ES2327409T3 - Proteinas de fusion fc mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Proteína de fusión que comprende (i) al menos un primer dominio que comprende un dominio de fijación de ligando del receptor CD95 fusionado a (ii) un segundo dominio heterólogo que comprende un fragmento Fc de un dominio constante pesado de inmunoglobulina que comprende el dominio CH2 y CH3 y opcionalmente al menos una parte de la región bisagra en donde existe al menos solapamiento de un aminoácido entre el primer dominio y el segundo dominio en la región de fusión, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en las Figuras 3A o 3B, para reducir el potencial inmunógeno de la proteína de fusión en el contexto de aplicaciones terapéuticas.
Description
Proteínas de fusión Fc mejoradas.
La invención se refiere a proteínas de fusión
que comprenden al menos un dominio de polipéptido biológicamente
activo y un segundo dominio seleccionado de un dominio constante de
inmunoglobulina.
Proteínas de fusión que comprenden un dímero de
cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina o un tetrámero de
cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina, en las cuales una
secuencia de aminoácidos de una pareja de fijación de ligando que
es un receptor, una proteína portadora, una hormona, un factor de
crecimiento o una enzima, se encuentra en sustitución de la región
variable de al menos de una cadena de inmunoglobulina, se describen
en EP-A-0526452. Una proteína de
fusión que comprende el dominio extracelular del receptor de muerte
CD95 (APO-1; Fas) fusionado a un fragmento Fc de
inmunoglobulina se describe en WO 95/27735. Derivados truncados en
el terminal N de la molécula APO-1 fusionados
opcionalmente a fragmentos Fc de inmunoglobulina se describen en
EP-A-0965637. Una proteína de fusión
constituida por fragmentos solubles IL-15R\alpha y
Fc se describe en WO 98/36768. Una proteína de fusión constituida
por un mutante antagonista de IL-15 y un fragmento
Fc IgG2a ha sido descrita por Kim et al. (J. Immunol.
160 (1998), 5742-5748).
Aunque se ha demostrado que proteínas de fusión
como las arriba descritas tienen actividad biológica alta in
vitro e in vivo, existen problemas con relación al
potencial inmunógeno de tales moléculas dado que existe una región
de fusión entre dos dominios proteínicos de origen diferente que
comprenden una secuencia amino no existente naturalmente que puede
provocar una respuesta inmune indeseable en un organismo al que se
administre la proteína de fusión.
WO 02/066514 describe proteínas de fusión
artificiales que tienen una inmunogenicidad reducida comparadas con
la molécula no modificada parental cuando se exponen a una especie
in vivo. Estas proteínas consisten esencialmente en una
molécula de inmunoglobulina o un fragmento de la misma fusionado
covalentemente a través de su término C al término N de una
molécula biológicamente activa que no es una inmunoglobulina,
preferiblemente un polipéptido o proteína o un fragmento
biológicamente activo de los mismos. Las moléculas tienen secuencias
de aminoácidos que están alteradas en una o más posiciones de
residuos de aminoácido pero, en principio, tienen la misma
actividad biológica comparadas con las moléculas inalteradas. Los
cambios se producen en regiones de las moléculas que están
identificadas como epítopes de células T, que contribuyen a una
reacción inmunitaria en un hospedador vivo. Sin embargo, una
desventaja de este procedimiento es que no todos los epítopes,
particularmente los epítopes distintos de células B, pueden
eliminarse fiablemente. Adicionalmente, la introducción de
secuencias de aminoácidos no existentes naturalmente puede conducir
a la generación de neo-epítopes.
Por esta razón, ha sido un objeto de la presente
invención proporcionar proteínas de fusión que tienen al menos dos
dominios de origen diferente que tienen un potencial inmunógeno
reducido.
Se describe una proteína de fusión que
comprende
(i) al menos un primer dominio que comprende un
polipéptido biológicamente activo y
(ii) un segundo dominio heterólogo que comprende
al menos una porción de un dominio constante de inmunoglobulina,
en la cual existe al menos un solapamiento de
aminoácidos entre el primer dominio y el segundo dominio en la
región de fusión.
La proteína de fusión puede ser una proteína
monómera o una proteína multímera, v.g. una proteína dímera o
tetrámera, que puede formarse por multimerización por la vía del
domino constante de inmunoglobulina.
El diseño de una proteína de fusión comprende:
i) la selección de al menos un primer dominio y un segundo dominio
que es heterólogo al primer dominio y ii) la selección de al menos
un aminoácido terminal que es común al primer y al segundo dominio,
v.g. el o los últimos aminoácidos del primer dominio se
selecciona(n) de tal modo que los mismos son idénticos al
primer o primeros aminoácidos del segundo dominio. Preferiblemente,
el solapamiento tiene una longitud de uno, dos o tres aminoácidos.
