ES2326549T3 - Eritrocitos que contienen arginina desiminasa. - Google Patents
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Abstract
Eritrocitos que contienen arginina desiminasa para reducir la concentración de arginina en el plasma in vivo.
Description
Eritrocitos que contienen arginina
desiminasa.
La presente invención se refiere a la
disminución de arginina en el plasma, a la composición para
proporcionar dicha disminución y al tratamiento de las patologías
que pueden beneficiarse de dicha disminución y sus efectos, por
ejemplo en la síntesis del óxido nítrico. De este modo, la invención
se refiere al tratamiento de determinados tumores, tales como el
melanoma maligno y el hepatocarcinoma y a la prevención y
tratamiento del choque séptico.
La arginina es un aminoácido no esencial. Se
sintetiza en el transcurso del ciclo de la urea, a partir de la
citrulina en dos etapas, debido a la acción de la argininosuccinato
sintetasa y al argininosuccinato liasa. La primera enzima cataliza
la conversión de la citrulina a argininosuccinato y la segunda
realiza la conversión en arginina. La arginina se metaboliza a
ornitina bajo la acción de la arginasa, y la ornitina puede a su
vez transformarse en citrulina mediante una reacción catalizada por
la ornitina transcarbamoilasa.
Se ha demostrado, sin embargo, que determinados
tipos de células tumorales requieren que se suministre arginina, y
esto conduce a la consideración de la disminución de la arginina
como un posible tratamiento para estas formas de cánceres,
denominado arginina-auxótrofo. La actividad
antitumoral de la arginina desiminasa ha sido el tema de numerosas
publicaciones. De este modo, se ha mostrado actividad in vivo
con respecto al melanoma maligno y al hepatocarcinoma. Sin
embargo, esta enzima adolece de algunos inconvenientes mayores. La
arginina desiminasa no se produce en los mamíferos sino que se
obtiene a partir de microorganismos, haciéndola un compuesto muy
antigénico para un mamífero.
Además, esta enzima tiene una vida media muy
breve en los mamíferos, del orden de aproximadamente 5 horas, y
debe administrarse a diario a una dosis alta para llegar a ser
eficaz. Para superar estos inconvenientes, los autores propusieron
formas pegiladas de esta enzima, es decir arginina desiminasa
conjugada con polietilenglicol (PEG), que conduce a formulaciones
menos antigénicas con una vida media más prolongada (de 7 a 9 días).
Entre los trabajos que tratan de este tema, los autores pueden
mencionar el siguiente que se refiere al tratamiento del melanoma y
del hepatocarcinoma: F. Izzo et al., J. Clin. Oncol.
2004, 22:1815-1822; C:M. Ensor et al.,
Cancer Research 2002, 62: 5443-5450; F.W. Holtsberg
et al. J. Control Release 2002, 80:
259-271; J. S. Bomalaski et al.,
Preclinica, Research Article Nov/Dic 2003, 1, 5:
284-293; Curlay S.A. et al.,
Hepatogastroenterology, 50, 1214-6, 2003.
La patente US nº 4.965.857 propone un
procedimiento completamente diferente, que implica el tratamiento
extracorpóreo de la sangre utilizando un reactor en el que la
arginina desiminasa actúa en la circulación extracorpórea.
Los tratamientos actuales basados en arginina
desiminasa pegilada son interesantes, pero adolecen de determinadas
limitaciones en relación con la necesidad de administrar dosis
relativamente grandes repetidas a intervalos cortos, ya que la vida
media es todavía corta, y con toxicida relacionada con la
administración repetida a alta dosis, a largo plazo con un riesgo
de producir niveles de anticuerpos para el principio activo que
pueden conducir a efectos alérgicos y a la inhibición del principio
activo.
Por consiguiente sería de considerable utilidad
tener a nuestra disposición un producto activo que tenga mejor
biodisponibilidad (mejor actividad biológica, vida media
prolongada), posibilitando optimizar la cantidad de enzima
administrada y disminuir la toxicidad, aun en el caso de
tratamientos repetidos, y limitar los riesgos de la reacción
inmunitaria y la alergia clínica.
La ventaja de utilizar glóbulos rojos como
vectores de productos medicinales se sugirió hace tiempo. Presentan
biocompatibilidad natural y, después de la transfusión, son
completamente biodegradables por un procedimiento conocido y
presentan una vida media relativamente larga in vivo (vida
media del orden de aproximadamente 30 días en el hombre).
La encapsulación de la arginasa, una enzima
natural del ciclo de la urea, se propuso y se probó dentro del
alcance del tratamiento de pacientes hiperargininémicos que
presentan insuficiencia de esta enzima en sus eritrocitos (C. G.
Millan, J. Controlled Release 2004.95: 27-49; K.
Adriaenssens et al., Int. J. Biochem. 1984, 16, 7:
779-786). El objetivo era compensar las
insuficiencias metabólicas enzimáticas relacionadas con la
insuficiencia de arginasa endógena.
La arginasa tiene un pH alcalino óptimo a
aproximadamente 9,5, y su actividad es baja a pH fisiológico. En
cambio, la arginina desiminasa tiene un pH óptimo de aproximadamente
6,5, retiene más del 70% de su actividad a pH fisiológico, y su
afinidad para la arginina es 1000 veces mayor que la de la
arginasa: B.J. Dillon et al., Med. Sci. Monit. 2002,
8, 7: 248-253. En este estudio, que se refiere a la
inhibición de la síntesis del óxido nitrico NO, los autores
describen la fuerte actividad de la arginina desiminasa sobre la
arginina extracelular, pero ausencia de actividad en la arginina
intracelular (macrófagos).
NO es un biomediador y se cree que se sintetiza
esencialmente a partir de la arginina intracelular. El choque
séptico es mediado por NO y por el factor de la necrosis tumoral
TNF\alpha. La inhibición de la síntesis del NO se ha previsto
como un tratamiento contra el choque séptico, de ahí los trabajos de
Dillion et al. supra y de J.B. Thomas Biochem.
J. 2002, 363, 581-587. El NO parece también
estar implicado en los procesos de cancerización, como se describe
en Lind DS. Arginine and cancer. J. Nutr.
2004:2837S-41.
Parece que la arginina desiminasa posee mayor
potencial para la degradación de la arginina y la inhibición de la
síntesis del NO que la arginasa. Sin embargo, esta enzima no
tendría, actividad enzimática intracelular, el pH fisiológico no es
su pH óptimo, tiene una vida media corta y es probable que produzca
una reacción inmunitaria.
Partiendo de esta compleja situación, los
inventores se fijaron el objetivo de proponer una solución técnica
que proporcione degradación eficaz de la arginina del plasma y/o
inhibición de la síntesis del óxido nítrico NO.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
la utilización de eritrocitos que contienen arginina desiminasa
para la preparación de un producto medicinal destinado a disminuir
la concentración de arginina en el plasma in vivo.
La arginina desiminasa está identificada con la
referencia EC 3.5.3.6 en la Nomenclatura Enzimática IUBMB. La
enzima empleada puede ser de origen natural, sintético o artificial,
u obtenida por ingeniería genética (por ejemplo producción de la
enzima en una célula hospedadora, por ejemplo E. Coli, tras
la integración de un vector que expresa el gen que codifica la
enzima). Las argininas desiminasas que pueden utilizarse tal como
se describe, por ejemplo, en los documentos
EP-A-1 011 717,
EP-A-0 414 007,
US-A5 372 942,
JP-A-6062867,
JP-A2053490 y JP-A2035081. De manera
equivalente, la invención incluye la utilización de análogos de
esta enzima que pueden principalmente ser enzimas que han sido
modificadas para aumentar actividad enzimática (documento
EP-A0 981 607).
