ES2326704T3 - Moduladores de la funcion de receptores fas y otras proteinas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA PROTEINAS CAPACES DE MODULAR O MEDIAR EL LIGANDO RECEPTOR DEL FAS O EL EFECTO TNF EN CELULAS QUE TRANSPORTAN RECEPTOR DE FAS O RECEPTOR P55 POR FIJACION O INTERACCION CON LA PROTEINA MORT - 1, LA CUAL, A SU VEZ, SE FIJA AL CAMPO INTRACELULAR DEL RECEPTOR FAS O A OTRA PROTEINA TRADD, QUE SE FIJA AL RECEPTOR P55. ADEMAS, SE PROPORCIONAN INHIBIDORES PEPTIDICOS QUE INTERFIEREN EN LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LAS PROTEINAS DE FIJACION A MORT - 1 QUE TIENEN ACTIVIDAD PROTEOLITICA, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA DESIGNARLAS.

Description

Moduladores de la función de receptores FAS y otras proteínas.

Campo del invento

El presente invento está generalmente en el campo de los receptores que pertenecen a la superfamilia de receptores TNF/NGF y el control de sus funciones biológicas. La superfamilia de receptores de TNF/NGF incluye receptores tales como los receptores p55 y p75 de factor de necrosis tumoral (TNF-Rs, de aquí en adelante llamados p55-R y p75-R) y el receptor del ligando de FAS (también llamado FAS/APO1 o FAS-R y de aquí en adelante llamado FAS-R) y otros. Más específicamente, el presente invento tiene que ver con proteínas nuevas que se unen a la proteína MORT-1 (O FADD), y más específicamente, se refiere a las isoformas de una proteína tal como la proteína de unión a MORT-1, aquí designada como MACH siendo dichas isoformas capaces de inhibir la muerte celular.

Por consiguiente, aquí están descritas, en general, nuevas proteínas que son capaces de modular o mediar la función de MORT-1 o de otras proteínas que se unen a MORT-1 directa o indirectamente. En particular, el presente invento tiene que ver con diversas isoformas nuevas de MACH, su preparación y los usos de la misma. Dichas isoformas nuevas son capaces de inhibir la muerte celular.

Antecedentes de la técnica anterior

El factor de necrosis tumoral (TNF-a) y la linfotoxina (TNF-b) (de aquí en adelante, TNF, se refiere tanto a TNF-a como a TNF-b) son citoquinas proinflamatorias multifuncionales formadas principalmente por fagocitos mononucleares, que tienen muchos efectos en las células (Wallach, D. (1986) en: Interferon 7 (Ion gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, Londres; y Beutler y Cerami (1987)). Ambos TNF-a y TNF-b inician sus efectos uniéndose a receptores específicos de superficie celular. Algunos de los efectos es probable que sean beneficiosos para el organismo: pueden destruir, por ejemplo, células tumorales o células infectadas por virus y aumentan las actividades antibacterianas de los granulocitos. De esta manera, TNF contribuye a la defensa de los organismo frente a tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación por lesión. Así, TNF puede ser usado como un agente antitumoral en cuya aplicación se une a su receptor en la superficie de células tumorales e inicia de ese modo eventos que conducen a la muerte de las células tumorales. TNF puede también ser usado como un agente anti-infeccioso.

Sin embargo, tanto el TNF-a como TNF-b también tienen efectos nocivos. Hay evidencias de que la sobreproducción de TNF-a puede jugar un papel patogénico principal en varias enfermedades. Por ejemplo, efectos de TNF-a, principalmente en la vasculatura, son conocidos como una causa principal para los síntomas del shock séptico (Tracey y otros, 1986). En algunas enfermedades, el TNF puede causar pérdida excesiva de peso (caquexia) suprimiendo actividades de adipocitos y causando anorexia, y el TNF-a fue así llamado caquetina. Fue también descrito como mediador del daño a tejidos en enfermedades reumatoides (Beutler y Cerami, 1987) y como un mediador principal del daño observado en reacciones de injerto contra paciente (Piquete y otros, 1987). Además, TNF se conoce que está implicado en el proceso de inflamación y en muchas otras enfermedades.

Dos receptores distintos, expresados de modo independiente, los TNF-Rs p55 y p75, que se unen específicamente tanto a TNF-a como a TNF-b, inician y/o median los efectos biológicos anteriormente mencionados del TNF. Estos dos receptores tienen dominios intracelulares estructuralmente diferentes sugiriendo que señalizan de modo diferente (Véase Omán y otros, 1989; Engelmann y otros; 1990; Brockhaus y otros, 1990; Leotscher y otros, 1990; Schall y otros, 1990; Nophar y otros, 1990; Smith y otros, 1990; y Heller y otros, 1990). Sin embargo, el mecanismo celular, por ejemplo, las diversas proteínas y posiblemente otros factores, que están implicados en la señalización intracelular de los TNR-Rs p55 y p75 aún no han sido elucidados. Es en esta señalización intracelular, que tiene lugar normalmente después de la unión del ligando, es decir, TNF (a o b), al receptor, que es responsable del comienzo de la cascada de reacciones que dan como resultado final la respuesta observada de la célula a TNF.

En lo que se refiere al efecto citocida de TNF anteriormente mencionado, en la mayoría de las células estudiadas hasta ahora, este efecto es desencadenado principalmente por el TNF-R p55. Los anticuerpos frente al dominio extracelular (dominio de unión al ligando) del TNF-R p55 pueden desencadenar ellos mismos el efecto citocida (véase la patente europea EP 412486) que se relaciona con la efectividad de la reacción entrecruzada del receptor por los anticuerpos, que se cree que es la primera etapa en la generación del proceso de señalización intracelular. Además, los estudios mutacionales (Brakebusch y otros, 1992; Tartaglia y otros, 1993) han mostrado que la función biológica del TNF-R p55 depende de la integridad de su domino intracelular, y por consiguiente se ha sugerido que el inicio de la señalización intracelular que lleva al efecto citocida de TNF tiene lugar como consecuencia de la asociación de dos o más dominios intracelulares del p55 TNF-R. Por otro lado, el TNF (a y b) está presente como un heterotrímero, y como tal, se ha sugerido que induce la señalización intracelular vía el p55 TNF-R por medio de su habilidad para unirse a y reaccionar entrecruzadamente con las moléculas receptoras, es decir, causando la agregación del receptor.

Otro miembro de la superfamilia de receptores TNF/NGF es el receptor FAS (FAS-R) que ha sido también llamado el antígeno FAS, una proteína de superficie celular expresada en diversos tejidos y que comparte homología con un número de receptores de superficie celular incluyendo TNF-R y NGF-R. El FAS-R media la muerte celular en forma de apoptosis (Itoh y otros, 1991), y parece que sirve como un selector negativo de células T autoreactivas, es decir, durante la maduración de células T, el FAS-R media la muerte celular por apoptosis de las células T reconociendo autoantígenos. También se ha encontrado que las mutaciones en el gen de FAS-R (lpr) causa un trastorno linfoproliferativo en ratones que se parece a la enfermedad autoinmune humana de lupus eritematoso sistémico (SLE) (Watanabe-Fukunaga y otros, 1992). El ligando para FAS-R parece ser una molécula asociada a la superficie celular expresada por, entre otras, células T asesinas (o linfocitos T citotóxicos-CTLs), y de ahí que cuando tales CTLs entran en contacto con células que llevan FAS-R, estas sean capaces de inducir muerte celular por apoptosis de las células que llevan FAS-R. Además, se ha preparado un anticuerpo monoclonal que es específico para FAS-R, este anticuerpo monoclonal es capaz de inducir la muerte celular por apoptosis en células que llevan FAS-R, incluyendo células de ratón transformadas por cADN que codifican para FAS-R humano (Itoh y otros, 1991).

Mientras que algunos de los efectos citotóxicos de los linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos, con el receptor de superficie celular FAS-R (CD95) presente de manera amplia, que tiene la capacidad de desencadenar la muerte celular, se ha encontrado también que diversas otras células, aparte de los linfocitos T, expresan el FAS-R en su superficie y pueden ser destruidos por la reacción desencadenada por este receptor. La inducción descontrolada de tal proceso de muerte se supone que contribuye al daño celular en ciertas enfermedades, por ejemplo, la destrucción de células de hígado en la hepatitis aguda. Por consiguiente, encontrar medios para contener la actividad citotóxico de FAS-R puede tener un potencial terapéutico.

Por el contrario, puesto que también se ha encontrado que ciertas células malignas y células infectadas por VIH llevan el FAS-R en su superficie, los anticuerpo frente a FAS-R, o el ligando de FAS-R, pueden ser usados para desencadenar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en estas células y de ese modo proporcionar un medio para combatir tales células malignas o células infectadas por VIH (véase Itoh y otros, 1991). Encontrar aún otros modos para potenciar la actividad citotóxica de FAS-R puede por lo tanto tener también un potencial terapéutico.

Ha sido una necesidad durante mucho tiempo proporcionar un medio para modular la respuesta celular al TNF (a o b) y el ligando de FAS-R. Por ejemplo, en las situaciones patológicas anteriormente mencionadas, en las que TNF o el ligando de FAS-R están sobreexpresados, es deseable inhibir los efectos citocidas inducidos por TNF o el ligando de FAS-R, mientras que en otras situaciones, por ejemplo, aplicaciones de curación de heridas, es deseable potenciar el efecto de TNF, o en el caso de FAS-R, en células tumorales o células infectadas por VIH, es deseable potenciar el efecto mediado por FAS-R.

Un número de aproximaciones han sido hechas por el laboratorio de la solicitud (por ejemplo, las solicitudes Europeas Nºs EP 186833, EP 308378, EP 398327 y EP 412486) para regular los efectos deletéreos del TNF mediante la inhibición de la unión del TNF a sus receptores usando anticuerpo anti-TNF o usando receptores de TNF solubles (siendo esencialmente los dominios extracelulares de los receptores solubles) para competir con la unión del TNF a los TNF-Rs unidos a la superficie celular. Además,en base a que la unión del TNF a sus receptores es requerida para los efectos celulares inducidos por TNF, las aproximaciones por el laboratorio de los solicitantes (véase por ejemplo el documento EPO 568925) han sido hechas para modular el efecto del TNF modulando la actividad de los TNF-Rs.

Brevemente, el documento EPO 568925 se refiere a un método para modular la transducción de señales y/o el corte en TNF-Rs mediante el cual los péptidos u otras moléculas pueden interaccionar bien con el receptor mismo o bien con las proteínas efectoras que interaccionan con el receptor, por tanto, modular la función normal de TNF-Rs. En el documento de patente EPO 568925, se describe la construcción y caracterización de diversos p55 TNF-Rs mutantes, que tienen mutaciones en los dominios extracelulares, transmembranas e intracelulares del TNF-R p55. De esta manera, se identificó que las regiones dentro de los dominios por encima del p55TNR-R son esenciales para el funcionamiento del receptor, es decir, la unión del ligando (TNF) y la subsiguiente transducción de señales y señalización intracelular que da como resultado final el efecto del TNF observado en las células. Además, se ha descrito también un número de aproximaciones para aislar e identificar proteínas, péptidos y otros factores que son capaces de unirse a las diversas regiones en los dominios anteriores del TNF-R, proteínas, péptidos y otros factores que pueden estar implicados en regular o modular la actividad del TNF-R. Un número de aproximaciones para aislar y clonar las secuencias de ADN que codifican tales proteínas y péptidos; para construir vectores de expresión para la producción de estas proteínas y péptidos; y para la preparación de anticuerpos o fragmentos de las mismas que interaccionan con el TNF-R o con las proteínas y péptidos anteriormente que se unen a diversas regiones del TNF-R, son también expuestas en el documento de patente EPO 568925. Sin embargo, el documento de patente EPO 568925 no especifica las proteínas y péptidos precisos que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-Rs (por ejemplo p55-TNF-R) ni describe la aproximación de doble híbrido de levadura para aislar e identificar tales proteínas o péptidos que se unen a los dominios intracelulares de TNF-Rs. De igual manera, hasta este momento no ha habido una descripción de proteínas o péptidos capaces de unir el dominio intracelular de FAS-R.

Así, cuando se desea inhibir el efecto de TNF, o el ligando de FAS-R, sería deseable disminuir la cantidad o actividad de los TNF-Rs o FAS-R en la superficie celular, mientras que un aumento en la cantidad de actividad de TNF-Rs o FAS-R se desearían cuando se busca un efecto potenciado de TNF o ligando de FAS-R. En este extremo los promotores tanto de p55 TNF-R y de p75 TNF-R han sido secuenciados, analizados y se ha encontrado que un número de motivos de secuencias clave que son específicos de diversos factores reguladores de la transcripción, y como tales la expresión de estos TNF-Rs pueden ser controlados a su nivel de promotor, es decir, inhibición de la transcripción a partir de los promotores para una disminución en el número de receptores, y un potenciamiento de la transcripción a partir de los promotores para un aumento en el número de receptores (documento de patente EP 606869 y el documento de patente WO 9531206). Estudios correspondientes que se refieren al control de FAS-R al nivel del promotor del gen FAS-R aún no han sido documentados.

Mientras que se sabe que los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), y el receptor de FAS-R relacionado estructuralmente desencadena en las células, tras la estimulación con ligando producidos por leucocitos, actividades destructivas que llevan a su propia destrucción, los mecanismos de esta reacción desencadenada son aún poco conocidos. Estudios mutacionales indica que en la señalización de FAS-R y el receptor p55 TNF (p55-R) para la citotoxicidad implica distintas regiones dentro de los dominios intracelulares (Brakebusch y otros, 1992; Tartaglia y otros 1993; Itoh y Nagata, 1993). Estas regiones (los "dominios de la muerte") tiene similitud de secuencia. Los "dominios de muerte" de tanto FAS-R y p55-R tienden a autoasociarse. Esta autoasociación promueve aparentemente esa agregación del receptor que es necesaria para la iniciación de la señalización, (véase Song y otros, 1994; Wallach y otros, 1994; Boldin y otros, 1995), y a niveles elevados de la expresión del receptor puede dar como resultado el desencadenamiento de la señalización independiente de ligando (Holding y otros, 1995).

Así, previamente al documento WO 9531544 y el presente invento, no se han proporcionado proteínas que pueden regular el efecto de los ligandos que pertenecen a la superfamilia TNF/NGF, tal como el efecto de TNF o el ligando de FAS-R en las células, mediante la mediación del proceso de señalización intracelular, señalización que se cree que está ampliamente gobernada por los dominios intracelulares (ICs) del receptor que pertenece a la superfamilia de receptores TNF/NGF, tales como los de los dominios intracelulares de TNR-Rs, es decir el p55 y p75 TNF-R (p55IC y p75IC, respectivamente), así como el FAS-IC.

Algunos de los efectos citotóxicos de los linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos con FAS-R (CD95), con un receptor de superficie celular ampliamente expresado que tiene la habilidad de desencadenar la muerte celular (véase Nagata y Golstein, 1995). La muerte celular producida por fagocitos mononucleares implica un acoplamiento ligando-receptor, el TNF y su receptor p55-R (CD120), que está estructuralmente relacionado con el FAS-R y su ligando (véase también Vandenabeele y otros, 1995). Al igual que otros efectos inducidos por receptor, la inducción de la muerte celular por los receptores de TNF y el FAS-R tiene lugar vía una serie de interacciones proteína-proteína, que llevan a la unión del ligando-receptor hasta la eventual activación de las funciones enzimáticas efectoras, que en el caso de estos receptores particulares resulta en una muerte celular. Estudios previos han elucidado interacciones proteína proteína no enzimáticas que inician la señalización para la muerte celular: la unión de las moléculas de TNF trimérico o FAS-R a los receptores, las interacciones resultantes de sus dominios intracelulares (Brakebusch y otros, 1992; Tartaglia y otros, 1993; Itoh y Nagata, 1993) aumentadas por una propensidad de los motivos de los dominios de muerte a autoasociarse, (Holding y otros, 1995a), e indujeron la unión de dos proteínas citoplasmáticas (que pueden también unirse entre sí) a los dominios intracelulares de los receptores-MORT-1 (o FADD) a FAS-R (Holding y otros, 1995b; Chinnaiyan y otros, 1995; Kischkel y otros, 1995) y TRADD a p55-R (Hsu y otros, 1995; Hsu y otros, 1996).

Tres proteínas que se unen al dominio intracelular de FAS-R y p55-R en la región del "dominio de muerte" implicada en la inducción de muerte celular por los receptores a través de la heteroasociación de las regiones homólogas y que de modo independiente son también capaces de desencadenar la muerte celular fueron identificadas mediante el procedimiento de cribado de doble híbrido de levadura. Una de éstas es la proteína, MORT-1 (Boldin y otros, 1995) también conocida como FADD (Chinnaiyan y otras, 1995), que se une específicamente a FAS-R. Una segunda, TRADD (véase también Hsu y otros, 1995, 1996), se une a p55-R, y la tercera, RIP (véase también Stranger y otros, 1995), se une tanto a ambos FAS-R como a p55-R. Además de su unión a FAS-R y p55-R, estas proteínas son también capaces de unirse entre sí, lo cual proporciona una comunicación entrecruzada "Cross-talk" funcional entre FAS-R y p55-R. Estas uniones tienen lugar a través de un motivo de secuencia conservada, el "módulo de dominio de muerte" común a los receptores y sus proteínas asociadas. Además, aunque en el ensayo de doble híbrido de levadura MORT-1 demostró unirse espontáneamente a FAS-R, en células de mamífero esta unión tiene lugar sólo tras la estimulación del receptor, sugiriendo que MORT-1 participa en los eventos de iniciación de señalización por FAS-R. MORT-1 no contiene ningún motivo de secuencia característico de actividad enzimática, y por lo tanto, su capacidad para desencadenar la muerte celular parece no implicar una actividad intrínseca de MORT-1 mismo, sino más bien, la activación de alguna(s) otra(s) proteína(s) que se unen a MORT-1 y actúan aguas mas abajo en la cascada de señalización. la expresión celular de los mutantes MORT-1 que carecen de la parte N-terminal de la molécula han demostrado bloquear la inducción de citotoxicidad por FAS/APO1 (FAS-R) o p55-R (Hsu yo otros, 1996; Chinnaiyan y otros, 1996), indicando que esta región N-terminal transmite la señalización para el efecto citocida de ambos receptores a través de las interacciones proteína-proteína.

Estudios recientes han implicado un grupo de tiolproteasas citoplasmáticas que están estructuralmente relacionadas con la proteasa CED3 de Caenorhabditis elegans y a la enzima convertidora de interleuquina -1b (ICE) de mamífero en el inicio de diversos procesos de muerte celular fisiológica (revisados en Kumar, 1995 y Henkart, 1996). Ha habido otras indicaciones de que la(s) proteasa(s) de esta familia puede tomar parte en la citotoxidadid celular inducida por FAS-R y TNF-Rs. Se encontró que inhibidores peptídicos específicos de las proteasas y dos proteínas codificadas por virus que bloquean su función, la proteína crmA de cowpox y la proteína de Baculovirus p35, proporcionan protección a las células frente a la citotoxicidad celular (Enari y otros, 1995; Los y otros, 1995; Tewari yotros, 1995; Xue y otros, 1995; Beidler y otros, 1995). El corte rápido de ciertas proteínas celulares específicas, mediadas aparentemente por proteasa(s) de la familia CED3/ICE, fue observado en células al poco tiempo de la estimulación de FAS-R o TNF-Rs. Hasta este momento, no se ha presentado información para identificar las proteasas CED3/ICE específicas implicadas, ni el del mecanismo de activación de estas proteasas por los receptores.

Compendio del invento

Es un objetivo del invento proporcionar nuevas proteínas MACH o fragmentos de las mismas, que son capaces de inhibir la muerte celular y la unión a MORT-1, la cual se une al dominio intracelular de FAS-R, cuyas proteínas nuevas afectan al proceso de señalización intracelular iniciado por la unión del ligando de FAS a su receptor. Específicamente las proteínas nuevas MACH o fragmentos de las mismas son capaces de inhibir la muerte celular.

Otro objetivo del invento es proporcionar anticuerpos a las proteínas nuevas anteriores o fragmentos de las mismas, que pueden ser usados para inhibir el proceso de señalización, o, más específicamente, la citotoxicidad celular, cuando se desea.

Un aspecto adicional descrito aquí es el de usar las proteínas nuevas anteriores, o fragmentos de las mismas, para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales que pueden estar implicados en la regulación de la actividad del receptor, por ejemplo, otras proteasas que cortan las proteínas nuevas para hacerlas biológicamente activas, y/o aislar e identificar otros receptores aguas mas arriba en el proceso de señalización a los cuales estas proteínas nuevas, o fragmentos de las mismas se unen (por ejemplo, otros FAS-R o receptores relacionados), y de ahí, en cuya función estén implicadas.

Un objetivo adicional mas descrito aquí es proporcionar inhibidores que puedan ser introducido en las células para unirse o interaccionar con las proteasas MACH e inhibir su actividad proteolítica.

Por otro lado, es un objetivo del presente invento usar las proteínas nuevas anteriormente mencionadas, o fragmentos de las mismas como antígenos para la preparación de anticuerpo policlonales y/o monoclonales para estos. Los anticuerpos, a su vez, pueden ser usados, por ejemplo, para la purificación de las nuevas proteínas para las diferentes fuentes, tales como extractos celulares o líneas celulares transformadas.

Además, estos anticuerpos pueden ser usados para propósitos de diagnóstico, por ejemplo, para identificar trastornos relacionados con el funcionameniento anormal de los efectos celulares mediados por FAS-R u otros receptores relacionados.

Un objetivo adicional del invento es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas nuevas anteriores o fragmentos de las mismas, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anteriormente anotados.

Los presentes inventores descubrieron una proteína nueva, MACH, que es capaz de unirse a, o interaccionar con, MORT-1, que por sí misma se une al dominio intracelular de FAS-R así como a isoformas MACH llamadas MACH a3, MACHb1, MACHb3, MACHb4 y MACHb5 que están sujetas al presente invento. MACH probablemente funciona como un componente efector de la ruta de muerte celular iniciada por la unión del ligando de FAS a FAS-R en la superficie celular, y esto por virtud del hecho de que al menos algunas de las isoformas de MACH parecen ser proteasas intracelulares activas. Las proteasas de la familia CED3/ICE han sido implicadas en el proceso apoptótico desencadenado por FAS-R. MORT-1 (o FADD) se une al dominio intracelular o FAS-R tras la activación de este receptor y la proteína MACH nueva del presente invento se une a MORT-1. La proteína MACH, clonada y caracterizada aquí existe en realidad en múltiples isoformas, algunas de las cuales tiene una región de homología CED3/ICE, que tiene una actividad proteolítica (dominios proteolíticos), y causa la muerte de las células cuando son expresadas en las células. Así, la activación de este homólogo CED3/ICE nuevo (es decir, las diversas isoformas MACH, que tienen el dominio proteolítico) por FAS-R (vía interacción con MORT-1) parece constituir un componente efector de la ruta de muerte celular mediada por FAS-R.

Por otro lado, MACH también parece funcionar como un componente efector de la ruta de muerte celular iniciada por la unión de TNF a p55-R en la superficie celular, esto por medio de un mecanismo indirecto de unión de MORT-1 a TRADD, una proteína que se une al dominio intracelular de p55-R (Hsu y otros, 1995), seguido por o junto con la unión de MACH a MORT-1, con la activación de MACH en una proteasa activa implicada en afectar la muerte celular.

También debería notarse que mientras que MACH, en particular la isoforma MACHa1, muestra unas características de secuencia críticas para la función de las proteasas CED3/ICE, tiene sin embargo algunas características de secuencia distintivas en sí misma que pueden posiblemente dotarla con un modo de acción específico de tejido/célula.

MORT-1 (por "Mediador de la toxicidad del receptor", Boldin y otros, 1995b), previamente designado como HF-1, es capaz de unirse al dominio intracelular del ligando de FAS-R. Esta proteína de unión FAS-IC parece actuar como un mediador o modulador del efecto del ligando de FAS-R sobre las células mediando o modulando el proceso de señalización intracelular que normalmente tiene lugar tras la unión de ligando de FAS-R en la superficie celular. Además de su especificidad a la unión de FAS-IC, MORT-1 demostró tener otras características (véase el Ejemplo 1), por ejemplo, tiene una región homóloga al de las regiones del "dominio de muerte" (DD) del p55-TNF-R y FAS-R (p55-DD y FAS-DD), y de ese modo es también capaz de autoasociación. MORT-1 es también capaz de activar la citotoxicidad celular por si mismo, una actividad posiblemente relacionada a su capacidad de autoasociación. Se ha encontrado recientemente que la coexpresión de la región en MORT-1 (HF-1) que contiene la homología de secuencia de los "dominios de muerte" (MORT-DD, presente en la parte C-terminal de MORT-1) interfiere en gran medida con la muerte celular inducida por FAS, como se esperaría por su capacidad para unirse al "dominio de muerte" del FAS-IC. Además, en las mismas condiciones experimentales, se ha encontrado que la co-expresión de la parte de MORT-1 que no contiene la región MORT-DD (la parte N-terminal de MORT-1, aminoácidos 1-117, "cabeza de MORT-1") resultó en la no interferencia de la muerte celular inducida por FAS, y en todo caso, una citotoxicidad celular inducida por FAS algo potenciada.

