ES2326963T3 - Nuevo derivado del acido mandelico y su uso como inhibidor de la trombina. - Google Patents

Nuevo derivado del acido mandelico y su uso como inhibidor de la trombina. Download PDF

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Abstract

El compuesto Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OH) de fórmula o su sal farmacéuticamente aceptable.

Description

Nuevo derivado del ácido mandélico y su uso como inhibidor de la trombina.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un nuevo compuesto farmacéuticamente útil, en particular a un compuesto que se metaboliza en un compuesto que es un inhibidor competitivo de serina proteasas del tipo tripsina, especialmente trombina, su uso como medicamento, composiciones farmacéuticas que lo contienen y rutas sintéticas para su producción.
Antecedentes
La coagulación de la sangre es el procedimiento clave implicado tanto en la hemostasis (es decir, la prevención de la pérdida de sangre por un vaso dañado) como en la trombosis (es decir, la formación de un coágulo de sangre en un vaso sanguíneo, que algunas veces conduce a la obstrucción).
La coagulación es la consecuencia de una compleja serie de reacciones enzimáticas. Una de las últimas etapas en esta serie de reacciones es la conversión de la proenzima protrombina a la enzima activa trombina.
Se sabe que la trombina juega un papel central en la coagulación. Activa a las plaquetas, lo que conduce a la agregación de las plaquetas, convierte el fibrinógeno en monómeros de fibrina, los cuales polimerizan espontáneamente para dar polímeros de fibrina, y activa el factor XIII, el cual a su vez reticula los polímeros para formar fibrina insoluble. Además, la trombina activa el factor V y el factor VIII lo que conduce a una generación de trombina a partir de protrombina por "retroalimentación positiva".
Inhibiendo la agregación de las plaquetas y la formación y reticulación de la fibrina, sería de esperar que los agentes inhibidores efectivos de la trombina exhibieran actividad antitrombótica. Además, sería de esperar que la actividad antitrombótica aumentara mediante la inhibición efectiva del mecanismo de retroalimentación positiva.
Técnica anterior
Se ha descrito anteriormente el desarrollo de inhibidores de bajo peso molecular de trombina por Claesson en Blood Coagul. Fibrinol. (1994) 5, 411.
Blombäck et al (en J. Clin. Lab. Invest. 24, supl. 107, 59, (1969)) han descrito agentes inhibidores de la trombina basados en la secuencia de aminoácidos situada alrededor del sitio de escisión de la cadena A\alpha del fibrinógeno. De las secuencias de aminoácidos discutidas, estos autores sugirieron que la secuencia tripéptida Phe-Val-Arg (P9-P2-P1, de aquí en adelante denominada la secuencia P3-P2-P1) sería el agente inhibidor más efectivo.
Los agentes inhibidores de la trombina basados en derivados dipeptidílicos con una \alpha,\omega-aminoalquil guanidina en la posición P1 son conocidos por la patente de EE.UU. Nº 4.346.078 y la solicitud de patente internacional WO 93/11152. También se ha informado de derivados dipeptidílicos similares, estructuralmente relacionados. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 94/29336 describe compuestos con, por ejemplo, aminometil benzamidinas, aminoalquil amidinas cíclicas y aminoalquil guanidinas cíclicas en la posición P1 (la solicitud de patente internacional WO 97/23499 describe profármacos de algunos de estos compuestos); la solicitud de patente europea 0 648 780 describe compuestos, por ejemplo, con aminoalquil guanidinas cíclicas en la posición P1.
Los agentes inhibidores de la trombina basados en derivados peptidílicos, que también tienen aminoalquil guanidinas cíclicas (por ejemplo, 3- ó 4-aminometil-1-amidino-piperidina) en la posición P1 son conocidos por las solicitudes de patente europea 0 468 231, 0 559 046 y 0 641 779.
Los agentes inhibidores de la trombina basados en derivados tripeptidílicos con arginina aldehído en la posición P1 fueron descritos en primer lugar en la solicitud de patente europea 0 185 390.
Más recientemente, se han descrito derivados peptidílicos basados en arginina aldehído, modificados en la posición P3. Por ejemplo, la solicitud de patente international WO 93/18060 describe hidroxi ácidos, la solicitud de patente europea 0 526 877 des-amino ácidos y la solicitud de patente europea 0 542 525 ácidos O-metil mandélicos en la posición P3.
También se conocen agentes inhibidores de serina proteasas (por ejemplo, la trombina) basados en cetonas electrófílas en la posición P1. Por ejemplo, la solicitud de patente europea 0 195 212 describe peptidil \alpha-ceto ésteres y amidas, la solicitud de patente europea 0 362 002 fluoroalquilamida cetonas, la solicitud de patente europea 0 364 344 \alpha,\beta,\delta-tricetocompuestos y la solicitud de patente europea 0 530 167 derivados de \alpha-alcoxi cetona de arginina en la posición P1.
Otros agentes inhibidores de serina proteasas estructuralmente diferentes, semejantes a la tripsina basados en derivados de arginina con ácido borónico en el extremo C-terminal y sus análogos de isotiouronio son conocidos por la solicitud de patente europea 0 293 881.
Más recientemente, se han descrito agentes inhibidores de la trombina basados en derivados de peptidilo en la solicitud de patente europea 0 669 317 y las solicitudes de patentes internacionales WO 95/35309, WO 95/23609, WO 96/25426, WO 97/02284, solicitudes WO 95/35309, WO 95/23609, WO 96/25426, WO 97/02284, WO 97/46577, WO 96/32110, WO 96/31504, WO 96/03374, WO 98/06740, WO 97/49404, WO 98/57932, WO 99/29664, WO 00/35869 y WO 00/42059.
En particular, el documento WO 97/02284 y el documento WO 00/42059 describe agentes inhibidores de trombina con ácidos mandélicos sustituidos en la posición P3.
Sin embargo, permanece una necesidad de agentes inhibidores efectivos de serina proteasas semejantes a la tripsina, tales como la trombina. También hay una necesidad de compuestos que tengan un perfil farmacocinético favorable y sean selectivos para inhibir la trombina con respecto a otras serina proteasas, en particular las implicadas en la hemostasis. Sería de esperar que los compuestos que exhiben actividad inhibidora competitiva hacia la trombina fueran especialmente útiles como anticoagulantes y por lo tanto en el tratamiento terapéutico de la trombosis y trastornos relacionados.
Descripción de la invención
De acuerdo con invención se proporciona el compuesto Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OH) de fórmula
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1 
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o su sal farmacéuticamente aceptable.
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Se proporciona un compuesto de fórmula I
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2 
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(es decir, Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2,6-diF)), su derivado farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "derivado farmacéuticamente aceptable" incluye sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, sales de adición de ácido).
Las abreviaturas se explican al final de esta memoria descriptiva.
El compuesto de fórmula I puede prepararse de acuerdo con técnicas muy conocidas para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe de aquí en adelante.
\newpage
Según otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula I, que comprende:
1.
\;
(i)
el acoplamiento de un compuesto de fórmula II,
3
con un compuesto de fórmula III,
4
por ejemplo, en presencia de un agente de acoplamiento (por ejemplo, cloruro de oxalilo en DMF, EDC, DCC, HBTU, HATU, PyBOP o TBTU), una base apropiada (por ejemplo, piridina, DMAP, TEA, 2,4,6-colidina o DIPEA) y un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, EtOAc o DMF);
2.
\;
(ii)
el acoplamiento de un compuesto de fórmula IV,
5
con el compuesto de fórmula V,
6
por ejemplo, bajo condiciones como se describe en el procedimiento (i) anterior; o
3.
\;
(iii)
reacción de un compuesto de fórmula XVI correspondiente, como se describe de aquí en adelante, con una fuente adecuada de amonio (por ejemplo, acetato de amonio o gas amoniaco) bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como por reacción de un intermedio de etilimidoato (formado por la reacción de un compuesto de fórmula XVI con HCl(g) en etanol) con gas amoniaco en etanol, o bajo las condiciones descritas en Tetrahedron Lett. 40, 7067 (1999).
Los compuestos de fórmula II están disponibles usando técnicas conocidas y/o convencionales.
Por ejemplo, los compuestos de fórmula II pueden prepararse por la reacción del aldehído de fórmula VI,
7
con:
(a)
un compuesto de fórmula VII,
VIIR''CN
en la que R'' representa H o (CH_{3})_{3}Si, por ejemplo, a temperatura ambiente o elevada (p. ej. inferior a 100ºC) en presencia de un disolvente orgánico adecuado (p. ej., cloroformo o cloruro de metileno) y, si es necesario, en presencia de una base adecuada (p. ej., TEA) y/o un sistema catalítico adecuado (p. ej., cloruro de bencilamonio o yoduro de cinc, o usando un catalizador quiral, por ejemplo, como se describe en Chem. Rev., (1999) 99, 3649), seguido de hidrólisis en condiciones que son muy conocidas para los expertos en la técnica (por ejemplo, como se describe de aquí en adelante);
(b)
NaCN o KCN, por ejemplo, en presencia de NaHSO_{3} y agua, seguido de hidrólisis;
(c)
cloroformo, por ejemplo, a temperatura elevada (p. ej., por encima de la temperatura ambiente pero por debajo de 100ºC) en presencia de un disolvente orgánico adecuado (p. ej., cloroformo) y, si es necesario, en presencia de un sistema catalítico adecuado (p. ej., cloruro de bencilamonio), seguido de hidrólisis;
(d)
un compuesto de fórmula VIII,
8
en la que M representa Mg o Li, seguido de escisión oxidante (por ejemplo, ozonolisis o catalizada por osmio o rutenio) en condiciones que son muy conocidas para los expertos en la técnica; o
(e)
tris(metiltio)metano en condiciones que son bien conocidas por los expertos en la técnica, seguido de hidrólisis en presencia de, por ejemplo, HgO y HBF_{4}.
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Los compuestos de fórmula II pueden prepararse de forma alternativa mediante la oxidación de un compuesto de fórmula IX,
9
o un derivado del mismo, que está opcionalmente protegido en el grupo hidroxilo secundario, en presencia de un agente oxidante adecuado (por ejemplo, una combinación de un oxidante por radicales libres adecuado (tal como TEMPO) y una sal de hipoclorito adecuada (tal como hipoclorito sódico)) en condiciones conocidas para el experto en la técnica, por ejemplo a entre -10ºC y temperatura ambiente, en presencia de un disolvente adecuado (p. ej., agua, acetona o una mezcla de los mismos), una sal adecuada (p. ej., haluro de metal alcalino tal como bromuro potásico) y una base adecuada (p. ej., un carbonato o hidrogenocarbonato de metal alcalino, tal como hidrogenocarbonato de sodio).