El objetivo de la presente invención es la
disminución de la arginina en el plasma, lo que significa disminuir
la concentración de arginina en el plasma. Sin querer estar
vinculado por una teoría, se cree que la arginina en el plasma se
introduce en los eritrocitos tratados por difusión pasiva. Los
eritrocitos de la invención se comportan como biorreactores, en los
que la arginina desiminasa degrada la arginina que entra. La
invención ofrece otras ventajas. Al final de su vida, los
eritrocitos son destruidos por los macrófagos, esencialmente en el
hígado, el bazo y en la médula ósea, así como en los pulmones. Esto
conduce a la liberación dirigida de la arginina desiminasa,
produciendo la disminución local de las arginina en el plasma. Este
efecto es utilizado en el tratamiento de patologías, en particular
de tumores, que afectan estos órganos, tal como el
hepatocarcinoma.
La solución adoptada por la invención posibilita
combinar varias ventajas decisivas de manera estable, la vida de
los eritrocitos emite un tiempo prolongado de acción, almacenamiento
de la enzima en un medio que es, por otra parte, favorable, con un
pH generalmente inferior a 7,4 al que la enzima presenta una
actividad enzimática superior al 80% y, por otra parte, conservada,
ya que la enzima se aísla del sistema inmunitario, reduciendo de
este modo el riesgo de desarrollar una reacción inmunitaria para la
enzima, que es una gran ventaja en caso de tratamientos repetidos.
La enzima está protegida de cualquier anticuerpo
anti-arginina desiminasa por la membrana de los
eritrocitos, y su actividad enzimática se conserva por consiguiente
aun cuando los anticuerpos están presentes en la sangre del
paciente que se está tratando. Además, se conservan las células
sanas, ya que la enzima no actúa en la arginina intracelular.
La invención, por consiguiente, encuentra una
aplicación particularmente interesante en los tumores dependientes
de la arginina, para los que se ha demostrado el efecto favorable de
la disminución de la arginina en el plasma (véase por ejemplo F.
Izzo et al, 2004, CM. Ensor et al., 2002, F.W.
Holtsberg et al., 2002, J.S. Bomalaski et al., 2003,
y Curley S.A. et al., 2003, citada anteriormente).
Según una primera forma de realización de la
invención, se propone el producto medicinal para el tratamiento de
los tumores dependientes de la arginina. La expresión dependiente de
arginina significa los tumores que implican células tumorales que
requieren arginina para la replicación, son incapaces de sintetizar
alguna parte o toda la arginina que necesitan, y por consiguiente
requieren un aporte de arginina. La disminución de la arginina en
el plasma privará a estas células de la arginina que es esencial
para su desarrollo, lo que conduce a la muerte programada de estas
células, a la inhibición del crecimiento del tumor o a la regresión
de la masa tumoral.
Según una característica, la invención se
refiere a la utilización de estos eritrocitos para la preparación
de un producto medicinal destinado al tratamiento del
hepatocarcinoma o del cáncer de hígado primario.
Según una segunda característica, la invención
se refiera a la utilización de estos eritrocitos para la preparación
de un producto medicinal para tratar el melanoma maligno, en sus
varias formas, tal como el melanoma que se extiende en superficie y
el melanoma ganglionar.
Según una segunda forma de realización de la
invención, la invención se refiere a la utilización de estos
eritrocitos para la preparación de un producto medicinal destinado
a inhibir las síntesis del óxido nítrico. Debe señalarse que el
producto medicinal actúa por lo menos parcialmente mediante la
degradación de la arginina del plasma, como se describe en Dillon
et al., 2002, citada anteriormente.
Según una característica de esta forma de
realización, la invención se refiere a la utilización de estos
eritrocitos para la preparación de un producto medicinal destinado
a la prevención y/o el choque séptico.
La invención se refiere además a la utilización
de estos eritrocitos para la preparación de un producto medicinal
destinado al tratamiento de una de las siguientes formas de
cáncer:
- -
- Cáncer de mama (Shen Wei-Chiang et al., California Breast, cancer research: http://www.cbcrp.org/ research/PageGrant,asp?grant_id=1954)
- -
- Neuroblastoma (Gong H. et al., Int. J. Cancer 2003,106:723-8)
- -
- Leucemia (Gong H. et al., Leukemia 2000, Vol. 14, 826-9; Noh E.J. et al., Int. J. Cancer 2004, 112: 502-8);
o para la inhibición de angiogénesis y el
tratamiento de las enfermedades asociadas tales como: angioma,
angiofibroma, artritis, retinopatía diabética, retinopatía del
prematuro, glaucoma neovascular, enfermedad de la córnea, formas
involutivas y otras de degeneración macular, terigión, degeneración
retiniana, fibroplasia retrolenticular, psoriasis, telengiectasia,
granuloma piógeno, dermatitis seborreica, acné, cáncer y metástasis
relacionada con la angiogénesis (WO 0209741; Park I.S. et
al., Br. J. Cancer 2003, 89: 907-14).
La invención se refiere asimismo a eritrocitos
que contienen arginina desimilasa.
La invención se refiere asimismo a una
suspensión de estos eritrocitos en una solución salina
farmacéuticamente aceptable (generalmente, medio patrón para
eritrocitos, solución que contiene NaCl y uno o más ingredientes
seleccionados de entre glucosa, dextrosa, adenina y manitol; p. ej.
SAG-manitol o ADsol). Dicha solución puede
proporcionar conservación de los eritrocitos, y puede incluir un
conservante tal como la L-carnitina. Dicha
suspensión puede estar envasada lista para su uso o para dilución
antes de su uso.
El valor de hematocrito final del producto listo
para usar (después de la dilución antes de su uso, si es necesario)
está comprendido preferentemente entre 40 y 70%. Puede administrarse
por vía intravenosa, preferentemente por perfusión.
Dicha suspensión o cualquier formulación
administrable que contiene eritrocitos según la invención
constituye en sí misma un producto medicinal o una composición
farmacéutica comprendida por la invención. Dicho producto o
composición medicinal puede principalmente ser propuesta para varias
aplicaciones mencionadas anteriormente. Puede envasarse por ejemplo
como una bolsa flexible para perfusión o en alguna otra forma para
administración por inyección.
Según una característica de la invención, el
producto medicinal comprende una suspensión de eritrocitos con un
valor de hematocrito entre 40 y 70%, preferentemente entre 45 y
55%, y más preferentemente de 50%. Está preferentemente envasado en
un volumen de 10 a 250 ml. La cantidad de enzima encapsulada
correspondiente a la receta médica está preferentemente contenida
totalmente en una bolsa de sangre. Una prescripción médica puede
variar entre 1 y 200 U.I. por kg de peso corporal.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de tratamiento de formas de cáncer dependientes de
arginina, tales como el hepatocarcinoma y el melanoma maligno, o
una de las demás patologías cancerosas o no cancerosas mencionadas
anteriormente, que comprende la administración de una cantidad
eficaz de dicho producto medicinal a un paciente que lo necesita,
principalmente por vía intravenosa, por inyección o perfusión y
preferentemente por perfusión.
Según una modalidad interesante, el paciente es
tratado tras la extracción quirúrgica del tumor.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de tratamiento propuesto para inhibir la síntesis del
óxido nítrico y/o impedir y/o tratar el choque séptico, que
comprende la administración de una cantidad eficaz de dicho
producto medicinal a un paciente, principalmente por vía
intravenosa, por inyección o perfusión y preferentemente por
perfusión.
Según una modalidad particularmente ventajosa
para estos varios procedimientos de tratamiento, el paciente es
tratado con sus propios eritrocitos, después que se han tratado para
la encapsulación de la enzima. Como variante, se extraen
eritrocitos de uno o más donantes.
El procedimiento puede comprender, de este modo,
recoger una o más muestras de sangre, como por ejemplo bol-
sa(s) de sangre, de un paciente o de uno o más donantes, la preparación de un depósito o concentrado de eritrocitos, la incorporación de la enzima según la invención y la producción de un lote de eritrocitos que incorporan la enzima, a continuación la administración de la suspensión (producto medicinal) al paciente, por vía intravenosa.
sa(s) de sangre, de un paciente o de uno o más donantes, la preparación de un depósito o concentrado de eritrocitos, la incorporación de la enzima según la invención y la producción de un lote de eritrocitos que incorporan la enzima, a continuación la administración de la suspensión (producto medicinal) al paciente, por vía intravenosa.