Por consiguiente, es posible que MORT-1 también se una a otras proteínas implicadas en los procesos de señalización intracelular. Estas proteínas de unión a MORT-1 puede por lo tanto actuar como mediadores o moduladores indirectos del efecto del ligando de FAS-R en las células mediando o modulando la actividad de MORT-1; o estas proteínas de unión de MORT-1 pueden actuar directamente como mediadores o moduladores del proceso de señalización intracelular asociado a MORT-1 mediando o modulando la actividad de MORT-1, que, como se observa anteriormente, tiene una capacidad aparentemente independiente para activar la citotoxicidad celular. Estas proteínas de unión a MORT-1 pueden también ser usadas en cualquiera de los procedimientos de cribado estándar para aislar, identificar y caracterizar proteínas, péptidos, factores, anticuerpos, etc. adicionales, que pueden estar implicados en el proceso de señalización asociado con MORT-1 o asociado a FAS-R o pueden ser elementos de otros procesos de señalización intracelular. Tales proteínas de unión a MORT-1 han sido aisladas y descritas aquí (véase los ejemplos 2 y ejemplo 3). Una de estas proteínas de unión MORT-1, aquí designada MACH, fue inicialmente clonada, secuenciada, y parcialmente caracterizada por tener las siguientes propiedades. El cADN MACH codifica el marco de lectura abierta ORF-B; MACH se une a MORT-1 en una manera muy fuerte y específica; el sitio de unión a MACH en MORT-1 tiene lugar aguas arriba del motivo de "dominio de muerte" MORT-1; la región ORF-B de MACH es la parte de interacción de MORT-1 de la misma; y MACH es capaz de autoasociación y de inducir citotoxicidad celular en sí misma.

Según el presente invento, se ha demostrado ahora, que MACH en realidad existe en un número de isoformas. Por otro lado, el MACH ORF-B observado anteriormente es de hecho una de las isoformas designadas aquí como MACHb1 (a continuación).

Por consiguiente, la presente descripción proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína o fragmento de la misma, capaz de unirse a o interaccionar con MORT-1, dichas proteínas o fragmentos de las mismas son capaces de mediar el efecto intracelular mediado por FAS-R o p55-TNF-R. Específicamente dicha proteína o fragmento de la misma es capaz de inhibir la muerte celular.

En particular, el presente invento proporciona una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia de ADN de las SEQ ID Nºs: 4, 19, 21, 23, 24 ó 33;

(b) una secuencia de cADN que codifica una proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular que comprende la SEQ ID Nº: 5, 8, 20, 22, 25 ó 34;

(c) una secuencia de ADN capaz de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas a la secuencia de (a) o (b), en la que la secuencia de ADN codifica una proteína MACH, que es capaz de inhibir la muerte celular;

(d) una secuencia de ADN que es degenerada como resultado del códico genético a las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) y que codifican una proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular, y

(e) un fragmento del ADN de una cualquiera de (a) a (d) que codifica una proteína que es capaz de inhibir la muerte celular.

Las secuencias de ADN anteriormente mencionadas de las SEQ ID Nº: 4, 19, 23, 24 ó 33 pertenecen a MACHb1, MACH a3, MACHb3, MACH b4 y MACH b5, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas de las SEQ ID Nº: 5, 8, 20, 22, 25 ó 34 pertenecen a MACHb1, MACHb3, MACH a3, MACH b2, MACH b4 y MACH b5 respectivamente.

También proporcionados por el presente invento están los vectores que codifican las proteínas MACH anteriores que son capaces de inhibir la muerte celular, que contiene la secuencia de ADN anterior del invento, estos vectores son capaces de ser expresados en células hospedantes eucarióticas o procarióticas adecuadas. Las células hospedantes eucarióticas o procarióticas transformadas contienen tales vectores; y un método para producir la proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular, creciendo tales hospedantes transformados en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, llevando a cabo las modificaciones postraduccionales de dicha proteína según sea necesario para obtener dicha proteína y extraer dicha proteína expresada, del medio de cultivo de dichas células transformadas o de los extractos celulares de dichas células transformadas. Las definiciones anteriores pretenden incluir las isoformas de la proteína MACH en el presente invento.

En otro aspecto, el presente invento también proporciona anticuerpos o derivados activos o fragmentos de los mismos específicos para la proteína MACH que son capaces de inhibir la muerte celular, del invento.

Mediante otro aspecto más del invento, se proporciona el uso de las secuencias de ADN anteriores o las proteínas que codifican, según el invento para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el daño tisular en shock séptico, rechazo de injerte contra paciente o hepatitis aguda.

El presente invento también proporciona una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo uno cualquier de los siguientes:

(i) una proteína de unión a MORT-1 según el invento, y mezclas biológicamente activas de la misma;

(ii) un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular y codificar una proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular según el invento; También descrito está una secuencia de oligonucleótidos que codifican una secuencia antisentido de la proteína MACH capaz de inhibir la secuencia de muerte celular según el invento, en la que dicho oligonucleótido puede ser la segunda secuencia del vector del virus animal recombinantes de (ii) anterior.

Como surge de todo lo anteriormente mencionado, así como de la descripción detallada aquí a continuación, MACH puede ser usada en una forma independiente de MORT-1 para tratar células o tejidos. El aislamiento de las proteínas de unión MORT-1, su identificación y caracterización puede ser llevada a cabo por cualquier de las técnicas de cribado estándar usadas para aislar e identificar proteínas, por ejemplo, el método de doble híbrido de levaduras, métodos de cromatografía de afinidad, y cualquier de los otros procedimientos estándar bien conocidos usados para este propósito.

Otros aspectos y realizaciones del presente invento son también proporcionados como que surgen de la siguiente descripción detallada del invento.

Debería observarse que, donde se usa, los siguientes términos: "Modulación del efecto de ligando FAS o de TNF en las células"; y "Modulación del efecto de la proteína de unión a MORT-1 o More-1 en las células" se entiende que comprende un tratamiento in vitro así como in vivo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la interacción de MORT-1 con FAS-IC y la autoasociación de MORT-1 en levaduras transformadas según se evalúa mediante un ensayo de expresión de b-galactosidasa de doble híbrido.

La Figura 2 describe esquemáticamente el nucleótido preliminar (SEQ ID Nº: 1) y la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº: 2) de MORT-1 (HF1) en el que el "dominio de muerte" está subrayado ya que es un posible sitio de iniciación de la traducción, es decir, el residuo de metionina subrayado en la posición 49 (en negrita, subrayado M). El asterisco indica la traducción del codon stop (nucleótidos 769-771). Al principio y en mitad de cada línea se proporcionan dos números que proporcionan las posiciones relativas de los nucleótidos y aminoácidos de la secuencia con respecto al inicio de la secuencia (extremo 5'), en el que el primer número indica el nucleótido y el segundo número indica el aminoácido.

La Figura 3 es una secuencia nucleotídica parcial preliminar que codifica una proteína de unión MORT-1 obtenida a partir del clon de cADN.

La figura 4A-C describe esquemáticamente el cADN MACH y su proteína codificada, en el que en la Fig. 4a se muestra la estructura del cADN MACH que codifica dos marcos de lectura abierta MACH (ORF-A y ORF-B), el área rayada del ORF-B indica la región de la misma que tiene homología con la proteína MORT-1; en la Fig. 4B, se muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº: 5) para l región MACH ORF-B, los residuos aminoacídicos subrayados son la región que tiene homología con MORT-1 (correspondiente a la región rayada de Fig. 4a); y en la Fig. 4C, se muestra la secuencia nucleotídica (SEQ ID Nº: 4) de la molécula de cADN MACH entera (designada MACH b1). La Figura 5 describe los resultados que ilustran la interación de MORT-1 y MACH en las células de levadura transfectadas.

La Figura 6 describe gráficamente el desencadenamiento independiente de ligando de los efectos citocidas en células HeLa transfectadas con vectores de expresión controlados por tetraciclina que codifican MACH, comparados con los efectos en estas células transfectadas con tales vectores que codifican otras proteínas tales como luciferasa (luc, testigo negativo), FAS-IC, MORT-1, y células cotranfectadas con vectores que codifican MORT-1 y MACH.

Las Figuras 7A y 7B muestran la secuencia de aminoácidos (SEQ ID N:5) de MACH B1 (Fig. 7A). La Fig. 7B muestra la homología de secuencias del modulador MORT en MACH b1, MORT-1 y PEA-15 (SEQ ID Nº: 6).

La Figura 8 es una representación diagramática del receptor y las interacciones diana que participan en la inducción de muerte celular por FAS/APO y p55, el módulo del dominio de muerte está indicado por bandas, el módulo MORT está indicado en gris y la región CED3/ICE está indicada en negro.

La Figura 9A-C describe los resultados que ilustran la interacción in vitro de MACH b1 y sus mutantes de deleción con MORT-1. La Fig. 9A muestra la evaluación de la expresión de proteínas y sus tamaños moleculares mediante la inmunoprecipitación a partir de lisados celulares usando una anticuerpo anti-FLAG. La Fig. 9B muestra la afinidad de unión de las proteínas a GST-MORT-1, adsorbidas a esferas de glutation-agarosa (o, como un testigo, a GST o GST unido al dominio intracelulares de Fas-APO-1). La Fig. 9C muestra los resultados de las inmunoprecipitaciones de las diversas construcciones de fusión MORT-1 y MACH usando los diversos anticuerpos específicos.

la Figura 10 es una representación diagramática de las diversas isoformas MACH.

La Figura 11 es un alineamiento de secuencia de aminoácido colineal esquemático de las isoformas MACH, MACH a1 (SEQ ID Nº: 7), MACH \beta1 (SEQ ID Nº: 5), y MACH \beta3 (SEQ ID Nº: 8) y los diversos miembros conocidos de la familia de proteasas CED3/ICE, CED-3 (SEQ ID Nº: 9), Ich-11/Nedd2 (SEQ id nº: 10), ICE_{rel}III (SEQ ID Nº: 11), Tx/Ich2/ICE_{rel} II (SEQ ID Nº: 12), ICE (SEQ ID Nº: 13), CPP-32 (SEQ ID Nº: 30), Mcn2a (SEQ ID Nº: 31). Los residuos aminoacídicos están enumerados tanto a la izquierda como a la derecha de cada secuencia. Las líneas de puntos; espacios en la secuencia para permitir el alineamiento óptimo. Los aminoácidos que son idénticos en al menos tres de los miembros de la familia de proteasas CED3/ICE mostradas están encuadrados. Los módulos MORT aguas arriba de la región de homología CED3/ICE están encuadrados. Los sitios de las deleciones C-terminales empleados en este estudio son mostrados por líneas intermitentes. Los bloques de cuatro aminoácidos aguas abajo de la región del módulo MORT, que varían entre las diversas isoformas MACH (bloques 1-4) son observados mediante líneas en la parte superior. en la región de homología CED3/ICE, los aminoácidos que se alinean con residuos en el ICE implicados en la actividad catalítica mediante análisis de cristales por rayos X como se muestra a continuación: los residuos putativamente implicados en la catálisis, correspondientes a HiS_{237}, Gly _{238} y Cys_{285} en ICE están marcados por círculos rellenos por debajo del alineamiento (\bullet). Los residuos que constituyen el bolsillo de unión para la cadena lateral de carboxilato del P1 Asp, correspondiente a Arg_{179}, correspondiente a Arg_{179}, Gln_{283}, Arg_{341} y Ser_{347} en ICE, están marcados mediante círculos abiertos por debajo del alineamiento (o). Los residuos Ala aguas arriba de los residuos que corresponden a Cys_{285} en ICE, y los residuos Arg y Gly aguas abajo a la Cys, que están conservados en todas las proteasas previamente descritas de la familia CED3/ICE. Los residuos próximos a los residuos P1-P4 del sustrato están marcados por triángulos por debajo del alineamiento (\Delta). Conocidos y previamente supuestos sitios de corte Asp-X y sitios potenciales de corte encontrados en localizaciones similares en MACH están encuadrado. las flechas indican que los extemos N- y C-terminales de las subunidades p20 y p10 de ICE y de las subunidades p17 y p12 de CPP32. Los extremos C-terminales de las proteínas se indican por asteriscos (*).

Las Figuras 12A-F describen los resultados ilustrando la actividad proteasa de MACHa1 a 15 min (Fig. 12A), 30 min. (Fig. 12B), 60 min. (Fig. 12C), 90 min. (Fig 12D), 180 min. (Fig. 12E). La Fig 12 F muestra la actividad proteolítica a lo largo del tiempo a una concentración específica de sustrato.

Las Figuras 13A y 13B muestran la actividad proteasa de la región de homología CED3/ICE en MACHa. A, cinética de corte del sustrato fluorogénico derivado de la secuencia PARP, Ac-DEVD-AMC (50 uM), por extractos de E. coli que expresan una proteína de fusión-GST de la región de homología CED3/ICE en MACHa1 (Ser_{217} a través del extremo C-terminal de la proteína (\sqbullet) comparado con la falta de corte mediante extractos de bacterias que expresan los productos de las proteínas de fusión-GST de MACHa1 (o) de longitud completa, o de la región de homología CED3/ICE en la que Cys_{360} está remplazada por la Ser (\nabla), o por extractos de bacteria que expresan productos de fusión a GST de cualquier de los dos productos proteolíticos potenciales de la región de homología CED3/ICE (Ser_{217} hasta Asp_{373} (\Delta) y Ser_{375} hasta Asp_{479}, el extremo C terminal de la proteína (\Delta)). B, dependencia de la concentración del sustrado del corte de Ac-DEVD-AMC. El sustrato fue incubado durante 180 min con extractos de bacteria que expresan el producto de fusión a GST de la región de homología CED3/ICE de MACHa1 (\sqbullet). El corte de este sustrato mediante los extractos fue inhibido en presencia de ácido yodoacético (5 mM, \Box). Ac-YVAD-AMC, un sustrato fluorogénico que corresponde a un sitio de corte ICE en el precursor IL-1\beta, no fue cortado (\bullet).

Las Figuras 14A-D muestran la muerte celular mediada por MACHa1 y MACHa2.

La Figura 15 describe gráficamente la muerte celular mediada por MACHa1 y MACHa2.

Las Figuras 16A-D muestran la morfología de las células en las que la muerte celular fue inducida o bloqueada.

La Figura 17 muestra gráficamente que las moléculas MACH A que contienen una región CED3/ICE no funcional bloquean la inducción de muerte celular por p55-R.

La Figura 18 muestra que las moléculas MACHa que contienen una región CED3/ICE no funcional bloquean la inducción por muerte celular por FAS/APO1.

La Figura 19 muestra la muerte de las células HeLa que expresan de modo transitorio FAS/APO1.

Descripción detallada del invento

El presente invento se refiere, en un aspecto, a las isoformas de la proteína de unión a MORT-1 nueva, MACH, siendo dichas isoformas capaces de inhibir la muerte celular, que son capaces de unirse a o interaccionar con MORT-1 y de ese modo unirse al dominio intracelular del receptor FAS-R, al cual se une MORT-1, o a la unión del dominio intracelular del p55 TNF-R, al cual se une la proteína TRADD (véase el Ejemplo 2 y como se indica anteriormente) y al cual se une la proteína MRT-1 de TRADD.

Más específicamente, además de la unión a o interacción con MORT-1 las proteínas o fragmentos del presente invento son capaces de inhibir la muerte celular. Por consiguiente, las proteínas de unión a MORT-1 del presente invento son consideradas como mediadores o moduladores de FAS-R, que tiene un papel, en por ejemplo, el proceso de señalización que es iniciado por la unión del ligando FAS a FAS-R, e igualmente que tienen un papel en el proceso de señalización que es iniciado por la unión de TNF a p55-R. Las proteínas de unión a MORT-1 del presente invento son las nuevas isoformas MACH descubiertas que son capaces de inhibir la muerte celular, las secuencias de aminoácidos y de ADN de las cuales las nuevas secuencias no aparecen en las bases de datos de "GENBANK" o "PROTEIN BANK" de secuencias de ADN o aminoácidos.

Más particularmente, según la presente descripción diversos homólogos de mamíferos de la proteasa de nemátodo, CED3 han sido descritos. Estos han sido designados como isoformas MACH (isoformas MACHa y MACH\beta) que, aunque están estrechamente relacionadas, muestran sin embargo algunas diferencias de estructura y de especificidad de sustrado, y como tal pueden servir un poco para diferentes funciones en células de mamífero. Ciertamente, dos actividades diferentes de las proteasas son conocidas. El papel principal de ICE parece ser el procesamiento del precursor precursor de IL-1\beta, mientras que el CED3 se ha demostrado claramente que sirve como un efector de la muerte celular programada. Este último papel parece ser el papel de al menos algunos de los homólogos de mamíferos (algunas isoformas MACH). La secuencia de aminoácidos de MACHa1 muestra un cierto parecido con CPP32, el homólogo mamífero más próximo conocido de CED3. La especificidad de sustrado de MACH es también similar al de CPP32, excepto que MACHa1 muestra tener una especificidad de sustrato mas restingida que el de CPP32. CPP32 corta preferencialmente el péptido sustrato correspondiente al sitio de corte en poli (ADP ribosa) polimerasa (PARP), aunque también tiene cierta actividad proteolítica frente al péptido que corresponde al sitio de corte ICE en el precursor IL-1\beta. MACHa1 parece, sin embargo, ser sólo capaz de cortar la secuencia derivada de PARP. Estas relaciones de MACHa1 a CPP32 y CED3, y sus disimilaridades a ICE, son consistentes con la idea que MACHa1 sirve, de modo similar a CED3, como regulador de la muerte celular. MACHa1 muestra, sin embargo, algunas características de secuencias que la distinguen de CED3 y de CPP32, así como de todos los otros miembros de la familia CED3/ICE. La parte C terminal de MACHa1, aguas arriba de sus región de homología CED3/ICE, no muestra similitud en absoluto con la región aguas arriba de cualquier de los otros homólogos. Hay también algunas características de secuencias únicas a la región de homología CED3/ICE de la proteína. Estas diferencias sugieren que MACHa1 pertenece a una rama evolucionaría de la familia y que su contribución a la muerte celular difieren en algo de la de los homólogos CED3/ICE previamente descritos.

Una diferencia importante puede referirse a la manera en la que la función de la proteasa es regulada. Estando ambas implicadas en los procesos de muerte celular relacionados con el desarrollo y en la inmunocitolisis inducida por el receptor, el corte de las proteínas por proteasas de la familia CED3/ICE debería ser susceptible a regulación tanto por las señales que se forman dentro de la célula como por señales que emanan de los receptores de superficie celular. En procesos de muerte celular durante el desarrollo, la activación de tales proteasas parece implicar mecanismos que afectan la expresión génica, dando como resultado síntesis portenciada de proteasas, así como en síntesis disminuida de proteínas tipo BCL-2, que antagonizan su efecto apoptótico. Esto claramente no es el caso sin embargo, para la citotoxicidad desencadenada por FAS-R o los receptores TNF. Las células pueden ser destruidas por TNF o por el ligando de FAS-R aún cuando su actividad de síntesis de proteínas está completamente bloqueada (son de hecho en ese caso destruidas más eficazmente) y permanecen dependientes de estímulo en esas condiciones. La activación de proteasas de la familia CED3/ICE por los receptores TNF y FAS-R puede así tener lugar mediante un mecanismo que es independiente de la síntesis de proteínas. Las propiedades de secuencia únicas de MACHa1 pueden permitirle tomar parte en tal mecanismo.

Para el conocimiento de los solicitantes, ninguna otra proteasa ha sido hasta ahora descrita como que se asocie, bien directamente o a través de una proteína adaptadora, con el dominio intracelular de un receptor de superficie celular. Bien por inferencia del modo de acción de las proteínas asociadas al receptor que tienen otras actividades enzimáticas, parece plausible que la unión de MACHa1 a MORT1 permite la estimulación de la actividad proteasa de MACHa1 tras el desencadenamiento de FAS-R. También puede permitir la activación de la proteasa por el p55-R, a través de la unión de MORT1 a TRADD, que se une a p55-R.

Otros miembros de la familia CED3/ICE fueron encontrados que exhiben una actividad completa sólo tras el procesamiento proteolítico, que tiene lugar bien mediante auto corte o mediante los efectos de otras proteasas de esta familia (revisado en Kumar, 1995; Henkart, 1996). El efecto citotóxico que resulta de la coexpresión de los dos potenciales productos principales de autocorte de MACHa1, al contrario de la falta de citotoxicidad en las células que expresan la región de homología CED3/ICE completa, es consistente con la posibilidad que también MACHa1 gana una actividad completa sólo tras, su procesamiento. La actividad enzimática observada en lisados de bacteria que expresan la región de longitud completa refleja aparentemente el autoprocesamiento de la proteína producida en estas condiciones o procesadas por algunas proteasas de bacterias. De qué modo este procesamiento tiene lugar dentro de la célula de mamífero, y como puede provocarse mediante el desencadenamiento de FAS-R y p55-R no se conoce, ni está claro aún que contribución relativa tiene la actividad proteasa de MACHa1 en la citotoxicidad inducida por FAS-R y TNF. La evaluación de esta contribución se complica por el hecho que también la expresión de MACHb1, que carece de la región de homología CED3/ICE, da como resultado una marcada citotoxicidad. Presumiblemente, esta citotoxicidad refleja la capacidad de MACH\beta1 para unirse a MACHa1. Debido a esta capacidad, las moléculas de MACH transfectadas pueden imponer, tras agregación, un cambio conformacional en las moléculas de MACHa1 que son endógenas de las células transfectadas. Tal mecanismo puede bien dar cuenta también de la citotoxicidad observada cuando las moléculas que actúan aguas arriba de MACH, (MORT1, TRADD o los dominios de muerte de tienen el p55-R o FAS-R) están sobreexpresadas en las células. En este momento, no se puede excluir que la citotoxicidad observada tras la expresión inducida de MACH o de las moléculas que actúan aguas arriba a ella, reflejen, además de la actividad proteolítica de la región de homología CED3/ICE en MACH, también la activación de algunos de los otros mecanismos que se creía tomaban parte en el efecto citotóxico de FAS-R y p55-R (por ejemplo, la activación de la esfingomielinasa neutra o ácida). Tampoco se puede excluir que la actividad proteolítica de la región de homología CED3/ICE sirva para otras funciones aparte de la inducción de citotoxicidad. Una idea más clara de la función de MACHa1 debería ganares mediante la identificación del las proteínas sustrato endógenas que son cortadas tras la activación de MACHa1. Encontrar modos de eliminar la actividad de MACHa1 según se desee, por ejemplo mediante la expresión de moléculas inhibidoras, contribuirá también a comprender la función de esta proteína, y sirve como un modo de regular su actividad cuando se desea. Bien puede existir en células que expresan MACHa1 inhibidores naturales de la proeteasa comprendida en este proteína. La existencia de isoformas de corte y empalme alternativos para algunos de los otros miembros de la familia CED3/ICE se ha demostrado que constituye un modo de restricción fisiológica de la función de estas proteasas. Algunas de las isoformas de estas otras proteasas fueron documentadas que actúan como inhibidores naturales de las isoformas de longitud completa, aparentemente formando heterodímeros inactivos, con ellos. Esto puede bien ser el caso también para algunas isoformas de MACH, por ejemplo, MACHa3, en el que el sitio de corte potencial del extremo N-terminal no existe y los mutantes MACHa1 cuya región de homología CED3/ICE es deficiente. La expresión de tales isoformas inhibidoras pueden constituir un mecanismo de autoprotección celular frente a la citotoxicidad de FAS-R y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas MACH, que exceden ampliamente la heterogeneidad observada para cualquier de las otras proteasas de la familia CED3/ICE, puede permitir un ajuste particularmente refinado de la función de la forma activa de esta proteína. Parece posible que algunas de las isoformas MACH sirve otras funciones. La capacidad de MACHb1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACHa1 sugieren la posibilidad de que algunas de estas isoformas, y tal vez también otras isoformas MACH, no tiene un efecto inhibitorio sino más bien un efecto potenciador de la función de las isoformas enzimáticamente activas. Parece posible que algunas isoformas no sirvan para un papel relacionado con la citotoxicidad, sino más bien actuar como sitios de anclaje para moléculas que están implicadas en otros efectos, no citotóxicos de FAS-R y TNF.

