ES2327100T3 - Trastornos de la neurotransmision. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para diagnosticar Miastenia grave en un mamífero o parálisis muscular y/o articulaciones rígidas en descendencia de mamífero recién nacido que comprende la etapa de detectar autoanticuerpos para un epítopo de la tirosina cinasa específica de músculo (MuSK) en un líquido corporal de dicho mamífero o en el líquido corporal de la madre de dicha descendencia de mamífero recién nacido.

Description

Trastornos de la neurotransmisión.

La presente invención se refiere a Miastenia grave y parálisis muscular y/o articulaciones rígidas en descendencia y, en particular, a un método para diagnosticar tales trastornos en mamíferos.

La Miastenia grave (MG) es un trastorno autoinmune crónico de la transmisión neuromuscular que da como resultado debilidad muscular. La característica clave de debilidad debida a MG es su variabilidad. Los pacientes experimentan generalmente un decaimiento de fuerza a lo largo del día con una tendencia a fatiga posteriormente en el día o incluso hacia el final de una tarea particular. A menudo, un síntoma de MG es debilidad ocular, que provoca ptosis (párpados caídos) y/o dipoplía (visión doble). Otros síntomas incluyen debilidad de piernas; disfagia y habla mal articulada o nasal. Los síntomas de debilidad tienden a empeorar con diversos estresantes, tales como esfuerzo excesivo, calor e infección.

En la década de los 60 se descubrió que la MG estaba provocada por anticuerpos contra el receptor de acetilcolina (AChR) y que, por lo tanto, es de origen autoinmune. Actualmente, la MG es uno de los trastornos neurológicos más caracterizados, lo que ha conducido por consiguiente a tratamientos que mejoran en gran medida la duración y la calidad de vida de miasténicos. Aproximadamente 10 personas en cada millón de una población contraen esta enfermedad en un año. No existe predominancia racial y el 75% de los pacientes con MG menores de 40 años de edad son mujeres y el 60% de los mayores de 40 años de edad son hombres.

Aproximadamente el 80% los pacientes con MG posee dentro de su plasma autoanticuerpos que se pueden inmunoprecipitar con AChR radiomarcado. Sin embargo, el 20% restante de los pacientes con MG no muestran tales anticuerpos en su plasma pero tienen síntomas similares y responden a las mismas terapias, tales como sustitución de plasma e inmunosupresión. En consecuencia, no se ha establecido si estos pacientes tienen la misma afección de MG o una distinta y separada (3,4). Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antígeno que la respuesta inmune de un individuo reconoce como extraño, incluso aunque ese antígeno realmente se ha originado en el individuo. Pueden estar presentes en el sistema circulatorio como anticuerpos libres circulantes o en forma de inmunocomplejos circulantes unidos a su diana dependiendo de la naturaleza del antígeno al que se hace referencia.

En plasma humano de pacientes que son negativos a autoanticuerpos anti-AChR (AAAN o conocidos previamente como MG seronegativa) se investigó para encontrar autoanticuerpos alternativos y un autoanticuerpo candidato fue uno para la proteína MuSK.

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que muchos del 20% de los pacientes con MG que no muestran ningún autoanticuerpo contra AChR, en su lugar tienen anticuerpos IgG dirigidos contra los dominios N-terminales extracelulares de MuSK, un receptor tirosina cinasa localizado en la superficie celular de uniones neuromusculares, indicando que están aquejados de una forma de MG que tiene una etiología diferente de MG caracterizada por autoanticuerpos circulantes contra AChR.

La proteína MuSK se ha secuenciado y la proteína se ha caracterizado recientemente por Valenzuela et al. (Solicitud Internacional de Patente Nº PCT/US96/20696, publicada como el documento WO97/21811). Es un receptor tirosina cinasa (RTK) localizado sobre la superficie celular de células musculares en la unión neuromuscular.

Los ligandos se unen a los RTK en el sitio de unión en el lado extracelular del receptor, lo que induce la transmisión de una cascada de señales a proteínas diana intracelulares. Los RTK se clasifican de acuerdo con su función y los miembros de estas familias comparten una alta homología en su secuencia de aminoácidos así como en la funcionalidad.

En la unión neuromuscular (NMJ), donde las dendritas del axón del nervio motor coinciden con la membrana basal de la célula muscular, se intercambian señales fisiológicas importantes entre estas células adyacentes. Un ejemplo de esto es el transmisor químico acetilcolina que pasa a través de la hendidura sináptica de la célula nerviosa y después se une rápidamente y específicamente por el AChR en la pared de la célula muscular. Esto, a su vez, comienza una cascada de acontecimientos que conducen finalmente a la contracción de las células musculares.

La estructura post-sináptica en la pared de la célula muscular se denomina la placa motora que está llena densamente con proteína y lípido, dando de este modo un aspecto electrodenso cuando se observa por microscopía electrónica. Los AChR musculares están presentes en este lugar y se piensa que la señalización da lugar a concentraciones de proteínas en ese lugar mediante dos mecanismos; uno es la distribución alterada de proteínas de membrana pre-existentes y el otro es por inducción de transcripción localizada de genes específicos solamente por núcleos subsinápticos subyacentes a la NMJ.

