preparación de un vector que comprende insertar el fragmento de ADN de uno cualquiera de los puntos (1) a (15) en un vector replicable en células hospedadoras.
- (18)
- El vector del punto (16), en el que una región reguladora de la expresión génica está unida aguas arriba respecto de una región codificadora de una proteína.
- (19)
- Un transformante no humano, que contiene al menos el fragmento de ADN de uno cualquiera de los puntos (1) a (15), o al menos un vector según los puntos (16) o (18), introducido en una célula hospedadora.
- (20)
- El transformante del punto (19), en el que la célula hospedadora es un microorganismo.
- (21)
- Un método de preparación de transformantes no humanos, que comprende introducir el vector del punto (16) o (18) en una célula hospedadora.
- (22)
- Una proteína codificada por un fragmento de ADN de uno cualquiera de los puntos (1) a (15), que tiene actividad 7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa, 7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa, destiobiotina-sintetasa o biotina-sintetasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pJA\beta2.
La Fig. 2 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pJAW.
La Fig. 3 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pJA41.
La Fig. 4 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pSP302.
La Fig. 5 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pSP304.
La Fig. 6 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pSS301.
La Fig. 7 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pSS305.
La Fig. 8 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pSS304.
La Fig. 9 muestra la estructura y el mapa de
restricción del plásmido pSS306.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente descripción, el gen implicado en
la biosíntesis de biotina y derivado de un microorganismo
perteneciente al género Sphingomonas, se refiere a un gen que
codifica una enzima implicada en la biosíntesis de biotina en
células del microorganismo perteneciente al género Sphingomonas.
Dicho gen incluye, por ejemplo, un gen de
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa
(a partir de aquí denominado "el gen bio F de la presente
invención"), un gen de
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa
(a partir de aquí denominado "el gen bio A de la presente
invención"), un gen de destiobiotina-sintetasa (a
partir de aquí denominado "el gen bio D de la presente invención)
y un gen de biotina-sintetasa (a partir de aquí
denominado "el gen bio B de la presente invención). En la
invención se describe además un gen que codifica una enzima que
tiene actividad para catalizar una reacción en una etapa de
biosíntesis aguas arriba respecto a la
pimelil-Co-A, en la ruta
biosintética de la biotina (denominado a partir de aquí "el
gen bio C").
El gen bio F de la presente invención es un gen
que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID NO: 2, que tiene actividad
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa;
y tiene la secuencia básica representada como SEQ ID NO: 4 ó 5.
El gen bio A de la presente invención es un gen
que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID NO: 7, que tiene actividad
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa;
y tiene la secuencia básica representada como SEQ ID NO: 9.
El gen bio D de la presente invención es un gen
que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID NO: 11, que tiene actividad
destiobiotina-sintetasa; y tiene la secuencia básica
mostrada como SEQ ID NO: 13.
El gen bio B de la presente invención es un gen
que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID Nº: 15, que tiene actividad
biotina-sintetasa, y tiene la secuencia básica
representada como SEQ ID Nº: 17.
La presente invención describe adicionalmente
genes bio F que codifican
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
que derivan de microorganismos pertenecientes al género
Sphingomonas, y que son genes que codifican una proteína que tiene
una secuencia de aminoácidos formada por deleción, sustitución,
modificación o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, y que tiene actividad
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa.
La presente invención describe adicionalmente
genes bio A que codifican
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
que derivan de microorganismos pertenecientes al género
Sphingomonas, y que son genes que codifican una proteína que tiene
una secuencia de aminoácidos formada por deleción, sustitución,
modificación o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de
aminoácidos representada como SEQ ID NO: 7, y que tiene actividad
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa.
También se describen en la invención genes bio
D, que codifican para destiobiotina-sintetasa, que
derivan de microorganismos pertenecientes al género Sphingomonas, y
que son genes que codifican una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos formada por deleción, sustitución, modificación o
adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID NO: 11, y que tiene actividad
destiobiotina-sintetasa.
\newpage
En la presente invención se describen
adicionalmente genes bio B que codifican
biotina-sintetasa, que derivan de microorganismos
pertenecientes al género Sphingomonas, y que son genes que codifican
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos formada por
deleción, sustitución, modificación o adición de uno o más
aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID
NO: 15, y que tienen actividad
biotina-sintetasa.
Adicionalmente, en la invención se describe un
gen bio C que incluye, por ejemplo, genes que contienen una región
de aproximadamente 0,8-0,9 kpb, que codifica una
enzima que tiene actividad para catalizar una reacción en una etapa
de biosíntesis aguas arriba respecto a
pimelil-Co-A en la ruta biosintética
de la biotina, los cuales derivan de microorganismos pertenecientes
al género Sphingomonas. Ejemplos más específicos de los mismos son
genes que codifican una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos representada como SEQ ID NO: 20 ó 21, o una secuencia
de aminoácidos formada por deleción, sustitución, modificación o
adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID NO: 20 ó 21, y que tiene actividad para
catalizar una reacción en una etapa de biosíntesis aguas arriba
respecto a la pimelil Co-A, en la ruta biosintética
de la biotina; y genes que codifican una enzima que tiene actividad
para catalizar una reacción en una etapa de biosíntesis aguas
arriba respecto a la pimelil-Co-A en
la ruta biosintética de la biotina, que tiene la secuencia básica
representada como SEQ ID NO: 22 ó 23.
La invención describe adicionalmente un
microorganismo usado para aislar a partir del mismo cualquiera de
los genes bio F, bio A, bio D y bio B, así como el gen bio C, que
puede ser, bien una cepa aislada de la naturaleza, bien una cepa
obtenida mediante introducción de una mutación en dicha cepa
aislada, siempre que sea una bacteria productora de biotina
perteneciente al género Sphingomonas, es decir, que tenga un gen
implicado en la biosíntesis de biotina. Dicho microorganismo
incluye, por ejemplo, la cepa Sphingomonas sp. SC42405,
descrita en el documento
JP-A-133790. Adicionalmente, se
describe aquí la cepa Sphingomonas paucimobilis JCM7511, que
se almacena en estado susceptible de distribución en los
dispositivos de almacenamiento de líneas biológicas del Institute
of Physical and Chemical Research. La cepa de Sphingomonas
sp. SC42405 está depositada bajo el Tratado de Budapest como
FERM-BP3995 (nº de acceso) (fecha de depósito: 3 de
Septiembre de 1992) en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry
(1-3,
Higashi-1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) y se ha descrito en la
Patente de EE.UU. 5.432.067.
A continuación se proporciona un ejemplo de
método para preparar un fragmento de ADN que contiene un gen
implicado en la biosíntesis de biotina, procedente de una bacteria
productora de biotina perteneciente al género Sphingomonas.
En primer lugar, se aisla el ADN genómico de un
microorganismo perteneciente al género Sphingomonas, por ejemplo,
mediante el método de extracción convencional de ADN genómico
descrito en Biochemica. Biophysica. Acta., vol. 72,
619-629 (1963), etc. El ADN genómico aislado se
escinde parcialmente con una enzima de restricción adecuada como
Sau eAI, y los fragmentos de ADN así obtenidos se insertan en un
vector adecuado, para preparar una genoteca de ADN. Como vector
usado en este caso, se puede usar cualquier vector, con tal de que
pueda proliferar y replicarse en una cepa en la que se introduzca
la genoteca de ADN. El vector incluye, por ejemplo, plásmidos,
bacteriófagos y cósmidos.
Como método para identificar y aislar un gen
implicado en la biosíntesis de biotina de la genoteca de ADN
genómico así preparada, se puede mencionar un método de introducción
de la genoteca de ADN en un mutante de deleción génica que carece
de un gen implicado en la biosíntesis de biotina y tiene
requerimientos de biotina, y seleccionar una cepa que posea
productividad de biotina recuperada, a partir de los transformantes
obtenidos. Como mutante que requiere biotina usado en este método,
se puede usar cualquier cepa, siempre que los fragmentos de ADN
genómico del microorganismo del género Sphingomonas introducidos en
la misma se puedan expresar en células de dicha cepa. Tal mutante
se puede preparar, por ejemplo, mediante el método convencional
descrito, por ejemplo, en Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA, vol. 69, 2219 (1972), Journal of Bacteriology, vol.
115, 662 (1973), etc. Como método para introducir la genoteca de ADN
en el mutante que requiere biotina, se pueden mencionar métodos
convencionales, como un método de tratamiento de células con cloruro
cálcico (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)), método de electroporación (Current
Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons. Inc.
ISBNO-471-50338-X
(1987)), etc.
Los transformantes obtenidos del mutante que
requiere biotina se cultivan en un medio selectivo adecuado que no
contiene biotina, y se seleccionan los transformantes que han
crecido. Los transformantes así seleccionados son candidatos de
cepas que retienen el vector que tiene como inserto el fragmento de
ADN que contiene un gen implicado en la biosíntesis de biotina y
derivado del microorganismo perteneciente al género
Sphingomonas.
Por ejemplo, cuando el vector es un plásmido o
un cósmido, el vector recombinante se extrae de los transformantes
mencionados anteriormente, mediante un método convencional como el
método de lisis alcalina o el método de ebullición (Molecular
Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
Cuando el vector es un bacteriófago, el vector recombinante se
extrae de los transformantes mediante un método convencional, como
un método que usa centrifugación en gradiente de densidad o
cromatografía de intercambio iónico (Current Protocols in Molecular
Biology, vol. 1, John Wiley & Sons. Inc.
ISBNO-471-50338-X
(1987)). La secuencia básica del vector recombinante extraído se
analiza mediante el método de Sanger de terminación de cadena
mediado por didesoxi (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)). Así se puede determinar la
secuencia básica del fragmento de ADN insertado en el vector.
Cuando se selecciona una región que codifica una
proteína y tiene una secuencia básica con elevada homología con
cada gen conocido descrito anteriormente, a partir de marcos de
lectura abiertos de 500 pb o más, que se encuentran en la secuencia
básica determinada, se puede especificar como un gen implicado en la
biosíntesis de biotina de la bacteria del género Sphingomonas;
cuando el fragmento de ADN es el obtenido usando un mutante de
deleción bio F, el gen es un gen de bio F conocido; cuando el
fragmento de ADN es el obtenido usando un mutante de deleción bio
A, el gen es un gen de bio A conocido; cuando el fragmento de ADN es
el obtenido usando un mutante de deleción bio D, el gen es un gen
de bio D conocido; cuando el fragmento de ADN es el obtenido usando
un mutante de deleción bio B, el gen es un gen de bio B conocido; y
cuando el fragmento de ADN es el obtenido usando un mutante de
deleción bio C, el gen es un gen de bio C conocido. Lo siguiente
también es posible. Cada región codificadora se escinde con enzimas
de restricción adecuadas y se preparan subclones que incluyen cada
región codificadora. Cada subclon se introduce en un mutante de
deleción génica como sigue: cuando el subclon es el del fragmento
de ADN obtenido usando un mutante de deleción de bio F, se introduce
en un mutante de deleción de bio F; cuando el subclon es el del
fragmento de ADN obtenido usando un mutante de deleción de bio A,
se introduce en un mutante de deleción de bio A; cuando el subclon
es el del fragmento de ADN obtenido usando un mutante de deleción
de bio D, se introduce en un mutante de deleción de bio D; cuando
el subclon es el del fragmento de ADN obtenido usando un mutante de
deleción de bio B, se introduce en un mutante de deleción de bio B;
y cuando el subclon es el del fragmento de ADN obtenido usando un
mutante de deleción de bio C, se introduce en un mutante de
deleción de bio C. Se investiga el crecimiento del mutante que
tiene el gen así introducido en su interior, sobre un medio
selectivo que no contiene biotina, con lo que se especifica la
región codificadora incluida en el subclon retenido por el mutante
que se ha transformado en cultivable, como un gen implicado en la
biosíntesis de biotina de la bacteria del género Sphingomonas.
