ES2326834T3

ES2326834T3 - Marcaje de oligosacaridos en fase solida: una tecnica para la manipulacion de carbohidratos inmovilizados.

Info

Publication number: ES2326834T3
Application number: ES06706037T
Authority: ES
Inventors: Anders Lohse; Malene Ryborg Jorgensen; Rita Martins; Ole Hindsgaul
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-08
Publication date: 2009-10-20
Anticipated expiration: 2026-02-08
Also published as: AU2006212596B2; EP1846765A1; DE602006006976D1; RU2007133723A; RU2398237C2; CN101120254B; US7893253B2; DK1846765T3; CA2597490A1; MX2007009467A; KR101270870B1; ATE432471T1; JP2008530538A; US20080227092A1; JP5139085B2; BRPI0607935A2; CN101120254A; KR20070115887A; WO2006084461A1; AU2006212596A1

Abstract

Un método para la preparación de un azúcar reactivo, comprendiendo dicho método las etapas de i.el suministro de una muestra que comprenda un azúcar reductor ii. suministro de un soporte sólido enlazado de manera covalente con un enlazador que comprenda un grupo de captura que comprenda un grupo -NH2, estando enlazado, opcionalmente, dicho enlazador con dicho soporte sólido a través de un espaciador iii la reacción de dicho azúcar reductor con dicho grupo -NH2, con lo que se obtiene un azúcar inmovilizado, iv. la reacción de los grupos -NH 2 libres con un agente de enmascaramiento, comprendiendo el agente de enmascaramiento un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo -NH 2; v. la reducción de los enlaces C=N con un agente reductor; vi. obteniéndose, de este modo, un azúcar reactivo con la estructura azúcarCHn-NH- enlazado con un soporte sólido a través de un enlazador y, opcionalmente, a través de un espaciador, siendo n 1 o 2, llevándose a cabo la etapa iv como paso previo a la etapa v.

Description

Marcaje de oligosacáridos en fase sólida: una técnica para la manipulación de carbohidratos inmovilizados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la manipulación de los carbohidratos. De manera particular, la invención se refiere a métodos para la manipulación de carbohidratos inmovilizados por medio de una derivatización. De este modo, los carbohidratos pueden ser detectados y/o identificados o manipulados de una manera más sencilla en función de la naturaleza de la derivatización. Por consiguiente, la invención se refiere en uno de sus aspectos al campo de la detección y de la identificación de los carbohidratos.

Fundamento de la invención

Los carbohidratos existen en muchas formas en la naturaleza. En los animales, con inclusión de los seres humanos, ejemplos de carbohidratos incluyen azúcares reductores libres en solución (tal como el monosacárido glucosa en suero), los oligosacáridos libres en solución (tales como el disacárido lactosa en la leche), éstos pueden ser enlazados con péptidos o con proteínas a través de ligamientos covalentes con una variedad de aminoácidos (tales como la asparagina, la serina, la treonina y otros), pueden ser enlazados de manera covalente con lípidos tales como la ceramida (como en los gangliósidos) o pueden ser enlazados con anclajes membranales a través de fosfatidilinositoles. De la misma manera, se encuentran azúcares enlazados con muchas moléculas pequeñas con inclusión de algunas que participan en el metabolismo, tales como los glucurónidos. En los ejemplos precedentes, la longitud de las cadenas de los azúcares pueden variar entre uno y por encima de 100 residuos de azúcar.

En los organismos inferiores, con inclusión de las bacterias y de las plantas, existe incluso una enumeración mayor de estructuras. La superficie de las células bacterianas puede estar cubierta con polímeros de azúcar que tienen una longitud de miles de residuos, que pueden actuar como antígenos en la detección de bacterias y como vacunas. Los azúcares son una parte integrante de las paredes de las células bacterianas. Los propios azúcares pueden ser antibióticos (tales como los antibióticos aminoglicósidos, por ejemplo la estreptomicina), o pueden presentarse como componentes esenciales de antibióticos (tales como la eritromicina y la vancomicina), como inhibidores enzimáticos (como en la Acarbosa) o como agentes anticancerígenos (tal como, por ejemplo, la calicheamicina).

Un área de particular interés está constituida por la estructura de las cadenas de carbohidrato (glicanos) que se encuentran enlazadas con las glicoproteínas y con los glicolípidos. Las pautas de glicosilación de las glicoproteínas han demostrado ser importantes para sus funciones biológicas, con inclusión de su biodisponibilidad, su capacidad de orientación, e incluso se han relacionado directamente con el potencial metastático de las células tumorales. La pauta de glicosilación de la transferrina del suero humano, por ejemplo, ha sido utilizada como un ensayo de diagnóstico para una serie de enfermedades genéticas denominadas Síndromes de Glicosilación Carbohidrato-deficientes. Se ha observado que intervienen en el desarrollo neuronal y en la señalización de la superficie celular, en diabetes secuencias específicas de glicolípidos y que están acumuladas en ciertas enfermedades metabólicas específicas tal como la enfermedad de Tay-Sachs, para la cual constituyen un diagnóstico.

Los ligamientos entre los residuos de azúcar en los oligosacáridos y los polisacáridos, que han sido descritos precedentemente, pueden tener o bien la configuración alfa o bien la configuración beta, y los glicanos pueden estar ramificados de maneras múltiples. Por consiguiente, la diversidad de posibles estructuras para las cadenas de glicano es enorme y su caracterización estructural es, por consiguiente, inherentemente compleja. Por consiguiente, existe un gran interés en métodos para la detección, la caracterización estructural, la identificación, la cuantificación, y la manipulación química/enzimática de estructuras de carbohidrato y de glicano, en investigación, en diagnósticos, en monitorización de la glicosilación de glicoproteínas recombinantes y en el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos.

En la actualidad se encuentran en uso diversos métodos para el análisis de estructuras de carbohidrato, y éstos han sido recientemente evaluados. Los oligosacáridos y los glicolípidos no derivatizados pueden ser analizados por medio de la espectroscopia RMN, por medio de la espectrometría de masas y por medio de la cromatografía. Para las glicoproteínas más largas, la espectrometría de masas proporciona una información más limitada pero el análisis de sus productos de digestión proteolítica, es decir los glicopéptidos, ha sido empleado extensamente. Por consiguiente, puede deducirse una información estructural indirecta sobre los oligosacáridos no derivatizados a partir de su capacidad para interactuar con proteínas de enlace carbohidrato tales como las lecitinas, los anticuerpos o los enzimas.

Los carbohidratos, propiamente dichos, no tienen cromóferos característicos, únicamente tienen grupos N-acetilo, de manera que no se utiliza usualmente la monitorización de su separación por medio de una detección óptica o espectroscópica. Sin embargo, la detección por amperiometría pulsada de los polioles ha sido una técnica importante para la detección en cromatografía.

El método más ampliamente utilizado para la detección de alta sensibilidad de los carbohidratos ha sido el etiquetado de los extremos reductores (lactoles, tautómeros de hidroxialdehídos e hidroxicetonas) bien con marcadores TAGs radioactivos o fluorescentes. Se ha descrito que, tanto los métodos químicos como los métodos enzimáticos, escinden a los carbohidratos a partir de las glicoproteínas y de los glicolípidos, permitiendo la generación de los azúcares reductores requeridos a partir de las glicoproteínas, de los glicolípidos y de otros glicoconjugados. En el caso más común, dichos azúcares reductores se hacen reaccionar con derivados que contienen amino de moléculas fluorescentes bajo condiciones de aminación por reducción: es decir en el caso en que las iminas formadas inicialmente (C=N) se reducen para dar aminas (CH-NH) para producir un ligamiento estable. En la mayoría de los casos, las reacciones de etiquetado han sido llevadas a cabo en solución empleándose un gran exceso de agente para el etiquetado. Esto requiere la separación del exceso del agente para el etiquetado y de sus productos acompañantes antes o durante el análisis. Otros marcadores TAGs, que son útiles en espectrometría de masas, han sido añadidos de la misma manera, bien por medio de una aminación o bien por medio de una aminación por reducción, habiéndose llevado a cabo la detección entonces por medio del espectrómetro de masas.

Una vez que ha sido añadida la etiqueta, para permitir la detección específica, los carbohidratos precedentemente descritos pueden ser sometidos, a continuación, a la separación y la detección/cuantificación. Puede obtenerse una información estructural adicional por medio de la exposición de los carbohidratos marcados a enzimas tales como las glicosidasas. Si las glicosidasas específicas actúan sobre los carbohidratos marcados, éstos pueden escindir uno o varios residuos de azúcar dando como resultado un cambio en la movilidad cromatográfica o electroforética, tal como se ha detectado, por ejemplo, por medio de un detector fluorescente en HPLC, CE o por medio de un cambio en su movilidad en SDS-PAGE, o un cambio en su masa como se ha detectado por medio de un cambio en el valor m/z en el espectrómetro de masas. Se han utilizado listados de enzimas para proporcionar un análisis de rendimiento más elevado.

A continuación se da una breve recopilación del arte previo:

: Gao et al. 2003, Analytical Letters 36(7), 1281-1310 revisiones de las técnicas adecuadas para la derivatización de carbohidratos en solución. Los carbohidratos en solución pueden ser derivatizados por medio de una aminación por reducción. En general, los grupos -NH_{2} de las aminas pueden reaccionar con un grupo aldehído o con un grupo cetona de azúcares reductores, produciendo, de este modo, compuestos con la estructura -C=N. Tales compuestos pueden ser reducidos a continuación, por ejemplo, por medio de NaCNBH_{3}. La publicación de los autores Gao et al., 2003 no divulga la manipulación de los carbohidratos inmovilizados.

La publicación US5,100,778 describe un método para la secuenciación de oligosacáridos que comprende la colocación de una etiqueta identificadora en el residuo terminal reductor de un oligosacárido, la división en una pluralidad de porciones separadas, el tratamiento de cada porción con, por ejemplo, glicosidasas específicas, el agrupamiento del producto y el análisis de los grupos obtenidos. El documento no describe oligosacáridos inmovilizados.

La publicación US 4,419,444 describe métodos para enlazar químicamente compuestos orgánicos que contienen residuos de carbohidrato con un soporte que porta grupos reactivos -NH_{2}. Los métodos comprenden bien la oxidación con peryodato de los dioles de los carbohidratos para producir aldehídos reactivos por medio de la escisión de los enlaces C-C en el carbohidrato o la oxidación de los grupos -CH_{2}OH para dar grupos -CHO por vía enzimática. Ambas oxidaciones dan como resultado la alteración de la estructura del carbohidrato. Los aldehídos reactivos pueden ser inmovilizados por medio de la reacción con los grupos -NH_{2}. Tras inmovilización del compuesto, que contiene el carbohidrato, puede llevarse a cabo una etapa de reducción (por ejemplo con utilización del NaBH_{4}) para incrementar la estabilidad. El documento no describe ni la inmovilización de un azúcar reductor por medio de su extremo reductor, ni la manipulación de los compuestos, que contienen carbohidrato alterado, inmovilizado, por medio del enlace amina reducido. Por otra parte, se ha alterado la naturaleza química del carbohidrato y esta alteración puede perjudicar otras modulaciones, tal como una escisión enzimática específica por medio de glicosidasas. El documento tampoco describe la adición de cualquier reactivo químico al oligosacárido inmovilizado que resulta de la adición de estructuras moleculares al mismo.

La publicación WO 92/19974 describe un método de secuenciación de oligosacáridos. El método comprende la inmovilización de oligosacáridos sobre un soporte sólido y el tratamiento subsecuente con una variedad de glicosidasas. Como paso previo a la inmovilización, el oligosacárido puede ser ligado con un conjugado. El documento no describe la modulación de los oligosacáridos inmovilizados distinta a la del tratamiento con glicosidasa.

Los autores Kakehi et al. 1990, Journal of Chromatography 502, 297-304; Nadkarni & Linhardt 1997, Biotechniques 23(3), 382-385; y la publicación WO03/014736 describen métodos para el enlace químico de residuos de carbohidrato con soportes que portan grupos reactivos -NH_{2} que comprende una etapa de reducción seguida de una etapa de enmascaramiento/bloqueo. Los documentos no divulgan la realización de estas dos etapas en el orden inverso.

Lo indicado precedentemente describe la importancia biológica y la complejidad de los glicanos, y resume algunos beneficios del enlace de los marcadores TAGs con los azúcares reductores, tales como los monosacáridos, así como para la reducción del extremo de azúcar de los oligosacáridos. Hasta el momento se ha llevado a cabo dicho enlazamiento en solución, empleándose grandes excesos de agente para el marcaje (y con frecuencia agentes químicos adicionales tales como agentes reductores), y por consiguiente, requiere un consumo de tiempo y, con frecuencia, deben ser aplicadas técnicas de separación dificultosas, como paso previo a su detección o a su subsiguiente manipulación. Dichas técnicas de separación dan como resultado, de manera invariable, pérdidas de material, y dilución, lo que complica considerablemente y perjudica al análisis. Por consiguiente, existe una gran necesidad de métodos simples que puedan instalar un marcador TAG en una estructura de carbohidrato y la manipulación ulterior de la estructura, sin la necesidad de métodos complejos e imprecisos para la reacción de separación de los materiales de partida, de los reactivos, de los productos acompañantes y de los productos buscados. En este caso describimos dichos métodos simples.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos para el enlazamiento covalente de azúcares reductores, (que pueden estar constituidos por cualquiera de los azúcares reductores mencionados en este caso más adelante en la sección "azúcar reductor") con un soporte sólido (que puede ser cualquiera de los soportes sólidos descritos en este caso más adelante en la sección "soporte sólido") por medio de la reacción con una molécula inmovilizada constituida por un espaciador opcional (es decir con o sin espaciador) y con un enlazador (que puede ser escindible) que incorpora un grupo de captura que contiene una funcionalidad -NH_{2}. El azúcar inmovilizado, resultante, tiene una forma acíclica con un enlace C=N, que puede estar en equilibrio con su tautómero glicosilamina cíclico.

Los grupos libres -NH_{2} sobre el soporte sólido se enmascaran tras la inmovilización y el enlace C=N se somete a continuación a una reducción. El método está esquematizado en la figura 1 A+B\rightarrowE. La figura muestra una piranosa no derivatizada, que, sin embargo, se supone que representa cualquier azúcar reductor.

En una variación, un método que no forma parte de la presente invención puede comprender la reducción del azúcar inmovilizado que contiene un enlace C=N (ejemplificado por la estructura C, figura 1) para dar CH-NH como paso previo al enmascaramiento de los grupos -NH_{2} libres, dando como resultado un compuesto con la estructura C_{red} (figura 1). Los grupos -NH_{2} en C_{red} pueden ser, entonces, enmascarados en esta etapa para proporcionar un compuesto con la misma estructura E que el que ha sido producido por medio de la secuencia C se convierte en D, se convierte en E, que ha sido descrita precedentemente y que está mostrada en la figura 1.

Los compuestos de la estructura E pueden ser producidos, por consiguiente, bien por medio de la secuencia A+B se convierte en C, se convierte en D, se convierte en E, o A+B se convierte en C, se convierte en C_{red}, se convierte en E.

\vskip1.000000\baselineskip

Sin embargo constituye un objeto de la presente invención el hecho de proporcionar métodos para la preparación de un azúcar reactivo, cuyo procedimiento comprende las etapas de

i.: la suministro de una muestra que comprende un azúcar reductor (tal como A en la figura 1),

ii.: el suministro de un soporte sólido (por ejemplo sólido en la figura 1) enlazado de manera covalente con un enlazador, que comprende un grupo de captura, que comprende un grupo -NH_{2}, estando enlazado dicho enlazador, de manera opcional, con dicho soporte sólido a través de un espaciador (tal como B en la figura 1),

iii.: la reacción de dicho azúcar reductor con dicho grupo -NH_{2}, obteniéndose en este caso un azúcar inmovilizado (tal como C en la figura 1),

iv.: la reacción de los grupos -NH_{2} libres con un agente de enmascaramiento, comprendiendo el agente de enmascaramiento un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo -NH_{2},

v.: la reducción de los enlaces C=N con un agente reductor,

vi.: obteniéndose, de este modo, un azúcar reactivo que contiene la estructura de azúcar CH_{n}-NH- enlazada con dicho soporte sólido a través de un enlazador y, opcionalmente, a través de un espaciador, siendo n 1 o 2 (tal como el compuesto E de la figura 1),

llevándose a cabo la etapa iv como paso previo a la etapa v.

\vskip1.000000\baselineskip

El enmascaramiento de los grupos -NH_{2} en la etapa iv da como resultado el compuesto D de la figura 1, mientras que la reducción, que se lleva a cabo en la etapa v, da como resultado el compuesto E de la figura 1.

En métodos alternativos, que no forman parte de la presente invención, en los que la etapa v se lleva a cabo como paso previo a la etapa iv, la reducción del enlace C=N (por ejemplo del compuesto C de la figura 1) da como resultado el compuesto C_{red} de la figura 1. El enmascaramiento de los grupos -NH_{2} en la etapa iv da como resultado, por ejemplo, los compuestos de la estructura E, figura 1. De manera alternativa, la muestra que comprende el azúcar reductor puede ser incubada, simultáneamente, con el soporte sólido y con el azúcar reductor. De este modo, la reducción de los enlaces C=N (etapa v) se lleva a cabo inmediatamente después de la reacción del azúcar reductor con el grupo -NH_{2} del soporte sólido (etapa iii).

De manera preferente, en la etapa iii) el extremo reductor de dicho azúcar reductor se hace reaccionar con dicho grupo -NH_{2}. De este modo, el grupo aldehído o el hemiacetal del azúcar reductor se hace reaccionar, de manera preferente, con el grupo -NH_{2}.

Es preferente que los procedimientos comprendan, además, la etapa de

vii.: la reacción del grupo -NH- del azúcar reactivo (por ejemplo el compuesto E de la figura 1) con un agente para la derivatización que comprenda un grupo funcional reactivo con el nitrógeno (X), obteniéndose, de este modo, un azúcar enlazado de manera covalente con dicho agente. Dicho azúcar, enlazado de manera covalente con dicho agente, puede ser, por ejemplo, el compuesto F de la figura 1 (cuando el agente para la derivatización sea un marcador TAG) o el compuesto H de la figura 1, cuando el agente para la derivatización sea un inmovilizador enlazado sobre el grupo funcional.

El término marcador "TAG" en el presente contexto, y en la figura 1 (véase más abajo), quiere indicar cualquier átomo, molécula o entidad que pueda enlazarse de manera covalente con otra molécula llevando a cabo el etiquetado de dicha otra molécula, como si hubiese sido sometida al enlazamiento covalente.

Descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un ejemplo del método de conformidad con la invención. La figura 1: A-E ilustra la captura y la manipulación de un azúcar reductor sobre un soporte sólido para dar un azúcar reactivo E. La figura 1: E-G y J ilustra la manipulación de un azúcar reactivo E sobre un soporte sólido, y la escisión de un azúcar marcado. Los métodos de la invención comprenden las etapas ilustradas en la figura 1 como las que han sido definidas por las reivindicaciones dependientes. En la figura 1, el azúcar reductor está ejemplificado por medio de una piranosa, sin embargo puede ser utilizado con el método cualquier azúcar reductor. La figura muestra un ejemplo en el que el enlazador está enlazado con el soporte sólido a través de un espaciador, sin embargo, el enlazador puede también estar directamente enlazado con el soporte sólido. El soporte sólido ha sido designado como "sólido" en la figura, sin embargo puede ser cualquiera de los soportes sólidos mencionados aquí más adelante.

La figura 2 ilustra las estructuras 1 - 10 de los azúcares reductores, y mezclas de los mismos, usadas en los ejemplos de la presente invención.

La figura 3 ilustra la síntesis de un enlazador (14) y la estructura de un espaciador (15).

La figura 4 ilustra la síntesis en fase solución del derivado de la D-galactosa marcado con TMR, GalCH_{2}-N(R)-TMR (21), y los patrones de descripción de nomenclatura usados para el monosacárido.

La figura 5 ilustra las estructuras 21 - 28 de los derivados marcados sintéticamente de los ocho monosacáridos comunes de los mamíferos con la estructura general azúcarCH_{2}-N(R)-TMR.

La figura 6 ilustra las estructuras de los cuatro soportes sólidos B^{P}, B^{0}, B^{1} y S^{2}.

La figura 7 ilustra las estructuras de algunos agentes de enmascaramiento.

La figura 8 ilustra las estructuras de algunos agentes para el marcaje reactivos con el nitrógeno, usados, con la estructura general TAG-X

La figura 9 ilustra el ejemplo partiendo de E para llegar hasta J (30) usándose el agente reactivo con el nitrógeno protegido (29) con la estructura general X-inmovilizador-Y_{P}.

La figura 10 ilustra la separación por CE de los ocho patrones de monosacáridos etiquetados con TMR mostrados en la figura 5. El orden de elución es GalNAc (27), Xyl (24), Man (23), Glc (22), GlcNAc (26), Fuc (25), Gal (21), y GlcA (28). La traza superior es una expansión.

La figura 11 ilustra la CE de G^{P}3 (con LacNAc como el azúcar reductor marcado con empleo de TRITC, sección 4.2.1).

La figura 12 ilustra el espectro de masas por electrospray en el modo de ión negativo de G^{P}5 (con lacto-N-tetraosa como el azúcar reductor marcado con empleo de 4-bromofenilisotiocianato, sección 4.2.2). El inserto es una expansión que muestra los dos picos que corresponden a los isótopos mayores de Br.

La figura 13 ilustra la CE de G^{P}6_{a} (con la mezcla de monosacáridos 6 marcada con empleo de TRITC, sección 4.2.3). X significa picos no identificados. El orden de elución es GalNAc (27), Man (23) y Fuc (25). La traza inferior es una expansión.

La figura 14 ilustra la CE de G^{P}7_{a} (con la mezcla de monosacáridos 7 marcada con empleo de TRITC, sección 4.2.4). X significa picos no identificados. El orden de elución es GalNAc (27), Man (23) y Fuc (25). La traza inferior es una expansión.

La figura 15 ilustra la CE de G^{P}9 (con la mezcla de oligosacáridos 9 marcada con empleo de FITC, sección 4.2.5). El orden de elución es G7 hasta G2 (figura 2).

La figura 16 ilustra la CE de G^{P}10 (oligosacáridos de ribonucleasa B 10 marcados con empleo de FITC, sección 4.2.6).

La figura 17 ilustra la CE de G^{1}2 (con Gal 2 como el azúcar reductor marcado con empleo de TRITC, sección 4.3.1).