El desarrollo de la unión neuromuscular se inicia mediante activación de MuSK. Las isoformas de agrina, liberadas de la neurona motora, desencadenan la fosforilación de MuSK y el receptor de acetilcolina muscular (AChR) dando como resultado el agrupamiento de los AChR y otras proteínas del aparato post-sináptico (1). Se ha demostrado que la capacidad de la agrina de provocar el agrupamiento de AChR en miotubos cultivados se inhibe por anticuerpos anti-agrina. Actualmente se acepta que la agrina no se une directamente a MuSK, sino por un componente de unión a agrina hipotético denominado Componente de Especificidad Asociado a Miotúbulo (MASC) (1,11). No se ha descrito ninguna enfermedad asociada con MuSK, MASC o agrinas y hasta ahora no se han aclarado sus papeles en el músculo adulto.

Ya se ha demostrado que la MG negativa a autoanticuerpos anti-AChR está provocada por anticuerpos IgG humorales: se puede tratar de forma exitosa por sustitución de plasma y otras inmunoterapias (5); se describió MG neonatal transitoria en el recién nacido de una de las pacientes con anticuerpos anti-MuSK (17); y la inyección de preparaciones de inmunoglobulina o IgG en ratones provocó defectos en la transmisión neuromuscular (5).

Por lo tanto, los presentes inventores ahora han demostrado que los anticuerpos anti-MuSK tienen efectos funcionales sobre agrupamiento de AChR inducido por agrina in vitro y la interferencia directa con esta ruta de agrina/MuSK/AChR puede ser un mecanismo importante de enfermedad in vivo. La MuSK es un miembro relativamente nuevo de la familia de receptor tirosina cinasa (RTK). Con muy pocas excepciones (por ejemplo, véase 18), los autoanticuerpos para RTK no se han implicado en trastornos humanos, pero la combinación de grandes dominios extracelulares y actividades funcionales hace que los mismos sean antígenos potenciales atractivos en otras afecciones autoinmunes. Otros miembros de la familia de RTK están mutados en enfermedades hereditarias y se han observado mutaciones somáticas en diversos tumores (19). Se puede probar que la MuSK está implicada en trastornos musculares congénitos así como en adquiridos.

Por lo tanto, se proporciona por un primer aspecto de la presente invención un método para diagnosticar Miastenia grave en un mamífero que comprende la etapa de detectar en un líquido corporal de dicho mamífero autoanticuerpos contra un epítopo de la tirosina cinasa específica de músculo, MuSK.

Más particularmente, una subclase o subtipo de MG que se encuentra generalmente en pacientes que no muestran la capacidad de inmunoprecipitar AChR radiomarcado con sus líquidos corporales.

Este aspecto de la invención es particularmente ventajoso debido a que la identificación de esta nueva subclase o subtipo de pacientes con MG permitirá un diagnóstico más preciso y rápido de individuos por facultativos médicos. El método de acuerdo con este aspecto de la invención permitirá la detección de anomalías de la neurotransmisión que son congénitas o adquiridas, por ejemplo, postnatalmente o prenatalmente por transmisión de la madre al feto. Como se expone con más detalle en el ejemplo proporcionado, se identificó que algunas madres de bebés con parálisis y articulaciones rígidas tenían anticuerpos contra MuSK, que se transfirieron por vía placentaria.

Hasta la fecha, la MuSK se ha estudiado principalmente en el desarrollo de la NMJ. La presencia de anticuerpos contra el dominio extracelular de MuSK en un trastorno adquirido implica que la MuSK es funcional en la NMJ adulta e implica la MuSK como una diana novedosa para autoanticuerpos patógenos que provocan Miastenia grave. El aislamiento y la purificación de este autoanticuerpo anti-MuSK dará lugar a un producto útil que se puede aprovechar como un indicador de enfermedades de la neurotransmisión.

Preferiblemente, el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención comprende las etapas de a) poner en contacto dicho líquido corporal con dicha MuSK o un determinante antigénico de la misma; y b) detectar cualquier complejo de anticuerpo-antígeno formado entre dicha MuSK o un fragmento antigénico de la misma y anticuerpos presentes en dicho líquido corporal, en el que la presencia de dichos complejos es indicativa de que dicho mamífero padece Miastenia grave.

Las etapas reales de detección de autoanticuerpos en una muestra de un líquido corporal se pueden realizar de acuerdo con técnicas de ensayo inmunológico conocidas en sí en la técnica. Los ejemplos de técnicas adecuadas incluyen ELISA, radioinmunoensayos y similares. En términos generales, tales ensayos usan un antígeno que se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Una muestra a ensayar se pone en contacto con el antígeno y si están presentes autoanticuerpos específicos para la proteína en una muestra, reaccionarán inmunológicamente con el antígeno para formar complejos de autoanticuerpo-antígeno que después se pueden detectar o medir cuantitativamente. La detección de complejos de autoanticuerpo-antígeno se realiza preferiblemente usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana secundario, típicamente anti-IgG o anti-IgM humana, que reconoce características generales comunes a todas las IgG o IgM humanas, respectivamente. El anticuerpo secundario se conjuga habitualmente con una enzima tal como, por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano (HRP), de tal forma que la detección de complejos de autoanticuerpo/antígeno/anticuerpo secundario se consigue mediante la adición de un sustrato enzimático y detección colorimétrica, quimioluminiscente o fluorescente posterior de los productos de la reacción enzimática.