Las formas enantioméricamente puras de los compuestos de fórmula II (es decir, aquellos compuestos que tienen diferentes configuraciones de sustituyentes sobre el átomo de C \alpha- respecto al grupo CO_{2}H) pueden separarse mediante una etapa de derivatización enantioespecífica. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante un procedimiento enzimático. Tales procedimientos enzimáticos incluyen, por ejemplo, transesterificación del grupo \alpha-OH entre la temperatura ambiente y la de reflujo (por ejemplo, entre 45 y 65ºC) en presencia de una enzima adecuada (por ejemplo, Lipasa PS Amano), un éster apropiado (por ejemplo, acetato de vinilo) y un disolvente adecuado (por ejemplo, metil-terc-butil-éter). El isómero derivatizado puede entonces separarse del isómero sin reaccionar por técnicas de separación convencionales (por ejemplo, cromatografía).
Los grupos añadidos a los compuestos de fórmula II en tal etapa de derivatización pueden separarse antes de cualquier reacción posterior o en cualquier etapa posterior en la síntesis de compuestos de fórmula I. Los grupos adicionales pueden separarse usando técnicas convencionales (por ejemplo, para ésteres del grupo \alpha-OH, hidrólisis en condiciones conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, entre temperatura ambiente y de reflujo en presencia de una base adecuada (por ejemplo, NaOH) y un disolvente apropiado (por ejemplo, MeOH, agua o sus mezclas))).
Los compuestos de fórmula III se pueden preparar por acoplamiento del ácido azetidina-2-carboxílico a un compuesto de fórmula V, como se ha definido en lo que antecede, por ejemplo, en condiciones similares a las descritas en la presente memoria para preparar los compuestos de fórmula I.
Los compuestos de fórmula IV pueden prepararse por acoplamiento de un compuesto de fórmula II, como se ha definido en lo que antecede, al ácido azetidina-2-carboxílico, por ejemplo, en condiciones similares a las descritas en la presente memoria para preparar los compuestos de fórmula I.
El compuesto de fórmula VI está disponible usando técnicas conocidas y/o convencionales. por ejemplo, puede prepararse por:
(i)
metalación (en la que el metal puede ser, por ejemplo, un metal alcalino tal como Li o, preferiblemente, un metal divalente tal como Mg) de un compuesto de fórmula X,
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10 
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en la que Hal representa un átomo de halógeno seleccionado entre Cl, Br y I, seguido por la reacción con una fuente adecuada del grupo formilo (tal como N,N-dimetilformamida), por ejemplo, en las condiciones descritas de aquí en adelante;
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(ii)
reducción de un compuesto de fórmula XI,
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11 
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en presencia de un agente reductor adecuado (por ejemplo, DIBAL-H); o
\newpage
(iii)
oxidación de un compuesto de fórmula XII,
12
en presencia de un agente oxidante adecuado (p. ej., MnO_{2}, clorocromato de piridinio, una combinación de DMSO y cloruro de oxalilo, o complejo de SO_{3} y piridina en DMSO).
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Los compuestos de fórmula IX pueden prepararse por la dihidroxilación de un compuesto correspondiente de fórmula XIII
13
en presencia de un agente dihidroxilante adecuado (por ejemplo, un reactivo o mezcla de reactivos que proporcione OsO_{4}, tal como AD-mezcla-\alpha o, particularmente, AD-mezcla-\beta), por ejemplo, bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como entre -10ºC y temperatura ambiente en presencia de un disolvente apropiado (por ejemplo, agua, terc-butanol o sus mezclas). Cuando se emplean oxidantes asimétricos tales como AD-mezcla-\alpha o AD-mezcla-\beta, este método puede usarse para preparar compuestos de fórmula IX que tengan configuraciones específicas de los grupos (es decir, R o S) sobre ambos de los átomos C a los que se unen los grupos hidroxilo primario y secundario.
El compuesto de fórmula XIII puede prepararse por la reacción de un compuesto de fórmula X correspondiente, como se define en lo anterior en este documento, con una fuente adecuada del anión vinilo (por ejemplo, tributil(vinil)estaño) bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, a temperaturas entre ambiente y reflujo (por ejemplo, 50ºC) en presencia de un disolvente apropiado (por ejemplo, tolueno), un agente de acoplamiento adecuado (por ejemplo, un complejo de coordinación de paladio(0) tal como tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0)) y opcionalmente en presencia de un catalizador apropiado (por ejemplo, 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol).
Los compuestos de fórmula V, VII, VIII, X, XI, XII y el ácido azetidina-2-carboxílico están disponibles en el comercio, son conocidos en la bibliografía, o se pueden obtener de forma análoga a los procedimientos descritos en la presente memoria, o por procedimientos sintéticos convencionales, de acuerdo con técnicas estándar, a partir de materiales de partida fácilmente disponibles, usando reactivos y condiciones de reacción adecuadas. Los compuestos de fórmula XVI pueden obtenerse mediante los procedimientos descritos de aquí en adelante.
Los sustituyentes sobre el anillo fenilo en los compuestos de fórmula I, II, III, IV, V, VI, IX, X, XI, XII y XIII pueden introducirse usando técnicas muy conocidas para los expertos en la técnica por medio de interconversiones de grupos funcionales estándar, de acuerdo con técnicas estándar, a partir de materiales de partida fácilmente disponibles usando los reactivos y las condiciones de reacción apropiados.
Por ejemplo, los compuestos de fórmula I, II, IV, VI, X, XI y XII pueden prepararse a partir de los compuestos correspondientes a aquellos compuestos, en los que, en lugar del grupo -OCHF_{2}, están presentes grupos -OH (en lo sucesivo en este documento denominados "los compuestos precursores de fenol relevantes"), por ejemplo, por reacción de tal compuesto precursor de fenol relevante con un haloalcano fluorado apropiado (tal como ClCHF_{2}), por ejemplo, a temperatura ambiente o superior (por ejemplo, a reflujo) en presencia de una base adecuada (por ejemplo, terc-butóxido de potasio, KOH o NaOH, por ejemplo, en solución acuosa) y un disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, THF, cloroformo o i-propanol), por ejemplo, como se describe de aquí en adelante.
El experto en la técnica apreciará que tales transformaciones del grupo funcional pueden llevarse a cabo en una etapa anterior en la síntesis global de los compuestos de formula II, IV, VI, X, XI y XII (es decir, sobre precursores apropiados de los compuestos precursores de fenol relevantes). Los compuestos precursores de fenol relevantes están tanto comercialmente disponibles, son conocidos en la bibliografía, o pueden obtenerse por analogía con los procedimientos descritos en la presente memoria, o por procedimientos sintéticos convencionales, según técnicas estándares, a partir de materiales de partida fácilmente disponibles usando reactivos y condiciones de reacción apropiadas. Por ejemplo, los compuestos precursores de fenol relevantes pueden obtenerse por la desprotección de los fenoles protegidos correspondientes (en los que el grupo protector puede ser, por ejemplo, metilo, alilo, bencilo o terc-butilo) bajo condiciones estándar.
Los compuestos de fórmula I pueden aislarse de sus mezclas de reacción usando técnicas convencionales.
Los derivados farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I también incluyen derivados "protegidos", y/o compuestos que actúan como profármacos, de compuestos de fórmula I.
Los compuestos que pueden actuar como profármacos de los compuestos de fórmula I que pueden mencionarse incluyen compuestos de fórmula Ia,
14
en la que
R^{1} representa OR^{2} o C(O)OR^{3};
R^{2} representa un átomo de H, un grupo alquilo de C_{1-10}, alquil C_{1-3}-arilo o alquil C_{1-3}-oxiarilo (las partes alquilo de los dos últimos grupos están opcionalmente interrumpidas por uno o más átomos de oxígeno, y las partes arilo de los dos últimos grupos están opcionalmente sustituidas por uno o más sustituyentes seleccionados de un resto halo, un grupo fenilo, un grupo metilo o un grupo metoxi, cuyos tres últimos grupos también están opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes halo); y
R^{3} representa un grupo alquilo C_{1-10} (cuyo último grupo está opcionalmente interrumpido por uno o más átomos de oxígeno), o un grupo alquil C_{1-3}-arilo o alquil C_{1-3}-oxiarilo (las partes alquilo de los dos últimos grupos están opcionalmente interrumpidas por uno o más átomos de oxígeno, y las partes arilo de los dos últimos grupos están opcionalmente sustituidas por uno o más sustituyentes seleccionados de un resto halo, un grupo fenilo, un grupo metilo o un grupo metoxi, cuyos tres últimos grupos también están opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes halo),
y sus derivados farmacéuticamente aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "derivados farmacéuticamente aceptables" de los compuestos de fórmula Ia incluyen las sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, sales de adición de ácido).
Los grupos alquiloxiarilo que R^{2} y R^{3} pueden representar comprenden un grupo alquilo y un arilo unidos por medio de un átomo de oxígeno. Los grupos alquilarilo y alquiloxiarilo están unidos al resto de la molécula vía la parte alquilo de esos grupos, parte alquilo que puede (si hay un número suficiente (es decir, tres) de átomos de carbono) ser de cadena ramificada. Las partes arilo de los grupos alquilarilo y alquiloxiarilo que R^{2} y R^{3} pueden representar, o con los que puede estar sustituido, incluyen grupos carbocíclicos y heterocíclicos aromáticos, tales como fenilo, naftilo, piridinilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, indolilo y benzofuranilo y similares.
Los grupos alquilo que R^{2} y R^{3} pueden representar pueden ser de cadena lineal o, cuando hay un número suficiente (es decir, un mínimo de tres) de átomos de carbono, de cadena ramificada y/o cíclicos. Además, cuando hay un número suficiente de átomos de carbono (esto es, un mínimo de cuatro), tales grupos alquilo también pueden ser parte cíclicos/acíclicos. Tales grupos alquilo también pueden ser saturados o, cuando hay un número suficiente de átomos de carbono (esto es, un mínimo de dos), pueden ser insaturados.
Los grupos halo con los que R^{2} y R^{3} pueden estar sustituidos incluyen fluoro, cloro, bromo y yodo.
\newpage
Cuando R^{1} representa C(O)OR^{3}, los grupos R^{3} preferidos incluyen:
(a)
grupos alquilo de C_{3-6} lineales, ramificados o cíclico, por ejemplo, un grupo cicloalquilo de C_{4-6};
(b)
grupos alquilo de C_{1-2}-arilo, tales como el grupo bencilo, opcionalmente sustituidos como se indicó antes en la presente memoria.