Así, se obtiene una proteína de fusión que está exenta de una
transición no existente naturalmente entre el último aminoácido de
un dominio y el primer aminoácido de otro dominio.
El o los primeros dominios está o están
localizados en el término N de la proteína de fusión, mientras que
el segundo dominio está localizado en el término C. Así, al menos un
aminoácido del terminal carboxi de un primer dominio se solapa con
al menos un ácido del terminal amino del segundo dominio.
El segundo dominio puede estar localizado en el
término N de la proteína de fusión y el o los primeros dominios
está o están localizados en el término C. Así, al menos un
aminoácido carboxiterminal del segundo dominio se solapa con al
menos un ácido del terminal amino de un primer dominio.
\newpage
En los casos en que la proteína de fusión
comprende más de uno, v.g. dos o tres, primeros dominios, estos
dominios están localizados preferiblemente de modo secuencial en el
término N o el término C de la proteína de fusión, y el segundo
dominio en el término C o en el término N, respectivamente. Debe
indicarse que los primeros dominios en tales proteínas pueden ser
iguales o diferentes. Las transiciones entre los primeros dominios
individuales están diseñadas preferiblemente de tal manera que
existe también al menos un solapamiento de aminoácido (y por tanto
no una transición no existente naturalmente entre el último
aminoácido de un dominio y el primer aminoácido del otro dominio)
entre las primeros dominios individuales. Proteínas de fusión que
comprenden primeros dominios múltiples se describen en WO
00/18932.
El primer dominio de la proteína de fusión
comprende un polipéptido biológicamente activo, es decir un
polipéptido que es capaz de interaccionar con, v.g. fijarse a, una
pareja de fijación, v.g. otro polipéptido, en su ambiente natural
en una célula o en un organismo y que es preferiblemente capaz de
exhibir una actividad farmacológica. El primer dominio es
preferiblemente un polipéptido distinto de inmunoglobulina. El
primer dominio puede ser un polipéptido existente naturalmente o
una variante del mismo que tiene actividad biológica deseada, v.g.
aumentada o reducida, o un fragmento de un polipéptido existente
naturalmente o una variante del mismo. El primer dominio se
selecciona preferiblemente del dominio de fijación de ligando de un
receptor y un dominio de fijación de receptor de un ligando. Los
términos "ligando" y "receptor" deben entenderse en este
contexto de tal manera que los ligandos se definen como proteínas
que se sabe funcionan para unirse específicamente a moléculas
receptoras. El término "receptor" incluye proteínas receptoras
solubles o ancladas a la membrana que tienen una región
transmembranal hidrófoba o un ancla fosfolipídica. Adicionalmente,
el término "receptor" abarca proteínas portadoras tales como
hormonas, proteínas celulares adhesivas, lectinas, factores de
crecimiento, enzimas, etc.
El primer dominio es un domino receptor de
fijación de ligando que comprende el dominio extracelular de un
receptor anclado a la membrana o un fragmento de fijación de ligando
del mismo. El receptor puede seleccionarse de receptores de muerte,
receptores de factores de crecimiento y receptores de citoquinas. El
receptor puede seleccionarse de CD95 (APO-1; Fas),
receptores TRAIL, receptores TNF, receptores VEGF, un receptor de
interleuquina tal como IL-15R\alpha. El receptor
puede ser CD95, un receptor TRAIL, v.g. el
receptor-1 TRAIL, el receptor-2
TRAIL, el receptor-3 TRAIL, o el
receptor-4 TRAIL o un receptor TNF, v.g. el
receptor-1 TNF o el receptor-2
TNF.
El primer dominio es un dominio de ligando de
fijación de receptor, tal como el ligando CD95, TRAIL, TNF, v.g.
TNF-\alpha o TNF-\beta, factores
de crecimiento, v.g. VEGF y citoquinas, tales como interferones o
interleuquinas, v.g. IL-15 o variantes de los
mismos.
La proteína de fusión comprende primeros
dominios múltiples que pueden ser iguales o diferentes. Un ejemplo
de una proteína de fusión múltiple de este tipo es una proteína de
fusión VEGF Trap, que comprende el segundo dominio extracelular del
receptor 1 VEGF (Flt-1) con el tercer dominio del
receptor 2 VEGF (KDR/FIK-1) y una región constante
de IgG.
La proteína del primer dominio es
preferiblemente una proteína de mamífero, más preferiblemente una
proteína humana. Para propósitos terapéuticos en particular, se
prefiere el uso de proteínas humanas.