Por lo general, se administra un volumen de
suspensión de eritrocitos tratados correspondiente a 1 a 200 I.U. de
enzima por kg de peso corporal. Según una característica de la
invención, se administran de 10 a 250 ml de una suspensión de
eritrocitos a un valor de hematocrito entre 40 y 70%,
preferentemente entre 45 y 55% y más preferentemente de 50%.
Según una modalidad particular, dicha suspensión
se administra a una frecuencia entre 15 días y tres meses, con
preferencia mensualmente, durante un período de tiempo
suficiente.
Las técnicas para la encapsulación de los
principios activos en los eritrocitos son conocidas y la técnica
básica por lisis-resellado, que es la preferida
aquí, esta descrita en las patentes
EP-A-101 341 y
EP-A-679 101, a la que un experto
en la materia puede referirse. Según esta técnica, se suministra
continuamente una suspensión de eritrocitos al compartimento
primario de un dializador, mientras que el compartimento secundario
contiene una solución acuosa que es hipotónica con relación a la
suspensión de eritrocitos con objeto de lisar los eritrocitos; a
continuación, en una unidad de resellado, se produce el resellado de
los eritrocitos en presencia de la enzima aumentando la presión
osmótica y/o oncótica, a continuación se recoge una suspensión de
eritrocitos que contiene la enzima.
Entre las variantes descritas hasta la fecha, se
prefiere el método descrito en la solicitud de patente francesa No.
0408667, que proporciona encapsulación eficaz, reproducible, fiable
y estable de la enzima. Este procedimiento comprende las etapas
siguientes:
- 1
\;
- - puesta en suspensión de concentrado de glóbulos rojos (PRBC) (o concentrado globular) en una solución isotónica en un índice hematocrito superior o igual al 65%, refrigeración entre +1 y +8ºC,
- 2
\;
- - medición de la fragilidad osmótica en una muestra de eritrocitos de los mismos PRBC,
- en la que las etapas 1 y 2 pueden realizarse en cualquier orden (incluyendo en paralelo),
- 3
\;
- - procedimiento para la lisis e interiorización de la enzima (en particular en una y la misma cámara) a una temperatura mantenida constante entre +1 y +8ºC, que comprende pasar la suspensión de eritrocitos a un índice hematocritos superior o igual al 65% y una solución de lisis hipotónica refrigerada entre +1 y 8ºC a través de un cartucho de diálisis; estando los parámetros de la lisis ajustados en fusión de la fragilidad osmótica medida anteriormente; y
- 4
\;
- - procedimiento de resellado (realizado en particular en una segunda cámara) en el que la temperatura esta comprendida +30 y +40ºC, en presencia de solución hipertónica.
- "Interiorización" significa la penetración de la enzima dentro de los eritrocitos.
Según una primera característica de la
invención, los PRBC se ponen en una solución isotónica a un valor de
hematocrito elevado, superior o igual al 65%, y preferentemente
superior o igual al 70%, y esta suspensión se refrigera entre +1 y+
8ºC, preferentemente entre +2 y +6ºC, y por lo general a
aproximadamente +4ºC. Según una modalidad particular, el valor de
hematocrito está comprendido entre 65 y 80%, y preferentemente entre
70 y 80%.
Según una característica importante de la
invención, la fragilidad osmótica de los eritrocitos se mide justo
antes de la etapa de lisis. Los eritrocitos o la suspensión que los
contiene están de manera ventajosa a una temperatura próxima o
igual a la temperatura seleccionada para la lisis. Según otra
característica ventajosa de la invención, una vez se ha obtenido la
medición de la fragilidad osmótica se utiliza rápidamente, es decir
el procedimiento de lisis se realiza muy pronto después de tomar la
muestra. Este retardo de tiempo entre la toma de muestras y el
comienzo de la lisis es preferentemente inferior o igual a 30
minutos, y aun más preferentemente inferior o igual a 25 o incluso
20 minutos.
Los dos parámetros que permiten que la diálisis
sea controlada son el tiempo de retención de las células en el
dializador (en función de las características de estas últimas) y la
osmolaridad del dializado. Estos dos parámetros deben ser ajustados
en relación con las características de la resistencia osmótica, o
por el contrario la fragilidad, de los glóbulos rojos que se
procesan para experimentar las etapas de lisis/resellado. Esta
resistencia osmótica puede caracterizarse por al menos uno de los
parámetros siguientes:
- a.
- La osmolaridad del medio en el que aparece la hemólisis, es decir, el comienzo de la formación de poros.
- b.
- La velocidad V de hemólisis, determinada por la pendiente de la parte lineal de la curva % de hemólisis = (osmolaridad del medio).
- c.
- El porcentaje de hemólisis para una osmolaridad dada.
- d.
- La osmolaridad a la que se obtiene el 50% de hemólisis (H_{50}).
- e.
- El tiempo transcurrido para obtener un determinado porcentaje de hemólisis (por ejemplo 50%).
Según las formas de realización preferidas, la
resistencia osmótica se caracteriza por medio de los parámetros b, d
o b y d.
La fragilidad osmótica debe medirse, por
consiguiente, en un período corto, compatible con el período corto
de demora entre la toma de muestra y el comienzo de la lisis. Según
una característica de la invención uno o más de estos parámetros de
la hemólisis se miden frente a una solución hipotónica de
isotonicidad conocida p. ej. agua (agua destilada, etc.) a través
de una membrana semipermeable. Puede preverse un procedimiento
manual. Sin embargo, según una forma de realización, la fragilidad
osmótica se mide utilizando un instrumento de medición automático
que se diseña para medir la fragilidad osmótica de una muestra de
eritrocitos en menos de 15 minutos, más específicamente en menos de
12 minutos y preferentemente en menos de 10 minutos, y el resultado
obtenido se utiliza con una demora breve para ajustar los parámetros
de la lisis, y comienza la lisis.
La fragilidad osmótica puede medirse utilizando
un instrumento que automatiza, al menos en parte, la técnica manual
descrita por J. V. Dacie en Practical Haematology, 2^{a} edición,
Churchill, Londres 1956. Un ejemplo de dicho instrumento está
descrito en el artículo de J. Didelon et al., Clinical
Hemorheology and Microcirculation 23 (2003)
31-42. El principio se basa en la utilización de un
dispositivo en el que la muestra de la suspensión de eritrocitos
que debe evaluarse, y una solución hipotónica conocida, por e.j.
agua destilada, de volúmenes adecuados, se colocan en uno de los
lados de una membrana semipermeable, con el fin de generar hemólisis
lenta de los eritrocitos a medida que los iones de NaCl se difunden
hacia la solución, por ejemplo agua destilada. El avance de la
hemólisis a lo largo del tiempo se controla midiendo la
transmitancia (véase J. Didelon et al., Biorheology 37,
2000: 409-416) utilizando radiación láser con una
longitud de onda de 808 nm. Una célula fotoeléctrica mide la
variación en la luz transmitida a través de la suspensión. Por
ejemplo, se toman mediciones durante 10 minutos. El instrumento
proporciona uno o más de los parámetros a-e
mencionados anteriormente.
Según una primera modalidad, la fragilidad
osmótica se mide en una muestra cuya temperatura inicial está
comprendida entre +1 y +8ºC, preferentemente con agua destilada
también a esta temperatura, en condiciones en las que la variación
de temperatura no afecta la medición. Según una segunda modalidad,
la fragilidad osmótica se mide en una muestra mantenida a una
temperatura entre +1 y +8ºC. De este modo, el instrumento de
medición descrito en J. Didelon et al., (anteriormente)
puede modificarse para permitir la regulación de la temperatura.
Dicha temperatura preferentemente es próxima o igual a la
temperatura de lisis.
Una vez se han determinado uno o más de estos
parámetros, puede aplicarse una relación que tiene en cuenta dicho
parámetro o parámetros con objeto de determinar si el caudal de las
células en el dializador, o la osmolaridad del dializado es
suficiente para obtener glóbulos rojos que encapsulan la enzima la
cantidad deseada de esta última:
Caudal de
eritrocitos = [A x (H_{50})] + [B x (V)] +
K
- -
- A y B = variables que pueden adaptarse en relación con el dializador y la osmolaridad de la solución de lisis.