Debido a la capacidad única de FAS-R y los receptores de TNF de causar muerte celular, así como la capacidad de los receptores de TNF de desencadenar otras actividades de daño celular diversas, una aberración de la función de estos receptores puede ser particularmente dañina para el organismo. Ciertamente, se ha demostrado que tanto una función excesiva como deficiente de los receptores que contribuyen a las manifestaciones patológicas de diversas enfermedades. Identificar moléculas que toman parte en la actividad de señalización de estos receptores, y encontrar modos de modular la función de estas moléculas, constituye una indicación potencial para nuevas aproximaciones terapéuticas a estas enfermedades. En vista del papel central que se supone a MACH a1 en la toxicidad de FAS-R y TNF, parece particularmente importante diseñar fármacos que puedan bloquear la función proteolítica de esta molécula, como se ha hecho para algunos otros miembros de la familia CED3/ICE. Las características de secuencia únicas de estos homólogos CED3/ICE que comprenden las moléculas MACHa1 puede permitir diseñar fármacos que pueden afecta su protección frente a una citotoxicidad excesiva mediada por el sistema inmune sin interferir con los procesos de muerte celular fisiológica, en el que otros miembros de la familia CED3/ICE están implicados.

Así, la presente descripción también tiene que ver con la secuencia de ADN que codifica para una proteína de unión MORT-1 y las proteínas de unión MORT-1 codificadas por las secuencias de ADN.

Por otro lado, la presente descripción tiene que ver además con las secuencias de ADN que codifican los análogos biológicamente activos, fragmentos y derivados de la proteína de unión MORT-1, y los análogos, fragmentos y derivados codificados por los mismo. La preparación de tales análogos, fragmentos y derivados es mediante un procedimiento estándar (véase por ejemplo, Sambrook y otros, 1989) en el que las secuencias de ADN que codifican la proteína de unión MORT-1, uno o más codones pueden ser delecionados, añadidos o sustituidos por otra, para dar análogos que tiene al menos un cambio en un residuo de aminoácidos con respecto a la proteína nativa.

Un polipéptido o proteína que "corresponde sustancialmente" a la proteína de unión a MORT-1 incluye no sólo la proteína de unión a MORT-1 sino también polipéptidos o proteínas que son análogos a la unión a MORT-1.

Análogos que corresponden sustancialmente a la proteína de unión a MORT-1 son los polipéptidos en los que uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a MORT-1 han sido remplazados por otros aminoácidos, delecionado y/o insertado, siempre que las proteína resultante exhiba sustancialmente la misma o mayor actividad biológica que la proteína de unión a MORT-1 a la cual corresponde.

A modo de corresponder sustancialmente a la proteína de unión a MORT-1, los cambios en la secuencia de las proteínas de unión a MORT-1, tal como las isoformas MACH son generalmente relativamente menores. Aunque el número de cambios puede ser más de diez, preferiblemente no hay más de diez cambios, más preferiblemente no más de cinco, y más preferiblemente no más de tres cambios como tal. Mientras que cualquier técnica puede ser usada para encontrar potenciales proteínas biológicamente activas que corresponden sustancialmente a las proteínas de unión a MORT-1, una técnica tal es el uso de técnicas de mutagénesis convencional en el ADN que codifica la proteína, dando como resultado unas pocas modificaciones. Las proteínas expresadas por tales clones pueden ser entonces cribadas para la unión a MORT-1 y/o para la actividad mediada por FAS-R y p55-R.

Cambios "conservativos" son aquellos cambios que no serían esperados que cambien la actividad de la proteína y son normalmente los primeros en ser cribado ya que estos no se espera que cambien sustancialmente el tamaño, carga o configuración de la proteína y así no se esperaría que cambie las propiedades biológicas de las mismas.

Las sustituciones conservativas de las proteínas de unión a MORT-1 incluyen un análogo en el que al menos un residuos aminoácidico en el polipéptido ha sido remplazado de modo conservador por un aminoácido diferente. Tales sustituciones son preferiblemente hechas según la siguiente lista como se presente en la Tabla IA, sustituciones que pueden ser determinadas mediante la experimentación de rutina para proporcionar propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula polipeptídica sintetizada al tiempo que se mantiene la actividad biológica característica de la proteína de unión a MORT-1.

TABLA IA

1

Alternativamente, otro grupo de sustituciones de la proteína de unión a MORT-1 son aquellas en las que al menos un residuo aminoacídico en el polipéptido ha sido eliminado y un residuo diferente insertado en su sitio según la Tabla IB siguiente. Los tipos de sustituciones que pueden ser hechas en el polipéptido pueden ser basados en análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homóloga de diferente especie, tal como los presentados en la Tabla 1-2 de Schulz y otros, G.E., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, Nueva York, NY, 1798, y las Figs 3-9 de Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman y Co., San Francisco, CA 1983. Basado en tal análisis, las sustituciones conservativas alternativas son definidas aquí como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

TABLA IB

2

Los tres residuos aminoacídicos en paréntesis arriba tiene funciones especiales en la arquitectura de las proteínas: Gly es el único residuo que carece de una cadena lateral y así imparte flexibilidad a la cadena. Esto tiende sin embargo, a promover la formación de estructura secundaria distinta de la a-helice. Pero, debido a su geometría inusual, restringe mucho la cadena y generalmente tiende a promover estructuras de tipo giro beta, aunque en algunos casos la Cys puede ser capaz de participar en la formación de puentes disulfuro que es importante en el plegamiento de la proteína. Obsérvese que Schulz y otros, supra, unirán los Grupos 1 y 2 anteriores. Obsérvese también que la Tyr, debido a su potencial de enlaces de hidrógeno, tiene un parentesco significativo con Ser, y Thr, etc.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos según el presente invento, por ejemplo, como se presenta anteriormente, son conocidos en la técnica y se esperaría que mantuviera las propiedades biológicas y estructurales del polipéptido tras una sustitución aminoacídica. La mayoría de las deleciones y sustituciones según el presente invento son aquellas que no producen cambios radicales en las características de la proteína o molécula polipeptídica. "Características" se define en una manera no inclusiva para definir cambios tanto en la estructura secundaria, por ejemplo, a-hélice o b-lámina, así como cambios en la actividad biológica, por ejemplo, la unión de MORT-1 o mediación del ligando de FAS-R o el efecto del TNF en las células.

Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden ser usadas para obtener análogos de proteínas de unión a MORT-1 para su uso en el presente invento incluyen cualquiera de las etapas de los métodos conocidos, tales como los presentados en la patente norteamericana RE 33.653, 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, a Mark y otros; 5.116.943 a Koths y otros 4.965.195 a Namen y otros: 4.879.111 a Chong y otros, y 5.017.691 a Lee y otros; y proteínas sustituidas por lisina presentadas en la patente norteamericana Nº. 4.904,584 (Shaw y otros).

Aparte de las sustituciones conservativas tratadas anteriormente que no cambiarían significativamente la actividad de la proteína de unión a MORT-1, sustituciones bien conservativas o bien menos conservativas y cambios más aleatorios, que llevan a un aumento en la actividad biológica de los análogos de las proteínas de unión a MORT-1, se pretende que estén dentro del alcance de la descripción.

Cuando se ha de confirmar el efecto exacto de la sustitución o deleción, una persona con experiencia en la técnica apreciará en el efecto de la(s) sustitución(es), deleción(es), etc., será evaluado mediante la unión de rutina y los ensayos de muerte celular. El cribado que usa tal ensayo estándar no implica una experimentación excesiva.

Análogos aceptables son aquellos que conservan al menos la capacidad de unión a MORT-1, y de ese modo, como se observa anteriormente mediar la actividad (por ejemplo, mediante la actividad proteasa de al menos algunas de las isoformas MACH) de FAS-R y p55-R. De tal modo, se pueden producir análogos que tienen el así llamado efecto dominante negativo, a saber, un análogo que carece bien de la unión a MORT-1, o en una señalización subsiguiente o actividad proteasa que sigue a dicha unión. Tales análogos pueden ser usados, por ejemplo, para inhibir el efecto del ligando de FAS compitiendo con las proteínas de unión a MORT-1 naturales. Por ejemplo, parece probable que las isoformas MACH, MACHa2 y MACHa3 sean análogos "naturales" que sirven para inhibir la actividad MACHa compitiendo con la unión de las isoformas MACH (proteasa) activa a MORT-1 que parece ser esencial en la activación de estas isoformas MACH. Una vez que las isoformas MACH no pueden unirse a More-1, las rutas de señalización intracelular mediada por FAS-R y p55-R serán de ese modo también inhibidas. De igual modo, análogos así llamados dominante positivos pueden ser producidos que servirían para potencial el efecto del ligando FAS o de TNF. Estas tendrían las mismas o mejores propiedades de unión a MORT-1 y la misma o mejores propiedades de señalización de las proteínas de unión a MORT-1.

A nivel genético, estos análogos son preparados generalmente mediante mutagénesis dirigida de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína de unión a MORT-1, produciendo de ese modo un ADN que codifica el análogo, y a partir de ahí sintetizar el ADN y expresar el polipéptido en cultivo de células recombinantes. Los análogos exhiben típicamente la misma o aumentada actividad biológica cualitativa como la proteína presente de manera natural, Ausubel y otros, current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications y Wiley-Interscience, Nueva York, NY, 1987-1995; Sambrook y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

La preparación de una proteína de unión a MORT-1 según se adjunta, o una secuencia nucleotídica alternativa que codifica el mismo polipéptido pero que difiere de la secuencia natural debido a los cambios permite mediante la degeneración conocida del código genético, puede ser lograda mediante mutagénesis específica de sitio del ADN que codifica un análogo preparado anteriormente o una versión nativa de una proteína de unión a MORT-1. La mutagénesis dirigida permite la producción de análogos a través del uso de secuencias oligonucleotídicas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionan una secuencia cebadora del tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que está siendo atravesada. Tópicamente, un cebador de alrededor de 20 a 25 nucleótidos en longitud es preferida, con alrededor de 5 a 10 nucleótidos complementarios en cada lado de la secuencia que está siendo alterada. En general, la técnica de mutagénesis dirigida es bien conocida en la técnica, como se ejemplifica por las publicaciones tales como Adelman y otros, DNA 2:183 (1983).

Como se apreciará, la técnica de mutagénesis dirigida emplea típicamente un vector fago que, existe bien como hebra única o bien como doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida incluye vectores tales como el fago M13, por ejemplo, como se describe por Messing y otros, Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinante DNA. Editor A. Walton, Elsevier, Ámsterdam (1981).

Estos fagos están fácilmente disponibles de modo comercial y su uso es generalmente bien conocido por aquellos con experiencia en la técnica. Alternativamente, los vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación de fago de hebra única (Veira y otros, Meth, Enzymol. 153;3, 1987) pueden ser empleados para obtener ADN de hebra única.

En general, la mutagénesis dirigida según se adjunta es lograda obteniendo primero un vector de hebra única que incluye en su secuencia una secuencia de ADN que codifica el polipéptido relevante. Un cebador oligonucleotídico que lleva la secuencia mutada deseada es preparado sintética-mente mediante el ADN automatizado/síntesis de oligonucleótidos. Este cebador es entonces hibridado con el vector que contiene la secuencia proteica de hebra única, y sujeto a enzimas de polimerización de ADN tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la hebra que lleva la mutación. Así, una secuenciai mutada y la segunda hebra lleva la mutaciones deseadas. El vector heterodúplex es entonces usado para transformar las células apropiadas, tales como las células JM101 de E. coli, y los clones son seleccionados para incluir vectores recombinantes que llevan el reordenamiento de la secuencia mutada.

Después que tal clon es seleccionado, la proteína de unión a MORT-1 puede se religada y colocada en un vector apropiado, generalmente un vector de transferencia o de expresión del tipo que puede ser empleado para la transfección de un hospedante apropiado.

Por consiguiente, el gen o ácido núcleo que codifica la proteína de unión a MORT-1 puede también ser detectado, obtenido y/o modificado, in vitro, in situ y/o in vivo, mediante el uso de técnicas de amplificación del ADN o ARN conocidas, tales como PCR y síntesis de oligonucleótidos químicos. PCR permite la amplificación (aumento en número) de secuencias de ADN específicas mediante reacciones de ADN polimerasas repetidas. Esta reacción puede ser usada como un remplazo del clonaje; todo lo que se requiere es un conocimiento de la secuencia de ácidos nucleicos. Para llevar a cabo una PCR, los cebadores son diseñados a modo de que sean complementarios a las secuencias de interés. Los cebadores son entonces generados mediante síntesis automatizada de ADN. Debido a que los cebadores pueden ser hibridados con cualquier parte del gen, se pueden crean las condiciones de tal modo que los desemparejamientos (mismatch) en el emparejamiento de base complementaria pueda ser tolerado. La amplificación de estas regiones de desemparejamientos puede llevar a la síntesis de un producto mutado que resulta en la generación de un péptido con nuevas propiedades (es decir, la mutagénesis dirigida). véase también, por ejemplo, Ausubel, supra Ch.16. También mediante el acoplamiento de la síntesis de ADN complementario (cADN), usando la transcriptasa inversa, con PCR, ARN puede ser usado como el material de partida para la síntesis del dominio extracelular de un receptor de prolactina sin clonar.

Además, los cebadores de PCR pueden ser diseñados para incorporar nuevos sitios de restricción u otras características tales como los codones de terminación en los extremos del segmento génico a ser amplificado. Esta colocación de los sitios de restricción en los extremos 5' y 3' de la secuencia génica amplificada permite a los segmentos génicos codificar la proteína de unión a MORT-1 o un fragmento de la misma a ser diseñado a la medida para la ligación de otras secuencias y/o sitios de clonaje en vectores.

PCR y otros métodos de amplificación de ARN y/o ADN son bien conocidos en la técnica y pueden ser usados según el presente invento sin una experimentación excesiva, basado en la enseñanza y guía presentada aquí. Métodos conocidos de amplificación de ADN o ARN incluyen, pero no se limitan a reacción polimerasa en cadena (PCR) y procesos de amplificación relacionados (véanse por ejemplo, las patentes norteamericanas Nºs 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, a Mullis y otros; 4. 795.699 y 4.921.794, a Tabor y otros; 5.142.033 a Innis; 5.122.464 a Wilson y otros; 5.091.310 a Innis; 5.066.584 a Gyllesten y otros; 4.689.818 a Gelfand y otros. 4.994.370 a Silver y otros; 4.766.067 a Biswas; 4.656.134 a Ringold; e Inns y otros, eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) y amplificación mediada por ARN que usa ARN antisentido para la secuencia diana como molde para la síntesis de ADN de doble hebra (el documento de patente norteamericana Nº: 5.130.238 a Malek y otros, con la marca registrada NASBA): y la inmuno PCR que combina el uso de la amplificación de ADN con marcaje de anticuerpos (Ruzicka y otros, Science 260:487 (1993); Sano y otros, Science 258:120 (1992); Sano y otros Biotechniques 9: 1378 (1991)).

De manera análoga, los fragmentos biológicamente activos de las proteínas de unión a MORT-1 (por ejemplo, aquellas de cualquiera de las isoformas MACH) pueden ser preparadas como se observa anteriormente con respecto a los análogos de las proteínas de unión a MORT-1. Fragmentos adecuados de las proteínas de unión a MORT-1 son aquellas que conservan la capacidad de unión a MORT-1 y que pueden mediar la actividad biológica de FAS-R y p55-R como se indica anteriormente. Por consiguiente, se pueden preparar fragmentos de la proteína de unión a MORT-1 que tengan un efecto dominante negativo o dominante positivo como se observa a continuación con respecto a los análogos. Debería observarse que estos fragmentos representan una clase especial de los análogos del invento, a saber, son porciones definidas de las proteínas de unión a MORT-1 derivados de la secuencia completa de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, la de una cualquier de las isoformas MACH), teniendo cada una de tales porciones o fragmentos alguna de las actividades deseadas anteriormente observadas. Tales fragmentos pueden ser por ejemplo, un péptido.

De igual modo, los derivados pueden ser preparados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más residuos aminoacídicos de la proteína de unión a MORT-1, su análogo o fragmento, o en conjugación de la preoteína de unión a MORT-1, sus análogos o fragmentos, a otras moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como son bien conocidas en la técnica. Consecuentemente, el término "derivados" como se usan aquí cubre derivados que pueden ser preparados a partir de los grupos funcionales que tienen lugar en las cadenas laterales en los residuos o los grupos N- o C- terminales, por medios conocidos en la técnica, y están incluidos en el invento. Los derivados pueden tener restos químicos tales como residuos carbohidrato o fosfato, siempre que tal fracción tenga la misma o mayor actividad biológica que las proteínas de unión a MORT-1.

Por ejemplo, los derivados pueden incluir ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante la reacción con amonio o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acilo o grupos amino libre de los residuos aminoacídicos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o carbocíclico aroilo) o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo el de los residuos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

El término "derivado" se pretende que incluya sólo los derivados que no cambian un aminoácido a otro de los veinte aminoácidos normalmente presentes de manera natural.

Aunque la proteína de unión a MORT-1 es una proteína o polipéptido, es una secuencia de residuos de aminoácidos. Un polipéptido que consiste en una secuencia más larga que incluye la secuencia entera de una proteína de unión a MORT-1, según las definiciones aquí, se pretende que incluya en el alcance de tal polipéptido siempre que las adiciones no afecten a las características básicas y nuevas del invento, es decir, si ellas o bien conservan o bien aumentan la actividad biológica de la proteína de unión a MORT-1 o pueden ser cortadas para dejar una proteína o polipéptido que tiene la actividad biológica de la proteína de unión a MORT-1. Así, por ejemplo, la presente descripción se pretende que incluya las proteínas de fusión de la proteína de unión a MORT-1 con otros aminoácidos o péptidos.

También aquí descrito está el aspecto de que la nueva proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos y derivados de los mismos, pueden tener un número de usos, por ejemplo:

(i) Proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos y derivados de los mismos, pueden ser usadas para imitar o potencia la función de MORT-1 y por tanto del ligando de FAS-R o TNF, en situaciones en las que un efecto potenciado de FAS-R o TNF es deseado, tal como una aplicación antitumoral, antiinflamatoria, anti VIH, etc., en el que la citotoxicidad inducida por ligando de FAS-R o TNF es deseada. En este caso, la proteína de unión a MORT-1, su análogo, fragmentos o derivados de las mismas, que potencian el efecto del ligando de FAS-R o TNF, es decir, el efecto citotóxico, puede ser introducido en las células mediante procedimientos estándar conocidos per se. Por ejemplo, como la proteína de unión a MORT-1 son intracelulares y deberían ser introducidas sólo en las células en las que el efecto del ligando de FAS-R o TNF es deseado, un sistema para la introducción específica de estas proteínas en las células es necesario. Un modo de hacer esto es creando un virus animal recombinante, por ejemplo, uno derivado de Vaccinia, al ADN al que los siguientes dos genes serían introducidos: el gen que codifica un ligando que se une a las proteínas de superficie celular específicamente expresadas por las células, por ejemplo, tales como la proteína gp120 del virus del SIDA (VIH) que se une específicamente a algunas células (linfocitos CD4 y leucemias relacionadas), o cualquier otro ligando que se une específicamente a las células que llevan un FAS-R o p55-R, de tal modo que el vector del virus recombinante sería capaz de unirse a talas células que llevan FAS-R o p55-R; y el gen que codifica la proteína de unión a MORT-1. Así, la expresión de la proteína de unión a la superficie celular en la superficie del virus dirigirá el virus específicamente a la célula tumoral u otras células que lleven FAS-R o p55-R, tras lo cual la secuencia que codifica la proteína de unión a MORT-1 será introducida en las células vía el virus, y una vez expresada en las células, tendrá como resultado el potenciamiento del efecto del ligando de FAS-R o TNF que lleva a la muerte celular de las células tumorales u otras células que llevan FAS-R o p55-R que se deseen matar. La construcción de tal virus animal recombinante es mediante procedimientos estándar (véase por ejemplo, Sambrook y otros, 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, una cualquiera de las isoformas MACH) en forma de los oligonucleótidos que pueden ser absorbidos por las células y expresados ahí.

(ii) En una realización de la presente descripción pueden ser usados para inhibir el efecto del ligando de FAS-R o TNF, por ejemplo, en casos tales como daño tisular en shock séptico, rechazo injerto frente a paciente, o hepatitis aguda, en el que se desea bloquear la señalización intracelular de FAS-R o p55-R inducida por el ligando de FAS-R o TNF. En esta situación, es posible, por ejemplo, introducir en las células, mediante procedimiento estándar, los oligonucleótidos que tiene la secuencia antisentido codificante para la proteína de unión a MORT-1, que bloquearía eficazmente la traducción de los mARN que codifican bien la proteína MORT-1 o la proteína de unión a MORT-1 y de ese modo bloquean su expresión y llevan a la inhibición del efecto del igando de FAS-R o TNF. Tales oligonucleótidos pueden ser introducidos en las células usando la aproximación del virus recombinante anterior, la segunda secuencia llevada por el virus son las secuencias oligonucleotídicas.

Otra posibilidad es usar anticuerpos específicos para la proteína de unión a MORT-1 para inhibir su actividad de señalización intracelular.

Otra manera más de inhibir el efecto del ligando de FAS-R o del TNF es mediante la aproximación de ribozimas recientemente desarrollada. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que cortan específicamente los ARN. Las ribozimas pueden ser manipuladas mediante ingeniería a modo de cortar los ARN dianas de elección, por ejemplo, la proteína de unión a MORT-1 que codifican los mANRs del invento. Tales ribozimas tendrían una secuencia específica para el mARN de la proteína de unión a MORT-1 y serían capaces de interaccionar con estas (unión complementarias) seguido del corte del mARN, dando como resultado una disminución (o pérdida completa) en la expresión de la proteína de unión a MORT-1, siendo el nivel de la expresión disminuida dependiente del nivel de la expresión de ribozimas en la célula diana. Para introducir ribozimas en las células de elección (por ejemplo, las que llevan FAS-R o p55-R), cualquier vector adecuado puede ser usado, por ejemplo, plásmido, vectores de virus animales (retrovirus), que son normalmente usados para este propósito (véase también (i) anteriormente, en el que el virus tiene, una segunda secuencia, un cADN que codifica la secuencia de ribozima de elección). (Para revisiones, métodos etc. que tienen que ver con ribozimas véase Chen y otros, 1992; Zhao y Pick, 1993; Shore y otros, 1993; Joseph y Burke, 1993; Shimayama y otros, 1993; Cantor y otros, 1993; Barinaga, 1993; Crisell y otros, 1993 y Koizumi y otros, 1993).

(iii) La proteína de unión a MORT-1, sus análogos, fragmentos o derivados pueden también ser usados para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, es decir, aquellas que se unen al dominio intracelular de FAS-R o a receptores funcionalmente relacionados, o aquellos que se unen a MORT-1 y de ese modo a receptores funcionalmente relacionados tales como FAS-R y p55-R, e implicados en el proceso de señalización intracelular. En esta solicitud el sistema de doble híbrido de levadura anteriormente mencionado puede ser usado, o puede usarse un sistema recientemente desarrollado que emplea una hibridación Southern no rigurosa tras el clonaje de PCR (Wilks y otros, 1989). En la publicación de Wilks y otros, se describe la identificación y clonaje de dos proteínas tirosina quinasas putativas mediante la aplicación de hibridación Southern no rigurosa seguida por el clonaje por PCR basado en la secuencia conocida del motivo quinasa, una secuencia quinasa concebida. Esta aproximación puede ser usada, según el presente invento usando la secuencia de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, cualquiera de las isoformas MACH) para identificar y clonar las de las relacionadas a las proteínas de unión a MORT-1.

(iv) Otra aproximación más para utilizar la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados de los mismos, del invento es usarlas en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores a lo que son capaces de unirse, por ejemplo, MORT-1, u otras proteínas o factores implicados en el proceso de señalización intracelular. En esta solicitud, la proteína de unión a MORT-1, su análogo, fragmentos o derivados de los mismos, del presente invento, puede ser unidos individualmente a las matrices de cromatografía de afinidad y después puestas en contacto con los extractos celulares o proteínas aisladas o factores que se sospecha que están implicados en el proceso de señalización intracelular. Tras el procedimiento de cromatografía de afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados de las mismas del invento, pueden ser eluídas, aisladas y caracterizadas.