Por tanto, en una realización, el complejo de anticuerpo/antígeno se puede detectar por un anticuerpo adicional, tal como el anticuerpo anti-IgG. Los complejos se pueden visualizar alternativamente por microscopía. Otros marcadores o moléculas indicadoras que se pueden usar en un método de acuerdo con la invención. Preferiblemente, dicha molécula indicadora o marcador incluye cualquiera de un metal pesado, una molécula fluorescente o luminiscente, etiqueta radiactiva o enzimática. Preferiblemente, el marcador o la molécula indicadora es tal que la intensidad de la señal del anticuerpo anti-IgG humana es indicativa de la cantidad relativa del autoanticuerpo anti-MuSK en el líquido corporal cuando se compara con una lectura de control positivo y negativo.

Un método alternativo para detectar autoanticuerpos para MuSK o un epítopo de la misma depende de la unión de una MuSK o su epítopo, junto con un marcador indicador, a los autoanticuerpos en el suero o el líquido corporal. Este método comprende poner en contacto la MuSK o un epítopo o determinante antigénico de la misma que tiene un marcador adecuado en la misma, con dicho líquido corporal, inmunoprecipitar cualquier anticuerpo de dicho líquido corporal y controlar para dicho marcador en cualquiera de dichos anticuerpos, en el que la presencia de dicho marcador es indicativa de que dicho mamífero padece dicho trastorno de la neurotransmisión o del desarrollo. Preferiblemente, el marcador es un marcador radiactivo que puede ser ^{125}I o similares. La yodación e inmunoprecipitación son técnicas convencionales en la técnica, cuyos detalles se pueden encontrar en las referencias (4 y 6).

Antes de la presente invención, no había base para proporcionar un diagnóstico clínico inmediato para tales pacientes.

Se describe adicionalmente un autoanticuerpo aislado o purificado específico para MuSK. Un anticuerpo de este tipo se puede detectar en líquidos corporales de mamíferos y aislar o purificar de los mismos usando técnicas que se conocerían por el facultativo especialista, tales como inmunoabsorción o cromatografía por inmunoafinidad o cromatografía de alta presión.

También se describe un anticuerpo aislado o purificado específico para un autoanticuerpo anti-MuSK del líquido corporal de un mamífero. Un anticuerpo purificado o aislado de este tipo que es específico para autoanticuerpo anti-MuSK se puede usar ventajosamente como un medicamento o en la preparación de un medicamento para tratar trastornos de la neurotransmisión en un mamífero y preferiblemente un ser humano que padece Miastenia grave. Un anticuerpo de ese tipo también se puede incluir en una composición farmacéutica junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable para la misma. Los anticuerpos, policlonales o monoclonales, se pueden preparar usando técnicas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la técnica descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497) para desarrollar hibridomas capaces de producir anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales para uso terapéutico pueden ser anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales quiméricos de ser humano-ratón. Se pueden preparar moléculas de anticuerpo quiméricas que contienen un dominio de unión a antígeno de ratón con regiones constantes humanas (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6581, Takeda et al., 1985, Nature 314: 452). Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadores se pueden inmunizar por inyección con autoanticuerpo anti-MuSK o un fragmento o derivado del mismo, incluyendo, pero sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyendo, pero sin limitación, de Freund (completo o incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias con actividad superficial tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

No solamente se describen moléculas de anticuerpo completas, sino también fragmentos de las mismas. Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula mediante técnicas conocidas, por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitación, el fragmento F(ab')_{2} que se puede producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

El anticuerpo que es específico para autoanticuerpos anti-MuSK también se puede usar, ventajosamente, en un kit de diagnóstico para detectar trastornos de la neurotransmisión, tales como Miastenia grave. Como se ha mencionado anteriormente, también se puede usar cualquier proteína que se una al autoanticuerpo, tal como un epítopo o fragmento de la propia proteína MuSK. Un kit de este tipo comprende un anticuerpo aislado o purificado específico para autoanticuerpos anti-MuSK y medios para poner en contacto dicho anticuerpo con un líquido corporal de dicho mamífero.

De acuerdo con la presente invención, se debe suponer que un líquido corporal significa plasma, suero, sangre completa, orina, sudor, linfa, heces, líquido cefalorraquídeo o aspirado de pezones. Sin embargo, generalmente, los métodos de la invención se realizarán entre muestras de suero o plasma.

En la composición farmacéutica, las composiciones preferidas incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, sales no tóxicas, agua estéril o similares. También puede estar presente un tampón adecuado que permite que las composiciones se liofilicen y almacenen en condiciones estériles antes de la reconstitución por la adición de agua estéril para administración posterior. El vehículo también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar otras condiciones tales como pH, osmolaridad, viscosidad, esterilidad, lipofilicidad, solubilidad o similares. También se pueden usar composiciones farmacéuticas que permitan la liberación sostenida o retardada después de la administración.

