ES2327170T3

ES2327170T3 - Proteina de fusion de eritropoyetina.

Info

Publication number: ES2327170T3
Application number: ES07003659T
Authority: ES
Inventors: Robert Weik; Thomas Hemetsberger; Heinz Redl
Original assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Current assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Priority date: 2007-02-22
Filing date: 2007-02-22
Publication date: 2009-10-26
Anticipated expiration: 2027-02-22
Also published as: CA2678986C; EA017377B1; AU2008217202A1; CN101688210A; EA200970782A1; US20100203050A1; US9085640B2; JP2010520859A; DE602007001273D1; PL1961821T3; EP1961821B1; CA2678986A1; JP5588684B2; EP1961821A1; AU2008217202B2; BRPI0807786A2; ATE433492T1; KR20090122430A; WO2008101680A1; KR101539120B1

Abstract

Una proteína de fusión de EPO recombinante que tiene una semivida fisiológica mejorada y una actividad hematopoyética reducida cuando se compara con la EPO in vivo, y que tiene además actividad neurorregeneradora in vivo, caracterizada porque comprende una porción Fc de una molécula de IgG humana y una porción de eritropoyetina (EPO), preferiblemente una porción de eritropoyetina humana, en la que la porción Fc está directamente unida mediante su N-terminal con el C-terminal de la porción de EPO, y en la que la proteína de fusión está modificada por carbamoilación.

Description

Proteína de fusión de eritropoyetina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a proteínas de fusión recombinantes en las que la eritropoyetina (EPO) está unida a un vehículo de proteína, más específicamente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como un fragmento Fc, en las que dichas proteínas de fusión recombinantes están adicionalmente carbamoiladas. La invención se refiere además a un procedimiento para la fabricación de dichas proteínas de fusión y a las composiciones farmacéuticas que las contienen, así como al uso de dichas proteínas de fusión y composiciones farmacéuticas en terapia médica.

Antecedentes técnicos

Eritropoyetina (EPO), una glicoproteína bien conocida, fue identificada por primera vez por sus efectos hormonales sobre la médula ósea y está implicada en el crecimiento y desarrollo de los glóbulos rojos maduros. Además de esta actividad hematopoyética, se ha descubierto recientemente que EPO actúa también como una potente molécula producida localmente que mejora el estrés metabólico en muchos tejidos. Las actividades protectoras de tejidos de EPO están mediadas a través de la interacción con el receptor de la eritropoyetina. En el cerebro, por ejemplo, EPO y su receptor se producen localmente, modulados por estresores metabólicos, y proporcionan funciones neuroprotectoras y anti-inflamatorias (Doggrell, SA. (2004) Expert Opin Investig Drugs; 13(11):1517-9). En la espina dorsal, EPO proporciona efectos beneficiosos incluyendo la inhibición de la apoptosis y de la necrosis de neuronas, oligodendrocitos y células endoteliales, menos cavitaciones, reducción de la peroxidación de lípidos, movilización de células progenitoras endoteliales, promoción de angiogénesis y restauración de la autorregulación vascular (Gorio, A. y col. (2002) Proc Natl Acad Sci USA; 99(14):9450-5; Leist M. (2004) Science; 305(5681):239-42). Se ha demostrado que EPO señala a través de la modulación de miembros de la ruta del factor nuclear (NF)-kappaB así como mediante los transductores de la señal de Janus quinasa-2 y activadores del sistema de transcripción-5 (Gorio A. (2005) Neurosurgery; 56(4):821-7; Grasso G. (2005) Neurosurgery; 56(4):821-7).

Mediante modificación química, es decir carbamoilación de al menos un grupo amino primario de las lisinas y/o del aminoácido N-terminal de EPO, la actividad hematopoyética de esta citoquina se reduce considerablemente mientras que su actividad protectora de tejidos, es decir su actividad regeneradora de las células nerviosas permanece sustancialmente inalterada o incluso se potencia cuando se compara con la de la EPO no carbamoilada.

Los documentos WO 2006/014466 y WO 2006/002646 desvelan la fabricación y uso de EPO carbamoilada en diferentes indicaciones médicas.