Adicionalmente, el gen deseado así obtenido se
puede mejorar en su función, por ejemplo, mediante el método
convencional de introducción de mutaciones descrito en Molecular
Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989),
etc. Se puede introducir una mutación en cualquier gen que participe
en la biosíntesis de biotina. Para incrementar la productividad de
biotina, es particularmente efectivo introducir una mutación en un
gen bio B que codifica una biotina-sintetasa,
susceptible de catalizar la conversión de
destio-biotina en biotina, que es, a menudo, una
etapa determinante de la velocidad en la vía biosintética de la
biotina. La mutación a introducir puede ser una mutación en una
región que codifique una proteína que incremente la actividad
enzimática o mejore la estabilidad de la proteína, o una mutación
en una región reguladora de la expresión génica que favorezca la
expresión génica. El gen que tiene la mutación introducida en su
seno, se expresa mediante su introducción en un mutante de deleción
génica que tiene requerimiento de biotina, según se describió
anteriormente, y su capacidad para complementar la deleción génica
se compara con la del gen de tipo silvestre. De este modo, es
posible seleccionar un gen mutante que puede contribuir a la mejora
de la productividad de biotina. El gen mutante que puede contribuir
a la mejora de la productividad de biotina se puede seleccionar
también expresando el gen que tiene la mutación introducida en su
seno en un microorganismo, y comparando la cantidad producida de
una enzima codificada por el gen introducido, la actividad
enzimática, la cantidad de un compuesto producido mediante una
reacción catalizada por dicha enzima, o similares, con los
producidos en el caso de utilización del gen de tipo silvestre. La
actividad de una enzima que tiene actividad para catalizar una
reacción en una etapa de biosíntesis aguas arriba respecto a la
pimelil-Co-A en la vía biosintética
de la biotina,
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa
y destiobiotina-sintetasa, se puede medir, por
ejemplo, mediante el método descrito en Y. Izumi et al.,
Methods in Enzymology, vol. 62, 326-338 (1979), etc.
La actividad de la biotina-sintetasa se puede
medir, por ejemplo, mediante el método descrito en I. Sanyal et
al., Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 326,
48-56 (1996), A. Mejean et al., Biochemical
and Biophysical Research Communications, vol. 217,
1231-1237 (1995), etc.
Un ejemplo específico del gen mencionado
anteriormente, que tiene una mutación introducida en su seno, es un
gen biotina-sintetasa, que tiene la secuencia básica
representada como SEQ ID NO: 19. En este gen, cuando la A del codón
de iniciación (ATG) se toma como la primera base, la base 57 y la
706 son sustituyentes, en comparación con el gen de la biotina
sintetasa que tiene la secuencia básica representada como SEQ ID NO:
16. Como gen que tiene una mutación introducida en su seno, también
se puede ejemplificar un gen
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
que tiene la secuencia básica representada como SEQ ID NO: 5. En
este gen, cuando la A del codón de iniciación (ATG) se toma como la
primera base, la base 11 es un sustituyente, en comparación con un
gen de
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa
que tiene la secuencia básica representada como SEQ ID NO: 4.
En la presente descripción, el término
"fragmento de ADN que contiene al menos un gen implicado en la
biosíntesis de biotina y derivado de un microorganimso
perteneciente al género Sphingomonas" significa un fragmento de
ADN que contiene al menos un gen que codifica una enzima implicada
en la biosíntesis de biotina en células de un microorganismo
perteneciente al género Sphingomonas. Dicho fragmento de ADN puede
ser, bien un fragmento de ADN aislado de un microorganismo de la
forma indicada anteriormente, o un fragmento de ADN preparado
ligando genes que codifican una enzima que participa en la
biosíntesis de biotina que derivan de diversas cepas de
microorganismos, o genes obtenidos introduciendo una mutación en el
gen citado anteriormente.
En la presente invención, se describe además un
fragmento de ADN que tiene una secuencia básica parcial de un gen
implicado en la biosíntesis de biotina y derivado de un
micororganismo perteneciente al género Sphingomonas. Dicho
fragmento de ADN es útil, por ejemplo, como sonda usada en un método
de hibridación, o cebador usado en un método de PCR. Cuando el
fragmento de ADN se emplea como cebador usado en un método de PCR,
su número de bases es preferiblemente grande en general, para
asegurar la especificidad de la hibridación. Por otra parte, con un
incremento del número de bases, el propio cebador adquiere una
estructura de orden mayor durante las reacciones PCR, de forma que
la eficiencia de la hibridación se reduce en algunos casos. Por
tanto, se requieren operaciones complejas para la purificación
después de la síntesis. Cuando se considera tal desventaja, el
número de bases es preferiblemente no demasiado grande. Normalmente,
es preferible un fragmento génico compuesto por ADN monohebra que
no tenga más de 50 y no menos de 15 bases. Ejemplos específicos de
tal fragmento de ADN son fragmentos de ADN que tienen cualquiera de
las secuencias básicas de los cebadores BF, BR, BF1, BR1, C1 y C6
mostrados en la Tabla 1, y fragmentos de ADN que tienen las
secuencias básicas de los cebadores BF4, BR4, F2, F3, CDA1, CDA6,
CDA3 y CDA7, mostrados en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen implicado en la biosíntesis de biotina y
derivado de un microorganismo perteneciente al género Sphingomonas,
contiene una región que codifica una proteína y una región
reguladora de la expresión génica aguas arriba o aguas abajo
respecto a la misma.
Se puede usar un fragmento de ADN compuesto por
la región codificadora de una proteína del gen implicado en la
biosíntesis de biotina y derivado de un microorganismo perteneciente
al género Sphingomonas, por ejemplo, en una etapa de unión de la
región citada anteriormente a un promotor capaz de funcionar en
células hospedadoras, en la construcción de un vector para la
expresión del gen en las células hospedadoras.
La región reguladora de la expresión génica se
refiere a una región de decenas a centenares de pares de bases, que
está localizada aguas arriba o aguas abajo respecto a la región que
codifica una proteína, y tiene una influencia importante sobre la
regulación de la expresión génica para la proteína. En particular,
un promotor localizado aguas arriba respecto a la región que
codifica la proteína, es una región reguladora de la expresión
génica importante. Ejemplos específicos de la región reguladora de
la expresión génica son una región que tiene una secuencia básica
desde la base 222 a la primera base, en caso de tomar la A del codón
de iniciación (ATG) como primera base en la SEQ ID NO: 16, y una
región que tiene una secuencia básica desde la base 201 hasta la
primera base, en caso de tomar la A del codón de iniciación (ATG)
como primera base en la SEQ ID NO: 4.
La región reguladora de la expresión génica se
especifica, por ejemplo, introduciendo una mutación, como una
mutación puntual, deleción o inserción en secuencias básicas, antes
y después de la región que codifica una proteína del gen implicado
en la biosíntesis de biotina y derivado de un microorganismo
perteneciente al género Sphingomonas, expresando dicho gen en un
microorganismo, midiendo la cantidad producida de la enzima
codificada por dicho gen, la actividad enzimática, la cantidad de
un compuesto producido por una reacción catalizada por la enzima, o
similar, y encontrando una región en la que la introducción de la
mutación cambie notablemente el valor medido. También es posible
realizar el mismo experimento anterior, excepto porque se usa un gen
que codifica una proteína que permite la medición sencilla de la
cantidad anterior o de la actividad enzimática, en la zona de la
región que codifica una proteína para el gen mencionado
anteriormente. La región reguladora de la expresión génica se puede
obtener especificándola mediante el método anterior.
La región reguladora de la expresión génica
obtenida se puede modificar para obtener una región reguladora de
la expresión génica que permita un mayor grado de expresión génica,
introduciendo una mutación, como una sustitución, deleción o
inserción, por ejemplo, mediante un método de PCR según se describió
anteriormente. También es posible obtener una región reguladora de
la expresión génica que permita un grado elevado de expresión
génica, aislando un gen de un mutante capaz de producir una cantidad
incrementada de una proteína deseada, o una actividad enzimática
incrementada debida a la mutación, o similares. Como tal región
reguladora de la expresión génica, se pueden mencionar regiones
reguladoras de la expresión génica que tiene secuencias básicas
representadas como secuencias n^{os} 24 y 25, respectivamente.
Se puede usar un fragmento de ADN compuesto por
la región reguladora de la expresión génica mencionada anteriormente
del gen implicado en la biosíntesis de biotina y derivado de un
microorganismo perteneciente al género Sphingomonas, por ejemplo,
para construir un vector destinado a expresar el gen en un
microorganismo perteneciente al género Sphingomonas.
El fragmento de ADN así obtenido, que contiene
el gen implicado en la biosíntesis de biotina y derivado de un
microorganismo perteneciente al género Sphingomonas, o una secuencia
básica parcial de dicho gen, se inserta en un vector replicable en
células hospedadoras, con lo que se puede construir un vector para
introducir dicho gen o una de sus partes en las células
hospedadoras. Además, la región reguladora de la expresión génica se
une aguas arriba respecto a la región que codifica una proteína del
gen mencionado anteriormente, seguido por inserción en un vector,
con lo que se puede construir un vector para expresar dicho gen en
células hospedadoras.
Como fragmento de ADN usado en este caso, se
pueden mencionar fragmentos de ADN obtenidos mediante escisión
previa hasta un tamaño adecuado de un fragmento de ADN que contiene
un gen implicado en la biosíntesis de biotina y derivado de un
microorganismo perteneciente al género Sphingomonas, que se obtiene
de la forma descrita anteriormente, con enzimas de restricción
adecuadas para facilitar la unión del fragmento de ADN con un
vector; y fragmentos de ADN obtenidos introduciendo un sitio de
restricción arbitrario en cada extremo del gen implicado en la
biosíntesis de biotina, mediante PCR, en el caso de que no esté
presente ningún sitio de restricción adecuado.
Como gen destinado a insertarse en un vector, es
suficiente que se use al menos un gen seleccionado del grupo
formado por los genes bio F, bio A, bio D, bio B y bio C, descritos
con más detalle en la presente invención. Por ejemplo, todos o
algunos de los genes anteriores se pueden insertar en un vector.