El anticuerpo o la proteína MuSK o el fragmento de la misma o la composición farmacéutica se puede administrar por vía oral. En esta realización, el anticuerpo, la MuSK o su fragmento epitópico o la composición farmacéutica se puede encapsular y/o combinar con vehículos adecuados en formas de dosificación sólidas que se conocerían bien por los especialistas en la técnica.

Además, como se entendería por el facultativo especialista, el protocolo de dosificación específico se puede calcular de acuerdo con el área de superficie corporal del paciente o el volumen de espacio corporal a ocupar, dependiendo de la vía de administración particular a usar. La cantidad de la composición administrada en realidad, sin embargo, se determinará por un facultativo médico basándose en las circunstancias en relación al trastorno a tratar, tales como la gravedad de los síntomas, la edad, el peso y la respuesta del individuo.

Se describe adicionalmente un método para tratar un paciente que padece un trastorno de la neurotransmisión tal como Miastenia grave que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz del anticuerpo o una proteína MuSK o un epítopo de la misma.

Por lo tanto, también se describe un método para preparar una formulación farmacéutica para el tratamiento de trastornos de la neurotransmisión, que comprende las etapas de aislar o purificar un anticuerpo o proteína MuSK o un fragmento de la misma, fabricar cantidades voluminosas de dicho anticuerpo y formular el anticuerpo en un compuesto que incluye un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

Se describe adicionalmente un método para identificar compuestos capaces de aliviar o tratar trastornos de la neurotransmisión, que comprende las etapas de poner en contacto un compuesto candidato en presencia de MuSK o un epítopo de la misma y un anticuerpo capaz de unirse a MuSK, en el que un compuesto que evita la unión de dicho anticuerpo a MuSK o un epítopo de la misma es un candidato para tratar trastornos de la neurotransmisión. Tales compuestos también se pueden usar para tratar trastornos de la neurotransmisión o del desarrollo o en la fabricación de un medicamento para tratar tales trastornos. Los compuestos identificados también pueden servir, como entenderían los especialistas en la técnica, como compuestos líderes para el desarrollo de compuestos análogos. Los análogos deben tener una configuración electrónica y conformación molecular estabilizadas que permitan que se presenten grupos funcionales claves a los polipéptidos de la invención de sustancialmente el mismo modo que el compuesto líder. En particular, los compuestos análogos tienen propiedades electrónicas espaciales que se pueden comparar con la región de unión, pero pueden ser moléculas menores que el compuesto líder, teniendo frecuentemente un peso molecular inferior a aproximadamente 2 kD y preferiblemente inferior a 1 kD. La identificación de compuestos análogos se puede realizar mediante el uso de técnicas tales como análisis de campo autoconsistente (SCF), análisis de interacción de configuración (CI) y análisis de dinámica de modo normal. Están disponibles programas informáticos para implementar estas técnicas; por ejemplo, Rein, Computer-Assisted Modelling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Los métodos para la preparación de derivados y análogos químicos se conocen bien por los especialistas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. y Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Además, dichos derivados y análogos se pueden ensayar para sus efectos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica; véase también anteriormente. Además, se pueden usar peptidomiméticos y/o diseño asistido por ordenador de derivados y análogos apropiados.

La presente invención se puede comprender más claramente con referencia a los siguientes ejemplos y Figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1: es una ilustración de los resultados obtenidos usando anticuerpos de pacientes AAAN que reaccionan con el dominio extracelular de MuSK. Las muestras de pacientes AAAN se indican como SNMG (MG seronegativa), como se conoce previamente. a, las construcciones de MuSK usadas se muestran en la Figura 1a. b, los plasmas AAAN unidos a células COS expresan MuSK de longitud completa (AAAN/MuSK). La inmunorreactividad de MuSK aparece como un patrón moteado, similar al observado previamente con anticuerpos de conejo anti-MuSK (13). Las células no transfectadas en el mismo campo, demostradas más adelante por microscopía de contraste de fases (flechas), mostraron solamente unión no específica. No había unión específica de plasmas AAAN con células que expresan MuSK que carecen de los dominios extracelulares (MuSK D) o se unen a plasma de control sano (HC/MuSK). c, Dos plasmas AAAN, pero ningún plasma de control sano, inmunoprecipitó MuSK de extractos de detergente de células COS que expresan MuSK y miotubos de C2C12. La MuSK se identificó por unión de un anti-MuSK de conejo purificado por afinidad. Aparece como una banda de 110 kD de células COS y como varias bandas que representan diferentes variantes de corte y empalme de MuSK en las células C2C12.

La Figura 2: es una ilustración de resultados obtenidos mediante el uso de anticuerpos IgG para los dominios extracelulares de MuSK en MG seronegativa medido por ELISA. a, Se encontraron anticuerpos anti-MuSK en 17/24 pacientes AAAN en comparación con 13 controles. Solamente se encontraron valores negativos o límite en 39 pacientes con MG positivos para anti-AChR. No se ha sustraído la unión no específica de IgG a las placas. b, Titulación de un plasma AAAN frente a diferentes dominios de MuSK. Los anticuerpos se unieron intensamente a construcciones de MuSK que expresan los dominios similares a inmunoglobulina distales, Ig1-4 e Ig1-2 (véase la Figura 1a) pero no a los dominios proximales de membrana de Ig3-4.