Puesto que EPO tiene una semivida en suero relativamente corta, y puesto que es bien sabido en la técnica que la fusión de una región constante de inmunoglobulina con una o proteína no-inmunoglobulina puede prolongar marcadamente la semivida en suero de dicha proteína no-inmunoglobulina, se han formulado diferentes hipótesis uniendo un fragmento de inmunoglobulina a EPO. Por ejemplo, el documento WO 99/02709 desvela la producción y uso de proteínas de fusión que comprenden EPO y una porción Fc de una inmunoglobulina, en la que las proteínas de fusión EPO-Fc tiene una semivida in vivo aumentada en relación con la de la EPO de origen natural.

Del documento WO2005/063808 se sabe que se puede obtener una mejora adicional de la farmacocinética, es decir semivida en suero prolongada y potencia in vivo aumentada de las proteínas de fusión EPO-Fc por mutaciones, delecciones o inserciones de aminoácidos específicos.

Según esto, existe necesidad de una terapia con EPO simplificada y menos costosa, es decir que requiera una administración de EPO menos frecuente, para el tratamiento de enfermedades, en la que es deseable una actividad regeneradora de tejido inalterada o incluso potenciada, es decir la actividad regenerativa de células nerviosas de la EPO, a la vez que simultáneamente, la actividad hematopoyética de EPO es menos deseable o incluso es indeseable y por tanto debería reducirse. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a disfunciones o desequilibrios de cualquiera o ambos sistemas nerviosos central (SNC) y periférico (SNP) y concretamente incluye enfermedades que están asociadas con o causadas por lesiones nerviosas como daños nerviosos físicos tras, por ejemplo, un impacto mecánico.

Resumen de la invención

Es por tanto un objeto de la presente invención mejorar las proteínas de fusión EPO-Fc conocidas, que tienen una semivida en suero prolongada cuando se compara con la de las proteínas EPO no fusionadas, mediante modificación química, es decir carbamoilación, para obtener proteínas de fusión EPO-Fc modificadas, que tienen además de una semivida en suero prolongada, una actividad hematopoyética reducida pero manteniendo una actividad regeneradora inalterada o potenciada cuando se compara con las proteínas de fusión EPO-Fc no modificadas.

Las proteínas de fusión EPO-Fc modificadas según la presente invención son adecuadas para el tratamiento de enfermedades o disfunciones de cualquiera o ambos sistemas nerviosos central (SNC) y periférico (SNP), incluyendo enfermedades que están causadas o asociadas con el daño físico de los nervios producido, por ejemplo, por impacto mecánico, calor o irradiación. Uno de los rasgos ventajosos de las proteínas de fusión EPO-Fc modificadas de la presente invención es que se pueden administrar a dosis terapéuticas mayores en comparación con EPO o EPO-Fc convencionales para el mismo objetivo, y esencialmente sin aumentar efectos indeseados sobre el sistema hematopoyético, es decir, el recuento sanguíneo.

Según esto, es un objeto de la presente invención proporcionar una proteína de fusión de EPO modificada recombinante, en la que EPO está unida a un vehículo de proteína, en particular a una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina tal como un fragmento Fc, más concretamente a la porción Fc de una molécula de IgG, y en la que dicha proteína de fusión recombinante está adicionalmente modificada mediante carbamoilación.

Es otro objeto de la invención proporcionar un procedimiento para la preparación de dicha proteína de fusión EPO-Fc recombinante carbamoilada.

Es otro objeto de la invención proporcionar composiciones farmacéuticas que contienen dicha proteína de fusión EPO-Fc recombinante carbamoilada.

En otro aspecto adicional la invención se refiere al uso de dicha proteína de fusión EPO-Fc recombinante carbamoilada en terapia médica.

En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de composiciones farmacéuticas que contienen dicha proteína de fusión EPO-Fc recombinante carbamoilada para terapia médica.