Además, diversos genes específicos se pueden insertar para
incrementar una actividad enzimática específica. Si es necesario, se
pueden insertar en el mismo vector genes marcadores selectivos,
como genes resistentes a fármacos, útiles para la selección de
transformantes descritos más adelante en la invención, y ADNs
genómicos utilizables para la recombinación homóloga con los genomas
de las células hospedadoras, junto con el gen o genes mencionados
anteriormente.
Como región reguladora de la expresión génica
destinada a unirse aguas arriba respecto a la región que codifica
una proteína, se puede usar cualquier secuencia básica, a condición
de que tenga una función reguladora de la expresión génica en
células hospedadoras. Por ejemplo, cuando las células hospedadoras
son células de un microorganismo perteneciente al género
Sphingomonas, se pueden mencionar la región reguladora de la
expresión génica de un gen implicado en la biosíntesis de biotina y
derivada de un microorganismo perteneciente al género Sphingomonas,
como se describió anteriormente. Cuando las células hospedadoras son
células de E. coli, se pueden utilizar promotores
disponibles en el comercio, que tienen actividad reguladora de la
expresión génica en E. coli.
Como vector en el cual se inserta el fragmento
de ADN, se puede usar cualquier vector, a condición de que sea
replicable en células hospedadoras, por ejemplo, en células de
microorganismo. Por ejemplo, cuando las células hospedadoras son
células de un microorganismo perteneciente al género Sphingomonas,
se pueden usar RK2 clasificadas en el grupo P de plásmidos
incompatibles, y vectores plasmídicos derivados de RK2 (Plasmids,
vol. 13, 149-153 (1985), Journal of Bacteriology,
vol. 167, 604-610 (1986)), RSF1010 clasificado en el
grupo Q de plásmidos incompatibles, y vectores plasmídicos
derivados de RSF1010 (Gene, vol. 16, 237-247
(1981)), etc. Cuando las células hospedadoras son células de E.
coli, se pueden utilizar plásmidos, fagos y similares,
disponibles en el comercio, que son replicables en E.
coli.
Se pueden preparar transformantes introduciendo
el vector así construido, que contiene en gen implicado en la
biosíntesis de biotina, por ejemplo, células de microorganismo
hospedador.
Las células hospedadoras en las que se introduce
el gen implicado en la biosíntesis de biotina no están
particularmente limitadas, a condición que el fragmento de ADN
introducido se mantenga en ellas de forma estable y el gen se
exprese en ellas. Como células hospedadoras se pueden mencionar
células de microorganismos pertenecientes al género Sphingomonas,
E. coli, etc.
Como método para introducir el vector en células
hospedadoras, se puede emplear un método de ingeniería genética
convencional. Por ejemplo, como método para introducir el vector en
un microorganismo hospedador, se pueden mencionar métodos
convencionales como un método de tratamiento de las células con
cloruro cálcico (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)), método de electroporación (Current
Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons Inc.
ISBNO-471-50338-X
(1987)), etc. También se puede emplear un método de introducción de
genes, en el que un fragmento de ADN deseado se introduce en los
genomas de células hospedadoras utilizando la recombinación
homóloga. Por ejemplo, un fragmento de ADN genómico derivado de
células hospedadoras se une a cada extremo del fragmento de ADN que
contiene el gen implicado en la biosíntesis de biotina y los
fragmentos unidos se insertan en un vector, tras lo cual el vector
se introduce en células hospedadoras. Cuando se produce la
recombinación homóloga entre el ADN genómico en el vector y el ADN
genómico de las células hospeddoras, el fragmento de ADN que
contiene el gen implicado en la biosíntesis de biotina se introduce
en los genomas de las células hospedadoras para producir
transformantes.
El microorganismo transformado, obtenido
mediante introducción del fragmento de ADN que contiene el gen
implicado en la biosíntesis de biotina, de la forma descrita
anteriormente, se puede seleccionar eficientemente basándose en el
fenotipo de un gen marcador selectivo contenido en el vector e
introducido en las células hospedadoras junto con el gen. Por
ejemplo, cuando el gen marcador es un gen de resistencia a
ampicilina, las células se siembran en estrías sobre un medio de
nutrientes adecuado que contiene ampicilina, después de la
introducción del gen, y las colonias desarrolladas se separan
mediante un método de enganche, con lo que se pueden obtener los
transformantes. Por tanto, se pueden obtener los transformantes que
tienen como fragmento de ADN introducido, el fragmento de ADN que
contiene el gen implicado en la biosíntesis de biotina. Los
transformantes se pueden utilizar para producir biotina y ácido
7-ceto-8-aminopelargónico,
ácido 7,8-diaminopelargónico y destiobiotina, que
son precursores de la biosíntesis de biotina.
La presente invención se explica más adelante
con más detalle con referencia a los Ejemplos, pero no está limitada
por los mismos.
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Se inoculó un asa de Sphingomonas
paucimobilis JCM7511 en 200 ml de medio de cultivo LB (triptona
al 7%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%) y se sometió a
cultivo en agitación a 30ºC durante 15 horas, y las células
bacterianas se recogieron en la fase de crecimiento logarítmico
mediante centrifugación (8.000 rpm, 10 min.). Las células recogidas
se pusieron en suspensión en 20 ml de un tampón (sacarosa al 25%,
Tris-HCl 50 mM (pH 8.0)) y se añadieron 2,5 ml de
una solución de cloruro de lisozima (50 mg/ml), seguido de
incubación a 37ºC durante 30 minutos. Luego, se añadieron 2,5 ml de
una solución de SDS (10% (v/v) y 0,25 ml de una solución de EDTA
(0,5 M), y la mezcla resultante se incubó a 37ºC durante 16 horas.
Se añadió a la mezcla incubada una cantidad igual de fenol saturado
TE y la mezcla resultante se agitó lentamente y luego se centrifugó
(10.000 rpm, 10 min.), tras lo cual se recuperó la capa superior
para realizar la desproteinización. El procedimiento anterior de
desproteinización se repitió 5 veces más. Se añadió un volumen de
etanol del doble de la capa superior recuperada, a dicha capa
superior recuperada, para precipitar el ADN. El ADN se recuperó
enrollándolo alrededor de una varilla de vidrio, se lavó con etanol
al 70%, se secó al aire y luego se disolvió en 20 ml de tampón TE,
y se añadieron 20 \mul de RNAsa (10 mg/ml), seguido de incubación
a 37ºC durante 16 horas. Así, se obtuvo una solución de ADN que
contenía aproximadamente 21 mg de ADN genómico de Sphingomonas
paucimobilis JCM7511.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron cuarenta y tres microgramos del ADN
genómico obtenido en (1-A) con 15 U de una enzima de
restricción Sau 3 AI a 37ºC durante 2 minutos, para que fueran
digeridos parcialmente. Los fragmentos de ADN genómico obtenidos
mediante la digestión parcial se mezclaron con un vector plasmídico
pUC19, disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), se escindieron
mediante una enzima de restricción BamHI, y luego se
desfosforilaron. Usando un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO
Co., Ltd.), los fragmentos de ADN genómico obtenidos mediante la
digestión parcial, se unieron con el vector plasmídico pUC19, según
el manual de instrucciones adjunto, para preparar plásmidos
recombinantes que contuviesen varios fragmentos de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos recombinantes obtenidos en
(1-B) se introdujeron en cepas del mutante de
deleción de bio F de E. coli (R874), el mutante de deleción
bio A de E. coli (R879), el mutante de deleción bio B de
E. coli (R875) y el mutante de deleción bio C de E.
coli (R876), respectivamente (Journal of Bacteriology, vol. 94,
2065-2066 (1972), Journal of Bacteriology, vol.
112, 830-839 (1972)) con un generador de impulsos
génicos (fabricado por Bio-Rad Laboratories Inc.)
mediante un método de electroporación (voltaje aplicado 18 kV/cm,
capacitancia 25 \muF, resistencia 400 \Omega). Las cepas así
tratadas se sembraron en estrías sobre una placa de agar selectivo
exento de biotina (Na_{2}HPO_{4}-7H_{2}O al
1,48%, KH_{2}PO_{4} al 0,3%, NaCl al 0,05%, NH_{4}Cl al 0,1%,
ampicilina al 0,005%, agar al 1,5%) y la placa de agar se incubó a
37ºC durante 2 días. Las cepas que crecían en el medio y formaban
colonias se recogieron y luego se incubaron sobre medio LB a 37ºC
durante 16 horas. Se extrajeron plásmidos de estas cepas mediante el
método de lisis alcalina (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)), se escindieron con enzimas
de restricción y se investigaron mediante electroforesis en gel de
agarosa, encontrándose que el plásmido recombinante introducido en
cada mutante de deleción contenía un fragmento insertado que tenía
un tamaño mostrado en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para los plásmidos recombinantes pBC01, pBC02,
pBC03, pBC04 y pBC05, obtenidos en (1-C), se
prepararon clones de deleción que contenían fragmentos insertados
de diversos tamaños, mediante el uso de un kit de deleción para la
kilosecuencias (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.) de la forma
descrita más adelante.
Se escindieron veinte microgramos de cada uno de
los plásmidos recombinantes pBC01, pBC02, pBC03, pBC04 y pBC05, con
las siguientes enzimas: pBC01: SmaI y KpnI, pBC02: PstI y XbaI,
pBC03, pBC04 y pBC05: XbaI y Sse 8387 I. Las enzimas se eliminaron
mediante extracción con fenol, seguida de precipitación de ADN con
etanol. El ADN obtenido se disolvió en 100 \mul de tampón ExoIII
(Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5
mM, 2-mercaptoetanol 10 mM), seguido por adición de
180 unidades de exonucleasa III, y la mezcla resultante se agitó y
luego se incubó a 37ºC. A intervalos de 1 minuto, se muestrearon 10
\mul de la solución resultante, y luego se mezclaron con 100
\mul de tampón de nucleasa MB enfriado en hielo (acetato sódico
40 mM (pH 4,5), NaCl 100 mM, ZnCl_{2} 2 mM, glicerol al 10%) y la
exonucleasa III se inactivó mediante tratamiento a 65ºC durante 5
minutos. La solución así obtenida se enfrió hasta 37ºC y luego se
añadieron 50 unidades de nucleasa MB, seguido de incubación durante
60 minutos. Las enzimas se eliminaron mediante extracción con fenol,
seguida por precipitación del ADN con etanol. El ADN obtenido se
disolvió en 50 \mul de tampón de Klenow (Tris-HCl
7 mM (pH 7,5), EDTA 0,1 mM, NaCl 20 mM, MgCl_{2} 7 mM, dNTPs cada
uno 0,1 mM) y se añadieron 2 unidades de fragmento de Klenow,
seguido de incubación a 37ºC durante 15 minutos. A 100 \mul de la
solución de unión A, se añadieron 10 \mul de la solución
resultante, y luego 12 \mul de la solución de unión B, seguido de
incubación a 16ºC durante 1 hora. Luego, el ADN se concentró por
precipitación con etanol, y se disolvió en 5 \mul de agua
esterilizada, y la solución resultante se introdujo en E.
coli JM109. La E. coli JM109 así tratada se sembró en
estrías sobre una placa de agar de medio de cultivo LB (triptona al
1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%, agar al 1,5%), que
contenía ampicilina (0,005%), y la placa de agar se incubó a 37ºC
durante 16 horas. Los plásmidos se extrajeron de las colonias
desarrolladas y se investigaron los tamaños de los fragmentos de
ADN insertados. Se seleccionaron como clones de deleción de pBC01
ocho clones que contenían los fragmentos insertados,
respectivamente, que variaban de tamaño desde 250 pb hasta 1,8 kpb.