(v) Como se observa anteriormente, la proteína de unión a MORT-1, o sus análogos, fragmentos o derivados de los mismos, de la descripción pueden ser usados para los propósitos de purificación de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo isoformas MACH) bien a partir de extractos celulares o bien a partir de líneas celulares transformadas produciendo proteínas de unión a MORT-1, o sus análogos o fragmentos. Además, estos anticuerpos pueden ser usados para propósitos de diagnóstico para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal del sistema de ligando de FAS-R o TNF, por ejemplo, efectores celulares inducidos por ligando de FAS-R o TNF hiperreactivos o hiporeactivos. Así, si tales trastornos estuvieran relacionados con un malfuncionamiento del sistema de señalización intra-celular que implican la proteína MORT-1, o la proteína de unión a MORT-1, tales anti-cuerpos servirían como una importante herramienta de diagnóstico.

Debería también mencionarse que el aislamiento, identificación y caracterización de la proteína de unión a MORT-1 (por ejemplo, las isoformas MACH) del invento pueden ser realizadas usando cualquiera de los procedimientos de cribado estándar bien conocidos. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de cribado, el procedimiento de levadura de doble híbrido como está expuesto aquí (Ejemplo 1), fue usado para identificar la proteína MORT-1 y subsiguientemente las proteínas de unión a MORT-1 (Ejemplo 2-3) del invento. Similarmente como se observa anteriormente y a continuación, otros procedimientos pueden ser empleados tales como cromatografía de afinidad, los procedimientos de hibridación de ADN, etc. como se conocen bien en la técnica, para aislar, identificar y caracterizar la proteína de unión a MORT-1 del invento o para aislar, identificar y caracterizar proteínas, factores, receptores, etc. adicionales que son capaces de unirse a la proteína MORT-1 o a las proteínas de unión a MORT-1 del invento.

Como se expone aquí anteriormente, la proteína de unión a MORT-1 puede ser usada para generar anticuerpos específicos frente a las proteínas de unión a MORT-1, por ejemplo, isoformas MACH. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser usados como se exponen aquí a continuación en detalle, comprendiéndose que en estas aplicaciones los anticuerpos o fragmentos de los mismos son aquellos específicos para las proteínas de unión a MORT-1.

Basados en los hallazgos de los presentes inventores que al menos algunas de las isoformas MACH (véase anteriormente y en el Ejemplo 3 a continuación) son proteasas relacionadas con las proteasas de la familia de proteasas CED3/ICE, las siguientes aplicaciones médicas específicas son previstas para estas isoformas MACH; se ha encontrado que los inhibidores específicos de otras proteasas CED3/ICE, algunas de las cuales son permeables a las células, ya existen, que pueden bloquear eficazmente los procesos de muerte celular programada. Por lo tanto, es posible según el presente invento diseñar inhibidores que pueden impedir la muerte celular inducida por el ligando de FAS-R o TNF, rutas en las que las isoformas de las proteasas MACH están implicadas. Además, en vista de las características de secuencia únicas de estas nuevas proteasas MACH, parece posible diseñar inhibidores que serán altamente específicos para los efectos inducidos por TNF y el ligando de FAS-R. Estos hallazgos de los presentes inventores también proporcionan un modo de estudiar mecanismos en los que la "proteasa asesina" es activada en respuesta al ligando de FAS-R y TNF, permitiendo esto el desarrollo subsiguiente de fármacos que pueden controlar la extensión de esta activación. Hay muchas enfermedades en las que tales fármacos pueden ser de gran ayuda. Entre otras, hepatitis aguda en la que el daño agudo al hígado parece reflejar la muerte de las células hepáticas mediada por el ligando de FAS-R; la muerte celular inducida por autoinmunidad tal como la muerte de las células b-de Langerhans del páncreas, que resultan en diabetes; la muerte de células en el rechazo del injerto (por ejemplo, riñón, corazón e hígado); la muerte de los oligodendrocitos en el cerebro en esclerosis múltiple, y el suicidio de las células T inhibido por el SIDA que causa la proliferación del virus del SIDA y por tanto la enfermedad del SIDA.

Como se menciona aquí anteriormente y a continuación, parece que dos de las isoformas MACH, MACHa2 y MACHa3 pueden servir como inhibidores "naturales" de las isoformas de la proteasa MACH, y éstas pueden así ser empleadas como los inhibidores específicos anteriormente mencionados de estas proteasas MACH. De igual modo, otras sustancias tales como los péptidos, compuestos orgánicos, anticuerpos, etc. pueden también ser cribados para obtener fármacos específicos que son capaces de inhibir las proteasas MACH.

Un ejemplo no limitante de cómo los inhibidores peptídicos de las proteasas MACH serían diseñadas y cribadas está basado en estudios previos de inhibidores peptídicos de proteasas ICE o tipo ICE, la especificidad de sustrato de ICE y estrategias para el análisis de epítopos usando la síntesis peptídica. El requerimiento mínimo para el corte eficaz del péptido por ICE se encontró que implica cuatro aminoácidos en el extremo izquierdo del sitio de corte con una preferencia fuerte por el ácido aspártico en la posición P1 y siendo la metilamina suficiente en la derecha de la posición P1 (Sleath y otros, 1990; Howard y otros, 1991; Thornberry y otros, 1992). Además, el péptido sustrato fluorogénico (un tetrapéptido), acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metil-cumaril-7-amida) abreviado Ac-DEVD-AMC, corresponde con una secuencia en la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) que se encontró que se corta en las células poco después de la estimulación con FAS-R, así como otros procesos apoptóticos (Kaufmann, 1989; Kaufmann y otros, 1993; Lazebnik y otros, 1994), y se corta de modo eficaz mediante CPP32 (un miembro de la familia de proteasas CED3/ICE) y proteasas MACH.

Como el Asp en la posición P, la posición del sustrato parece ser importante, teniendo los tetrapéptidos Asp como el cuarto residuo aminoacídico y diversas combinaciones de aminoácidos en las tres primeras posiciones de los residuos pueden ser rapidamente cribados para la unión al sitio activo de las proteasas MACH usando, por ejemplo, el método desarrollado por Geysen (Geysen, 1985; Geysen y otros, 1987) en el que un gran número de péptidos en soportes sólidos fueron cribados para las interacciones específicas con anticuerpos. La unión de las proteasas MACH a péptidos específicos pueden ser detectados mediante una variedad de métodos de detección bien conocidos para aquellos con experiencia en la técnica, tal como radiomarcaje de la proteasa MACH, etc. Este método de Geysen demostró ser capaz de ensayar al menos 4000 péptido cada día laboral.

Puesto que puede ser ventajoso diseñar inhibidores peptídicos que inhiben selectivamente las proteasas MACH sin interferir con los procesos de muerte celular fisiológicos en los que otros miembros de la familia de proteasas CED3/ICE están implicados, el grupo de péptidos que se unen a las proteasas MACH en un ensayo tal como el descrito anteriormente puede ser sintetizados como un péptido sustrato fluorogénico para ensayar en lo que se refiere a corte selectivo de las proteasas MACH sin ser cortadas por otras proteasas CED3/ICE. Los péptidos que se determina que son selectivamente cortado por las proteasas MACH, pueden entonces ser modificados para potenciar la permeabilidad celular e inhibir la actividad por muerte celular de MACH bien de modo reversible o irreversible. Thornberry y otros (1994) documentaron que un tetrapéptido (aciloxi)metil cetona Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH_{2}OC(O)-[2,6 (CF3)2]Ph fue un potente inactivador de ICE. De igual modo, Milligan y otros (1995) documentaron que los inhibidores tetrapeptídicos que tienen un grupo clorometilcetona (irreversiblemente) o aldehído (reversiblemente) inhibieron ICE. Además, un grupo benciloxicarboxil-Asp-CD2OC(O)-2,6-diclorobenceno (DCB) se demostró que inhibe ICE (Máxima y otros, 1995). Por consiguiente, los tetrapéptidos que se unen selectivamente a las proteasas MACH pueden ser modificados con, por ejemplo, un grupo aldehído, clorometilcetona, (aciloxi) metil cetona o un grupo CH_{2}OC(O)-DCB para crear un inhibidor peptídico de la actividad proteasas MACH.

Mientras que algunos inhibidores específicos de otras proteasas CED3/ICE son permeables a las células, la permeabilidad celular de los inhibidores peptídicos puede necesitar ser potenciada. Por ejemplo, péptidos pueden ser modificados químicamente o derivados para potenciar su permeabilidad a través de la membrana celular y facilitar el transporte de tales péptidos a través de la membrana y en el citoplasma. Muranishi y otros (1991) documentaron derivar hormona liberadora de tirotropina con ácido láurico para formar un derivado lauroilo lipofílico con buenas características de penetración a través de las membranas celulares. Zacharia y otros (1991) también documentaron la oxidación de la metionina a sulfóxido y el remplazamiento del enlace peptídico con su isoéster cetometileno (COCH_{2}) para facilitar el transporte de péptidos a través de las membranas celulares. Estas son sólo algunas de las modificaciones conocidas y derivadas que son bien conocidas por aquellos profesionales con experiencia en la técnica.

Además, fármacos o inhibidores peptídicos, que son capaces de inhibir la actividad de muerte celular de MACHa1 y MACHa2, pueden ser conjugados o acomplejados con moléculas que facilitan la entrada en la célula.

El documento de patente norteamericana 5.149.782 describe la conjugación de una molécula que ha ser transportada a través de la membrana celular con un agente de unión de membranas tales como polipéptidos fusogénicos, polipéptidos formadores de canales iónicos, otros polipéptidos de membrana, y ácidos grasos de cadena larga, por ejemplo, ácido mirístico, ácido palmítico. Estos agentes de unión de membranas insertan los conjugados moleculares en la bicapa lipídica de las membranas celulares y facilitan su entrada en el citoplasma.

Low y otros, documento de patente norteamericana 5.108.921, revisa métodos disponibles para el suministro transmembrana de moléculas tales como, pero no limitadas a, proteínas y ácidos nucleicos mediante el mecanismo de actividad endocítica mediada por receptor. Estos sistemas de receptores incluyen aquellos que reconocen galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, transferrina, asialoglicoproteína, transcobalamina (vitamina B_{12}), a-2 macroglobulinas, insulina y otros factores de crecimiento peptídico tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF). Low y otros, enseñan que los receptores de nutrientes, tales como receptores para biotina y folato, pueden ser usados ventajosamente para potenciar el transporte a través de la membrana celular debido a la localización y multiplicidad de la biotina y los receptores folato de las superficies de membrana de la mayoría de las células y los procesos de transporte transmembrana mediados por el receptor asociados. Así, un complejo formado entre un compuesto a ser introducido en el citoplasma y un ligando, tal como una biotina o folato, es puesto en contacto con una membrana celular que lleva biotina o receptores folato para iniciar el mecanismo de transporte transmembrana mediado por el receptor y permitir de ese modo la entrada del compuesto deseado en la célula.

ICE es conocido como que tiene la capacidad para tolerar las sustituciones liberales en la posición P_{2} y esta tolerancia a las sustituciones liberales fue explotada para desarrollar un marcaje de afinidad potente y altamente selectivo que contiene un marcaje de biotina (Thornberry y otros, 1994). Por consiguiente, la posición P2 así como posiblemente el extremo N-terminal del inhibidor tetrapeptídico puede ser modificado o derivado, tal como con la adición de una molécula de biotina, para potenciar la permeabilidad de estos inhibidores peptídicos a través de la membrana celular.

Además, se conoce en la técnica que fusionar una secuencia peptídica deseada con una secuencia de peptido líder/señal para crear "péptidos quimera" permitirá a tal péptido quimera ser transportado a través de la membrana celular en el citoplasma.

Como se apreciará por aquellos profesionales con experiencia en la técnica de péptidos, los inhibidores peptídicos de la actividad proteolítica de MACH, pretenden incluir fármacos o inhibidores peptidomiméticos, que pueden también ser rápidamente cribados para la unión a la proteasa MACH para diseñar tal vez inhibidores más estables.

También se apreciará que los medios para facilitar o potenciar el transporte de los inhibidores peptídicos a través de la membrana celular como se discute anteriormente son también aplicables a las isoformas MACH mismas así como a otros péptidos y proteínas que ejercen sus efectos intracelularmente.

Con respecto a los anticuerpo mencionados aquí a través de la solicitud, el término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quimeras, anticuerpo anti-idiotipo (anti-Id) a anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, pero no limitado a corte enzimático, síntesis peptídica o ténicas recombinantes.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas a partir del suero de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, población que contiene sustancialmente sitios de unión de epitopos similares. Los mAbs pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Véase por ejemplo Oler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); documento de patente norteamericana Nº 4.376.110; Ausubel y otros, eds., Harlow y Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan y otros, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wileay Inntersciences N.Y., (1992-1996), el contenido de cuyas referencias está completamente incorporado aquí mediante referencia. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de la misma. Un hibridoma que produce un mAb del presente invento puede ser cultivado in vitro, in situ o in vivo. La producción de concentraciones elevadas de mAbs in vivo o in situ hace que éste sea el método actual de producción preferido.

Los anticuerpos quimera son moléculas de las cuales las diferentes porciones son derivadas a partir de diferentes especies animales, tales como las que tienen la región variable derivada de un mAb murino y una región constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quimera son principalmente usados para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y el aumento de rendimiento en la producción, por ejemplo en el que los mAbs murinos tiene rendimientos elevados a partir de hibridomas pero una mayor inmunogenicidad en humanos, tal que mAbs quimeras humanos/murinos son usados. Los anticuerpos quimeras y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne y otros, Nature 312:643-646 (1984); Cabilly y otros, solicitud de patente europea 125023 (publicada el 14 de Noviembre de 1984); Neuberger y otros, Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi y otros, solicitud de patente europea 171496 (publicada el 19 de Febrero de 1985); Morrison y otros, Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo, 1986); Neuberger y otros, solicitud de patente PCT WO8601533 (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo y otros, Solicitud de patente europea 184187 (publicada el 11 de Junio de 1986); Asgan y otros, J. Immunol 137: 1066-1074 (1986); Robinson y otros Solicitud de patente internacional Nº WO8702671 (publicada el 7 de Mayo de 1987); Liu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better y otros, Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.

Un anticuerpo anti-idiotipo (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede ser preparado inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo cepa de ratón) como la fuente de los mAbs frente a los cuales un anticuerpo anti-Id es preparado. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo frente a estos determinantes idiotípicos (el anticuerpos anti-Id). Véase, por ejemplo, el documento de patente norteamericana Nº: 4.699.880.

El anticuerpos anti-Id puede también ser usado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal más, produciendo un así llamado anticuerpo anti-anti-Id. el anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Así, usando anticuerpos frente a los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

Por consiguiente, mAbs generados frente a las proteínas de unión a MORT-1, análogos, fragmentos o derivados de los mismos, del presente invento pueden ser usados para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células de bazo de tales ratones inmunizados son usadas para producir híbridos anti-Id que secretan mAbs anti-Id. Además los mAbas anti-Id pueden ser acoplados a un vehículo tal como la hemocianina de lapa keyhole (KLH) y usada para inmunizar ratones BALB/c adicionales. El suero de estos ratones contendrá anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para un epítopo de la proteína de unión a MORT-1 anterior, o análogos, fragmentos y derivados de los mismos.

Los mAbas anti-Id tienen así sus propios epítopos idiotípicos, o "idiotopos" estructuralmente similares al epítopo a ser evaluado, tal como la proteína GRB-a.

El término "anticuerpo" también pretende incluir tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2, que son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápido de la circulación, y pueden tener menos unión tisular inespecífica que un anticuerpo intacto (Wahl y otros, J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en el presente invento pueden ser usados para la detección y cuantificación de la proteína de unión a MORT-1 según los métodos descritos aquí para moléculas de anticuerpo intactas. Tales fragmentos son típicamente producidos por el corte proteolítico, usando enzimas tales como papaina (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para de ese modo unir la molécula al anticuerpo. El término "epítopo" pretende referirse a la porción de cualquier molécula capaz de estar unida por un anticuerpo al que puede también ser reconocido por ese anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos" consisten normalmente en agrupaciones de moléculas en la superficie químicamente activa tal que los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tiene características estructurales en tres dimensiones específicas así como características de carga específicas.

Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse por un anticuerpo que es además capaz de inducir a un animal a producir un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más que un epítopo. La reacción específica a la que se hace referencia anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará, en una manera altamente selectiva con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpos, útiles en el presente invento pueden ser usados cuantitativamente o cualitativamente para detectar la proteína de unión a MORT-1 en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan la proteína de unión a MORT-1 del presente invento. Esto puede lograrse mediante técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase a continuación) acoplado con detección por microscopia de luz visible, citometría de flujo o fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en el presente invento pueden ser empleados histológicamente, como en inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica, para la detección in situ de la proteína de unión a MORT-1 del presente invento. La detección in situ puede ser lograda eliminando un espécimen histológico de un paciente, y proporcionando el anticuerpo marcado del presente invento a tal espécimen. El anticuerpo (o fragmento) es proporcionado preferiblemente aplicando o solapando el anticuerpo (o fragmento) marcado con una muestra biológica. A través del uso de tal procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de la proteína de unión MORT-1, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando el presente invento, aquellos con una experiencia general percibirán rápidamente que cualquiera de la amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) pueden ser modificados para lograr tal detección in situ.

Tales ensayos para la proteína de unión a MORT-1 del presente invento comprenden típicamente incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto tisular, células recién recogidas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo tisular, en presencia de un anticuerpo dtetectablemente marcado capaz de indentificar la proteína de unión a MORT-1, y detectar el anticuerpo por cualquiera del número de técnicas bien conocidas en la técnica.

La muestra biológica puede ser tratada con un soporte o vehículo en fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte o vehículo sólido que es capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte o vehículo puede ser entonces lavado con tampones adecuados seguido por tratamiento con un anticuerpo detectablemente marcado según el presente invento, como se observa anteriormente. El soporte o vehículo en fase sólida puede ser entonces lavado con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuero no unido. La cantidad de marcaje unido en dicho soporte o vehículo sólido puede ser entonces detectado mediante medios convencionales.

Por "soporte en fase sólida", "vehículo en fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de unir antígenos o anticuerpos. Soportes o vehículos bien conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, poletileno, dextrano, nilón, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser bien soluble en cierta medida o insoluble para los propósitos del presente invento. El material soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Así, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una bola, cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de un bastoncillo. Alternativamente, la superficie puede ser plana como en las láminas, tiras de ensayo, etc. Soportes o vehículos preferidos incluyen bolas de poliestireno. Aquellos con experiencia en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para la unión de anticuerpos o antígenos, o serán capaces de establecerlo usando experimentación rutinaria.

La actividad de unión de un lote de anticuerpos dado, del invento como se menciona anteriormente, puede ser determinada según métodos bien conocidos. Aquellos con experiencia en la técnica serán capaces de determinar condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación rutinaria.

Otras etapas tales de lavado, agitación, filtrado y similares pueden ser añadidas a los ensayos como se acostumbre o sea necesario para una situación particular.

Uno de tales modos en los que un anticuerpo según el presente invento puede ser detectablemente marcado es uniendo los mismos a una enzima y usarlo en un inmuno ensayo enzimático (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando luego es expuesta a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal manear que produzca un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden ser usadas para marcar detectablemente el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, isómeros delta-5-esteriodeos, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerolfosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolin-esterasa. La detección puede ser lograda mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección puede también ser lograda mediante comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de un modo similar.

La detección puede ser lograda usando cualquiera de la variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcaje radioactivo de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible detectar R-PTPase a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción de RIA puede ser encontrada en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por Works, T.S. y otros., North Holland Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioinmune Assay and Related Techniques" por Chard, T., incorporadas mediante referencia aquí. El isótopo radioactivo puede ser detectado mediante tales medios como el uso de un contador g o un contador de centelleo o mediante autoradiografía.

Es posible también marcar un anticuerpo según el presente invento con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescentemente es expuesto a la luz con la apropiada longitud de onda, su presencia puede ser entonces detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescentes más comúnmente usados están el isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo puede también ser detectablemente marcado usando metales emisores de fluorescencia tales como ^{152}E, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden ser unidos al anticuerpo usando tales grupos quemadores de metales como el ácido dietilenetriamina pentaacético (ETPA).

El anticuerpo puede también ser detectablemente marcado acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscentemente es entonces determinado detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster acridino teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato.

De igual modo, un compuesto bioluminiscente puede ser usado para marcar el anticuerpos del presente invento. la bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los que la proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción de quimioluminiscencia. La presencia de una proteína bioluminiscente es determinada detectando la presencia de luminiscencia: Compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcado son luciferina, luciferasa y aequorina.

Una molécula de anticuerpo del presente invento puede ser adaptada para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como el ensayo de "dos sitios" o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpos (o fragmento de anticuerpo) sin marcar es unido a un soporte o vehículo sólido y una cantidad del anticuerpo soluble detectablemente marcado es añadida para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo de fase sólida, antígeno, y anticuerpo marcado.

Ensayos inmunométricos típicos, y preferidos incluyen ensayos "directos" o "forward" en los que el anticuerpo unido a la fase sólida es puesto primero en contacto con la muestra a ser ensayada para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo binario anticuerpo en fase sólida-antígeno. Tras un período de incubación adecuada, el soporte o vehículo sólido es lavado para eliminar el residuo de la muestra fluida, incluyendo el antígeno sin reaccionar, si lo hay, y después puesto en contacto con la disolución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo sin marcar (que funciona como una "molécula receptora"). Tras un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado se acompleje con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo sin marcar, el soporte o vehículo sólido es lavado una segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado sin reaccionar.

En otro tipo de ensayo "sándwich", que puede también ser usado con los antígenos del presente invento, los ensayos así llamados "simultáneo" e "inverso" son usados. Un ensayo simultáneo implica una etapa de incubación única según el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado son ambos añadidos a la muestra a ser ensayada al mismo tiempo. Después de que la incubación se completa, el soporte o vehículo sólido es lavado para eliminar el residuo de muestra fluida y un anticuerpo marcado no acomplejado. La presencia de anticuerpos marcados asociados con el soporte o vehículo sólido es entonces determinada como ser haría en un ensayo sándwich "directo" convencional.

En el ensayo "inverso", la adición secuencial del anticuerpo marcado sobre la muestra fluida seguido por la adición de anticuerpo sin marcar unido a un soporte o vehículo sólido tras una período de incubación adecuado es utilizado. Tras una segunda incubación, la fase sólida es lavada en una manera convencional para liberarlo del residuo de la muestra a ser ensayada y la disolución del marcador marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte o vehículo sólido es entonces determinado como en los ensayos "simultáneo" y "directo".

Las proteínas de unión a MORT-1 de la descripción pueden ser producidas por cualquier procedimiento de ADN recombinante estándar (véase por ejemplo, Sambrook y otros 1989 y Ansabel y otros, 1987-1995, supra) en los que las células hospedantes eucarióticas o procarióticas adecuadas bien conocidas en la técnica son transformadas por los vectores eucorioticos o procarióticos apropiados que contiene las secuencias que codifican las proteínas. Por consiguiente, la presente descripción también tiene que ver con los vectores de expresión y los hospedantes transformados para la producción de las proteínas de la descripción. Como se menciona anteriormente, estas proteínas también incluyen sus análogos biológicamente activos, fragmentos y derivados, y así los vectores que los codifican también incluyen vectores que codifican análogos y fragmentos de estas proteínas, y los hospedantes transformados incluyendo los que producen tales análogos y fragmentos. Los derivados de estas proteínas producidas por los hospedantes transformados, son los derivados producidos por la modificación estándar de las proteínas o sus análogos o fragmentos.

La presente descripción también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden los vectores virales animales recombinantes que codifican las proteínas de unión a MORT-1, vectores que también codifican una proteína de superficie viral capaz de unir proteínas de superficie específicas de las células diana (por ejemplo, células cancerígenas) para dirigir la inserción de las secuencias de las proteínas de unión a MORT-1 en las células. Otras composiciones farmacéuticas de la descripción comprenden como ingrediente activo (a) una secuencia oligonucleotídica que codifican una secuencia anti-sentido de la secuencia de la proteína de unión a MORT-1, o (b) fármacos que bloquean la actividad proteolítica de las isoformas MACH.

Las composiciones farmacéuticas según el presente invento incluyen una cantidad suficiente del ingrediente activo para lograr el propósito buscado. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden ser usados farmacéuticamente y que pueden estabilizar tales preparaciones para la administración al sujeto que necesita la misma así como conocida por aquellos con experiencia en la técnica.