El principio de la invención se describe adicionalmente en las reivindicaciones independientes, mientras que las diferentes realizaciones de la invención son la materia sujeta de las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de la figura

La fig.1 muestra los resultados de la determinación de la recuperación locomotora en ratas tras una lesión de contusión, tras administración posterior de la proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada según la presente invención. Ordenada = escala Beattie-Bresnahan-Basso; abscisa = puntos temporales seleccionados antes y después de la lesión de contusión; praeOP = antes de la lesión de contusión; grupo 1 = animales tratados con proteína rhEPO (control); grupo 2 = animales no tratados (grupo placebo); grupo 3 = animales tratados con proteína de fusión EPO-Fc no carbamoilada (grupo comparativo); grupo 4 = animales tratados con proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada (grupo experimental); grupo 5 = animales tratados con Metilprednisolona (grupo comparativo).

Descripción detallada de la invención

En su primera realización, la presente invención proporciona proteínas de fusión EPO-Fc recombinantes químicamente modificadas, es decir carbamoiladas, que tienen una semivida en suero significativamente prolongada en comparación con la de las proteínas EPO no fusionadas y, simultáneamente, teniendo una actividad hematopoyética reducida relativa a la de las proteínas de fusión EPO-Fc no modificadas más una actividad regeneradora de células nerviosas que permanece inalterada o incluso mejorada respecto de la correspondiente actividad de las proteínas de fusión EPO o EPO-Fc no modificadas.

"Proteína de fusión EPO-Fc" tal como se usa en el presente documento se refiere a una proteína que comprende una porción EPO y una porción Fc. La "Porción EPO" tal como se usa en el presente documento abarca eritropoyetina de longitud completa de tipo salvaje o que se produce naturalmente procedente de seres humanos u otras fuentes, así como moléculas tipo eritropoyetina incluyendo fragmentos de eritropoyetina biológicamente activos, análogos, variantes, mutantes y derivados de la eritropoyetina. La "Porción Fc" tal como se usa en el presente documento abarca regiones derivadas de la región constante de una inmunoglobulina, preferiblemente de una inmunoglobulina humana, incluyendo un fragmento, análogo, variante, mutante o derivado de la región constante. Las inmunoglobulinas adecuadas incluyen IgG, es decir las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y otras clases.

La "actividad biológica" de la eritropoyetina a la que se refiere el presente documento debería entenderse como la capacidad de la EPO o de las moléculas tipo EPO para interactuar con un receptor de eritropoyetina.

Una molécula tipo EPO activa comparte una similitud o identidad sustancial de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, comprendida entre al menos un 55% y aproximadamente un 65%, 75%, 80%, e incluso de hasta aproximadamente 90-95% de identidad) con la correspondiente secuencia de la EPO de tipo salvaje o que se produce naturalmente y posee una o más de las funciones de la EPO de tipo salvaje.

Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento biológicamente activo" significa un fragmento que puede ejercer un efecto biológico similar al de la proteína de longitud completa. Dichos fragmentos se pueden producir mediante delecciones amino- y carboxi-terminales, así como mediante delecciones internas. También incluyen formas trucadas e híbridas de la eritropoyetina. Formas "truncadas" son versiones más cortas de la eritropoyetina en las que faltan uno o más restos N-terminal y/o C-terminal.

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La proteína de fusión EPO-Fc de la presente invención se puede unir entre sí de diferentes maneras. Bien la porción Fc se une mediante su C-terminal con el N-terminal de la porción EPO, es decir la proteína de fusión EPO-Fc tiene una porción Fc hacia el N-terminal de la proteína de fusión EPO-Fc, o como se prefiere en la presente invención la porción Fc está unida mediante su N-terminal con el C-terminal de la porción EPO.

Además, la porción EPO y la porción Fc se pueden fusionar entre sí bien directamente término a término, o indirectamente mediante un enlazante, por ejemplo un péptido enlazante, insertado entre la porción EPO y la porción Fc.

Según esto, la presente invención en un primer aspecto se refiere a una proteína de fusión de EPO recombinante que tiene una semivida fisiológica mejorada y una actividad hematopoyética reducida en comparación con la de la EPO in vivo, y teniendo además actividad neurorregeneradora in vivo, caracterizada porque comprende una porción Fc de una molécula de IgG humana y una porción de eritropoyetina (EPO), preferiblemente una porción de eritropoyetina humana, en la que la porción Fc está directamente unida mediante su N-terminal con el C-terminal de la porción EPO y en la que la proteína de fusión está modificada por carbamoilación.