Se seleccionaron como clones de pBC02 doce clones que contenían
fragmentos insertados, respectivamente, que variaban de tamaño
desde 250 pb hasta 2,8 kpb, de aproximadamente 250 pb cada uno. Se
seleccionaron como clones de pBC03 seis clones que contenían
fragmentos insertados, respectivamente, que variaban de tamaño desde
250 pb hasta 1,4 kpb, de aproximadamente 250 pb cada uno. Se
seleccionaron como clones de pBC04 seis clones que contenían
fragmentos insertados, respectivamente, que variaban de tamaño
desde 250 pb hasta 1,4 kpb, de aproximadamente 250 pb cada uno. Se
seleccionaron como clones de pBC05 quince clones que contenían
fragmentos insertados, respectivamente, que variaban de tamaño
desde 250 pb hasta 3,7 kpb, de aproximadamente 250 pb cada uno.
Cada clon de deleción se extrajo mediante el
método de lisis alcalina (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Se realizó la secuencia de
reacción usando 300 ng del extracto como molde y el cebador de M13
M4 (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.) o el cebador de M13 RV
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.) como cebador, usando un kit
de reacción "ABI prism dye terminator cycle sequencing ready
reaction kit" (fabricado por Perkin-Elmer
Corporation), y la secuencia básica se analizó mediante un
analizador de secuencia básica automático 373A (fabricado por
Perkin-Elmer Corporation).
Para especificar un gen implicado en la
biosíntesis de biotina entre las secuencias básicas de los
fragmentos insertados de los plásmidos recombinantes, se
seleccionaron regiones que codificaban una proteína, que tenían una
elevada homología en su secuencia básica con el gen bio F, bio A,
bio D, bio B y bio C, respectivamente, de marcos de lectura
abiertos de 500 pb o más, presentes en los fragmentos y
especificados como los genes de la bacteria del género Sphingomonas
que corresponden a los genes anteriores, respectivamente. pBC01
contenía bio F (SEQ ID NO: 3). pBC02 contenía bio D (SEQ ID NO: 12)
y bio A (SEQ ID NO: 8). pBC03 contenía bio D (SEQ ID NO: 16). Cada
uno de pBC04 y pBC05 contenía bio D (SEQ ID NO: 22). Las secuencias
básicas de los fragmentos insertados de pBC01 y pBC02, que se
habían obtenido independientemente, se compararon para encontrar que
una combinación de los fragmentos insertados de pBC01 y pBC02 es
ADN continuo sobre el genoma. Por tanto, quedó claro que bio F, bio
D y bio A forman un operón.
Se inoculó el contenido de un asa de
Sphingomonas sp. SC42405 en 200 ml de medio de cultivo LB
(triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%) y se
sometió a cultivo en agitación a 30ºC durante 15 horas, y las
células bacterianas se recogieron en la fase de crecimiento
logarítmico mediante centrifugación (8.000 rpm, 10 min.). Las
células recogidas se pusieron en suspensión en 20 ml de un tampón A
(sacarosa al 25%, Tirs-HCl 50 mM (pH 8,0)) y se
añadieron 2,5 ml de una solución de cloruro de lisozima (50 mg/ml),
seguido de incubación a 37ºC durante 30 minutos. Luego, se
añadieron 2,5 ml de una solución de SDS (10% (v/v)) y 0,25 ml de una
solución de EDTA (0,5 M), y la mezcla resultante se incubó a 37ºC
durante 16 horas. Se añadió a la mezcla incubada una cantidad igual
del fenol saturado TE, y la mezcla resultante se agitó lentamente y
luego se centrifugó (10.000 rpm, 10 min.), tras lo cual se recuperó
la capa superior para realizar la desproteinización. El
procedimiento de desproteinización anterior se repitió 5 veces más.
Se añadió a dicha capa superior recuperada un volumen de etanol del
doble de dicha capa superior recuperada, para precipitar el ADN. El
ADN se recuperó enrollándolo alrededor de una varilla de vidrio, se
lavó con etanol al 70%, se secó al aire y luego se disolvió en 20 ml
de tampón TE, y se añadieron 20 \mul de RNasa (10 mg/ml), seguido
de incubación a 37ºC durante 16 horas. Así, se obtuvo una solución
de ADN que contenía aproximadamente 21 mg de ADN genómico de
Sphingomonas sp. SC42405.
Se trataron cincuenta microgramos del ADN
genómico obtenido en (2-A) con 15 U de una enzima de
restricción Sau 3 AI, a 37ºC durante 2,5 minutos, para digerirlo
parcialmente. Los fragmentos de ADN genómico obtenidos mediante la
digestión parcial se mezclaron con un vector plasmídico pUC19
(disponible de TAKARA SHUZO Co. Ltd.), se escindieron mediante una
enzima de restricción BamHI y luego se desfosforilaron. Usando un
kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO Co. Ltd), los fragmentos
de ADN genómico obtenidos mediante la digestión parcial, se unieron
con el vector plasmídico pUC19, según el manual de instrucciones
adjunto, para preparar plásmidos recombinantes que contenían
diversos fragmentos de ADN.
Los plásmidos recombinantes obtenidos en
(2-B) se introdujeron en cepas de un mutante de
deleción de bio F de E. coli (R874), un mutante de deleción
de bio A de E. coli (R875) y un mutante de deleción de bio C
de E. coli (R876), repectivamente (Journal of Bacteriology,
vol. 112, 830-839 (1972)) con un generador de
impulsos génicos (fabricado por Bio-Rad
Laboratories Inc.), mediante un método de electroporación (voltaje
aplicado 18 kV/cm, capacitancia 25 \muF, resistencia 400
\Omega). Las cepas así tratadas se sembraron en estrías sobre una
placa de agar selectivo exento de biotina
(Na_{2}HPO_{4}-12H_{2}O al 1,71%,
KH_{2}PO_{4} al 0,3%, NaCl al 0,05%, NH_{4}Cl al 0,1%,
ampicilina al 0,005%, IPTG 0,2 mM, y agar al 1,5%), y la placa de
agar se incubó a 37ºC durante 2 días. Las cepas que crecían sobre la
placa y formaban colonias se recogieron y luego se incubaron sobre
medio LB a 37ºC durante 16 horas. Los plásmidos se extrajeron de
dichas cepas mediante el método de lisis alcalina (Molecular
Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), se
escindieron con enzimas de restricción y se investigaron mediante
electroforesis en gel de agarosa, descubriéndose que el plásmido
recombinante introducido en cada mutante de deleción contenía un
fragmento insertado que tenía un tamaño mostrado en la Tabla 4.
Para los plásmidos recombinantes pBC11, pBC12,
pBC13, pBC14 y pBC15, obtenidos en (2-C), se
prepararon clones de deleción que contenían fragmentos de varios
tamaños, mediante el uso de un kit de deleción para kilosecuencias
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), de la forma descrita
anteriormente.
Se escindieron veinte microgramos de cada uno de
los plásmidos recombinantes pBC11, pBC12, pBC13, pBC14 y pBC15, con
las siguientes enzimas: pBC11: XbaI y Sse 8387 I, pBC12 y pBC13:
PstI y XbaI, pBC14 y pBC15: XbaI y KpnI. Las enzimas se eliminaron
mediante extracción con fenol, seguida de precipitación con etanol.
El ADN obtenido se disolvió en 100 \mul de tampón ExoIII
(Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, MgCl_{2}
5 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM), seguido de adición de
180 unidades de exonucleasa III, y la mezcla resultante se agitó y
luego se incubó a 37ºC. A intervalos de 1 minuto, se muestrearon 10
\mul de la solución resultante, y luego se mezclaron con 100
\mul de tampón nucleasa MB enfriado en hielo (acetato sódico 40 mM
(pH 4,5), NaCl 100 mM, ZnCl_{2} 2 mM, glicerol al 10%) y la
exonucleasa III se inactivó mediante tratamiento a 65ºC durante 5
minutos. La solución así obtenida se enfrió hasta 37ºC y luego se
añadieron 50 unidades de nucleasa MB, seguido de incubación durante
60 minutos. Las enzimas se eliminaron mediante extracción con fenol,
seguido de precipitación del ADN con etanol. El ADN obtenido se
disolvió en 50 \mul de tampón de Klenow (Tris-HCl
7 mM (pH 7,5), EDTA 0,1 mM, NaCl 20 mM, MgCl_{2} 7 mM, dNTP's 0,1
mM cada uno) y se añadieron dos unidades de fragmento de Klenow,
seguido de incubación a 37ºC durante 15 minutos. A 100 \mul de la
solución de unión A se añadieron 10 \mul de la solución
resultante, y luego 12 \mul de la solución de unión B, seguido de
incubación a 16ºC durante 1 hora. Luego, el ADN se concentró
mediante precipitación con etanol y se disolvió en 5 \mul de agua
esterilizada, y la solución resultante se introdujo en E.
coli JM109. La E. coli JM105 así tratada se sembró en
estrías sobre una placa de agar de medio de cultivo LB (triptona al
1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%, agar al 1,5%) que
contenía ampicilina (0,005%), y se incubó la placa a 37ºC durante
16 horas. Se extrajeron plásmidos de las colonias desarrolladas y se
investigaron los tamaños de los fragmentos de ADN insertados. Se
seleccionaron nueve clones que contenían los fragmentos insertados,
respectivamente, que variaban en tamaño desde 250 pb hasta 2,3 kpb,
de aproximadamente 250 pb cada uno, como clones de deleción de
pBC11. Se seleccionaron ocho clones que contenían los fragmentos
insertados, respectivamente, que variaban en tamaño desde 250 pb
hasta 2,2 kpb, de aproximadamente 250 pb cada uno, como clones de
deleción de pBC12. Se seleccionaron diez clones que contenían los
fragmentos insertados, respectivamente, que variaban en tamaño
desde 250 pb hasta 2,6 kpb, de aproximadamente 250 pb cada uno, como
clones de deleción de pBC13. Se seleccionaron ocho clones que
contenían los fragmentos insertados, respectivamente, que variaban
en tamaño desde 250 pb hasta 1,9 kpb, de aproximadamente 250 pb
cada uno, como clones de deleción de pBC14. Se seleccionaron ocho
clones que contenían los fragmentos insertados, respectivamente, que
variaban en tamaño desde 250 pb hasta 2,0 kpb, de aproximadamente
250 pb cada uno, como clones de deleción de pBC15.