La proteína de unión a MORT-1 MACH, es expresada en diferentes tejidos en niveles marcadamente diferentes y aparentemente también con diferentes patrones de isotipos. Esas diferencias contribuyen probablemente a las características específicas de tejido de la respuesta al ligando Fas/APO-1 y TNF. Como es el caso de otros homólogos de CED3/ICE (Wang y otros, 1994; Alnemri y otros., 1995), las isoformas MACH que contienen las regiones CED3/ICE incompletas (por ejemplo, MACHa3) se encuentra que tienen un efecto inhibitorio sobre la actividad de las moléculas MACHa1 o MACHa2 coexpresadas; también se encuentran que bloquean la inducción de muerte por Fas/APO1 y p55-R. La expresión de tales isoformas inhibidoras en las células pueden constituir un mecanismo de autoprotección celular frente a la citotoxicidad mediada por Fas/APO1 y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas MACH, que excede ampliamente la observada por cualquiera de las otras proteasas de la familia CED3/ICE, debería permitir un ajuste fino de la función de las isoformas MACH activas.

También es posible que algunas isoformas MACH sirvan para otras funciones. La capacidad de MACH\beta1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACHa1 sugiere que esta isoforma puede en realidad potenciar la actividad de las isoformas enzimáticametne activas. La ligera citotoxicidad observada en los cultivos 293-EBNA y MCF7 transfectados con esta isoforma y el efecto citotóxico bastante significativo que ejerce en células HeLa es probable que refleje la activación de las moléculas MACHa engógenamente expresadas tras la unión a las moléculas MACHb1 transfectadas. Es imaginable, que algunas de las isoformas MACH puedan también actuar como sitios de anclaje para moléculas que están implicadas en otros, efectos no citotóxicos de los receptores Fas/APO1 y TNF.

Debido a su capacidad única de los receptores de Fas/APO1 y TNF para causar la muerte celular, así como la capacidad de los receptores TNF para desencadenar otras actividad de daño tisular, aberraciones en la función de estos receptores podría ser particularmente nociva para el organismo. Efectivamente, tanto un funcionamiento excesivo como deficiente de estos receptores se ha demostrado que contribuye a las manifestaciones patológicas de diversas enfermedades (Vassalli, 1992; Nagata y Golstein, 1995). La identificación de las moléculas que participan en la actividad de señalización de los receptores y encontrar medios para modular la actividad de estas moléculas, podría dirigir nuevas aproximaciones terapéuticas. En vista del papel central que se sospecha de MACHa en Fas/APO1 y la toxicidad mediada por TNF, parece particularmente importante diseñar fármacos que puedan bloquear la actividad proteolítica de MACHa, como se hizo para otras proteínas de la familia CED3/ICE (Thornberry y otros, 1994; Millar y otros, 1995; Máxima y otros, 1995; Milligan y otros, 1995; Enari y otros, 1995, Los y otros, 1995). Las características de secuencias únicas del homólogo CED3/ICE dentro de las moléculas MACHa permitiría diseñar fármacos que afectarían especialmente su actividad. Tales fármacos podrían proporcionar protección a partir de la citotoxicidad mediada por el sistema inmune implicando MACHa sin interferir con los procesos de muerte celular fisiológica en los que otros miembros de la familia CED3/ICE están implicados.

Otros aspectos del invento serán evidentes a partir de los siguientes ejemplos.

El invento será ahora descrito en más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y los dibujos que acompañan.

Debería observarse también que los procedimientos de: i)cribado de doble híbrido y ensayo de expresión de \beta-galactosidasa de doble híbrido; (ii) expresión inducida, marcaje metabólico e inmunoprecipitación de proteínas: (iii) unión in vitro; (iv) evaluación de la citotoxicidad; y (v) análisis por Northern y de secuencia, como se expone en los Ejemplos 1 (véase también Boldin y otros, 1995b) y 2 a continuación, con respecto a MORT-1 y a la proteína de unión a MORT-1, son igualmente aplicables (con algunas modificaciones) para el aislamiento correspondiente, clonaje y caracterización de MACH y sus isoformas. Estos procedimientos deben así ser interpretados como la descripción completa de los mismos procedimientos usados para el aislamiento, clonaje y caracterización de MACH según el presente invento, como se detalla en el Ejemplo 3 a continuación.

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Ejemplo 1 Clonaje y aislamiento de la proteína MORT-1 que se une al dominio intracelular de FAS-R (i) Cribado de doble híbrido y ensayo de expresión de \beta-galactosidasa de doble híbrido

Para aislar proteínas que interaccionan con el dominio intracelular del FAS-R, el sistema de doble híbrido de levadura fue usado (Fields y Song, 1989). Brevemente, este sistema de doble híbrido es un ensayo genético basado en levaduras para detectar interacciones proteína -proteína específicos in vivo mediante el restablecimiento de un activador transcripcional eucariótico tal como GAL4 que tiene dos dominios separados, un dominio de unión a ADN y un dominio de activación, dominios que cuando están expresados y unidos juntos para formar una proteína GAL4 restablecida, son capaces de unirse a una secuencia activadora aguas arriba que a su vez activa un promotor que controla la expresión de un gen reportero, tal como lacZ o HIS3, la expresión de la cual es fácilmente observada en las células cultivadas. En este sistema, los genes para las proteínas de interacción candidatas son clonados en vectores de expresión separados. En un vector de expresión, la secuencia de una proteína candidata es clonada en la fase con la secuencia del dominio de unión a ADN de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de unión a ADN de GAL4, y en el otro vector la secuencia de una segunda proteína candidata es clonada en fase con la secuencia del dominio de activación GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de activación GAL4. Los vectores de doble híbrido son entonces cotransformados en una cepa hospedante de levadura que tienen un gen reportero lacZ o HIS3 bajo el control de los sitios de unión GAL4 aguas arriba. Sólo aquellas células hospedantes transformadas (cotransformantes) en las que las proteínas de doble híbrido están expresadas y son capaces de interaccionan entre sí, serán capaces de expresar el gen reportero. En el caso del reportero lacZ, las células hospedantes que expresan este gen se volverán de color azul cuando se añade X-gal a los cultivos. De este modo, las colonias azules son indicadoras del hecho que las dos proteínas candidatas clonadas son capaces de interaccionar entre sí.

Usando este sistema de doble híbrido, el dominio intracelular, FAS-IC, fue clonado, separadamente, en el vector pGBT9 (que llevan la secuencia de unión de ADN GAL4, proporcionado por CLONTECH, USA, véase a continuación), para crear proteínas de fusión con el dominio de unión a ADN de GAL4. Para el cloaje de FAS-R en pGBT9, un clon que codifica para la secuencia de cADN completa de FAS-R (documento de patente WO9531544) fue usado a partir del cual el dominio intracelular (IC) fue cortado mediante procedimientos estándar usando diveras enzimas de restricción y aislado entonces mediante procedimientos estándar e insertado en el vector pGBT9, abierto en su región del sitio de clonaje múltiple (MCS), con las correspondientes enzimas de restricción adecuadas. Debería observarse que el FAS-IC se extiende desde los residuos aminoacídicos 175-319 del FAS-R intacto, conteniendo esta porción los residuos 175-319 estando el FAS-IC insertado en el vector pGBT9.

El vector híbrido (quimera) anterior fue entonces cotransfectado junto con una librería de cADN a partir de las células HeLa humanas clonadas en el vector pGAD GH, que llevan el dominio de activación GAL4, en la cepa hospedante de levadura HF7c (todos los vectores observados anteriormente, pGBT9 y pGAD GH que llevan la librería de cADN de células HeLa, y la cepa de levadura fueron comprados de Clontech Laboratories, Inc., USA, como parte del sistema de doble híbrido MATCHMAKER, Nº PT 1265-1). Las levaduras cotransfectadas fueron seleccionadas por su capacidad de crecer en medio carente de Histidina (medio His), el que crezcan colonias es indicativo de transformantes positivos. Los clones de levadura seleccionados fueron entonces ensayados en lo que respecta a su capacidad para expresar el gen lacZ, es decir, a su actividad LACZ, y esto se hace añadiendo X-gal al medio de cultivo, que es catabolizado para formar un producto coloreado azul por b-galactosidasa, la enzima codificada por el gen lacZ. Así, colonias azules son indicadoras de un gen lacZ activo. Para la actividad del gen lacZ, es necesario que el activador de la transcripción GAL4 esté presente en una forma activa en los clones transformados, a saber, que el dominio de unión a ADN GAL4 codificado por el vector híbrido anterior a ser combinados apropiadamente con el dominio de activación GAL4 codificado por el otro vector híbrido. Tal combinación es sólo posible si las dos proteínas fusionadas a cada uno de los dominio GAL4 son capaces de interaccionar (unirse) de manera estable entre sí. Así, las colonias His^{+} y azules (LACZ^{+}) que fueron aisladas son colonias que han sido cotransfectadas con un vector que codifica el FAS-IC y un vector que codifica un producto proteico de origen de células HeLa humanas que es capaz de unirse de modo estable a FAS-IC.

El ADN plasmídico a partir de las colonias de levadura His^{+}, LACZ^{+} fue aislado y electroporado en la cepa HB101 de E. coli mediante procedimientos estándar seguido por la selección de tranformantes Leu^{+} resistentes a Ampicilina, siendo estos transformantes los que llevan el vector GH pGAD híbrido que tiene tanto las secuencias codificantes Amp^{R} y Leu2. Tales transformantes son por lo tanto clones que llevan estas secuencias que codifican nuevas proteínas identificadas capaces de unirse al FAS-IC. El ADN plasmídico fue entonces aislado a partir de estas E. coli transformadas y reensayado mediante:

(a) retransformación de éstas con el plásmido híbrido del dominio intracelular de FAS-R (híbrido pGTB9 que lleva el FAS-IC) en la cepa de levadura HF7 como se expone aquí anteriormente. Como testigos, los vectores que llevan secuencias que codifican proteínas irrelevantes, por ejemplo, pACT-lamin o pGBT9 solas fueron usadas para la cotransformación con el plásmido que codifica la proteína de unión a FAS-IC (es decir, MORT-1). Las levaduras cotransformadas cuando son ensayadas en lo que respecta a su crecimiento en medio His^{-} solo, o con niveles diferentes de 3-aminotriazol; y

(b) retransformación del ADN plasmídico y el plásmido FAS-IC híbrido original y los plásmidos testigo descritos en (a) en las células hospedantes de levaduras de la cepa SFY526 y determinación de la actividad LACZ^{+} (efectividad de la formación de b-gal, es decir, formación de color azul).

Los resultados de los ensayos anteriores revelaron que el patrón de crecimiento de las colonias en medio His^{-} fue idéntica al patrón de actividad LACZ, como se evalúa por el color de la colonia, es decir, las colonias His^{+} fueron también LACZ^{+}. Además, la actividad LACZ en cultivo líquido (condiciones de cultivo preferidas) fue evaluado tras la transfección de los dominios híbridos de unión de ADN GAL4 y activación en los hospedantes de levadura SFY526 que tienen una mejor inducibilidad LACZ con el activador de transcripción GAL4 que el de las células hospedantes de levadura HF7.

Usando el procedimiento anterior, una proteína llamada previamente designada, y ahora referido como MORT-1 por "Mediador de la toxicidad inducida por el receptor" o "Mediator of Receptor-induced Toxicity", fue identificada, aislada y caracterizada.

Además, debería también mencionarse que en un número de los ensayos de expresión de la b-galactosidasa de doble híbrido anterior, la expresión de la b-galactosidasa fue también evaluada mediante un filtro preferido. En el cribado, cindo de alrededor de 3x10^{6} cADNs se encontró que contenían el inserto MORT-1. Los insertos de cADN clonados así aislados fueron entonces secuenciados usando procedimientos de secuenciación de ADN estándar. La secuencia de aminoácidos de MORT-1 (SEQ ID Nº: 2) fue deducida a partir de la secuencia de ADN. La numeración de residuos en las proteínas codificadas por los insertos de cADN son como en la base de datos Swiss Prot. Los mutantes de deleción fueron producidos por PCR, y los mutantes puntuales mediante oligonucleótidos por mutagénesis dirigida (Current Protocols in Molec. Biol., 1994).

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(ii) Expresión inducida, marcaje metabólico e inmunoprecipitación de proteínas

MORT-1, unido por N- al octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), Fas-IC, FAS-R, p55-R, una quimera comprendida del dominio extracelular de p55-R (aminoácidos 1-168) unida al dominio transmembrana e intracelular de FAS-R (aminoácidos 153-319), y el cADN de luciferasa que sirve como testigo, fueron expresadas en las células HeLa. La expresión fue llevada a cabo usando un vector de expresión controlada por tetraciclina, en un clon de células HeLa (Hita-1) que expresa un transactivador controlado por tetraciclina (Gossen y Bujard, 1992); véase también Boldin y otros., 1995). El marcaje metabólico con [^{35}S] metionina y [^{35}S] cisteína (DUPONT, Wilmington, DE, USA y Amersham, Buckinghamshire, England) fue realizada 18 horas tras la transfección, por una incubación de 4 h adicional a 37ºC en medio Eagle modificado de Dulbecco que carece de metionina y cisteína, pero suplementado con 2% de suero de ternera fetal dializado. Las células fueron entonces lisadas en tampón RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 1% desoxicolato, 0,1% SDS y 1 mM de EDTA) y el lisado fue preaclarado mediante incubación con antisuero de conejo irrelevante (3 ml/ml) y bolas de Proteína G Sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia; 60 ml/ml). La inmunoprecipitación fue realizada mediante 1 h de incubación a 4ºC de alícuotas de 0,3 ml de lisado con anticuerpos monoclonales de ratón (5 ml/alícuota) frente al octopéptido FLAG (M2; Eastman Kodak), p55-R (Nº 18 y Nº 20; Engelmann y otros, 1990), o FAS-R (ZB4; Kamiya Southand Oaks, Ca., USA) o con los anticuerpos de ratón del isotipo relacionado como testigos, seguido por una incubación adicional de 1 h con bolas de proteína G Sefarosa (30 ml/alícuota).

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(iii) Unión in vitro

Las fusiones de Glutation-S-transferasa (GST) con el Fas-IC salvaje o mutado fueron producidas y adsorbidas a bolas de glutation-agarosa; véase Boldin y otros, 1995; Current Protocols in Molecuar Biology, 1994; Frangioni y Neel, 1993). La unión de proteínas de fusión FLAG-MORT-1 metabólicamente marcadas A GST-FAS-IC fue evaluada incubando las bolas durante 2 h a 4ºc con extractos de células hela, metabólicamente marcadas con [^{35}S]metionina (60 mCi/ml), que expresan FLAG-MORT-1. Los extractos fueron preparados en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, 0,1% NP-40, ditiotreitol 1 mM, EDTA 1 mM, fenilmetilsulfonilfluoruro 1 mM, Aprotinina 20 mg/ml, Leupeptina 20 mg/ml, fluoruro sódico 10 mM y vanadato sódico 0,1 mM (1 ml por 5x10^{5} células).

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(iv) Evaluación de la citotoxicidad desencadenada por la expresión inducida por MORT-1

cADN de MORT-1, Fas-IC, p55-IC y luciferasa fueron insertado en un vector de expresión controlado por tetraciclina y tranfectado a las células HtTa-1 (Gossen y Bujard, 1992) junto con el cADN de fosfatasa alcalina de placenta secretada, colocado bajo el control del promotor SV40 (el vector pSBC-2, Dirks y otros, 1993). Muerte celular fue evaluada 40 horas tras la transfección, bien mediante el ensayo de ingesta de rojo neutro (Wallach, 1984) o, para evaluar la muerte específicamente en aquellas células que expresan los cADNs tranfectados, determinando las cantidades de fosfatasa alcalina de placenta (Berger y otros, 1988) secretada al medio de crecimiento en las últimas 5 horas de incubación.

En otro grupo de experimentos para analizar la región de la proteína MORT-1 implicada en la unión al FAS-IC, las siguientes proteínas fueron expresadas de modo transitorio en las células HeLa que contiene un transactivador controlado por tetraciclina (HtTa-1), usando un vector de expresión controlado por tetraciclina (pUHD10-3): FAS-R humano solo; FAS-R humano así como la parte N-terminal de MORT-1 (aminoácidos 1-117, la "cabeza de MORT-1"); FAS-R humano así como la parte c-terminal de MORT-1, que contiene su región de homología del "dominio de muerte" (aminoácidos 130-245, el "MORT-1 DD"); FLAG-55.11 (aminoácidos 309-900 de la proteína 55.11 fusionada al extremo N-terminal del octapéptido FLAG, siendo la proteína 55.11 una proteína de unión específica a p55-IC. Doce horas tras la transfección, las células fueron tripsinizadas y resembradas a una concentración de 30.000 células/pocillo. Tras 24 h siguientes a la incubación, las células fueron tratadas durante 6 horas con un anticuerpo monoclonal frente al dominio extracelular de FAS-R (anticuerpo monoclonal CH-11, Oncor, Gaithersburg, MD, USA) a diversas concentraciones (0,001-10 mg/ml anticuerpo monoclonal), en presencia de 10 mg/ml de cicloheximida. La viabilidad celular fue entonces determinada mediante el ensayo de ingesta de rojo neutro y los resultados fueron presentados en términos de % de células viables según se compara con las células que han sido incubadas con cicloheximida sola (en ausencia de anticuerpo monoclonal CH-11 anti-FAS-R).

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(v) Análisis por Northern y de secuencia

ARN poly A^{+} fue aislado de ARN total de células HeLa (Oligotex-dT RNA kit. QIAGEN, Hilden, Alemania). Análisis Northern usando el cADN de MORT-1 como una sonda fue usado mediante métodos convencionales (véase Holding y otros, 1995). La secuencia nucleotídica de MORT-1 fue determinada en ambas direcciones mediante el método de terminación de cadena didesoxi.

El análisis de secuencia de cADN MORT-1 clonado mediante el procedimiento de doble híbrido indicó que codifica una proteína nueva. Aplicando adicionalmente el ensayo de doble híbrido para evaluar la especificidad de la unión de esta proteína (MORT-1 por "Mediador de la toxicidad inducida por receptor") a Fas-IC, y para definir la región particular en Fas-IC a la cual se une, llevó a los siguientes hallazgos (Figura 1): (a) la proteína MORT-1 se une tanto al Fas-IC humano como de ratón, pero no a varias otras proteínas ensayadas, incluyendo tres receptores de la familia TNF/NGF (receptores TNF p55 y p75 y CD40); (b) mutaciones de remplazamiento en la posición 225 (Ile) en el "dominio de muerte" de FAS-R, mostraron que abolen la señalización tanto in vitro como in vivo (la mutación lpr^{cg} (Watanabe-Fukunaga y otros, 1992; Itoh y Nagata, 1993), también impide la unión de MORT-1 al FAS-IC; (c) el sitio de unión de MORT-1 en FAS-R se encuentra dentro del "dominio de muerte" de este receptor; y (d) MORT-1 se une a sí mismo. La autoasociación, y la unión de MORT-1 a FAS-R implica diferentes regiones de la proteína: un fragmento de MORT-1 que corresponde a los residuos 1-117 se une a MORT-1 entera, pero no se une a sí mismo ni al FAS-IC. Por el contrario, un fragmento que corresponde a los residuos 130-245 se une al FAS-R, pero no se une a MORT-1 (FIG 1). Además, es evidente a partir de los resultados de la Fig. 1 que la región del "dominio de muerte" de FAS-R es crítica para la autoasociación de FAS-IC, como lo es la región del "dominio de unión" de p55-R para la autoasociación de p55-IC. Las deleciones en ambos lados de estos "dominios de muerte" no afectan a la capacidad de autoasociación de la misma mientras que, sin embargo, una deleción en estos "dominios de muerte" afecta a la autoasociación. En el caso de MORT-1, la unión de MORT-1 a FAS-IC también depende del "dominio de muerte" completo (entero) de FAS-R, mientras que sin embargo, tampoco depende de las regiones fuera de la región del "dominio de muerte" de FAS-R para la unión a FAS-IC.

En la Fig.1, se describe la interacción de las proteínas codificadas por el dominio de unión de ADN Gal4 y las construcciones del dominio de activación (pGBT9 y pGAD-GH) en levaduras transfectadas SFY526 como se evalúa mediante el ensayo de filtros de expresión de b-galactosidasa. Las construcciones del dominio de unión a ADN incluyen cuatro construcciones del Fas-IC humano, cuatro construcciones del Fas-IC de ratón incluyendo dos construcciones completas que tienen mutaciones de remplazamiento de Ile a Leu o Ile a Ala en la posición 225 (I225N y I225A, respectivamente) y tres construcciones MORT-1, todas las cuales se muestran esqueméticamente a la izquierda de la Fig. 1. Las construcciones del dominio de activación incluyen tres construcciones MORT-1, la porción MORT-1 está como en la construcción del dominio de unión a ADN; y una construcción de Fas-IC humana completa, siendo la porción Fas-IC la misma en la construcción del dominio de unión a ADN anterior. los dominios intracelulares del receptor p55 TNF (P55-IC residuos 206-426), CD40 humano (CD40-IC, residuos216-277) y receptor p75 TNF humano (p75-IC, residuos 287-461) así como los vectores lamin, ciclina D y Gal4 "vacío" (pGBT9) sirven como testigos negativos en la forma de construcciones de dominio de unión a ADN. SNF-1 y SNF4 sirven como testigos positivos en la forma de dominio de unión a ADN (SNF1) y construcciones de dominio de activación (SNF4). Vectores Gal4 "vacíos" (pGAD-GH) también sirven como testigos negativos en la forma de construcciones de dominios de activación. Los símbolos "++" y "+" indican el desarrollo de un color fuerte a los 30 y 90 min del ensayo, respectivamente; y "-" indica el no desarrollo de color a las 24 h. Combinaciones para las cuales no se da ningún valor es que no han sido ensayadas.

La expresión de moléculas MORT-1 unidas a su extremo N terminal con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1) dieron proteínas en células HeLa de cuatro distintos tamaños-alrededor de 27, 28, 32 y 34 kD. La interacción de MORT-1 con Fas-IC in vitro fue observda realizando un inmunoprecipitado de proteínas de extractos de células HeLa transfectadas con la proteína de fusión FLAG-MORT-1 o con cADN de luciferasa como testigo, siendo la inmunoprecipitación realizada con un anticuerpo anti-FLAG (aFLAG). La interacción in vitro fue también demostrada entre MORT-1 y FAS-IC en la que MORT-1 está en la forma de proteína de fusión FLAG-MORT metabólicamente marcada con [^{35}S]metionina obtenidas de extractos de células HeLa transfectadas y FAS-IC está en la forma de proteínas de fusión GST-FAS-IC humanas y de ratón incluyendo una que tiene una mutación de remplazamiento en la posición 225 en Fas-IC, todas las cuales proteínas de fusión GST-FAS-IC fueron producidas en E. coli. Las proteínas de fusión GST fueron unidas a bolas de glutatión antes de la intereacción con extractos que contiene la proteína de fusión MORT-1-FLAG tras esta interacción, se realizó SDS-PAGE (electroforesis). Así, la interacción in vitro fue evaluada mediante autoradiografía tras SDS-PAGE, la unión de MORT-1 metabólicamente marcada con [35S], producida en células HeLa como una fusión con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1), a GST, fusión GST con el Fas-IC de humano o de ratón (GST-huFas-IC, GST-mFas-IC) o a fusión GST con Fas-IC que contiene una mutación de remplazamiento de Ile a Ala en la posición 225. Se mostró que las cuatro proteínas FLAG-MORT1 mostraron su capacidad para unirse a Fas-IC tras incubación con una proteína de fusión Fas-IC. Como en el ensayo de doble híbrido (Fig 1), MORT-1 no se unió a la proteína de fusión GST-Fas-IC con un remplazamiento en el sitio de mutación lpr^{cg} (I225A).

Las proteínas codificadas por el cADN FLAG-MORT-1 mostraron también una capacidad para unirse al dominio intracelular de FAS-R, así como al dominio intracelular de la quimera FAS-R cuyo dominio intracelular fue remplazado con la de p55-R (p55-FAS), cuando se coexpresa con estos receptores en las células HeLa. En este caso, la interacción de MORT-1 con FAS-IC en las células HeLa transfectadas, es decir, in vivo, como se observa con los inmunoprecipitados de diversas células HeLa tranfectadas demostraron la interacción in vivo y la especificidad de la interacción entre MORT-1 y FAS-IC en células cotransfectadas con construcciones que codifican estas proteínas. Así, la proteína de fusión FLAG-MORT-1 fue expresada y marcada metabólicamente con [^{35}S] cisteína (20 mCi/ml) y [^{35}S] metionina (40 mCi/ml) en células HeLa solo o junto con FAS-R humano, FAS-R quimera en la que el dominio extracelular de FAS-R fue remplazado con la correspondiente región en el p55-R humano (p55-FAS), o p55-R humano, como testigo negativo. Una inmunoprecipitación cruzada de MORT-1 con el receptor coexpresado fue realizado usando diversos anticuerpos específicos. Los resultados indican que, FLAG-MORT-1 es capaz de unirse al dominio intracelular de FAS-R, así como al dominio intracelular de una quimera FAS-R-p55-R que tiene el dominio extracelular de p55-R y el dominio intracelular de FAS-R, cuando es coexpresado con estos receptores en las células HeLa. Además, la inmunoprecipitación de FLAG-MORT1 a partir de extractos de las células transfectadas también da como resultado la precipitación del FAS-R coexpresado o la quimera p55-FAS coexpresada. Por el contrario, la inmunoprecipitación de estos receptores resulta en la coprecipitación de FLAG-MORT-1.