- -
- K = Constante para el ajuste.
Osmolaridad del
dializado = [C x (H_{50})] + [D x (V)] +
K
- -
- C y D = variables que pueden adaptarse en relación con el dializador y caudal de eritrocitos en el dializador.
- -
- K = Constante para el ajuste.
Según un aspecto de la invención, el
procedimiento de lisis comienza cuando la temperatura de la
suspensión de eritrocitos está comprendida entre +1 y +8ºC, y se ha
medido la fragilidad osmótica y se han registrado los parámetros de
la lisis.
Según una forma de realización preferida, la
concentración de NaCl en g/l que lleva aproximadamente 50% de
hemólisis se mide (parámetro d.) y el caudal de la suspensión de
eritrocitos en el cartucho de diálisis se ajusta según los valores
de concentración medidos.
Según un aspecto de la invención, el
procedimiento de lisis comienza cuando la temperatura de la
suspensión de eritrocitos está comprendida entre +1 + 8ºC, y se ha
medido la fragilidad osmótica y se han registrado los parámetros de
la lisis.
Según una característica ventajosa, la
suspensión inicial que debe tratarse se coloca en la cámara de
lisis-interiorización mencionada anteriormente.
Según una forma de realización de la invención, el procedimiento
emplea un modulo refrigerado equipado con control de temperatura, y
en este modulo se coloca una bolsa de la suspensión de eritrocitos
refrigerada entre +1 y +8ºC, ya conectada, o que se conecta
entonces, a un conjunto intercambiable esterilizado disponible, que
comprende un cartucho de diálisis, tubos para conectar el cartucho a
la bolsa y a la solución de lisis, y además el modulo tiene medios
para proporcionar la circulación de la suspensión de eritrocitos y
de la solución de la lisis, estando la temperatura en dicho modulo
estabilizada a una temperatura comprendida +1 y +8ºC. El modulo
refrigerado está dimensionado de modo que pueda acomodar la bolsa y
el conjunto intercambiable disponible. La disposición de la bolsa,
el cartucho de diálisis y la solución de lisis, conectados por
varios tubos, en dicho modulo refrigerado individual existe una
característica ventajosa del procedimiento según la invención.
El término "bolsa" se refiere a las bolsas
o sacos flexibles comúnmente utilizados en el campo de la
transfusión de sangre y de derivados de sangre.
Según un aspecto importante de la invención, las
etapas se efectúan para mantener los eritrocitos en suspensión
homogénea en la bolsa, con el fin de mantener un índice hematocrito
estable de la suspensión que pasa a través del dializador. Según
una característica de la invención, la bolsa está provista por
consiguiente de circulación externa en un bucle, que proporciona
circulación de la suspensión desde y hasta la bolsa.
La expresión "Cartucho de diálisis"
significa un elemento que comprende dos compartimientos separados
por un tabique para la diálisis, a través del cual puede tener
lugar el intercambio iónico, permitiendo que se altere de manera
controlada la presión osmótica de una solución acuosa situada en uno
de los compartimentos introduciendo una solución acuosa que
contiene una sal en el otro compartimento. Este tipo de cartuchos se
utiliza extensamente en el campo médico. Según una modalidad
preferida, se utiliza un cartucho para diálisis de fibra hueca, que
tienen por ejemplo las especificaciones siguientes: diámetro interno
de las fibras entre 100 y 400 \mum, superficie externa total de
las fibras entre 0,3 y 2 m^{2}, longitud de las fibras entre 10 y
40 cm, coeficiente de ultrafiltración entre 1,5 y 8 m/h.mm Hg.
Como ya se mencionó, el procedimiento de lisis
puede iniciarse cuando la temperatura de la suspensión está
comprendida entre +1 y +8ºC. Según una modalidad interesante la
temperatura de la suspensión se controla mediante un detector
situado en la circulación del bucle externo.
Dependiendo de la fragilidad osmótica
determinada, puede tomarse acción en dos parámetros principales, el
caudal de la suspensión de eritrocitos en el cartucho de diálisis y
la osmolaridad y la solución de lisis, siendo preferible fijar, en
ambos casos, un caudal constante para la solución de lisis. El valor
del caudal no es crítico. Por lo general, para un cartucho de
diálisis de fibra hueca tal como se describió anteriormente, el
caudal de la solución de lisis se fija entre 50 y 300 ml/min, y
preferentemente entre 150 y 250 ml/min.
La solución de lisis es una solución salina que
es hipotónica con respecto a la suspensión de los glóbulos rojos.
Cuando se fija a un valor constante, su osmolaridad puede estar
comprendido por lo general entre 20 y 120 mOsm, preferentemente
entre 70 y 110 mOsm, por ejemplo del orden de 90 mOsm.
Como ejemplo, la solución de lisis puede
comprender Na_{2}HPO_{4} y/o NaH_{2}PO_{4} y un azúcar tal
como la glucosa.
Según una primera modalidad, se ajusta el caudal
de la suspensión de eritrocitos a través del cartucho de diálisis,
mientras que el caudal y la osmolaridad del tampón de lisis son
fijos. Fragilidad osmótica superior significa el caudal mayor de la
suspensión. Por lo general, para un cartucho con las
especificaciones indicadas anteriormente, el caudal necesitara
variar en el intervalo entre 5 y 200 ml/min. Preferentemente entre
10 y 40 ml/min.
Según una segunda modalidad, la osmolaridad de
la solución de la lisis se ajusta, mientras que los caudales de la
suspensión y de la solución de lisis son fijos. Fragilidad osmótica
superior significa aumentar la osmolaridad de la solución de lisis.
Por lo general, la osmolaridad, necesitará variar en el intervalo
comprendido entre 10 y 200 mOsm/l, preferentemente entre 20 y 150
mOsm/l.
Según una tercera modalidad, tanto el caudal de
la suspensión de eritrocitos a través del cartucho de diálisis,
como la osmolaridad de la solución de lisis se ajustan.
La enzima que debe encapsularse puede estar
presente en la bolsa de suspensión y/o puede introducirse,
preferentemente poco a poco, en la circulación de la suspensión
corriente arriba o corriente abajo del cartucho de diálisis. Ya que
los volúmenes introducidos son pequeños, la refrigeración de la
enzima es opcional.
Preferentemente, la suspensión de glóbulos rojos
se produce a partir de los PRBC de un grupo sanguíneo compatible
con el receptor, desleucocitado, sin patógeno listado,
principalmente presentada en una bolsa, por ejemplo de 500 ml. Los
glóbulos rojos pueden haber sido irradiados cuando están destinados
a pacientes muy inmunodeprimidos susceptibles de presentar una
reacción inmunitaria injerto/hospedador (R.J. Davey, Immunol.
Invest. 1995, 24(1-2):
143-149).
Según una característica específica de la
invención, los PRBC iniciales, utilizados para preparar la
suspensión, se trataron de antemano para eliminar los elementos de
la sangre distintos de los eritrocitos. Este tipo de tratamiento,
por ejemplo lavado con una solución salina para eliminar el plasma o
una solución de conservación, es conocido por los expertos en la
materia.
Según una modalidad especifica, el lavado se
realiza en presencia de la enzima que va a encapsularse.
El lavado puede realizarse por cualquier técnica
habitual, como la bolsa cuádruple o la técnica de 4 bolsas para el
lavado de los glóbulos rojos (procedimiento MacoPharma y bolsa de
transferencia). También es posible utilizar un lavador de glóbulos
rojos automático del tipo COBE 2991 Cell Processor.
Según otra característica de la invención, los
eritrocitos pueden tratarse de antemano con una solución para
aumentar y/o homogenizar su resistencia osmótica. Dichas soluciones
son conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, una
solución que contiene L-carnitina puede proporcionar
una mejorara de la resistencia osmótica de los glóbulos rojos. Como
otros ejemplos, se pueden mencionar las soluciones de heparina, de
citrato-fosfato-dextrosa (CPD) y de
manitol.
La temperatura durante la etapa de lisis se
mantiene preferentemente entre +2 y +6ºC incluso más preferentemente
alrededor de +4ºC.