Los compuestos preferidos de fórmula Ia incluyen aquellos en los que R^{1} representa OR^{2}.
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Cuando R^{1} representa OR^{2}, los grupos R^{2} preferidos incluyen:
(a)
un átomo de H;
(b)
alquilo C_{1-8} no sustituido, lineal, ramificado o cíclico (por ejemplo, C_{1-6}), tal como alquilo C_{1-3} lineal (por ejemplo, etilo o, particularmente, metilo), alquilo C_{3-8} ramificado (por ejemplo, i-propilo, i-butilo o 4-heptilo) o alquilo C_{4-7} cíclico (es decir, cicloalquilo C_{4-7}, por ejemplo, ciclobutilo o ciclohexilo);
(c)
un grupo alquil C_{1-3}-oxifenilo (por ejemplo, alquil C_{2}-oxifenilo), cuyo grupo fenilo está opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes como se indica en lo anterior en este documento (por ejemplo, trifluorometilo);
(d)
un grupo alquil C_{1-2}-arilo (por ejemplo, metilarilo), en el que el grupo arilo es un grupo fenilo, piridinilo o isoxazolilo, cuyos tres últimos grupos están opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes como se indica en lo anterior en este documento (por ejemplo, metoxi, metilo, bromo y/o cloro).
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Los compuestos preferidos de fórmula Ia incluyen aquellos en los que R^{1} representa OR^{2} y R^{2} representa alquilo C_{1-6} (por ejemplo, C_{1-4}) lineal, ramificado (cuando sea apropiado), o cíclico (cuando sea apropiado), tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo o ciclobutilo.
Los compuestos de fórmula Ia pueden prepararse por uno o más de los siguientes métodos:
(a)
la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula II como se define en lo anterior en este documento con un compuesto de fórmula XIV,
15
en el que R^{1} es como se define en lo anterior en este documento, por ejemplo, bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento para la síntesis de compuestos de fórmula I;
\vskip1.000000\baselineskip
(b)
la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula IV como se define en lo anterior en este documento con un compuesto de fórmula XV,
16
en el que R^{1} es como se define en lo anterior en este documento, por ejemplo, bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento para la síntesis de compuestos de fórmula I;
\newpage
(c)
para compuestos de fórmula Ia en los que R^{1} representa OH, la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula XVI,
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17
con hidroxilamina, por ejemplo, bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica;
\vskip1.000000\baselineskip
(d)
para compuestos de fórmula Ia en los que R^{1} representa OR^{2}, reacción de un derivado protegido de un compuesto correspondiente de fórmula I que es, por ejemplo, un compuesto de fórmula XVII,
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18
en el que R^{a} representa, por ejemplo, -CH_{2}CH_{2}-Si(CH_{3})_{3} o bencilo, o su tautómero, con un compuesto de fórmula XVIII,
XVIIIR^{2}ONH_{2}
en el que R^{2} es como se define en lo anterior en este documento, o su sal de adición de ácido, por ejemplo, a temperaturas entre ambiente y reflujo en presencia de un disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, THF, CH_{3}CN, DMF o DMSO), seguido de la eliminación del grupo -C(O)OR^{a} bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, haciéndolo reaccionar con QF o TFA (por ejemplo, como se describe de aquí en adelante));
(e)
para compuestos de fórmula Ia en los que R^{1} representa OH, la reacción de un compuesto de fórmula XVII, como se define en lo anterior en este documento, en el que R^{a} representa bencilo con hidroxilamina, o su sal de adición de ácido, por ejemplo, bajo condiciones que serán muy conocidas por los expertos en la técnica;
(f)
para compuestos de fórmula Ia en los que R^{1} representa COOR^{3}, la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula I como se define en lo anterior en este documento con un compuesto de fórmula XIX,
XIXL^{1}COOR^{3}
en el que L' representa un grupo saliente adecuado, tal como halo o nitrofenilo (por ejemplo, 4-nitrofenilo), y R^{3} es como se define en lo anterior en este documento, por ejemplo, a temperatura ambiente o aprox. temperatura ambiente en presencia de una base adecuada (por ejemplo, NaOH, por ejemplo, en solución acuosa) y un disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, cloruro de metileno); o
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(g)
para compuestos de fórmula Ia en los que R^{1} representa OCH_{3} o OCH_{2}CH_{3}, la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula Ia en el que R^{1} representa OH con sulfato de dimetilo o sulfato de dietilo, respectivamente, por ejemplo, en presencia de una base adecuada (por ejemplo, un hidróxido de un metal alcalino tal como KOH (por ejemplo, en disolución acuosa a, por ejemplo, 50% en peso)) y un catalizador apropiado (por ejemplo, un haluro de amonio cuaternario como cloruro de benciltrimetilamonio (por ejemplo, en disolución de CH_{2}Cl_{2} o THF a, por ejemplo, 10% en peso)).
\newpage
Los compuestos de fórmula XVI pueden prepararse por la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula II, como se define en lo anterior en este documento, con un compuesto de fórmula XX,
19
por ejemplo bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento para la síntesis de compuestos de fórmula I.
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Los compuestos de fórmula XVI pueden prepararse de forma alternativa por la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula IV, como se define en lo anterior en este documento, con un compuesto de fórmula XXI,
20
por ejemplo bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento para la síntesis de compuestos de fórmula I.
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Los compuestos de fórmula XVII pueden prepararse por la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula II, como se define en lo anterior en este documento, con un compuesto de fórmula XXII,
21
en el que R^{a} es como se define en lo anterior en este documento, por ejemplo, bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento para la síntesis de compuestos de fórmula I.
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De forma alternativa, los compuestos de fórmula XVII pueden prepararse por la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula I con un compuesto correspondiente a un compuesto de fórmula XIX en el que, en lugar de R^{3}, el grupo R^{a} está presente, en el que R^{a} es como se define en lo anterior en este documento, por ejemplo, bajo las condiciones descritas antes con respecto a la preparación de compuestos de fórmula Ia.
Los compuestos de fórmula XIV y XXII pueden prepararse por la reacción del ácido azetidina-2-carboxílico, respectivamente, con un compuesto de fórmula XV como se define en lo anterior en este documento, o un compuesto de fórmula XXIII,
22
en el que R^{a} es como se define en lo anterior en este documento, por ejemplo, bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento para la síntesis de compuestos de fórmula I.
\newpage
Los compuestos de fórmula XV, XVIII, XIX, XX, XXI y XXIII están disponibles en el comercio, son conocidos en la bibliografía, o se pueden obtener de forma análoga a los procedimientos descritos en la presente memoria, o por procedimientos sintéticos convencionales, de acuerdo con técnicas estándar, a partir de materiales de partida fácilmente disponibles, usando reactivos y condiciones de reacción adecuadas. Por ejemplo, los compuestos de fórmula XX pueden prepararse por la reacción de un compuesto correspondiente de fórmula XXI con ácido azetidina-2-carboxílico, por ejemplo, bajo condiciones similares a las descritas en lo anterior en este documento.
Los compuestos de fórmulas I y Ia, según se definen antes, y sus derivados, se denominarán en lo sucesivo en este documento "los compuestos".
El compuesto de la invención puede exhibir tautomerismo. Todas las formas tautómeras y sus mezclas están incluidas dentro del alcance de la invención. Las formas tautómeras particulares que pueden mencionarse incluyen las conectadas con la posición del doble enlace en la funcionalidad amidina en un compuesto de fórmula Ia, y la posición del sustituyente R^{1}.
El compuesto de la invención también contiene dos átomos de carbono asimétricos y puede exhibir, por lo tanto, isomerismo óptico y/o diastereoisomerismo. Los diastereoisómeros pueden separarse usando técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía. Los diversos estereoisómeros pueden aislarse por separación de una mezcla racémica u otra mezcla de los compuestos usando técnicas convencionales, por ejemplo, técnicas HPLC. Alternativamente, los isómeros ópticos deseados pueden fabricarse por reacción de los materiales de partida apropiados ópticamente activos en condiciones que no provoquen racemización o epimerización, o por derivatización, por ejemplo, con un ácido homoquiral seguido por separación de los derivados diastereómeros por medios convencionales (por ejemplo, HPLC, cromatografía sobre sílice).
Los compuestos en los que
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23
el fragmento está en configuración S son preferidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos preferidos incluyen aquellos en los que el fragmento estructural
24
está en configuración R.
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Las líneas onduladas en los enlaces en los dos fragmentos anteriores significan las posiciones de enlace de los fragmentos.
Así, los compuestos preferidos incluyen:
Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF);
Ph(3-Cl)(6-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OMe); y
Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OH).
\newpage
Los expertos en la técnica apreciarán que en los procedimientos anteriormente descritos y de aquí en adelante los grupos funcionales de los compuestos intermedios pueden necesitar ser protegidos mediante grupos protectores.
Los grupos funcionales que son deseables de proteger incluyen los grupos hidroxi, amino y ácido carboxílico. Los grupos protectores adecuados para hidroxi incluyen opcionalmente grupos alquilo sustituidos y/o insaturados (por ejemplo, metilo, alilo, bencilo o terc-butilo), grupos trialquilsililo o diarilalquilsililo (por ejemplo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo o trimetilsililo) y tetrahidropiranilo. Los grupos protectores adecuados del grupo ácido carboxílico incluyen ésteres de alquilo de C_{1-6} o de bencilo.
Los grupos protectores adecuados para amino y amidino incluyen t-butiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo o 2-trimetilsililetoxicarbonilo (Teoc). Los átomos de nitrógeno del grupo amidino también pueden estar protegidos con grupos hidroxi o alcoxi, y pueden estar mono o diprotegidos.
La protección y desprotección de grupos funcionales puede ocurrir antes o después de la condensación, o antes o después de cualquier otra reacción en los esquemas anteriormente mencionados.
Los grupos protectores pueden separarse según técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica y como se describe de aquí en adelante.
Los expertos en la técnica apreciarán que, con el fin de obtener compuestos de la invención de una manera alternativa, y, en algunas ocasiones, más conveniente, las etapas individuales del procedimiento mencionadas antes en la presente memoria pueden realizarse en un orden diferente, y/o las reacciones individuales pueden realizarse en una etapa diferente en la ruta global (es decir, pueden añadirse sustituyentes y/o ser realizadas transformaciones químicas sobre compuestos intermedios diferentes a los mencionados antes en la presente memoria junto con una reacción particular. Esto puede negar, o hacer necesaria, la necesidad de grupos protectores.