La figura 18 ilustra la CE de G^{1}5 (con LNT 5 como el azúcar reductor marcado con empleo de TRITC, sección 4.3.2).

La figura 19 ilustra la CE de G^{1}8 (con 8 como la mezcla de azúcares reductores marcada con empleo de TRITC, sección 4.3.3). El orden de elución es LNT seguido por Gal.

La figura 20 ilustra la CE de los productos escindidos G^{0}5 (A), G^{1}5 (B) y G^{2}5 (C) tras digestión con beta-galactosidasa de la LNT inmovilizada (5), sección 5.1.1). El tetrasacárido LNT etiquetado con TRITC es eluido en primer lugar, aproximadamente al cabo de 36 minutos. La pérdida de galactosa proporciona el producto trisacárido, que es eluido al cabo de 38 minutos.

La figura 21 ilustra la CE del producto escindido antes (traza A) y después (traza B) de la incubación de F^{2}4 (maltotriosa (G3) como el azúcar reductor marcado con empleo de TRITC) con glucoamilasa, sección 5.1.2). Se añadió una muestra de referencia de Glc marcada (22, figura 5) a la muestra como paso previo al registro de la traza A.

La figura 22 ilustra la CE de los productos escindidos obtenidos tras tratamiento con beta-galactosidasa de C^{2}5 (que porta LNT y grupos NH_{2} libres), seguido por la captura de la galactosa liberada, reducción y marcaje con empleo de TRITC, sección 5.2. El orden de elución es LNT, el trisacárido que resulta de la pérdida de galactosa y galactosa (21).

La figura 23 ilustra el análisis por CE de los productos escindidos derivados de C^{2}2 (galactosa inmovilizada) tras enmascaramiento con diversos agentes, reducción y marcaje con empleo de TRITC, sección 6.1). Los agentes de enmascaramiento eran A (anhídrido acético), B (anhídrido benzoico), C (anhídrido tricloroacético) y D (dibromoxileno). La galactosa marcada (21) es eluido aproximadamente al cabo de 17 minutos en todas las trazas.

La figura 24 ilustra la CE del producto escindido a partir de la galactosa del proceso a través de la secuencia C\rightarrowC_{red}\rightarrow\rightarrowG, sección 6.2). La galactosa 21 es eluida al cabo de 17 minutos.

Descripción detallada de la invención Métodos de manipulación de un azúcar reductor

La presente invención se refiere a métodos para la manipulación de un azúcar reductor. En la figura 1 está esquematizado un ejemplo de los métodos de la invención. Debe observarse que los métodos de la invención no comprenden necesariamente todas las etapas ilustradas en la figura 1. De este modo, los métodos pueden comprender únicamente algunas de las etapas esquematizadas en la figura 1.

Los métodos comprenden, al menos, las etapas A+B\rightarrowC, C\rightarrowD y D\rightarrowE. En la figura 1 el azúcar reductor ha sido ejemplificado por medio de una piranosa, sin embargo puede ser empleado con la invención cualquier azúcar reductor, en particular cualquiera de los azúcares reductores descritos en este caso más adelante en la sección "azúcar reductor". El grupo -OH que disocia el anillo de piranosa en la figura 1 indica que el azúcar reductor puede portar uno o más grupos hidroxilo enlazados con el mismo.

Cada una de las etapas de los métodos de la invención está descrita en este caso más adelante con mayor detalle, haciendo referencia las letras mayúsculas A hasta J y C_{red} a la figura 1.

La identidad de cada uno de los compuestos o de los intermedios de la presente invención, por ejemplo los compuestos A, B, C, D, E, F, G, H, I o J, puede ser verificada por medio de técnicas estándar conocidas por el técnico en la materia, tal como por medio de la RMN.

A. Azúcar reductor

El término "azúcar reductor", tal como se utiliza en este caso, cubre la definición clásica de los azúcares que son capaces de reducir Cu^{2+} en Cu^{+}. Puede ensayarse si un azúcar es reductor, por ejemplo, por medio del reactivo de Fehlings. En la terminología más moderna, los azúcares reductores son azúcares que comprenden un grupo aldehído o un hemiacetal de la fórmula R_{2}C(OH)OR', en la que R' no es H. De manera preferente, un azúcar reductor es una estructura de carbohidrato que contiene un aldehído, que está en equilibrio con la forma cíclica, denominada un hemiacetal. La D-glucosa es un ejemplo no limitativo de un azúcar reductor de este tipo. Las formas cíclicas más abundantes contienen anillos de 5 miembros, denominadas furanosas, y anillos de 6 miembros, denominadas piranosas. (Véanse las reglas de nomenclatura).

El término "azúcar", tal como se utiliza en este caso, cubre monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos así como compuestos que comprenden monosacárido, oligosacárido o polisacárido. El término "carbohidrato" y el término "azúcar" se utilizan en este caso de manera intercambiable.

Los oligosacáridos y los polisacáridos son compuestos que están constituidos por monosacáridos enlazados de manera glicosídica. En general, los polisacáridos comprenden, al menos, 10 residuos de monosacárido, mientras que los oligosacáridos comprenden, en general, entre 2 y 10 monosacáridos. Los oligosacáridos y los polisacáridos pueden ser lineales o ramificados. Se define un monosacárido como un polihidroxialdehído H-(CHOH)_{n}-CHO o como una polihidroxicetona H-(CHOH)_{n}-CO-(CHOH)_{m}-H, siendo m y n números enteros. Los monosacáridos preferidos comprenden entre 4 y 9 carbonos, de este modo, para los polihidroxialdehídos, n significa de manera preferente, un número entero comprendido entre 3 y 8 y para las polihidroxicetonas n+m significa un número entero comprendido entre 3 y 8. Los monosacáridos son compuestos tales como aldosas y cetosas y una gran variedad de derivados de los mismos. La derivación incluye aquellos productos obtenidos por oxidación, por desoxigenación, por substitución de uno o de varios grupos hidroxilo preferentemente por un átomo de hidrógeno, un grupo amino o un grupo tiol, así como por alquilación, acilación, sulfatación o fosforilación de grupos hidroxi o de grupos amino. De conformidad con la nomenclatura IUPAC, los carbohidratos son compuestos con la fórmula estequiométrica C_{n}(H_{2}O)_{n}, tales como las aldosas y las cetosas así como las substancias derivadas de los monosacáridos por reducción del grupo carbonilo (alditoles), por oxidación de uno o más grupos terminales para dar ácidos carboxílicos, o por substitución de uno o de varios grupos hidroxilo por un átomo de hidrógeno, por un grupo amino, por un grupo tiol o por grupos similares o por derivados de estos compuestos.

En una realización preferente, el azúcar reductor es un azúcar reductor de origen natural o un azúcar reductor, que ha sido liberado a partir de un compuesto de origen natural o producido de manera recombinante, que comprende un carbohidrato, de manera preferente, sin haber sido sometido a modificaciones ulteriores tras la liberación. En particular, es preferente que el azúcar reductor sea un azúcar reductor de origen natural o un azúcar reductor liberado a partir de un compuesto de origen natural o producido de manera recombinante, en el que no hayan sido transformados por vía enzimática ninguno de los grupos alcohol de dicho azúcar de origen natural o de dicho azúcar liberado, para dar un aldehído o una cetona por oxidación al nivel del oligosacárido. De la misma manera, es preferente que el azúcar reductor sea un azúcar reductor de origen natural o un azúcar reductor liberado a partir de un compuesto de origen natural o producido de manera recombinante, no habiendo sido sometido dicho azúcar de origen natural o dicho azúcar liberado a un tratamiento con peryodato. Por consiguiente, es preferente en general que no haya sido transformado el grupo alcohol de dicho azúcar de origen natural o de dicho azúcar liberado, para dar un aldehído o una cetona. En este contexto, los compuestos producidos de manera recombinante son compuestos producidos por un organismo vivo con ayuda de tecnologías recombinantes, por ejemplo con glicoproteínas heterólogas.

Los azúcares reductores pueden derivarse de una variedad de fuentes. Por ejemplo, el azúcar reductor puede ser obtenido a partir de un organismo vivo o de una parte de un organismo vivo, tal como animales o plantas o a partir de uno o de varios tejidos animales o vegetales específicos, a partir de organismos tales como células procariotas o eucariotas, a partir de virus, a partir de células de mamíferos cultivadas in vitro, a partir de células de insectos, de células de plantas, de hongos, de células bacterianas, de levaduras o de fagos. A título de ejemplo, el azúcar reductor puede ser aislado a partir de extractos de cualquiera de las células, de los organismos microbianos o de los organismos vivos, que han sido citados precedentemente. Tales extractos pueden comprender azúcares reductores tales como carbohidratos libres. De la misma manera, los extractos pueden comprender compuestos que comprendan monosacárido, oligosacárido, polisacárido o mitades de carbohidrato, principalmente glicoproteínas o glicolípidos o moléculas orgánicas pequeñas con las que se han enlazado carbohidratos, que se denominan de manera general glicósidos. Las glicoproteínas son compuestos en los que está enlazado un componente carbohidrato con un péptido, con un polipéptido o con un componente proteico. De este modo, tal como se utiliza en este caso, el término glicoproteína abarca, de igual modo, los proteoglicanos y los glicosaminoglicanos. Los glicolípidos son compuestos que contienen uno o varios monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos o mitades de carbohidrato enlazadas por medio de un enlace glicosídico con la mitad hidrófoba tal como un acilglicerol, un esfingoide, una ceramida (N-acilesfingoide) o un prenilfosfato. Los glicósidos describen moléculas orgánicas pequeñas (PMt 100 - 5.000) enlazadas de manera glicosídica con uno o varios azúcares a través de O, de N o de S.

De la misma manera, los azúcares reductores pueden ser los producto de síntesis química, o de síntesis química/enzimática, como los oligosacáridos preparados in vitro por medio de síntesis química en solución o en fase sólida. Estos mismos oligosacáridos sintéticos pueden ser modificados ulteriormente por medio de una reacción enzimática, tal como por ejemplo por medio de la sulfatación, la fosforilación o la glicosilación. De este modo, los métodos descritos en este caso pueden ser empleados, de igual modo, para la manipulación de oligosacáridos sintéticos o semisintéticos o de librerías de oligosacáridos.

De manera preferente, la mitad monosacárida, oligosacárida, polisacárida o de carbohidrato se libera a partir de la glicoproteína, como paso previo a la realización de los métodos de la invención. Esto puede ser llevado a cabo con ayuda de métodos estándar conocidos por el técnico en la materia. Los monosacáridos, los oligosacáridos, los polisacáridos o los carbohidratos N-enlazados pueden ser escindidos a partir de glicoproteínas con ayuda de métodos químicos o enzimáticos. Los métodos enzimáticos pueden comprender, por ejemplo, la utilización de glicosidasas tales como las endoglicosidasas H y F o N-glicanasas tales como la PNGasa-F. Los monosacáridos, los oligosacáridos, los polisacáridos o los carbohidratos O-enlazados pueden ser escindidos a partir de glicoproteínas con ayuda de métodos químicos, con inclusión de la hidrazinólisis o de la \beta-eliminación alcalina o por vía enzimática con utilización de enzimas tal como una O-glicosidasa. Los métodos químicos adecuados para la liberación de los N-enlazados y de los O-enlazados, incluyen reacciones con nucleófilos fuertes y/o con bases fuertes tales como la hidrazina. Los carbohidratos pueden ser escindidos a partir de moléculas orgánicas pequeñas con utilización de reacciones ácidas o bien de reacciones básicas, o por medio de la acción de glicosidasas.

En una realización de la invención, se añade una cantidad predeterminada de un patrón de referencia a la muestra que comprende el azúcar reductor. Esto puede facilitar la cuantificación de dicho azúcar reductor tras inmovilización o tras inmovilización y desprendimiento en realizaciones de la invención en las que el enlazador puede ser escindido.

El patrón de referencia puede ser cualquier compuesto capaz de reaccionar con -NH_{2}, por ejemplo cualquier compuesto que comprenda uno de los grupos funcionales nitrógeno reactivos descritos en este caso más adelante en la sección "E\rightarrowF. adición de marcadores TAGs". De manera preferente, el patrón de referencia es un aldehído o una cetona, de una manera más preferente es un azúcar. En otra realización de la invención, se añade el mismo patrón o se añade un patrón diferente al soporte sólido como paso previo al contacto con la solución que contiene el azúcar reductor con o sin la adición de patrón de referencia incluido en la solución (véase en este caso más adelante en la sección "B. soporte sólido"). De este modo, pueden ser empleados dos o varios patrones de referencia, pueden añadirse uno (o varios) al soporte sólido como paso previo a la puesta en contacto del soporte sólido con la solución que comprende un azúcar reductor, y pueden añadirse uno o varios a la solución que contiene el azúcar reductor.

Por consiguiente, pueden añadirse uno o varios patrones de referencia al soporte sólido tras la puesta en contacto con el azúcar reductor, pero de manera preferente, como paso previo al enmascaramiento. De este modo, por ejemplo, el patrón de referencia puede ser añadido al compuesto C de la figura 1, preferentemente tras la etapa de lavado.

En realizaciones de la invención en las que el soporte sólido está copulado con un patrón de referencia (véase en este caso más adelante la sección "B. soporte sólido") es preferente que sean utilizados patrones de referencia diferentes.

En una realización de la invención, los métodos comprenden una etapa de tratamiento previo de la muestra que debe ser usada con el método. En particular, puede ser sometida a un tratamiento previo una muestra que comprenda azúcares enlazados de manera glicosídica, tales como una glicoproteína, un glicolípido o una un glicósido, con resina adsorbente como paso previo a la reacción con el soporte sólido. La resina adsorbente es, de manera preferente, una resina que comprende un grupo nucleófilo capaz de reaccionar con los aldehídos y con las cetonas, con inclusión de los azúcares reductores, de manera preferente, la resina adsorbente comprende un grupo amino o una hidrazina. De este modo, la incubación de la muestra con la resina adsorbente provocará la eliminación de los aldehídos adicionales, de las cetonas adicionales y de los azúcares reductores. Tras el tratamiento previo, tales métodos comprenden, en general, la etapa correspondiente a la liberación de los azúcares reductores a partir de dicho azúcar enlazado de manera glicosídica obteniéndose, de este modo, una muestra que comprende azúcares reductores. De este modo, la gran mayoría de los aldehídos y de las cetonas en esta muestra liberan los azúcares reductores a partir de los azúcares enlazados de manera glicosídica. Dichos azúcares reductores pueden ser liberados con ayuda de un número de métodos, con inclusión de los métodos químicos o enzimáticos, tales como cualquiera de los métodos descritos aquí más adelante en esta sección. El tratamiento de la muestra tratada previamente por ejemplo con PNGasaF puede provocar la liberación de oligosacáridos reductores en solución para la captura y la manipulación de conformidad con los métodos de la invención. Los oligosacáridos, liberados de este modo, estarán esencialmente libres de compuestos carbonilo contaminantes. De igual modo, la liberación de los carbohidratos reductores puede llevarse a cabo con otros enzimas, tales como glicosidasas, o por medio del empleo de reacciones químicas, tras la adsorción de los compuestos carbonilo contaminantes como se ha descrito precedentemente.

\vskip1.000000\baselineskip

B. Soporte sólido

Los métodos, de conformidad con la presente invención, comprenden la inmovilización de un azúcar reductor con un soporte sólido. La química en fase sólida ofrece un número de ventajas, tales como la fácil manipulación, purificación y concentración de los compuestos inmovilizados. Sin embargo, no pueden ser llevadas a cabo sobre fases sólidas todas las reacciones que pueden ser realizadas en solución. El enlazamiento con un soporte sólido confiere prácticamente un tamaño infinito a cada entidad molecular. Esto tiene como efecto que la molécula reaccione de una manera mucho más lenta en una reacción bimolecular que lo haría la misma molécula en solución. Algunas reacciones, que pueden ser llevadas a cabo en solución con un rendimiento aceptable, simplemente no se verifican sobre soporte sólido.

El término "soporte sólido", tal como se ha utilizado aquí, cubre sólidos físicos así como también polímeros insolubles, partículas insolubles, superficies, membranas, y resinas, de manera preferente, el soporte sólido es un polímero insoluble, una partícula insoluble, una superficie o una resina.

Por consiguiente, el "soporte sólido" puede ser una matriz inorgánica insoluble (tal como un vidrio), un polímero insoluble (tal como un plástico, por ejemplo un poliestireno), una matriz insoluble que esté constituida por partes de componentes tanto orgánicos como inorgánicos (por ejemplo algunos silicatos híbridos, tales como compuestos con la estructura R-Si-O-), polímeros orgánicos de uso común en síntesis de fase sólida (poliestirenos, resinas PEGA, resinas PEG, resinas SPOCC e híbridos de las mismas), cadenas de polietilenglicol (que pueden ser solubles en ciertos disolventes orgánicos y que pueden insolubilizarse por medio de la adición de otros disolventes). De igual modo, el sólido puede ser un metal (tal como el oro), una aleación, o un material compuesto tal como, por ejemplo, indio-óxido de estaño o mica.

Cualquiera de los soportes sólidos, que han sido enumerados precedentemente, puede ser revestido, adicionalmente, con agentes que tengan una afinidad para los carbohidratos, tales como, pero sin carácter limitativo, los arilboronatos o los polímeros de los mismos. Tales revestimientos pueden acrecentar la concentración del carbohidrato en la superficie del soporte sólido, reforzando la velocidad y el rendimiento de captura.

Los polímeros orgánicos, empleados en síntesis en fase sólida incluyen, por ejemplo, TentaGel (comercialmente disponible en la firma Rapp polymere, Tübingen, Alemania), ArgoGel (comercialmente disponible en la firma Argonaut Technologies Inc., San Carlos, CA), PEGA (comercialmente disponible en la firma Polymer Laboratories, Amherst, MA), POEPOP (Renil et al., 1996, Tetrahedron Lett., 37: 6185-88; disponible en la firma Versamatrix, Copenhague, Dinamarca) y SPOCC (Rademann et al, 1999, J. Am. Chem. Soc., 121: 5459-66; disponible en la firma Versamatrix, Copenhague, Dinamarca).

En una realización de la invención, el soporte sólido es un sensor, tal como un sensor de ondas acústicas de superficie (tal como cualquiera de los sensores descritos en la publicación de los autores Samoyolov et al. 2002, J. Molec. Recognit. 15: 197-203) o un sensor de resonancia de plasma de superficie (tal como cualquiera de los sensores evaluados en la publicación de los autores Homola et al., 1999, Sensors y Actuators B, 54: 3-15). Tales soportes sólidos pueden ser materiales inorgánicos tales como vidrio, metales, tal como el oro, materiales polímeros orgánicos o híbridos de los mismos y pueden cubrir varios revestimientos tales como proteínas o polisacáridos, oligómeros tales como dendrímeros o polímeros tales como poliacrilamida o polietilenglicol.

En una realización preferida el soporte sólido es un vidrio o una resina de PEGA.

En una realización de la presente invención, el soporte sólido está copulado con un patrón de referencia, que puede facilitar la cuantificación del azúcar reductor inmovilizado. En particular, es preferente que dicho patrón de referencia esté enlazado con dicho soporte sólido (bien de manera directa o bien de manera indirecta) por medio de un enlazador escindible, que pueda facilitar la cuantificación del azúcar reductor inmovilizado y liberado. En las realizaciones de la invención, en las que el azúcar reductor está inmovilizado sobre el soporte sólido a través de un enlazador escindible, es preferente que el patrón de referencia esté inmovilizado sobre el soporte sólido a través de un enlazador idéntico o similar escindible.

El patrón de referencia puede ser cualquier compuesto detectable, por ejemplo el patrón de referencia puede ser o no puede ser un azúcar, de manera preferente, sin embargo, es un carbohidrato.

La cantidad del patrón de referencia puede variar, en general, el soporte sólido puede comprender entre 20 y 500, de manera preferente, entre 50 y 200, tal como entre 90 y 110 grupos -NH_{2} por patrón de referencia.

\vskip1.000000\baselineskip

B. Espaciador

De conformidad con la presente invención, el soporte sólido está copulado, de manera opcional, con un enlazador a través de un espaciador. Sin embargo, queda comprendido también en la presente invención, el hecho de que el soporte sólido esté directamente acoplado con el enlazador.

Un espaciador es una entidad química con una longitud comprendida entre 1 y 1.000 átomos. De manera preferente, dicho espaciador es una cadena lineal o ramificada y/o es una estructura anular. La naturaleza del espaciador puede ser hidrófoba o hidrófila o tiene una mezcla de estas dos propiedades. El grupo de espaciadores comprende moléculas de uso común en la síntesis en fase sólida y en ensayos en perla, en celdilla o en placa, que comprenden la detección de las moléculas enlazadas a través de los espaciadores con los soportes sólidos. El técnico en la materia puede identificar fácilmente un espaciador adecuado para un soporte sólido dado.

El espaciador es, de manera preferente, una cadena alquilo (de una manera más preferente una cadena alquilo con 1 a 1.000 átomos de carbono), que opcionalmente puede estar ramificada, estando substituida dicha cadena alquilo opcionalmente en una o en varias posiciones por grupos que contienen uno o más de los elementos B, O, N, S, P, Si, F, Cl, Br o I. De igual modo, el espaciador puede comprender uno o varios residuos arilo que opcionalmente pueden estar ramificados o substituidos de la misma manera. En una realización preferente, el espaciador se elige entre el grupo constituido por las aminas y por los éteres. De este modo, el espaciador puede estar constituido esencialmente por una cadena que contenga uno o varios enlaces amida (-CONH-), una o varias unidades de etilenglicol (-CH_{2}-CH_{2}-O-), o combinaciones de estas unidades con las cadenas alquilo o arilo.

En una realización de la invención, el espaciador no comprende, de manera preferente, ni una amina primaria ni una amina secundaria. En otra realización de la invención, cualquier amina comprendida en el espaciador está enmascarada.

B. Enlazador

La presente invención se refiere a la captura de los azúcares reductores sobre soportes sólidos enlazados de manera covalente con un enlazador que comprende un grupo de captura. El enlazador sirve para enlazar el grupo de captura, terminado en -NH_{2}, con el soporte sólido opcionalmente a través de un espaciador. El enlazador puede ser uno cualquiera entre una amplia variedad de enlazadores tales como aquellos de uso común en la síntesis orgánica de fase sólida.

El enlazador puede ser un enlazador no escindible o puede ser un enlazador escindible.

