ES2327450T3 - Utilizacion de un agente estimulante del sistema defensivo de las plantas y procedimiento para la utilizacion del mismo. - Google Patents

Utilizacion de un agente estimulante del sistema defensivo de las plantas y procedimiento para la utilizacion del mismo. Download PDF

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Abstract

Utilización de ramnolípidos R1 y/o R2 como agentes estimulantes de las reacciones de defensa naturales de las plantas.

Description

Utilización de un agente estimulante del sistema defensivo de las plantas y procedimiento para la utilización del mismo.
La presente invención se refiere a la utilización de un agente para estimular las reacciones de defensa natural de las plantas y a un procedimiento para la utilización de dicho agente.
Hace varios años se ha demostrado que las plantas poseen mecanismos de protección de dos tipos: en primer lugar medios de protección pre-existentes, tales como la presencia de capas externas rígidas, como la cutícula, que bloquea la entrada de agentes contaminantes, los cuales, por tanto, sólo pueden penetrar en la planta a través de heridas o poros naturales, o tales como los compuestos antimicrobianos almacenados especialmente en vacuolas; y en segundo lugar, reacciones inducidas destinadas a proteger la planta. Estas reacciones llevan a la producción de unos antibióticos vegetales, las fitoalexinas, proteínas de defensa, proteínas-PR y compuestos destinados a reforzar las paredes celulares vegetales. Además, las células infectadas son capaces de prevenir a sus vecinas del peligro de forma que éstas puedan reaccionar inmediatamente frente a ataques posteriores. Estas reacciones pueden ser provocadas por unas moléculas denominadas "elicitadores", procedentes de la planta o de microorganismos (patógenos o no). Los elicitadores aislados, en contacto con una planta, son capaces de estimular en dicha planta las mismas reacciones de defensa que aquellas que desarrolla la planta cuando es atacada por un agente patógeno.
Por el término "estimular" se entiende tanto "activar" como "promover" o "incrementar". Igualmente ocurre con los sustantivos correspondientes.
Cuando una planta entra en contacto con un elicitador capaz de activar sus defensas naturales antes de haber entrado en contacto con el agente patógeno, esta planta estará mejor protegida, incluso inmunizada, contra la enfermedad provocada por tal agente.
Tal como se habrá podido entender, la utilización de elicitadores presenta numerosas ventajas: en primer lugar, la ventaja de respetar el medioambiente, ya que la utilización de pesticidas se puede reducir incluso evitar; y, en segundo lugar, la utilización de elicitadores permite activar el sistema de defensa de la planta y, por tanto, es eficaz contra gran cantidad de microorganismos patógenos.
Entre las plantas susceptibles de ponerse en contacto con agentes elicitadores se mencionarán especialmente vid, tabaco y Arabidopsis. Esta última es particularmente interesante, ya que es una planta modelo para los biólogos moleculares.
Por tanto, uno de los objetos de la presente invención consiste en utilizar un agente estimulante del sistema defensivo de una planta para que ésta pueda luchar mejor contra los microorganismos patógenos.
Este objetivo, así como otros que se mostrarán posteriormente, se alcanzan por medio de la utilización de ramnolípidos R1 y/o R2 como agentes de estimulación de las reacciones de defensa naturales en plantas.
La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para estimular las reacciones de defensa naturales de las plantas, caracterizado porque a las plantas a tratar se aplica una composición acuosa compuesta por una concentración de al menos un 0,01% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
Preferentemente, a las plantas a tratar se aplica una composición acuosa compuesta por una concentración de al menos un 0,1% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
Los ramnolípidos son glicolípidos que comprenden una cadena de ácido graso acoplada a una (R1) o dos (R2) ramnosas en la parte carboxi terminal de la cadena ácido graso. Un ramnolípido R1 o RLL es un éster de ácido decanoico y de 3-[(6-desoxi-L-manopiranosil)oxi]-1-(carboximetil)octilo; un ramnolípido R2 o RRLL es un éster de ácido decanoico y de 3-{[(6-desoxi-2-O-(6-desoxi-L-manopiranosil)-L-manopiranosil]oxi}-1-(carboximetil)octilo.