En general, la carbamoilación de proteínas frecuentemente se produce como efecto secundario del uso de urea en la purificación de proteínas y como resultado de niveles elevados de urea en suero debido a la descomposición espontánea de la urea a cianato. El cianato es el responsable de la carbamoilación de aminas primarias incluyendo aminas primarias en proteínas, y reacciona rápidamente con los restos amino libres de lisina y con el aminoácido N-terminal de una proteína, por ejemplo la glicoproteína EPO. El procedimiento de carbamoilación mediante cianato es dependiente del pH, y también se puede producir, aunque en menor extensión, con otros aminoácidos de la proteína, incluyendo arginina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico e histidina.

La carbamoilación preparativa se realiza haciendo reaccionar una cantidad predeterminada de cianato con una cantidad predeterminada de proteína. El grado de carbamoilación es dependiente del tiempo de reacción entre el cianato y la proteína y de la concentración de cianato y/o de la proteína deseada.

En un aspecto adicional la invención se refiere a dicha proteína de fusión EPO-Fc, en la que al menos uno, preferiblemente dos o más, restos de lisina y/o el aminoácido N-terminal de dicha proteína de fusión están carbamoilados.

La proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada de la presente invención puede contener modificaciones adicionales en la porción Fc, tales como mutaciones de aminoácidos como por ejemplo inserciones de aminoácidos, delecciones de aminoácido, o sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. En particular, las sustituciones de aminoácidos en la porción Fc están ampliamente descritas en la técnica anterior para extender adicionalmente la semivida en suero de proteínas de fusión, por ejemplo proteínas de fusión EPO-Fc, disminuyendo o eliminando el enlace del receptor Fc o complementariamente fijando la actividad. La proteína de fusión EPO-Fc puede tener también modificaciones adicionales en la porción de la eritropoyetina tales como mutaciones de aminoácidos como por ejemplo inserciones de aminoácidos, delecciones de aminoácido, o sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos o deglicosilaciones de aminoácidos que reducen la afinidad del enlace con el receptor EPO y/o aumentan la actividad biológica de la eritropoyetina.

En general, la región constante de una inmunoglobulina se define como un polipéptido de origen natural o sintéticamente producido homólogo respecto de la región C-terminal de la inmunoglobulina que se produce tras digestión con papaína.

La región constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina puede incluir un dominio de región constante de cadena pesada 1 (CH1), una región bisagra, un dominio de región constante de cadena pesada 2 (CH2) y un dominio de región constante de cadena pesada 3 (CH3).

Según esto, la porción Fc de la presente invención puede incluir una región bisagra, un dominio CH2 y/o CH3. La porción Fc puede incluir adicionalmente todo o parte de la región bisagra, el dominio CH2 y/o CH3.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a dicha proteína de fusión EPO-Fc que tiene una porción Fc que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 derivados de la IgG humana.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a dicha proteína de fusión EPO-Fc, en la que la fusión entre la porción EPO y la porción Fc se lleva a cabo en la región bisagra.

En general, la proteína de fusión EPO-Fc de la presente invención se produce mediante procedimientos de expresión recombinante, usando técnicas bien conocidas de los expertos en la técnica. Para obtener una proteína de fusión EPO-Fc recombinante glicosilada que tenga un motivo de glicosilación, que es sustancialmente el mismo que en la EPO e inmunoglobulinas de origen natural, se prefiere usar células eucariotas para la expresión recombinante de las proteínas de fusión EPO-Fc. Las proteínas expresadas de manera recombinante se secretan al medio de cultivo en forma de cadenas simples de polipéptidos para formar los monómeros de proteína de fusión EPO-Fc, pero también se pueden secretar al medio de cultivo en forma dimérica o multimérica en la que las cadenas de polipéptido se unen entre sí mediante puentes disulfuro.

En un aspecto adicional la invención se refiere a dicha proteína de fusión EPO-Fc, en la que dos monómeros de proteína de fusión EPO-Fc se unen entre sí para formar un homodímero.

Las proteínas secretadas producidas de forma recombinante se pueden aislar del medio de cultivo celular y purificarse adicionalmente con técnicas bien conocidas en la técnica.