Los enlazadores no escindibles pueden ser, por ejemplo, alquilo, arilo, éteres o amidas, pudiendo estar opcionalmente substituido cualquiera de los que han sido precedentemente citados. A título de ejemplo, cualquiera de los precedentemente citados puede estar substituido con heteroátomos o pueden contener O-alquilo, alquilo, arilo o heteroátomos como ramificaciones. En un ejemplo, el enlazador comprende, o está esencialmente constituido por, PEG y/o poliamida.

El enlazador puede comprender un locus en el que pueda realizarse una reacción para servir la parte que contiene el grupo de captura (con inclusión de las moléculas que ha capturado y que han sido opcionalmente modificadas ulteriormente) a partir del espaciador y del soporte sólido. Tales enlazadores son denominados enlazadores escindibles, y tienen una amplia aplicación en la síntesis orgánica de fase sólida. Se conocen ejemplos de enlazadores escindibles en los que la escisión puede llevarse a cabo por medio de agentes electrófilos, de nucleófilos, por medio de una oxidación, por medio de agentes reductores, por medio de radicales libres, por medio de ácidos, por medio de bases, por acción de la luz, por medio de calentamiento o por medio de enzimas.

A título de ejemplo, los enlazadores escindibles pueden ser lábiles a los ácidos (por ejemplo la amida Rink, como la que ha sido descrita en la publicación de Rink, 1987, Tetrahedrom Lett., 28: 387 y los enlazadores sililo carentes de traza como ha sido descrito por los autores Plunkett et al., 1995, J. Org. Chem., 60: 6006-7), pueden ser lábiles a las bases (por ejemplo HMBA como se ha descrito en la publicación de los autores Atherton et al. 1981, J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1: 538), o pueden ser fotolábiles (por ejemplo, de tipo 2-nitrobencilo como se ha descrito en la publicación de los autores Homles et al., 1995, J. Org. Chem., 60: 2318-2319). Los enlazadores pueden ser más específicos y restrictivos que el tipo realizado por vía química, tales como los enlazadores sililo (por ejemplo aquellos escindidos con fluoruro como se ha descrito en la publicación de los autores Boehm et al., 1996, J. Org. Chem., 62: 6498-99), enlazadores alilo (por ejemplo, Kunz et al., 1988, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27: 711-713), y los enlazadores de sulfonamida bloqueados de manera segura (por ejemplo, como se ha descrito en la publicación de los autores Kenner et al., 1971, Chem. Commun., 12: 636-7). Los enlazadores, que pueden ser escindidos por vía enzimática, pueden ser, por ejemplo, cualquiera de los enlazadores escindibles por vía enzimática como los que han sido descritos en la publicación de los autores Reents et al., 2002, Drug Discov. Today, 7: 71-76, o cualquier derivado funcionalizado de los grupos protectores lábiles a los enzimas descritos en la revisión publicada por los autores Waldmann et al., 2001, Chem. Rev. 101: 3367-3396. Los enlazadores lábiles al calor pueden ser, por ejemplo, del tipo descrito en la publicación de los autores Meng et al., 2004, Angew. Chem. Int. Ed., 43: 1255-1260.

B. Grupo de captura

De conformidad con la presente invención, el enlazador comprende un grupo de captura, comprendiendo el grupo de captura, al menos, un grupo -NH_{2}. En un formato favorable, el grupo de captura está terminado en un grupo -NH_{2} que está enlazado con un enlazador a través de un grupo opcional R. De este modo, el grupo de captura tiene, de manera preferente, la estructura R-NH_{2}. R puede ser un simple grupo alquilo, arilo o un grupo alquilo o arilo substituido. De manera preferente, R debería contener un heteroátomo directamente enlazado con el grupo -NH_{2}, para producir estructuras del tipo enlazador-M-NH_{2}, siendo M un heteroátomo (es decir que no es carbono), de manera preferente, M se elige entre el grupo constituido por N, O y S. Son especialmente favorables aquellos compuestos en los que M es un heteroátomo, tal como en las estructuras enlazador-O-NH_{2}, enlazador-NH-NH_{2}, enlazador-CO-NH-NH_{2}, enlazador-NH-CO-NH-NH_{2}, enlazador-S(O)_{2}NH-NH_{2} y enlazador-S-NH_{2}.

A+B\rightarrowC. Métodos de captura

La captura del azúcar reductor se lleva a cabo por medio de la reacción del grupo -NH_{2} del grupo de captura con el extremo reductor de dicho azúcar reductor, es decir con el grupo aldehído o con el grupo hemiacetal. La reacción puede llevarse a cabo con cualquiera valor de pH pero está más favorecida en el intervalo de pH comprendido entre 2 y 9. Los métodos pueden comprender la adición de uno o de varios aditivos, tales como aditivos que puedan o bien facilitar o bien alterar favorablemente el equilibrio entre el aldehído de cadena abierta procedente del azúcar reductor y el hemiacetal procedente del azúcar reductor (por ejemplo compuesto A, figura 1), siendo preferida la forma del aldehído de cadena abierta. El aditivo puede estar constituido, por ejemplo, por iones metálico, por boronatos o por silicatos. La captura produce una especie enlazada con el soporte sólido a través de un doble enlace covalente (mostrado como C=N), derivándose C de la mitad de azúcar y derivándose N del grupo de captura. Por consiguiente, este azúcar inmovilizado puede encontrarse en equilibrio con su forma anular cíclica, en particular cuando el azúcar reductor sea la piranosa, entonces el azúcar inmovilizado puede encontrarse en equilibrio con su forma anular cíclica con 6 miembros (véanse, por ejemplo, los compuestos C y C' de la figura 1), pero igualmente puede encontrarse en equilibrio con su forma anular con 5 miembros si el grupo OH apropiado en el azúcar no está substituido.

La reacción de captura puede llevarse a cabo en cualquier disolvente adecuado. Un técnico común en la materia podrá identificar fácilmente un disolvente adecuado para cualquiera de los compuestos dados A y B. El disolvente puede ser elegido, por ejemplo, entre el grupo constituido por el agua, los tampones acuosos, los disolventes orgánicos y mezclas de disolventes acuosos y orgánicos. Por consiguiente, el disolvente puede ser cualquiera de los que han sido citados precedentemente con inclusión de uno o de varios aditivos tales como ácidos, bases, sales, cationes metálicos divalentes, detergentes, agentes formadores de complejos con inclusión de moléculas formadoras de complejos de inclusión tales como las ciclodextrinas o los calixarenos, los agentes formadores de quelatos (por ejemplo EDTA), los boratos, los boronatos o los silicatos.

En una realización preferida, la cantidad de soporte sólido (compuesto B de la figura 1), añadida a la reacción se ajusta de tal manera que esté presente un exceso molar de grupos de captura en relación con el azúcar reductor, de manera preferente, dicho exceso es amplio, tal como, al menos, 2 veces, de manera preferente, al menos 5 veces, de manera preferente, al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces, por ejemplo al menos 100 times o por encima de este valor. Este exceso asegura una captura más eficiente del azúcar reductor.

La reacción de captura puede ser llevada a cabo a cualquier temperatura, pero, de manera preferente, se lleva a cabo a temperaturas comprendidas entre 0 y 100ºC.

C. Lavado

Una vez que el azúcar reductor ha sido inmovilizado sobre el soporte sólido por medio de la reacción con el grupo de captura (etapa A+B\rightarrowC de la figura 1), el soporte sólido puede ser lavado para eliminar el material que no está enlazado de manera covalente. Por consiguiente, si el azúcar reductor es suministrado en una solución que contenga otros compuestos, en particular otros compuestos que no contengan grupos reactivos -NH_{2}, el azúcar reductor puede ser purificado a partir de dicha solución. Por consiguiente, está comprendido en la presente invención que el azúcar reductor sea suministrado en una forma no purificada, tal como en la forma de un extracto celular crudo o similar. De la misma manera, queda comprendido que el azúcar reductor puede ser producido a partir de una glicoproteína, de un glicolípido o de un glicósido purificado o parcialmente purificado, bajo la acción de un enzima tal como la glicosidasa o una amidasa o por medio de la escisión de un enlace glicosídico por medio de reactivos químicos.

El técnico en la materia podrá identificar fácilmente las condiciones de lavado adecuadas para un azúcar inmovilizado dado (compuesto C, figura 1). El lavado puede ser efectuado, por ejemplo, con cualquiera de los disolventes que han sido citados precedentemente, que comprenda cualquiera de los aditivos que han sido citados precedentemente además de detergentes y de agentes desnaturalizadores. El lavado puede llevarse a cabo a cualquiera temperatura, pero, de manera preferente, se lleva a cabo a temperaturas comprendidas entre 0 y 100ºC.

C\rightarrowD. Enmascaramiento

El soporte sólido copulado con el azúcar inmovilizado (tal como el compuesto C de la figura 1) contiene todavía grupos -NH_{2} libres, que no han reaccionado, y puede ser sometido a las manipulaciones únicas que acrecientan el ámbito de su utilidad.

De conformidad con la invención, a continuación de la inmovilización del azúcar reductor, los grupos -NH_{2}, que no han reaccionado, son enmascarados por medio de un agente de enmascaramiento, tal como por medio de un agente de acilación (por ejemplo anhídrido acético) o por medio de otros agentes reactivos con el nitrógeno perfectamente conocidos en la técnica, bajo condiciones en las que no reaccione el enlace C=N de C. Tras el enmascaramiento, el soporte sólido ya no comprende grupos amino libres, sino que únicamente comprende átomos de nitrógeno enmascarados (N(H)CAP) de reactividad muy baja frente a los electrófilos. El producto del enmascaramiento del compuesto C tiene, por ejemplo, la estructura general D (véase la figura 1) que contiene un grupo -R-N(H)CAP, en el que puede estar presente, o no, el (H) en función de la estructura del grupo CAP.

Por consiguiente, si el enlace C=N, que enlaza al azúcar con el soporte sólido, está reducido para dar un -NH-, será formalmente un átomo de nitrógeno SP^{3}-hibridizado en la secuencia R-NH-CH_{2}-. Por consiguiente, pueden ser dirigidas reacciones específicas a este grupo, que permitan reacciones específicas y estequiométricas en el azúcar reductor.

De manera preferente, el agente de enmascaramiento reacciona de manera específica con los grupos -NH_{2} remanentes, sin reaccionar de manera substancial con la funcionalidad C=N. Tales reactivos son perfectamente conocidos en la técnica e incluyen agentes de acilación utilizados comúnmente para la formación de enlace amida, por ejemplo anhídrido acético, otros anhídridos de ácidos alcanoicos, anhídridos aromáticos (por ejemplo anhídrido benzoico), anhídridos cíclicos (por ejemplo anhídrido succínico, anhídrido ftálico), otros ésteres activos tales como los ésteres de N-hidroxisuccinimida, los ésteres de pentaflúorfenilo y una variedad de ésteres activos de uso común para la formación del enlace amida con inclusión de la síntesis en fase sólida de enlaces péptido. Los grupos -NH_{2} pueden ser enmascarados, de manera alternativa, por medio de la adición de los ácidos libres correspondientes y un agente de activación in situ tal como la DCC, utilizada corrientemente en la formación del enlace péptido formándose in situ, en este caso, un éster activo. Pueden ser utilizados otros agentes conocidos por ser reactivos con los grupos -NH_{2} tales como los alquilisotiocianatos (R-NCS), los arilisotiocianatos (Ar-NCS), los agentes de alquilación R-L (siendo L un grupo disociable de manera típica elegido entre la serie formada por Cl, Br, I, OS(O)_{2}R', pudiendo ser R' alquilo o arilo), aceptores de Michael tales como compuestos carbonilo alfa-beta insaturados (CHR=CH-CO-, pudiendo ser R H, alquilo o arilo o alquilo o arilo substituido) o sulfonas alfa-beta insaturadas (CHR=CHS(O)_{2}R' o Ar, pudiendo ser R H, alquilo o arilo o alquilo o arilo substituido), agentes de sulfonación (tales como RSO_{2}Cl) y derivados de los mismos. De una manera similar, los grupos -NH_{2} pueden ser enmascarados por medio de una reacción con ésteres activos de carbonatos de la fórmula general RO-C(O) L, siendo L como se ha descrito precedentemente.

D\rightarrowE. Reducción

De conformidad con la invención, el enlace C=N, que enlaza el azúcar con el enlazador (por ejemplo el compuesto D de la figura 1) se reduce por medio del empleo de un agente reductor. El enlace C=N puede ser reducido con una variedad de agentes reductores perfectamente conocidos, de manera preferente, el agente reductor es capaz de saturar el doble enlace con colocación de un átomo de hidrógeno sobre el N.

Tienen un valor especial los boranos o los borohidruros, que comprenden un enlace BH, estando incluidos, por ejemplo, el NaBH_{4}, el NaCNBH_{3}, y los complejos de BH_{3} tales como la BH_{3}-piridina, el BH_{3}-dimetilsulfuro o similares. De la misma manera, pueden ser empleados los silanos, con la estructura R_{3}SiH, tales como los silanos que comprenden enlaces SiH, como los agentes que pueden transferir hidrógeno tales como las diimidas, o los catalizadores de hidrogenación homogéneos o los catalizadores de hidrogenación que comprende un enlace metal-H.

La reducción da como resultado un azúcar reactivo que contiene la estructura azúcarCH-NH- preferentemente enlazada con un soporte sólido a través de un enlazador y, opcionalmente, a través de un espaciador. De manera general, si el azúcar reductor era un aldehído, la reducción dará como resultado un compuesto con la estructura azúcarCH_{2}-NH-. Si el azúcar reductor era una cetona, entonces la reducción dará como resultado un compuesto con la estructura azúcarCH-NH-.

Los productos de la reducción tienen, por ejemplo, la estructura general E (figura 1) que contiene un átomo de N formalmente hibridizado SP^{3}.

C\rightarrowC_{red}\rightarrowE

En un método alternativo, que no forma parte de la invención, está invertido el orden de las etapas de enmascaramiento y de reducción. La reducción del enlace C=N en el compuesto C (figura 1) puede quedar afectada por cualquiera de los reactivos descritos en D\rightarrowE precedente para producir un compuesto con la estructura C_{red} (figura 1). De la misma manera, la reducción puede ser llevada a cabo in situ, lo cual significa que puede ser añadido un agente reductor (tal como NaCNBH_{3}) al soporte sólido (por ejemplo el compuesto E) simultáneamente con el azúcar reductor de tal manera que se reduzca el enlace C=N a las formas que producen también C_{red}. La muestra que comprende el azúcar reductor puede ser incubada entonces simultáneamente con el soporte sólido y con el azúcar reductor. Por consiguiente, se llevará a cabo la reducción de los enlaces C=N (etapa v) inmediatamente después de la reacción del azúcar reductor con el grupo -NH_{2} del soporte sólido (etapa iii). Los grupos -NH_{2} libres en C_{red} pueden ser enmascarados por medio del empleo de cualquiera de los reactivos descritos precedentemente en C\rightarrowD bajo condiciones que no provoquen la reacción con la mitad azúcarCH-NH-. En particular, en esta alternativa es preferente que el agente de enmascaramiento reaccione de manera preferente, con grupos amino primarios sobre el grupo amino secundario. De la misma manera, es preferente que la temperatura de la reacción y el tiempo se ajusten para proporcionar una reacción con grupos amino primarios con preferencia con respecto a los grupos amino secundarios. De manera virtual, todos los compuestos que reaccionan con grupos amino, reaccionan de una manera más rápida con los grupos amino primarios que con los grupos amino más substituidos pero esto ocurre, de manera especial, dichos compuestos son estéricamente grandes, tales como por ejemplo los ésteres activos de benzoilo, los ésteres activos del ácido isopropanoico, los ésteres activos de pivaloilo, el anhídrido Boc o la azida Boc y similares. Se han descrito los compuestos adecuados y las condiciones para la reacción con grupos amino primarios con preferencia con respecto a los grupos amino secundarios, en la publicación de los autores Greene et al. 1999, Grupos Protectores en Síntesis Orgánica -Protective Groups in Organic Synthesis-, 3rd. Ed., Chapter 7, pp. 503-653. Otros agentes de enmascaramiento muy preferentes son los ésteres NHS o los ésteres de pentaflúorfenilo (PFP) estéricamente impedidos o los ésteres de tetraflúorfenilo
(TFP).

E\rightarrowF. Adición de marcadores TAGs

El compuesto E, figura 1, obtenido por cualquiera de las vías que han sido indicadas precedentemente, contiene sólidos enlazados con un átomo de nitrógeno enmascarado (N(H)CAP) con reactividad muy baja frente a los electrófilos y un átomo de nitrógeno formalmente hibridizado SP^{3} en la secuencia azúcarCH_{2}-NH-R. La reacción de E con grupos funcionales reactivos con el nitrógeno, adecuados (preferentemente el grupo funcional reactivo con el nitrógeno es un electrófilo moderado) resulta, por consiguiente, en la adición exclusiva, o casi exclusiva, del electrófilo al átomo de nitrógeno SP^{3} adicionando efectivamente una estructura molecular, que se ha descrito aquí como marcador "TAG", u otro agente de derivatización sobre el nitrógeno con el que está enlazado el azúcar. El producto de la adición de un marcador TAG está mostrado como F en la figura 1.

A través de la descripción, el término "grupo reactivo con el nitrógeno" se utiliza para describir la reactividad a través de un nitrógeno formalmente hibridizado SP^{3}, tal como un compuesto con una estructura R-NH-R', por ejemplo aminas, siendo R y R' independientemente entre sí, alquilo o arilo (opcionalmente substituido) o compuestos en los que R' es un heteroátomo tal como O, o N, enlazado con -NH- tal como en los derivados de hidroxilamina (R-NH-OR') o en los derivados de hidrazina (R-NH-NH-R').

La identidad del agente de derivatización (por ejemplo un marcador TAG), es decir la estructura química específica del agente de derivatización, puede elegirse por el usuario. Para la adición al nitrógeno SP^{3} en E, el agente de derivatización (por ejemplo el marcador TAG) debe comprender a su vez un grupo funcional reactivo con el nitrógeno designado por "X" en la figura 1. De manera preferente, el marcador TAG debe contener un electrófilo, o debe estar enlazado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno X. De manera preferente, el agente de derivatización tiene la estructura general TAG-X (véase la figura 1), siendo X un grupo funcional reactivo con el nitrógeno. De manera preferente, X es cualquier electrófilo moderado que reaccione mal con los grupos -OH presentes en el azúcar. Tales electrófilos moderados incluyen los isotiocianatos (TAG-NCS), los ésteres activos (TAG-C(O)-L), siendo L un grupo disociable empleado usualmente en la formación del enlace amida tal como en la síntesis de enlaces péptido, los ácidos carboxílicos (TAG-COOH) que pueden ser activados para dar ésteres activos in situ con ayuda de métodos utilizados usualmente en la formación del enlace amida tal como en las síntesis de los enlaces péptido, los agentes de alquilación (TAG-L), siendo L un grupo disociable elegido, de manera preferente, pero no de manera exclusiva, entre la serie formada por Cl, Br, I, OS(O)_{2}R, pudiendo ser R alquilo o arilo, los marcadores TAGs comprenden aceptores de Michael (que contienen de manera típica la secuencia -CR=CH-C(O)-) o sulfonas alfa-beta insaturadas (-CR=CH-S(O)2-) y derivados de cualquiera de los aldehídos o cetonas, que han sido citados precedentemente, que puedan reaccionar con el grupo azúcarCH_{2}-NH-amino por aminación por reducción, o grupos haloaromáticos substituidos portando el anillo aromático grupos electronegativos tal como grupos nitro, por ejemplo como en el reactivo de Sanger constituido por 1-flúor-2,4-dinitrobenceno o los reactivos de 4-halo-7-nitro-2-oxa-1,3-diazoles (NBD) siendo el halógeno preferido F o Cl.

El marcador TAG puede ser, por ejemplo, una mitad fluorescente, un marcador TAG para espectrometría de masa, un primer participante en el enlace capaz de enlazarse con un segundo participante en el enlace, un ácido nucleico en el que cualquiera de los marcadores TAGs precedentemente citados comprenda, de manera preferente, o esté enlazado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno. En particular, el marcador TAG puede ser cualquiera de los marcadores TAGs, que han sido descritos con mayor detalle aquí más adelante, pudiendo estar enlazado cualquiera de estos marcadores TAGs con cualquiera de los grupos funcionales reactivos con el nitrógeno que han sido citados precedentemente.

Un ejemplo de un compuesto que puede ser obtenido por medio de la adición de un marcador TAG al compuesto E está mostrado como F en la figura 1.

F. Lavado

En una realización el azúcar marcado (por ejemplo el compuesto F, figura 1) es lavado como paso previo a cualquier otra manipulación. De este modo, es eliminada una cantidad del marcador TAG no enlazado. El lavado puede ser realizado fácilmente puesto que el azúcar marcado está inmovilizado sobre un soporte sólido.

Tras el lavado, únicamente estará presente el marcador TAG, enlazado de manera covalente. De este modo, la cantidad del marcador TAG se encontrará en correlación con la cantidad del azúcar inmovilizado. Por consiguiente, por medio de la determinación de la presencia del marcador TAG, puede ser determinada la cantidad del azúcar inmovilizado. Si se inmovilizó esencialmente todo el azúcar reductor en una muestra dada, los métodos permiten, en un aspecto, la determinación de la cantidad del azúcar reductor presente en la muestra.

El técnico en la materia podrá identificar fácilmente las condiciones de lavado adecuadas para un azúcar marcado, inmovilizado, dado (por ejemplo el compuesto F, figura 1). El lavado puede ser efectuado, por ejemplo, con un disolvente elegido entre el grupo constituido por el agua, los tampones acuosos, los disolventes orgánicos y disolventes acuosos y orgánicos mezclados. El disolvente puede ser, por consiguiente, cualquiera de los que han sido mencionados precedentemente con inclusión de uno o de varios aditivos tales como las sales, los cationes metálicos divalentes, los detergentes, los agentes formadores de complejos con inclusión de las moléculas que forman complejos de inclusión tales como las ciclodextrinas o los calixarenos, los agentes formadores de quelatos (por ejemplo EDTA), los boratos, los boronatos o los silicatos. Por otra parte, el disolvente puede comprender, opcionalmente, detergentes y agentes desnaturalizantes. El lavado puede ser llevado a cabo a cualquier temperatura, pero, de manera preferente, se lleva a cabo a temperaturas comprendidas entre 0 y 100ºC.