El tipo de química implicada dictará la necesidad, y el tipo, de grupos protectores así como la secuencia para conseguir la síntesis.
El uso de grupos protectores se describe completamente en "Protective Groups in Organic Chemistry", editado por J W F McOmie, Plenum Press (1973), y "Protective Groups in Organic Synthesis", 3ª edición, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999).
Los derivados protegidos del compuesto de la invención pueden convertirse químicamente en el compuesto de la invención usando técnicas de desprotección estándar (por ejemplo, hidrogenación). El experto en la técnica también apreciará que ciertos compuestos de fórmula Ia también pueden denominarse "derivados protegidos" de compuestos de fórmula I.
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Uso médico y farmacéutico
Los compuestos pueden poseer actividad farmacológica por sí mismos.
Sin embargo, el compuesto de la invención puede no poseer tal actividad, aunque se puede administrar parenteralmente u oralmente, y puede ser metabolizado a partir de ahí en el cuerpo para formar compuestos que sean farmacológicamente activos. Tales compuestos (que también incluyen compuestos que pueden poseer alguna actividad farmacológica, pero que esa actividad es apreciablemente menor que la de los compuestos "activos" a los que se metabolizan), pueden por lo tanto ser descritos como "profármacos" de los compuestos activos.
Así, el compuesto de la invención es útil porque posee actividad farmacológica, y/o se metaboliza en el cuerpo después de una administración oral o parenteral para formar compuestos que poseen actividad farmacológica. El compuesto de la invención se indica por lo tanto como agente farmacéutico.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona así el compuesto de la invención para uso como agente farmacéutico.
En particular, el compuesto de la invención se metaboliza después de su administración para formar potentes inhibidores de trombina, por ejemplo, como puede demostrarse en las pruebas descritas más abajo.
Mediante "profármaco de un agente inhibidor de la trombina", se incluyen compuestos que forman un agente inhibidor de la trombina, en una cantidad experimentalmente detectable, y dentro de un tiempo predeterminado (por ejemplo, aproximadamente 1 hora), tras la administración oral o parenteral (véase, por ejemplo, el ensayo E más adelante) o, alternativamente, tras la incubación en presencia de microsomas de hígado (véase, por ejemplo, el ensayo G más adelante).
Así, se espera que el compuesto de la invención sea útil en enfermedades en las que se requiera la inhibición de la trombina y/o en enfermedades en las que se indique una terapia anticoagulante, incluyendo las siguientes:
El tratamiento y/o profilaxis de la trombosis y la hipercoagulabilidad en la sangre y/o los tejidos de animales incluyendo el hombre. Se sabe que la hipercoagulabilidad puede conducir a enfermedades tromboembólicas. Las afecciones asociadas con la hipercoagulabilidad y las enfermedades tromboembólicas que pueden mencionarse incluyen la resistencia heredada o adquirida a la proteína C activada, tal como la mutación del factor V (factor V de Leiden), y deficiencias heredadas o adquiridas en antitrombina III, proteína C, proteína S, cofactor II de la heparina. Otras afecciones que se sabe que están asociadas con la hipercoagulabilidad y la enfermedad tromboembólica incluyen anticuerpos antifosfolípidos circulantes (Lupus anticoagulante), homocisteinemia, trombocitopenia inducida por la heparina y defectos en la fibrinolisis, así como los síndromes de coagulación (por ejemplo, coagulación intravascular diseminada (CID)) y lesión vascular en general (por ejemplo, debido a la cirugía).
El tratamiento de afecciones en las que hay un exceso indeseable de trombina sin signos de hipercoagulabilidad, por ejemplo, en enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer.
Los estados patológicos particulares que pueden mencionarse incluyen el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de la trombosis venosa (por ejemplo, VTP) y la embolia pulmonar, trombosis arterial (por ejemplo, en el infarto de miocardio, angina inestable, la apoplejía basada en la trombosis y la trombosis arterial periférica), y embolia sistémica normalmente desde la aurícula durante la fibrilación auricular (p. ej., fibrilación auricular no valvular) o desde el ventrículo izquierdo después del infarto de miocardio transmural, o provocada por insuficiencia cardiaca congestiva; la profilaxis de reoclusión (es decir, trombosis) después de la trombolisis, la angioplastia transluminal percutánea (ATP) y las operaciones de derivación coronaria; la prevención de la retrombosis después de microcirugía y cirugía vascular en general.
Indicaciones adicionales incluyen el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de la coagulación intravascular diseminada provocada por bacterias, el trauma múltiple, la intoxicación o cualquier otro mecanismo; el tratamiento anticoagulante cuando la sangre está en contacto con superficies extrañas en el cuerpo tales como los injertos vasculares, stents vasculares, catéteres vasculares, válvulas prostéticas mecánicas y biológicas, o cualquier otro dispositivo médico; y el tratamiento anticoagulante cuando la sangre está en contacto con dispositivos médicos fuera del cuerpo tal como durante la cirugía cardiovascular usando una máquina corazón-pulmón o en hemodiálisis; el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del síndrome idiopático y de dificultad respiratoria en adultos, fibrosis pulmonar tras el tratamiento con radiación o quimioterapia, choque séptico, septicemia, respuestas inflamatorias, las cuales incluyen, pero no se limitan edema, aterosclerosis aguda o crónica tal como enfermedad arterial coronaria y la formación de placas ateroscleróticas, enfermedad cerebral arterial, infarto cerebral, trombosis cerebral, embolia cerebral, enfermedad arterial periférica, isquemia, angina (incluyendo la angina inestable), daño por reperfusión, reestenosis después de la angioplastia transluminal percutánea (PTA) y cirugía coronaria de derivación de las arterias.
El compuesto de la invención que inhibe a la tripsina y/o a la trombina también puede ser útil en el tratamiento de la pancreatitis.
Los compuestos de la invención están así indicados tanto en los tratamientos terapéuticos como profilácticos de estas enfermedades.
El compuesto de la invención normalmente se administrará por vía oral, intravenosa, subcutánea, bucal, rectal, dérmica, nasal, traqueal, bronquial, y por cualquier otra vía parenteral o vía de inhalación, en forma de preparaciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de la invención en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable.
Dependiendo del trastorno y el paciente que se tenga que tratar y la vía de administración, las composiciones se pueden administrar en dosis variables.
El compuesto de la invención también se pueden combinar y/o coadministrar con cualquier agente o agentes antitrombóticos con un mecanismo de acción diferente, tal como uno o más de los siguientes: los agentes antiplaquetarios ácido acetilsalicílico, ticlopidina y clopidogrel; receptor de tromboxano y/o inhibidores de sintetasa; antagonistas del receptor de fibrinógeno; miméticos de prostaciclina; inhibidores de fosfodiesterasa; antagonistas del receptor de ADP (P_{2}T); e inhibidores de carboxipeptidasa U (CPU).
El compuesto de la invención puede además combinarse y/o coadministrarse con agentes trombolíticos tales como uno o más de, el activador de plasminógeno tisular (natural, recombinante o modificado), la estreptoquinasa, la uroquinasa, la prouroquinasa, el complejo activador de plasminógeno-estreptoquinasa anisoilado (APSAC), activadores de las glándulas salivales en animales, y similares, en el tratamiento de enfermedades trombóticas, en particular el infarto de miocardio.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una formulación farmacéutica que incluye el compuesto de la invención, en mezcla con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las dosis diarias adecuadas del compuesto de la invención en el tratamiento terapéutico de seres humanos es de aproximadamente 0,001-100 mg/kg de peso corporal con administración peroral y 0,001-50 mg/kg de peso corporal con administración parenteral, excluyendo el peso de cualquier contraión ácido.
Para evitar dudas, según se emplea en esta memoria, el término "tratamiento" incluye tratamiento terapéutico y/o profiláctico.
El compuesto de la invención tiene la ventaja de que puede ser más eficaz, menos tóxico, de mayor período de actuación, tener un espectro de actividad más amplio, ser más potente, producir menos efectos secundarios, ser más fácilmente adsorbido y/o tener un perfil farmacocinético mejor (por ejemplo, mayor biodisponibilidad oral y/o menor aclaramiento) y/o tener otras propiedades farmacológicas, físicas o químicas útiles que los compuestos conocidos en la técnica anterior. El compuesto de la invención puede tener la ventaja adicional de que se puede administrar con menos frecuencia que los compuestos conocidos en la técnica anterior.
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Ensayos biológicos
Pueden emplearse los siguientes procedimientos de ensayo.
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Ensayo A
Determinación del tiempo de coagulación de la trombina (TT)
La solución de inhibidor (25 TL) se incuba con plasma (25 TL) durante tres minutos. A continuación, se añade entonces trombina humana (T 6769; Sigma Chem. Co o Hematologic Technologies) en una disolución tampón, pH 7,4 (25 TL, 4,0 NIH unidades/mL) y se mide el tiempo de coagulación en un dispositivo automático (KC 10; Amelung).
El tiempo de coagulación de la trombina (TT) se expresa como valores absolutos (segundos) así como la relación de TT sin agente inhibidor (TT_{0}) respecto a TT con agente inhibidor (TT_{i}). Las últimas relaciones (amplitud 1-0) se representan frente a la concentración de agente inhibidor (transformada en log) y se ajustan a curvas sigmoidales dosis-respuesta según la ecuación
y = a/[1+(x/IC_{50})^{s}]
donde: a = amplitud máxima, es decir, 1; s = pendiente de la curva dosis-respuesta; e IC_{50} = la concentración de agente inhibidor que dobla el tiempo de coagulación. Los cálculos se procesan en un PC usando el programa informático GraFit versión 3, regulando la ecuación igual a: Inicio a 0, final definido = 1 (Erithacus Software, Robin Leatherbarrow, Imperial College de Science, London, UK).