El proceso de resellado se efectúa
preferentemente calentando la suspensión lisada y añadiendo una
solución hipertónica de resellado. La temperatura de resellado
puede estar entre +30 y +40ºC. Está comprendida preferentemente
entre +35 y +38ºC, por ejemplo aproximadamente 37ºC. La incubación
por lo general puede durar de 15 a 45
minutos.
minutos.
Preferentemente, las suspensión que deja el
cartucho de diálisis así como la solución de resellado hipertónica
se introducen, con preferencia continuamente, en una bolsa
intermedia. Ahí se calienta la suspensión, y se incuba a la
temperatura deseada durante un tiempo suficiente para asegurar el
resellado. Según un aspecto particular, la bolsa intermedia se
coloca en el módulo calentado o el recipiente, cuya temperatura
interior se regula a la temperatura elegida.
Como variante, la suspensión y la solución de
resellado se introducen en una bolsa intermedia. Cuando toda la
suspensión se ha recogido en esta bolsa se sella y se transfiere a
un módulo para calentamiento e incubación a la temperatura
deseada.
La suspensión de los glóbulos rojos resellados
puede entonces experimentar una o más etapas de lavado con una
solución salina, con objeto de eliminar las células que se
resellaron poco o no se resellaron, los residuos y la hemoglobina
extracelular.
Según otra característica, los eritrocitos se
concentran en una solución de almacenamiento de eritrocitos que
contiene, por ejemplo, L-carnitina.
Los eritrocitos producidos se almacenan
preferentemente a una temperatura comprendida entre +1 y +8ºC,
preferentemente entre +2 y +6ºC, por lo general a aproximadamente
+4ºC.
El valor de hematocrito final del producto está
comprendido preferentemente entre 40 y 80%, por lo general entre 40
y 70%.
La presente invención puede realizarse
utilizando un dispositivo de resellado para lisis que comprende:
- -
- un módulo que puede refrigerarse a una temperatura comprendida entre +1 y +8ºC, que comprende medios de refrigeración y medios de regulación de la temperatura,
- -
- un conjunto intercambiable estéril desechable, diseñado para fijar en el módulo y que comprende un cartucho para diálisis que puede conectarse por una parte a una alimentación de la solución de lisis y por otra parte a una alimentación de la suspensión de eritrocitos,
- -
- unos medios para controlar el caudal de la suspensión de eritrocitos a través del cartucho de lisis y/o ajustar la osmolaridad de la solución de lisis, en función de la fragilidad osmótica de los eritrocitos que han de tratarse.
Según una forma de realización, el conjunto
intercambiable es un kit desechable y comprende una bolsa para
contener la suspensión de eritrocitos y un tubo que conecta dicha
bolsa al cartucho de diálisis, y el módulo comprende una bomba que
trabaja junto con dicho tubo para circular la suspensión de
eritrocitos desde la bolsa hasta y a través del cartucho, estando
dicha bomba acoplada además a medios de regulación del caudal. El
conjunto asegura que se mantiene la esterilidad.
Según una característica ventajosa, la bolsa
está equipada además con un tubo con ambos de sus extremos
conectados en un bucle a la bolsa, y el módulo contiene una bomba
que actúa junto con dicho tubo para proporcionar la circulación de
los contenidos de la bolsa desde y hasta dicha bolsa.
Según otra característica ventajosa, se dispone
de un detector de temperatura en dicho bucle del tubo.
Según otra característica, un tubo de inyección
de la enzima está conectado al tubo que conecta la bolsa a la
entrada de la "sangre" del cartucho de diálisis.
Según otra característica, el cartucho de
diálisis está conectado mediante un tubo a una botella que puede
contener la solución de lisis y el módulo refrigerado contiene
medios para recibir dicha botella y una bomba que puede operar
junto con dicho tubo para circular la solución de lisis hasta y a
través del cartucho de diálisis.
Según una característica, los medios de
refrigeración y de control de temperatura son capaces de mantener
una temperatura entre +2 y +6ºC y preferentemente del orden de +4ºC
en el módulo.
Según otra característica, la salida de la
"sangre" del cartucho de diálisis está conectada a un tubo de
salida que conduce, o que puede conducir, al exterior del módulo.
Según otra característica, un tubo para el principio activo está
conectado a dicho tubo de salida. El tubo de salida puede estar
conectado a una segunda bolsa (bolsa intermedia) que es capaz de
recoger la suspensión de eritrocitos después de la lisis así como
una solución de resellado (introducida preferentemente por una
apertura del tubo secundario en el tubo de salida un poco corriente
arriba de su abertura de la bolsa intermedia). Dicha bolsa está
dispuesta ventajosamente en un segundo módulo equipado con unos
medios de control de la temperatura en dicho módulo entre +30 y
+40ºC preferentemente +35ºC y +38ºC.
Según una forma de realización ventajosa, el
montaje intercambiable desechable contiene todo lo siguiente: las
bolsas, tubos de circulación, tubos de inyección, (equipados con un
dispositivo de inyección o un receptáculo que está destinado a
operar con dicho dispositivo), cartucho de diálisis y
preferentemente una botella de solución de lisis.
Preferentemente, el conjunto intercambiable no
tiene medios específicos proyectados para la refrigeración o el
calentamiento. Estas funciones son proporcionadas solamente por los
módulos o cámaras en las que las se colocan las dos partes del
conjunto.
Las bombas utilizadas en el procedimiento y el
dispositivo de la invención son preferentemente bombas
peristálticas; según una forma de realización, la bomba que
proporciona la recirculación de la suspensión desde y hasta la
bolsa inicial y la bomba para circulación del tampón de lisis tienen
una velocidad de rotación predeterminada constante, mientras que la
bomba que envía la suspensión al cartucho de diálisis tiene una
velocidad de rotación que es controlable en función de la
fragilidad osmótica de los eritrocitos que deben tratarse.
La enzima puede introducirse por cualquier medio
adecuado, por ejemplo una bomba de inyección de flujo fijo,
opcionalmente dirigida, conectada al correspondiente tubo de
inyección. Como variante, las bombas de inyección pueden
sustituirse con bombas peristálticas.
El dispositivo incluye unos medios de control de
caudal de la suspensión de eritrocitos a través del cartucho de
lisis y/o la osmolaridad de la solución de lisis, en función de la
fragilidad osmótica de los eritrocitos que deben tratarse.
Según una característica, los medios de
regulación del caudal se diseñan para controlar la bomba que envía
la suspensión al cartucho de diálisis. Según otra, característica
alternativa, se diseñan unos medios de regulación para regular la
osmolaridad de una solución de lisis, ya sea por dilución para bajar
la osmolaridad, o para aumentar dicha osmolaridad introduciendo un
soluto adecuado. Como variante, se introduce en el módulo una
solución de lisis de osmolaridad ajustada a la fragilidad osmótica
de los eritrocitos que deben tratarse.
Según una modalidad preferida, el dispositivo
comprende medios electrónicos para controlar el proceso de lisis y
finalmente el proceso de resellado, según las instrucciones
introducidas por el operador (p. ej. el operador introduce
directamente los datos relativos al caudal de la suspensión de
eritrocitos) o según los datos introducidos por el operador, en
relación con la fragilidad osmótica (se diseñan los medios
electrónicos para determinar y ajustar los parámetros de la lisis,
p. ej. el caudal de la suspensión de eritrocitos). Dichos medios
electrónicos están conectados preferentemente a detectores de
temperatura (para controlar la temperatura en los módulos y/o en el
detector de temperatura para la suspensión de eritrocitos). Dichos
medios pueden operar y controlar las bombas, por ejemplo la presión
y el caudal de la suspensión a través del cartucho de diálisis.
Preferentemente, los módulos están equipados, en
una cara por lo menos, con una superficie de cristal, para el
control visual de la instalación y la circulación de las soluciones
y suspensiones.