H. Escisión del enlazador escindible

Cuando el enlazador utilizado sea un enlazador escindible, los métodos de la invención pueden comprender una etapa de escisión de dicho enlazador escindible liberando, de este modo, el azúcar capturado. De manera preferente, la escisión se lleva a cabo después de la adición de un agente de derivatización, tal como un marcador TAG (agregado por medio del empleo de TAG-X) o un inmovilizador-Y (agregada por medio del empleo de X-inmovilizador-Y) al grupo -NH- del azúcar inmovilizado. De este modo, puede ser liberado un azúcar marcado (compuesto G o compuesto J en la figura 1) en solución a partir de F o a partir de I, respectivamente. G está constituido por una porción de azúcar que porta un marcador TAG sobre el átomo de nitrógeno que está enlazado con el residuo (si está presente) del enlazador que permanece después de la escisión, y que se ha denominado, para simplificar, como azúcar-TAG. J está constituido por una porción de azúcar que porta un inmovilizador sobre el átomo de nitrógeno, que está enlazado con el resido (si está presente) que permanece después de la escisión. El inmovilizador puede estar opcionalmente enlazada con un marcador TAG.

Sin embargo, el enlazador escindible puede ser escindido en el momento que se desee durante el procedimiento.

Si un marcador TAG, agregado al compuesto E, tiene propiedades espectroscópicas beneficiosas, tales como propiedades fluorescentes, la cantidad del azúcar-TAG (compuesto G, figura 1) puede ser cuantificada en solución. Por otra parte, el azúcar-TAG (compuesto G, figura 1) puede ser sometido a técnicas de separación analítica tales como la HPLC o la CE, y cuando esté presente más de un azúcar, los componentes individuales pueden ser separados, puede ser determinada su proporción relativa y pueden ser identificados cuando estén disponibles patrones auténticos, y pueden ser cuantificados. Por consiguiente, pueden ser empleados como ligandos que pueden enlazarse con proteínas de reconocimiento de los carbohidratos, por consiguiente, que proporcionan información sobre la estructura del carbohidrato o de la proteína.

Si el marcador TAG es una estructura que proporciona al azúcar-TAG propiedades que sean beneficiosas para la práctica de la espectrometría de masas, bien debido al aumento de la sensibilidad, a la simplificación de la interpretación espectral o bien que permitan la realización del análisis diferencial por medio de la utilización de isótopos codificadores, entonces el azúcar-TAG liberado en la solución puede ser analizado favorablemente por medio de la espectrometría de masas.

F. Marcadores TAGs con propiedades espectroscópicas

En una realización preferida de la invención, el marcador TAG agregado, por ejemplo, al compuesto E o al compuesto H tiene propiedades espectroscópicas beneficiosas. De manera preferente, el marcador TAG con las propiedades espectroscópicas beneficiosas es añadido, por ejemplo, al compuesto E por medio del empleo de un derivado con la estructura X-TAG, siendo X un grupo funcional nitrógeno reactivo, tal como cualquiera de los grupos funcionales nitrógeno reactivos que han sido descritos aquí precedentemente en la sección "E\rightarrowF adición de marcadores TAGs". Se entenderá por propiedades espectroscópicas beneficiosas que el marcador TAG puede ser visualizado fácilmente, por ejemplo, por medio de una espectrometría. De este modo, el marcador TAG puede ser detectado de manera espectroscópica. En una realización preferida, el marcador TAG es un marcador TAG fluorescente. Ejemplos de este marcaje incluyen la reacción con isotiocianatos (por ejemplo FITC, TRITC), con ésteres activos, con aceptores de Michael, con sulfonilos alfa-beta-insaturados (específicamente con vinilsulfonas) y con agentes de alquilación, tales como los halogenuros de alquilo y los tosilatos, un compuesto halo-arilo tal como, por ejemplo, el reactivo de Sanger.

El producto de la adición de dicho marcador TAG (por ejemplo el compuesto F de la figura 1) puede absorber y puede reemitir luz, que puede ser detectada. El número de tales marcadores TAGs presente en F reflejará el número de moléculas de azúcar A añadido a B y capturado para producir C. Por consiguiente, el número de moléculas de azúcar reductor (A) originalmente presente en una muestra puede ser estimado por medio de la fluorescencia del compuesto F, a condición de que el soporte sólido proporcionado (compuesto B) comprenda un exceso de grupos de captura. De la misma manera, pueden ser usados marcadores TAGs diferentes de las moléculas fluorescentes. Éstos pueden incluir marcadores TAGs radioactivos, marcadores TAGs fosforescentes, marcadores TAGs quimioluminiscentes, marcadores TAGs absorbedores de los UV, nanopartículas, puntos cuánticos, compuestos coloreados, marcadores TAGs electroquímicamente activos, marcadores TAGs activos por infrarrojos, marcadores TAGs activos en la espectroscopía Raman o difusión Raman, marcadores TAGs detectables por medio de la microscopía de fuerza atómica o marcadores TAGs que comprendan átomos metálicos o clusters de los mismos.

Si el soporte sólido del compuesto F es un sensor, tal como un sensor de ondas acústicas de superficie o un sensor de resonancia de plasma de superficie, entonces la adición de una especie de este tipo que se enlace específicamente con el marcador TAG puede dar como resultado la producción de una señal que es proporcional al marcador TAG y, por consiguiente, al número de moléculas de azúcar. Un ejemplo consiste en que el marcador TAG sea un residuo de biotina, introducido comúnmente por medio de la reacción de con un éster activo de biotina. La adición de una proteína avidina al compuesto E, cuando el marcador TAG sea un residuo de biotina, puede dar como resultado una señal que es detectada fácilmente y que es indicada por el sensor. Otros ejemplos de sensores que pueden ser utilizados para detectar el enlace de segundos participantes en el enlace para con los marcadores TAGs inmovilizados incluyen, pero no están limitados a, los sensores piezoeléctricos, los sensores amperométricos, los sensores de espectroscopía de fluorescencia de plasma de superficie, los sensores de interferometría de polarización dual (DPI), los sensores ópticos consultados por longitud de onda (WIOSs), los sensores de impedancia, los sensores acopladores de rejilla de guiaondas ópticas, los sensores acústicos y los sensores calorimétricos.

Una vez que el azúcar ha sido enlazado con un marcador TAG con propiedades espectroscópicas, pueden ser determinadas entonces dichas propiedades espectroscópicas. Las propiedades ópticas pueden ser determinadas para azúcares inmovilizados todavía sobre el soporte sólido (tal como para el compuesto F o I de la figura 1) o para azúcares liberados en solución (por ejemplo el compuesto G o J de la figura 1). Esto último requiere que el enlazador sea un enlazador escindible. En función de la naturaleza del marcador TAG con propiedades espectroscópicas, pueden ser determinadas dichas propiedades por medio de la utilización de métodos convencionales, tal como la espectrometría. De este modo, los métodos de la invención pueden comprender la etapa de detección por espectrometría del marcador TAG enlazado con el azúcar.

F. Marcadores TAGs para espectrometría de masas

En una realización de la invención, el marcador TAG es un marcador TAG para espectrometría de masas. Dicho marcador TAG para espectrometría de masas se añade preferentemente por medio de un reactivo con la estructura X-TAG, siendo X un grupo funcional reactivo con el nitrógeno, tal como cualquiera de los grupos funcionales reactivos con el nitrógeno que han sido citados aquí precedentemente en la sección "adición de marcadores TAGs". El término "marcadores TAGs para espectrometría de masas" tal como se usa aquí, se refiere a aquellas moléculas que mejoren la detección y la caracterización estructural de los productos por medio de la espectrometría de masas, de manera preferente, tras escisión a partir del soporte sólido (como se ha descrito aquí precedentemente en la sección "escisión del enlazador escindible"). Ejemplos a este respecto incluyen la introducción de una etiqueta de bromo que imparte un patrón de isotopo característico en el espectro de masas. A título de ejemplo, puede ser añadida una etiqueta de bromo, de este tipo, por medio de la adición de isotiocianato de p-bromofenilo al compuesto E para dar un compuesto con la estructura F en la que el marcador TAG contiene un átomo de bromo. Se ha descrito la utilidad de las etiquetas que contienen bromo en la espectrometría de masas de los carbohidratos, por ejemplo, en la publicación de los autores Li et al., 2003, Rapid. Commun. Mass Spectr., 17: 1462-1466. Otro ejemplo incluye la introducción de moléculas que impartan o bien cargas positivas o bien cargas negativas para reforzar la detección bien en un modo de ión positivo o bien en un modo de ión negativo de separación masa/carga. Otro ejemplo incluye la introducción de moléculas que mejoren la realización o la sensibilidad en electrospray, MALDI u otras técnicas de ionización comunes en la práctica de la espectrometría de masas. De igual modo, otro ejemplo incluye la introducción de moléculas estables etiquetadas con isótopos que permiten la cuantificación de las especies etiquetadas por medio de la espectrometría de masas. Los métodos adecuados para el etiquetado con isótopos han sido evaluados, por ejemplo, en la publicación de los autores Tao et al., 2003, Current Opinion in Biotechnology, 14: 110-118.

Una vez que el azúcar ha sido enlazado con un marcador TAG para espectrometría de masas, el azúcar marcado (F o G o I o J, figura 1) puede ser detectado entonces por medio de la espectrometría de masas. La espectrometría de masas puede llevarse a cabo en azúcares aún inmovilizados sobre el soporte sólido (tal como para los compuestos F e I de la figura 1), pero, de manera preferente, se lleva a cabo en azúcares liberados en solución, por ejemplo por medio de la escisión de un enlazador escindible (por ejemplo para los compuestos G o J de la figura 1). De este modo, es preferente que el enlazador sea un enlazador escindible. El técnico en la materia puede llevar a cabo una espectrometría de masas adecuada en función de la naturaleza del marcador TAG para espectrometría de masas. De este modo, los métodos de la invención pueden comprender la etapa de detección por medio de la espectrometría de masas del azúcar enlazado con el marcador TAG para espectrometría de masas.

F. Marcadores TAGs participantes en el enlace

En otra realización preferida de la presente invención, el marcador TAG es un primer participante en el enlace, capaz de interaccionar de manera específica con un segundo participante en el enlace, siendo añadido dicho primer participante en el enlace, por ejemplo, al compuesto E (o al compuesto H) a través de la reacción con un reactivo con la estructura X-TAG, siendo X un grupo funcional reactivo con el nitrógeno (por ejemplo un "agente de derivatización"). El segundo participante en el enlace está preferentemente etiquetado con una etiqueta detectable, tal como un tinte, una etiqueta fluorescente, un isótopo radioactivo, un metal pesado o un enzima. El primer participante en el enlace puede ser, por ejemplo, una molécula que sea un ligando para una proteína adecuada en la detección del ligando inmovilizado resultante, bien de manera estequiométrica o por medio de una amplificación subsiguiente. El primer participante en el enlace puede ser una proteína y el segundo participante en el enlace puede ser un ligando para dicha proteína.

Ejemplos de participantes en el enlace incluyen pares de ligando-proteína usados comúnmente en los ensayos ELISA. A título de ejemplo, el compuesto E puede hacerse reaccionar con un reactivo de biotinilación y, tras lavado, puede detectarse la biotina, ahora inmovilizada, con estreptavidina (o con otras avidinas) que está directamente etiquetada con una etiqueta detectable, tal como con un marcador TAG fluorescente, un isótopo reactivo o un metal pesado, o con estreptavidina (o con otras avidinas) que esté conjugada con un enzima tal como peroxidasa de rábano que puede catalizar una reacción química que da por resultado la producción de una señal que puede ser detectada por medio de una espectrometría.

Otros ejemplos de participantes en el enlace son pares anticuerpo-epitopo. De este modo, uno de los participantes en el enlace puede comprender un epitopo y el otro participante en el enlace puede ser un anticuerpo capaz de enlazar dicho epitopo con elevada afinidad, preferentemente un anticuerpo que enlace de manera específica dicho epitopo.

F. Marcadores TAGs de ácido nucleico

En otra realización de la invención el marcador TAG es un ácido nucleico. De conformidad con la invención, los ácidos nucleicos pueden ser cualquier ácido nucleico tal como el ADN o el ARN, o análogos de los mismos tales como ALN, APN, AHN o similares. De manera preferente, el ácido nucleico es el ADN, de manera preferente, es un oligómero de ADN. De manera preferente, dicho ADN está derivatizado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno, tal como cualquiera de los grupos funcionales reactivos con el nitrógeno que han sido mencionados aquí precedentemente en la sección "adición de marcadores TAGs". Es preferente que la secuencia de dicho marcador TAG de ácido nucleico sea conocida o que al menos sea parcialmente conocida, lo que permitirá al técnico en la materia detectar fácilmente dicho marcador TAG por medio de la utilización de métodos estándar.

El marcador TAG de ácido nucleico puede tener cualquier longitud deseada, preferentemente puede tener al menos una longitud que permita una detección específica. De este modo, el ácido nucleico preferente tiene, al menos, 6 nucleótidos, de manera más preferente tiene, al menos, 10 nucleótidos, por ejemplo tiene una longitud comprendida entre 10 y 5.000 nucleótidos.

Tras adición de un marcador TAG de ácido nucleico reactivo con el nitrógeno al azúcar, puede ser detectado entonces el ácido nucleico, tal como los oligómeros de ADN, directamente sobre el soporte sólido por medio de una hibridización, para dar los ácidos nucleicos complementarios o para dar los ácidos nucleicos esencialmente complementarios. Se entenderá por ácidos nucleicos esencialmente complementarios, un ácido nucleico que puede ser hibridizado para dar un ácido nucleico dado bajo condiciones estrictas como se han descrito, por ejemplo, por los autores Sambrook et al., 1989, en "Clonación Molecular/Un Manual de Laboratorio -Molecular Cloning/A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor. De manera preferente, dichos ácidos nucleicos complementarios pueden ser enlazados a una etiqueta detectable. Dicha etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, una etiqueta fluorescente o un radioisótopo o un enzima, de manera preferente, es una etiqueta fluorescente. De este modo, el marcador TAG del ácido nucleico puede ser detectado, por ejemplo, por medio de la hibridización de su ADN complementario etiquetado de manera fluorescente. De manera alternativa, un marcador TAG de ácido nucleico puede ser amplificado por medio de la utilización de métodos convencionales, conocidos en la técnica, tales como la reacción en cadena de polimerasa -Polymerase Chain Reaction- (RCP) o la reacción en cadena de ligasa. De este modo, el marcador TAG de ácido nucleico inmovilizado puede ser sometido a reacciones RCP para amplificar el oligómero de ADN inmovilizado que puede ser medido en solución por medio de una variedad de técnicas perfectamente conocidas para la cuantificación en RCP. Este proceso es particularmente válido para la detección indirecta y para la cuantificación de cantidades muy bajas de azúcarCH-NH-enlazador-espaciador-sólido presente en el soporte sólido. De manera alternativa, el azúcar enlazado con el ADN puede ser liberado en solución por medio de la escisión del enlazador y, a continuación, puede ser amplificado en solución, por ejemplo, por medio de una RCP o puede ser detectado en solución en virtud de la hibridización específica para dar los ácidos nucleicos esencialmente complementarios.

Inmovilizadores E\rightarrowH

El agente de derivatización, de conformidad con la presente invención, puede ser, por consiguiente, un inmovilizador copulado con, al menos, dos grupos funcionales. Tales reactivos bifuncionales tienen, en general, la estructura X-inmovilizador-Y o X-inmovilizador-Y_{p}, siendo X un grupo funcional reactivo con el nitrógeno y siendo Y un segundo grupo funcional reactivo y siendo Y_{p} un grupo funcional reactivo latente o un grupo Y reactivo protegido. El producto de la reacción del compuesto E con X-inmovilizador-Y (o X-inmovilizador-Y_{p}) puede tener, por ejemplo, la estructura general del compuesto H de la figura 1. El segundo grupo Y funcional reactivo puede ser reactivo con cualquiera de los tipos de reactivos utilizados en las síntesis en fase sólida. A título de ejemplo, el N en el azúcarCH-NH-enlazador-espaciador-sólido puede hacerse reaccionar con reactivos bifuncionales (X-inmovilizador-Y) en los que una función reacciona con establecimiento de un enlace con el nitrógeno inmovilizado (el grupo X funcional nitrógeno reactivo) y la otra función bien puede ser un segundo grupo Y funcional reactivo o puede ser convertido en el mismo (por ejemplo por medio de desenmascaramiento, de desprotección o por medio de otra reacción).

El inmovilizador puede ser cualquiera inmovilizador conveniente, por ejemplo alquilo, alquenilo o alquinilo (que puede ser lineales, ramificados o cíclicos), arilo o cualquiera de los enlaces amida, que están comprendidos en la descripción precedentemente indicada (NC(O)R) o grupos de etilenglicol (-CH_{2}CH_{2}-O-) o puede estar substituido con heteroátomos y sus derivados.

El segundo grupo Y funcional reactivo puede ser elegido, por ejemplo, entre el grupo constituido por los tioles, los grupos carboxilo, los grupos carboxilo activados, los disulfuros, los disulfuros activados, los agentes de alquilación, los alquenos, los alquinos, los aldehídos, las cetonas y las azidas. El agente de alquilación puede ser, por ejemplo, un halogenuro de alquilo o un grupo carbonilo alfa-halo. A título de ejemplo, Y_{p} puede estar constituido por aminas protegidas o por derivados protegidos de cualquiera de los grupos Y que han sido citados precedentemente. De este modo, Y_{p} puede elegirse, por ejemplo, entre el grupo constituido por las aminas protegidas, los tioles protegidos, los grupos carboxilo protegidos, los aldehídos protegidos y las cetonas protegidas. Los grupos reactivos protegidos se denominan en este caso Y_{p}, pudiendo ser desprotegido Y_{p} para proporcionar el grupo Y funcional reactivo. Los grupos protectores adecuados pueden encontrarse en la publicación de los autores Greene et al., 1999, "Grupos Protectores en Síntesis Orgánica -Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd. Ed., John Wiley y Sons, New York, de manera específica para los grupos carbonilo (capítulo 4, páginas 293 - 368), para los grupos carboxilo (capítulo 5, páginas 369 - 453), para los tioles (capítulo 6, páginas 454 - 493) y para los grupos amino (capítulo 7, páginas 494 - 653). Los ejemplos de las aminas protegidas incluyen, pero no están limitados a, aquellos de uso común en las síntesis de péptidos en fase sólida, tales como Fmoc, Boc, Alloc, p-nitrobenciloxicarbonilo, tritilo y tritilo substituido, o-nitrobenciloxicarbonilo, N-sulfenilo o azido. Sin embargo, el segundo grupo funcional reactivo puede estar constituido por cualquiera de los grupos funcionales Y, o por los grupos funcionales protegidos (Y_{p}) que se han hecho reaccionar sobre fase sólida, tales como los ejemplos perfectamente conocidos en la técnica de síntesis en fase sólida y de copulación de moléculas pequeñas con soportes sólidos y superficies sólidas. Estos grupos funcionalizados pueden capturar entonces directamente, o después de su desprotección para dar especies reactivas, un segundo agente de derivatización, que comprenda un grupo funcional (Z) capaz de reaccionar con el segundo grupo funcional Y.

Cuando Y, en el compuesto H, contenga un grupo NH_{2}, o cuando la desprotección pueda ser llevada a cabo de tal manera, que contenga un grupo NH_{2}, entonces puede utilizarse cualquiera de los reactantes reactivos con amina descritos en E-se convierte en-F (por ejemplo, isotiocianatos) para añadir un marcador TAG para producir compuestos con la estructura general I (figura 1).

El segundo agente de derivatización preparado para reaccionar con cualquiera de los grupos funcionales Y en el compuesto H (figura 1) puede estar constituido, por ejemplo, por marcadores TAGs espectroscópicos o por cualquiera de los marcadores TAGs mencionados precedentemente en la sección E\rightarrowF, comprendiendo, o estando derivatizados con un grupo funcional (Z), capaz de reaccionar con Y, dichos marcadores TAGs, en lugar de estarlo con un grupo reactivo con nitrógeno. Por consiguiente, éstos pueden ser moléculas pequeñas tales como medicamentos, agentes de imagen, péptidos, proteínas, enzimas y otras moléculas que presenten actividades biológicas, ácidos nucleicos tales como ADN o ARN.

De manera preferente, dichas moléculas pequeñas, agentes de imagen, péptidos o ácidos nucleicos comprenden, o están enlazados con, un grupo funcional Z, capaz de reaccionar con el segundo grupo Y funcional reactivo dado. El técnico en la materia podrá fácilmente identificar los grupos funcionales adecuados Y y Z. El segundo agente de derivatización puede ser, por consiguiente, cualquiera de los marcadores TAGs que han sido mencionados precedentemente, que han sido descritos precedentemente en las secciones "marcadores TAGs con propiedades espectroscópicas", "marcadores TAGs para espectrometría de masas", "marcadores TAGs participantes en el enlace" y "marcadores TAGs de ácido nucleico", conteniendo dichos marcadores TAGs, en lugar de un grupo funcional nitrógeno reactivo, un grupo funcional Z capaz de reaccionar con el grupo funcional Y. El grupo funcional enlazado con el inmovilizador en H (figura 1) puede ser, por consiguiente, un grupo latente o protegido (Y_{p}) que pueda ser convertido por medio de una reacción química o por medio de una reacción enzimática en Y que puede hacerse reaccionar a continuación como se ha descrito precedentemente. Si este grupo latente puede ser convertido en una amina primaria o secundaria (es decir que Y comprenderá la estructura -NH_{2} o -NH-), entonces puede añadirse cualquiera de las especies amina-reactivas descritas precedentemente en E\rightarrowF para producir compuestos marcados, de la estructura I.

Los métodos de la invención pueden comprender, por consiguiente, la etapa de

vii.: la reacción del grupo -NH- del azúcar reactivo con un reactivo bifuncional con la estructura X-inmovilizador-Y o X-inmovilizador-Y_{p}, siendo X un grupo funcional reactivo con el nitrógeno y siendo Y un segundo grupo funcional reactivo y siendo Y_{p} un grupo funcional latente que puede ser convertido o que puede ser desprotegido para formar un grupo Y funcional reactivo, obteniéndose, de este modo, un azúcar enlazado de manera covalente con dicho inmovilizador-Y o con dicho inmovilizador-Y_{p}.

Esta etapa se lleva a cabo, de manera preferente, por medio del empleo del compuesto E de la figura 1 como material de partida. De este modo, esta etapa puede generar, por ejemplo, un compuesto de la estructura general H de la figura 1.

En realizaciones de la invención en las que el reactivo bifuncional tiene la estructura X-inmovilizador-Y_{p}, es preferible entonces que el método comprenda además la etapa de conversión o de desprotección de Y_{p} para obtener un grupo Y funcional reactivo. Esta etapa puede ser llevada a cabo antes o después de la reacción de X con -NH-, de manera preferente, se lleva a cabo después de la reacción de X con -NH-.