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Ensayo B
Determinación de la inhibición de trombina con un ensayo cromógeno robótico
Hombrechtikon, Suiza), usando placas de microtítulo de 96 pocillos de medio volumen (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.; Nº. Cat. 3690). Disoluciones madre de la sustancia a ensayar en DMSO (72 \muL), 0,1 - 1 mmol/L, se diluyen en serie 1:3 (24 + 48 \muL) con DMSO para obtener diez concentraciones diferentes, las cuales se analizan como muestras en el ensayo. Se añaden 2 \muL, de la muestra de ensayo se diluye con 124 \muL de tampón de ensayo, 12 \muL de solución de sustrato cromogénico (S-2366, Chromogenix, Mölndal, Suecia) en tampón de ensayo y finalmente 12 \muL de solución de \alpha-trombina (\alpha-trombina humana, Sigma Chemical Co. o Hematologic Technologies) en tampón de ensayo y las muestras se mezclan. Las concentraciones finales de ensayo son: sustancia a ensayar 0,00068 - 13,3 \mumol/L, S-2366 0,30 mmol/L, \alpha-trombina 0,020 unidades NIH/mL. El incremento de absorbancia lineal durante 40 minutos de incubación a 37ºC se usa para el cálculo del porcentaje de inhibición para las muestras de ensayo, según se compara con los controles sin inhibidor. El valor IC_{50}-robótico, que corresponde a la concentración de agente inhibidor que provoca un
50% inhibición de la actividad de la trombina, se calcula a partir de la curva log concentración vs. % de inhibición.
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Ensayo C
Determinación de la constante de inhibición K_{i} para la trombina de ser humano
Las determinaciones de K_{i} se hacen usando un método con sustrato cromogénico, realizado a 37ºC en un analizador centrífugo Cobas Bio (Roche, Basilea, Suiza). La actividad enzimática residual después de la incubación de \alpha-trombina de ser humano con varias concentraciones de compuesto a ensayar se determina a tres concentraciones diferentes de sustrato, y se mide como el cambio en la absorbancia óptica a 405 nm.
Las soluciones del compuesto de ensayo (100 \muL; normalmente en disolución amortiguadora del pH o salina que contiene BSA 10 g/L) se mezclan con 200 \muL de \alpha-trombina de ser humano (Sigma Chemical Co) en disolución amortiguadora del pH de ensayo (0,05 mol/L Tris-HCl pH 7,4, fuerza iónica 0,15 ajustada con NaCl) que contiene BSA (10 g/L), y se analizan como muestras en el equipo Cobas Bio. Se añade una muestra de 60 \muL, junto con 20 \muL de agua, a 320 \muL del sustrato S-2238 (Chromogenix AB, Mölndal, Suecia) en disolución amortiguadora del pH de ensayo, y se monitoriza el cambio de la absorbancia (\DeltaA/min). Las concentraciones finales de S-2238 son 16, 24 y 50 \mumol/L y de la trombina 0,125 unidades NIH/mL.
La velocidad de reacción en estado estacionario se usa para construir representaciones de Dixon, es decir, diagramas de la concentración de inhibidor vs. 1/(\DeltaA/min). Para agentes inhibidores competitivos reversibles, los puntos de los datos para las diferentes concentraciones de sustrato forman típicamente líneas rectas que interceptan en x = -K_{i}.
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Ensayo D
Determinación del tiempo parcial activado de tromboplastina (APTT)
El APTT se determina en plasma citrado agrupado de seres humanos normales con el reactivo PTT Automated 5 fabricado por Stago. Los agentes inhibidores se añaden al plasma (10 \muL de disolución del agente inhibidor a 90 \muL plasma) y se incuban con el reactivo APTT durante 3 minutos seguido por la adición de 100 \muL de disolución de cloruro de calcio (0,025 M) y el APTT se determina mediante el uso del analizador de coagulación KC10 (Amelung) según las instrucciones del productor del reactivo.
El tiempo de coagulación se expresa en valores absolutos (segundos) así como la relación de APTT sin agente inhibidor (APTT_{0}) a APTT con agente inhibidor (APTT_{i}). Las últimas relaciones (amplitud 1-0) se representan frente a la concentración de agente inhibidor (transformada en log) y se ajustan a curvas sigmoidales dosis-respuesta según la ecuación
y = a/[1+(x/IC_{50})^{s}]
donde: a = amplitud máxima, es decir, 1; s = pendiente de la curva dosis-respuesta; e IC_{50} = la concentración de agente inhibidor que dobla el tiempo de coagulación. Las curvas (transformadas en logarítmicas) y ajustadas a dosis-respuesta sigmoidal según la ecuación
y = a/[1+(x/IC_{50})^{s}]
donde: a = amplitud máxima, es decir, 1; s = pendiente de la curva dosis-respuesta; e IC_{50} = la concentración de agente inhibidor que dobla el tiempo de coagulación. Los cálculos se procesan en un PC usando el programa informático GraFit versión 3, regulando la ecuación igual a: Inicio a 0, final definido = 1 (Erithacus Software, Robin Leatherbarrow, Imperial College de Science, London, UK). La IC_{50} del APTT se define como la concentración de agente inhibidor en plasma de ser humano que dobla el tiempo parcial activado de tromboplastina.
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Ensayo E
Determinación del tiempo de trombina ex vivo
La inhibición de trombina después de la administración oral o parenteral del compuesto de la invención, disuelto en etanol:Soluto13:agua (5:5:90), se examina en ratas conscientes a las que, uno o dos días antes del experimento, se les incorpora un equipo con un catéter para el muestreo de la sangre desde la arteria carótida. El día del experimento se extraen muestras de sangre a tiempos fijos después de la administración del compuesto en tubos de plástico que contiene 1 parte de disolución de citrato de sodio (0,13 mol por L) y 9 partes de sangre. Los tubos se centrifugan para obtener plasma pobre en plaquetas.
Se precipitan 50 \muL de muestras de plasma con 100 \muL de acetonitrilo frío. Las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm. Se diluyen 75 \muL del sobrenadante con 75 \muL de ácido fórmico al 0,2%. Se analizan por LC-MS/MS volúmenes de 10 \muL de las disoluciones resultantes y las concentraciones de agente inhibidor de la trombina se determinan usando curvas estándares.
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Ensayo F
Determinación del aclaramiento del plasma en rata
(concentration final 10%). Se precipitan 50 \muL de muestras de plasma con 100 \muL de acetonitrilo frío. Las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm. Se diluyen 75 \muL del sobrenadante con 75 \muL de ácido fórmico al 0,2%. Se analizan por LC-MS/MS volúmenes de 10 \muL de las disoluciones resultantes y las concentraciones de agente inhibidor de trombina se determinan usando curvas estándares. Se estimó el área bajo el perfil de la concentración en plasma-tiempo usando la regla trapezoidal log/lineal y se extrapoló a tiempo infinito. El aclaramiento en plasma (CL) del compuesto se determina entonces como
CL = Dosis/AUC
Los valores se dan en mL/min/kg.
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Ensayo G
Determinación de la estabilidad in vitro
Se preparan microsomas de hígado de ratas Sprague-Dawley y muestras de hígado humano según los SOP internos. Los compuestos se incubaron a 37ºC a una concentración total de proteínas de microsomas de 3 mg/mL en una disolución amortiguadora del pH TRIS 0,05 mol/L a pH 7,4, en presencia de los cofactores NADH (2,5 mmol/L) y NADPH (0,8 mmol/L). La concentración inicial de compuesto fue 5 ó 10 \mumol/L. Se tomaron muestras para análisis hasta 60 minutos después del comienzo de la incubación. La actividad enzimática en la muestra recogida se paró inmediatamente añadiendo ácido mirístico al 20% a un volumen correspondiente al 3,3% del volumen total de la muestra. La concentración de compuesto que permaneció (CONC FINAL) en la muestra a 60 min se determinó por medio de LCMS usando una muestra recogida a tiempo cero como referencia (CONC INICIAL). El % de inhibidor de trombina degradado se calcula como sigue:
100% x \frac{[CONC. \ INICIAL] - [CONC. \ FINAL]}{[CONC. \ INICIAL]}
Ensayo H
Modelo de trombosis arterial
El daño a los vasos se induce aplicando cloruro férrico (FeCl_{3}) tópicamente a la arteria carótida. Las ratas se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (80 mg/kg; Apoteksbolaget; Ume\ring{a}, Suecia), seguido por infusión continua (12 mg/kg/h) a lo largo de todo el experimento. La temperatura corporal de las ratas se mantuvo a 38ºC a lo largo de todo el experimento por calentamiento externo. El experimento comenzó con un período de control de 5 minutos. Cinco minutos después, se dio intravenosamente ^{125}I-fibrinógeno de ser humano (80 kBq; IM53; Amersham International, Buckinghamshire, UK) y se usó como un marcador para la incorporación subsiguiente de fibrinógeno en el trombo. El extremo proximal del segmento de la arteria carótida se colocó en un tubo de plástico (6 mm; Silastic®; Dow Corning, MI, EE.UU.) abierto longitudinalmente, que contenía papel de filtro empapado en FeCl_{3} (2 \muL; 55% p/p; Merck, Darmstadt, Alemania) (diámetro 3 mm; IF; Munktell, Grycksbo, Suecia). La arteria carótida izquierda se expuso a FeCl_{3} durante 10 minutos y a continuación se separó del tubo de plástico y se empapó en una disolución salina. Cincuenta minutos después, la arteria carótida se separó y se enjuagó en una disolución salina. También se tomaron muestras de sangre de referencia para la determinación de la actividad de ^{125}I en sangre, 10 minutos después de la inyección de ^{125}I-fibrinógeno, y al final del experimento. La actividad de ^{125}I en las muestras de sangre de referencia y en el segmento del vaso sanguíneo se midieron en un contador gamma (1282 Compugamma; LKB Wallac Oy, Turku, Finlandia) el mismo día en el que se realizó el experimento. El tamaño del trombo se determinó como la cantidad de actividad de ^{125}I incorporada en el segmento del vaso sanguíneo en relación ala actividad de ^{125}I en la sangre (cpm/mg).
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Detalles experimentales generales
Se realizó la TLC en gel de sílice. El análisis por HPLC quiral se realizó usando una columna de 46 mm X 250 mm Chiralcel OD con una precolumna de 5 cm.
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Detalles experimentales generales
Se realizó la TLC en gel de sílice. El análisis por HPLC quiral se realizó usando una columna de 46 mm X 250 mm Chiralcel OD con una precolumna de 5 cm. La temperatura de la columna se mantuvo a 35ºC. Se usó un caudal de 1,0 ml/min. Se usó un detector Gilson 115 UV a 228 nm. La fase móvil consistía en hexanos, etanol y ácido trifluroacético y se listan las proporciones apropiadas para cada compuesto. Normalmente, el producto se disolvió en una cantidad mínima de etanol y ésta se diluyó con la fase móvil.
La LC-MS/MS se realizó usando un instrumento HP-1100 equipado con un inyector CTC-PAL y una columna ThermoQuest, Hypersil BDS-C18 de 4x100 mm y 5 \mum. Se usó un detector de EM API-3000 (Sciex). El caudal fue 1,2 ml/min y la fase móvil (gradiente) consistió en acetonitrilo al 10-90% con 90-10% de disolución acuosa de acetato de amonio 4 mM, conteniendo ambas ácido fórmico al 0,2%.