Se trata de moléculas muy estables que se utilizan como agentes humidificantes, emulsionantes, adyuvantes, para herbicidas o pesticidas. Se utilizan también para desintoxicar los suelos, en particular en el marco de la descontaminación de hidrocarburos y metales pesados. Además, los ramnolípidos R1 y R2 no son tóxicos para el ser humano. De hecho, se utilizan como aditivos para ciertos productos alimenticios. Se utilizan en particular biosurfactantes, tales como aquellos de la familia de los ramnolípidos, como biofungicidas, para luchar contra los hongos con zoosporas.
Los ramnolípidos se aíslan a partir de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. La obtención de los ramnolípidos y las utilizaciones enumeradas a continuación en particular se describen en los siguientes documentos: Langmuir (2001) 17, 1367-1371; Pest Manag. Sci. (2000) 56, 1029-1035; Appl. Microbiol. Biotechnol. (2000) 54, 625-633; WO 97/25866 A, Biotechn. and Bioengin. (2003), 81(3), 316-322, Colloids and Surfaces (2004), 39, 1-7, Plant Disease (1997), 81(1), 4-12. En particular, los ramnolípidos R1 y R2 se comercializan en forma de solución, por ejemplo la solución JBR215 de la compañía Jeneil Biosurfactant Co., LLC. (400 N. Dekora Woods Blvd. Saukville, WI 53080).
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El límite superior de la concentración de ramnolípidos R1 y/o R2 en las composiciones aplicadas de acuerdo con la invención no se considera crítico; pero, en la práctica, una concentración superior al 0,1% (v/v) no aporta ningún beneficio adicional.
En el marco de la presente invención, se ha estudiado el estímulo de las reacciones de defensa naturales obtenido en el caso de la vid y de la Arabidopsis mediante el tratamiento de estas plantas con una solución de ramnolípidos R1 y/o R2 según los ejemplos siguientes. La composición de ramnolípidos R1 y/o R2 utilizada es aquella comercializada bajo la denominación JBR215 por la compañía americana Jeneil Biosurfactant Co., LLC: este producto es una solución acuosa con una concentración del 15% (v/v) en ramnolípidos R1 y R2.
Ejemplo 1
Se tratan unas vitroplantas de Vitis vinifera (vid, cepa Chardonnay) mediante infiltración de dos composiciones acuosas de ramnolípidos R1 y/o R2, conteniendo una un 0,01% (v/v) y la otra un 0,1% (v/v); la composición control es agua pura.
Este tratamiento se lleva a cabo infiltrando estas composiciones en el mesófilo de las vitroplantas, bien sea por medio de una jeringa o bajo una campana de vacío. Se cosechan las hojas 24 horas después de la aplicación del tratamiento.
La inducción de las respuestas de defensa, en este caso la expresión de genes de defensa tales como los genes
chit4-c, glucanasa, pgip, pr27, pal y lox se mide mediante PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas después de 24 horas. El método de extracción así como el análisis PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 6.
Se observa que una solución de ramnolípidos R1 y/o R2 a una concentración del 0,01% (v/v) en agua aplicada a vitroplantas de vid según el presente ejemplo induce en 5 veces la expresión de los genes de defensa quitinasas (chit-4c), tal como se representa en la Figura 1, en más de 4 veces el gen de glucanasa (Figura 2), en más de 3 veces el gen pgip (Figura 3), en más de 2 veces el gen de pr27 (Figura 4), en más de 3 veces el gen pal (Figura 5) y en más de 2 veces el gen lox (Figura 6).
Igualmente, una solución de ramnolípidos R1 y/o R2 a una concentración del 0,1% (v/v) en agua aplicada a vitroplantas de vid por infiltración induce en más de 6 veces la expresión de los genes de defensa chit-4c, tal como se representa en la Figura 1, en más de 8 veces el gen glucanasa (Figura 2), en más de 4 veces el gen pgip (Figura 3), en más de 3 veces el gen pr27, en más de 4 veces el gen pal (Figura 5), en más de 8 veces el gen lox (Figura 6).
Ejemplo 2
Se tratan unas vitroplantas de Vitis vinifera (vid, cepa Chardonnay) por inmersión durante 30 segundos en una composición acuosa de ramnolípidos R1 y/o R2 al 0,1% (v/v); la composición control es agua pura. Este tratamiento por inmersión equivale a una pulverización y abarca la vitroplanta en su totalidad, tallos y hojas.
La inducción de las respuestas de defensa, en este caso la expresión de genes de defensa tales como los genes