Cada clon de deleción se extrajo mediante el
método de lisis alcalina (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Usando 300 ng del extracto
como moldee y el cebador M4 de M13 (disponible de TAKARA SHUZO Co.,
Ltd.), o el cebador RV de M13 (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.)
como cebador, se realizó la secuencia de reacción usando un kit ABI
prism dye terminator cycle sequencing ready reaction (fabricado por
Perkin-Elmer Corporation), y la secuencia básica se
analizó mediante un analizador de secuencia básica automático 373A
(fabricado por Perkin-Elmer Corporation).
Para especificar un gen implicado en la
biosíntesis de biotina entre las secuencias básicas de los
fragmentos insertados de los plásmidos recombinantes, se
seleccionaron regiones que codificaban una proteína con elevada
proporción de homología en su secuencia básica con el gen bio F, bio
A, bio D, bio B y bio C conocidos, respectivamente, de marcos de
lectura abiertos de 50 pb o más, presentes en los fragmentos y
especificados como genes de la bacteria del género Sphingomonas,
que corresponden a los genes anteriores, respectivamente. pBC11
contenía bio F (SEQ ID NO: 4). Cada uno de pBC12 y pBC13 contenían
bio D (SEQ ID NO: 13) y bio A (SEQ ID NO: 9). pBC14 contenía bio B
(SEQ ID NO: 17). pBC15 contenía bio C (SEQ ID NO: 23). Como
resultado de la comparación de las secuencias básicas de los
fragmentos insertados de pBC12, pBC13 y pBC15, que se habían
obtenido independientemente, quedó claro lo siguiente: una
combinación de los fragmentos insertados de pBC12, pBC13 y pBC15 es
ADN continuo sobre el genoma; el codón de terminación TGA de bio C
y el codón de iniciación ATG de bio D solapan entre sí en la
secuencia básica TG; el codón de terminación TGA de bio D y el codón
de iniciación ATG de bio A solapan entre sí en la secuencia básica
TG; y bio C, bio D y bio A forman un operón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se escindió un microgramo de vector plasmídico
pJAJ7 derivado de un vector plasmídico RK2 (Journal of Bacteriology,
vol. 162, 604-614 (1986)) con enzimas de
restricción PstI y BamHI, y ambos extremos de los fragmentos
resultantes se hicieron romos mediante el uso de un kit de extremos
romos de ADN (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el
manual de instrucciones adjunto. Los fragmentos así tratados se
separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, para aislar un
fragmento de ADN de aproximadamente 10 kpb. Aparte, se escindieron 2
\mug de un vector plasmídico pBluescript KS (+), disponible de
Stratagene Cloning Systems) con una enzima de restricción HaeIII, y
ambos extremos de los fragmentos resultantes se hicieron romos
mediante el uso de un kit de extremos romos de ADN (disponible de
TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto.
Los fragmentos así tratados se separaron mediante electroforesis en
gel de agarosa, para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente
0,7 kpb. El fragmento total de aproximadamente 10 kpb y el fragmento
de ADN de aproximadamente 0,7 kpb así obtenidos, se mezclaron y
luego se unieron entre sí mediante el uso de un kit de unión
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de
instrucciones adjunto. El plásmido resultante se denominó pJA
\beta2 (Fig. 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el ADN genómico obtenido en el Ejemplo 1
(1-A), como molde y los cebadores BF y BR mostrados
en la Tabla 5, se realizó una PCR [composición de la reacción:
Tris-HCl 10 mM (pH 8,8), KCl 10 mM, Tween 20 al
0,002% (v/v), MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 20 pmol de
cada cebador, de 0,5 a 100 ng de ADN genómico, 3U de ADN polimerasa
ULTma® (disponible de Perkin-Elmer Corporation)/100
\mul; ciclos de reacción: 1 ciclo de reacción a 97ºC durante 2
minutos, 30 ciclos de reacción a 97ºC durante 1 minuto, a 55ºC
durante 1 minuto y luego a 72ºC durante 1,5 minutos,
respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante 7 minutos].
De este modo, se preparó un fragmento de ADN que contenía 1325 pb
en total desde la base 145 aguas arriba respecto a la región
codificadora de bio B, hasta 154 pb aguas abajo respecto a la región
codificadora, y que tenía un sitio Xba introducido en cada extremo
de la secuencia de 1325 pb. Este fragmento de ADN se escindió con
una enzima de restricción XbaI, y el fragmento de ADN resultante y
un fragmento de ADN obtenido escindiendo el vector plasmídico pJA
\beta2 con una enzima de restricción XbaI y desfosforilando el
vector plasmídico escindido, se mezclaron y luego se unieron entre
sí mediante el uso de un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO
Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido
así obtenido se denominó pJAW (Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo Sphingomonas paucimobilis
JCM7511/pJAW en forma de transformantes, introduciendo el plásmido
pJAW obtenido en el Ejemplo 3 en Sphingomonas paucimobilis
JCM7511 con un generador de impulsos génicos (fabricado por
Bio-Rad Laboratories Inc.) mediante un método de
electroporación (voltaje aplicado 18 kV/cm, capacitancia 25 \muF,
resistencia 400 \Omega).
\vskip1.000000\baselineskip
Se separaron en gel de agarosa fragmentos de ADN
obtenidos digiriendo parcialmente el plásmido pJAW obtenido en el
Ejemplo 3 con las enzimas de restricción Eco 52I y Bsp 1286I, para
obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 11,8 kpb, formado
mediante la deleción, a partir de pJAW, de una secuencia básica
desde la base 72 hasta la base 718, en caso de que se tome A como
el codón de iniciación ATG de bio B como la primera base. Por otra
parte, usando el ADN genómico obtenido en el Ejemplo 1,
(1-A), como molde y los cebadores BF1 y BR1
mostrados en la Tabla 5, se realizó una PCR [composición de la
reacción: Tris-HCl 10 mM (pH 8,8), KCl 10 mM, Tween
20 al 0,002% (v/v), MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 20
pmol de cada cebador, de 0,5 a 100 ng de ADN genómico, 3 U de ADN
polimerasa ULTma® (disponible de Perkin-Elmer
Corporation)/100 \mul; ciclos de reacción: 1 ciclo de reacción a
97ºC durante 2 minutos, 30 ciclos de reacción a 97ºC durante 0,5
minutos, a 60ºC durante 1 minuto y luego a 72ºC durante 1,5
minutos, respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante 7
minutos]. De este modo, se preparó un fragmento de ADN que contenía
una secuencia básica desde la base -75 hasta la base 721, en el
caso de A, del codón de iniciación ATG de bio B, como la primera
base. Luego, este fragmento de ADN se digirió parcialmente con las
enzimas de restricción Eco 52I y Bsp 1286I, y los fragmentos de ADN
resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa,
para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 0,8 kpb. La
secuencia básica del fragmento de ADN recuperado se analizó para
confirmar una secuencia básica desde las bases nº 1 a 1336,
mostrada en SEQ ID NO: 19. Los fragmentos de ADN así obtenidos se
unieron entre sí mediante el uso de un kit de unión (disponible de
TAKARA
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pJA41 (Fig. 3).
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pJA41 (Fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo Sphingomonas paucimobilis
JCM7511/pJA41, introduciendo el plásmido pJA41 obtenido en el
Ejemplo 5 en Sphingomonas paucimobilis JCM7511 con un
generador de impulsos génicos (fabricado por Bio-Rad
Laboratories Inc.) mediante un método de electroporación (voltaje
aplicado 18 kV/cm, capacitancia 25 \muF, resistencia
400 \Omega).
400 \Omega).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó el contenido de un asa de cultivo de
Sphingomonas paucimobilis JCM7511/pJAW y Sphingomonas
paucimobilis JCM7511/pJA41 en un tubo de ensayo pequeño (18 x
150 mm) que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%,
peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4} \cdot
7H_{2}O al 0,15%, tetraciclina al 0,005% (pH 7,2)). Como control,
se inoculó el contenido de un asa de cultivo de Sphingomonas
paucimobilis JCM7511, que no tenía ningún gen incorporado, en
un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm), que contenía 3 ml de un
medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al
0,15%, MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O al 0,15% (pH 7,2)). Los tres
tipos de bacterias anteriores se cultivaron a 30ºC durante 2 días
(250 rpm), para obtener caldos de precultivo. Luego, se inocularon
200 \mul de cada uno de los caldos de precultivo así obtenidos de
Sphingomonas paucimobilis JCM7511/pJAW y Sphingomonas
paucimobilis JCM7511/pJA41 en un tubo de ensayo mayor (22 x 220
nm) que contenía 10 ml de un medio de cultivo (glicerol al 4%,
extracto de levadura al 2%, ácido casamino al 0,5%,
K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}-7H_{2}O al 0,05%,
FeSO_{4}-7H_{2}O al 0,001%,
MnSO_{4}-4-6H_{2}O al 0,001%,
HCl tiamina al 0,000002%, tetraciclina al 0,005% (pH 7,0)) . Como
control, se inocularon 200 \mul del caldo de precultivo de
Sphingomonas paucimobilis JCM7511 en un tubo de ensayo
grande (22 x 220 mm), que contenía 10 ml de un medio de cultivo
(glicerol al 4%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino al
0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}-7H_{2}O al 0,05%,
FeSO_{4}-7 H_{2}O al 0,001%,
MnSO_{4}-4-6H_{2}O al 0,001%,
HCl tiamina al 0,000002% (pH 7,0)). Se cultivaron los tres tipos
anteriores de bacterias a 30ºC durante 4 días (250 rpm). La
concentración de biotina producida y acumulada en cada caldo de
cultivo se determinó mediante un método de cuantificación
microbiológico, usando la cepa Lactobacillus plantarum IFO
3070 (Izumi y Yamada "Vitaminological Experimental Method II.
Water-soluble Vitamins", págs.
481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo
Kagaku Dojin, 1985), encontrándose que la concentración de biotina
producida era según se muestra en la Tabla 6.
Se escindió el plásmido obtenido en el Ejemplo 1
con las enzimas de restricción BamHI y PstI, y los fragmentos de
ADN resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de
agarosa para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 1,4
kpb, que contenía una gran porción de una región codificadora de bio
F y una región que controlaba la expresión de bio F, bio D y bio A,
la cual estaba aguas arriba respecto a bio F. El fragmento de ADN
así obtenido y un vector plasmídico pBluescript SKII (+) (disponible
de Stratagene Cloning Systems), escindidos mediante las enzimas de
restricción BamHI y PstI, se mezclaron y se unieron entre sí
mediante el uso de un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO Co.,
Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así
obtenido se denominó pBC06.
Además, el plásmido pBC02, obtenido en el
Ejemplo 1, se escindió con las enzimas de restricción PstI y EcoRE,
y los fragmentos de ADN resultantes se separaron mediante
electroforesis en gel de agarosa para obtener un fragmento de ADN
de aproximadamente 2,2 kpb, que contenía una parte de una región
codificadora de bio F, regiones codificadoras de bio D y bio A, y
una región 3' no traducida de bio F, bio D y bio A, que estaba
aguas abajo respecto a bio A. El fragmento de ADN así obtenido y un
plásmido pBC06, escindidos mediante las enzimas de restricción PstI
y EcoRI, se mezclaron y luego se unieron entre sí mediante el uso de
un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el
manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se
denominó pSP105.
