ES2327450T3 - Utilizacion de un agente estimulante del sistema defensivo de las plantas y procedimiento para la utilizacion del mismo. - Google Patents
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Abstract
Utilización de ramnolípidos R1 y/o R2 como agentes estimulantes de las reacciones de defensa naturales de las plantas.
Description
Utilización de un agente estimulante del sistema
defensivo de las plantas y procedimiento para la utilización del
mismo.
La presente invención se refiere a la
utilización de un agente para estimular las reacciones de defensa
natural de las plantas y a un procedimiento para la utilización de
dicho agente.
Hace varios años se ha demostrado que las
plantas poseen mecanismos de protección de dos tipos: en primer
lugar medios de protección pre-existentes, tales
como la presencia de capas externas rígidas, como la cutícula, que
bloquea la entrada de agentes contaminantes, los cuales, por tanto,
sólo pueden penetrar en la planta a través de heridas o poros
naturales, o tales como los compuestos antimicrobianos almacenados
especialmente en vacuolas; y en segundo lugar, reacciones inducidas
destinadas a proteger la planta. Estas reacciones llevan a la
producción de unos antibióticos vegetales, las fitoalexinas,
proteínas de defensa, proteínas-PR y compuestos
destinados a reforzar las paredes celulares vegetales. Además, las
células infectadas son capaces de prevenir a sus vecinas del
peligro de forma que éstas puedan reaccionar inmediatamente frente a
ataques posteriores. Estas reacciones pueden ser provocadas por
unas moléculas denominadas "elicitadores", procedentes de la
planta o de microorganismos (patógenos o no). Los elicitadores
aislados, en contacto con una planta, son capaces de estimular en
dicha planta las mismas reacciones de defensa que aquellas que
desarrolla la planta cuando es atacada por un agente patógeno.
Por el término "estimular" se entiende
tanto "activar" como "promover" o "incrementar".
Igualmente ocurre con los sustantivos correspondientes.
Cuando una planta entra en contacto con un
elicitador capaz de activar sus defensas naturales antes de haber
entrado en contacto con el agente patógeno, esta planta estará mejor
protegida, incluso inmunizada, contra la enfermedad provocada por
tal agente.
Tal como se habrá podido entender, la
utilización de elicitadores presenta numerosas ventajas: en primer
lugar, la ventaja de respetar el medioambiente, ya que la
utilización de pesticidas se puede reducir incluso evitar; y, en
segundo lugar, la utilización de elicitadores permite activar el
sistema de defensa de la planta y, por tanto, es eficaz contra gran
cantidad de microorganismos patógenos.
Entre las plantas susceptibles de ponerse en
contacto con agentes elicitadores se mencionarán especialmente vid,
tabaco y Arabidopsis. Esta última es particularmente
interesante, ya que es una planta modelo para los biólogos
moleculares.
Por tanto, uno de los objetos de la presente
invención consiste en utilizar un agente estimulante del sistema
defensivo de una planta para que ésta pueda luchar mejor contra los
microorganismos patógenos.
Este objetivo, así como otros que se mostrarán
posteriormente, se alcanzan por medio de la utilización de
ramnolípidos R1 y/o R2 como agentes de estimulación de las
reacciones de defensa naturales en plantas.
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento para estimular las reacciones de defensa naturales de
las plantas, caracterizado porque a las plantas a tratar se aplica
una composición acuosa compuesta por una concentración de al menos
un 0,01% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
Preferentemente, a las plantas a tratar se
aplica una composición acuosa compuesta por una concentración de al
menos un 0,1% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
Los ramnolípidos son glicolípidos que comprenden
una cadena de ácido graso acoplada a una (R1) o dos (R2) ramnosas
en la parte carboxi terminal de la cadena ácido graso. Un
ramnolípido R1 o RLL es un éster de ácido decanoico y de
3-[(6-desoxi-L-manopiranosil)oxi]-1-(carboximetil)octilo;
un ramnolípido R2 o RRLL es un éster de ácido decanoico y de
3-{[(6-desoxi-2-O-(6-desoxi-L-manopiranosil)-L-manopiranosil]oxi}-1-(carboximetil)octilo.
Se trata de moléculas muy estables que se
utilizan como agentes humidificantes, emulsionantes, adyuvantes,
para herbicidas o pesticidas. Se utilizan también para desintoxicar
los suelos, en particular en el marco de la descontaminación de
hidrocarburos y metales pesados. Además, los ramnolípidos R1 y R2 no
son tóxicos para el ser humano. De hecho, se utilizan como aditivos
para ciertos productos alimenticios. Se utilizan en particular
biosurfactantes, tales como aquellos de la familia de los
ramnolípidos, como biofungicidas, para luchar contra los hongos con
zoosporas.