El análisis por Northern usando el cADN MORT-1 como sonda reveló un transcrito de hibridación único en células HeLa. En una transferencia Norther en el que el ARN poli A+ (0,3 mg) a partir de células transfectadas fue hibridado con cADN de MORT-1, el tamaño del transcrito de ARN (alrededor de 1,8 kb) se encontró que estaba próximo al tamaño del cADN MORT-1 (alrededor de 1702 nucleótidos).

En el análisis de secuencia, el cADN se encontró que contenía un marco de lectura abierta de alrededor de 250 aminoácidos. La Fig. 2 describe el nucleótido preliminar (SEQ ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID Nº: 2) de MORT-1 en el que el motivo del "dominio de muerte" está subrayado, ya que es un posible residuo de inicio Met (posición 49; en negrita, subrayado M) y el codon stop de la traducción (el asterisco bajo el codon en la posición 769-771). Este motivo de "dominio de muerte" muestra homología con los motivos de "dominio de muerte" p55-R y FAS-R (p55DD y FAS-DD). Para determinar el extremo C-terminal preciso de MORT-1 y obtener evidencias que conciernen al extremo N-terminal (residuo Met inicial) preciso de MORT-1, experimentos adicionales fueron llevados a cabo como se indica a continuación:

\newpage

Usando los métodos descritos anteriormente, un número de construcciones que codifican las moléculas MORT-1 fusionadas a su extremo N-terminal con el octapéptido FLAG (FLAG-MORT-1) fueron contruidas y expresadas en células HeLa con marcaje metabólido de las proteínas expresadas usando ^{35}S-cysteina y ^{35}S metionina. Las moléculas MORT-1-FLAG fueron codificadas por los siguiente cADN que contiene diferentes porciones de la secuencia codificante MORT-1:

i) El cADN del octapéptido FLAG unido al extremo 5' del cADN de MORT-1 a partir de cuyos nucleótidos 1-145 de la SEQ ID Nº: 1 (véase la Fig. 2) han sido delecionados:

ii) el cADN del octapéptido FLAG unido al extremo 5' del cADN MORT-1 completo;

iii) el cADN del octapéptido FLAG unido al extremo 5' del cADN MORT-1 del cual los nucleótidos 1-145 así como los nucleótidos 832-1701 de la SEQ ID Nº:1 (Fig. 2) han sido delecionados y el codon GCC en la posición 142-144 fue mutado para TCC para impedir el inicio de la traducción en este sitio.

Tras la expresión de los productos de fusión FLAG-MORT-1, la inmunoprecipitación fue llevada a cabo como se menciona anteriormente, usando bien los anticuerpos monoclonales anti-FLAG (M2) o como testigo, anticuerpos anti-p75 TNF-R (Nº 9), seguido por SDS-PAGE (10% acrilamida) y autoradiografía. Los resultados de los análisis con los productos de fusión FLAG-MORT-1 anteriores confirmaron (validaron) el extremo C-terminal de MORT-1 y han proporcionado evidencias de que el extremo N-terminal de MORT-1 puede estar en una posición 49 de la secuencia en la Fig. 2.

Ciertamente, se ha demostrado mediante experimentos de expresión adicional de MORT-1 sin el octapéptido FLAG fusionado a su extremo 5', que Met sirve como un sitio eficaz de inicio de la traducción.

Una búsqueda llevada a cabo en las bases de datos "Gene Bank" y "Protein Bank" revelaron que no hay secuencia correspondiente a la de la secuencia MORT-1 aislada. Así, MORT-1 representa una nueva proteína de unión específica a FAS-IC.

La elevada expresión de p55-IC da como resultado el desencadenamiento de un efecto citocida (Boldin y otros, 1995). La expresión de Fas-IC en células HeLa también tiene tal efecto, aunque en menor extensión, que podría ser detectado sólo con el uso de un ensayo sensible. El desencadenamiento independiente de ligando de los efectos citocidas en las células tranfectadas con MORT-1 así como p55-IC y FAS-IC humanos, fue así analizado. El efecto de la expresión transitoria de MORT-1- FAS-IC humano, p55-IC humano, o luciferasa que sirvió como testigo, en la viabildad de las células HeLa fue evaluado usando un vector de expresión controlado por tetraciclina. La viabilidad celular fue evaluada 40 min tras transfectar estos cADN en presencia o ausencia de tetraciclina (1 mg/ml, para bloquear la expresión), junto con un cADN que codifica la fosfatasa alcalina placentaria secretada. La viabilidad celular fue determinada bien mediante el ensayo de ingesta de rojo neutro o, para determinar específicamente la viabilidad de las células en particular que expresan el ADN transfectado, midiendo las cantidades de fosfatasa alcalina de placenta secretada al medio de crecimiento.

El análisis anterior reveló que la expresión de MORT-1 en células HeLa dio como resultado una muerte celular significativa, mayor que la causada por la expresión de FAS-IC. Estos efectos citotóxicos de todos los p55-IC, FAS-IC y MORT-1 parecen estar relacionados con las región de dominios de muerte, presentes en todas estas proteínas, "dominios de muerte" que tiene una propensidad a autoasociarse, y de ese modo desencadenar posiblemente los efectos citotóxicos.

En vista de las características anteriormente mencionadas de MORT-1, a saber, la asociación específica de MORT-1 con la región particular en FAS-R que está implicada en la inducción de merte celular, y el hecho que aún un pequeño cambio en estructura de esa región, que impide la señalización (la mutación lpr^{cg}) abola también la unión de MROT-1, indica que esta proteína juega un papel en la señalización o el desencadenamiento de la muerte celular. Esta noción es apoyada además por la capacidad observada de MORT-1 para desencadenar por sí misma un efecto citocida. Así, MORT-1 puede funcionar como (i) un modulador de la autoasociación de FAS-R por su propia capacidad para unirse a FAS-R así como a sí misma, o (ii) servir como un sitio de anclaje para proteínas adicionales que están implicadas en la señalización por FAS-R, es decir, MORT-1 puede ser una proteína de anclaje y puede por lo tanto unirse a otros receptores a parte de FAS-R, o (iii) constituir parte de un sistema de señalización distinto que interacciona con la señalización por FAS-R.

Para analizar además las regiones de MORT-1 implicadas en la unión a FAS-IC y la modulación de los efectos celulares mediados por FAS-R (citotoxicidad), los experimentos anteriormente mencionados fueron llevados a cabo, usando vectores que codifican porciones de MORT-1 (la "cabeza MORT-1", aminoácidos 1-117 y el "MORT-1 dd", aminoácidos 130-245)(separadamente), con un vector que codifica el FAS-R humano para cotransfecciones de células HeLa. En estos experimentos, las diversas proteínas y combinaciones de proteínas fueron expresadas de modo transitorio en las células HeLa que contienen un transactivador controlado por tetraciclina (HtTA-1) insertando las secuencias que codifican las proteínas en un vector pUHD 10-3. De expresión controlado por tetraciclina. Las transfecciones testigo emplean vectores que codifican sólo el FAS-R y vectores que codifican la proteína de fusión FLAG-55.11 (siendo la proteína 55.11 una proteína de unión especifica para p55-IC de la cual una porción que contiene los aminoácidos 309-900 fue fusionada (en su extremo N-terminal) al octapéptido FLAG).

Tras la transfección y períodos de incubación, las células transfectadas fueron tratadas con diversas concentraciones de un anticuerpo monoclonal anti-FAS-R (CH-11) que se une específicamente al dominio extracelular de FAS-R expresado por las células. Esta unión de anticuerpo anti-FAS-R induce la agregación del FAS-R a la superficie celular (muy similar al ligando FAS-R) e induce la ruta de señalización intracelular mediada por FAS-ICE, resultando, en última instancia, en la muerte celular (citotoxicidad celular mediada por FAS-R). La concentración del anticuerpo monoclonal anti FAS-R (CH-11) usado fueron en el intervalo de 0,01-10 mg/ml, normalmente concentraciones tales como 0.005; 0,05 y 5 mg/ml. Las células fueron tratadas con el anticuerpo anti-FAS en presencia de 10 mg/ml de cicloheximida.

Los resultados de los análisis anteriores muestra que la expresión de FAS-R en las células transfectadas transmite una sensibilidad aumentada a los efectos citocidas de los anticuerpo anti-FAS-R (compárese "fas" con "55.11"). Además, la coexpresión de la región en MORT-1 que contiene la región de homología del "dominio de muerte" y FAS-R ("fas + MORT-1DD") interfiere fuertemente con la muerte celular inducida por FAS (es decir, mediada por FAS-R) como se esperaría por la capacidad de la región del "dominio de muerte" (DD) de MORT-1 para unirse al "dominio de muerte" de FAS-R (FAS-DD). Por otro lado, la coexpresión de la parte N-terminal de MORT-1 y FAS-R ("fas + MORT1 he") no interfiere con la muerte celular mediada por FAS-R y, en todo caso potencia algo la citotoxicidad (es decir, aumenta ligeramente la muerte celular).

Así, los resultados anteriores indican claramente que la proteína MORT-1 tiene dos regiones distintas en lo que a la unión de FAS-IC y mediación de la actividad citotóxica celular de FAS-IC se refiere.

Estos resultados por tanto también proporcionan una base para el uso de diferentes partes (es decir, fragmentos activos o análogos) de la proteína MORT-1 para diferentes aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, los análogos o fragmentos o derivados de los mismos de la proteína MORT-1 que contienen esencialmente sólo la porción C-terminal de MORT-1 incluyendo su región de "dominios de muerte" puede ser usado para inhibir los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en células o tejidos que contienen FAS-R y de ese modo proteger estas células o tejidos de los efectos nocivos del ligando de FAS-R en casos tales como, por ejemplo, hepatitis aguda. Alternativamente, los análogos o fragmentos o derivados de los mismos de la proteína MORT-1 que contiene esencialmente sólo la porción N-terminal de MORT-1 puede ser usada para potenciar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en células y tejidos que contienen FAS-R llevando de ese modo a la destrucción potenciada de esta células o tejidos cuando se desee en casos tales como, por ejemplo, células tumorales y células T y B autoreactivas. Como se detalla aquí anteriormente, los usos anteriores de las diferentes regiones de MORT-1 pueden ser llevadas a acabo usando los diversos virus recombinantes (por ejemplo, Vaccinia) para insertar la secuencia codificante de la región MORT-1 en células o tejidos específicos que se desea tratar.

Además, es también posible preparar y usar varias otras moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas que tienen secuencias o estructuras moleculares correspondientes a las regiones MORT-1 anteriormente mencionaddas para lograr el mismo efecto deseado mediado por estas regiones MORT-1.

Por otro lado, MORT-1 puede ser utilizado para identificar de modo específico, aislar y caracterizar otras proteínas que son capaces de unirse a MORT-1 (es decir, proteínas de unión a MORT-1); véanse Ejemplos 2 y 3.

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Ejemplo 2 Aislamiento de una proteína de unión a MORT-1 (i) Cribado de doble híbrido y ensayo de expresión de \beta-galactosidasa de doble híbrido

En una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando el dominio intracelular de p55 TNF-R (p55 IC) y MORT-1 como cebos, y un cribado de una librería de células B humanas, dos clones de cADN fueron obtenidos, los cuales codifican una proteína capaz de unirse tanto a MORT-1 como a p55-ICE. Ambos clones tienen idénticas secuencias nucleotídicas en el extremo 5' como se muestra en la Fig. 3 (SEQ ID Nº: 3).

(ii) Propiedades de unión del ADN recién clonado, en cribados de doble híbrido

Usando el procedimiento de doble híbrido de levadura anteriormente mencionado, una construcción que contiene el nuevo cADN de la proteína de unión a MORT-1 fue usado como "presa" a la cual se añadieron las construcciones de un número de "cebos" en reacciones separadas, para determinar la especificidad de unión de la proteína de unión a MORT-1 codificada por este cADN. Estos "cebos" incluyen construcciones que codifican MORT-1, porciones de MORT-1 ("cabeza" de MORT, aa l-117, "cola" de MORT, aa 130-245), el p55 IC (206-426 p55) o porción de la misma (el "dominio de unión", 326-426 p55; y otros aguas arriba del "dominio de unión" es decir 206-326). Los resultados son mostrados en la Tabla 2.

TABLA 2

3

Los resultados anteriores del ensayo de expresión de \beta-galactosidasa de doble híbrido de la unión del clon a un largo panel de cebos confirmó que la proteína codificada por este clon se une específicamente a los dominios de muerte tanto de la p55 TNF-R como de MORT-1.

En general, la proteína de unión a MORT-1 puede ser utilizada directamente para modular o mediar los efectos asociados a MORT-1 en las células, o, indirectamente, para modular o mediar el efecto del ligando de FAS-R sobre las células cuando este efecto es modulado o mediado por MORT-1. Lo mismo es cierto con respecto a otras proteínas intracelulares o dominios intracelulares de proteínas transmembranas, como se demuestra específicamente para la p55-TNF-R aquí.

Las proteínas de unión a MORT-1 incluyen aquellas que se unen específicamente a la proteína MORT-1 entera o las que se unen a diferentes regiones de la proteína MORT-1, por ejemplo, las regiones indicadas anteriormente N y C terminal de MORT-1. Las proteínas de unión a MORT-1 que se unen específicamente a tales regiones pueden ser usadas para modular la actividad de estas regiones y de ese modo la actividad específica de MORT-1 como se determina por estas regiones.

Ejemplo 3 Aislamiento y caracterización de la proteína MACH. Otra proteína de unión a MORT-1 (i) Cribado de doble híbrido, ensayo de b-galactosidasa de doble híbrido, secuenciación y análisis de secuencia

Usando el procedimiento expuesto en los Ejemplos 1 y 2, una construcción de longitud completa que codifica la proteína MORT-1 humana fue empleada como "cebo" en el sistema de doble híbrido de levadura para aislar un clon de cADN que codifica una nueva proteína de unión a MORT-1. Esta nueva proteína fue originalmente designada MORT-2, y ahora redesignada y referida como MACH (por homóloga de CED3 asociada a MORT-1), en virtud de sus características como se detallan aquí a continuación.

Este clon fue secuenciado mediante procedimientos estándar como se expuso en los Ejemplos 1 y 2 anteriores. Los análisis de secuencia mediante procedimientos estándar y programas computerizados (véase los Ejemplos 1 y 2) revelaron qu este cADN tiene una nueva secuencia y codifica una proteína nueva (ni el ADN ni las secuencias de aminoácidos fueron encontradas en las bases de datos de GENBANK o PROTEÍN BANK). Además, el cADN que codifica MACH reveló un marco de lectura abierta ORF-B qu tiene una fuerte homología con la región anterior (5' aguas arriba) el motivo de "dominio de muerte" de la proteína MORT-1 (véase el Ejemplo 1). En las Figs. 4A-C, la estructura de esa parte del clón de cADN de MACH que contiene el ORG-B (235 residuos de aminoácidos; Fig 4A); la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº:5) del ORF-B de MACH (Fig. 4B); y la secuencia nucleotídica (SEQ ID Nº 4) de la molécula de cADN de MACH (Fig. 4C) como se muestra. En la Fig 4A, la región rayada del ORF-B es la región que comparte alta homología con la región de MORT-1 aguas arriba del motivo del "dominio de muerte" de MORT-1, y esta región de homología ORF-B de MACH consiste en los residuos aminoacídicos subrayados en la Fig 4B.

El ensayo de doble híbrido de levadura fue aplicado adicionalmente para evaluar la especificidad de unión de MACH a MORT-1, en partircular, para definir la región en MORT-1 a la cual se une MACH, así como para determinar cual de las ORFs de MACH interactúa con MORT-1, siendo el procedimiento como se expone aquí anteriormente en los Ejemplos 1 y 2. Brevemente, diversas construcciones de MORT-1 y MACH fueron preparadas para ensayar la interacción de las proteínas codificadas por las construcciones del dominio de unión y activación al ADN Gal4 en las células de levadura SFY526 transfectadas como se evalúa mediante el ensayo del filtro de expresión de b-galactosidasa. Las construcciones del dominio de unión a ADN fueron preparadas en los vectores pGBT9 y las construcciones del dominio de activación fueron preparadas en los vectores pGAD-GM. Para las construcciones del dominio de activación, el cADN de MACH de longitud completa (MACH) fue usado, al igual que lo fue una construcción que codifica sólo la región ORF-B (MACH B). Las construcciones del dominio de activación testigo fueron aquellas que contenían la secuencia que codifica para MORT-1 completa (MORT-1, testigo positivo) y aquellas que no tienen insertos, es decir, vectores "vacíos" (pGAD -GM). Para las construcciones del dominio de unió al ADN, el cADN de MORT-1 de longitud completa fue usado (MORT-1), como lo fueron las construcciones que codifican sólo para la región aguas arriba de MORT-1 (MORT-1-IDD aa 130-245). Las construcciones del dominio de unión a ADN testigo, que fueron construidas para determinar también la especificidad de la unión a MACH, incluyendo las construcciones que codifican lámina (Lamin), los residuos 287-461 del dominio intracelular del p75 TNF-R humano (p75 IC humano), ciclina D (cyc D), SNF1, residuos 206-426 del dominio intracelular del p55 TNF-R humano (p75 IC humano), la región del "dominio de muerte" del dominio intracelular del Fas-R humano (Fas DD humano), residuos 216-277 del dominio intracelular del CD40 humano (CD40 IC humano), vectores sin inserto o vectores pGBT9 "vacíos" (pGBT9, testigo negativo), y una construcción que codifica la región ORF-B de MACH (MACH B). En el ensayo, el desarrollo de color fue determinado, en el que cuanto mayor fue el desarrollo del color, mayor era la interacción entre las construcciones codificadas por el dominio de unión a ADN y dominio de activación. El desarrollo del color fue descrito mediante símbolos, en los que "+++" y "+" indican el desarrollos de un color fuerte a los 30 y 90 min del ensayo respectivamente, y "- -"indican la falta de desarrollo de color a las 24 h del ensayo, En los casos en los que las interacciones no fueron ensayadas, no se indican ningún símbolo. Los resultados de las diversas interacciones para el caso anterior están expuestas en la Tabla 3, mientra que los resultados de las diversas interacciones de las isoformas MACH se describen en la Fig. 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

5

Así, como surge de las tablas mostradas en la Tabla 3 a continuación, está claro que:

(a)

MACH se une a MORT-1 en una manera muy fuerte y específica

(b)

El sitio de unión a MACH en MORT-1 tiene lugar antes (aguas arriba) del motivo del "dominio de muerte" en MORT-1, es decir, en la región de MORT-1 definida por aa 1-117 de MORT-1;

(c)

La región ORF-B de MACH es la región de la proteína MACH de interacción con MORT-1; y

(d)

La región ORF-B de MACH es capaz de autoasociación.

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(ii) Efectos citotóxicos celulares mediados por la capacidad de autoasociación de la proteína MACH

La observación de que MACH se puede autoasociar, en particular, que la región ORF-B de MACH se autoasocia y la correlación previa entre la autoasociación y la citotoxicidad celular como se observa para los dominios intracelulares de p55TNF-R y FAS-R, y como se observa para MORT-1 (véase Ejemplo 1), sugiere que la autoasociación de MACH puede también estar implicada en la citotoxicidad celular.

Para ensayar esta posibilidad, construcciones que codifican MACH fueron preparadas con un vector de expresión controlado por tetraciclina (para detalles véase el Ejemplo 1). Estas construcciones fueron usadas para transfectar células HeLa en las que los vectores fueron expresados de modo transitorio. A parte de las construcciones MACH, otras construcciones testigo fueron usadas para evaluar el efecto de la expresión transitoria en la viabilidad de las células HeLa para las que el efecto de las construcciones MACH podría ser comparado. Estas otras construcciones incluyen MORT-1, FAS-IC humano y luciferasa (Luc). Además, la cotransfección de las células HeLa fue también ensayada usando MORT-1 y construcciones de MACH para determinar los efectos que la interacción entre estos productos podría causar. Tras la transfección de las células HeLa fueron incubadas y la viabilidad celular fue evaluada 48 h tras la transfección bien en presencia o en ausencia de tetraciclina (1 ug/ml) para bloquear la expresión. La viabilidad celular fue determinada mediante el ensayo de ingesta de rojo neutro.

Los resultados son mostrados en la Fig. 6, que describe gráficamente el desencadenamiento independiente de ligando de los efectos citocidas en las células transfectadas con MACH en comparación con las células transfectadas con construcciones que codifican las otras proteínas así como las células cotransfectadas (MORT-1 + MACH). Los resultados son mostrados como la viabilidad celular en unidades de DO a 540 nm para cada construcción, en el que para cada construcción, una barra rayada indica incubación de células tras la transfección en ausencia de tetraciclina, y una barra rellena indica incubación de las células transfectadas en presencia de tetraciclina.

A partir de los resultados mostrados en la Fig. 6, es aparente que MACH induce un efecto citotóxico dramático en células HeLa, es decir, la sobreexpresión inducida de cADN de MACH en células HeLa, da como resultado un efecto citotóxico dramático. Este efecto citotóxico es probable que esté relacionado con la capacidad de autoasociación de MACH.

(iii) Análisis Northern

Usando procedimientos bien conocidos (véase el Ejemplo 1), los análisis Northern de diversas líneas celulares fueron llevados a cabo usando un cADN MACH como sonda. Los resultados de este análisis muestran que en un gran número de líneas celulares, en particular, las líneas celulares CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat y A673, existen dos transcritos hibridadores de aproximadamente 3,2 kb en tamaño.

En vista a lo anterior, la proteína MACH, particularmente la proteína MACHb1 (ORF-B de MACH) puede ser utilizada directamente para modular o mediar los efectos asociados con MORT-1 en las células, o indirectamente, para modular o mediar el efecto del ligando de FAS-R en las células cuando este efecto es modulado o mediado por MORT-1. El hecho que MACH se une específicamente a la región aguas arriba de MORT-1 y comparte homología con MORT-1 proporciona una manera específica en la que MACH o ORF-B de MACH puede ser usado para modular esta región específica de MORT-1 y por tanto la actividad específica de MORT-1 determinada por esta región aguas arriba. Además, MACH u ORF-B de MACH puede ser usada como un modulador o mediador de los efectos intracelulares en un modo análogo a la propia MORT-1 (véase anteriormente) en virtud de la capacidad de MACH de autoasociarse e inducir la citotoxicidad celular por su cuenta.

Análisis adicionales del la proteína MACH y las secuencias de ADN que la codifican han sido realizados como se expone aquí a continuación. Además, se reveló que el ORF-B de MACH no representa más que una de las isoformas de MACH. Por tanto, la proteína MACH y las secuencias de ADN que lo codifican han sido ahora renombrada, como será evidente a partir de lo siguiente.

(a) Cribado de doble híbrido para proteínas que se unen a MORT-1 revela una proteína nueva que comparte un motivo de secuencia con MORT-1

Como se mencionó anteriormente, para identificar proteínas que participan en la inducción de la muerte celular por MORT-1, la técnica de doble híbrido fue usada para cribar librerías de cADN para proteínas que se unen a MORT-1. Un cribado de doble híbrido de una librería de células B humanas (Durfee y otros, 1993) usando cADN de MORT-1 como cebo dio clones de cADN de MORT-1 misma, reflejando la capacidad de esta proteína para autoasociarse así como clones de TRADD, a los cuales MORT-1 se une eficazmente (véase el Ejemplo 2). El cribado también dio clones de cADN de una secuencia nueva cuyo producto se unió específicamente a MORT-1. La proteína que inicialmente fue llamada MACH, y luego, tras encontrarse que está presente en múltiples isoformas (véase a continuación) fue renombrada MACH b1, mostró también una capacidad para unirse en un ensayo de doble híbrido a sí misma, pero fue incapaz de unirse a FAS-R.