El segundo dominio de la proteína de fusión
comprende al menos una porción de un dominio constante de
inmunoglobulina, v.g. un dominio constante pesado de
inmunoglobulina o un dominio constante ligero de inmunoglobulina.
Preferiblemente, el segundo dominio comprende al menos una porción
de un dominio constante pesado de inmunoglobulina. El dominio
constante pesado de inmunoglobulina es preferiblemente un fragmento
Fc que comprende el dominio CH2 y CH3 y, opcionalmente, al menos
una parte de la región bisagra. El dominio de inmunoglobulina puede
ser un dominio de inmunoglobulina IgG, IgM, IgD o IgE, o un dominio
de inmunoglobulina modificado derivado de los mismos.
Preferiblemente, el segundo dominio comprende al menos una porción
de un dominio constante de inmunoglobulina IgG. El dominio de
inmunoglobulina IgG puede seleccionarse de dominios IgG1, IgG2, IgG3
o IgG4, o de dominios modificados tales como los descritos en US
5.925.734. El dominio de inmunoglobulina puede exhibir funciones
efectoras, particularmente funciones efectoras seleccionadas de ADCC
y/o CDC. En algunas realizaciones, sin embargo, pueden utilizarse
dominios de inmunoglobulina modificados que tienen funciones
efectoras modificadas, v.g. al menos parcialmente delecionadas.
El diseño de la proteína de fusión de la
presente invención comprende una selección del o de los aminoácidos
terminales del primer dominio y del segundo dominio a fin de crear
un solapamiento de al menos un aminoácido entre ambos dominios. Con
objeto de alcanzar esta meta, es usualmente necesario delecionar uno
o varios aminoácidos de un primer y/o segundo dominio y/o añadir
uno o varios amino-ácidos del dominio adyacente existente
naturalmente al primer y/o segundo dominio. Por ejemplo, puede ser
necesario proporcionar un primer dominio que tenga una deleción de
preferiblemente hasta 10 y, más preferiblemente hasta 6 aminoácidos,
v.g. 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos de los límites del dominio
existentes naturalmente. Por otra parte, puede ser necesario añadir
preferiblemente hasta 10 y, más preferiblemente, hasta 6
aminoácidos, v.g. 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos de un domino
adyacente existente naturalmente al primer y/o segundo dominio.
Cuando se delecionan y/o añaden aminoácidos, sin embargo, debe
tenerse precaución a fin de que la actividad biológica del primer
dominio y/o el segundo dominio no se vea afectada
desfavorablemente.
La proteína de fusión de la invención puede
comprender una secuencia señal N-terminal que
permite la secreción de una célula hospedadora después de expresión
recombinante. La secuencia señal puede ser una secuencia señal que
es homóloga al primer dominio de la proteína de fusión.
Alternativamente, la secuencia señal puede ser también una
secuencia señal heteróloga, v.g. la secuencia del péptido señal
Ig\kappa o la secuencia señal Ig\lambda. En una realización
diferente, la proteína de fusión está exenta de una secuencia
N-terminal, representando así la forma madura de la
proteína de fusión.
El solapamiento entre el primer y el segundo
dominio o entre los dos primeros dominios tiene una longitud de
preferiblemente 1, 2 ó 3 aminoácidos. Más preferiblemente, el
solapamiento tiene una longitud de un solo aminoácido. Ejemplos de
solapamiento de aminoácidos son S, E, K, H, T, P y D.
La presente invención se explica en detalle a
continuación con relación a varias realizaciones específicas
preferidas. Debe indicarse, sin embargo, que proteínas de fusión
adicionales de la invención pueden fabricarse por medios
análogos.
En una primera realización preferida, el primer
dominio es el dominio extracelular de CD95 humana. El dominio
extracelular de la proteína de fusión comprende preferiblemente la
secuencia de aminoácidos hasta el aminoácido 170, 171, 172 ó 173 de
CD95 humana. Preferiblemente, el dominio extracelular de CD95 está
fusionado con un fragmento Fc de IgG humana, v.g. un fragmento Fc
de IgG1 humana. La secuencia de aminoácidos de la molécula CD95
humana se muestra en la Figura 1. La secuencia de aminoácidos del
dominio de la cadena constante de IgG1 humana se muestra en la
Figura 2. Se prefiere especialmente la proteína de fusión que
comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en las Figuras
3A y 3B, en donde la secuencia de aminoácidos solapante es S.