La Figura 3: es una ilustración de los resultados que muestran que los anticuerpos AAAN inducen agrupamientos AChR pero inhiben el agrupamiento de AChR inducido por agrina. a, En ausencia de agrina, un número moderado de agrupamientos de AChR (como se demuestra por fluorescencia de rodamina-a-bungarotoxina) se indujeron en presencia de plasma AAAN en comparación con el de plasma de control (HC). Se encontraron agrupamientos inducidos por agrina en presencia de plasma de control sano pero estaban inhibidos en presencia de plasma AAAN. b, c, Los agrupamientos de AChR sin (b) o con (c) agrina añadida en plasma y cultivos tratados con IgG. Las muestras de AAAN están marcadas con 1-16. Solamente los plasmas positivos a anti-MuSK y preparaciones de IgG afectaron a los agrupamientos de AChR.

La Figura 4: es una ilustración de los resultados obtenidos de ensayos adicionales para confirmar la especificidad del ensayo para Miastenia grave expuesto en los ejemplos proporcionados.

La Figura 5: es una ilustración de los resultados obtenidos de un ensayo para detectar anticuerpos contra MuSK en madres de bebés con defectos del desarrollo.

La Figura 6: es una ilustración de los resultados obtenidos usando un ensayo ELISA para detectar anticuerpos contra MuSK en sueros enviados para análisis.

La Figura 7: es una ilustración de los resultados obtenidos usando un ensayo de inmunoprecipitación para detectar anticuerpos contra MuSK en los sueros de la Figura 6.

La Figura 8: es la correlación de los resultados de ensayos ELISA y de inmunoprecipitación de las Figuras 6 y 7 para la detección de anticuerpos contra MuSK.

Ejemplo

Identificación de Pacientes

Se obtuvieron muestras de 24 pacientes (18M, 6H) con MG generalizada moderada o grave, diagnosticada por electrofisiología clínica, pero en los que el ensayo de radioinmunoprecipitación convencional para anticuerpos anti-AChR (4) fue negativo en varias ocasiones. La edad a la aparición variaba entre 2 y 68 años (mediana 24) y la duración de los síntomas en el muestreo estaba entre un mes y 13 años (mediana 1,0 años). En 18 casos, el plasma se obtuvo durante plasmaféresis terapéutica que mejoró la fuerza muscular. Las 6 muestras restantes se tomaron del suero en el primer examen. Seis de los pacientes habían recibido corticosteroides hasta dos meses antes del muestreo. También se obtuvieron sueros o plasmas de voluntarios sanos y de pacientes con MG positiva a anticuerpos anti-AChR. Se generaron preparaciones de IgG usando un kit de purificación de IgG de Pierce ImmunoPureÒ (G).

Construcciones de expresión de MuSK y Agrina

Las construcciones que codifican MuSK de longitud completa (13) y el fragmento soluble de s-agrina (4/19) (20) se han descrito previamente. Se generaron fragmentos de deleción de MuSK que comprenden todo el dominio extracelular (Ig1-4; aa 1-490, números de acuerdo con ref (10)) o comprendiendo la primera mitad dos dominios de Ig (Ig1-2; aa 1-230) por inserción de señales de terminación artificiales en esas posiciones. Se generaron fragmentos N-terminales de MuSK que comprenden los dominios extracelulares proximales a membrana, incluyendo dominios de Ig 3 y 4 (Ig3-4; aa 198-430) o la región transmembrana y el dominio intracelular (MuSK D, aa 491-869). Los fragmentos de ADNc correspondientes, incluyendo un sitio SphI introducido recientemente, se ligaron a un vector que contenía una secuencia señal artificial seguida de seis histidinas y una etiqueta de epítopo de 10 aa (20). Todas las construcciones se introdujeron por transfección de forma transitoria en células COS7 (12). Para la producción de construcciones de agrina soluble y MuSK, las células se cambiaron a medios sin suero el segundo día después de la transfección. El medio acondicionado, que contenía fragmentos de MuSK o agrina, se retiró 24 horas más tarde y se analizó por transferencia de Western para confirmar la expresión.

Inmunotinción de células COS7 transfectadas con MuSK

Se sembraron células COS7 en portaobjetos con cámara el día después de la transfección. Dos días más tarde, las células se fijaron con paraformaldehído al 2% y se tiñeron como se ha descrito (13). Los plasmas de pacientes con Miastenia grave y controles se analizaron en diversas diluciones (entre 1:20 y 1:5000). Los anticuerpos unidos se visualizaron con anticuerpos secundarios conjugados a Cy3 (IgG anti-humano, Dianova). En todos los experimentos, la expresión de las construcciones de MuSK introducidas por transfección se confirmó tiñendo portaobjetos paralelos con anticuerpos de conejo anti-MuSK (13).