chit4-c, glucanasa, pgip y pr27 se mide por PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas después de 24 horas. El método de extracción así como el análisis PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 7 a 10.
Así, una solución de ramnolípidos R1 y/o R2 con una concentración del 0,1% (v/v) en agua, aplicada a vitroplantas de vid según el presente ejemplo, induce en 2,5 veces la expresión de los genes de defensa quitinasas (chit-4c), tal como se representa en la Figura 7, en 5 veces el gen glucanasa (Figura 8), en aproximadamente en 1,6 veces el gen pgip (Figura 9), y en más de 6 veces el gen pr27 (Figura 10).
Ejemplo 3
Se tratan por infiltración plantas enteras de Arabidopsis thaliana en macetas con composiciones acuosas que contienen un 0,1% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
Este tratamiento se lleva a cabo por infiltración de estas composiciones en el mesófilo de las plantas, bien sea por medio de una jeringa o bajo una campana de vacío. Se cosechan las hojas 3, 6 y 24 horas después de la aplicación del tratamiento.
La inducción de las respuestas de defensa, en este caso la expresión de genes de defensa tales como los genes pr1 y pdf1.2, se mide por PCR cuantitativa en tiempo real en los ADNc que corresponden a los ARNm extraídos de las hojas obtenidas en los distintos momentos mencionados anteriormente. El método de extracción así como el análisis por PCR en tiempo real se describen en Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 y Mol. Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12.
Tal como se observa en estas Figuras, una solución de ramnolípidos R1 y/o R2 con una concentración del 0,1% (v/v) en agua, aplicada por infiltración en hojas de Arabidopsis thaliana, induce en 60 veces la expresión de los genes de defensa pr1 (Figura 1) y en más de 20 veces el gen de defensa pdf1.2 (Figura 12) 3 horas después del tratamiento.
Los resultados de los Ejemplos 1 a 3 demuestran que los ramnolípidos R1 y/o R2 son capaces de estimular los mecanismos de defensa (actividad elicitadora) en plantas tales como la vid (Vitis vinifera) y Arabidopsis thaliana.
Ejemplo 4
Se llevaron a cabo también pruebas de protección en la vid, especialmente contra el hongo Botrytis cinerea.
Se trataron por inmersión vitroplantas de vid tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, con dos composiciones acuosas de ramnolípidos R1 y/o R2, una que contenía un 0,01% (v/v) y la otra con un 0,1% (v/v).
5 días después de este tratamiento, se arrancaron las hojas y se colocaron con la cara inferior hacia arriba en una placa Petri que contenía un disco de papel Wattman humidificado con agua. A continuación, se inocularon con una pastilla de micelio de Botrytis cinerea procedente de un cultivo de 3 días en un medio V8. Se incubaron las placas a 26ºC y se observaron los resultados de la infección 96 horas después de la inoculación con el hongo.
Se constató que la infección se interrumpe durante las primeras horas después de la inoculación. Después de 96 horas, no se observa ningún micelio en las muestras tratadas con las composiciones acuosas de ramnolípidos R1 y/o R2 a un 0,01 y 0,1%, mientras que el micelio había colonizado totalmente las hojas cuando no se realizó ningún tratamiento con los ramnolípidos R1 y/o R2.
Los resultados complementarios obtenidos sobre el crecimiento del micelio en placa en medio V8 demuestran que, además, los ramnolípidos R1 y/o R2 inhiben el crecimiento fúngico a partir del 0,01% y preferentemente a partir del 0,1%, con más de un 70% de inhibición de crecimiento radial.
Por tanto, estos resultados demuestran que los ramnolípidos R1 y/o R2 protegen eficazmente la vid contra Botrytis cinerea.
Se incluyen estos ejemplos para demostrar al especialista en la técnica que composiciones como éstas de ramnolípidos R1 y/o R2 son eficaces en plantas agronómicamente útiles, así como en plantas modelo.

Claims (3)

1. Utilización de ramnolípidos R1 y/o R2 como agentes estimulantes de las reacciones de defensa naturales de las plantas.
2. Procedimiento para estimular las reacciones de defensa naturales de las plantas, caracterizado porque se aplica a las plantas a tratar una composición acuosa que contiene una concentración de al menos un 0,01% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se aplica a las plantas a tratar una composición acuosa que contiene una concentración de al menos un 0,1% (v/v) de ramnolípidos R1 y/o R2.
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