En un aspecto adicional la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una proteína de fusión EPO-Fc recombinante carbamoilada que comprende una porción Fc de una molécula de IgG humana y una porción EPO, preferiblemente una porción EPO humana, en el que la porción Fc está directamente unida mediante su N-terminal con el C-terminal de la porción EPO, procedimiento que comprende:

-: preparar una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión EPO-Fc;

-: transformar una célula huésped con dicha molécula de ADN;

-: expresar dicha proteína de fusión EPO-Fc codificada por dicha molécula de ADN;

-: cosechar dicha proteína de fusión EPO-Fc;

-: purificar dicha proteína de fusión EPO-Fc; y

-: carbamoilar dicha proteína de fusión EPO-Fc haciendo reaccionar dicha proteína de fusión EPO-Fc con cianato,

en el que al menos uno, preferiblemente dos o más restos de lisina y/o el aminoácido N-terminal de la proteína de fusión están carbamoilados.

Las proteínas de fusión EPO-Fc de la presente invención combinan la ventajosa semivida en suero prolongada obtenida mediante la fusión de la porción EPO con la porción Fc de una inmunoglobulina con una actividad hematopoyética reducida manteniendo simultáneamente una actividad regeneradora células nerviosas inalterada o incluso potenciada debido a la carbamoilación de al menos una amina primaria de la proteína.

En un aspecto adicional la invención se refiere a dicha proteína de fusión EPO-Fc para uso como fármaco.

En general, dicha proteína de fusión EPO-Fc se puede usar en lugar de la proteína EPO carbamoilada en todos los casos en los que se requiera tratamiento con EPO carbamoilada. Específicamente, dicha proteína de fusión EPO-Fc se usa en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central SNC) y/o del sistema nervioso periférico.

Por ejemplo, dicha proteína de fusión EPO-Fc se puede usar para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo constituido por apoplejía, un evento isquémico en el SNC distinto a una apoplejía, una lesión por contusión, una lesión en la espina dorsal, una lesión cerebral traumática, y una enfermedad neurodegenerativa.

Debido a la prolongada semivida en suero de las proteínas de fusión EPO-Fc inventivas en comparación con las proteínas EPO carbamoiladas no fusionadas, las composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de fusión EPO-Fc requieren una administración menos frecuente en comparación con las composiciones farmacéuticas que contienen proteínas EPO carbamoiladas no fusionadas. Por tanto, una terapia con las proteínas de fusión EPO-Fc de la presente invención es mucho más cómoda para el paciente que necesite dicho tratamiento.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha proteína de fusión EPO-Fc, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional la invención se refiere pero no se limita a dicha composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. Puesto que una terapia eficaz con EPO requiere niveles terapéuticos de EPO en suero, es deseable que dichas composiciones farmacéuticas estén adaptadas a una disolución de inyección en la que la proteína de fusión EPO-Fc de la presente invención esté presente en premezcla con sustancias vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de la presente invención dichas composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma galénica adecuada para inyección intravenosa o subcutánea.

En un aspecto adicional la invención se refiere al uso de dichas composiciones farmacéuticas para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central (SNC) y/o del sistema nervioso periférico.

En un aspecto adicional la invención se refiere al uso de dichas composiciones farmacéuticas para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo constituido por apoplejía, un evento isquémico en el SNC distinto a la apoplejía, una lesión de contusión, un lesión en la espina dorsal, una lesión cerebral traumática, y una enfermedad neurodegenerativa.

Con el fin de que la invención descrita en el presente documento se pueda comprender más completamente, se definen los siguientes ejemplos. Los ejemplos tienen propósito ilustrativo únicamente, y no se deben tomar como limitantes de esta invención en aspecto alguno.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación y caracterización de las proteínas de fusión EPO-Fc carbamoiladas a) Construcción de un vector de expresión que codifica la proteína de fusión EPO-Fc

La proteína de fusión Epo-Fc se generó por fusión mediante PCR del gen de la EPO humano y un fragmento IgG1 hinge-CH2-CH3 humano. Se ubico la EPO en el N-terminal del constructo y se fusionó con la región bisagra de la IgG1 humana. Para la secreción de la proteína al sobrenadante del medio de cultivo, se usó la secuencia de señalización de la eritropoyetina que se amplificó conjuntamente con el ADNc de EPO. Esta construcción permite la secreción de una molécula homodimérica EPO-Fc.