Además, el plásmido pSP105 se escindió con las
enzimas de restricción BamHI y HindIII, y los fragmentos de ADN
resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa
para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 3,6 kpb, que
contenía regiones codificadoras de bio F, bio D y bio A, y una
región reguladora de la expresión de bio F, bio D y bio A. El
fragmento de ADN así obtenido y un plásmido pJA41, escindidos
mediante las enzimas de restricción BamHI y HindIII, se mezclaron y
luego se unieron entre sí mediante el uso de un kit de unión
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de
instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSP302
(Fig. 4).
Se obtuvo Sphingomonas paucimobilis
JCM7511/pSP302, introduciendo el plásmido pSP302, obtenido en el
Ejemplo 8, en Sphingomonas paucimobilis JCM7511 con un
generador de impulsos génicos (fabricado por Bio-Rad
Laboratories, Inc.) mediante un método de electroporación (voltaje
aplicado 18 kV/cm, capacitancia 25 \muF, resistencia 400
\Omega).
Se realizó una PCR usando el ADN genómico
obtenido en el Ejemplo 1, (1-A), como molde y los
cebadores C1 y C6 mostrados en la Tabla 5, para preparar un
fragmento de ADN que contenía 1435 pb en total desde 387 pb aguas
arriba respecto de una región codificadora de bio C, hasta 196 pb
aguas abajo respecto a la región codificadora, y que tenían un
sitio HindIII introducido en el extremo aguas arriba respecto de la
secuencia de 1435 pb y un sitio XhoI introducido en el extremo
aguas abajo. Se mezclaron un fragmento obtenido escindiendo este
fragmento de ADN con enzimas de restricción HindIII y XhoI, y un
fragmento de ADN obtenido escindiendo el plásmido pSP302 con
enzimas de restricción HindIII y XhoI, y luego se unieron entre sí
usando un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.),
según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido
se denominó pSP304 (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo Sphingomonas paucimobilis
JCM7511/pSP304 introduciendo el plásmido pSP304 obtenido en el
Ejemplo 10 en Sphingomonas paucimobilis JCM7511 con un
generador de impulsos génicos (fabricado por Bio-Rad
Laboratories Inc.) mediante un método de electroporación (voltaje
aplicado 18 kV/cm, capacitancia 25 \muF, resistencia
400 \Omega).
400 \Omega).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó el contenido de un asa de cultivo de
Sphingomonas paucimobilis JCM7511/pSP302 y Sphingomonas
paucimobilis JCM7511/pSP302 en un tubo de ensayo pequeño (18 x
150 mm) que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%,
peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
al 0,15% y tetraciclina al 0,005% (pH 7,2)). Como control, se
inoculó el contenido de un asa de cultivo de Sphingomonas
paucimobilis JCM7511 que no tenía ningún gen introducido en su
seno en un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm) que contenía 3 ml
de un medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al 2%,
K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15% (pH
7,2)) . Los tres tipos anteriores de bacterias se cultivaron a 30ºC
durante 2 días (250 rpm) para obtener caldos de precultivo. Luego,
se inocularon 200 \mul de cada uno de los caldos de precultivo
así obtenidos de Sphingomonas paucimobilis JCM7511/pSP302 y
Sphingomonas paucimobilis JCM7511/pSP304 en un tubo de
ensayo grande (22 x 220 mm) que contenía 10 ml de un medio de
cultivo (glicerol al 4%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino
al 0,5%, K_{2}HPO4 al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}-7H_{2}O al 0,05%,
FeSO_{4}-7H_{2}O al 0,001%,
MnSO_{4}-4-6H_{2}O al 0,001% y
tetraciclina al 0,005% (pH 7,0)). Como control, se inocularon 200
\mul del caldo de precultivo de Sphingomonas paucimobilis
JCM7511 en un tubo de ensayo grande (22 x 220 nm), que contenía 10
ml de un medio de cultivo (glicerol al 4%, extracto de levadura al
2%, ácido casamino al 0,1%, K_{2}HPO4 al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}-7H_{2}O al 0,05%,
FeSO_{4}-7H_{2}O al 0,001% y
MnSO_{4}-4-6H_{2}O al 0,001% (pH
7,0)). Los tres tipos anteriores de bacterias se cultivaron a 30ºC
durante 4 días (250 rpm). La concentración de biotina producida y
acumulada en cada caldo de cultivo se determinó mediante el método
de cuantificación microbiológica usando la cepa Lactobacillus
plantarum IFO 3070 (Izumi y Yamada "Vitaminological
Experimental Method II. Water-soluble Vitamins",
págs. 481-499, Vitaminological Society of Japan,
Tokyo Kagaku Dojin, 1985), encontrándose que que la concentración de
biotina producida era según se muestra en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una PCR usando el ADN genómico
obtenido en el Ejemplo 2, (2-A), como molde y los
cebadores BF4 y BR4 mostrados en la Tabla 8, [composición de
reacción 1 x tampón Expand HF, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de
cada dNTP, 300 nM de cada cebador, 0,5 a 100 ng de ADN genómico, 2,6
U de mezcla de enzimas del sistema de PCR de alta fidelidad Expand®
(disponible de Boehringer Mannheim Co., Ltd.)/50 \mul; ciclos de
reacción: 1 ciclo de reacción a 97ºC durante 2 minutos, 10 ciclos
de reacciones a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30
segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos, respectivamente, 15
ciclos de reacciones a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30
segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos (el tiempo de reacción a
72ºC durante 1,5 minutos se incrementó en 20 segundos en cada
ciclo), respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante 7
minutos]. De este modo, se preparó un fragmento de ADN que contenía
1358 pb en total desde 151 pb aguas arriba respecto a una región
codificadora de bio B, hasta 151 pb aguas abajo respecto de una
región la región codificadora, y que tiene un sitio XbaI
introducido en cada extremo de la secuencia de 1358 pb. Este
fragmento de ADN se escindió con una enzima de restricción XbaI, y
el fragmento de ADN resultante y un fragmento de ADN obtenido
escindiendo el vector plasmídico pJA \beta2 con una enzima de
restricción XbaI y desfosforilando el vector plasmídico escindido,
se mezclaron y luego se unieron entre sí mediante el uso de un kit
de unión (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd., según el manual de
instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS301
(Fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo Sphingomonas sp. SC42405/pSS301
como transformante, introduciendo el plásmido pSS301 obtenido en el
Ejemplo 13 en Sphingomonas sp. SC42405 con un generador de
impulsos génicos (fabricado por Bio-Rad Laboratories
Inc.), mediante un método de electroporación (voltaje aplicado 18
kV/cm, capacitancia 25 \muF, resistencia 400 \Omega).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó el contenido de un asa de cultivo de
Sphingomonas sp. SC42405/pSS301 en un tubo de ensayo pequeño
(18 x 150 mm) que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al
1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4}, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O y
tetraciclina al 0,005% (pH 7,2)). Como control, se inoculó el
contenido de un asa de cultivo de Sphingomonas sp. SC42405
que no tenía ningún gen introducido en su seno en un tubo de ensayo
pequeño (18 x 150 mm), que contenía 3 ml de un medio de cultivo
(glicerol al 1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} y
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (pH 7,2)). Los dos tipos anteriores de
bacterias se cultivaron a 30ºC durante 2 días (250 rpm) para obtener
caldos de precultivo. A continuación, se inocularon 160 \mul del
caldo de precultivo de Sphingomonas sp. SC42405/pSS301 así
obtenido en un tubo de ensayo grande (22 x 220 mm), que contenía 8
ml de un medio de cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al
2%, ácido casamino al 0,5%, K_{2}HPO_{4} al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O al
0,01%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1% y tetraciclina al
0,005% (pH 7,0)). Como control, se inocularon 160 \mul del caldo
de precultivo de Sphingomonas sp. SC42405 en un tubo de
ensayo grande (22 x 220 mm) que contenía 8 ml de un medio de cultivo
(glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino al
0,5%, K_{2}HPO_{4} al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O al
0,01% y MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1% (pH 7,0)). Los dos
tipos anteriores de bacterias se cultivaron a 30ºC durante 4 días
(250 rpm).
La concentración de biotina producida y
acumulada en cada caldo de cultivo se determinó mediante el método
de cuantificación microbiológico usando Lactobacillus
plantarum IFO 3070 (Izumi y Yamada "Vitaminological
Experimental Method II. Water-soluble Vitamins",
págs. 481-499, Vitaminological Society of Japan,
Tokyo Kagaku Dojin, 1985), encontrándose que la concentración de
biotina producida era según se muestra en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una PCR usando el ADN genómico
obtenido en el Ejemplo 2, (2-A), como molde, y los
cebadores F2 y F3 mostrados en la Tabla 8 [Composición de la
reacción: 1 x tampón HF Expand, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de
cada dNTP, 300 nM de cada cebador, 0,5 a 100 ng de ADN genómico, 2,6
U de mezcla de enzimas del sistema de PCR de elevada afinidad
Expand® (disponible de Boehringer Mannheim Co., Ltd.)/50 \mul;
ciclos de reacción: 1 ciclo de reacción a 97ºC durante 2 minutos,
10 ciclos de reacción a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30
segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos, respectivamente, 15
ciclos de reacción a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30
segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos (el tiempo de reacción a
72ºC durante 1,5 minutos se incrementó en 20 segundos en cada
ciclo), respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante 7
minutos]. De este modo, se preparó un fragmento de ADN que contenía
1408 pb en total desde 201 pb aguas arriba respecto de una región
codificante de bio F, hasta 46 pb aguas abajo respecto de la región
codificante, y que tenía un sitio SpeI introducido en el extremo
aguas arriba respecto de la secuencia de 1408 pb y un sitio PstI
introducido en el extremo aguas abajo. Este fragmento de ADN se
escindió con las enzimas de restricción SpeI y PstI, y el fragmento
de ADN resultante y un fragmento de ADN obtenido escindiendo un
vector plasmídico pBluescript SK(+) (disponible de Stratagene
Cloning Systems) con enzimas de restricción SpeI y PstI, se
mezclaron y luego se unieron entre sí usando un kit de unión
(disponible de TAKARA
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS202.
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS202.