La invención se describirá a continuación con
más detalle basándose en las formas de realización que se utilizan
a modo de ejemplos no limitativos, haciendo referencia a los dibujos
en los que:
- La Fig. 1 es una representación esquemática de
un dispositivo de lisis-resellado según la
invención;
- la Fig. 2 es un diagrama de flujo del
procedimiento;
- la Fig. 3 es un gráfico que ilustra las
concentraciones de arginina frente a citrulina en el sobrenadante
de los glóbulos rojos con o sin ADI (arginina desiminasa);
- las Fig. 4 y 5 representan unos gráficos en
relación con los farmacocinéticos en los glóbulos rojos para
concentraciones de arginina y citrulina; la Figura 4 presenta la
variación en concentración de arginina durante el tiempo (hasta 48
horas después del tratamiento) y la Figura 5 presenta la variación
en la concentración de citrulina durante el tiempo (hasta 48 horas
después del tratamiento) para tres grupos de ratones tratados con:
ADILE (glóbulos rojos cargados con arginina desiminasa) ADI
(arginina desiminasa libre) +RBC o RBC.
Las siglas RBC ó BC se utilizan en la presente
memoria para designar a los glóbulos rojos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se hará referencia a la Fig. 1. Un primer
recuadro presentado por líneas de puntos representa un primer modulo
1, que tiene una forma general de un paralelepípedo, con un frente
cubierto por un cristal (no mostrado), dispuesto de modo que puede
abrirse y cerrarse. En el dorso de este modulo hay bombas
peristálticas P1, P2 y P3 y unos medios, no mostrados, para recibir
un conjunto intercambiable que se describirá a continuación. Las
bombas P1 y P3 tienen una descarga constante y predeterminada. La
bomba P2 está controlada de modo que varía su descarga.
El conjunto intercambiable incluye una bolsa 2
que es flexible en volumen, que contiene una suspensión de
eritrocitos que va a lisarse. Dicha bolsa 2 está equipada con un
tubo flexible 3, en un bucle que opera junto con la bomba P1, para
proporcionar la circulación desde y hasta la bolsa para mantener los
eritrocitos en suspensión. Dicha bolsa esta además conectada a su
base a un tubo flexible 4 conectado a la entrada del compartimento
de "sangre" de un cartucho de diálisis 5. Dicho tubo 4 opera
junto con la bomba P2, que proporciona la circulación de la
suspensión desde la bolsa al cartucho. Una bomba de inyección
accionada PS1 está conectada al tubo 4 corriente arriba del
cartucho 5, y dicha bomba de inyección permite que la enzima sea
introducida en la circulación de los eritrocitos. La salida del
compartimento de la "sangre" del cartucho 5 está conectada a un
tubo 6 flexible externo, que opera en el exterior del modulo 1. Una
segunda bomba de inyección accionada PS2 está conectada al tubo 6,
y esta bomba de inyección permite que la enzima sea introducida en
la circulación de los eritrocitos utilizados. Una botella 7 que
contiene una solución de lisis está dispuesta en el módulo 1, y
está conectada a la entrada del "dializado" del cartucho 5
mediante un tubo 8 flexible, que opera junto con la bomba P3 para
proporcionar la circulación de la solución de lisis a través del
cartucho 5. Por último, la solución de lisis que abandona el
cartucho es extraída del modulo 1 por un tubo 9 de descarga
flexible, que termina en una botella 10 situada en el exterior del
módulo 1.
El tubo 6 externo entra en un segundo modulo 11
con la fórmula general de un paralelepípedo, con un frente cubierto
de cristal (no mostrado), dispuesto de modo que puede abrirse y
cerrarse. En el dorso de este módulo existen medios, no mostrados,
para recibir elementos que forman parte del conjunto intercambiable
que se acaba de describir en parte. Dichos elementos comprende una
bolsa 12 flexible, conectada al tubo 6, y en el que la suspensión
lisada se almacenará. Una bomba de inyección PS3 accionada está
conectada al tubo 6, para inyectar el producto resellador.
El conjunto intercambiable es enteramente de
plástico flexible y transparente de modo que el proceso es
completamente visible.
El dispositivo está provisto asimismo de varios
medios que no se muestran:
- -
- unos medios para enfriar el interior del módulo 1 y regular su temperatura entre +2 y +4ºC que comprende, entre otras cosas, un detector de temperaturas situado en el tubo 3 para medir la temperatura de la suspensión que circula en éste, y un detector de temperatura para medir la temperatura T1 dentro del módulo 1,
- -
- el modulo 1 está provisto además de medios de calentamiento del interior del modulo 11 y de regulación de la temperatura T2 en éste entre +37 y 38ºC; un detector de temperatura está provisto dentro del módulo.
- -
- unos medios (por ejemplo ultrasónico o colorimétrico) para detectar la presencia de eritrocitos en los tubos, en D1 y D2,
- -
- unos medios PR1 para medir la presión a la entrada del cartucho de diálisis.
- -
- un dispositivo electrónico que recibe por una parte datos que llegan de los sensores de temperatura y de presión y medios de detección, y por otra parte datos referentes a los puntos de consigna de los parámetros de lisis; basándose en dichos datos, el dispositivo controla las bombas P1, P2 y P3. En la Fig. 2 se presenta un diagrama de flujo del proceso.
El dispositivo electrónico comprende un
ordenador, diseñado para ejecutar el diagrama de flujo anterior.
La puesta en práctica de dicho dispositivo
conduce a la recuperación, en 12 de una bolsa que contiene una
suspensión de eritrocitos que contienen la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se extraen del paciente 400 ml de sangre. La
sangre, mantenida a 4ºC, se desleucocita y se lava con una solución
salina para eliminar el plasma y se coloca en una bolsa flexible de
250 ml de volumen, a un hematocrito ajustado al 80%.
Se añade una solución acuosa de arginina
desiminasa a la suspensión de eritrocitos a fin de obtener una
concentración de 400 U.I. de enzimas por ml y un hematocrito del
70%.
Se toma 1 ml de la suspensión a 4ºC y se coloca
en el instrumento para medir la fragilidad osmótica descrita en J.
Didelon et al. 2.000 citada anteriormente, cuyo principio de
operación se describió anteriormente. Se toman mediciones durante
10 minutos. El instrumento posibilita determinar la salinidad que
proporciona el 50% de hemólisis. Esta salinidad está comprendida
generalmente entre 3 y 5,5 g NaCl por litro.
La bolsa 2 flexible de 250 ml de capacidad, que
contiene la suspensión de eritrocitos y la enzima, se coloca en la
instalación del Ejemplo 1, y la suspensión y la solución de lisis
hipotónica se admiten gradualmente en los compartimentos
respectivos del cartucho de diálisis. El caudal de la suspensión de
eritrocitos en el dializador se controla entre 15 y 30 ml/min en
función del parámetro de salinidad determinado en la etapa de
tratamiento (fragilidad o resistencia osmótica).
La solución de resellado se añade en línea al
10% v/v a la suspensión de eritrocitos lisados justo corriente
arriba de la bolsa 12. Se incuba la suspensión durante 30 min a 37ºC
en la bolsa. Se lava a continuación con una solución salina, se
añade a ella una solución conservante (SAG-manitol),
a continuación se almacena la bolsa a +4ºC hasta que se
utiliza.
El procedimiento posibilita obtener eritrocitos
con una actividad enzimática comprendida entre 80 y 180 U.I. por ml
de eritrocitos puros.
El volumen total de la suspensión se administra
al paciente por perfusión intravenosa según la práctica habitual de
la transfusión de sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La arginina desaminasa es una arginasa que
cataboliza la enzima que transforma arginina en citrulina y
amoniaco. El objetivo del estudio consistía en observar y confirmar
la disminución de actividad de la arginina desiminasa obtenida a
partir de Pseudomonas aeruginosa una vez encapsulada dentro
de glóbulos rojos. Con esta finalidad, los glóbulos rojos cargados
con arginina desiminasa se incubaron con tampón que contiene
arginina. Las concentraciones de citrulina y arginina se evaluaron
posteriormente por el procedimiento HPLC MS MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de L-arginina
desiminasa (ADI) (120 U.I./ml) que contiene SeMet recombinante
originada a partir de Pseudomona aeruginosa.
La sangre fresca de ratón o F1 heparinizada se
adquirió en los laboratorios Charles River y se centrifugó (800 g.