Experimentos de inmunoprecipitación

Se prepararon extractos de detergente a partir de células COS7 transfectadas con MuSK o de miotubos de C2C12 que se habían fusionado durante cinco días. La inmunoprecipitación se realizó como se ha descrito previamente (12, 13). Los plasmas AAAN y de control se incubaron con los extractos a 1:20. El suero de conejo anti-MuSK se usó a 1:100. La MuSK en los inmunoprecipitados se analizó por transferencia de Western usando anticuerpos séricos purificados por afinidad dirigidos contra la secuencia citoplasmática de MuSK (13).

Detección por ELISA de anticuerpos anti-MuSK

Se diluyó medio acondicionado de células COS transfectadas con MuSK o de células de control transfectadas de forma simulada con ADN de esperma de pez 1:1 con tampón NaHCO3 100 mM, pH 9,5 y se aplicó durante una noche a placas ELISA. Los plasmas se ensayaron en primer lugar a 1:5 en triplicados y posteriormente a 1:10 en duplicados. Los anticuerpos unidos se detectaron por peroxidasa de rábano rusticano-proteína A (Amersham) seguido de o-fenilenodiamina y midiendo a A_{492}. Para cada muestra se sustrajo la inmunorreactividad no específica, determinada por incubación de placas recubiertas con medio acondicionado de células COS7 transfectadas de forma simulada.

Ensayo de agregación de AChR

La línea de célula muscular de ratón, C2C12, se usó para determinar los efectos funcionales de anticuerpos. Las células se sembraron en portaobjetos con cámara, se fusionaron y trataron con o sin agrina y/o plasmas o IgG durante cinco horas^{13}. Después de la fijación, los AChR se visualizaron con rodamina-a-bungarotoxina y se midió el número de agregados de más de 20 campos microscópicos y al menos dos cultivos independientes como se ha descrito (20).

Resultados

Inicialmente se buscaron anticuerpos IgG en cinco plasmas AAAN y tres plasmas de individuos sanos usando células COS7 transfectadas con construcciones de MuSK de rata (Figura 1a). Los experimentos se realizaron en ciego. Los cinco plasmas AAAN (por ejemplo, Figura 1b, AAAN), pero ninguno de los plasmas de control sanos (por ejemplo HC), marcaron los agregados de MuSK en la superficie celular a diluciones hasta 1:1000. El patrón de inmunorreactividad era indistinguible del marcado observado con anticuerpos generados contra MuSK recombinante en conejos (13). Cada uno de los plasmas AAAN reconoció los dominios extracelulares de MuSK, ya que no se observó inmunorreactividad con células COS7 que expresan solamente los dominios transmembrana y citoplasmáticos (Figura 1b, MuSK D). No todas las células expresaron MuSK (compárese la Figura 1b, AAAN/MuSK y contraste de Fases, más adelante) y estas células no transfectadas y células transfectadas de forma simulada (no mostradas) no se unieron a los anticuerpos IgG de AAAN.

Los experimentos de inmunoprecipitación confirmaron que los anticuerpos IgG en los plasmas AAAN reconocieron la proteína MuSK nativa. Los extractos de detergente de células COS7 que expresan MuSK y de miotubos de C2C12 de ratón, que expresan MuSK funcional, se incubaron con plasmas de dos pacientes AAAN y un control sano. Los anticuerpos de ambos pacientes AAAN, pero no del control, inmunoprecipitaron bandas de 110 kDa que se identificaron como MuSK por unión de un anticuerpo anti-MuSK específico (Figura 1C). Con cada extracto se inmunoprecipitaron bandas de tamaño similar por un suero de conejo anti-MuSK de extractos paralelos (Figura 1c).

Después se ensayaron sueros y plasmas de individuos AAAN, con MG positiva a anti-AChR y sanos en un ELISA. Los fragmentos que comprendían solamente dominios extracelulares de MuSK se expresaron en células COS7 de las que se secretan estas construcciones solubles y los medios se usaron como una fuente del antígeno polipeptídico. Se encontraron anticuerpos IgG anti-MuSK, sustancialmente más de la media +3 DT de los valores de control sano (0,08 unidades de DO) en 17/24 muestras AAAN, mientras que se encontraron valores solamente límites o negativos en los pacientes positivos a anti-AChR (Figura 2a). Cuatro de los siete negativos, en comparación con solamente dos de las 17 muestras positivas, eran de pacientes que habían recibido terapia con corticosteroides antes del muestreo. Lo que es aún más interesante, en los 11 pacientes ensayados en ambos ensayos, los valores de DO para la unión de anticuerpos a MuSK se correlacionaron (p<0,02) con la unión de IgG a la línea celular TE671 humana (que tiene características de músculo humano) como se ha medido previamente (8). Esto sugiere que la MuSK es la diana para anticuerpos IgG de AAAN en la superficie de TE671 y que los valores negativos en siete muestras probablemente no se deben a una ausencia de reactividad con MuSK de rata. Los resultados adicionales con cuatro plasmas AAAN (por ejemplo, Figura 2b) indicaron que la mayoría de los anticuerpos están dirigidos contra las secuencias N-terminales (construcción de Ig1-2 en la Figura 1a) y que había poca reactividad con la mitad proximal a la membrana (construcción Ig3-4 en la Figura 1a). No se observaron indicios de anticuerpos IgM contra MuSK (datos no mostrados), sugiriendo que la diana para los supuestos anticuerpos no IgG que se habían descrito previamente en algunos de los pacientes AAAN (15) todavía se tienen que definir.