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Los espectros de RMN de ^{1}H se registraron usando tetrametilsilano como patrón interno. Los espectros de RMN de ^{13}C se registraron usando los disolventes deuterados listados como patrón interno. Se proporcionan otros ejemplos distintos al ejemplo 3 como los Ejemplos de Referencia.
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Ejemplo 1 Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF) (i) 3-Cloro-5-metoxibenzaldehído
Se añadió gota a gota 3,5-dicloroanisol (74,0 g, 419 mmol) en THF (200 mL) a magnesio metal (14,2 g, 585 mmol, prelavado con HCl 0,5 N) en THF (100 ml) a 25ºC. Después de la adición, se añadió 1,2-dibromoetano (3,9 g, 20,8 mmol) gota a gota. La mezcla marrón oscuro resultante se calentó a reflujo durante 3 h. La mezcla se enfrió a 0ºC, y se añadió N,N-dimetilformamida (60 ml) en una porción. La mezcla se repartió entre éter dietílico (3 x 400 ml) y HCl 6 N (500 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (300 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron a vacío para dar un aceite. La cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con Hex:EtOAc (4:1) dio el compuesto del sub-título (38,9 g, 54%) como un aceite amarillo.
^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,90 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,15 (s, 1 H), 3,87 (s, 3H).
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(ii) 3-Cloro-5-hidroxibenzaldehído
Una disolución de 3-cloro-5-metoxibenzaldehído (22,8 g, 134 mmol; véase la etapa (i) anterior) en CH_{2}Cl_{2} (250 ml) se enfrió a 0ºC. Se añadió gota a gota tribromuro de boro (15,8 ml, 167 mmol) a lo largo de 15 min. Después de agitar la mezcla de reacción durante 2 h, se añadió H_{2}O (50 ml) lentamente. Después, la disolución se extrajo con Et_{2}O (2 x 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con Hex:EtOAc (4:1) proporcionó el compuesto del subtítulo (5,2 g, 25%).
^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,85 (s, 1H), 7,35 (s,1H), 7,20 (s,1H), 7,10 (s,1H), 3,68 (s,1H).
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(iii) 3-Cloro-5-difluorometoxibenzaldehído
Una disolución de 3-cloro-5-hidroxibenzaldehído (7,5g, 48 mmol; véase la etapa (ii) anterior) en 2-propanol (250 ml) y KOH al 30% (100 ml) se calentó a reflujo. Mientras se agitaba, se burbujeó CHClF_{2} en la mezcla de reacción durante 2 h. La mezcla de reacción se enfrió, se acidificó con HCl 1 N y se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). Los productos orgánicos se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con Hex:EtOAc (4:1) proporcionó el compuesto del subtítulo (4,6 g, 46%).
^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,95 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 6,60 (t, J_{H-F} = 71,1 Hz, 1H).
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(iv) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OTMS)CN
Una disolución de 3-cloro-5-difluorometoxibenzaldehído (4,6 g, 22,3 mmol; véase la etapa (iii) anterior) en CH_{2}Cl_{2} (200 mL) se enfrió a 0ºC. Se añadieron ZnI_{2} (1,8 g, 5,6 mmol) y cianuro de trimetilsililo (2,8 g, 27,9 mmol) y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 15 h. La mezcla se concentró parcialmente a vacío dando el compuesto del subtítulo en forma de un líquido, que se usó directamente en la siguiente etapa (v) sin más purificación o caracterización.
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(v) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OH)C(NH)OEt
Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OTMS)CN (6,82 g, implica 22,3 mmol; véase la etapa (iv) antes) se añadió gota a gota a HCl/EtOH (500 ml). La mezcla de reacción se agitó 15 h, después se concentró parcialmente a vacío dando el compuesto del subtítulo en forma de un líquido, que se usó en la etapa (vi) sin más purificación o caracterización.
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(vi) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OH)C(O)OEt
Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OH)C(NH)OEt (6,24 g, implica 22,3 mmol; véase la etapa (v) above) se disolvió en THF (250 mL), se añadió H_{2}SO_{4} 0,5 M (400 ml) y la reacción se agitó a 40ºC durante 65 h, se enfrió y después se concentró parcialmente a vacío para separar la mayor parte del THF. Después, la mezcla de reacción se extrajo con Et_{2}O (3 x 100 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró a vació para dar el compuesto del subtítulo en forma de un sólido, que se usó en la etapa (vii) sin más purificación o caracterización.
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(vii) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OH)C(O)OH
Una disolución de Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OH)C(O)OEt (6,25 g, implica 22,3 mmol; véase la etapa (vi) anterior) en 2-propanol (175 ml) y KOH al 20% (350 ml) se agitó a temperatura ambiente 15 h. Después la reacción se concentró parcialmente a vacío para separar la mayor parte del 2-propanol. El resto de la mezcla se acidificó con H_{2}SO_{4} 1 M, se extrajo con Et_{2}O (3 x 100 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a vacío para dar un sólido. La cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con CHCl_{3}:MeOH:NH_{4}OH concentrado (6:3:1) proporcionó la sal de amonio del compuesto del subtítulo. Después la sal de amonio se disolvió en una mezcla de EtOAc (75 ml) y H_{2}O (75 ml) y se acidificó con HCl 2 N. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (50 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a vacío para proporcionar el compuesto del subtítulo (3,2 g, 57% a partir de las etapas (iv) a (vii)).
^{1}H NMR (300 MHz, CD_{3}OD) \delta 7,38 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,89 (t, J_{H-F} = 71,1 Hz, 1H), 5,16 (s, 1H).
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(viii) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)OH (a) y Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(S)CH(OAc)C(O)OH (b)
Una mezcla de Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R,S)CH(OH)C(O)OH (3,2 g, 12,7 mmol; véase la etapa (vii) anterior) y Lipasa PS "Amano" (-2,0 g) en acetato de vinilo (125 ml) y MTBE (125 ml) se calentó a reflujo durante 48 h. La mezcla de reacción se enfrió, se filtró a través de Celite® y la torta de filtración se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró a vacío y se sometió a cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con CHCl_{3}:MeOH:NH_{4}OH concentrado (6:3:1) dando las sales de amonio de los compuestos (a) y (b) del subtítulo. El compuesto (a) en forma de sal se disolvió en H_{2}O, se acidificó con HCl 2 N y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar el compuesto (a) del subtítulo (1,2 g, 37%).
Para el compuesto (a) del subtítulo
^{1}H NMR (300 MHz, CD_{3}OD) \delta 7,38 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,89 (t, J_{H-F} = 71,1 Hz, 1H), 5,17 (s, 1H).
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(ix) 2,6-Difluoro-4[(metilsulfinil)(metiltio)metil]benzonitrilo
Se disolvió (metilsulfinil)(metiltio)metano (7,26g, 0,0584 mol) en 100 ml de THF seco en argón y se enfrió a -78ºC. Se añadió gota a gota butil-litio en hexano (16 ml 1,6 M, 0,0256 mol) con agitación. La mezcla se agitó durante 15 min. Mientras tanto, una disolución de 3,4,5-trifluorobenzonitrilo (4,0 g, 0,025 mmol) en 100 ml de THF seco se enfrió a -78ºC en argón y la primera disolución se añadió mediante una cánula a esta última disolución a lo largo de un periodo de 35 min. Después de 30 min, se quitó el baño de enfriamiento y cuando la reacción alcanzó la temperatura ambiente se vertió en 400 ml de agua. El THF se evaporó y la capa acuosa restante se extrajo tres veces con éter dietílico.
Las fases de éter combinadas se lavaron con agua, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. Rendimiento: 2,0 g (30%).
^{1}H NMR (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,4-7,25 (m, 2H), 5,01 (s, 1H, diastereoisómero), 4,91 (s, 1H, diastereoisómero), 2,88 (s, 3H, diastereoisómero), 2,52 (s, 3H, diastereoisómero), 2,49 (s, 3H, diastereoisómero), 2,34 (s, 3H, diastereoisómero), 1,72 (ancho, 1H).
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(x) 2,6-Difluoro-4-formilbenzonitrilo
El 2,6-difluoro-4[(metilsulfinil)(metiltio)metil]benzonitrilo (2,17 g, 8,32 mmol; véase la etapa (ix) anterior) se disolvió en 90 mL de THF y se añadieron 3,5 ml de ácido sulfúrico concentrado. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 3 días y posteriormente se vertió en 450 ml de agua. Le siguió la extracción tres veces con EtOAc y las fases de éter combinadas se lavaron dos veces con disolución acuosa de bicarbonato de sodio y con salmuera, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. Rendimiento: 1,36 g (98%). La posición del grupo formilo se estableció por RMN de ^{13}C. La señal de los carbonos fluorados a 162,7 ppm presentaba el patrón de acoplamiento esperado con dos constantes de acoplamiento del orden de 260 Hz y 6,3 Hz respectivamente, correspondientes a un acoplamiento ipso y uno meta de los átomos de flúor.
^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 10,35 (s, 1H), 7,33 (m, 2H).
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(xi) 2,6-Difluoro-4-hidroximetilbenzonitrilo
El 2,6-difluoro-4-formilbenzonitrilo (1,36 g, 8,13 mmol; véase la etapa (x) anterior) se disolvió en 25 mL de metanol y se enfrió en un baño de hielo. Se añadió borohidruro sódico (0,307 g, 8,12 mmol) en porciones con agitación y la mezcla de reacción se dejó durante 65 min. El disolvente se evaporó y el residuo se repartió entre éter dietílico y disolución acuosa de bicarbonato de sodio. La capa de éter se lavó con más disolución acuosa de bicarbonato de sodio y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. El producto bruto cristalizó pronto y se pudo usar sin más purificación. Rendimiento: 1,24 g (90%).
^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,24 (m, 2H), 4,81 (s, 2H), 2,10 (ancho, 1H).
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(xii) Metanosulfonato de 4-ciano-2,6-difluorobencilo
A una disolución enfriada con hielo de 2,6-difluoro-4-hidroximetilbenzonitrilo (1,24 g, 7,32 mmol; véase la etapa (xi) anterior) y cloruro de metanosulfonilo (0,93 g, 8,1 mmol) en 60 ml de cloruro de metileno se añadió trietilamina (0,81 g, 8,1 mmol) con agitación. Después de 3 h a 0ºC, la mezcla se lavó dos veces con HCl 1 M y una vez con agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. El producto se pudo usar sin más purificación. Rendimiento: 1,61 g (89%).