El primer dominio puede ser el dominio
extracelular de un receptor TRAIL humano, v.g. el
receptor-1 TRAIL humano, el
receptor-2 TRAIL humano, el
receptor-3 TRAIL humano y el
receptor-4 TRAIL humano. El dominio extracelular
comprende la secuencia de aminoácidos hasta el aminoácido 232, 233,
234, 235, 236, 237, 238, 239 (TRAILR-1), 204, 205,
206, 207, 208, 209, 210 (TRAILR-2 largo), 185, 186,
187, 188, 189, 190, 191 (TRAILR-2 largo - sin
repetición), 179, 180, 181, 182, 183, 184 (TRAILR-2
corto), 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236,
(TRAILR-3), 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158,
159, 160, 161 (TRAILR-3 sin repetición) y 201, 202,
203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211
(TRAILR-4). Se describe especialmente el
receptor-2 TRAIL humano. El dominio del receptor
TRAIL humano extracelular puede estar fusionado con un fragmento Fc
de IgG-1 humana. Las secuencias de aminoácidos de
receptores TRAIL humanos se muestran en la Figura 4 (
TRAILR-1), Figura 6 ( TRAILR-2
largo), Figura 9 ( TRAILR-2 corto), Figura 11 (
TRAIL-3) y Figura 14 ( TRAILR-4).
Ejemplos específicos de proteínas de fusión comprenden las
secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figuras 5, 7, 8,
10, 12, 13 y 15.
La proteína de fusión puede comprender un primer
dominio que es el dominio extracelular de un receptor TNF humano,
v.g. un receptor-1 de TNF humano o un
receptor-2 de TNF humano. El dominio extracelular
comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos hasta el
aminoácido 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211
(TNF-R1) o 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255,
256, 257 (TNF-R2). El dominio extracelular del
receptor TNF humano puede estar fusionado a un fragmento Fc de
IgG-1 humana. Las secuencias de aminoácidos de
receptores TNF humanos se muestran en las Figuras 16
(TNF-R1) y 18 (TNF-R2). Ejemplos
específicos de proteínas de fusión comprenden las secuencias de
aminoácidos que se muestran en las Figuras 17 y 19.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína
de fusión como se ha descrito arriba. La molécula de ácido nucleico
puede ser una molécula de DNA, v.g. una molécula de DNA bicatenario
o monocatenario, o una molécula de RNA. La molécula de ácido
nucleico puede codificar la proteína de fusión o un precursor de la
misma, v.g. una pro- o pre-proforma de la proteína
de fusión que puede comprender una secuencia señal u otras porciones
de aminoácidos heterólogos para secreción o purificación que están
localizadas preferiblemente en el término N y/o C de la proteína de
fusión. Las porciones de aminoácidos heterólogos pueden estar
enlazadas al primer y/o segundo dominio por la vía de un sitio de
escisión con proteasa, v.g. un sitio de escisión de Factor X_{a},
trombina o proteasa IgA.
La molécula de ácido nucleico puede estar
enlazada operativamente a una secuencia de control de la expresión,
v.g. una secuencia de control de la expresión que permite la
expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula
hospedadora deseada. La molécula de ácido nucleico puede estar
localizada en un vector, v.g. un plásmido, un bacteriófago, un
vector viral, un vector de integración de cromosomas, etc. Ejemplos
se secuencias de control de la expresión y vectores adecuados han
sido descritos por ejemplo por Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press, y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons.
Pueden utilizarse diversos sistemas vector de
expresión/célula hospedadora para expresar las secuencias de ácido
nucleico que codifican las proteínas de fusión de la presente
invención. Células hospedadoras adecuadas incluyen, pero sin
carácter limitante, células procariotas tales como bacterias, v.g.
E. coli, células hospedadoras eucariotas tales como células
de levadura, células de insecto, células de plantas o células de
animales, preferiblemente células de mamífero y, más
preferiblemente, células humanas.
Adicionalmente, la solicitud se refiere a un
organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de
ácido nucleico como se ha descrito arriba. Tales organismos
transgénicos pueden generarse por métodos conocidos de
transferencia genética que incluyen recombinación homóloga.
\newpage
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende como agente
activo al menos una proteína de fusión o una molécula de ácido
nucleico que codifica la misma en donde el primer dominio es el
dominio extracelular CD95 para uso en la profilaxis y/o el
tratamiento de trastornos asociados con apoptosis.
En esta realización de la invención, la
composición puede utilizarse en la profilaxis y/o el tratamiento de
trastornos seleccionados de trastornos autoinmunes, SIDA, trastornos
cardíacos, v.g. infarto de miocardio, trastornos de rechazo
inverso, rechazo de trasplantes, deterioro cerebral, v.g. derrame
cerebral, lesiones de la médula espinal, v.g. paraplejia, sepsis,
hepatitis, trastornos asociados con inflamación, lesión de
reperfusión isquémica y trastornos renales. Estos trastornos y
trastornos adicionales que pueden tratarse por administración de
proteínas de fusión de receptores de muerte, particularmente
proteínas de fusión CD95, se describen en WO 95/27735, WO 99/50413,
WO 01/41803, EP-A-0 965 637 y
EP-A-0 992 243.