El ADNc de EPO humano se amplificó a partir del plásmido phEpo mediante PCR usando los oligonucleótidos epo back BamHI (diseñados para añadir un único emplazamiento de restricción BamHl en el extremo 5' del fragmento de ADN) y epo hyb hinge dando como resultado un fragmento de ADN de 576 pb (epo back BamHI: 5' GGGG
GATCCGCC ATGGGGGTGCACGAATGTCC 3' [SEC. ID Nº 1]; epo hyb hinge para 5' AGATTTGGGCTCTCTGT
CCCCTGTCCTGCAGG 3' [SEC. ID Nº 2]). El fragmento IgG1 hinge-CH2-CH3 humano se amplificó a partir del plásmido p2G12HC mediante PCR usando los oligonucleótidos CH3 for Notl (diseñados para añadir un único emplazamiento de restricción Notl en el extremo 3' del fragmento de ADN) y hinge hyb epo back dando como resultado un fragmento de ADN de 671 pb DNA (CH3 for Notl: 5' GGGGCGGCCGCTCAT TTACCCGGAGACAGG 3' [SEC. ID Nº 3]; hinge hyb epo back: 5' ACAGG GGACAGAGAGCCCAAATCTTGTGAC 3' [SEC. ID Nº 4]). La amplificación se realizó en un volumen total de 50 l usando un motive de 20 ng de plásmido, 10 pmol de cada oligonucleótido, nucleótidos 250 M, 1 x tampón PCR y 5 unidades de la polimerasa Taq termostable. Ambas reacciones de PCR se realizaron durante 25 ciclos con 94ºC durante 20 s, 56ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min.

Tras purificación de los dos fragmentos con el kit de purificación Qiaquick (Qiagen) se llevó a cabo la fusión PCR en un volumen de 50 l usando 50 ng de ADNc de IgG1 hinge-CH2-CH3, 50 ng de ADNc de EPO, nucleótidos 250 M, 1 x tampón PCR 5 unidades de polimerasa Taq. En una primera etapa se llevaron a cabo 6 ciclos con 94ºC durante 20 s, 60ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min. Tras añadir 10 pmol de cada uno de los cebadores externos (epo back BamHl y CH3 for Notl) se continuó la PCR durante 25 ciclos con 94ºC durante 20 s, 56ºC durante 30 s y 72ºC durante 1,5 min.

Tras lo anterior, el producto de la PCR se purificó mediante extracción en gel preparativa y el kit de extracción en gel de Qiagen. El ADNc EPO-Fc resultante se insertó en un vector de expresión en un BamHl/Notl abierto eucariótico conteniendo el promotor humano CMV (citomegalovirus) y se transformó en una cepa E. coli TG1. Se usaron 10 ng de fragmento de EPO-Fc y 5 ng de vector pECMV, 1 unidad de ligasa T4 y 1 x tampón de enlace (New England Biolabs) para el enlace en un volumen total de 10 l durante 1 hora a 37ºC. Se identificaron los clones positivos por selección mediante PCR con los cebadores externos. Se verificó la corrección del ADNc de Epo-Fc en el plásmido final pCMV_EpoFc por análisis de secuencia y restricción.

b) expresión y purificación de la proteína de fusión EPO-Fc

La preparación a gran escala del plásmido (pCMV_EpoFc) de la etapa a) se usó para la transfección de células CHO negativas para la dihidrofolato-reductasa. Los dos plásmidos pCMV_EpoFc y p2_dhfr se usaron en una relación 20:1 para la transfección de células con lipofectina. La selección de células transfectadas se inició 24 horas después de la transfección (DMEM 4 mM L-Glutamina y FCS dializado al 10%) y se aplicó presión MTX (MTX 0,05 M y 0,1 M) cuando los clones empezaron a crecer. Tras selección y aislamiento de los clones con mejor comportamiento, el cultivo se cambió a condiciones libres de proteína. El sobrenadante celular se cosechó de una fermentación con alimentación por lotes con una viabilidad celular del 80%.