^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,29 (m, 2H), 5,33 (s, 2H), 3,07 (s, 3H).
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(xiii) 4-Azidometil-2,6-difluorobenzonitrilo
Una mezcla de metanosulfonato de 4-ciano-2,6-difluorobencilo (1,61 g, 6,51 mmol; véase la etapa (xii) anterior) y azida sódica (0,72 g, 0,0111 mol) en 10 ml de agua y 20 ml de DMF se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El resultado posteriormente se vertió en 200 ml de agua y se extrajo tres veces con éter dietílico. Las fases de éter combinadas se lavaron cinco veces con agua, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. Una pequeña muestra se evaporó con el propósito del análisis por RMN y el producto se cristalizó. El resto se evaporó con precaución, pero no hasta sequedad completa. El rendimiento (teóricamente 1,26 g) se asumió que era casi cuantitativo basándose en el análisis por RMN y HPLC analítico.
^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,29 (m, 2H), 4,46 (s, 2H).
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(xiv) 4-Aminometil-2,6-difluorobenzonitrilo
Esta reacción se llevó a cabo según el procedimiento descrito en J. Chem. Res. (M) (1992) 3128. A una suspensión de 520 mg de Pd/C al 10% (50% de humedad) en 20 ml de agua se añadió una disolución de borohidruro sódico (0,834 g, 0,0221 mol) en 20 ml de agua. Se produjo algo de evolución de gas. El 4-azidometil-2,6-difluorobenzonitrilo (1,26 g, 6,49 mmol; véase la etapa (xiii) anterior) se disolvió en 50 mL de THF y se añadió a la mezcla acuosa en un baño de hielo a lo largo de 15 min. La mezcla se agitó durante 4 h, después de los cual se añadieron 20 ml de HCl 2 M y la mezcla se filtró a través de Celite. La Celite se aclaró con más agua y las fases acuosas combinadas se lavaron con EtOAc y posteriormente se hicieron alcalinas con NaOH 2 M. Le siguió la extracción tres veces con cloruro de metileno y las
fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. Rendimiento: 0,87 g (80%).
^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,20 (m, 2H), 3,96 (s, 2H), 1,51 (ancho, 2H).
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(xv) 2,6-Difluoro-4-terc-butoxicarbonilaminometilbenzonitrilo
Una disolución de 4-aminometil-2,6-difluorobenzonitrilo (0,876 g, 5,21 mmol; véase la etapa (xiv) anterior) se disolvió en 50 mL de THF y se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (1,14 g , 5,22 mmol) en 10 mL de THF. La mezcla se agitó durante 3,5 h. El THF se evaporó y el residuo se repartió entre agua y EtOAc. La capa orgánica se lavó tres veces con HCl 0,5 M y agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. El producto se pudo usar sin más purificación. Rendimiento: 1,38 g (99%).
^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,21 (m,2H), 4,95 (ancho, 1H), 4,43 (ancho, 2H), 1,52 (s, 9H).
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(xvi) Boc-Pab(2,6-diF)(OH)
Una mezcla de 2,6-difluoro-4-terc-butoxicarbonilaminometilbenzonitrilo (1,38 g, 5,16 mmol; véase la etapa (xv) anterior), hidrocloruro de hidroxilamina (1,08 g, 0,0155 mol) y trietilamina (1,57 g, 0,0155 mol) en 20 ml de etanol se agitó a temperatura ambiente durante 36 h. El disolvente se evaporó y el residuo se repartió entre agua y cloruro de metileno. La capa orgánica se lavó con agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. El producto se pudo usar sin más purificación. Rendimiento: 1,43 g (92%).
^{1}H NMR (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 7,14 (m, 2H), 4,97 (ancho, 1H), 4,84 (ancho, 2H), 4,40 (ancho, 2H), 1,43 (s, 9H).
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(xvii) Boc-Pab(2,6-diF) x HOAc
Esta reacción se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por Judkins et al, Synth. Comm. (1998) 4351. El Boc-Pab(2,6-diF)(OH) (1,32 g, 4,37 mmol; véase la etapa (xvi) anterior), anhídrido acético (0,477 g, 4,68 mmol) y 442 mg de Pd/C al 10% (50% de humedad) en 100 ml de ácido acético se hidrogenó a 5 atm de presión durante 3,5 h. La mezcla se filtró a través de Celite, se aclaró con etanol y se evaporó. El residuo se liofilizó en acetonitrilo y agua y unas gotas de etanol. El producto del subtítulo se pudo usar sin más purificación. Rendimiento: 0,1,49 g (99%).
^{1}H NMR (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 7,45 (m, 2H), 4,34 (s, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,40 (s, 9H).
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(xviii) Boc-Pab(2,6-diF)(Teoc)
A una disolución de Boc-Pab(2,6-diF) x HOAc (1,56 g, 5,49 mmol; véase la etapa (xvii) anterior) en 100 mL de THF y 1 ml de agua, se añadió carbonato de 2-(trimetilsilil)etilo y p-nitrofenilo (1,67 g, 5,89 mmol). Se añadió gota a gota una disolución de carbonato de potasio (1,57 g, 0,0114 mol) en 20 ml de agua a lo largo de 5 min. La mezcla se agitó durante una noche. El THF se evaporó y el residuo se repartió entre agua y cloruro de metileno. La capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno y las fases orgánicas combinadas se lavaron dos veces con disolución acuosa de bicarbonato de sodio, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. La cromatografía instantánea en gel de sílice con heptano/EtOAc = 2/1 dio 1,71 g (73%) de compuesto puro.
^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,43 (m, 2H), 4,97 (ancho, 1H), 4,41 (ancho, 2H), 4,24 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,11 (m, 2H), 0,06 (s, 9H).
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(xix) Boc-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(Teoc)
Boc-Pab(2,6-diF)(Teoc) (1,009 g, 2,35 mmol; véase la etapa (xviii) anterior) se disolvió en 50 mL de EtOAc saturado con HCl(g). La mezcla se dejó durante 10 min, se evaporó y se disolvió en 18 ml de DMF, y después se enfrió en un baño de hielo. Se añadieron Boc-(S)Aze-OH (0,450 g, 2,24 mmol), PyBOP (1,24 g, 2,35 mmol) y finalmente diisopropiletilamina (1,158 g, 8,96 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y después se vertió en 350 ml de agua y se extrajo tres veces con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. La cromatografía instantánea en gel de sílice con heptano:EtOAc (1:3) dio 1,097 g (96%) del compuesto deseado.
^{1}H NMR (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,46 (m, 2H), 4,65-4,5 (m, 3H), 4,23 (m, 2H), 3,87 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 2,45-2,3 (m, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,05 (s, 9H).
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(xx) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(Teoc)
Boc-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(Teoc) (0,256 g, 0,500 mmol; véase la etapa (xix) anterior) se disolvió en 20 mL de EtOAc saturado con HCl(g). La mezcla se dejó durante 10 min y se evaporó y disolvió en 5 ml de DMF. Se añadieron Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)OH (0,120 g, 0,475 mmol; véase la etapa (viii) anterior), PyBOP (0,263 g, 0,498 mmol) y finalmente diisopropiletilamina (0,245 g, 1,89 mmol. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y después se vertió en 350 ml de agua y se extrajo tres veces con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. La cromatografía instantánea en gel de sílice con EtOAc dio 0,184 g (60%) del compuesto del subtítulo deseado.
^{1}H NMR (400 MHz, CD_{3}OD, mezcla de rotámeros) \delta 7,55-7,45 (m, 2H), 7,32 (m, 1H, rotámero mayoritario), 7,27 (m, 1H, rotámero minoritario), 7,2-7,1 (m, 2H), 6,90 (t, 1H, rotámero mayoritario), 6,86 (t, 1H, rotámero minoritario), 5,15 (s, 1H,rotámero mayoritario), 5,12 (m, 1H, rotámero minoritario), 5,06 (s, 1H, rotámero minoritario), 4,72 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,6-4,45 (m, 2H), 4,30 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,24 (m, 2H), 4,13 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,04 (m, 1H, rotámero minoritario), 3,95 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,62 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,48 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,22 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,10 (m, 1H, rotámero minoritario), 1,07 (m, 2H), 0,07 (m, 9H).
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(xxi) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF).
Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(Teoc) (81 mg, 0,127 mmol; véase la etapa (xx) anterior) se disolvió en 0,5 mL de cloruro de metileno y se enfrió en un baño de hielo. Se añadió TFA (3 mL) y la reacción se dejó proseguir durante 75 min. El TFA se evaporó y el residuo se liofilizó a partir de agua y acetonitrilo. El producto sin purificar se purificó mediante RPLC preparativa con CH_{3}CN:NH_{4}OAc 0,1M (35:65) para producir 39 mg (55%) del compuesto del título como su sal de HOAc, pureza: 99%.
^{1}H NMR (400 MHz, CD_{3}OD mezcla de rotámeros) \delta 7,5-7,4 (m, 2H), 7,32 (m, 1H, rotámero mayoritario), 7,28 (m, 1H, rotámero minoritario), 7,2-7,1 (m, 3H) 6,90 (t, 1H, rotámero mayoritario), 6,86 (t, rotámero minoritario), 5,15 (s, 1H, rotámero mayoritario), 5,14 (m, 1H, rotámero minoritario), 5,07 (s, 1H, rotámero minoritario), 4,72 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,65-4,45 (m, 2H), 4,30 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,16 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,03 (m, 1H, rotámero minoritario), 3,95 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,63 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,48 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,21 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,07 (m, 1H, rotámero minoritario), 1,89 (s, 3H).
^{13}C-NMR (75 MHz; CD_{3}OD): (carbonos de carbonilo y/o amidina, mezcla de rotámeros) \delta 171,9, 171,2, 165,0, 162,8, 160,4.
APCI-MS: (M + 1) = 503/505 m/z.
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Ejemplo 2 Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OMe) 
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25 
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(i) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OMe,Teoc)
Una mezcla de Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(Teoc) (64 mg, 0,099 mmol; véase el ejemplo 1(xx) anterior) e hidrocloruro de O-metil-hidroxilamina (50 mg, 0,60 mmol) en 4 ml de acetonitrilo se calentó a 70ºC durante 3 h. El disolvente se evaporó y el residuo se repartió entre agua y EtOAc. La capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. El producto se pudo usar sin más purificación. Rendimiento: 58 mg (87%).
^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,90 (bt, 1H), 7,46 (m, 1H), 7,25-6,95 (m, 5H), 6,51, t, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,83 (m, 1H), 4,6-4,5 (m, 2H), 4,4-3,9 (m, 4H), 3,95 (s, 3H), 3,63 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 1,87 (ancho, 1H), 0,98 (m, 2H), 0,01, s, 9H).