10 min a 4ºC) para separar el plasma y la capa de color cuero. Se
lavaron tres veces los eritrocitos concentrados (1:1 v/v) con NaCl
al 0,9% (800 g, 10 min a 4ºC). Después del lavado final se
mezclaron los eritrocitos con (CGR- ADI) o sin
(CGR-LR) 20 U.I./ml de arginina desiminasa y el
hematocrito de la suspensión de RBC se ajusto al 70% (utilizando
solución de ADI o salina).
La lisis de los eritrocitos se obtuvo por un
proceso de diálisis en flujo continuo en una bolsa de diálisis
(corte 10 Kd). La etapa hipotónica se realizó a 4ºC durante 60
minutos frente a un volumen adecuado de tampón de lisis a 40 mOsm/l
(0,73 g/l de NaH_{2}PO_{4}, 2H_{2}O; 5,035 g/l de
Na_{2}HPO_{4,} 12H_{2}O; 0,36 g/l de glucosa). Se añadieron
100 ml de solución hipotónica para 1 ml de eritrocitos introducidos.
Después de la recogida, la suspensión de eritrocitos lisados se
incubó a 37ºC durante 10 min. Se resellaron a continuación las
células y se hibridaron por incubación a 37ºC durante 30 minutos en
una solución 1/10 (v/v) de resellado (0,39 g/l de adenina; 15,6 g/l
de inosina; 6,4 g/l piruvato sódico; 4,9 g/l de NaH_{2}PO_{4},
H_{2}O; 10,9 g/l de Na_{2}HPO_{4}, 12H_{2}O, 11,5 g/l de
glucosa; 50 g/l de NaCl). Después del resellado los eritrocitos se
lavaron 3 veces (800 g, 10 min a 4ºC) en 310 mOsm/l de Tris pH 7,4,
BSA al 4%.
En la sangre completa y en la suspensión de RBC
antes y después de la etapa de diálisis se controló el hematocrito
(Ht), el volumen medio de células (MCV), la hemoglobina de celular
media (MCHC) y la concentración de hemoglobina corpuscular media
(MCHC) utilizando un contador de células Cobas Micros 601 CS 14/12.
CGR-ADI y la suspensión de CGR-LR
estaban a un hematocrito del 25% después de la diálisis.
Se recogieron alícuotas de la suspensión de RBC
(con o sin ADI) antes y después de la etapa de diálisis para la
medición ulterior de la actividad de ADI.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de actividad de ADI se realizó en
alícuotas de la suspensión de RBC (CGR-ADI y
CGR-LR) recogidas antes y después de la
diálisis.
El hematocrito de CGR-ADI y
alícuotas de CGR-LR antes de la diálisis se
ajustaron desde el 70% hasta el 40% por dilución adecuada en NaCl
al 0,9%. El hematocrito de CGR-ADI y la suspensión
de la alícuota de CGR-LR después de la diálisis fue
del 25% y no se modificó. La tasa de ADI encapsulado se determinó
por medición de la actividad de ADI en la sangre completa o en el
sobrenadante. Para determinar la actividad de ADI en la sangre
completa, un tercio de la alícuota de la suspensión de RBC se
congeló en nitrógeno líquido durante 5 minutos y se calentó a 37ºC
y 10 \mul de una dilución de 10 veces en MES 50 mM de
RBC congelado se utilizó a continuación para el ensayo de actividad
enzimática. Para determinar la actividad enzimática fuera de los
glóbulos rojos, los otros dos tercios de la suspensión de RBC se
centrifugaron a 4ºC durante 10 minutos y 10 \mul de una dilución
2 veces en MES 50 mM de sobrenadante se utilizaron para el ensayo
enzimático. La cantidad de citrulina formada en 10 min se
cuantificó mediante el ensayo colorimétrico de Prescott y Jones. La
mezcla del ensayo estándar contenía 900 \mul de tampón MES 0,1 mM
pH 6,0, MgCl_{2} 20 mM y 10 \mul de sobrenadante o de muestra
de RBC congelada. La reacción comenzó por la adición de 1 ml de
L-arginina 10 mM y se dejó continuar durante 5, 10,
15 ó 20 min a 37ºC. Se interrumpió la reacción a estos diferentes
tiempos mediante la adición de 1ml de solución
antipirina-diacetil-monoxima. Se
hirvió la mezcla durante 20 minutos y se midió la absorbancia a 466
nM. Se construyeron curvas patrón por dilución apropiada de una
solución madre de citrulina. La actividad de ADI entre 15 y 20 min
se definió como micromoles de citrulina formados por min de enzima.
Todas las medidas se realizaron por duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se completó el ensayo in vitro incubando
glóbulos rojos cargados con arginina desiminasa
(CGR-ADI) en un tampón que contenía arginina y
observando las concentraciones tanto del aminoácido arginina como
citrulina. El control de la reacción se realizo con glóbulos rojos
cargados sin arginina desiminasa incubados con
(CGR-LR) en las mismas condiciones.
Se mezcló 1 ml de glóbulos rojos cargados con
arginina desiminasa precalentada (CGR-ADI) con 1 ml
de tampón que contenía arginina 300 \muM, MgCl_{2} 20 mM en
Tris pH 7,4. Se preparó tampón Tris a 320 mOsm/kg, pH 7,4. El
ensayo de referencia se realizó mezclando en las mismas condiciones
una cantidad equivalente de CGR-LR con tampón que
contenía arginina. La mezcla se realizó mediante movimientos de
arriba abajo. Se recogieron inmediatamente 400 \mul de muestra,
representando el tiempo 0 en un tubo ependorf y se colocaron a 4ºC.
El resto de la mezcla se incubo durante 30 minutos a 37ºC. Al final
de la reacción, 400 \mul que representan el tiempo 30 (durante 30
minutos) se recogieron en un tubo ependorf y se colocaron a 4ºC.
Para todas las muestras de 400 \mul recogidas, tres cuartos (300
\mul) se centrifugaron a 4ºC durante 10 min. Después de la
centrifugación, se recogió una alícuota de 100 \mul de
sobrenadante y se congeló a -20ºC. El otro cuarto se congeló
directamente en nitrógeno liquido durante cinco minutos. Después de
calentar a 37ºC, se recogió una alícuota de 50 \mul de muestra y
se congeló a - 20ºC.
Las concentraciones de arginina y citrulina en
cada muestra se analizaron a continuación por el método
HPLC/MS/
MS.
MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados: véase la Figura 3
En 30 minutos a 37ºC, ADI que atrapa RBC es
capaz de eliminar la arginina contenida en el medio (sobrenadante)
desde aproximadamente 135 \mumoles/l hasta aproximadamente 42
\mumoles/l. Al mismo tiempo, se produce la concentración de
citrulina en el medio (eritrocitos extracelulares) desde
aproximadamente 17 hasta aproximadamente 110 \mumoles/l. La
actividad de ADI en el sobrenadante era inferior al límite detección
(<0,1 U.I./ml). La actividad medida en el sedimento de RBC fue
de 2,56 U.I./ml. Esto demuestra claramente que la
desiminación de la arginina se produce dentro de la ADI del
eritrocito, y que la arginina se introduce en el eritrocito para
ser digerida dentro del mismo. Además, se sugiere claramente que la
citrulina producida en el eritrocito está yendo al medio RBC
extracelular a través de la membrana de los glóbulos rojos.
Haciendo referencia a los RBCs de referencia,
que son eritocitos procesados en los que ADI está sustituido por
solución salina, arginina del medio RBC extracelular disminuye
solamente desde aproximadamente 165 \mumoles/l hasta
aproximadamente 157 \mumoles/l en 30 minutos a 37ºC, y la
citrulina alcanza solamente desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 2 \mumoles/l. Esta disminución baja puede
explicarse por la actividad endógena de la arginasa contenida en
los RBC. Los autores destacan de nuevo que la arginasa no produce
citrulina en tanto que la digestión de la arginina, es específica
para ADI.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El objetivo del estudio fue seguir la
farmacocinética en el plasma de arginina y citrulina en ratones OF1
en respuesta a inyecciones de eritrocitos cargados con arginina
desiminasa.