El sobrenadante se filtró por tamaños (tamaño de poro de 0,2 \mum) y se añadió Tris 1 M hasta un pH final de 8,5 y a continuación se hizo pasar por una columna de proteína A-Sefarosa equilibrada con Tris-solución salina tamponada 0,025 M, pH 8,5 y se eluyó con glicina 0,1 M, pH 3,5. Se midió el pH de la fracción de producto eluída, y se ajustó a pH 7,0 - 7,5 con Tris 1 M, pH 8,0, según necesidad.

c) Producción de la proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada

El material de partida para este procedimiento fue la proteína de fusión EPO-Fc recombinante humana purificada tal como se ha descrito anteriormente, incluyendo típicamente todas las isoformas de la proteína de fusión presentes en el sobrenadante del cultivo, lo que permite un rendimiento elevado del producto final deseado.

En primer lugar, la concentración de proteína de la proteína de fusión EPO-Fc recombinante humana se ajustó a 4-7 mg/ml mediante ultrafiltración (por ejemplo membrana con un corte de 10 kD). Se prepare una disolución de KOCN-borato disolviendo 60 mg/mg_{\text{proteína} \ de \ fusión \ EPO-Fc} en tampón Na-borato 0,6 M buffer, pH 8.

A continuación, la disolución de proteína de fusión EPO-Fc se mezcló con la disolución de KOCN-borato en una relación 1:1 y la disolución se incubó durante 48 horas a 37ºC. La proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada se formuló finalmente por filtración en gel (por ejemplo Sephadex G25) en PBS. Se determinó la concentración de proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada mediante DO_{280 \ nm} de acuerdo con una curva de calibración con proteína de fusión EPO-Fc, que se determinó mediante ELISA.

La posterior determinación del grado de carbamoilación confirmó que sustancialmente todos los grupos amino libres estaban carbamoilados.

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Ejemplo 2

Determinación de la recuperación locomotora en ratas tras lesión por contusión

Se analizó en un experimento con animales la actividad regeneradora in vivo de las células nerviosas de la proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada en comparación con una proteína de fusión EPO-Fc no modificada. La proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada y la proteína de fusión EPO-Fc no modificada se produjeron según se desvela en el Ejemplo 1.

35 ratas Sprague-Dawley pesando 240 - 260 g se dividieron en cinco grupos comprendiendo seis animales (grupo 1), siete animales (grupo 2, 4 y 5) u ocho animales (grupo 3). Los animales se anestesiaron con mezcla de Ketavet (110 mg/kg) y de Rompun (12 mg/kg) inyectada intraperitonealmente seguido por una laminectomía a nivel T-11. Una vez expuesta la espina dorsal, los animales recibieron una lesión por contusión en la espina dorsal def 150 kdinas usando el Impactor IH 400 (Precision Systems & Instrumentation, Lexington, KY, USA). Una hora tras la lesión, los animales recibieron una dosis única en inyección de la respectiva proteína (véase la tabla 1). Se evaluó la recuperación locomotora mediante la escala de puntuación Basso-Beattie-Bresnahan tres días, una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas y seis semanas tras el evento de lesión por contusión. La escala de puntuación Basso-Beattie-Bresnahan es una escala de 21 puntos que detalla sistemáticamente la función impedida de la pierna de los movimientos de la articulación, capacidad de subir escalones, el grado de control fino de la coordinación de la subida de escalones y la estabilidad del tronco.

1

Los animales se expusieron en un campo abierto y se observaron durante un periodo de cinco minutos durante tres días, una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas y seis semanas tras el evento de lesión por contusión. La Fig. 1 desvela los valores sobre la escala Basso-Beattie-Bresnahan obtenidos en este experimento.

Se encontró que la administración de rhEPO-Fc carbamoilada (grupo 4) y rhEPO-Fc (grupo 3) mejoró significativamente la recuperación locomotora en comparación con los grupos control (grupos 1 y 2). A diferencia de lo anterior, los animales tratados con metilprednisolona (grupo 5) escasamente mostraron diferencias con los animales de control. Mientras que los animales de control alcanzaron un estado estacionario tras aproximadamente cuatro semanas y no mostraron ninguna mejoría regenerativa adicional, los animales de los grupos 3 y 4 (proteína de fusión EPO-Fc y proteína de fusión EPO-Fc carbamoilada, respectivamente) mostraron mejoras continuas y significativas durante las seis semanas del periodo de recuperación.