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(ii) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OMe)
Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OMe,Teoc) (58 mg, 0,086 mmol; véase la etapa (i) anterior) se disolvió en 3 mL de TFA, se enfrió en un baño de hielo y se dejó reaccionar durante 2 h. El TFA se evaporó y el residuo se disolvió en EtOAc. La capa orgánica se lavó dos veces con disolución acuosa de carbonato de sodio y agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. El residuo se liofilizó en agua y acetonitrilo para dar 42 mg (92%) del compuesto del título. Pureza: 94%.
^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,95 (t ancho, 1H), 7,2-7,1 (m, 4H), 6,99 (m, 1H), 6,52 (t, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,85-4,75 (m, 3H), 4,6-4,45 (m, 2H), 4,29 (ancho, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 3,69 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 1,85 (ancho, 1H).
^{13}C-NMR (100 MHz; CDCl_{3}): (carbonos de carbonilo y/o amidina) \delta 172,1, 169,8, 151,9.
APCI-MS: (M + 1) = 533/535 m/z.
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Ejemplo 3 Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OH) 
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26 
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(i) Boc-(S)Aze-NHCH_{2}Ph(2,6-diF, 4-CN)
Se disolvió Boc-(S)Aze-OH (1,14 g, 5,6 mmol) en 45 mL de DMF. Se añadieron 4-aminometil-2,6-difluorobenzonitrilo (1,00 g, 5,95 mol, véase el ejemplo 1(xiv) anterior), PyBOP (3,10 g, 5,95 mmol) y DIPEA (3,95 mL, 22,7 mmol) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se evaporó y el residuo se dividió entre H_{2}O y EtOAc (75 mL cada uno). La fase acuosa se extrajo con 2 x 50 mL de EtOAc y el extracto orgánico reunido se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La cromatografía instantánea (SiO_{2}, EtOAc/heptano (3/1)) proporcionó el compuesto del sub-título (1,52 g, 77%) como un aceite que cristalizó en el frigorífico.
^{1}H-NMR (400 MHz; CD_{3}OD): \delta 7,19 (m, 2H), 4,65-4,5 (m, 3H), 3,86 (m, 1H), 3,73 (m, 1H), 2,45-2,3 (m, 2H), 1,39 (s, 9H).
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(ii) H-(S)Aze-NHCH_{2}-Ph(2,6-diF, 4-CN) x HCl
El Boc-(S)Aze-NHCH_{2}-Ph(2,6-diF, 4-CN) (0,707 g, 2,01 mmol, véase la etapa (i) anterior) se disolvió en 60 mL de EtOAc saturado con HCl(g). Después de agitar a temperatura ambiente durante 15 minutos, el disolvente se evaporó. El residuo se disolvió en CH_{3}CN/H_{2}O (1/1) y se liofilizó para dar el compuesto del sub-título (0,567 g, 98%) como un polvo amorfo amarillento.
^{1}H-NMR (400 MHz; CD_{3}OD): \delta 7,49 (m, 2H), 4,99 (m, 1H), 4,58 (m, 2H), 4,12 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,47 (m, 1H).
MS (m/z) 252,0 (M + 1)^{+}.
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(iii) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-NHCH_{2}-Ph(2,6-diF, 4-CN)
Se disolvió Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)OH (0,40 g, 1,42 mmol, véase el ejemplo l(viii) anterior) en 10 mL de DMF y se añadieron H-(S)Aze-NHCH_{2}-Ph(2,6-diF, 4-CN) x HCl (0,43 g, 1,50 mmol, véase la etapa (ii) anterior) y PyBOP (0,779 g, 1,50 mmol), seguido de DIPEA (1,0 mL, 5,7 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 h, el disolvente se evaporó. El residuo se repartió entre H_{2}O (200 mL) y EtOAc (75 mL). La fase acuosa se extrajo con 2 x 75 mL de EtOAc y el extracto orgánico reunido se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La cromatografía instantánea (SiO_{2}, EtOAc/heptano (4/1)) proporcionó el compuesto del sub-título (0,56 g, 81%) como un aceite.
^{1}H-NMR (400 MHz; CD_{3}OD) rotámeros: \delta 7,43 (m, 2H), 7,31 (m, 1H, rotámero mayoritario), 7,26 (m, 1H, rotámero minoritario), 7,2-7,1 (m, 2H), 6,90 (t, 1H, rotámero mayoritario), 6,86 (t, 1H, rotámero minoritario), 5,14 (s, 1H, rotámero mayoritario), 5,11 (m, 1H, rotámero minoritario), 5,04 (s, 1H, rotámero minoritario), 4,71 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,6-4,45 (m, 2H), 4,30 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,2-3,9 (m, 1H; y 1H, rotámero minoritario), 2,62 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,48 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,21 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,09 (m, 1H, rotámero minoritario).
^{13}C-NMR (100 MHz; CD_{3}OD): (carbonos de carbonilo) \delta 171,9, 171,8.
MS (m/z) 484,0, 485,9 (M - 1)^{-}, 486,0, 487,9 (M + 1)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
(iv) Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OH)
El Ph(3-Cl)(5-OCHF_{2})-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-NHCH_{2}-Ph(2,6-diF, 4-CN) (0,555 g, 1,14 mmol, de la etapa (iii) anterior) se disolvió en 10 mL de EtOH (95%). A esta disolución se añadió hidrocloruro de hidroxilamina (0,238 g, 3,42 mmol) y Et_{3}N (0,48 mL, 3,44 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 14 h, el disolvente se retiró y el residuo se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera y H_{2}O y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. El producto sin purificar se purificó por RPLC preparativa con CH_{3}CN:0,1 M NH_{4}OAc como eluyente, proporcionando el compuesto del título como un polvo amorfo (0,429 g, 72%) después de liofilizar.
^{1}H-NMR (400 MHz; CD_{3}OD) rotámeros: \delta 7,35-7,1 (m, 5H), 6,90 (t, 1H, rotámero mayoritario), 6,85 (t, 1H, rotámero minoritario), 5,15 (s, 1H, rotámero mayoritario), 5,12 (m, 1H, rotámero minoritario), 5,08 (s, 1H, rotámero minoritario), 4,72 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,6-4,4 (m, 2H), 4,30 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,12 (m, 1H, rotámero mayoritario), 4,04 (m, 1H, rotámero minoritario), 3,94 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,62 (m, 1H, rotámero minoritario), 2,48 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,22 (m, 1H, rotámero mayoritario), 2,10 (m, 1H, rotámero minoritario).
^{13}C-NMR (100 MHz; CD_{3}OD): (carbonos de carbonilo y amidina, rotámeros) \delta 172,4, 171,9, 171,0, 152,3, 151,5.
MS (m/z) 517,1, 519,0 (M - -1)^{-}, 519,1, 521,0 (M+1)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
El compuesto del título del Ejemplo 1 se analizó en el Ensayo A anterior y se encontró que exhibía un valor IC_{50}TT de menos de 0,02 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
El compuesto del título del Ejemplo 1 se analizó en el Ensayo D anterior y se encontró que exhibía un valor IC_{50} APTT de menos de 1 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
El compuesto del título del Ejemplo 2 se analizó en el Ensayo E anterior y se encontró que exhibía una biodisponibilidad oral y/o parenteral en rata como el inhibidor activo correspondiente (amidina libre).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
El compuesto del título del Ejemplo 2 se analizó en el Ensayo G anterior y se encontró que se convertía en el inhibidor activo correspondiente (sin amidina) en microsomas de hígado de humanos y de ratas.
\vskip1.000000\baselineskip
Abreviaturas
Ac =
acetilo
APCI =
ionización química a presión atmosférica (en relación a EM)
API =
ionización química a presión atmosférica (en relación a EM)
ac. =
Acuoso
AUC =
área bajo la curva
Aze =
azetidina-2-carboxilato
AzeOH =
ácido azetidina-2-carboxílico
Boc =
terc-butiloxicarbonilo
BSA =
albúmina de suero bovino
CI =
ionización química (en relación a MS)
d =
día(s)
DCC =
diciclohexil-carbodiimida
DIBAL-H =
hidruro de di-isobutilaluminio
DIPEA =
Diisopropiletilamina
MAP =
4-(N,N-dimetil-amino) piridina
DMF =
dimetilformamida
DMSO =
Dimetilsulfóxido
DVT =
trombosis de vena profunda
EDC =
hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
Et =
etilo
éter =
éter dietílico
EtOAc =
acetato de etilo;
EtOH =
etanol
Et_{2}O =
éter dietílico
h =
hora(s)
HATU =
hexafluorofosfato de O-(azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HBTU =
[Hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronio]
HCl =
ácido clorhídrico, cloruro de hidrógeno gaseoso o sal de hidrocloruro (dependiendo del contexto)
Hex =
hexanos
HOAc =
ácido acético o sal de ácido acético
HPLC =
cromatografía líquida de alta resolución
LC =
cromatografía líquida
Me =
metilo
MeOH =
Metanol
min =
minuto(s)
MS =
espectroscopía de masas
MTBE =
Metil terc-butil éter
NADH =
nicotinamida adenina dinucleótido, forma reducida
NADPH =
fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido, forma reducida
NIH =
National Institute of Health (EE.UU.)
NIHU =
Unidades del National Institute of Health
RMN =
resonancia magnética nuclear
OAc =
Acetato
Pab =
para-amidinobencilamino
H-Pab =
para-amidinobencilamina
Ph =
fenilo
PyBOP =
hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinfosfonio
QF =
fluoruro de tetrabutilamonio
RPLC =
cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa
ta/TA =
temperatura ambiente
SOP =
procedimientos de operación estándar
TBTU =
[tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronio]
TEA =
trietilamina
Teoc =
2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo
TEMPO =
radical libre de 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi
TFA =
ácido trifluoroacético
THF =
tetrahidrofurano
TLC =
cromatografía de capa fina
UV =
ultravioleta
\vskip1.000000\baselineskip
Los prefijos n, s, i y t tienen sus significados usuales: normal, secundario, iso y terciario. El prefijo c significa ciclo.

Claims (5)

1. El compuesto Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2,6-diF)(OH) de fórmula
27
o su sal farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una formulación farmacéutica que comprende el compuesto definido en la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, en mezcla con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. El compuesto según se define en la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, para uso como agente farmacéutico.
4. El compuesto según se define en la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de la trombosis.
5. El compuesto según se define en la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, para uso como anticoagulante.
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