De manera adicional, los métodos de la invención pueden comprender, así mismo, las etapas de

viii.: el suministro de un segundo agente de derivatización que comprenda un grupo funcional (Z) capaz de reaccionar con Y,

ix.: la reacción de los grupos funcionales Z e Y, enlazándose en este caso de manera covalente el segundo agente de derivatización con el azúcar a través de un inmovilizador y del primer agente de derivatización.

De manera alternativa, los métodos de la invención pueden comprender, así mismo, las etapas de:

viii.: el suministro de una partícula elegida entre el grupo constituido por las células eucariotas, las células procariotas, los organismos microbianos, las micelas, los fagos, los virus y las nanopartículas, comprendiendo la partícula un grupo funcional (Z) capaz de reaccionar con Y,

ix.: la reacción de los grupos funcionales Z e Y, enlazándose, de este modo, de manera covalente la partícula con el azúcar a través del inmovilizador y del agente.

Por consiguiente, la etapa ix. puede generar un compuesto de la estructura general I esquematizada en la figura 1, cuando el marcador TAG sea una partícula. En el caso en que el enlazador sea un enlazador escindible, los métodos pueden comprender, así mismo, la etapa de la escisión del enlazador, generándose de este modo, por ejemplo, un compuesto de la estructura general J de la figura 1.

El producto de la reacción de azúcarCH-NH-enlazador-espaciador-sólido (por ejemplo el compuesto E de la figura 1) con reactivos bifuncionales X-inmovilizador-Y por ejemplo tiene la estructura general H y puede contener, o puede hacerse de modo que contenga, otros grupos reactivos que pueden formar enlaces covalentes con conjuntos mayores que las moléculas: por ejemplo las bacterias, los fagos, las levaduras, las micelas, los virus, las nanopartículas o las células eucariotas o las células procariotas. La escisión del enlazador da como resultado a continuación especies de la fórmula general azúcarCH-N(conjunto)-enlazador, añadiéndose efectivamente el azúcar al conjunto. De este modo, el azúcar puede ser transferido, en principio, desde un soporte sólido hasta un conjunto.

Tratamiento enzimático

Cuando el soporte sólido sea biocompatible, es decir cuando permita el contacto con macromoléculas biológicas tales como los enzimas sin alteración significativa de sus actividades, entonces la molécula de azúcar inmovilizada puede hacerse actuar por medio de enzimas que alteren su estructura. La molécula de azúcar inmovilizada puede ser, por ejemplo, un compuesto con cualquiera de las estructuras generales C, C_{red}, D, E, F, H o I de la figura 1.

Ejemplos no limitativos de soportes sólidos biocompatibles incluyen vidrio, PEGA, SPOCC o geles polisacáridos. En el caso de esta realización, es preferente que el enlazador sea relativamente largo y, de este modo, es preferente que el enlazador comprenda al menos 2 átomos, de manera preferente, al menos 6 átomos, de una manera más preferente el enlazador comprende una cadena de, al menos, 6 átomos, por ejemplo la cadena más larga de átomos en el enlazador tiene una longitud de, al menos, 6 átomos, tal como una longitud comprendida entre 6 y 1.000 átomos. De igual modo, es preferente que el enlazador sea hidrófilo.

De la misma manera, es posible poner en contacto los azúcares liberados en solución por escisión del enlazador escindible, tal como los compuestos G o J de la figura 1 con macromoléculas biológicas, tales como enzimas.

Los enzimas pueden pertenecer a cualquiera de las clases que pueden actuar sobre los carbohidratos, por ejemplo las glicosidasas, las glicosiltransferasas, y los enzimas que modifican los grupos alcohólicos por acilación, por fosforilación, por sulfatación o por oxidación. De manera alternativa, si los azúcares están ya substituidos en los grupos -OH, por ejemplo están acilados, fosforilados o sulfatados, entonces las deacilasas, las fosfatasas y las sulfatasas pueden alterar sus estructuras. De este modo, los métodos de la invención pueden comprender, además, la etapa de la puesta en contacto del azúcar (por ejemplo cualquiera de los compuestos C, D, E, F, G, H, I o J de la figura 1) con uno o varios enzimas elegidos entre las clases de las glicosiltransferasas, las sulfatasas, las fosforilasas, las sulfotransferasas, las fosfotransferasas, las glicosintasas y las transglicosidasas, convirtiéndose, de este modo, dicho azúcar en una nueva estructura. En una realización preferida, los métodos comprenden, así mismo, la etapa de la puesta en contacto del azúcar (por ejemplo cualquiera de los compuestos C, D, E, F, G, H, I o J de la figura 1) con una o varias glicosidasas, generándose, de este modo, un nuevo azúcar reductor, a condición de que el primer azúcar sea un substrato de dicha o de dichas glicosidasa(s).

Un ejemplo incluiría la incubación de azúcar-C=N-enlazador-espaciador-sólido no enmascarado (por ejemplo, los compuestos C de la figura 1), que contienen todavía grupos -NH_{2} libres, con una exoglicosidasa que provoque la disminución de la longitud del azúcar en un residuo monosacárido. La escisión del residuo monosacárido conduce a un oligosacárido enlazado con el soporte sólido que es una unidad de azúcar más corta, y produce un azúcar reductor que puede ser capturado por el mismo soporte sólido o por un soporte sólido diferente, tal como un soporte sólido de la estructura general B en la figura 1, que puede ser sometido a continuación a cualquiera de las manipulaciones descritas precedentemente en B para llegar a J.

De este modo, los métodos de la invención pueden comprender, así mismo, las etapas de

a): el suministro de uno o de varios enzimas que puedan actuar sobre los carbohidratos,

b): la puesta en contacto del azúcar con uno o varios de dichos enzimas.

Estas etapas pueden ser llevadas a cabo en cualquier momento durante el procedimiento. Los enzimas pueden ser cualquiera de los enzimas descritos en la presente sección.

En una realización particular, el enzima es una glicosidasa y el método descrito en este caso precedentemente en la sección del sumario comprende las etapas adicionales de:

iii.a): el suministro de una o varias glicosidasas que puedan actuar sobre los carbohidratos,

iii.b): la puesta en contacto del azúcar con una o varias de dichas glicosidasas, generándose, de este modo, un nuevo azúcar reductor, a condición de que el primer azúcar sea un substrato para dicha o para dichas glicosidasa(s).

iii.c): la inmovilización del o de los nuevos azúcares reductores generados sobre un soporte sólido.

Las etapas iii.a - iii.c pueden llevarse a cabo a continuación de la etapa iii. del método esquematizado en la sección "sumario de la invención" descrita aquí precedentemente. Sin embargo, las etapas iii.a hasta iii.c pueden ser llevadas a cabo también a continuación de las etapas iv, v, vi o vii de dicho método. Por consiguiente, las etapas iii.a - iii.c pueden ser llevadas a cabo sobre cualquiera de los azúcares inmovilizados que están ejemplificados por medio de las estructuras C, D, E, F, H o I de la figura 1.

En particular, dichos nuevos azúcares reductores generados pueden ser inmovilizados con grupos -NH_{2} libres del mismo soporte sólido o sobre otro soporte sólido. Dicho soporte sólido adicional puede estar, por ejemplo, bien no substituido o bien puede portar un patrón de referencia inmovilizado. Es preferente que dicho soporte sólido adicional sea un soporte sólido tal como se ha descrito en este caso precedentemente, y que el soporte sólido esté enlazado con un enlazador (opcionalmente a través de un espaciador), comprendiendo dicho enlazador un grupo de captura (véase la descripción detallada de los enlazadores, de los grupos de captura y de los espaciadores descritos aquí precedentemente).

La reducción y el etiquetado fluorescente del producto glicosidasa y del monosacárido liberado sobre el mismo soporte sólido o sobre un soporte sólido diferente tienen un valor particular con el fin de obtener información estructural. Un ejemplo específico incluye la captura de Gal-GlcNAc-Gal-Glc (lacto-N-tetraosa, LNT) sobre NH_{2}-enlazador-espaciador-sólido de la estructura B (figura 1), incubación de la LNT capturada e inmovilizada (un ejemplo de un compuesto de estructura C de la figura 1) con beta-galactosidasa seguido por la captura de la galactosa liberada sobre el mismo soporte sólido (C) para proporcionar una mezcla de Gal-GlcNAc-Gal-GlcC=N-enlazador-espaciador-sólido que no ha reaccionado, y los productos de la reacción que están constituidos por GlcNAc-Gal-GlcC=N-enlazador-espaciador-sólido y Gal-C=N-enlazador-espaciador-sólido. El enmascaramiento, la reducción, el marcaje por fluorescencia con TRITC y la escisión a partir del sólido, como se han descrito en la etapa F\rightarrowG precedente, permite entonces la confirmación de que la LNT inmovilizada tiene un residuo beta-galactosa terminal, por medio de una comigración de los productos trisacáridos y monosacáridos con patrones conocidos.

Con la presente invención puede emplearse una gran cantidad de glicosidasas adecuadas, que han sido descritas en la técnica, por ejemplo cualquiera de las glicosidasas descritas en la publicación US 5,100,778 o en la publicación WO 92/19974.

Si el soporte sólido es biocompatible, entonces los grupos -NH_{2}, que no han reaccionado, en el azúcar-C=N-enlazador-espaciador-sólido (por ejemplo el compuesto C, figura 1) pueden ser enmascarados (por ejemplo con anhídrido acético como se ha descrito en C\rightarrowD precedente) y, a continuación, puede ser expuestos a enzimas activos con los carbohidratos, o pueden ser reducidos ulteriormente, para dar el azúcarCH-NH-enlazador-espaciador-sólido (como se ha descrito en la sección D\rightarrowE precedente) y, a continuación, pueden ser expuestos a los enzimas activos con los carbohidratos. De manera alternativa, el compuesto C, de la figura 1, puede ser reducido para dar C_{red} y, a continuación, puede ser expuesto a los enzimas activos con los carbohidratos. El azúcarCH-NH-enlazador-espaciador-sólido (por ejemplo el compuesto E, figura 1) puede ser marcado a continuación (como se ha descrito en la sección E\rightarrowF precedente) para proporcionar azúcarCH-N(TAG)-enlazador-espaciador-sólido (por ejemplo el compuesto F, figura 1), y, a continuación, puede ser expuesto a los enzimas activos con los carbohidratos. En cualquiera de estos procedimientos, el producto de la reacción enzimática, que permanece enlazado con el soporte sólido, puede ser manipulado a continuación, de conformidad con los métodos de la invención, o puede ser escindido por reacción en el enlazador, para análisis ulteriores. Cualquier producto de la reacción enzimática que de por resultado la escisión de fragmentos del azúcar inmovilizado aparecerá en solución, en la que puede ser sometido a una investigación ulterior por medio del empleo de técnicas establecidas de química analítica o, en aquél caso en que sea en sí mismo un azúcar reductor, puede ser sometido a las manipulaciones descritas para el azúcar genérico A en la figura 1.

Los azúcares individuales pueden ser detectados por medio de la cromatografía gaseosa de capilaridad (GC), por medio de la cromatografía líquida supercrítica en microcolumna (SFC), por medio de la cromatografía líquida en microcolumna (LC), por medio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), por medio de la cromatografía capilar de alta resolución (HPCE), por medio de la cromatografía con intercambio de iones o por medio de la espectrometría de masas. La detección de los azúcares individuales puede hacerse antes o después del etiquetado con un agente de derivatización y puede hacerse bien en solución o bien en fase sólida.

\vskip1.000000\baselineskip

Agentes de detección

En una realización de la invención, el método comprende las etapas de

viii.: la puesta en contacto del azúcar con un agente de detección capaz de asociarse con dicho azúcar,

ix.: la detección del agente de detección.

De manera preferente, dicho azúcar está inmovilizado sobre un soporte sólido tal como se ha descrito aquí precedentemente y, por consiguiente, puede ponerse en contacto, por ejemplo, un compuesto de la estructura general C, C_{red}, D, E, F, H o I de la figura 1 con dicho agente de detección. De la misma manera, es posible que dicho azúcar haya sido liberado a partir del soporte sólido por medio de la escisión de un enlazador escindible, pudiéndose poner en contacto un compuesto de la estructura general G o J con dicho agente de detección.

El agente de detección puede ser cualquier agente capaz de asociarse con dicho azúcar. Los agentes de detección preferentes son compuestos capaces de asociarse con azúcares con una afinidad mucho mayor que con cualquier otro compuesto, tales como compuestos que tengan, al menos, una afinidad para los azúcares 2 veces mayor, tales como los que tengan una afinidad para los azúcares, al menos, 5 veces mayor que para cualquier otro compuesto.

Por otra parte, es preferente que dicho agente de detección pueda ser detectado de manera directa o indirecta por un método conocido por el técnico en la materia. Por ejemplo, el propio agente de detección puede ser, por ejemplo, un compuesto fluorescente o coloreado. El agente de detección puede ser un compuesto para el cual estén disponibles métodos de detección sencillos.

En una realización de la invención, el agente de detección comprende un arilboronato o un heteroarilboronato, en el que la mitad arilo está substituida con un grupo con actividad espectroscópica tal como un marcador TAG fluorescente o cualquier otro marcador TAG detectable, descrito aquí precedentemente en la sección "F. marcadores TAGs con propiedades espectroscópicas".

En otra realización, el agente de detección es un polipéptido, de manera preferente, es un polipéptido elegido entre el grupo constituido por las lectinas, las selectinas y otras proteínas, toxinas, receptores, anticuerpos y enzimas enlazadores de los carbohidratos. Cuando el agente de detección sea un polipéptido, dicho polipéptido puede estar copulado con una etiqueta detectable, tal como un enzima o un compuesto fluorescente. De igual modo, el polipéptido puede ser detectado por medio de la ayuda de anticuerpos o de compuestos con una afinidad elevada similar.

Ejemplos

La siguiente descripción ilustra ejemplos de los métodos de la invención y no debe ser considerada como limitativa de la invención. A menos que se deduzca del contexto claramente, de otra manera, las letras mayúsculas A, B, C, C_{red}, D, E, F, G, H, I y J se refieren a las estructuras generales esquematizadas en la figura 1.

Parte experimental 1. Ejemplos de A: azúcares reductores usados en el presente trabajo

Las estructuras de los azúcares reductores capturados por los soportes sólidos B están mostradas en las figura 2. Éstas incluyen los monosacáridos D-Glc (1) y D-Gal (2), el disacárido constituido por la N-acetillactosamina (LacNAc, 3), el trisacárido constituido por la maltotriosa (maltotriosa G3, 4) y el tetrasacárido constituido por la lacto-N-tetraosa (LNT, 5). Las muestras 6 y 7 contienen mezclas de los monosacáridos Fuc:Man:GalNAc en las relaciones de 2:3:1 y de 1:3:2, respectivamente. La muestra 8 contiene una mezcla 1:1 de Gal (2) y LNT (5). La muestra 9 contiene una mezcla aproximadamente equimolar de maltobiosa (G2), de maltotriosa (G3), de maltotetraosa (G4), de maltopentaosa (G5), de maltohexaosa (G6) y de maltoheptaosa (G7). La muestra 10 está constituida por cadenas oligosacáridas N-enlazadas liberadas a partir de ribonucleasa B (Sigma) por medio de la acción de la PNGasa F (producto número 1365177, Boehringer Mannheim GmbH, Alemania).

2. Patrones de referencia para enlazadores, espaciadores y azúcar marcado 2.1 Enlazador y espaciador

La síntesis del enlazador escindible y la estructura del espaciador están mostradas en la figura 3 y descritas más adelante.

12: Ácido N-Fmoc-4-aminooximetil-benzoico

Se añadió Fmoc-Cl (2,8 g, 0,011 moles) a una solución de hidrocloruro del ácido 4-aminooximetil-benzoico 11^{1} (2,0 g, 0,010 moles) en dioxano (20 ml) y solución semisaturada de Na_{2}CO_{3} (20 ml), y la mezcla se agitó durante 2 horas. Se añadió acetato de etilo (100 ml) y el pH de la fase acuosa se ajustó a 1 - 3 por medio de una adición cuidadosa de HCl(_{conc.}). La mezcla se vertió en un embudo de separación y se aisló la fase orgánica, se lavó una vez con agua (100 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el disolvente se eliminó en el evaporador rotativo para dar un aceite que se solidificó tras reposo. El producto en bruto se purificó por medio de una cromatografía en columna flash (éter de petróleo, acetato de etilo, AcOH 60:40:1). Rendimiento: 3,5 g (92%) ^{1}H-RMN (250 MHz, DMSO-d6)

\delta = 4,05 (1 H, t, J = 6,3 Hz), 4,27 (2H, d, J = 6,3 Hz), 4,51 (2H, s), 7,08-7,22 (6H, m), 7,46 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,66 (2H, d, J = 7,1 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,4 Hz), 10,29 (1 H, br. s), 12,78 (1 H, br. s). ^{13}C-RMN (63 MHz, DMSO-d6)

\delta = 47,04, 66,03, 76,91, 120,51, 125,41, 127,45, 128,03, 128,89, 129,33, 129,63, 130,82, 141,19, 144,01, 157,12, 167,48. MS (ES) m/z = 389 (MH^{+}).

13: Reacción del ácido N-Fmoc-4-aminooximetil-benzoico (12) con bromoacetato de b-butilo

Se disolvió el ácido N-Fmoc-4-aminooximetil-benzoico (12) (1,0 g, 2,57 mmoles) en DMF (15 ml) y Cs_{2}CO_{3} (0,42 g, 1,28 mmoles, Aldrich) seguido por agitación durante 5 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió bromoacetato de terc.-butilo (0,55 g, 2,28 mmoles, Fluka) y la mezcla se calentó a 50ºC durante 30 minutos y, a continuación, se enfrió de nuevo hasta la temperatura ambiente. Se añadió CH_{2}Cl_{2} (70 ml) y la mezcla se vertió en un embudo de separación y se lavó con solución semisaturada de NaHCO_{3} (3 \times 50 ml) y, a continuación, con agua (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}. El disolvente se eliminó bajo presión reducida para proporcionar un producto en bruto en forma de un aceite. Tras cromatografía en columna flash (acetato de etilo al 20-40% en éter de petróleo) se obtuvo un sólido blanco con un rendimiento de 1,15 g (89%). ^{1}H-RMN (250 MHz, CDCl_{3})

\delta = 1,37 (9H, s), 4,06 (1 H, t, J = 6,7 Hz), 4,37 (2H, d, J = 6,7 Hz), 4,61

^{1}El material se preparó como se ha descrito precedentemente: Deles, J. et al.; PJCHDQ; Pol. J. Chem.; EN; 53; 1979; 1025-1032 (2H, s), 4,67 (2H, S), 7,11-7,18 (2H, m), 7,22-7,27 (4H, m), 7,43 (2H, d, J = 7,5 Hz), 7,60 (2H, d, J = 7,3 Hz), 7,75 (1 H, s), 7,93 (2H, dd, J = 1,7 Hz, 6,6 Hz). ^{13}C-RMN (63 MHz, CDCl_{3})

\delta = 26,31, 45,28, 59,95, 65,52, 75,99, 80,84, 118,30, 123,27, 125,41, 126,10, 126,93, 127,23, 128,30, 139,29, 139,58, 141,73, 155,70, 163,94, 165,15. MS (ES) m/z = 542 (MK^{+}).

14: Preparación del enlazador

Se agitó el sólido blanco (13) (1,15 g), obtenido en el experimento precedente, en una solución al 50% de CF_{3}CO_{2}H en oCH_{2}Cl_{2} (30 ml) durante 3 horas y se evaporó a sequedad. El residuo oleaginoso se recogió en una pequeña cantidad de acetato de etilo y el producto se precipitó en forma de un polvo blanco fino por medio de la adición lenta de hexanos a la solución. El producto se filtró y se lavó un par de veces con hexanos y se secó bajo vacío para dar el producto deseado en un rendimiento prácticamente cuantitativo (1,0 g, 98%). ^{1}H-RMN (250 MHz, DMSO-d6)

\delta = 4,07 (1H, t, J = 6,3 Hz), 4,28 (2H, d, J = 6,3 Hz), 4,53 (2H, s), 4,62 (2H, S), 7,07-7,14 (2H, m), 7,17-7,26 (4H, m), 7,46 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,66 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,77 (2H, d, J = 8,3 Hz), 10,30 (1 H, br. s). ^{13}C-RMN (63 MHz, DMSO-d6)

\delta = 47,04, 61,62, 66,04, 76,79, 120,50, 125,41, 127,46, 128,03, 129,05, 129,69, 141,19, 142,20, 144,00, 157,12, 165,50, 169,47. MS (ES) m/z = 446 (M-H^{+}). HRMS (ES) calculado (C_{25}H_{21}NO_{7}Na^{+}): 470.1210 encontrado: 470.1224.

2.2 Síntesis de los patrones monosacáridos etiquetados con tetrametilrodamina (TMR) de la estructura general G

Se usaron los 8 monosacáridos D-Glc, D-Gal, D-Man, D-Xyl, D-GlcNAc, D-GalNAc, L-Fuc y D-GlcA. El esquema de síntesis general está mostrado en la figura 4 para D-Gal (2), y la estructura del producto (21) está mostrada en la figura 4 y se ha mostrado abreviadamente como GalCH_{2}-N(R)-TMR. Las estructuras de los ocho derivados monosacáridos azúcarCH_{2}-N(R)-TMR preparados están mostrados en la figura 5.

16: Reacción del ácido N-Fmoc-4-aminooximetil-benzoico (12) con bromuro de bencilo

Se disolvió el ácido N-Fmoc-4-aminooximetil-benzoico (12) (2,0 g, 5,14 mmoles) en DMF (30 ml) y se añadió Cs_{2}CO_{3} (0,84 g, 2,57 mmoles) agitándose a continuación durante 5 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió bromuro de bencilo (1,05 g, 6,17 mmoles) y la mezcla se continuó agitando durante otros 30 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió agua (200 ml) y la mezcla se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (3 x 50 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, se evaporaron a sequedad para dar un aceite que se utilizó sin otra caracterización en el experimento siguiente.