La proteína de fusión se administra a un
individuo que se encuentra en necesidad de ello, particularmente un
paciente humano, en una dosis suficiente para el tratamiento de las
condiciones específicas por medios adecuados. Por ejemplo, la
proteína de fusión puede formularse con una composición farmacéutica
junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente
aceptables. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden
determinarse de acuerdo con protocolos estándar. La composición
farmacéutica puede administrarse sistémicamente, v.g. por vía
intraperitoneal, intramuscular o intravenosa, o localmente, v.g. por
vía intranasal, subcutánea o intratecal. Se prefiere la
administración intravenosa.
La dosis de la proteína de fusión administrada
dependerá por su puesto del individuo a tratar, del peso del
individuo, del tipo y gravedad de la lesión, de la modalidad de
administración y del criterio del médico prescriptor. Para la
administración de las proteínas de fusión CD95 o
TRAIL-R, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a
100 mg/kg.
Además, se describe un método de fabricación de
una proteína de fusión que comprende
- (i)
- al menos un primer dominio que comprende una proteína biológicamente activa fusionada a
- (ii)
- un segundo dominio que comprende al menos una porción de un dominio constante de inmunoglobulina con potencial inmunógeno reducido, en donde el primer dominio está fusionado al segundo dominio con solapamiento de al menos un aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, se describe una proteína de
fusión que comprende:
- (i)
- al menos un primer dominio que comprende un polipéptido biológicamente activo fusionado a
- (ii)
- un segundo dominio heterólogo que es capaz de oligomerizar la proteína de fusión, en donde existe al menos un solapamiento de un aminoácido entre el primer y segundo dominio en la región de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Proteínas de fusión que comprenden segundos
dominios heterólogos que son capaces de oligomerizar las proteínas
de fusión en ausencia de terceras proteínas se describen en WO
01/49866 y WO 02/090553, por ejemplo. La presencia de al menos un
solapamiento de un aminoácido, v.g. solapamiento de uno, dos o tres
aminoácidos, entre el primer y el segundo dominio en las proteínas
de fusión conduce - como se ha explicado arriba - a proteínas de
fusión con potencial inmunógeno reducido.
El primer dominio en esta proteína de fusión
oligomerizante se define como anteriormente. El primer dominio
puede ser un dominio extracelular de un receptor anclado a la
membrana, o un fragmento de fijación de ligando del mismo. El
receptor se selecciona de CD95, un receptor TRAIL, particularmente
el receptor-2TRAIL y un receptor TNF,
particularmente el receptor-2TNF. Alternativamente,
el primer dominio puede ser un dominio de ligando de fijación de
receptor, en donde el ligando se selecciona preferiblemente de
ligando CD95, TRAIL y TNF. Ejemplos específicos de primeros
dominios preferidos son como se ha descrito arriba.
El segundo dominio de la proteína de fusión
comprende una porción oligomerizante de una proteína.
Preferiblemente, el segundo dominio es capaz de di-, tri-, tetra- o
pentamerizar la proteína de fusión. En este contexto, se hace
referencia particular a la descripción de WO 01/49866 y WO
02/090553. Ejemplos preferidos de segundos dominios son C1q, MBP
(Proteína de Fijación de Manosa), SP-A
(Proteína-A Tensioactiva de Pulmón),
SP-D (Proteína-D Tensioactiva de
Pulmón), BC (Conglutinina de Suero Bovino), CL43
(Colectina-43 de Bovino), ACRP-30
(una proteína de la familia C1q) y COMP (Proteína Matriz Oligómera
de Cartílago) o el dominio de colágeno de EDA o un derivado
funcionalmente activo del mismo. Se prefieren especialmente
porciones de ACRP-30, particularmente de la proteína
ACRP-30 humana, v.g. los aminoácidos 18 a 108, 18 a
110 de COMP.
Como se ha descrito arriba, el o los primeros
dominios de la proteína de fusión pueden estar localizados en el
término N o C, y el segundo dominio en el término C o N.
Adicionalmente, tanto el primer como el segundo dominio son
preferiblemente de la misma especie, más preferiblemente de origen
humano. Adicionalmente, las características relativas a
realizaciones preferidas de las proteínas de fusión basadas en
inmunoglobulinas se aplican también a las proteínas de fusión
oligomerizantes.