Los ramnolípidos se aíslan a partir de la
bacteria Pseudomonas aeruginosa. La obtención de los
ramnolípidos y las utilizaciones enumeradas a continuación en
particular se describen en los siguientes documentos: Langmuir
(2001) 17, 1367-1371; Pest Manag. Sci. (2000) 56,
1029-1035; Appl. Microbiol. Biotechnol. (2000) 54,
625-633; WO 97/25866 A, Biotechn. and Bioengin.
(2003), 81(3), 316-322, Colloids and Surfaces
(2004), 39, 1-7, Plant Disease (1997), 81(1),
4-12. En particular, los ramnolípidos R1 y R2 se
comercializan en forma de solución, por ejemplo la solución JBR215
de la compañía Jeneil Biosurfactant Co., LLC. (400 N. Dekora Woods
Blvd. Saukville, WI 53080).
\newpage
El límite superior de la concentración de
ramnolípidos R1 y/o R2 en las composiciones aplicadas de acuerdo
con la invención no se considera crítico; pero, en la práctica, una
concentración superior al 0,1% (v/v) no aporta ningún beneficio
adicional.
En el marco de la presente invención, se ha
estudiado el estímulo de las reacciones de defensa naturales
obtenido en el caso de la vid y de la Arabidopsis mediante
el tratamiento de estas plantas con una solución de ramnolípidos R1
y/o R2 según los ejemplos siguientes. La composición de
ramnolípidos R1 y/o R2 utilizada es aquella comercializada bajo la
denominación JBR215 por la compañía americana Jeneil Biosurfactant
Co., LLC: este producto es una solución acuosa con una
concentración del 15% (v/v) en ramnolípidos R1 y R2.
Se tratan unas vitroplantas de Vitis
vinifera (vid, cepa Chardonnay) mediante infiltración de dos
composiciones acuosas de ramnolípidos R1 y/o R2, conteniendo una un
0,01% (v/v) y la otra un 0,1% (v/v); la composición control es agua
pura.
Este tratamiento se lleva a cabo infiltrando
estas composiciones en el mesófilo de las vitroplantas, bien sea
por medio de una jeringa o bajo una campana de vacío. Se cosechan
las hojas 24 horas después de la aplicación del tratamiento.
La inducción de las respuestas de defensa, en
este caso la expresión de genes de defensa tales como los
genes
chit4-c, glucanasa, pgip, pr27, pal y lox se mide mediante PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas después de 24 horas. El método de extracción así como el análisis PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 6.
chit4-c, glucanasa, pgip, pr27, pal y lox se mide mediante PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas después de 24 horas. El método de extracción así como el análisis PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 6.
Se observa que una solución de ramnolípidos R1
y/o R2 a una concentración del 0,01% (v/v) en agua aplicada a
vitroplantas de vid según el presente ejemplo induce en 5 veces la
expresión de los genes de defensa quitinasas
(chit-4c), tal como se representa en la Figura
1, en más de 4 veces el gen de glucanasa (Figura 2), en más
de 3 veces el gen pgip (Figura 3), en más de 2 veces el gen
de pr27 (Figura 4), en más de 3 veces el gen pal
(Figura 5) y en más de 2 veces el gen lox (Figura 6).
Igualmente, una solución de ramnolípidos R1 y/o
R2 a una concentración del 0,1% (v/v) en agua aplicada a
vitroplantas de vid por infiltración induce en más de 6 veces la
expresión de los genes de defensa chit-4c,
tal como se representa en la Figura 1, en más de 8 veces el gen
glucanasa (Figura 2), en más de 4 veces el gen pgip
(Figura 3), en más de 3 veces el gen pr27, en más de 4 veces
el gen pal (Figura 5), en más de 8 veces el gen lox
(Figura 6).
Se tratan unas vitroplantas de Vitis
vinifera (vid, cepa Chardonnay) por inmersión durante 30
segundos en una composición acuosa de ramnolípidos R1 y/o R2 al
0,1% (v/v); la composición control es agua pura. Este tratamiento
por inmersión equivale a una pulverización y abarca la vitroplanta
en su totalidad, tallos y hojas.