Además, usando el ADN genómico obtenido en el
Ejemplo 2, (2-A), como molde y los cebadores CDA1 y
CDA6 mostrados en la Tabla 8, se realizó una PCR [composición de la
reacción: 1 x tampón HF Expand, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de
cada dNTP, 300 nM de cada cebador, de 0,5 a 100 ng de ADN genómico,
2,6 U de mezcla de enzimas del sistema de PCR de alta fidelidad
Expan® (disponible de Boehringer Mannheim Co., Ltd.)/50 \mul;
ciclos de reacción: 1 ciclo de reacción a 97ºC durante 2 minutos,
10 ciclos de reacciones a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante
30 segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos, respectivamente, 15
ciclos de reacciones a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30
segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos (el tiempo de la
reacción a 72ºC durante 1,5 minutos se incrementó en 20 segundos en
cada ciclo), respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante
7 minutos]. De este modo, se preparó un fragmento de ADN que
contenía 1287 pb (en total), compuesto por una secuencia de 209 pb
aguas arriba respecto de una región codificadora de bio C, la región
de 726 pb codificadora de bio C, y la primera mitad, de
aproximadamente 300 pb, de una región codificadora de bio D, y que
tenía un sitio PstI introducido en el extremo aguas arriba de la
secuencia de 1287 pb y un sitio HindIII introducido en el extremo
aguas abajo. Este fragmento de ADN se escindió con las enzimas de
restricción PstI y HindIII, y el fragmento de ADN resultante y un
fragmento de ADN obtenido escindiendo un vector plasmídico
pBluescript SK(+) (disponible de Stratagene Cloning Systems) con las
enzimas de restricción PstI y Hind III, se mezclaron y luego se
unieron entre sí usando un kit de unión (disponible de TAKARA
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS205.
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS205.
Adicionalmente, usando el ADN genómico obtenido
en el Ejemplo 2, (2-A), como molde y los cebadores
CDA3 y CDA7 mostrados en la Tabla 8, se realizó una PCR
[composición de la reacción: 1 x tampón HF Expand, MgCl_{2} 1,5
mM, 200 \muM de cada dNTP, 300 nM de cada cebador, de 0,5 a 100 ng
de ADN genómico, 2,6 U de mezcla de enzimas del sistema de PCR de
alta fidelidad Expand® (disponible de Boehringer Mannheim Co.,
Ltd.)/50 \mul; ciclos de reacción: 1 ciclo de reacción a 97ºC
durante 2 minutos, 10 ciclos de reacciones a 97ºC durante 15
segundos, a 60ºC durante 30 segundos y luego a 72ºC durante 1,5
minutos, respectivamente, 15 ciclos de reacciones a 97ºC durante 15
segundos, a 60ºC durante 30 segundos y luego a 72ºC durante 1,5
minutos (el tiempo de la reacción a 72ºC durante 1,5 minutos se
incrementó en 20 segundos en cada ciclo), respectivamente, y 1 ciclo
de reacción a 72ºC durante 7 minutos]. De este modo, se preparó un
fragmento de ADN que contenía 1653 pb (en total) compuesto por la
segunda mitad de aproximadamente 400 pb de una región codificadora
de bio D, una región de 1251 pb codificadora de bio A, una
secuencia de 208 pb aguas abajo respecto de la región codificadora
de bio A, y que tenía un sitio HindIII introducido en el extremo
aguas arriba respecto de la región de 1653 pb y un sitio XhoI
introducido en el extremo aguas abajo. Este fragmento de ADN se
escindió con las enzimas de restricción HindIII y XhoI, y el
fragmento resultante y el fragmento de ADN obtenido escindiendo un
vector plasmídico pBluescript SK (+) (disponible de Stratagene
Cloning Systems) con enzimas de restricción HindIII y XhoI, se
mezclaron y se unieron entre sí usando un kit de unión (disponible
de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones
adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS206.
El plásmido pSS205, obtenido de la forma
descrita anteriormente, se escindió con las enzimas de restricción
PstI y HindIII, y los fragmentos de ADN resultantes se separaron
mediante electroforesis en agarosa, para preparar un fragmento de
ADN que contenía 1287 pb (en total), compuesto por una secuencia de
209 pb aguas arriba respecto a una región codificadora de bio C, la
región codificadora de bio C de 762 pb, la primera mitad de
aproximadamente 300 pb de una región codificadora de bio D, y que
tenía un sitio PstI introducido en el extremo aguas arriba de la
secuencia de 1287 pb y un sitio HindIII introducido en el extremo
aguas abajo. Se mezclaron el fragmento de ADN así obtenido y pSS206
escindido mediante las enzimas de restricción PstI y HindIII, y
estos fragmentos de ADN se unieron entre sí mediante el uso de un
kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el
manual de instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se
denominó pSS2071.
A continuación, pSS2071 se escindió con una
enzima de restricción ClaI y los fragmentos de ADN resultantes se
sometieron a autounión mediante el uso de un kit de unión
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de
instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó
pSS207.
Además, el plásmido pSS202 se escindió con las
enzimas de restricción SpeI y PstI, y los fragmentos de ADN
resultantes se separaron mediante electroforesis en agarosa, para
preparar un fragmento de ADN que contenía 1408 pb en total desde
201 pb aguas arriba respecto de una región codificadora de bio F,
hasta 46 pb aguas abajo respecto de la región codificadora, y que
tenía un sitio SpeI introducido en el extremo aguas arriba de la
secuencia de 1406 pb y un sitio PstI introducido en el extremo aguas
abajo. El fragmento de ADN así obtenido se mezcló con pSS207
escindido mediante las enzimas de restricción SpeI y PstI y estos
fragmentos de ADN se unieron entre sí usando un kit de unión
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de
instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó
pSS209.
El plásmido pSS209 se escindió con las enzimas
de restricción SpeI y XhoI, y los fragmentos de ADN resultantes se
separaron mediante electroforesis en agarosa para preparar un
fragmento de ADN que contenía bio F, bio C, bio D y bio A y que
tenía un sitio SpeI introducido en el extremo aguas arriba y un
sitio XhoI introducido en el extremo aguas abajo. El fragmento de
ADN así obtenido se mezcló con pJA \beta2 escindido mediante las
enzimas de restricción SpeI y XhoI, y estos fragmentos de ADN se
unieron entre sí usando un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO
Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido
así obtenido se denominó pSS305 (Fig. 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el plásmido pSS305 obtenido en el Ejemplo
16 como molde y cada una de las combinaciones del cebador RV de M13
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.) y el cebador R1 mostradas en
la Tabla 8, y una combinación del cebador M4 de M13 (disponible de
TAKARA SHUZO Co., Ltd.) y del cebador MUTB1 (disponible de TAKARA
SHUZO Co., Ltd.), se realizó una PCR [composición de la reacción: 1
x tampón HF Expand, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada dNTP, 300
nM de cada cebador, de 0,5 a 100 ng de ADN molde, 2,6 U de mezcla de
enzimas del sistema de PCR de alta fidelidad Expand® (disponible de
Boehringer Mannheim Co., Ltd.)/50 \mul; ciclos de reacción: 1
ciclo de reacción a 97ºC durante 2 minutos, 10 ciclos de reacciones
a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y luego a
72ºC durante 1,5 minutos, respectivamente, 15 ciclos de reacciones a
97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y luego a 72ºC
durante 1,5 minutos (el tiempo de la reacción a 72ºC durante 1,5
minutos se incrementó en 20 segundos en cada ciclo),
respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante 7 minutos].
Los cebadores y los dNTPs en exceso se eliminaron de la solución de
reacción tras la PCR mediante Centricon-100
(fabricado por Amicon Inc.), tras lo cual se añadió el tampón TF al
residuo para completar un volumen total de 50 \mul. Luego, se
mezclaron 0,5 \mul de cada una de las soluciones así obtenidas. Se
añadieron a la mezcla resultante 50 \mul de 10 x tampón Expand
HF, 4 \mul de cada dNTP 2,5 mM, 38,62 \mul de agua destilada
esterilizada y 0,38 \mul de mezcla de enzimas del sistema de PCR
de alta fidelidad Expand® (disponible de Boehringer Mannheim Co.,
Ltd.) (3,5 U/\mul), y la mezcla así obtenida se calentó a 94ºC
durante 10 minutos, se enfrió hasta 37ºC durante un período de 60
minutos, y luego se incubó a 37ºC durante 15 minutos. A esta
solución de reacción se le añadieron 0,5 \mul de cebador RV de M13
20 pmol (disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), seguido de PCR
[ciclos de reacción: 1 ciclo de reacción a 97ºC durante 2 minutos,
10 ciclos de reacciones a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante
30 segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos, respectivamente, 15
ciclos de reacciones a 97ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 30
segundos y luego a 72ºC durante 1,5 minutos (el tiempo de la
reacción a 72ºC durante 1,5 minutos se incrementó en 20 segundos en
cada ciclo), respectivamente, y 1 ciclo de reacción a 72ºC durante
7 minutos]. El fragmento de ADN así obtenido se escindió con las
enzimas de restricción NotI y HIndIII y se mezcló con un vector
plasmídico pBluescript SK(+) (disponible de Stratagene Cloning
Systems) escindido mediante las enzimas de restricción NotI y
HindIII, seguido de unión usando un kit de unión (disponible de
TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto.
De los clones resultantes se seleccionó, mediante análisis de
secuencia de bases, un clon que tenía la secuencia básica (SEQ ID
NO: 5) de bio F mutante, que tenía G como sustituyente para la base
-11 C en caso de tomar la A del codón de iniciación (ATG) de bio F
como la primera base. El plásmido así obtenido se denominó plásmido
pSS201. A continuación, el plásmido pSS201 se escindió con las
enzimas de restricción SpeI y PstI, y los fragmentos de ADN
resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa,
para preparar un fragmento de ADN que contenía 1408 pb en total,
desde 201 pb aguas arriba respecto a la región codificadora de bio
F, hasta 46 pb aguas abajo respecto de la región codificadora, y
que tenía un sitio SpeI introducido en el extremo aguas arriba y un
sitio PstI introducido en el extremo aguas abajo. El fragmento de
ADN así obtenido se mezcló con pSS207 mediante las enzimas de
restricción SpeI y PstI y estos fragmentos de ADN se unieron entre
sí mediante el uso de un kit de unión (disponible de TAKARA SHUZO
Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El plásmido
así obtenido se denominó pSS208.
Además, el plásmido pSS208 se escindió con las
enzimas de restricción SpeI y XhoI y los fragmentos de ADN
resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa
para preparar un fragmento de ADN que contenía bio F mutante, así
como bio C, bio D y bio A, y que tenía un sitio SpeI introducido en
el extremo aguas arriba y un sitio XhoI introducido en el extremo
aguas abajo. El fragmento de ADN así obtenido se mezcló con pJa
\beta2 escindido mediante las enzimas de restricción SpeI y XhoI y
estos fragmentos de ADN se unieron entre sí usando un kit de unión
(disponible de TAKARA SHUZO Co., Ltd.), según el manual de
instrucciones adjunto. El plásmido así obtenido se denominó pSS304
(Fig. 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron Sphingomonas sp.
SC42405/pSS304 y Sphingomonas sp. SC42405/pSS305,
introduciendo el plásmido pSS304 obtenido en el Ejemplo 17 y el
plásmido pSS305, respectivamente, en Sphingomonas sp. SC42405
con un generador de impulsos génicos (fabricado por
Bio-Rad Laboratories Inc.), mediante un método de
electroporación (voltaje aplicado 18 kV/cm, capacitancia 25 \muF,
resistencia 400 \Omega).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó el contenido de un asa de cultivo de
Sphingomonas sp. SC42405/pSS304 y Sphingomonas sp.