El potencial inmunógeno reducido de la proteína
de fusión es resultado de la falta de transiciones existentes no
naturalmente entre el primer y el segundo dominio en las proteínas
de fusión, lo que conduce a su vez a un potencial reducido para la
formación de neo-epítopes resultantes de la fusión
entre dos polipéptidos heterólogos.
La presente invención se ilustra adicionalmente
por las Figuras y Ejemplos que siguen.
Figura 1: la secuencia de aminoácidos de la
proteína humana CD95 (APO-1; Fas);
Figura 2: la secuencia de aminoácidos de la
región C de la cadena de IgG-1 humana;
Figuras 3A y 3B: un ejemplo preferido de una
proteína de fusión IgG1 CD95-Fc con un aminoácido
solapante;
Figura 4: la secuencia de aminoácidos del
receptor-1 TRAIL humano;
Figura 5: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1 Fc TRAILR-1 con aminoácidos
solapantes;
Figura 6: la secuencia de aminoácidos del
receptor-2TRAIL humano (forma larga);
Figura 7: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión TRAILR-2 (largo) Fc IgG1 con aminoácidos
solapantes, con inclusión de una secuencia de repetición;
Figura 8: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión TRAILR-2 (forma larga) Fc con aminoácidos
solapantes (sin secuencia de repetición);
Figura 9: la secuencia de aminoácidos de
TRAILR-2 humano (forma corta);
Figura 10: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1 TRAILR-2 (corto) Fc con aminoácidos
solapantes;
Figura 11: la secuencia de aminoácidos del
receptor R-3 TRAIL humano;
Figura 12: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1 TRAILR-3 Fc con aminoácidos solapantes
(con inclusión de repeticiones);
Figura 13: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1 TRAILR-3 Fc con aminoácidos solapantes
(sin inclusión de repeticiones);
Figura 14: la secuencia de aminoácidos del
receptor-4TRAIL humano;
Figura 15: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1 TRAILR-4 Fc con aminoácidos
solapantes;
Figura 16: la secuencia de aminoácidos del
receptor-1 del factor de necrosis tumoral
humano;
Figura 17: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1TNFR-1 Fc con aminoácidos solapantes;
Figura 18: la secuencia de aminoácidos del
receptor-2 del factor de necrosis tumoral
humano;
Figura 19: ejemplos preferidos de proteínas de
fusión IgG1TNF-R2 Fc con aminoácidos solapantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Bases 221-736 de CD95 humana
(Genbank Acc. No. X63717). Secuencia utilizada de Oehm, A., Oehm,
A., "Purification and Molecular Cloning of the
APO-1 Cell Surface Antigen, a Member of the Tumour
Necrosis Factor/Nerve Growth Factor Receptor Superfamily,"
Journal of Biological Chemistry Vol. 267, No.15,
pp.10709-10715, 1992. Se creó cDNA a partir de RNA
total aislado de Linfocitos de Sangre Periférica (PBL) de sangre de
donantes por RT-PCR utilizando el iniciador Oligo
dT. Se utilizaron PCRs para amplificar el cDNA del dominio
extracelular de CD95 por inclusión de un sitio de restricción Hind
III y una secuencia Kozak en el 5' del dominio extracelular y en el
3' un sitio Bgl II (terminación del dominio extracelular).
Iniciadores PCR para la amplificación de cDNA de
CD95 con polimerasa Taq:
- Sentido huCD95-Hind III: TATA AAGCTT GCC ACC ATG CTG GGC ATC TG (SEQ ID NO:21)
- Antisentido huCD95-Bgl II: TATA AGATCT GGA TCC TTC CTC TTT GC (SEQ ID NO:2)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 2050-2745 pb.
Secuencia utilizada de Ellison, J., "The nucleotide sequence of
human immunoglobulin C gene", Nucleic Acid Research, Volumen 10
Número 13, 1982. Se creó cDNA a partir de RNA total aislado de
Linfocitos de Sangre Periférica (PBL) de sangre de donantes por
RT-PCR utilizando iniciador Oligo dT. Se utilizó una
PCR para amplificar el cDNA de Fc de IgG1 humana (bisagra
parcial-CH3) por inclusión de un sitio de
restricción Bgl II en el 5' del iniciador y en el 3' del iniciador
después del codón de parada, un sitio Xho I.
Iniciadores PCR para la amplificación de cDNA de
Fc de IgG1 con polimerasa Taq:
- Sentido hulgG1Fe-Bg111: TATA AGATCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TG (SEQ ID NO: 3)
- Antisentido hulgG1Fc-Xho1: TATA CTCGAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG (SEQ ID NO: 4)
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la amplificación, el producto PCR de
Fc de IgG1 se digirió con Bgl II y Xho I. El producto PCR de CD95
se digirió con Hind III y Bgl II y pcDNA3.1 (con promotor CMV) con
Hind III y Xho I. Los productos se purificaron por extracción con
gel (kit Qiagen).