\vskip1.000000\baselineskip
L-Arginina desiminasa (ADI) que
contiene SeMet recombinante (120 U.I./ml) se origina a partir de
Pseudomona aeruginosa.
Se diluyó arginina desiminasa libre (ADI+RBC) en
glóbulos rojos (RBC) de ratón lavados y Sag-manitol
1/3 (v/v) (Haemonetics) con objeto de obtener una concentración
final a 10 U.I./ml de RBC concentrado en hematocrito del 50%. El
Sag-manitol se enriqueció con MgCl_{2} 10 mM antes
de la adición.
La sustancia de ensayo (ADILE) consistía en
glóbulos rojos cargados con arginina desiminasa (RBC). El
procedimiento de preparación de glóbulos rojos cargados con
arginina desiminasa se determinó como se describe para la prueba de
funcionalidad in vitro de ADI. Antes de la diálisis se mezcló
ADI con eritrocitos concentrados lavados con objeto de tener una
concentración final de 50 U.I./ml. Después de la diálisis, el RBC
encapsulado se mezcló con Sag-manitol 1/3 (v/v)
enriquecido con MgCl_{2} 10 mM. El hematocrito final se ajustó al
50%. La actividad de ADI obtenida después de la encapsulación fue
8,35 U.I./ml de RBC encapsulado a hematocrito del 50%.
Un tercio de la muestra sin enzima (CGR) se
preparó con RBC lavado vuelto a poner en suspensión con
Sag-manitol (enriquecido con MgCl_{2} 10Mm) a
hematocrito final del 50%. Se añadió solución salina en sustitución
de
ADI.
ADI.
Durante el experimento completo, se controló el
hematocrito (Ht) en la sangre completa, en la suspensión de RBC
antes y después de la etapa de diálisis, el volumen celular medio
(MCV), hemoglobina celular media (MCHC) y concentración media de
hemoglobina corpuscular (MCHC) utilizando un contador de células 601
CS 14/12 de Cobas Micros. Se recogieron alícuotas de suspensión de
RBC antes y después de la etapa de diálisis para una medición de la
actividad de ADI posterior. Se determinó la medición de la actividad
de ADI tal como se describió anterior-
mente.
mente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones hembra 64 OF1, de 5 a 6 semanas de vida
y que pesan 18 a 22 g se adquirieron en Charles River Laboratories
(L'Arbresle, Francia). Se observaron los animales durante 7 días con
asistencia al animal exento de patógenos específicos (SPF) antes
del tratamiento. Los protocolos experimentales fueron aprobados por
los Ministerios Franceses de Agricultura e Investigación. Se
mezclaron 64 ratones OF1 sanos en un grupo de 4 ratones y 3 grupos
de 20 ratones. Los ratones tratados recibieron una sola inyección
por vía intravenosa en un volumen de inyección de
250 \mul.
250 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó el programa del tratamiento de la
forma siguiente: los ratones del grupo 1 no fueron tratados; los
ratones del grupo 2 fueron tratados con glóbulos rojos de ratón
lavados a hematocrito del 50% (RBC); los ratos del grupo 3
recibieron una sola inyección de eritrocitos cargados con arginina
desiminasa (ADILE); los ratos del grupo 4 recibieron una sola
inyección de (ADI+RBC) sin arginina desiminasa en suspensión en RBC
de ratón lavado a hematocrito del 50%. Se administraron diferentes
muestras del producto en un doble ensayo a ciegas.
Después del tratamiento, se sacrificaron los
ratones por punción cardiaca. Se utilizó Isoflurano Forene
(Centravet, Bondoufle, Francia) para anestesiar a los ratones antes
del sacrificio. El sacrificio de los ratones se realizó como se
describe a continuación en la tabla. Se recogieron aproximadamente
800 \mul de sangre completa en tubos de vidrio con heparina litio
y se mantuvieron inmediatamente en un baño de agua con hielo después
de la recogida. Las muestras de sangre se centrifugaron
inmediatamente a 2.500 g durante 10 min a +4ºC para obtener
plasma. Se transfirieron aproximadamente 200 \mul de plasma a
tubos de propileno, se congelaron inmediatamente a -20ºC. El
sedimento de glóbulos rojos restantes se transfirió a tubos de
propileno, se congeló inmediatamente a -20ºC hasta el análisis. Se
midieron las concentraciones de arginina y citrulina en un vial de
plasma y sedimento de glóbulos
rojos.
rojos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la concentración de arginina y
citrulina en el plasma y en los sedimentos de los glóbulos rojos
tras la extracción de argenina y citrulina por el procedimiento de
HPLC/MS/MS.
Resultados: véanse las figuras
4-5
- 1)
- Considerando la dosis de arginina en un sedimento de glóbulos rojos, se observa una disminución fuerte y rápida en la concentración en los ratones que recibieron ADI exenta u ocluida. No se observó ninguna modificación significativa en los ratones que recibieron RBC normal. Sin embargo, a las 12 horas la concentración en arginina recupera los valores normales para el grupo sin ADI (ADI RBC) y se mantiene muy baja durante por lo menos 48 horas para el ADI ocluido (ADILE).
- 2)
- A la vez que disminuye la arginina, se produce citrulina. Sin embargo, se observa que mientras para ADILE se mantiene la alta concentración hasta 48 horas, vuelve al valor normal en 24 horas para el grupo ADI+RBC. No se observó ninguna modificación significativa en los ratones que recibieron RBC normal.
Esto prueba que la oclusión de ADI en RBC es
posible mediante las etapas de lisis/resellado, y que el ADI
cargado en RBC es mucho más eficaz que el ADI en la solución
exenta.
Claims (16)
1. Eritrocitos que contienen arginina desiminasa
para reducir la concentración de arginina en el plasma in
vivo.
2. Eritrocitos según la reivindicación 1, para
el tratamiento de tumores dependientes de arginina.
3. Eritrocitos según la reivindicación 2, para
el tratamiento del hepatocarcinoma.
4. Eritrocitos según la reivindicación 2, para
el tratamiento del melanoma maligno.
5. Eritrocitos según la reivindicación 1, para
inhibir la síntesis del óxido nítrico.
6. Eritrocitos según la reivindicación 1, para
la prevención y/o el tratamiento del choque séptico.
7. Eritrocitos según la reivindicación 2, para
el tratamiento del cáncer de mama, del neuroblastoma o de la
leucemia linfoblástica de linfocitos T o para la inhibición de la
angiogénesis o el tratamiento de una enfermedad asociada.
8. Eritrocitos que contienen arginina
desiminasa.
9. Eritrocitos según la reivindicación 8, en
suspensión en un líquido farmacéuticamente aceptable.
10. Producto medicinal que contiene eritrocitos
o una suspensión de eritrocitos según la reivindicación 8 ó 9.
11. Producto medicinal según la reivindicación
10, para reducir la concentración de arginina en el plasma.
12. Producto medicinal según la reivindicación
10, para el tratamiento de un tumor dependiente de arginina.
13. Producto medicinal según la reivindicación
12, para el tratamiento de un tumor seleccionado de entre: melanoma
maligno, hepatocarcinoma, cáncer de mama, neuroblastoma y leucemia
linfoblástica de linfocitos T o para la inhibición de angiogénesis
o el tratamiento de una enfermedad asociada.
14. Producto medicinal según la reivindicación
10, para inhibir la síntesis de NO.
15. Producto medicinal según la reivindicación
14, para prevenir y/o tratar el choque séptico.
16. Eritrocitos según la reivindicación 7 o
producto medicinal según la reivindicación 13, para el tratamiento
de una enfermedad asociada a la angiogénesis seleccionada de entre
angioma, angiofibroma, artritis, retinopatía diabética, retinopatía
del prematuro, glaucoma neovascular, enfermedad de la córnea, formas
involutivas y otras de degeneración macular, terigión, degeneración
retiniana, fibroplasia retrolenticular, psoriasis, telengiectasia,
granuloma piógeno, dermatitis seborreica, acné, cáncer y metástasis
relacionada con la angiogénesis.
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