Se encontró también que la administración de rhEPO-Fc carbamoilada (grupo 4) mejora significativamente la recuperación locomotora cuando se compara con rhEPO-Fc (grupo 3), en particular poco tiempo tras la lesión por contusión. En el día tres, los animales tratados con rhEPO-Fc mostraron únicamente movimiento extensivo de una articulación o dos articulaciones (valor 2 ó 3 en la escala de puntuación Basso-Beattie-Bresnahan, respectivamente) mientras que los animales tratados con rhEPO-Fc carbamoilada mostraron movimiento extensivo de al menos dos articulaciones y un ligero movimiento de la tercera articulación o movimiento extensivo de las tres articulaciones de la pierna impedida (valor 6 ó 7 en la escala de puntuación Basso-Beattie-Bresnahan respectivamente).

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Referencias citadas en la memoria descriptiva

El listado de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones, y la OEP rechaza cualquier responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la memoria descriptiva

\bullet WO 2006014466 A [0004]: \bullet WO 2006002646 A [0004]

\bullet WO 9902708 A [0005]: \bullet WO 2005063808 A [0006]

Bibliografía no de patentes citada en la memoria descriptiva

\bulletDoggrell, SA. Expert Opin Investig Drugs, 2004, vol. 13 (11), 1517-9 [0002]

\bulletGorio, A. y col. Proc Natl Acad Sci USA; 2002 vol. 99 (14), 9450-5,

\bulletLeist M. Science; 2004 vol. 305 (5681), 239-42), [0002]

\bulletGorio A. Neurosurgery; 2005, vol. 56(4), 821-7;

\bulletGrasso G. Neurosurgery; 2005, vol. 56(4), 821-7).

Claims

1. Una proteína de fusión de EPO recombinante que tiene una semivida fisiológica mejorada y una actividad hematopoyética reducida cuando se compara con la EPO in vivo, y que tiene además actividad neurorregeneradora in vivo, caracterizada porque comprende una porción Fc de una molécula de IgG humana y una porción de eritropoyetina (EPO), preferiblemente una porción de eritropoyetina humana, en la que la porción Fc está directamente unida mediante su N-terminal con el C-terminal de la porción de EPO, y en la que la proteína de fusión está modificada por carbamoilación.

2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que al menos uno, preferiblemente dos o más restos de lisina y/o el aminoácido N-terminal de dicha proteína de fusión están carbamoilados.

3. La proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, en la que la porción Fc comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 derivados de IgG humana.

4. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la fusión se produce en una región bisagra.

5. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dos monómeros de proteína de fusión EPO-Fc se unen entre sí para formar un homodímero.

6. Un procedimiento para la preparación de una proteína de fusión EPO-Fc recombinante carbamoilada que comprende una porción Fc de una molécula de IgG humana y una porción EPO, preferiblemente una porción de EPO humana, en la que la porción Fc está directamente unida mediante su N-terminal con el C-terminal de la porción de EPO, procedimiento que comprende:

-: transformar una célula huésped con dicha molécula de ADN;

-: cosechar dicha proteína de fusión EPO-Fc;

-: purificar dicha proteína de fusión EPO-Fc; y

-: carbamoilar dicha proteína de fusión EPO-Fc hacienda reaccionar una cantidad de cianato con una cantidad de dicha proteína de fusión EPO-Fc, en la que al menos una, preferiblemente dos o más restos de lisina y/o el aminoácido N-terminal de la proteína de fusión están carbamoilados.

7. La proteína de fusión definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como fármaco.

8. Uso de una proteína de fusión según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una dolencia del sistema nervioso central (SNC) y/o del sistema nervioso periférico.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que la dolencia se selecciona entre el grupo constituido por apoplejía, un evento isquémico en el SNC distinto de una apoplejía, una lesión por contusión, una lesión en la espina dorsal, una lesión cerebral traumática, y una enfermedad neurodegenerativa.

10. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente para administración parenteral.

11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, adaptada como disolución para inyección.