Para investigar efectos funcionales de los autoanticuerpos contra MuSK, se examinó agrupamiento de AChR en miotubos obtenidos de la línea celular de ratón, C2C12. En ausencia de agrina (Figura 3a, paneles superiores), el plasma de control produjo muy pocos agrupamientos de AChR (HC), mientras que el plasma positivo a anti-MuSK indujo agregados de AChR a lo largo de la superficie de los miotubos (AAAN). Previamente se ha descrito una inducción inducida por anticuerpos similar de agrupamiento de AChR por dimerización artificial de la cinasa para anticuerpos de conejo inducidos contra MuSK purificada (13). De forma sorprendente, cuando se añadió agrina con los plasmas (Figura 3a, paneles inferiores), el marcado agrupamiento inducido por agrina que tuvo lugar en presencia de plasma de control (HC) no se observó en presencia de plasma AAAN indicando que los anticuerpos anti-MuSK habían inhibido el agrupamiento de AChR inducido por agrina. Tanto el agrupamiento (Figura 3b) como la actividad inhibidora (Figura 3c) se observaron con cada plasma positivo a anti-MuSK o IgG pero no con preparaciones negativas a anti-MuSK. Ya que actualmente está aceptado que la agrina no se une directamente a MuSK, sino por un componente de unión a agrina hipotético denominado MASC (1,11), se especula que los anticuerpos en pacientes ARAN se unen a MuSK de un modo tal que evita su interacción con MASC. Se conoce que esta interacción depende de la mitad N-terminal del dominio extracelular de MuSK (16) que se observa que es la diana principal para los anticuerpos IgG en pacientes negativos a autoanticuerpo anti-AChR (Figura 2b).

Para confirmar la especificidad del ensayo para miastenia grave, se ensayó un nuevo grupo de controles (OND) de pacientes con otros trastornos neurológicos. Solamente un suero fue positivo en el límite. La relativa incidencia de los anticuerpos contra MuSK en muestras AAAN se ensayó usando una segunda cohorte (Cohorte 2) de pacientes con Miastenia grave que eran negativos para anticuerpos contra el receptor de acetilcolina. Todos estos pacientes tenían enfermedad generalizada y 11/16 de los mismos eran positivos para anticuerpos contra MuSK.

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Los anticuerpos para la isoforma fetal del receptor de acetilcolina se encuentran en unas pocas madres que han tenido bebés nacidos con parálisis completa y articulaciones rígidas (22, 23). Esta grave afección es relativamente común, pero los anticuerpos maternales para el receptor de acetilcolina fetal se encuentran en solamente aproximadamente el 1% (Vincent, Dalton, hallazgos no publicados). Se cuestionó si los anticuerpos contra MuSK pueden estar presentes en algunas de estas madres. La Figura 5 muestra, en comparación con los resultados que se han descrito previamente, que seis madres de bebés afectados de un total de 200 ensayadas (solamente se muestran 60 en este documento) tienen estos anticuerpos en su suero. Esto indica que cada una de estas seis madres ha establecido una respuesta autoinmune a MuSK y sugiere que, después de la transferencia de estos anticuerpos a través de la placenta, pueden estar implicados en provocar la afección de los bebés. El ensayo para anticuerpos para MuSK en madres de bebés con parálisis muscular y/o articulaciones rígidas puede indicar una afección fetal debida a anticuerpos maternales.

Para evaluar cómo trabaja el ensayo en la práctica, se ha comenzado a comparar resultados de pacientes con SNMG definitiva, o una sospecha intensa de SNMG con los de aquellos en los que el diagnóstico es cuestionable (?SNMG). La Figura 6 muestra que entre el primer grupo, que incluye la cohorte 1 y la cohorte 2, el ensayo es positivo en 39/66 y entre aquellos con un diagnóstico cuestionable, la proporción es 6/25. El ensayo continúa siendo negativo en individuos sanos.

El ensayo ELISA usado como se ha identificado en el anterior ejemplo es difícil de normalizar y se ha ensayado un ensayo alternativo, usando inmunoprecipitación de ^{125}I-MuSK. Para este ensayo, el dominio extracelular purificado de MuSK se yoda usando ^{125}I (sin vehículo de Amersham como para bungarotoxina en la Ref (4, 6) o con clolarima T (condiciones convencionales)). La MuSK yodada se separa después de ^{125}I libre por filtración en gel. La ^{125}I-MuSK (aproximadamente 50.000 cpm) se añade después a 10 microlitros del suero del paciente a lo largo de una noche. Para inmunoprecipitar los anticuerpos del paciente y cualquier ^{125}I-MuSK que se haya unido por los mismos, se añade un exceso de anticuerpo de oveja para IgG humana. El precipitado se centrifuga para formar un sedimento, se lava y se recuenta para radiactividad. Los resultados (Figura 7) muestran que los controles sanos precipitaron menos de 1200 cpm, mientras que 38/66 de los agentes con SNMG precipitaron por encima de 1200 cpm, aumentando el valor hasta 7500 cpm que se corresponde a aproximadamente 1 nmol de MuSK precipitada por litro de suero. El ensayo también fue positivo en 5/25 pacientes con ?SNMG.