17: Eliminación del grupo Fmoc a partir del (N-Fmoc-4-aminooximetil)-benzoato de bencilo

Se agitó el producto en bruto (16), obtenido en el experimento precedente, con piperidina al 20% en DMF (20 ml) durante 1 minuto y se hizo pasar a través de un lecho de gel de sílice para eliminar por succión la mayoría de la DMF y de la piperidina. El producto se eluyó a partir del lecho de gel de sílice con una mezcla de acetato de etilo y de éter de petróleo (1:1) y se concentró en el evaporador rotativo. Se obtuvo una purificación adicional por medio de una cromatografía en columna flash (acetato de etilo, éter de petróleo 1:1) para dar un aceite claro con un rendimiento de 1,16 g (88%, dos etapas). ^{1}H-RMN (250 MHz, CDCl_{3}) \delta = 4,66 (2H, s), 5,29 (2H, s), 7,25-7,39 (7H, m), 7,99 (2H, dd, J= 1,7 Hz, 6,5 Hz). ^{13}C-RMN (63 MHz, CDCl_{3}) \delta = 67,11, 77,59, 128,32, 128,57, 128,66, 129,02, 129,19, 130,32, 136,48, 143,47, 166,64. MS (MALDI-TOF) m/z = 258 (MH^{+}).

Procedimiento general para la preparación de patrones monosacáridos etiquetados con TMR, ejemplificado por medio de la preparación de patrón de galactosa.

18: Formación de oxima entre galactosa y (4-aminooximetil)-benzoato de bencilo

Se disolvió galactosa (90 mg, 0,50 mmoles) en una mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 3 ml) y se añadió (17) (128 mg, 0,50 mmoles). La mezcla se calentó durante 3 horas a 55ºC y se vertió en agua (30 ml) y se enfrió sobre un baño de hielo lo que provocó la cristalización del producto en forma de cristales blancos finos. El producto se aisló mediante filtración, se lavó con agua (2 \times 10 ml) y se secó bajo vacío para dar 170 mg (83 %) del producto en forma de isómero sencillo. ^{1}H-RMN (250 MHz, DMSO-d6) \delta = 3,38-3,55 (4H, m), 3,67-3,75 (1 H, m), 4,27-4,33 (1 H, m), 5,12 (2H, s), 5,37 (2H, s), 7,36-7,52 (7H, m), 7,56 (1 H, d, J = 7,6 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,1 Hz). ^{13}C-RMN (63 MHz, DMSO-d6) \delta = 63,40, 66,52, 68,37, 69,21, 70,04, 72,63, 74,27, 128,25, 128,33, 128,49, 128,91, 129,13, 129,67, 136,52, 144,22, 154,00, 165,78. MS (MALDI-TOF) m/z = 442 (MNa^{+}).

19: Reducción de la "oxima de galactosa" (18) con BH_{3}-piridina

La oxima (18) (150 mg, 0,36 mmol) obtenida en el experimento previo se disolvió en metanol (10 ml). Se añadió BH_{3}-piridina (225 \mul, solución 8 M en piridina, 1,80 mmoles, Fluka) y CCl_{3}CO_{2}H (0,50 ml, solución acuosa al 50%) y la mezcla se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se vertió cuidadosamente en una solución semisaturada de Na_{2}CO_{3} (20 ml) y se extrajo con una mezcla 1 : 1 de éter y de hexanos (2 x 10 ml) para eliminar el exceso de reactivo de borano. El pH se ajustó ahora a 2-3 por medio de la adición cuidadosa de HCl(_{conc.}) y el volumen se redujo a la mitad del original en el evaporador rotativo. Durante la evaporación se separó el producto en forma de un sólido cristalino de un blanco bonito, que se separó por filtración, se lavó con agua (2 \times 10 ml), con éter (2 \times 10 ml) y, finalmente, el producto se secó bajo vacío para dar 112 mg (75%) de producto puro. ^{1}H-RMN (250 MHz, DMSO-d6) \delta = 3,31-3,33 (2H, m), 3,40-3,55 (5H, m), 3,74 (1H, t, J = 6,3 Hz), 5,24 (2H, s), 5,37 (2H, s), 7,36-7,50 (5H, m), 7,60 (2H, d, J = 8,2 Hz), 8,04 (2H, d, J = 8,2 Hz). ^{13}C-RMN (63 MHz, DMSO-d6) \delta = 53,34, 63,40, 64,73, 66,68, 69,37, 70,19, 70,89, 74,20, 128,36, 128,53, 128,92, 129,47. 129,87, 130,27, 136,41, 139,73, 165,62. MS (MALDI-TOF) m/z = 422 (MH^{+}).

\vskip1.000000\baselineskip

20: Etiquetado del producto reducido (19) por medio del empleo de TRITC

Se disolvió una pequeña cantidad del producto (19) (4,2 mg, 10 \mumoles) preparado en el experimento previo, en DMF (1 ml) y se añadió TRITC (4,4 mg, 10 \mumoles). Tras agitación durante 1 hora, se añadió agua (10 ml) y el producto precipitado se disolvió de nuevo por medio de adición de HCl(_{conc.}) y la solución rojo claro se aplicó en una columna pequeña C-18 Sep-Pak para enlazar el producto. La columna se lavó varias veces con abundante agua (volumen total 30 ml) seguido por la liberación del producto con metanol (5 ml). El volumen se redujo aproximadamente en 0,5 ml y el material se purificó por medio de una cromatografía en columna flash sobre gel de sílice con una mezcla de CH_{2}Cl_{2}, metanol, agua, AcOH (70:20:9:1). La identidad del compuesto se confirmó por medio de la espectroscopía de masas (MS) y se usó directamente en el experimento siguiente. MS (MALDI-TOF) m/z = 865 (MH^{+}).

\vskip1.000000\baselineskip

21: Hidrólisis del grupo protector del éster para dar el patrón final

Se disolvió todo el material (20), obtenido en el experimento previo, en LiOH 1 M (1 ml) y se agitó durante 30 minutos y, a continuación, se añadió agua (10 ml) y se acidificó con HCl_{(conc.)} para dar una solución rojo claro. El producto se desalinizó sobre una pequeña columna C-18 Sep-Pak por medio de lavados repetidos con agua (volumen total 30 ml) seguido de la liberación del producto con metanol (5 ml). El volumen se redujo aproximadamente a 0,5 ml y el producto se purificó por medio de una cromatografía en columna flash sobre gel de sílice con una mezcla de cloroformo, metanol, agua (120:85:20). La identidad del compuesto fue confirmada por medio de una MS de elevada resolución y se analizó su pureza usándose CE. HRMS (ES) calculado (C_{39}H_{43}N_{4}O_{11}S): 775.2649 encontrado: 775.2700.

Se prepararon patrones de los monosacáridos remanentes (glucosa, manosa, N-acetilglucosa, N-acetilgalactosamina, xilosa, fucosa y ácido glucurónico) por medio del empleo del mismo protocolo que ha sido descrito para la galactosa con rendimientos y pureza similares. De la misma manera, se confirmaron las identidades de los compuestos por medio de la espectroscopía de masas de alta resolución (véase la tabla más adelante). Cada compuesto dio un pico único en la CE y todos los 8 compuestos (21-28) pudieron ser resueltos en CE (figura 10).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

2

\vskip1.000000\baselineskip

3. Ejemplos de B: preparación y nomenclatura de los soportes sólidos

Se prepararon soportes sólidos de la estructura general B (figura 1) por medio de la utilización tanto de resina PEGA (PEGA 1900, Versamatrix A/S) así como de vidrio de poro controlado (CPG). B^{P} indica una resina PEGA en la que el enlazador está enlazado directamente con los grupos amino sobre la resina comercial sin un espaciador. B^{0}, B^{1} y B^{2} indican CPG en la que el enlazador ha sido enlazado a través de 0, de 1 y de 2 espaciadores respectivamente con el vidrio aminopropilado (AMP-CPG, CPG-Biotech). Las estructuras de los cuatro soportes sólidos están mostradas en la figura 6.

\vskip1.000000\baselineskip

3.1 B^{P} (resina PEGA de estructura general B)

Se lavó varias veces con DMF 1 g de resina comercial PEGA 1900 (carga de grupos amino: 0,23 mmol/g), hinchada en metanol, para asegurar la eliminación completa del metanol. Se mezclaron el enlazador (14) (308 mg, 0,69 mmoles), TBTU (207 mg, 644 mmoles) y DIPEA (119 mg, 0,92 mmoles) en DMF (10 ml) y se dejó que se verificase una activación previa durante 5 minutos antes de efectuar la adición de la mezcla a la resina. Al cabo de 3 horas se eliminaron los reactivos mediante succión y la resina se lavó con CH_{2}Cl_{2} (5 x 20 ml).

Se tomó una pequeña porción de la resina para el ensayo Kaiser que confirmó el éxito de la copulación del enlazador con la resina. De la misma manera, se determinó la carga del enlazador sobre la resina como se ha descrito en el ejemplo 3.3 y se encontró que aproximadamente era de 0,20 mmol/g por medio de la comparación con la curva patrón. El grupo protector de hidroxilamina (Fmoc) se eliminó ahora a partir de la resina remanente por medio de un tratamiento con piperidina al 20% en DMF (15 ml durante 2 minutos y 15 ml durante 18 minutos) seguido por un lavado extenso con DMF (5 \times 20 ml) y CH_{2}Cl_{2} (7 \times 20 ml). La resina se secó bajo alto vacío durante 24 horas para dar la resina PEGA final (B^{P}) que se usó para todos los experimentos subsiguientes.

\vskip1.000000\baselineskip

3.2 B^{0}, B^{1} y B^{2} (vidrio de poro controlado, CPG) B^{0}: Copulación del enlazador 14 con CPG-NH_{2}

Se lavó AMP CPG (250 mg, carga = 50,1 \mumol/g, 0,0125 mmoles. Millipore, producto no. AMP1400B) con DMF (3 \times 2 ml), con DIPEA al 50% en DMF (3 \times 2 ml), y con DMF (3 \times 2 ml). Las perlas se trataron con una mezcla de (14) (17 mg, 0,038 mmoles), TBTU (12 mg, 0,037 mmoles) y DIPEA (8,6 \mul, 0,05 mmoles) en DMF a la temperatura ambiente durante la noche. Las perlas se lavaron con DMF (3 \times 2 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml) y se trataron con Ac_{2}O al 50% en piridina durante 15 minutos a la temperatura ambiente, se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml), DMF (3 \times 2 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml) y se secaron. Se determinó un valor de carga de 14,2 \mumol/g como se ha descrito para B^{1}. El grupo Fmoc se eliminó por medio de la utilización de piperidina al 20% en DMF durante 2 \times 10 minutos a la temperatura ambiente y se lavó con DMF (3 \times 2 ml), con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml) y con etanol (3 \times 2 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml). La resina se secó en vacío.

\vskip1.000000\baselineskip

B^{1}: Copulación de un espaciador 15 y de un enlazador 14 con CPG-NH_{2}

Se lavó AMP CPG (2,26 g, carga = 50,1 \mumol/g, 0,11 mmoles. Millipore, producto no. AMP1400B) con DMF (3 \times 2 ml), con DIPEA al 50% en DMF (3 \times 2 ml), y con DMF (3 \times 2 ml). Las perlas se trataron con una mezcla de 15 (168 mg, 0,34 mmoles), TBTU (105 mg, 0,33 mmoles) y DIPEA (78 \mul, 0,45 mmoles) en DMF durante 3 horas a la temperatura ambiente. La resina se lavó con DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se trató con Ac_{2}O al 50% en piridina durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se trataron con TFA al 50% en CH_{2}Cl_{2} durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), DMF (3 \times 5 ml), y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml). Se lavó 1/3 de las perlas (2,5 ml, aproximadamente 0,70 g, aproximadamente 35 \mumoles) con DMF (3 \times 5 ml). Se trataron con (14) (47 mg, 0,11 mmoles), con TBTU (33 mg, 0,10 mmoles), y con DIPEA (34 \mul, 0,20 mmoles) en DMF durante la noche a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con DMF (3 x 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se trataron con Ac_{2}O al 50% en piridina durante 15 minutos a la temperatura ambiente, se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se secaron. Se determinó la carga (29 \mumol/g) y las perlas se trataron con piperidina al 20% en DMF a la temperatura ambiente durante 2 \times 10 minutos. Las perlas se lavaron con DMF (3 \times 2 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml), y etanol (3 \times 2 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 2 ml), y se secaron.

\vskip1.000000\baselineskip

B^{2}: Copulación de dos espaciadores 15 y enlazadores 14 con CPG-NH_{2}

Se lavaron 2/3 de la resina con un espaciador procedente de B^{1} (5,5 ml, aproximadamente 1,54 g, aproximadamente 77 \mumoles) con DMF (3 \times 5 ml). Las perlas se trataron con una mezcla de 15 (114 mg, 0,23 mmoles), TBTU (72 mg, 0,22 mmoles), y DIPEA (53 \mul, 0,31 mmoles) en DMF durante la noche a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se trataron con Ac_{2}O al 50% en piridina durante 15 minutos a la temperatura ambiente, se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se trataron con CF_{3}CO_{2}H al 50% en CH_{2}Cl_{2} durante 2 horas a la temperatura ambiente, se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), DMF (3 \times 5 ml), y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml). La mitad de la cantidad de las perlas (aproximadamente 42 \mumoles) se lavó con DMF (3 \times 5 ml) y se trató con (14) (56 mg, 0,13 mmoles), TBTU (39 mg, 0,12 mmoles), y DIPEA (29 \mul, 0,17 mmoles) a la temperatura ambiente durante la noche. Las perlas se lavaron con DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml) y se trataron con Ac_{2}O al 50% en piridina durante 15 minutos a la temperatura ambiente, se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml) y se secaron. Se determinó un valor de carga de 36 \mumol/g como se ha descrito para B^{1}. La resina se cubrió con piperidina al 20% en DMF a la temperatura ambiente durante 2 \times 10 minutos, se lavó con DMF (3 \times 5 ml), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), etanol (3 \times 5 ml) 3 \times CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml), y se secó en vacío.

\vskip1.000000\baselineskip

3.3 Ejemplo de la estimación de la carga de los grupos de captura sobre soportes sólidos de la estructura general B (figura 1)

Se prepararon siete concentraciones de Fmoc-Gly-OH en piperidina al 20% en DMF (0,0 mM, 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM). Se midió la absorbancia UV del fulveno liberado a 290 nm por medio de la utilización de tecnología sin goteo (Saveen Werner Nanodrop, Model: ND-1000, Serial No: 0911). Se representó la absorbancia frente a la concentración dando una curva lineal con una pendiente de 0,581 mM^{-1}.

\newpage

Se trataron perlas de B^{1}, protegidas con Fmoc (4,8 mg), con piperidina al 20% en DMF (200 \mul) durante 10 minutos. Se midió la absorbancia UV a 290 nm con un valor de 0,410 y se calculó la concentración del fulveno liberado

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

La carga se calculó por medio de la utilización de la fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Carga de B^{1}:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

4. Ejemplos de A+B\rightarrowC, y procesamiento de C 4.1 Variación de las condiciones de captura por medio de la utilización de glucosa a título de azúcar reductor y de B^{2} a título de soporte sólido

Se examinaron diversos disolventes, temperaturas y aditivos con el fin de encontrar las condiciones preferentes para la captura del azúcar reductor sobre los soportes sólidos de estructura general B, para producir C. Se utilizó D-Glc como compuesto modelo, puesto que la cantidad de Glc no capturada en solución pudo ser estimada fácilmente con elevada sensibilidad por medio del empleo del ensayo Amplex Red de la firma Molecular Probes. De este modo, la cantidad de Glc capturada se calculó como la cantidad añadida menos la cantidad remanente en solución tras incubación.

Se trataron 15-20 mg de perlas (B^{2}) con una solución de glucosa bajo diferentes condiciones. Una vez concluido el tiempo de la reacción se eliminó el sobrenadante y se estimó la cantidad de la glucosa sin reaccionar por medio de la utilización del estuche de ensayo Amplex Red Glucosa/Glucosa Oxidasa (A-22189, Molecular Probes).

Captura de glucosa por medio de la utilización de diferentes disolventes, concentraciones, temperaturas y tiempos de reacción

6

\vskip1.000000\baselineskip

4.2 Captura, procesamiento y análisis de azúcares reductores representativos sobre B^{P}

A continuación se utilizan las siguientes designaciones para describir compuestos de las estructuras generales C, C_{red}, D, E, F, G, H, I y J (figura 1). En primer lugar se ha dado la letra particular que describe la estructura particular sometida a consideración, por ejemplo C o E. El siguiente superíndice numérico se refiere al soporte sólido que fue utilizado entre los cuatro soportes sólidos mostrados en la figura 6. De este modo, a título de ejemplo, si B^{P} (figura 6) es usado para capturar un azúcar, entonces el producto tendrá la estructura general C que se designa a continuación como C^{P}. El número siguiente se refiere a la muestra, que ha sido capturada, de entre las diez muestras de azúcares reductores, que están mostrados en la figura 2. De este modo, C^{P}2 se refiere al producto de la resina PEGA B^{P} que ha capturado galactosa (compuesto 2 de la figura 2). De la misma manera, D^{2}5 se refiere al producto obtenido cuando el soporte sólido B^{2} ha capturado el tetrasacárido LNT (5, figura 2) para dar C^{2}5, y, a continuación, ha sido enmascarado ulteriormente para dar D^{2}5.

4.2.1 Captura y procesamiento del azúcar reductor 3 C^{P}3: Captura de LacNAc (3) sobre B^{P}

Se preparó una solución madre mediante la disolución inicial de LacNAc (3) (38 mg, 0,10 mmoles) en agua (1,0 ml) y dilución subsiguiente de la muestra 10 veces con una mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 9 ml) para dar una solución madre 10 mM de LacNAc (3). A continuación se tomaron 40 \mul (0,40 \mumoles) de la solución madre y, a continuación, se diluyeron con la mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 150 \mul) y el conjunto se añadió a B^{P} (10 mg, 2 \mumoles) y se dejó incubar a 60ºC durante la noche. La resina se lavó varias veces: DMF (5 \times 0,5 ml), metanol (5 \times 0,5 ml) y se usó directamente en los experimentos siguientes.

D^{P}3: Enmascaramiento de C^{P}3 con anhídrido acético

Se trataron todas las resinas, obtenidas en el experimento C^{P}3, con una mezcla de Ac_{2}O y de metanol 1:1 (0,4 ml) durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con DMF (5 \times 0,5 ml), con agua (2 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y se usaron directamente en el experimento siguiente.

E^{P}3: Reducción de D^{P}3 con BH_{3}-piridina

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento D^{P}3, con metanol (0,1 ml) y, a continuación, se añadió BH_{3}-piridina (20 \mul, 8 M en piridina) seguido por la adición de ácido CCl_{3}CO_{2}H al 50% en agua (40 \mul). Se dejó que la reacción se produjese durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó con DMF (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml). La resina fue usada directamente en la etapa siguiente.

F^{P}3: Marcaje de E^{P}3 por medio de la utilización de TRITC

Se disolvió TRITC (0,89 mg, 2 \mumoles) en DMF (0,2 ml) y la solución se añadió a la resina (E^{P}3) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se llevó a cabo un lavado extenso con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 0,5 ml) para eliminar el exceso de tinte. La resina fue usada directamente en la etapa siguiente.

G^{P}3: Escisión de LacNAc marcada con TMR a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo F^{P}3, con una solución 1 M de LiOH (0,2 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. Se recogió el líquido procedente de las perlas mediante succión y, a continuación, se llevó a cabo el lavado de las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y el pH se ajustó a neutralidad con AcOH al 10%. La solución rojo obscuro se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (50 mg), se lavó con agua (2 ml) y se eluyó con metanol (0,5 ml). Se confirmó la identidad de los productos por medio de la MS (ES) m/z = 978 (MH^{+}) y se registró el perfil por medio de la CE (figura 11).

4.2.2 Captura y procesamiento del azúcar reductor 5 C^{P}5: Captura de lacto-N-tetraosa (5) sobre B^{P}

Se preparó una solución por disolución de (5) (5,0 mg, 7,1 \mumoles) en una mezcla de DMSO y de AcOH 7:3 (3 ml). Esta mezcla se añadió a la resina PEGA B^{P} (175 mg, 35 \mumoles) y se incubó a 60ºC durante la noche. La resina se lavó varias veces: DMF (5 \times 5 ml), metanol (5 \times 5 ml) y se usó directamente en los experimentos siguientes.

D^{P}5: Enmascaramiento de C^{P}5 con anhídrido acético

Se trataron todas las resinas obtenidas en el experimento C^{P}5 con una mezcla de Ac_{2}O y de metanol 1:1 (5 ml) durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con DMF (5 \times 5 ml), con agua (2 \times 5 ml), con metanol (5 \times 5 ml) y se usaron directamente en el experimento siguiente.

E^{P}5: Reducción de D^{P}5 con BH_{3}-piridina

Se hinchó la resina obtenida en el experimento D^{P}5 en metanol (2 ml) y, a continuación, se añadió BH_{3}-piridina (200 \mul, 8 M en piridina) por adición de ácido CCl_{3}CO_{2}H al 50% en agua (400 \mul). Se dejó que se produjese la reacción durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó con DMF (5 \times 5 ml), con metanol (5 \times 5 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 5 ml). Finalmente se secó la resina bajo vacío durante la noche y se almacenó a temperatura ambiente para un utilización ulterior.

F^{P}5: Marcaje de E^{P}5 con MS-tag que contiene bromo

Se lavó una pequeña cantidad de la resina seca E^{P}5 (10 mg, 0,4 \mumoles) con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 0,5 ml) con el fin de hinchar la resina. Se preparó una solución por disolución de isotiocianatos de 4-bromofenilo (0,85 mg, 4 \mumoles) en DMF (0,2 ml) y la mezcla se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó la resina con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 0,5 ml). La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}5: Escisión de lacto-N-tetraosa marcada con bromo a partir del soporte

Se cubrió la resina obtenida en el experimento previo F^{P}5 con una solución 1 M de LiOH (0,2 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas mediante succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y se ajustó el pH de manera ligeramente ácida (pH 3-4) con AcOH al 10%. La solución que contenía el producto deseado se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (50 mg), se lavó con agua (2 ml) y se eluyó con metanol (0,5 ml). Se confirmó la identidad del producto por medio de MS (ES) m/z = 1,072 (98%, MH^{+}), 1,074 (100%, MH^{+}), m/z = 1,070 (98%, M-H^{+}), 1,072 (100%, M-H^{+}). La figura 12 muestra el espectro de masas con una expansión intercalada mientras que pueden distinguirse claramente dos isótopos del bromo.