Los fragmentos hulg G1Fc y CD95 se ligaron con
ligasa T4 en pcDNA3.1. Después de transfección de células
químicamente competentes One Shot Top 10 (E. coli) de Invitrogen,
Pedido #C4040-10 y amplificación, se realizó una
preparación de plásmido con el kit Qiagen Plasmid Prep.
Se realizó una ligación en tres puntos por
digestión de pcDNA3.1 con Hind III y Xho I, CD95 EC con Hind III y
Bgl II, y hulgG1Fc con Bgl II y Xho I. La presencia de la inserción
CD95-hulg G1Fc en pcDNA3.1 se verificó por
secuenciación y análisis con enzimas de restricción. El vector que
contenía la inserción se digirió con Hind III y Xba I y la
inserción se ligó en pcDNA3.1 que contenía el promotor
EF-1.
La secuencia Kozak del constructo original
CD95-FC se cambió de GCCACCATGC a GCCGCCACCATGG por
amplificación del producto CD95-FC completo con los
iniciadores SEQ ID 5 y SEQ ID 6.
\vskip1.000000\baselineskip
- ShuCD95EC_altKozak TATA AAGCTT GCC GCC ACC ATG GTG GGC ATC (SEQ ID NO. 5)
- AS698 hulgG1Fc-Xho1 TATA CTCGAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG (SEQ ID NO:6)
\vskip1.000000\baselineskip
El producto PCR se clonó en el vector
pcDNA3.1/V5 His Topo de Invitrogen (Pedido
#K4800-01), digerido con Hind III y Xba I así como
pcDNA3.1 que contenía el promotor pEF y se ligó con ligasa T4.
\vskip1.000000\baselineskip
El constructo que codificaba el producto final
se transfectó en líneas de células adecuadas para expresión de
proteínas. La transfección puede realizarse por cualquier método
estándar conocido por los expertos en la técnica. Ejemplos incluyen
electroporación, transferencia mediada por liposomas, transfección
con fosfato de calcio. Líneas de células adecuadas para la
expresión incluyen células 293T, células COS-1,
COS-7 y CHO. Pueden utilizarse otras líneas de
células.
En este ejemplo, se transfectaron
transitoriamente células 293T por el método del fosfato de calcio.
Alternativamente, se transfectaron células CHO utilizando FuGene6 y
se seleccionaron clones estables.
La proteína deseada puede purificarse a partir
del medio de cultivo de células por métodos cromatográficos. Los
métodos incluyen, pero sin carácter limitante, cromatografía de
afinidad en columnas de proteína G o proteína A, cromatografía de
cambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía
de exclusión de tamaños o una combinación de estos métodos.
En el ejemplo, el sobrenadante se purificó en
columnas de IgG (Amersham Pharmacia) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes, conduciendo a un producto
altamente purificado en un solo paso.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia utilizada de Ellison, J., "The
nucleotide sequence of human immunoglobulin C gene", Nucleic Acid
Research, Volumen 10, Número 13, 1982. Se creó cDNA a partir de RNA
total aislado de Linfocitos de Sangre Periférica (PBL) de sangre de
donantes por RT-PCR utilizando el iniciador Oligo
dT. Se utilizó una PCR para amplificar el cDNA de Fc de IgG1 humana
(bisagra parcial-CH3) con una secuencia solapante a
TRAILR2 en el extremo 5' y en el extremo 3' después del codón de
parada un sitio EcoRI.
- I.
- Iniciador: Sentido_hulgG1 (SEQ ID NO: 7)
- II.
- Iniciador: Antisentido_ERIhulgG1 (SEQ ID NO: 8)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia utilizada de Walczak H.,
"TRAIL-R2: a novel
apoptosis-mediating receptor for TRAIL" The EMBO
Journal Vo1.16, No.17, pp.5386-5397, 1997. (Número
de acceso DDBJ/EMBL/GenBank: AF016849). Se creó cDNA a partir de
RNA total aislado de linfocitos de sangre periférica (PBL) de sangre
de donantes por RT-PCR utilizando un iniciador
Oligo dT. Se utilizó una PCR para purificar el cDNA del dominio
TRAILR2 por inclusión de un sitio de restricción Hind III y una
secuencia Kozak en el extremo 5' y en el extremo 3' una secuencia
solapante para IgG1 humana.
- III.
- Iniciador: Sentido_HIII_TRAILR2 (SEQ ID NO: 9)
- TATA aag ctt gcc gcc acc atg gaa caa cgg gga cag aac
- IV.