La inducción de las respuestas de defensa, en
este caso la expresión de genes de defensa tales como los
genes
chit4-c, glucanasa, pgip y pr27 se mide por PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas después de 24 horas. El método de extracción así como el análisis PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 10.
chit4-c, glucanasa, pgip y pr27 se mide por PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas después de 24 horas. El método de extracción así como el análisis PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 10.
Así, una solución de ramnolípidos R1 y/o R2 con
una concentración del 0,1% (v/v) en agua, aplicada a vitroplantas de
vid según el presente ejemplo, induce en 2,5 veces la expresión de
los genes de defensa quitinasas (chit-4c),
tal como se representa en la Figura 7, en 5 veces el gen
glucanasa (Figura 8), en aproximadamente en 1,6 veces el gen
pgip (Figura 9), y en más de 6 veces el gen pr27
(Figura 10).
Se tratan por infiltración plantas enteras de
Arabidopsis thaliana en macetas con composiciones acuosas
que contienen un 0,1% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
Este tratamiento se lleva a cabo por
infiltración de estas composiciones en el mesófilo de las plantas,
bien sea por medio de una jeringa o bajo una campana de vacío. Se
cosechan las hojas 3, 6 y 24 horas después de la aplicación del
tratamiento.
La inducción de las respuestas de defensa, en
este caso la expresión de genes de defensa tales como los genes
pr1 y pdf1.2, se mide por PCR cuantitativa en tiempo
real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas
obtenidas en los distintos momentos mencionados anteriormente. El
método de extracción así como el análisis por PCR en tiempo real se
describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120
y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16,
1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras
11 y 12.
Tal como se observa en estas Figuras, una
solución de ramnolípidos R1 y/o R2 con una concentración del 0,1%
(v/v) en agua, aplicada por infiltración en hojas de Arabidopsis
thaliana, induce en 60 veces la expresión de los genes de
defensa pr1 (Figura 1) y en más de 20 veces el gen de defensa
pdf1.2 (Figura 12) 3 horas después del tratamiento.
Los resultados de los Ejemplos 1 a 3 demuestran
que los ramnolípidos R1 y/o R2 son capaces de estimular los
mecanismos de defensa (actividad elicitadora) en plantas tales como
la vid (Vitis vinifera) y Arabidopsis thaliana.
Se llevaron a cabo también pruebas de protección
en la vid, especialmente contra el hongo Botrytis
cinerea.
Se trataron por inmersión vitroplantas de vid
tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, con dos
composiciones acuosas de ramnolípidos R1 y/o R2, una que contenía un
0,01% (v/v) y la otra con un 0,1% (v/v).
5 días después de este tratamiento, se
arrancaron las hojas y se colocaron con la cara inferior hacia
arriba en una placa Petri que contenía un disco de papel Wattman
humidificado con agua. A continuación, se inocularon con una
pastilla de micelio de Botrytis cinerea procedente de un
cultivo de 3 días en un medio V8. Se incubaron las placas a 26ºC y
se observaron los resultados de la infección 96 horas después de la
inoculación con el hongo.
Se constató que la infección se interrumpe
durante las primeras horas después de la inoculación. Después de 96
horas, no se observa ningún micelio en las muestras tratadas con las
composiciones acuosas de ramnolípidos R1 y/o R2 a un 0,01 y 0,1%,
mientras que el micelio había colonizado totalmente las hojas cuando
no se realizó ningún tratamiento con los ramnolípidos R1 y/o
R2.
Los resultados complementarios obtenidos sobre
el crecimiento del micelio en placa en medio V8 demuestran que,
además, los ramnolípidos R1 y/o R2 inhiben el crecimiento fúngico a
partir del 0,01% y preferentemente a partir del 0,1%, con más de un
70% de inhibición de crecimiento radial.
Por tanto, estos resultados demuestran que los
ramnolípidos R1 y/o R2 protegen eficazmente la vid contra
Botrytis cinerea.
Se incluyen estos ejemplos para demostrar al
especialista en la técnica que composiciones como éstas de
ramnolípidos R1 y/o R2 son eficaces en plantas agronómicamente
útiles, así como en plantas modelo.
Claims (3)
1. Utilización de ramnolípidos R1 y/o R2 como
agentes estimulantes de las reacciones de defensa naturales de las
plantas.
2. Procedimiento para estimular las reacciones
de defensa naturales de las plantas, caracterizado porque se
aplica a las plantas a tratar una composición acuosa que contiene
una concentración de al menos un 0,01% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o
R2.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque se aplica a las plantas a tratar una
composición acuosa que contiene una concentración de al menos un
0,1% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
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