SC42405/
pSS305 en un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm) que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15%, tetraciclina al 0,005% (pH 7,2)). Como control, se inoculó el contenido de un asa de cultivo de Sphingomonas sp. SC42405 , que no tenía ningún gen incorporado, en un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm), que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15% (pH 7,2)). Los tres tipos de bacterias anteriores se cultivaron a 30ºC durante 2 días (250 rpm), para obtener caldos de precultivo. A continuación, se inocularon 160 \mul de cada uno de los caldos de precultivo así obtenidos de Sphingomonas sp. sc42405/pSS304 y Sphingomonas sp. SC42405/pSS305 en un tubo de ensayo grande (22 x 220 nm) que contenía 8 ml de un medio de cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino al 0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%, MgSO_{4} \cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4} \cdot7 H_{2}O al 0,01%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1% y tetraciclina al 0,005% (pH 7,0)). Como control, se inocularon 160 \mul del caldo de precultivo de Sphingomonas sp. SC42405 en un tubo de ensayo grande (22 x 220 mm), que contenía 8 ml de un medio de cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino al 0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O al 0,001%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1%, (pH 7,0)). Se cultivaron los tres tipos anteriores de bacterias a 30ºC durante 4 días (250 rpm). Las concentraciones de biotina y compuestos relacionados con biotina producidas y acumuladas en cada caldo de cultivo se determinaron mediante un método de cuantificación microbiológico (Izumi y Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", págs. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985), usando la cepa Lactobacillus plantarum IFO 3070 y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. Como resultado, se encontró que las concentraciones de biotina y de precursores en la síntesis de biotina, es decir, ácido 7-ceto-8-aminopelargónico, ácido 7,8-diaminopelargónico y destiobiotina (denominados a partir de aquí "vitámeros de biotina") eran según se muestra en la Tabla 10.
pSS305 en un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm) que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15%, tetraciclina al 0,005% (pH 7,2)). Como control, se inoculó el contenido de un asa de cultivo de Sphingomonas sp. SC42405 , que no tenía ningún gen incorporado, en un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm), que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15% (pH 7,2)). Los tres tipos de bacterias anteriores se cultivaron a 30ºC durante 2 días (250 rpm), para obtener caldos de precultivo. A continuación, se inocularon 160 \mul de cada uno de los caldos de precultivo así obtenidos de Sphingomonas sp. sc42405/pSS304 y Sphingomonas sp. SC42405/pSS305 en un tubo de ensayo grande (22 x 220 nm) que contenía 8 ml de un medio de cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino al 0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%, MgSO_{4} \cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4} \cdot7 H_{2}O al 0,01%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1% y tetraciclina al 0,005% (pH 7,0)). Como control, se inocularon 160 \mul del caldo de precultivo de Sphingomonas sp. SC42405 en un tubo de ensayo grande (22 x 220 mm), que contenía 8 ml de un medio de cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino al 0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O al 0,001%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1%, (pH 7,0)). Se cultivaron los tres tipos anteriores de bacterias a 30ºC durante 4 días (250 rpm). Las concentraciones de biotina y compuestos relacionados con biotina producidas y acumuladas en cada caldo de cultivo se determinaron mediante un método de cuantificación microbiológico (Izumi y Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", págs. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985), usando la cepa Lactobacillus plantarum IFO 3070 y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. Como resultado, se encontró que las concentraciones de biotina y de precursores en la síntesis de biotina, es decir, ácido 7-ceto-8-aminopelargónico, ácido 7,8-diaminopelargónico y destiobiotina (denominados a partir de aquí "vitámeros de biotina") eran según se muestra en la Tabla 10.
El plásmido pSS209 se escindió con las enzimas
de restricción SpeI y XhoI, y los fragmentos de ADN resultantes se
separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, para preparar
un fragmento de ADN que contenía bio F, Bio C, bio D y bio A, y que
tenía un sitio SpeI introducido en el extremo aguas arriba y un
sitio XhoI introducido en el extremo aguas abajo. El fragmento de
ADN así obtenido se mezcló con pSS301 escindido mediante las enzimas
de restricción SpeI y XhoI, y estos fragmentos de ADN se unieron
entre sí mediante el uso de un kit de unión (disponible de TAKARA
SHUZO Co., Ltd.), según el manual de instrucciones adjunto. El
plásmido así obtenido se denominó pSS306 (Fig. 9).
Se obtuvo Sphingomonas sp. SC42405/pSS306
introduciendo el plásmido pSS306 obtenido en el Ejemplo 20 en
Sphingomonas sp. SC42405 con un generador de impulsos génicos
(fabricado por Bio-Rad Laboratories Inc.) mediante
un método de electroporación (voltaje aplicado 18 kV/cm,
capacitancia 25 \muF, resistencia 400 \Omega).
Se inoculó el contenido de un asa de cultivo de
Sphingomonas sp. SC42405/pSS306 en un tubo de ensayo pequeño
(18 x 150 mm) que contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al
1%, peptona al 2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15%, tetraciclina al 0,005% (pH
7,2)). Como control, se inoculó el contenido de un asa de cultivo
de Sphingomonas sp. SC42405 , que no tenía ningún gen
incorporado, en un tubo de ensayo pequeño (18 x 150 mm), que
contenía 3 ml de un medio de cultivo (glicerol al 1%, peptona al
2%, K_{2}HPO_{4} al 0,15%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,15%
(pH 7,2)). Los dos tipos de bacterias anteriores se cultivaron a
30ºC durante 2 días (250 rpm), para obtener caldos de precultivo. A
continuación, se inocularon 160 \mul de cada uno de los caldos de
precultivo así obtenidos de Sphingomonas sp. sc42405/pSS306
en un tubo de ensayo grande (22 x 220 nm) que contenía 8 ml de un
medio de cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido
casamino al 0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O al
0,01%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1% y tetraciclina al
0,005% (pH 7,0)). Como control, se inocularon 160 \mul del caldo
de precultivo de Sphingomonas sp. sc42405 en un tubo de
ensayo grande (22 x 220 mm), que contenía 8 ml de un medio de
cultivo (glicerol al 6%, extracto de levadura al 2%, ácido casamino
al 0,5%, K_{2}HPO_{4}al 0,1%, KCl al 0,05%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,05%, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O al
0,001%, MnSO_{4}\cdot4~6H_{2}O al 0,1%, (pH 7,0)). Se
cultivaron los dos tipos anteriores de bacterias a 30ºC durante 4
días (250 rpm). Las concentraciones de biotina y compuestos
relacionados con biotina producidas y acumuladas en cada caldo de
cultivo se determinaron mediante un método de cuantificación
microbiológico (Izumi y Yamada "Vitaminological Experimental
Method II. Water-soluble Vitamins", págs.
481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo
Kagaku Dojin, 1985), usando la cepa Lactobacillus plantarum
IFO 3070 y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. Como
resultado, se encontró que las concentraciones de biotina producidas
eran según se muestra en la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un fragmento
de ADN que contiene al menos un gen implicado en la biosíntesis de
biotina, y derivado de un microorganismo perteneciente al género
Sphingomonas, y transformantes productores de biotina obtenidos
utilizando dicho fragmento de ADN, y es útil para mejor la
productividad de biotina, como vitamina esencial para animales,
plantas y algunos microorganismos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Sumitomo Chemical Co., Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fragmentos de ADN que contienen el
gen biotina-biosintetasa y uso del mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C2536 EP/1 S3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 05 00 3876.9
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
02-03-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 97/47838
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-03-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP1998/00858
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-03-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1536
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (427)..(1536)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (202)..(1365)
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 1408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Sphingomonas sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (202)..(1365)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 415
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<212> PRT
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<213> Sphingomonas paucimobilis
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 417
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<212> PRT
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<213> Sphingomonas sp.
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 1448
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<212> ADN
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<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1248)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1254)
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 621
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Sphingomonas paucimobilis
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(621)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(627)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (223)..(1248)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (152)..(1210)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (151)..(1176)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1582
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (489)..(1340)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 971
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (210)..(971)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas paucimobilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sphingomonas sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un fragmento de ADN que contiene un gen que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
representada como SEQ ID NO: 2, 7, 11, 15 o 21, en el que dicho
fragmento se puede obtener del microorganismo Sphingomonas
sp.
2. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho gen se selecciona del grupo formado por un gen de
7-ceto-aminopelargonato-sintetasa,
un gen de
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
un gen de destiobiotina-sintetasa, y un gen de
biotina-sintetasa.
3. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho gen es un gen que codifica
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
y que tiene la secuencia básica de ácido nucleico representada como
SEQ ID NO: 4 ó 5.
4. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína
que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 2
y que tiene actividad
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa.
5. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho gen es un gen que codifica
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
y que tiene la secuencia básica de ácido nucleico representada como
SEQ ID NO: 9.
6. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína
que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO:
7, y que tiene actividad
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa.
7. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho gen es un gen que codifica
destiobiotina-sintetasa y que tiene la secuencia
básica de ácido nucleico representada como SEQ ID NO: 13.
8. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho fragmento contiene un que codifica una proteína que
tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 11, y
que tiene actividad destiobiotina-sintetasa.
9. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho gen es un gen que codifica
biotina-sintetasa y que tiene la secuencia básica de
ácido nucleico representada como SEQ ID NO: 17.
10. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho fragmento contiene un gen que codifica una proteína
que tiene la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO:
15, y que tiene actividad biotina-sintetasa.
11. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que dicho gen es un gen
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
un gen
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
un gen destiobiotina-sintetasa o un gen
biotina-sintetasa.
12. El fragmento de ADN de la reivindicación 1,
en el que el fragmento comprende adicionalmente una región
reguladora de la expresión génica de un gen.
13. El fragmento de ADN de la reivindicación 12,
en el que dicho gen es un gen
7-ceto-8-aminopelargonato-sintetasa,
un gen
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
un gen destiobiotina-sintetasa o un gen
biotina-sintetasa.
14. Un fragmento de ADN que tiene la secuencia
básica representada como SEQ ID NO: 25, obtenida del microorganismo
Sphingomonas sp.
15. El fragmento de ADN de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14, en el que el microorganismo es
Sphingomonas sp. SC42405.
16. Un vector que contiene un fragmento de ADN
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Un método para preparar un vector, que
comprende insertar un fragmento de ADN de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en un vector replicable en células
hospedadoras.
18. El vector de la reivindicación 16, en el que
una región reguladora de la expresión génica está unida aguas arriba
a una región que codifica una proteína.
19. Un transformante no humano que tiene al
menos un fragmento de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 15, o al menos un vector según las reivindicaciones 16 o 18,
introducido en una célula hospedadora.
20. El transformante de la reivindicación 19, en
el que la célula hospedadora es un microorganismo.
21. Un método para preparar transformantes no
humanos, que comprende introducir el vector de las reivindicaciones
16 o 18 en una célula hospedadora.
22. Una proteína codificada por un fragmento de
ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que tiene
actividad
7,8-diaminopelargonato-aminotransferasa,
destiobiotina-sintetasa o
biotina-sintetasa.
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