4.2.3 Captura y procesamiento de la mezcla de azúcares reductores 6 C^{P}6: Captura de la mezcla de monosacáridos 6 (Fuc:Man:GalNAc, 2:3:1) sobre B^{P}

Se prepararon series de 3 soluciones madre mediante disolución de 3 monosacáridos individuales (Fuc: 16 mg, 0,10 mmoles, Man: 18 mg, 0,10 mol, GalNAc: 22 mg, 0,10 mmoles) en agua (3 \times 1,0 ml) y, a continuación, se diluyeron las mezclas 10 veces con una mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 3 \times 9 ml) para dar soluciones madre 10 mM de los 3 monosacáridos. Ahora se preparó una mezcla tomándose las siguientes cantidades a partir de 3 soluciones madre: Fuc (20 \mul, 0,2 \mumoles), Man (30 \mul, 0,3 \mumoles) y GalNAc (10 \mul, 0,1 \mumoles). La solución monosacárida se diluyó a continuación mediante adición de la mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 150 \mul) y el conjunto se añadió a resina PEGA B^{P} (10 mg, 2 \mumoles) y se dejó incubar a 60ºC durante la noche. La resina se lavó varias veces: DMF (5 \times 0,5 ml), metanol (5 \times 0,5 ml) y se usó directamente en los experimentos siguientes.

D^{P}6: Enmascaramiento de C^{P}6 con anhídrido acético

Se trataron todas las resinas, obtenidas en el experimento C^{P}6, con una mezcla 1:1 de Ac_{2}O y de metanol (0,4 ml) durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con DMF (5 \times 0,5 ml), con agua (2 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y se usaron directamente en el experimento siguiente.

E^{P}6: Reducción de D^{P}6 con BH_{3}-piridina

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento D^{P}6, con metanol (0,1 ml) y se añadió BH_{3}-piridina (20 \mul, 8 M en piridina) seguido por la adición de CCl_{3}CO_{2}H al 50% en agua (40 \mul). Se dejó que se produjese la reacción durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó con DMF (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml). La resina se repartió en 2 recipientes independientes (E^{P}6_{a} y E^{P}6_{b}, aproximadamente 5 mg en cada uno) y se usó directamente en las etapas siguientes.

F^{P}6_{a}: Marcaje de E^{P}6_{a} por medio de la utilización de TRITC

Se disolvió TRITC (0,5 mg, 1,2 \mumoles) en DMF (0,2 ml) y la solución se añadió a la resina (E^{P}6_{a}) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 0,5 ml) para eliminar el tinte en exceso. La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}6_{a}: Escisión de mezcla de monosacáridos marcada con TMR a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (F^{P}6_{a}), con una solución 1 M de LiOH (0,1 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas mediante succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y el pH se ajustó a neutralidad con AcOH al 10%. La solución rojo obscuro se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (50 mg), se lavó con agua (2 ml) y se eluyó con metanol (0,5 ml). Se confirmó la identidad de los 3 productos etiquetados por medio de MS (ES) m/z = 759 (Fuc, MH^{+}), 775 (Man, MH^{+}) 816 (GalNAc, MH^{+}) y se registró su perfil por medio de CE (figura 13).

F^{P}6_{b}: Marcaje de E^{P}6_{b} con anhídrido acético

Se añadió una mezcla 1:1 de Ac_{2}O y de metanol (0,2 ml) a la resina (E^{P}6_{b}) y se dejó reposar durante 16 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 0,5 ml). La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}6_{b}; Escisión de la mezcla de monosacáridos marcada con ácido acético a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (F^{P}6_{b}), con una solución al 10% de NH_{4}OH (0,1 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas mediante succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y se evaporaron a sequedad en el evaporador rotativo, se disolvieron de nuevo en agua (1 ml) y se secaron por liofilización. Se confirmó la identidad de los 3 productos marcados por medio de MS (ES) m/z = 356 (Fuc, M-H^{+}), 372 (Man, M-H^{+}), 413 (GalNAc, M-H^{+}). La relación de las intensidades de las 3 señales fue aproximadamente de 1,3:2:1.

4.2.4 Captura y procesamiento de la mezcla de azúcares reductores 7 C^{P}7: Captura de la mezcla de monosacáridos 7 (Fuc:Man:GalNAc, 1:3:2) sobre B^{P}

En el experimento siguiente se utilizaron las mismas 3 soluciones madre de monosacáridos (10 mM cada una) que habían sido usadas en el experimento C^{P}6. Se preparó una mezcla tomándose las cantidades siguientes de las 3 soluciones madre: Fuc (10 \mul, 0,1 \mumoles), Man (30 \mul, 0,3 \mumoles) y GalNAc (20 \mul, 0,2 \mumoles). Esta solución monosacárida se diluyó a continuación por medio de la adición de la mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 150 \mul) y el conjunto se añadió a la resina PEGA B^{P} (10 mg, 2 \mumoles) y se dejó incubar a 60ºC durante la noche. La resina se lavó varias veces: DMF (5 \times 0,5 ml), metanol (5 \times 0,5 ml) y se usó directamente en los experimentos siguientes.

D^{P}7: Enmascaramiento de C^{P}7 con anhídrido acético

Se trataron todas las resinas, obtenidas en el experimento C^{P}7, con una mezcla 1:1 de AC_{2}O y de metanol (0,4 ml) durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con DMF (5 \times 0,5 ml), con agua (2 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y se usaron directamente en el experimento siguiente.

E^{P}7: Reducción de D^{P}7 con BH_{3}-piridina

Se cubrieron las resinas, obtenidas en el experimento D^{P}7, con metanol (0,1 ml) y se añadió BH_{3}-piridina (20 \mul, 8 M en piridina) y, a continuación, se añadió CCl_{3}CO_{2}H al 50% en agua (40 \mul). Se dejó que se produjese la reacción durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó con DMF (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml). La resina se dividió en 2 recipientes independientes (E^{P}7_{a} y E^{P}7_{b}, aproximadamente 5 mg cada uno) y se usó directamente en la etapa siguiente.

F^{P}7_{a}: Marcaje de E^{P}7_{a} por medio de la utilización de TRITC

Se disolvió TRITC (0,5 mg, 1,2 \mumoles) en DMF (0,2 ml) y la solución se añadió a la resina (E^{P}7_{a}) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 0,5 ml) para eliminar el tinte en exceso. La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}7_{a}: Escisión de mezcla de monosacáridos marcada con TMR a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (F^{P}7_{a}), con una solución 1 M de LiOH (0,9 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas mediante succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y el pH se ajustó a neutralidad con AcOH al 10%. La solución rojo obscuro se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (50 mg), se lavó con agua (2 ml) y se eluyó con metanol (0,5 ml). Se confirmó la identidad de los 3 productos marcados por medio de MS (ES) m/z = 759 (Fuc, MH^{+}), 775 (Man, MH^{+}) 816 (GalNAc, MH^{+}) y se registró su perfil por medio de CE (figura 14).

F^{P}7_{b}: Marcaje de E^{P}7_{b} con anhídrido deuteroacético

Se añadió una mezcla 1:1 de anhídrido deuteroacético y de metanol (0,2 ml) a la resina (E^{P}7_{b}) y se dejó reposar durante 16 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 0,5 ml). La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}7_{b}: Escisión de la mezcla de monosacáridos marcada con deuterio a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (F^{P}7_{b}), con una solución al 10% de NH_{4}OH (0,1 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas por succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y se evaporaron a sequedad en el evaporador rotativo, se disolvieron de nuevo en agua (1 ml) y se secaron por liofilización. Se confirmó la identidad de los 3 productos marcados con deuterio por medio de MS (ES) m/z = 359 (Fuc, M-H^{+}), 375 (Man, M-H^{+}), 416 (GalNAc, M-H^{+}). La relación de las intensidades de las 3 señales fue aproximadamente de 1:4:4.

4.2.5 Captura y procesamiento de la mezcla de oligosacáridos reductores 9 C^{P}9: Captura de la mezcla de oligosacáridos 9 (G2-G7) sobre B^{P}

Se preparó una solución por disolución de una cantidad equimolar (10 \mumoles respectivamente) de los oligosacáridos puros G2-G7 en agua (1 ml). Se añadieron 100 \mul de la solución que contenía los oligosacáridos a una mezcla de DMSO y de AcOH (7:3, 0,9 ml) y el conjunto se añadió a la resina PEGA B^{P} (60 mg, 12 \mumoles) y se dejó incubar a 50ºC durante la noche. La resina se lavó varias veces: DMF (5 \times 2 ml), metanol (5 \times 2 ml) y se usó directamente en los experimentos siguientes.

D^{P}9: Enmascaramiento de C^{P}9 con anhídrido acético

Se trataron todas las resinas, obtenidas en el experimento C^{P}9, con una mezcla 1:1 de Ac_{2}O y de metanol (2 ml) durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con DMF (5 \times 2 ml), con agua (2 \times 2 ml), con metanol (5 \times 2 ml) y se usaron directamente en el experimento siguiente.

E^{P}9: Reducción de D^{P}9 con BH_{3}-piridina

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento D^{P}9, con metanol (1 ml) y se añadió BH_{3}-piridina (150 \mul, 8 M en piridina) y, a continuación, se añadió CCl_{3}CO_{2}H al 50% en agua (300 \mul). Se dejó que se produjese la reacción durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó con DMF (5 \times 2 ml), con metanol (5 \times 2 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 2 ml). La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

F^{P}9: Marcaje de E^{P}9 por medio de la utilización de FITC

Se disolvió FITC (12 mg, 30 \mumoles) en una mezcla 1:1 de DMF y de metanol (1 ml) y la solución se añadió a la resina (E^{P}9) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 2 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 2 ml), con metanol (5 \times 2 ml) y, finalmente, con agua (5 \times 2 ml) para eliminar el tinte en exceso. La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}9: Escisión de la mezcla de oligosacáridos marcada por medio de la utilización de FITC a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (F^{P}9), con una solución 1 M de LiOH (1 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. Se recogió el líquido a partir de las perlas mediante succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 3 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y el pH se ajustó a neutralidad con AcOH al 10%. La solución amarillo fuerte se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (350 mg), se lavó con agua (10 ml) y se eluyó con metanol (3 ml). Se confirmó la presencia de todos los 6 oligosacáridos marcados por medio de MS (ES) m/z = 881 (G2, MH^{+}), 1,043 (G3, MH^{+}), 1,205 (G4, MH^{+}), 1,367 (G5, MH^{+}), 1,529 (G6, MH^{+}), 1,691 (G7, MH^{+}) y se registró el perfil de la mezcla por medio de CE (figura 15).

\vskip1.000000\baselineskip

4.2.6 Captura y procesamiento de los oligosacáridos liberados a partir de ribonucleasa B C^{P}10: Captura y procesamiento de oligosacáridos a partir de RNAsa B (10) sobre B^{P}

Se usaron oligosacáridos en bruto, procedentes de la digestión con PNGasa F de RNAsa B (Sigma, R-7884), tras eliminación de la proteína sobre un concentrador Centricon-10 (Millipore) y, a continuación, se llevó a cabo la purificación del carbohidrato sobre una columna Carbograph SPE (peso del lecho 150 mg; Scantec Lab). Se preparó una solución por disolución de los oligosacáridos en bruto procedentes de RNAsa B (10)^{2} (300 \mug, aproximadamente 0,2 \mumoles) en una mezcla de DMSO que contenía ácido cítrico 0,9 M y THF 2:1 (100 \mul). Esta mezcla se añadió a la resina PEGA B^{P} (5 mg, 1,0 \mumoles) y se incubó a 60ºC durante la noche. La resina se lavó varias veces: DMF (5 \times 0,3 ml), metanol (5 \times 0,3 ml) y se usó directamente en los experimentos siguientes.

D^{P}10: Enmascaramiento de C^{P}10 con anhídrido acético

Se trataron todas las resinas, obtenidas en el experimento C^{P}10, con una mezcla 1:1 de Ac_{2}O y de metanol (0,2 ml) durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con DMF (5 \times 0,3 ml), con agua (2 \times 0,3 ml), con metanol (5 \times 0,3 ml) y se usaron directamente en el siguiente experimento.

E^{P}10: Reducción de D^{P}10 con BH_{3}-piridina

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento D^{P}10, con metanol (0,2 ml) y se añadió BH_{3}-piridina (10 \mul, 8 M en piridina) y, a continuación, se añadió 50% CCl_{3}CO_{2}H al 50% en agua (20 \mul). Se dejó que se produjese la reacción durante 2 horas a la temperatura ambiente y, a continuación, se lavó con DMF (5 \times 0,3 ml), con metanol (5 \times 0,3 ml) y con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,3 ml). La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

F^{P}10: Marcaje de E^{P}10 por medio de la utilización de FITC

Se disolvió FITC (1,9 mg, 5 \mumoles) en una mezcla de DMF y de metanol (1:1, 0,2 ml) y la solución se añadió a la resina (E^{P}10) y se dejó reposar durante 2 horas a 60ºC y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 0,3 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,3 ml), con metanol (5 \times 0,3 ml) y, por último, con agua (5 \times 0,3 ml) para eliminar el tinte en exceso. La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

G^{P}10: Escisión de los oligosacáridos a partir de la RNAsa marcada por medio de la utilización de FITC a partir del soporte

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (F^{P}10), con una solución 1 M de LiOH (0,2 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas mediante succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y el pH se ajustó a neutralidad con AcOH al 10%. La solución amarilla, que contenía el producto deseado, se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (50 mg), se lavó con agua (2 ml) y se eluyó con metanol (0,5 ml). Se analizó el perfil de los oligosacáridos marcados por medio de la CE. La Ce (figura 16) indica la presencia de varios oligosacáridos y de algunos contaminantes no identificados. Se confirmó la identidad de, al menos, uno de los componentes conocidos por medio de MS (ES) m/z = 1775 (Man_{5}GlcNAcGlcNAcCH_{2}-N-(R)-TAG, MH^{+}).

\vskip1.000000\baselineskip

4.3 Captura y procesamiento de azúcares reductores representativos sobre soportes CPG 4.3.1 Captura y procesamiento de 2 sobre B^{1} C^{1}2: Captura de galactosa (2) sobre B^{1}

Se trató B^{1} (20 mg, 0,6 \mumoles) con 2 (6,6 \mul, 1 mg/ml de agua, 0,03 \mumoles) en tampón de citrato-fosfato (113 \mul) y se dejó reposar durante la noche a 55ºC. Las perlas se transfirieron a una jeringuilla y se lavaron con agua (3 \times 0,5 ml) y con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar C^{1}2.

D^{1}2: Enmascaramiento de C^{1}2 con anhídrido acético

Se enmascaró C^{1}2 (0,6 \mumoles) con Ac_{2}O al 50% en etanol durante 15 minutos a la temperatura ambiente y se lavó con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar D^{1}2.

E^{1}2: Reducción de D^{1}2 con BH_{3}-piridina

Se trató D^{1}2 (0,6 \mumoles) con 100 \mul de una solución de BH_{3}-piridina (25 \mul), CCl_{3}CO_{2}H al 50% (50 \mul) en etanol (500 \mul). La mezcla se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar E^{1}2.

F^{1}2: Etiquetado de E^{1}2 con TRITC

Se trató E^{1}2 (0,6 \mumoles) con TRITC (100 \mul de 1,0 mg en 300 \mul de NMP y 300 \mul de CH_{2}Cl_{2}) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 0,5 ml), con etanol (3 \times 0,5 ml) y con agua (3 \times 0,5 ml) para dar F^{1}2 (perlas rojas).

G^{1}2: Tratamiento básico de F^{1}2

Se trató F^{1}2' (0,6 \mumoles) con solución 1 M de LiOH (100 \mul) durante 1 hora a la temperatura ambiente y la solución roja se aisló y se neutralizó con AcOH al 50% en agua para dar G^{1}2 (solución roja) que se hizo pasar a través de una columna Sep-Pak (CH_{3}CN al 30% en agua) y se analizó por medio de MS (775,3, MH^{+}) y CE (figura 17).

\vskip1.000000\baselineskip

4.3.2 Captura y procesamiento de 5 sobre B^{1} C^{1}5: Captura de LNT (5) sobre B^{1}

Se trató B^{1} (20 mg, 0,6 \mumoles) con 5 (25 \mul, 2 mg/ml de agua, 0,03 \mumoles) en tampón de citrato-fosfato (113 \mul) y se dejó reposar durante la noche a 55ºC. Las perlas fueron transferidas a una jeringuilla y se lavaron con agua (3 \times 0,5 ml) y con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar C^{1}5.

D^{1}5: Enmascaramiento de C^{1}5 con anhídrido acético

Se trató C^{1}5 (0,6 \mumoles) con Ac_{2}O al 50% en etanol durante 15 minutos a la temperatura ambiente y se lavó con (3 \times 0,5 ml) para dar D^{1}5.

E^{1}5: Reducción de D^{1}5 con BH_{3}-piridina

Se trató D^{1}5 (0,6 \mumoles) con 100 \mul de una solución de BH_{3}-piridina (25 \mul), CCl_{3}CO_{2}H al 50% (50 \mul) en etanol (500 \mul). La mezcla se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar E^{1}5.

F^{1}5: Etiquetado de E^{1}5 con TRITC

Se trató E^{1}5 (0,6 \mumoles) con TRITC (100 \mul de 1,0 mg en 300 \mul de NMP y 300 \mul de CH_{2}Cl_{2}) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con CH_{2}-Cl_{2} (3 \times 0,5 ml), con etanol (3 \times 0,5 ml) y con agua (3 \times 0,5 ml) para dar F^{1}5 (perlas rojas).

G^{1}5: Tratamiento básico de F^{1}5

Se trató la resina con una solución 1 M de LiOH (100 \mul) durante 1 hora a la temperatura ambiente y la solución roja se aisló mediante filtración y las perlas se lavaron con agua (3 \times 75 \mul) y se neutralizaron con AcOH al 50% en agua para dar G^{1}5 (solución roja) que se hizo pasar a través de una columna Sep-Pak (CH_{3}CN al 30% en agua) y se analizó por medio de MS (ES) m/z = 1300,6 (M-H^{+}), 1302,4 (MH^{+}) y por medio de CE (figura 18).

De manera alternativa, podría etiquetarse E^{1}5 con 1-flúor-2,4-dinitrobenceno (reactivo de Sanger, (figura 8) de la manera siguiente. La resina se trató con el reactivo de Sanger (20 equivalentes, 0,4 \mul, Sigma) y con TEA (10 equivalentes, 0,2 \mul) en etanol (70 \mul) durante 2 horas a 55ºC. Las perlas se lavaron con etanol (3 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 0,5 ml), con etanol (3 \times 0,5 ml) y con agua (3 \times 0,5 ml) (perlas amarillas), a continuación se trataron con solución 1 M de LiOH (70 \mul) durante 1 hora a la temperatura ambiente (solución parda). La solución se recogió por filtración y las perlas se lavaron con agua (3 \times 50 \mul). La mezcla se neutralizó con AcOH al 50% (solución amarilla). La mezcla se hizo pasar a través de una columna Sep-Pak con CH_{3}CN al 30% en agua. MS (ES) m/z = 1023,1 (M-H^{+}).

4.3.3 Captura y procesamiento de la mezcla 8 sobre B^{1} C^{1}8: Captura de galactosa (2) y de LNT (5) sobre B^{1}

Se trató B^{1} (20 mg, 0,6 \mumoles) con 2 (6,6 \mul, 1 mg/ml de agua, 0,03 \mumoles), con 5 (25 \mul, 2 mg/ml de agua, 0,03 \mumoles), con tampón de citrato-fosfato (100 \mul), y se dejó reposar durante la noche a 55ºC. Las perlas se lavaron con agua (3 \times 0,5 ml) y con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar C^{1}8.

D^{1}8: Enmascaramiento de C^{1}8 con anhídrido acético

Las hidroxilaminas remanentes en C^{1}8 (0,6 \mumoles) se enmascararon con Ac_{2}O al 50% en etanol durante 15 minutos a la temperatura ambiente y se lavaron con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar D^{1}8.

E^{1}8: Reducción de D^{1}8 con BH_{3}-piridina

Se trató D^{1}8 (0,6 \mumoles) con 100 \mul de una solución de BH_{3}-piridina (Fluka, 25 \muL), CCl_{3}CO_{2}H al 50% (50 \mul) en etanol (500 \mul). La mezcla se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con etanol (3 \times 0,5 ml) para dar E^{1}8.

F^{1}8: Etiquetado de E^{1}8 por medio de la utilización de TRITC

Se trató E^{1}8 (0,6 \mumoles) con TRITC (100 \mul de 1,0 mg en 300 \mul de NMP y 300 \mul de CH_{2}Cl_{2}) y se dejó reposar durante 2 horas a la temperatura ambiente para dar F^{1}8. Las perlas se lavaron con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 0,5 ml), con etanol (3 \times 0,5 ml), y con agua (3 \times 0,5 ml) (perlas rojas).

G^{1}8: Tratamiento básico de F^{1}8

Se trató F^{1}8 con solución 1 M de LiOH (100 \mul) durante 1 hora a la temperatura ambiente y se aisló la solución roja y se neutralizó con AcOH al 50% en agua para dar G^{1}8 (solución roja) que se hizo pasar a través de una columna Sep-Pak (CH_{3}CN al 30% en agua) y se analizó por medio de CE (figura 19).

5. Reacción de oligosacáridos inmovilizados con enzimas 5.1 Reacción de un oligosacárido marcado, inmovilizado, con una glicosidasa

5.1.1 Reacción de lacto-N-tetraosa inmovilizada (LNT, 5) de estructura F (cap = acetilo, TAG = TMR) con beta-galactosidasa (ensayos bovinos, SIGMA producto G-4142, 1 U/ml) sobre soportes de CPG sin espaciador (F^{0}5), con un espaciador (F^{1}5) y con dos espaciadores (F^{2}5). Todos los tres oligosacáridos inmovilizados se prepararon esencialmente como se ha descrito para F^{1}5 (sección 4.3.2).

Los soportes sólidos (5 mg) se incubaron con beta-galactosidasa (100 \mul de solución 0,2 U/ml en tampón de citrato/fosfato 0,1 M, pH 5,0, que contiene un 0,2% de BSA durante 23 horas a 37ºC y la resina se lavó a continuación con 3 \times agua, con 3 \times etanol, con 3 \times CH_{2}Cl_{2}, con 3 \times Et etanol OH, y con 3 \times agua. las perlas se trataron con solución 1 M de LiOH (60 \mul) durante 1 hora a la temperatura ambiente para dar productos de las estructuras generales G^{0}5, G^{1}5, y G^{2}5 en solución. Cada una de las soluciones rojas se recogió mediante filtración. El filtrado se neutralizó con AcOH al 50% y se analizó por medio de la utilización de la CE.