En la Fig 5, se muestran los resultados de la interacción de MORT-1 y MACH en las células de levaduras transfectadas. Brevemente, MORT-1 y MACH b1 y sus construcciones de deleción, así como MACHa1, un mutante de MACH a1 en el que la cisteína catalítica Cys_{360} es remplazada por Ser (MACHaI (C360S)) y el dominio intracelular del FAS-R (Fas-IC) humano; fueron expresados en la levadura SFY526 en construcciones del dominio de unión a ADN Gal4 y el dominio de activación (pGBT9 y pGAD-GH). Su interacción fue evaluada por un ensayo de filtro de expresión de \beta-galactosidasa como se describe en Boldin y otros (1995n). Los resultados están presente en términos del tiempo requerido para el desarrollo de un color fuerte. ND indica que el ensayo no fue hecho. Ninguno de los insertos examinados interaccionó con un número de testigos negativos ensayados, incluyendo los dominios intracelulares del receptor p55 TNF humano, receptor p75 TNF y CD40, y lámina, ciclina D y los vectores gal4 "vacíos". MACH \beta1 fue clonada mediante el cribado de doble híbrido de una librería de células B humanas marcadas con gal4-AD (Durfee y otros, 1993) para las proteínas que se unen a MORT-1, usando la cepa reportera de levadura HF7c. Excepto donde se indica lo contrario, todos los procedimientos experimentales para los hallazgos presentados son como se describieron anteriormente (véase también Holding y otros, 1995). Los análisis de deleción mostraron que MACH\beta1 se une a la parte N-terminal de MORT-1, que está implicada en la inducción de la muerte celular (Chinnaiyan y otros, 1995). MACH \beta1 también se autoasocia en la levadura transfectada. Sin embargo, no se unió a varias proteínas testigo y a diferencia de MORT-1 no fue capaz de unirse a FAS-R (Fig. 5). La expresión de las moléculas de MACH\beta1 en células de mamífero dieron una proteína de 34 kDa que se unió a las moléculas MORT-1 coexpresadas con ellas. También fue capaz de unirse a la proteína de fusión GST-MORT-1 in vitro.

La comparación de las secuencias de aminoácidos en MACH\beta1 y MORT-1 revelaron un motivo de secuencia compartido (designado "Módulo Mort") en estas dos proteínas, distintas del motivo de muerte a través del cual
MORT-1 se une a FAS-R. Este motivo está presente una vez en MORT-1 y dos veces en MACH\beta1. El mismo motivo se encuentra también en PEA-15, una fosfoproteína de astrocitos de función desconocida. Datos preliminares sugieren que el motivo MORT está implicado en la unión de MACH\beta1 (y de otras isoformas MACH) a MORT-1.

La Fig. 7A describe la secuencia de aminoácidos deducidas (SEQ ID Nº:5) de MACH\beta1. Los dos módulos MORT están recuadrados y los extremos C terminales de los dos mutantes de deleción MACH\beta1 empleados (Fig. 7) están indicados mediante asteriscos. La Fig. 7B muestra la homología de secuencia de los módulos en MACH\beta1 (designado MACH en la Fig 7 B), MORT-1 y el gen PEA-15 (número de acceso X86809). Residuos idénticos y similares están indicados mediante áreas recuadradas y sombreadas, respectivamente.

La Fig. 8 muestra una respresentación diagramático del dominio de muerte y los módulos MORT y de la región de homología CED3/ICE en Fas/APO1, MACH\beta1 y MACHa1.

La región en MORT-1 que contiene este "módulo" MORT ha demostrado tomar parte en la inducción de muerte celular por esta proteína (véase el Ejemplo 1 a continuación). Se ha demostrado también que contribuye a, aunque no es suficiente en, la autoasociación de MORT-1 (véase Ejemplo 1). Como se muestra en la Fig. 5, el análisis de las propiedades de unión de las construcciones de deleción de MACH\beta1 en levaduras transfectadas reveló una implicación similar de los módulos MORT en autoasociación de MACH\beta1, así como en su unión a MORT-1: las construcciones de deleción en la que la región debado (aguas abajo del módulo MORT) se ha perdido, fueron incapaces de unirse entre sí, aunque mantuvieron la capacidad para unirse a la MORT-1 de longitud completa y a la MACHb1 de longitud completa. Una truncación adicional en la que parte de la secuencia del módulo MORT fue también delecionada, dando como resultado la pérdida de la capacidad de unión de las proteínas. Para evaluar adicionalmente la implicaciónde los módulos MORT en estas interacciones, los mutantes de deleción de MACHb1, unidos con el octapéptido FLAG (FLAG-MACHb1), fueron expresadas en las células HeLa y evaluadas en lo que respecta a su unión in vitro a la proteína de fusión glutatión-S-transferasa-MORT-1 (GST-MORT-1) producida en bacterias. Como se muestra en las figuras 9A-C, de igual modo a la unión observada en el ensayo de doble híbrido de levadura, esta unión in vitro se encontró que depende de la interacción de la región en los módulos MACHb1. Las Figs. 9 A y 9 B mostraron los resultados (autoradiogramas) de la interacción in vitro de MACHb1 y sus mutantes de deleción con MORT-1. Brevemente, MACHb1 metabólicamente marcada con ^{35}[S], MACHb1 fusionada en su extremo N-terminal al octapéptido FLAG (FLAG-MACHb1), los mutantes de truncación en el C-terminal de FLAG-MACHb1, y, como testigo luciferasa, fueron producidos en células HeLa transfectadas. La expresión fue hecha usando un vector de expresión controlado por tetraciclina, en un clon de células HeLa (HtTA-1) que expresan un transactivador controlado por tetraciclina.

La Figura 9A muestra la evaluación de la expresión de las proteínas y sus tamaños moleculares mediante inmunoprecipitación a partir de lisados celulares, usando un anticuerpo anti-FLAG. Los anticuerpos usados son como se indica a continuación: antisueros de conejo anti MACHb1 y anti-MORT-1 fueron generados frente a las proteínas de fusión GST-MACHb1 Y GST-MORT1. Los anticuerpos monoclonales de ratón frente al octapéptido FLAG (M2) y frente a FAS/APO1(CH 11, Yonehara y otros, 1989) fueron adquiridos de Eastman Kodak y Oncor (Gaithersburg, MD) respectiva-mente. El anticuerpo monoclonal de ratón anti epítopo -HA (12CA5, Field y otros, 1988) y el anticuerpo anti-TNF fueron producidos en el laboratorio de los solicitantes según los métodos normales bien conocidos en la técnica. La Fig. 9B muestra una unión por afinidad de las proteínas a GST-MORT-1, adsorbidas a bolas de glutation-agarosa (o, como un testigo, a GST o GST-unidas al dominio intracelular de Fas-APO1). La Fig. 9C muestra los resultados de las inmunoprecipitaciones de las diversas construcciones de fusión MORT-1 y MACH usando los diversos anticuerpos específicos.

(b) MACH está presente en múltiples isoformas

Análisis Northern usando cADN de MACHb1 como una sonda reveló transcrito(s) de aproximadamente 3 kb en tamaño en varias líneas celulares diferentes. Brevemente, los análisis de transferencia Northern de ARN total (14 mg/carril) o ARN poli A^{+} (2 mg) de varias líneas celulares, usando cADN MACHb1 como sonda fueron realizados. Las líneas celulares examinadas, T47D, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat y A673, son todas de origen humano y fueron derivadas a partir de carcinoma ductal de mama, de leucemia de células T linfoblástica aguda, un linfoma de Burkitt, un linfoma de Burkitt, un carcinoma epiteloide, un hematoma humano, una leucemia aguda de células T y un rabdomiosarcoma, respectivamente. La forma más bien difusa de la banda que hibrida en las transferencias Northern sugirió que estos transcritos son de tamaños homogéneos que oscilan entre 2,85 y 3,5 Kb. Tanto las cantidades como los tamaños de los transcritos varió entre diferentes tejidos humanos y no estuvieron correlacionados con la expresión de MORT-1 (Chinnaiyan y otros, 1995) o de FAS/APO1 (Watanabe y otros, 1992). Sondas de cADN fueron radiomarcadas con el kit de cebadores aleatorios (random-prime) (Boehringer Mannheim) y aplicado para su análisis de transferencias de múltiples tejidos humanos (Clontech) según las instrucciones del fabricante. En testículo y músculo esquelético, por ejemplo, los transcritos fueron apenas detectados, aún cuando estos tejidos expresan cantidades significativas de MORT-1. Por el contrario, leucocitos mononucleares de sangre periférica, en el que la expresión de MORT1 es muy baja, fueron encontrados que expresan MACH a niveles elevados. La activación de lectina de los leucocitos resulta en un cambio notable en el patrón de tamaños de los transcritos MACH, junto con una inducción de MORT-1.

Explorar la naturaleza de esta heterogeneidad de tamaños, librerías de cADN fueron cribadas en busca de transcritos que hibriden con la sonda de cADN MACHb1. MACHb1 y MACHb2 fueron clonadas de una librería de cADN de Charon BS derivada a partir del mARN del timo humano. La librería fue cribada en condiciones rigurosas con una sonda de cADN MACHb1, marcada usando un kit de cebadores al azar (Boehringer Mannheim). Las otras isoformas MACH fueron clonadas por RT-PCR, a partir de ARN total de células linfoblastoides humanas Raji (MACH a1, a2, a3, \beta3, \beta4 y \beta5) y Daudi (MACHa2, \beta2, \beta3, \beta4, y \beta5). La reacción por transcriptasa inversa fue realizada con un cebador oligo-dT adaptador (5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)17-3'; SEQ ID Nº: 26) y la transcriptasa inversa SuperScript II (GIBCO-BRL), usada según las instrucciones del fabricante. La primera ronda de PCR fue realizada con Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim) usando los siguientes cebadores homosentido y antisentido: 5'-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3', correspondiendo a los nucleótidos 530-551 del cADN de MACH\beta1 (SEQ ID Nº: 4), y 5'-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3' (SEQ ID Nº: 27), respectivamente. La segunda ronda fue realizada con polimerasa Vent (NEB) usando los siguientes cebadores anidados homosentido y antisentido: 5' GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3' (SEQ ID Nº: 28) y 5'-GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3'; (correspondiendo a los nucleótidos 962-939 de la SEQ ID Nº: 4) de cADN de MACH\beta1, respectivamente. Para confirmar que MACH\beta3 y MACH\beta4 tienen codones de iniciación, una secuencia 5' más de estas isoformas del ARN de las células Raji fue clonado. La reacción de PCR, realizada usando el cebador olido-dT adaptador como se describe anteriormente, fue seguido por dos rondas de PCR (con polimerasa Vent (NEB)) usando los siguientes oligonucleótidos homosentido y antisentido: 5'-TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3' (SEQ ID Nº: 29) y 5'-ATTCTCAAACCCTGCATCCAAGTG-3'(correspondiendo a los nucleótidos 946-923 de la SEQ ID Nº: 4) en MACH\beta1. El último oligonucleótido es específico para las isoformas \beta. Entre los clones obtenidos de esta manera, aquellos que se encontró que contenían los nucleótidos que codifican para los aminoácidos del "bloque 2" (cuya presencia distingue MACH\beta3 y MACH\beta4 de MACH\beta1 y MACH\beta2 como se trata a continuación) fueron completamente secuenciados. Las secuencias de nucleótidos en todas las isoformas clonadas fueron determinadas en ambas direcciones mediante el método de terminación de cadena didesoxi. Sólo clones de cADN parciales de MACH\alpha3 y MACH\beta2 fueron obtenidos. Este cribado reveló la existencia de múltiples isoformas de MACH. Las secuencia aminoacídicas de ocho de estas isoformas fueron estudiadas en detalle. Los resultados son ilustrados diagramaticalmente en la Fig. 12 y ejemplificados en la Fig. 13 en las que las secuencias aminoacídicas de tres de las isoformas son comparadas con homólogos conocidos.

La Fig. 10 muestra una representación diagramática de las diversas isoformas MACH. Las regiones codificantes están representadas mediante áreas recuadradas. Los diversos dominios en las regiones codificantes son indicados mediante diferentes sombreados como se indica a continuación: los módulos MORT-1;

(\trama)

los tres bloques de secuencias de aminoácidos que están presentes en diferentes combinaciones en las isoformas. Las posiciones de los residuos en la región de homología CED3/ICE implicada en la actividad catalítica de ICE basada en su estructura cristalina por rayos X como se muestra. El residuo de cisteína catalítica está también indicado por una estrella (*). Estas partes de la secuencia de nucleótidos MACHa1 que faltan en las secuencias de otras isoformas están indicadas en los diagramas de las últimas isoformas mediante líneas conectoras en forma de V. Las longitudes de estas regiones de cADN, que probablemente corresponden a distintos exones, están indicadas por debajo del diagrama de MACH\alpha1. La falta de 65 nucleótidos que en MACH\alpha1 codifican el "bloque 2" causan la alteración en MACH\beta1 y MACH\beta2 del marco de lectura de los nucleótidos que codifican el "bloque 3". En estas isoformas, por lo tanto, estos nucleótidos codifican otros aminoácidos que juntos constituyen su región C-terminal única. Por otro lado, en MACH\beta3 y MACH\beta4 el marco de lectura del bloque 3 es mantenido, pero su ausencia de los nucleótidos que codifican la región CED3/ICED y partir de la región 3' no codificante resulta en la alteración del marco de lectura de los nucleótidos aguas mas abajo. Debido a esta alteración, la parte más 5' de esta región aguas abajo no codificante no codifica 10 aminoácidos, que constituyen la región C terminal única de estas dos isoformas (Aes rayadas indicadas en la figura, solo clones de cADN parciales de MACH\alpha3 y MACH\beta2 fueron obtenidos.

Las isoformas fueron clonadas a partir de una librería de cADN de células B humanas (MACH\beta1), a partir de librerías de cADN de timo humanas (MACH\alpha1 y \alpha2) y a partir del mARN de las células linfoblastoides humanas Raji (MACH2\alpha1, \alpha2, \alpha3, \beta3, \beta4, y \beta5) y Daudi (MACH\alpha2, \beta2, \beta3, \beta4, y \beta5). El clonaje del mARN de las células Raji y Daui fue hecho mediante RT-PCR, usando oligonucleótidos correspondientes a una región 3' no codificante y a una secuencia dentro del segundo módulo MORT en MACH\beta1. El codon de iniciación de clones aislados de ese modo es por tanto localizado dentro del segundo módulo MORT. La secuencia de cADN y la secuencia aminoacídica de las isoformas MACH son presentadas en el listado de secuencias e identificadas como sigue en la Tabla 4.

TABLA 4

6

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Las secuencias en las diferentes isoformas se relacionan entre sí como sigue: (a) todas las isoformas MACH comparten una región N-terminal común de 182-aminoácidos que comprenden los módulos MORT, aunque varía en los extremos carboxilo terminales (3' aguas abajo) de estos módulos, así como en las regiones no codificantes. (b) en base a sus secuencias C terminales, las isoformas caen en dos subgrupos: cuatro isoformas definidas como subgrupo b, tienen diferentes extremos C terminales debido a la alteración en el marco de lectura. Dos (MACHb1 y b2) comparten el extremo C-terminal encontrado en la isoforma inicialmente clonada en el cribado de doble híbrido y dos (MACHb y b4) comparten un extremo C-terminal diferente; tres isoformas, definidas como subgrupo a, tienen una regíon C-terminal mucho más larga que se asemeja mucho a las proteasas de la familia CED3/ICE (véase a continuación); (c) las regiones que se extienden entre la región del módulo MORT y la región C terminal que define los subgrupos varió de una isoformas a otra. Sin embargo, un examen cuidadoso mostró que estas regiones intermedias consisten en diferentes combinaciones de los tres bloques de secuencias aminoacídicas (bloques 1, 2 y 3). Las variaciones de secuencias de aminoácidos entre los diferentes clones reflejan dos tipos de variaciones en la secuencia de nucleótidos que muy probablemente están presentes mediante corte y empalme alternativo: (a) inserción o ausencia de cualquier de las dos secuencia nucleotídicas, una de 45 nucleótidos (nts) y la otra de 65 nts, o de ambas por debajo de los nucleótidos que codifican Lys 184; (b) presencia de un inserto adicional dentro de la región qu en MACHb1 constituye la parte 3' no codificante. Esta variaciones afectan tanto al marco de lectura abierto como a la longitud de la proteína.

Parte de las isoformas MACH abarcan un homólogo CED3/ICE. Una búsqueda en bases de datos reveló que la región C terminal de las isoformas MACH incluye el bloque 3 y la secuencia que se extiende aguas abajo de ella, se asemeja mucho a proteasas de la familia de CED3/ICE. La Fig. 11 presenta la comparación de secuencias de esta región en MACH y los diversos miembros humanos conocidos de esta familia así como la proteína ced3 de Caenorhabditis elegans. CED3 (Ellis y Horvitz, 1986; Yuan y otros 1993) y las proteasas humanas conocidas de la familia de proteasas CED3/ICE; CPP32 (Fernandez-Alnemri y otros, 1994), también llamada apopaina (Nicholson y otros, 1995) y Yama (Tewari y otros, 1995n), Mch2a (Fernández-Alnemri y otros, 1995), Ich-1 (Wang y otros, 1994; el homólogo humano de la proteína Nedd2, Kumar y otros, 1994), ICE_{rcl}, II (Munday y otros, 1995), ICE_{rcl}, II (Munday y otros 1995), también llamada TX e Ich-2 (Faucheu y otros, 1995; Kamens y otros, 1995), e ICE (Thornberry y otros, 1992; Cerretti y otros, 1992). La Fig. 11 describe esquemáticamente el alineamiento de secuencias aminoacídicas colineal de las isoformas MACH y los diversos miembros de la familia de proteasas CED/ICE. Se muestran las secuencias de aminoácidos de MACH\alpha1, MACHb1, MACHb3 así como la de la proteasa de Caenorhabditis elegans CED3, y de la conocida proteasa humana de la familia de proteasas CED3/ICE.

La región C-terminal arriba indicada de MACH se asemeja mucho a CPP32 (con un 41% de identidad y 62% de homología) y CED3 (con un 34% de identidad y 56% de homología). Muestra una similitud significativamente menor a ICE (con un 28% de identidad y 50% de homología) y a sus homólogos ICE_{rel}II próximamente relacionados (también llamados TX e Ich2) e ICE_{rel}III. La similitud fue observada a traves de casi toda la región comenzando desde la Tyr226 en el bloque 3, hasta el extremo C-terminal de las isoformas MACH\alpha.

Dos puntos de similitud son particularmente notables:

(a) todas las proteasas conocidas de la familia CED3/ICE de proteínas de corte en los sitios definidos por la presencia de un Asp en la posición P1 y un residuos aminoacídico hidrofóbico pequeño en la posición P1. Su especificidad difiere, sin embargo, en lo que respecta a otras características estructurales del sustrato, incluyendo la naturaleza de los residuos en las posiciones P2-P4. Consecuentemente, los residuos del sitio activo implicados en catálisis (correspondiente a His237, Gly238 y Cys285 en ICE) y en el boslillo de unión para la cadena lateral carboxilato del Asp P1 (Arg179, Gln283, Arg 341 y probablemente también Ser347) están conservados entre estas proteasas. Como se muestra en la Fig. 11, estos residuos (marcados por el sombreado de los residuos y por círculos rellenos o vacíos debajo de las secuencias) están también conservados en MACH\alpha1. Hay una excepción, aunque, un cambio conservativo de Ser a Thr en el sitio correspondiente a Ser347 de ICE. Otra ligera, pero potencialmente importante, diferencia de secuencia entre las isoformas MACH\alpha y otros miembros de la familia de proteasas es un remplazamiento Arg por Gln del residuo correspondiente a Arg286 de ICE. Este residuo, que es adyacente al residuos de cisteína catalítico putaivo, está completamente conservado en todos los otros miembros de la familia CED3/ICE. También parte de los residuos en los sitios situados cerca de los residuos P2-P4 del sustrato (marcados por triángulos por debajo de las secuencias en la Fig. 11) difieren en las isofofrmas MACH\alpha a partir de estos encontrados en otros miembros de la familia CED3/ICE.

(b) Proteasas de la familia CED3/ICE contienen sitios de autocorte. Se conoce ciertamente que varias de las proteasas son autoprocesadas, y dependen de este procesamiento para mostrar la actividad catalítica máxima. Su forma completamente bioactiva está compuesta de dos productos de corte asociados de modo no covalente, que difieren en tamaño (p20 y p17 en ICE; p17 y p12 en CPP32, como se indica mediante flechas en la Fig. 11) la presencia de sitios potenciales de autocorte en otros miembros de la familia sugiere que están sujetos a un procesamiento similar, y , de igual modo, dependen en este procesamiento para exhibir la actividad máxima. Tales sitos potenciales de autocorte están presentes en MACH\alpha1 casi en las mismas posiciones como en CPP32 (véase los recuadros sombreados en la Fig. 11). El sitio correspondiente al extremo de la subunidad p17 de CPP32 está situado en el segundo bloque de aminoácidos conservado, justo unos pocos aminoácidos aguas arriba del extremo N terminal de la región de homología CED3/ICE (por debajo de Asp 216). El sitio correspondiente al punto de corte entre las dos subunidades de CPP32 está situado, como en los otros miembros de la familia CED3/ICE que se conoce que están cortados, unos pocos aminoácidos aguas abajo del residos de cisteína catalítica (debajo de Asp 374). Esta conservación sugiere que la región de homología CED3/ICE en MACH1 está sometida al procesamiento proteolítico. Los tamaños de los dos productos esperados de este corte están muy próximos a los de las dos subunidades de la molécula CPP32 procesada.

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(c) La región de homología CED3/ICE en MACH tiene actividad proteolíca

Para descubrir si la región de homología CED3/ICE en MACH\alpha posee actividad proteolítica, los solicitantes expresaron la región que se extiende desde el sitio de corte potencial aguas arriba de esta región, entre Asp 216 y Ser 217, hasta el extremo C terminal de la proteína en bacterias, como una proteína de fusión. Los lisados bacterianos fueron examinados en lo que respecta a su capacidad para cortar los sustratos peptídicos fluorogénicos, mostrados antes del corte por otros homólogos CED3/ICE. Dos sustratos peptídicos fueron usados: el primero, acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-Metil-Cumaril-7-amida)(AC-DEVD-AMC), corresponde a una secuencia de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), una proteína nuclear encontrada que se corta en las células poco después de la estimulación con FAS-R (Tewari y otros, 1995b), así como en otros procesos apoptóticos (Kaufmann, 1989; Kaufmann y otros, 1993; Lazebnik y otros, 1994). Este sustrato fluorogénico está cortado de modo eficaz por CPP32. El segundo sustrato fluorogénico, Acetil-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC (Ac-YVAD-AMC), corresponde a un sitio de sustrato para ICE en el precursor de IL-1b. Este sustrato fluorogénico es cortado por ICE. Como se muestra en las Figs. 12A-F y 13A-B, lisados de bacteria que expresan la región de homología CED3/ICE en MACHa1 cortó de modo eficaz el sustrato fluorogénico derivado de la secuencia PARP. No tuvieron ninguna actividad proteolítica medible, sin embargo, frente al sustrato fluorogénico derivado de la secuencia precursora IL-1B (testigos), Ac-YVAD-AMC, que es un sitio de corte ICE en el precursos IL-1b (Thornberry y otros, 1992). La actividad proteolítica fue bloqueada mediante ácido yodoacético (5 mM), confirmando que está mediada por una tiol proteasa. No se observó ningún corte con lisados que contenían la región de homología CED3/ICE de MACH unida a GST en el que el residuo Cys360 de la cisteína catalítica fue remplazado por Ser. También, los lisados de las bacterias que expresaron la proteína MACH\alpha1 completa como una proteína de fusión GST no cortaron Ac-DEVD-AMC, probablemente debido a la ausencia de enzimas bacterianas capaces de procesar la molécula completa. Ni tuvo lugar un corte con los lisados que contenían cualquiera de los dos productos de corte potenciales de la región de homología CED3/ICE.

Las Figs. 12A-F y 13A muestran las cinéticas de corte del sustrato fluorogénico derivado de la secuencia PARP, Ac-DEVD-AMC 50 um), por extractos de E. coli que expresan una proteína de fusión GST de la región de homología CED3/ICE en MACH\alpha1 (Ser 217 a través del extremo C terminal de la proteína) comparado con la falta de corte mediante extractos de bacterias que expresan las proteínas de fusión a GST de la molécula de MACH\alpha1 completa o de cualquier de los dos producto proteolíticos potenciales de la región de homología CED3/ICE (Ser 217 hasta Asp 374 y desde Asp 374 hasta el extremo C-terminal de la proteína).