Los resultados de los ensayos de ELISA e inmunoprecipitación estaban altamente correlacionados (Figura 8). La mayoría de los sueros fueron positivos con ambos ensayos o negativos con ambos ensayos; había tres sueros que dieron resultados negativos con la inmunoprecipitación y positivos con ELISA y dos sueros que fueron negativos con el ELISA y positivos con la inmunoprecipitación.

Referencias

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4. Vincent. A., Newsom-Davis, J. Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for myasthenia gravis: results in 153 validated cases and 2967 diagnostic assays. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 48, 1246-52 (1985).

5. Mossman, S., Vincent, A., Newsom-Davis, J. Myasthenia gravis without acetylcholine-receptor antibody: a distinct disease entity. Lancet. 1, 116-119 (1986).

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8. Blaes, F., Beeson, D., Plested, P., Lang, B., Vincent, A. IgG from "seronegative" myasthenia gravis patients binds to a muscle cell line, TE671, but not to human acetilcholine receptor. Ann Neurol. 47, 504-10 (2000).

9. Vincent, A., Plested, P., Tang, T., Newsom-Davis, J. Serum factors from seronegative myasthenia gravis patients and acetylcholine receptor phosphorylation. Ann Neurol. 44, 439A (1998).

10. Valenzuela, D. M. et al. Receptor tyrosine kinase specific for the skeletal muscle lineage: expression in embryonic muscle, at the neuromuscular junction, and after injury. Neuron. 15, 573-584 (1995).

11. Glass, D. J. et al. Agrin acts via a MuSK receptor complex. Cell. 85, 513-523 (1996).

12. Hopf, C., Hoch, W. Tyrosine phosphorylation of the muscle-specific kinase is exclusively induced by
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13. Hopf, C., Hoch, W. Dimerization of the muscle-specific kinase induces tyrosine phosphorylation of acetylcholine receptors and their aggregation on the surface of myotubes. J Biol Chem. 273, 6467-6473 (1998).

14. Hoch, W., Campanelli, J. T., Harrison, S., Scheller, R. H. Structural domains of agrin required for clustering of nicotinic acetylcholine receptors. EMBO J. 13, 2814-2821 (1994).

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16. Zhou, H., Glass, D. J., Yancopoulos, G.D., Sanes, J. R. Distinct domains of MuSK mediate its ability to induce and to associate with postsynaptic specializations. J Cell Biol. 146, 1133-1146 (1999).

17. Miers, A. K., Harvard, C.W.H. Diaphragmatic myasthenia in mother in child. Postgraduate Med J. 61, 725-727 (1985).

18. Taylor, S. I., Barbetti, F., Accili, D., Roth, J., Gorden, P. Syndromes of autoimmunity and hypoglycaemia. Autoantibodies directed against insulin and its receptor. Endocrinol Metab Clin North Am 18, 123-43 (1989).

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Arthrogryposis multiplex congenita with maternal autoantibodies specific for a fetal antigen. Lancet 346, 24-25.

23. Riemersma S, Vincent A, Beeson D, Newland C, Brueton L, Huson S, Newsom-Davis J. 1996. Association of arthrogryposis multiplex congenita with maternal antibodies inhibiting fetal acetylcholine receptor function. J Clin Invest, 98: 2358-2363.

Claims (6)

1. Un método in vitro para diagnosticar Miastenia grave en un mamífero o parálisis muscular y/o articulaciones rígidas en descendencia de mamífero recién nacido que comprende la etapa de detectar autoanticuerpos para un epítopo de la tirosina cinasa específica de músculo (MuSK) en un líquido corporal de dicho mamífero o en el líquido corporal de la madre de dicha descendencia de mamífero recién nacido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho método comprende las etapas de:

a)

poner en contacto dicho líquido corporal con dicha MuSK o un determinante antigénico de la misma; y

b)

detectar cualquier complejo de anticuerpo-antígeno formado entre dicho receptor tirosina cinasa o un fragmento antigénico del mismo y anticuerpos presentes en dicho líquido corporal,

en el que la presencia de dichos complejos es indicativa de que dicho mamífero padece Miastenia grave o que dicha descendencia de mamífero recién nacido parece parálisis muscular y/o articulaciones rígidas en la descendencia.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho complejo de anticuerpo-antígeno se detecta usando un anticuerpo anti-IgG etiquetado o marcado con una molécula indicadora.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha molécula indicadora o marcador incluye cualquiera de un metal pesado, una molécula fluorescente o luminiscente, etiqueta radiactiva o enzimática.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha etiqueta enzimática comprende peroxidasa de rábano rusticano-proteína A seguido de reacción con o-fenilenodiamina para medición posterior a A_{492}.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 por el que la intensidad de la señal del anticuerpo anti-IgG humana es indicativa de la cantidad relativa del autoanticuerpo anti-MuSK en el líquido corporal cuando se compara con un lectura de control positivo y negativo.