La figura 20 muestra que no se produjo escisión detectable de galactosa a partir de la LNT para F^{0}5, se detectó una conversión del 39% para F^{1}5 (es decir el 39% del tetrasacárido había perdido el residuo Gal terminal y se había convertido en trisacárido) y se detectó una conversión del 83% para F^{2}5. Por consiguiente, se observó que la naturaleza del espaciador era importante para que se produjese la reacción enzimática.

5.1.2 Reacción de maltotriosa inmovilizada F^{2}4 (cap = acetilo, TAG = TMR) con glucoamilasa 2 a partir de Aspergillus niger (proporcionado por cortesía del Dr. Birte Svensson, Carlsberg Laboratories) sobre soporte de CPG con dos espaciadores. F^{2}4 se preparó esencialmente como se ha descrito para F^{1}5 (sección 4.3.2) pero empleándose maltotriosa (G3, figura 2) como el azúcar reductor y B^{2} como el soporte sólido. F^{2}4 (aproximadamente 5 mg) se incubó durante 23 horas a 37ºC con 50 \mul de 0,1 mg/ml de enzima en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, que contenía un 0,2% de BSA. Tras lavado y escisión, como se ha descrito precedentemente, se analizó el producto por medio de CE (figura 21), lo cual mostró una conversión completa de la maltotriosa etiquetada inmovilizada para dar un nuevo pico que es eluido entre la maltotriosa etiquetada y la glucosa, designada por consiguiente, como aducto de maltobiosa (G2) TMR.

\vskip1.000000\baselineskip

5.2 Reacción de un oligosacárido no marcado, inmovilizado, con una glicosidasa y captura del monosacárido reductor liberado sobre el mismo soporte

Se llevó a cabo la reacción de la LNT inmovilizada de la estructura C^{2}5 (no reducida, no enmascarada, no marcada) con beta-galactosidasa (ensayos bovinos) sobre soporte sólido de CPG con dos espaciadores. C^{2}5 se preparó esencialmente como se ha descrito para C^{1}5 (sección 4.3.2). Como paso previo a su uso, la solución enzimática se liberó de los contaminantes con moléculas pequeñas mediante centrifugación repetida con utilización de un dispositivo con filtro de centrifugación Microcon YM-3 (Millipore). C^{2}5 (5 mg) se incubó durante 23 horas a 37ºC con 55 \mul de 0,9 U/ml de enzima en fosfato/citrato 0,1 M, pH 5,0, que contenía un 0,2% de BSA, y, a continuación, durante otras 20 horas a 55ºC para permitir la captura de la galactosa liberada. El sólido se lavó, se redujo, se enmascaró con anhídrido acético, se marcó con empleo de TRITC y se escindió con LiOH como se ha descrito precedentemente para la conversión de C^{1}5 en G^{1}5. La CE del producto escindido está mostrada en la figura 22, que muestra la presencia de LNT sin reaccionar (32%) y cantidades similares tanto del trisacárido producto marcado con TMR así como de la galactosa escindida. Estos experimentos confirman la captura del azúcar escindido sobre el mismo soporte no enmascarado a partir del cual ha sido escindido.

\vskip1.000000\baselineskip

6. Variación de agentes de enmascaramiento 6.1. Enmascaramiento de C para producir D

Se utilizó una selección de agentes de enmascaramiento para llevar a cabo la conversión de C hasta D (figura 1). Se usó C^{2}2 como substrato (cuando el sólido era CPG con 2 espaciadores y cuando el azúcar capturado era la galactosa). Los grupos amino de C se enmascararon entonces con, entre otros, anhídrido acético, anhídrido benzoico, anhídrido tricloroacético y dibromoxileno (figura 6). El enmascaramiento se llevó a cabo con soluciones al 50% del agente de enmascaramiento en etanol, durante 15 a 120 minutos a la temperatura ambiente. A continuación se procesaron las muestras como se ha descrito para la conversión de C^{1}2 en G^{1}2 (sección 4.3.1), es decir reducción, etiquetado por medio de la utilización de TRITC, escisión básica y análisis por medio de CE. Los resultados están mostrados en la figura 23, que muestra que todas las condiciones proporcionan la galactosa etiquetada con TMR (compuesto 21, figura 5) con cantidades variables de otras impurezas que aparecen por delante del compuesto 21 en el electrofero-
grama.

\vskip1.000000\baselineskip

6.2 Ejemplos comparativos de enmascaramiento de C_{red} para producir E

Se redujo C^{2}2 procedente de la sección 6.1 precedente, con BH_{3}-piridina como se ha descrito para la conversión de D^{1}2 en E^{1}2 precedentemente (sección 4.3.1). El producto C_{red} ^{2}2 difiere de E^{1}2 en que contiene grupos NH_{2} no enmascarados. Se hizo reaccionar C_{red}^{2}2 (5 mg) con éster NHS del ácido benzoico (0,4 mg, 1,75 \mumoles) y con TEA (1,0 \mul) en DMF (50 \mul) durante la noche a 60ºC. A continuación se lavó el producto de la reacción, que tiene la estructura general E^{2}2 (siendo cap un benzoato) y se procesó de manera usual, por medio de un marcado con utilización de TRITC, escisión y análisis por medio de una CE. La figura 24 muestra que el producto es substancialmente el mismo que el que se ha formado por medio de la secuencia: C se convierte en D, se convierte en E, y se convierte en G. Se confirmó la identidad del producto por medio de su MS (ES) m/z = 775,0 (MH^{+}).

7. Ejemplo del u so de un inmovilizador: E se convierte en H, se convierte en I, se convierte en J (figura 1) Síntesis de 29 como ejemplo de X-inmovilizador-Y_{p} 29: Éster de 9H-fluoren-9-ilmetilo del ácido 4-isotiocianato-bencil)-carbámico

Se añadió TEA (1,15 ml, 8,27 mmoles) a una solución de 4-aminobencilamina (0,93 ml, 8,20 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (20 ml) seguido por una solución de éster de Fmoc-N-hidroxisuccinimida (2,48 g, 7,35 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (10 ml). Al cabo de 30 minutos de agitación, se añadió CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y la mezcla se lavó sucesivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 \times 50 ml) y salmuera (50 ml), y se secó (Na_{2}SO_{4}). El disolvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se purificó por medio de una cromatografía en vacío en columna seca (0-60% EtOAc en n-heptano) para proporcionar el material protegido con Fmoc constituido por el éster de 9H-fluoren-9-ilmetilo del ácido (4-amino-bencil)-carbámico (2,30 g, 91%). ^{1}H-RMN (250 MHz, DMSO-d6) \delta = 4,03 (2H, d, J = 5,3 Hz), 4,22 (1H, t, J = 6,8 Hz), 4,33 (2H, d, J = 6,8 Hz), 4,95 (2H, s), 6,53 (2H, d, J = 8,3 Hz), 6,92 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,29-7,44 (4H, m), 7,64-7,72 (3H, m), 7,88 (2H, d, J = 7,3 Hz). ^{13}C-RMN (63 MHz, DMSO-d6) \delta = 43,97, 47,19, 65,65, 114,09, 120,46, 121,75, 125,58, 127,11, 127,42, 127,96, 128,47, 129,30, 141,13, 144,32, 147,89, 156,63. MS (ES) m/z = 345 (MH^{+}).

Se añadió, gota a gota, una solución del éster de 9H-fluoren-9-ilmetilo del ácido (4-amino-bencil)-carbámico (718 mg, 2,09 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml) a una solución de tiofosgeno (199 \mul, 2,61 mmoles) en una mezcla de CH_{2}Cl_{2}-agua (40 ml, 1:1, v/v). Una vez que la mezcla se agitó durante la noche, la fase orgánica se aisló y se secó (Na_{2}SO_{4}). El disolvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se purificó por medio de una cromatografía en vacío en columna seca (0-100% CH_{2}Cl_{2} en n-heptano) para dar (29) (643 mg, 80%). ^{1}H-RMN (250 MHz, DMSO-d6) \delta = 4,18-4,25 (3H, m), 4,38 (2H, d, J = 6,7 Hz), 7,25-7,45 (8H, m), 7,69 (2H, d, J = 7,3 Hz), 7,87-7,90 (3H, m). ^{13}C-RMN (63 MHz, DMSO-d6) \delta = 43,64, 47,19, 65,70, 115,55, 120,48, 125,15, 125,49, 126,20, 127,42, 127,98, 128,72, 128,83, 133,55, 136,29, 140,26, 141,16, 144,23, 156,74. MS (ES) m/z = 387 (MH^{+}).

H^{P}5: Enlazamiento de inmovilizador amino protegido con Fmoc con E^{P}5 por medio de la utilización de 29 (figura 9)

Se lavaron 5 mg de la resina seca (E^{P}5) (0,2 \mumoles) un par de veces con CH_{2}Cl_{2} para asegurar el hinchamiento adecuado de la resina. El inmovilizador protegido con Fmoc (29) (0,8 mg, 2 \mumoles) se disolvió en DMF (0,2 ml) y se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 2 horas. La resina se lavó con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}Cl_{2} (5 \times 0,5 ml) y se eliminó el grupo protector Fmoc bajo condiciones estándar (piperidina al 20% en DMF, 0,5 ml 2 \times 10 min). La resina se usó directamente en el experimento siguiente tras lavado con DMF (5 \times 0,5 ml).

I^{P}5: Marcaje de H^{P}5 por medio de la utilización de TRITC

Se incubó la resina, obtenida en el experimento H^{P}5, que contiene ahora un grupo amino primario libre, con TRITC (0,9 mg, 2 \mumoles) en DMF (0,2 ml) a la temperatura ambiente durante 2 horas y, a continuación, se lavó extensamente con DMF (5 \times 0,5 ml), con CH_{2}-Cl_{2} (5 \times 0,5 ml), con metanol (5 \times 0,5 ml) y, al final, con agua (5 \times 0,5 ml) para eliminar el tinte en exceso. La resina se usó directamente en la etapa siguiente.

J^{P}5: Escisión de lacto-N-tetraosa marcada mediante la utilización de TRITC a través de un inmovilizador amino

Se cubrió la resina, obtenida en el experimento previo (I^{P}5), con una solución 1 M de LiOH (0,2 ml) y se dejó reposar durante 2 horas. El líquido se recogió a partir de las perlas por succión y, a continuación, se lavaron las perlas con agua (3 \times 0,5 ml). El líquido recogido y los lavados se reunieron y se ajustó el pH de una manera ligeramente ácida (pH 3-4) con AcOH al 10%. La solución rojo obscuro que contenía el producto deseado se adsorbió sobre una columna Sep-Pak (50 mg), se lavó con agua (2 ml) y se eluyó con metanol (0,5 ml). Se confirmó la identidad del producto por medio de la MS (ES) m/z = 1,465 (MH^{+}).

Análisis por electrofóresis capilar de los carbohidratos etiquetados

Se llevó a cabo la electrofóresis capilar (CE) por medio de la utilización de un sistema automatizado PrinCE 2-lift, modelo 560 CE (Prince Technologies, Los Países Bajos). Las separaciones se llevaron a cabo en un tubo capilar con pie de sílice no revestido con un diámetro interno de 75 \mum con una longitud efectiva comprendida entre 50 y 75 cm (más 30 cm de longitud extra a partir de la ventana de detección hasta la salida), controlado de manera termostática a 25ºC. El electrolito de base para la CE (BGE) fue o bien (A) tampón de borato 50 mM, pH 9,3, que contiene SDS 150 mM o bien (B) tampón de borato 0,2 M, pH 9,3, que contenía 0,8% (p/v) de \gamma-CD (Sigma, C-4892). Se usaron las condiciones A para los análisis mostrados en las figuras 11 y 15 - 22. Las condiciones B se usaron para los análisis mostrados en las figuras 10, 13, 14, 23 y 24.

El tubo capilar se acondicionó a temperatura ambiente mediante enjuagado a 2.000 mbares durante 30 minutos con NaOH 1 M, 10 minutos con agua, y 10 minutos con BGE como paso previo a su utilización. El tubo capilar se lavó entre las pasadas, a 2.000 mbares durante 3 minutos con NaOH 1 M, 3 minutos con agua, y 3 minutos con BGE. Las muestras se inyectaron de manera hidrodinámica durante 6 segundos a 50 mbares y se sometieron a electrofóresis a través de una diferencia de potencia de 25 kV. Todos los experimentos se llevaron a cabo con una polaridad normal, es decir entrada anódica. La detección se llevó a cabo por medio de la utilización de un detector fluorescente (Argos 250B, Flux Instruments, Suiza) equipado con filtros apropiados. Para muestras etiquetadas mediante la utilización de TRITC, los filtros de excitación y de emisión fueron respectivamente 546.1/10 y 570 nm. Para muestras etiquetadas mediante la utilización de FITC, los filtros de excitación y de emisión fueron respectivamente UG11 (200-400 nm) y 495 nm.

Abreviaturas

A través de la presente solicitud se han utilizado las siguientes abreviaturas:

AMP CPG: vidrio poroso controlado con aminopropilo

BGE: electrolito de base

BSA: albúmina de suero bovino

CE: electrofóresis capilar

CPG: vidrio poroso controlado

DIPEA: N,N-diisopropiletilamina

DMF: N,N-dimetilformamida

ES: electrospray

FITC: isotiocianato de fluoresceína

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HRMS: espectroscopía de masas de alta resolución

LNT: lacto-N-tetraosa

MS: espectroscopía de masas

NHS: N-hidroxisuccinimida

NMP: 1-metil-2-pirrolidona

PEGA: polímero de polietilenglicol acrilamida

RNAsa B: ribonucleasa B

rt: temperatura ambiente

TBTU: tetraflúorborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronio

TEA: trietilamina

TMR: tetrametilrodamina

TRITC: isotiocianatos de tetrametilrodamina

Claims

1. Un método para la preparación de un azúcar reactivo, comprendiendo dicho método las etapas de

i.: el suministro de una muestra que comprenda un azúcar reductor

ii.: el suministro de un soporte sólido enlazado de manera covalente con un enlazador que comprenda un grupo de captura que comprenda un grupo -NH_{2}, estando enlazado, opcionalmente, dicho enlazador con dicho soporte sólido a través de un espaciador

iii.: la reacción de dicho azúcar reductor con dicho grupo -NH_{2}, con lo que se obtiene un azúcar inmovilizado,

iv.: la reacción de los grupos -NH_{2} libres con un agente de enmascaramiento, comprendiendo el agente de enmascaramiento un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo -NH_{2};

v.: la reducción de los enlaces C=N con un agente reductor;

vi.: obteniéndose, de este modo, un azúcar reactivo con la estructura azúcarCH_{n}-NH- enlazado con un soporte sólido a través de un enlazador y, opcionalmente, a través de un espaciador, siendo n 1 o 2,

llevándose a cabo la etapa iv como paso previo a la etapa v.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende, además, la etapa de

vii.: la reacción del grupo -NH- del azúcar reactivo con un agente de derivatización que comprenda un grupo funcional reactivo con el nitrógeno (X), obteniéndose, de este modo, un azúcar enlazado de manera covalente con dicho agente.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicho grupo funcional reactivo con el nitrógeno se elige entre el grupo constituido por los isotiocianatos, los ésteres activos, los ácidos carboxílicos, los aceptores de Michael, las sulfonas alfa-beta insaturadas, los agentes de alquilación, los aldehídos, las cetonas y los grupos haloaromáticos substituidos que porten grupos electronegativos.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho agente de derivatización es un compuesto que puede ser detectado por vía espectroscópica, derivatizado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho agente de derivatización es un compuesto fluorescente, derivatizado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, en el que dicho método comprende, además, la etapa de

viii.: la detección por espectrometría de dicho agente enlazado con el azúcar.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho agente de derivatización es un marcador TAG para espectrometría de masas derivatizado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno, siendo capaz el marcador TAG para espectrometría de masas de mejorar la detección y/o la caracterización estructural de un azúcar.

8. El método según la reivindicación 7, en el que el marcador TAG para espectrometría de masas es una molécula que comprende bromo.

9. El método según la reivindicación 7, en el que el marcador TAG para espectrometría de masas es una molécula cargada.

10. El método según la reivindicación 7, en el que el marcador TAG para espectrometría de masas es una molécula etiquetada con isótopos.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el método comprende, además, la etapa de

viii.: la detección por medio de una espectrometría de masas de dicho marcador TAG para espectrometría de masas, enlazado con dicho azúcar.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho agente de derivatización es un primer participante en el enlace capaz de interaccionar específicamente con un segundo participante en el enlace, y estando derivatizado dicho primer participante en el enlace con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno.

13. El método según la reivindicación 12, en el que un participante en el enlace es una proteína y el otro participante en el enlace es un ligando de dicha proteína.

14. El método según la reivindicación 12, en el que un participante en el enlace comprende un epitopo y el otro participante en el enlace es un anticuerpo que reconoce de manera específica a dicho epitopo.

15. El método según la reivindicación 12, en el que un participante en el enlace es la biotina y el otro participante en el enlace es una avidina.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el segundo participante en el enlace está conjugado con una etiqueta detectable.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que el agente de derivatización es un ácido nucleico derivatizado con un grupo funcional reactivo con el nitrógeno o es un grupo funcional reactivo con el nitrógeno, protegido.

18. El método según la reivindicación 17, en el que dicho ácido nucleico es el ADN.

19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, en el que el método comprende, además, la etapa de

viii.: la detección de dicho ácido nucleico enlazado con dicho azúcar.

20. El método según la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico es detectado por medio de un ácido nucleico esencialmente complementario conjugado con la etiqueta detectable.

21. El método según la reivindicación 19, en el que la detección de dicho ácido nucleico comprende la amplificación del ácido nucleico.

22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho agente es un reactivo bifuncional con la estructura X-inmovilizador-Y o X-inmovilizador-Y_{p}, siendo X un grupo funcional reactivo con el nitrógeno y siendo Y un segundo grupo funcional reactivo e Y_{p} es un grupo reactivo Y protegido.

23. El método según la reivindicación 22, en el que dicho segundo grupo Y funcional reactivo se elige entre el grupo que está constituido por los tioles, los grupos carboxilo, los grupos carboxilo activados, los disulfuros, los disulfuros activados, los agentes de alquilación, los alquenos, los alquinos, los aldehídos, las cetonas y las azidas o Y_{p} se elige entre el grupo constituido por los derivados protegidos de los grupos Y precedentemente citados y aminas protegidas.

24. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, en el que el método comprende, además, las etapas de:

viii.: el suministro de un segundo agente de derivatización que comprenda un grupo funcional (Z) capaz de reaccionar con Y;

ix.: la reacción de los grupos funcionales Z e Y, enlazándose en este caso de manera covalente el segundo agente de derivatización con el azúcar a través de un inmovilizador y con el primer agente de derivatización.

25. El método según la reivindicación 24, en el que el segundo agente de derivatización se elige entre el grupo constituido por los fármacos, los agentes de imagen, los péptidos, los polipéptidos, las proteínas, los enzimas, los ácidos nucleicos, los compuestos detectables por vía espectroscópica, los marcadores TAGs para espectrometría de masas y primer participante en el enlace capaz de interaccionar de manera específica con un segundo participante en el enlace.

26. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, en el que el método comprende, además, las etapas de:

viii.: el suministro de una partícula elegida entre el grupo constituido por los organismos microbianos, las micelas, los fagos, los virus y las nanopartículas, comprendiendo las partículas un grupo funcional (Z) capaz de reaccionar con Y;

ix.: la reacción de los grupos funcionales Z e Y, enlazándose en este caso de manera covalente la partícula al azúcar a través del inmovilizador y el agente.

27. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende, además, las etapas de

viii.: la puesta en contacto del azúcar con un agente de detección capaz de asociarse a través de dicho azúcar;

ix.: la detección del agente de detección.

28. El método según la reivindicación 27, en el que dicho agente de detección comprende arilboronatos o heteroarilboronatos.

29. El método según la reivindicación 27, en el que el agente de detección es un polipéptido.

30. El método según la reivindicación 29, en el que dicho polipéptido se elige entre el grupo constituido por las lecitinas, las selectinas, las toxinas, los receptores, los anticuerpos y los enzimas.

31. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el grupo de captura comprende o está constituido por la estructura M-NH_{2}, siendo M un heteroátomo.

32. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el enlazador es un enlazador no escindible, seleccionado entre el grupo constituido por los alquilos, los arilos, los éteres y las amidas, pudiendo estar opcionalmente substituido cualquiera de los citados precedentemente.

33. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que el enlazador es un enlazador escindible.

34. El método según la reivindicación 33, en el que el enlazador puede ser escindido por medio de una reacción con ácidos, con bases, con nucleófilos, con electrófilos, por oxidación, por reducción, por medio de radicales libres, por medio de la luz, por calentamiento o por medio de enzimas.

35. El método según cualquiera de las reivindicaciones 33 y 34, en el que el método comprende, además, la etapa de escindir dicho enlazador escindible, liberándose en este caso el azúcar, pudiendo ser llevada a cabo esta etapa subsecuentemente a la etapa v, vi, vii, viii o ix.

36. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el enlazador está enlazado con dicho soporte sólido a través de un espaciador.

37. El método según la reivindicación 36, en el que el espaciador tiene una longitud comprendida entre 0 y 1.000 átomos y, opcionalmente, está ramificado.

38. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el soporte sólido se elige entre el grupo constituido por los polímeros, los sólidos, las partículas insolubles y las superficies.

39. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 37, en el que el soporte sólido es un sensor.

40. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende, además, la etapa de poner en contacto el azúcar con una o con varias glicosidasas, generándose, de este modo, un nuevo azúcar reductor, a condición de que el primer azúcar sea un substrato de dicha o de dichas glicosidasas.

41. El método según la reivindicación 40, en el que el método comprende, además, la etapa de inmovilizar sobre un soporte sólido a los nuevos azúcares reductores generados.

42. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende, además, la etapa de poner en contacto el azúcar con uno o con varios enzimas elegidos entre las clases de las glicosiltransferasas, las sulfatasas, las fosforilasas, las sulfotransferasas, las fosfotransferasas, las glicosintasas y las transglicosidasas, convirtiéndose en este caso dicho azúcar en una nueva estructura.

43. El método según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, que comprende la detección de los nuevos azúcares generados o de las nuevas estructuras generadas.

44. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente reductor es un borano o un borohidruro, que comprende un enlace BH, o es un silano, que comprende un enlace SiH.