También muestra la dependencia de la concentración de sustrato del corte de Ac-DEVD-AMC, incubada durante 180 min. Con extractos de bacterias expresando la región de homología CED3/ICE MACH\alpha1 en fusión con GST (véase la Fig. 13 B). No se observó ningún corte en presencia de ácido yodoacético (5 mM). Los extractos no tuvieron actividad en Ac-YVAD-AMC, un sustrato fluorogénico correspondiente al sitio de sustrato para ICE en el precursor IL-1b.

Brevemente, las proteínas de fusión GST fueron producidas en bacterias XL1-blue usando el vector de expresión pGEX3. Las bacterias fueron lisadas mediante sonicación en un tampón que contenía 25 mM HEPES (pH 7,5), 0,1% 3-[3-colamido propil)dimetil-amino]-1-propanosulfonato, 5 mM EDTA y 2 mM DDT, seguido por centrifugación a 16.000X g durante 10 min. El análisis por SDS-PAGE confirmó la presencia de niveles similares de las diversas proteínas de fusión en los lisados (no mostrado). Alícuotas de 50 \mul de los extractos (4 mg/ml de proteína total) fueron incubados a temperatura ambient durante los períodos indicados en un volumen de reacción total de 500 \mul con los sustratos fluorogénicos, a las concentraciones indicadas. La liberación de AMD fue medida mediante expectrofluorometría a una longitud de onda de excitación de 380 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. La concentración de AMC fue determinada a partir de una curva de patrones. Ambos péptidos sustratos fluorogénicos fueron obtenidos de Peptide Institute Inc. (Osaka, Japón). Otras proteasas CED3/ICE demostraron que exhibían una actividad completa sólo tras el procesamiento proteolítico, que tiene lugar bien por auto corte, o vía su corte por otras proteasas (revisado en Kumar, 1995; Henkart, 1996). La observación de los solicitantes de que los lisados de bacterias que expresan moléculas GST-MACH\alpha1 no poseen actividad enzimática, a diferencia de la actividad observada en lisados de bacterias que expresan la región de homología CED3/ICE, sugiriendo que el procesamiento es también requerido para la actividad MACHa. La manera en que el procesamiento de MACH tiene lugar dentro de las células de mamíferos, y como este procesamiento es provocado por el desencadenamiento de FAS-R o p55-R, no se conoce. MORT-1 se ha demostrado que se une en las células a FAS-R activado junto con algunas otras proteínas (Kischkel y otros, 1995). Estas proteínas es probable que incluyan MACH\alpha1 y otras isoformas MACH. Parece posible que la unión de MORT-1 en asociación con MACH\alpha a FAS-R una varias moléculas MACH juntas, o incluya cambios conformacionales en ellas, y que estos cambios desencadenen bien el procesamiento porteolítico de MACH\alpha o hagan MACH\alpha susceptible de corte por otras proteasas. La estimulación de p55-R puede desencadenar el autoprocesamiento de MACH\alpha en una manera similar, aunque menos directa, juntando varias moléculas TRADD, o induciendo un cambio conformacional en ellas, que a su vez inducen un cambio en la formación o estado de agregación de MORT-1 y su molécula MACH asociada.

La especificidad de sustrato de MACH\alpha parece estar más bien "orientada a la muerte". Aunque podría cortar un péptido sustrato correspondiente a un sitio de corte en el sustrato de muerte PARP (Ac-DEVD-AMC), MACH\alpha no mostró ninguna actividad proteolítica hacia un péptido correspondiente al sitio de procesamiento del precursor IL-1\beta por ICE (Ac-YVAD-AMC). La identificación de las proteínas celulares que sirven como sustrato para el corte por MACH\alpha elucidarán los eventos aguas más abajo en la inducción de muerte por esta proteasa. Sustratos probables para el corte de MACH\alpha son otros miembros de la familia CED3/ICE, como CPP32 e ICE. Algunas de estas proteasas son ciertamente procesadas tras el desencadenamiento del receptor FAS-R o TNF (Miura y otros, 1995; Schlegel y otros, 1996; Chinnaiyan y otros, 1996). Tal vez proteasas que no pertenecen a la familia CED3/ICE puedan también activarse por MACH\alpha, bien directamente o a través de la acción de otras proteasas CED3/ICE. La implicación de múltiples proteasas en el proceso de muerte celular es consistente con la capacidad documentada de los inhibidores de diversas proteasas, incluyendo inhibidores de las serín proteasas y un inhibidor del corte por ICE así como el cADN antisentido de ICE, para proteger las células de la toxicidad inducida por el receptor FAS-R y TNF (Weitzen y Granger, 1980; Ruggiero y otros, 1987; Enari y otros, 1995; Los y otros, 1995).

Una variedad de otras enzimas, incluyendo fosfolipasas, esfingomielinasas y proteína quinasas, pueden participar en la inducción de muerte celular por los receptores de TNF y FAS-R (véase Eischen y otros, 1994; Vandenabeele y otros, 1995; Cifone y otros, 1995 y referencias quí). Algunas de estas enzimas pueden activarse por el corte proteolítico iniciado por MACH\alpha. También parece posible, sien embargo, que al menos parte de estas otras actividades relacionadas con la muerte celular están estimuladas por distintas rutas de señalización, independientemente de la estimulación de MACH\alpha. La implicación de más de una cascada de señalización en la inducción de la muerte celular, algunas comunes a p55-R y Fas/APO1 y algunas inducidas sólo por una de ellas, sería consistente con los documentos sobre las características tanto compartidas como únicas de los procesos de muerte celular inducida por los dos receptores (Grell y otros, 1994; Schulze-Osthoff y otros, 1994; Wong y Goeddel, 1994; Clement y Stamenkovic, 1994).

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(d) MACHa1 se une a MORT1 así como a MACHb1

Para descubrir si MACH\alpha1 se puede unir a MORT1, como lo hace MACH\beta1, la interacción de las proteínas con las levaduras transfectadas fue examinada por primera vez. MACH\alpha1 pareció tener un efecto citotóxico significativo en las levaduras. Este efecto que se manifestó en una disminución marcada en el número de colonias en levaduras que expresaron la proteína en el vector del dominio de activación (AD) (cuyo nivel de expresión es mayor que el del vector del dominio de unión a ADN (DBD)). Por otro lado, MACH\beta1 en el que el residuo de cisteína catalítica, Cys360, remplazado con Ser (MACH\alpha1 (C360S)) no fue citotóxico para ninguna célula de mamífero (véase a continuación), o levadura. Al igual que MACH\beta1, MACH\alpha1 (C360S) unida en levaduras transfectadas a MORT1 y también a sí mismo. También se unió a MACH\beta1. También, las levaduras que expresan el MACH\alpha1 salvaje junto con MORT-1 o MACH\beta1 exhibieron interacción de las proteínas transfectadas. La intensidad del color del producto lacZ varió, sin embargo, entre las colonias de levaduras; en levaduras transfectadas con MACH\alpha1 tanto en los vectores AD como BD no se observó ningún producto coloreado, probablemente debido al efecto citotóxico del MACH\alpha1 salvaje. Aún así, pese a esta variación, las levaduras que expresan MACH\alpha1 bien con combinación con MORT1 o en combinación con MACH\beta1 fueron claramente positivas para la interacción de las proteínas transfectadas. A diferencia de MACH\beta1, MACH\alpha1 no exhibió una autointeracción en el ensayo de doble híbrido (Fig. 5).

Tanto MACH\alpha1 (C360S) como MACH\beta1 coinmunoprecipitaron con MORT-1 a partir de lisados de células embrionarias humanas 293-EBNA, indicando que se unen a MORT1 también en células de mamífero. Para ensayar adicionalmente si MACH\alpha1 puede unirse a MORT1 también dentro de células de mamíferos, MACH\alpha1 o MACH\beta2, unidas con el octapéptido FLAG fueron expresadas junto con las moléculas MORT1 marcadas con el epítopo HA. MACH\alpha1 y MACH\beta1 metabólicamente ^{35}[S] unidas a sus extremos N-terminales al octapéptido FLAG (FLAG-MACH\alpha1 y \beta1), y MORT1 unido por su extremo N terminal al epítopo HA (Field y otros, 1988) fueron expresadas en células HeLa. La inmunoprecipitación de las proteínas a partir de los lisados de las células fue realizada usando anticuerpos monoclonaeles frente al octapéptido FLAG (M2; Eastman Kodak), epítopo HA (12CA5, Field y otros, 1988) o el receptor p75 TNF (Nº 9, Bigda y otros, 1994) como testigo. Las proteínas fueron analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (12% acrilamida) seguido por autoradiografía. Tanto MACH\alpha1 como MACH\beta2 coinmunoprecipitaron con MORT1 a partir de lisados de las células, indicando que se unen a MORT1. La eficacia de interacción de MACH\alpha1 con MORT1 pareció ser menor que la de MACH\beta1.

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(e) Moléculas MACH que contienen la región de homología CED3/ICE pueden mediar la muerte celular

Para explorar la implicación de MACH en la inducción de muerte celular, el efecto de la sobreexpresión de diversas isoformas MACH en la viabilidad celular fue examinada. El ensayo fue realizado transfectando vectores de expresión de MACH junto con el vector de expresión de \beta-galactosidasa como un marcador de transfección en células de riñón embrionarias humanas 293-EBNA y células de carcinoma de mama MCF7.

Brevemente, células 293-EBNA, células de carcinoma de mama humanas MCF7 y células HeLa HtTA-1 fueron hechas crecer en medio esencial mínimo de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero de ternera fetal, aminoácidos no esenciales, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml estreptomicina. Placas de cultivo de tejido celular (5 x 10^{5} de células 293-EBNA, 3 x 10^{5} de células MCF7 o 3 x 10^{5} células HeLa en placas de 6 cm) fueron transfectadas de modo transitorio, usando el método de precipitación por fosfato cálcico, con los cADNs de las proteínas indicadas junto con el vector de expresión de \beta-galactosidasa. En los experimentos presentado en las Figs. 14a-d y 15, cada placa fue transfectada con 3,5 mg de la construcción de MACH indicada y 1,5 \mug de pSV-\beta-gal. En los experimentos presentado en las Figuras 16A-D y 17-19, cada placa fue transfectada con 2,5 \mug de la construcción MACH o MORT1 indicadan (o como testigo, vector vacío) y 1,5 ug de pSV-\beta-gal. Las células fueron lavadas de 6 a 10 h tras la transfección. Las células 293-EBNA y MCF7 fueron incubadas durante unas 18 h adicionales sin tratamiento adicional. Las células HeLa fueron incubadas durante 26 h tras la transfección y luego durante 5 h en presencia de bien un anticuerpo anti-Fas APO1 (CH11, 9,5 ug/ml) o bien TNF (100 ng/ml), junto con cicloheximida (10 ug/ml). La extensión de la muerte celular al final de los períodos de incubación fue evaluada mediante la determinación de la expresión de \beta-galactosidasa, como se describe por Kumar y otros, 1994.

Cultivos transfectados con un vector de expresión de bien MACH\alpha1 o MACH\alpha2 exhibieron una muerte celular masiva, manifestada por redondeamiento celular, vesiculación, contracción, y finalmente separación de las células de la placa (Fig. 14B). A las 20 h tras la transfección, la mayoría de las células transfectadas, identificadas por la tinción de \beta-galactosidasa (X-Gal), mostraron una morfología condensada típica de apoptosis (Figura 14B). Por el contrario, las células que expresan el vector vacío permanecieron viables.

En particular, las Figs. 14A-D muestran la morfología de las células de riñón embrionarias humanas 293-EBNA que expresan de modo transitorio las isoformas MACH indicadas. Las flechas (Fig 14B) indican las células apoptóticas. Las fotografías fueron tomadas 26 h tras la transfección. La Fig. 15 muestra la cuantificación de muerte inducida por MACH de las células 293-EBNA (recuadros de bandas) y MCF7 (recuadros negros) mediante la determinación de la porción de las células que expresan \beta-galactosidasas que exhiben morfología apoptótica 20 h tras la transfección de las construcciones indicadas. Los datos son a partir de tres experimentos independientes con las células 293-EBNA y dos experimentos independientes con las células MCF7. se expresan como el porcentaje medio de las células azules que exhiben signos de apoptosis como una fracción del número total de células azules contadas (alrededor de 500 células por muestra).

Para examinar la implicación de la región de homología CED3/ICE dentro de las isoformas MACH\alpha en sus efectos apoptóticos, las células fueron transfectadas con el vector de expresión para la isoforma MACH\beta1, que carece de la región de homología CED3/ICE, así como con los vectores de expresión para MACH\alpha3, que carece de una parte N-terminal de la región, y con vectores de expresión para MACH\alpha1 (C360S) y para el mutante truncado en el extremo C terminal de MACH\alpha1 (MACH\alpha1 (1-415)), que carece de uno de los residuos que se cree que son críticos para la función de la proteasa CED3/ICE (correspondiente a Ser 347 en ICE). No tuvo lugar ninguna muerte (más allá de la ligera cantidad observada en las células transfectadas con un vector de expresión vacio) presente en las células 293-EBNA o MCF7 transfectadas con los vectores de expresión para MACH\alpha3, MACH\alpha1 (1-415) o MACH\alpha1 (C360S). Por otro lado, las células tranfectadas con MACH\alpha1 junto con estos vectores también exhibieron muy poca muerte celular, indicando que las moléculas MACH que contienen una región CED3/ICE incompleta tiene un efecto dominante negativo en la actividad de las moléculas salvajes. Los cultivos que expresan MACH\beta1, que no contiene la región CED3/ICE en absoluto, exhibieron alguna ligera muerte celular (Figura 15). Este efecto de MACH\beta1, que más probablemente resulta de la activación de las moléculas MACH\alpha1 endógenas, fue por alguna razón más pronunciado en las células HeLa. Por otro lado, en las células HeLa MACH\alpha3, MACH\alpha1 (1-415) y MACH\alpha1 (C360S) fue también algo citotóxico (Figura 19).

La Figura 8 presenta diagramáticamente la interacción del receptor y la proteína diana que participan en la inducción de muerte celular por FAS/APO1 (FAS-R) y p55-R. La actividad parece constituir la etapa enzimática más aguas arriba en la cascada de señalización para los efectos citocidas de FAS/APO1 y p55-R. La capacidad de MACH\beta1 para unirse tanto a MORT-1 como a MACH\alpha1 sugieren que esta isoforma potencia la actividad de las isoformas enzimáticameente activas.

Es posible que algunas de las isoformas tengan funciones adicionales. La capacidad de MACH \beta2 para unirse tanto a MORT-1 como a MACH\alpha1 sugieren que esta isoforma puede potenciar la actividad de las isoforma enzimática-mente activas. La citotoxicidad moderada observada en cultivos de 293-EBNA y MCF7 transfectados con esta isoforma y el efecto citotóxico bastante significativo que ejerce en células HeLa probablemente refleja la activación de las moléculas MACH\alpha expresadas tras la unión a las moléculas MACH\beta1 transfectadas. Posiblemente, algunas de las isoformas MACH podrían también actuar como sitios de anclaje para moléculas que están implicadas en otros efectos no citotóxicos de receptores Fas/APO1 y TNF.

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(f) El bloqueo de la función MACHa interfiere con la inducción de muerte celular por Fas/APO1 y p55-R

Para evaluar la contribución de MACH\alpha a la citotoxicidad de Fas/APO1 (FAS-R) y p55-R, MACH\alpha3, así como los mutantes MACH\alpha1 no funcionales, MACH\alpha1 (1-415) y MACH\alpha (C360S), fueron expresadas en células que fueron inducidas para exhibir esta citotoxicidad. La citotoxicidad inducida por p55-R fue disparada en las células 293-EBNA mediante la sobreexpresión transitoria de este receptor (Boldin y otros, 1995a), y la citotixicidad de Fas/APO por sobre expresión de las moléculas quiméricas compuestas del dominio extracelular del p55-R y los dominios transmembrana e intracelulares de Fas/APO1. Por alguna razón, esta quimera tiene un efecto citotóxico mucho mayor que el del Fas/APO1 normal. Las actividades citotóxicas en las células HeLa fue también inducida tratándolas con anticuerpos anti TNF o anti Fas/APO1 en presencia del bloqueante de la síntesis proteica cicloheximida. Las células HeLa fueron hechas sensibles a Fas/APO1 mediante la expresión transitoria de este receptor. En todos los sistemas examinados, MACH\alpha3 y los mutantes MACH\alpha1 no funcionales demostraron una protección eficaz frente a la citotoxicidad inducida por el desencadenamiento de Fas/APO1 o p55-R (Figuras 16-19). Tal protección fue también observada, como se describió previamente (Hsu y otros, 1996; Chinnaiyan y otros, 1996), en células transfectadas con un mutante de deleción N-terminal de MORT1 que carece de la región de unión a MACH (MORT1 (92-208)). Estos efectos protectores indican que MACH\alpha es un componente necesario de las cascadas de señalización para muerte celular inducidas tanto por Fas/APO1 como por p55-R.

En particular, las Figs. 16A-D muestran la morfología de células 293-EBNA en las que la muerte celular fue inducida mediante la expresión transitoria de una quimera que comprende el dominio extracelular de p55-R (aminoácidos 1-168) unida a los dominios transmembrana e intracelulares de Fas/APO1(aminoácidos 153-319) (quimera p55-Fas) (Figs. 16A y 16B), o mediante la expresión del p55-R (Figs. 16C y 16D), y de las células que fueron protegidas de estos efectos citotóxicos mediante su transfección simultánea con MACH\alpha1 (C360S) (Figs. 16 B y 16 D). Las fotografías fueron tomadas 26 h tras la transfección. La Fig. 17 ilustra la cuantificación de la muerte inducida en células 293-EBNA mediante su transfección con la quimera p55-Fas o con p55-R, junto con un vector vacío, un mutante de delección MORT1 que carece de la región de unión a MACH (MORT1 (92-208)), o moléculas MACH\alpha que contienen una región CED3/ICE no funcional. La Fig. 18 muestra la muerte de las células HeLa que expresan de modo transitorio Fas/APO1, inducidas mediante el tratamiento con anticuerpo anti-Fas/APO (aFas) y cicloheximida (CHI), y su prevención mediante la cotransfección por MORT1DD (92-208), MACH\alpha (C360S) o MACH \alpha3. La Fig. 19 muestra la muerte de las células HeLa inducida mediante aplicación de TNF y cicloheximida (CHI), y su prevención como en la Fig. 18. Los datos son de al menos dos experimentos independientes y están expresados como en las Figuras 14A-F y 15.

MACH está expresado en diferentes tejidos a niveles marcadamente diferentes y aparentemente también con diferentes patrones de isotipo. Estas diferencias contribuyen probablemente a las características específicas de tejido de la respuesta al ligando Fas/APO1 y TNF. Como en el caso de otros homólogos CED3/ICE (Wang y otros, 1994; Alnemri y otros, 1995), isoformas MACH que contiene regiones CED3/ICE incompletas (por ejemplo MACH\alpha3) se encuentra que inhibir las actividades de moléculas MACH\alpha1 o MACH\alpha2 coexpresadas. También se ha encontrado que bloquean la inducción de muerte por Fas/APO1 y p55-R. La expresión de tales isoformas inhibidoras en células puede constituir un mecanismo de autoprotección celular frente a la citotoxicidad mediada por Fas/APO1 y TNF. La amplia heterogeneidad de las isoformas MACH, que excede ampliamente la observada para cualquiera de las otras proteasas de la familia CED3/ICE, debería permitir un ajuste particularmente fino de la función de las isoformas MACH activas.

La referencia a etapas de métodos conocidos, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es de ningún modo una admisión de que algún aspecto, descripción o realización del presente invento sea descrita, enseñada o sugerida en la técnica relevante.

La descripción precedente de las realizaciones específicas revelará de modo completo la naturaleza general del invento que otros pueden, aplicando conocimientos comunes a la técnica (incluyendo los contenidos en las referencias aquí citadas), modificar fácilmente y/o adaptar para diversas aplicaciones tales como realizaciones específicas, sin una experimentación excesiva, sin alejarse del concepto general del presente invento. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones pretenden estar dentro del significado y rango de equivalentes a las realizaciones descritas, basadas en la enseñanza y guía presentada aquí. Debe entenderse que la fraseología o terminología aquí es para los propósitos de descripción y no de limitación, tal que la terminología y fraseología de la presente especificación ha de ser interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y guías presentadas aquí, en combinación con el conocimiento de alguien con experiencia en la técnica.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD. at the Weizmann Institute of Science

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(B)

CALLE: P.O. Box 95

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

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(G)

TELÉFONO: 011-972-847-0617

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(H)

TELEFAX: 011-972-847-0733

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(A)

NOMBRE: David WALLACH

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(B)

CALLE: 24 Borochov Street

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76406

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(G)

TELÉFONO: 011-972-8946-3302

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(A)

NOMBRE: Mark P. BOLDIN

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(B)

CALLE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore 303

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(D)

ESTADO:

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(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Tanya M. GONCHAROV

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Derekh Yavne 17-15

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Yury V. GOLTSEV

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Weizmann Institute of Science, Beit Clore 402

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Henry WEINWURZEL

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Herzl Street 43

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Raanana

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 43353

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MODULADORES DE LA FUNCIÓN DE RECEPTORES DE fAS Y OTRAS PROTEÍNAS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, VersiÓn #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 114,615

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 16-JUL-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 114,986

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 17-AGO-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 115,319

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 14-SEP-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 116,588

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 27-DIC-1995

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 117,932

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 16-ABR-1996

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1701 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..768

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 256 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

9

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 200 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1036 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 235 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 479 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 277 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

17

170

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 489 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 421 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 376 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 377 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

25

250

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 404 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2887 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1323 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

30

300

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 335 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

31

310

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2619 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1301 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 266 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 334 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 829 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 784 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTCGAGTC TAGAGTCGAC TTTTTTTTTT TTTTTTT

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTCGAGTC TAGAGTCGAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleoótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGATCCCC AAATGCAAAC TGGATGATGA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGATCCAG ATGGACTTCA GCAGAAATCT T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 277 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 293 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 398 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1443 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

48

Claims (13)

1. Una secuencia de ADN seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ADN de las SEQ ID Nº: 4, 19, 21, 23, 24 ó 33;

(b) una secuencia de cADN que codifica una proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular que comprende la SEQ ID Nº: 5, 8, 20, 22, 25 ó 34;

(c) una secuencia de ADN capaz de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas a las secuencias de (a) o (b), en las que las secuencia de ADN codifica una proteína MACH, que es capaz de inhibir la muerte celular;

(d) una secuencia de ADN que es degenerada como resultado del código genético a las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) y que codifican una proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular; y

(e) un fragmento del ADN de una cualquier de (a) a (d) que codifica una proteína que es capaz de inhibir la muerte celular.

2. Un vector que comprende una secuencia de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN codifica una proteína MACH que es capaz de inhibir la muerte celular.

3. El vector de la reivindicación 2 capaz de ser expresada un una célula hospedante procariota o eucariota.

4. Las células hospedantes procariotas o eucariotas transformadas que contienen un vector de la reivindicación 2.

5. Una proteína MACH codificada por el ADN de la reivindicación 1.

6. Un método que produce una proteína MACH codificada por la secuencia de ADN de la reivindicación 1 que comprende crecer las células hospedantes transformadas de la reivindicación 4 en condiciones adecuadas para la expresión de dichas proteínas afectando las modificaciones postraduccionales para obtener dicha proteína y aislar dicha proteína expresada.

7. Anticuerpos específicos para la proteína MACH de la reivindicación 5 o fragmentos Fab o F(ab')2 de dichos anticuerpos.

8. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo una proteína MACH de la reivindicación 5 o una proteína aislada según el método de la reivindicación 6 o mezclas de las mismas.

9. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína MACH de la reivindicación 5.

10. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una secuencia oligonucleotídica que dificica una secuencia antisentido de la secuencia MACH de la reivindicación 1.

11. El uso de la proteína MACH de la reivindicación 5 o secuencias que codifican dicha proteína para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el tejido dañado en un shock séptico, rechazo del injerto contra paciente o hepatitis aguda.

12. Un inhibidor de proteasas MACH seleccionado a partir del grupo que consiste en: una proteína que tiene la secuencia aminoácidida SEQ ID Nº: 7 excepto que tiene un residuo de cisteína en lugar de un residuo de serina en la posición 360 (C360S) y una proteína que tiene aminoácidos 1 a 415 de la SEQ ID Nº: 7.

13. Una composición farmacéutica para usar para el tratamiento de tejido dañado en shock séptico, rechazo del injerto contra paciente o hepatitis aguda, que comprende una proteína MACH de la reivindicación 5 o secuencias que codifican dicha proteína.