- Iniciador: Antisentido_TRAILR2 (SEQ ID NO: 10)
- gtg agt ttt gtc aca aga GGC AGG AGT CCC TGG (Letras mayúsculas => parte huTRAIL-R2, al revés)
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación de la amplificación se realizó
una extracción con gel para aislar las inserciones modificadas. Se
realizó luego una tercera PCR utilizando ambos fragmentos. Debido al
solapamiento de ambos fragmentos y los iniciadores en el extremo,
esta PCR se une en un solo producto. Después de ello el producto se
digirió con Hind III y EcoRI y se ligó en un vector de expresión
adecuado, v.g. pcDNA3.1 (Invitrogen).
- III.
- Iniciador: Sentido_HIII_TRAILR2 (SEQ ID NO: 11)
- TATA aag ctt gcc gcc acc atg gaa caa cgg gga cag aac
- II.
- Iniciador: Antisentido_ERIhulgG1 (SEQ ID NO: 12)
- TATA gaa ttc tca ttt acc cgg aga cag gg
\vskip1.000000\baselineskip
El constructo se clonó y expresó en células
hospedadoras adecuadas como se describe en el Ejemplo 1.
\newpage
El constructo CD95-Fc con
aminoácidos solapantes como se describe en el Ejemplo 1 se utilizó
para el tratamiento de lesiones de la médula espinal en un modelo
de ratón como ha sido descrito por Demjen et al., Nat Med.
(7 de marzo de 2004). Se encontró que la administración del
constructo promueve la regeneración y recuperación funcional
después de lesión de la médula espinal.
\vskip1.000000\baselineskip
El constructo CD95-Fc con
aminoácidos solapantes se investigó respecto a su influencia en la
muerte por isquemia primaria y lesión secundaria por inflamación en
un modelo de ratón como se describe por
Martín-Villalba et al. (Cell Death
Differ. 8 (2001), 679-686). Se encontró que la
administración del constructo CD95-Fc daba como
resultado una disminución significativa tanto en los volúmenes de
infarto como en la mortalidad.
Claims (13)
1. Proteína de fusión que comprende
- (i)
- al menos un primer dominio que comprende un dominio de fijación de ligando del receptor CD95 fusionado a
- (ii)
- un segundo dominio heterólogo que comprende un fragmento Fc de un dominio constante pesado de inmunoglobulina que comprende el dominio CH2 y CH3 y opcionalmente al menos una parte de la región bisagra
en donde existe al menos solapamiento de un
aminoácido entre el primer dominio y el segundo dominio en la
región de fusión,
en donde la proteína de fusión comprende la
secuencia de aminoácidos que se muestra en las Figuras 3A o 3B,
para reducir el potencial inmunógeno de la
proteína de fusión en el contexto de aplicaciones terapéuticas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en donde las aplicaciones terapéuticas se seleccionan de profilaxis
y/o tratamiento de derrame cerebral, lesiones de la médula espinal y
trastornos de rechazo inverso.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1
ó 2, en donde el dominio de inmunoglobulina exhibe funciones
efectoras, particularmente funciones efectoras seleccionadas de ADCC
y/o CDC.
4. La proteína de fusión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primer dominio y/o el
segundo dominio de la proteína de fusión comprende una deleción de
preferiblemente hasta 6 aminoácidos.
5. La proteína de fusión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer dominio y/o el
segundo dominio de la proteína de fusión comprende una adición de
preferiblemente hasta 6 aminoácidos.
6. La proteína de fusión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de fusión
comprende una secuencia señal N-terminal.
7. la proteína de fusión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de fusión carece
de una secuencia señal N-terminal.
8. Molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína de fusión como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para reducir el potencial inmunógeno de la
proteína de fusión en el contexto de aplicaciones terapéuticas.
9. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8, en donde las aplicaciones terapéuticas se
seleccionan de profilaxis y/o tratamiento de derrame cerebral,
lesiones de la médula espinal y trastornos de rechazo inverso.
10. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8 ó 9, en donde la molécula de ácido nucleico está
enlazada operativamente a una secuencia de control de la
expresión.
11. La molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la molécula de
ácido nucleico está localizada en un vector.
12. Una composición farmacéutica para reducir el
potencial inmunógeno de una proteína de fusión en el contexto de
aplicaciones terapéuticas, que comprende como agente activo dicha
proteína de fusión como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 o una molécula de ácido nucleico como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
13. La composición de la reivindicación 12 para
uso en la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos seleccionados
de derrame cerebral, lesiones de la médula espinal y trastornos de
rechazo inverso.
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|---|---|---|---|
| EP03006949 | 2003-03-26 | ||
| EP03006949 | 2003-03-26 |
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