ES2327894T3

ES2327894T3 - Anticuerpos y proteinas antitumorales y utilizacion de los mismos.

Info

Publication number: ES2327894T3
Application number: ES00948759T
Authority: ES
Inventors: Kenneth L. Rock; Dancella Fernandes
Original assignee: University of Massachusetts Amherst
Current assignee: University of Massachusetts Amherst
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-18
Publication date: 2009-11-05
Anticipated expiration: 2020-07-18
Also published as: MXPA02000846A; NO20020329D0; PT1200476E; ZA200200856B; CA2380066C; DE60042273D1; JP4842476B2; IL187595A; AU6221200A; HU229416B1; EP1200476A4; NO329234B1; WO2001007481A1; PL204822B1; WO2001007481A9; CA2380066A1; PL353872A1; EP1200476B1; HUP0202270A3; IL147810A0

Abstract

Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo, seleccionado de entre: un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma seleccionada de entre ATCC Nº PTA-377, PTA-404 y PTA-405, caracterizado porque dicho anticuerpo es DMF10.6

Description

Anticuerpos y proteínas antitumorales y utilización de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y a las proteínas a las que se unen específicamente, y a la utilización de tales anticuerpos que se unen específicamente a las células tumorales.

Antecedentes de la invención

La línea celular E710.2.3 es una línea celular clonada de linfoma T CD4 CD8 tímico originalmente aislada de un tumor tímico de un ratón AKR/J. Cuando se cultiva por si mismo a baja densidad, E710.2.3 no prolifera espontáneamente, a no ser que se estimule con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). E710.2.3. se puede estimular para proliferar por contacto con los timocitos o esplenocitos. Sin embargo, E710.2.3 puede proliferar espontáneamente cuando se cultiva a alta densidad en ausencia de PMA o de otras células. Cuando se inyecta E710.2.3 en ratones singénicos, crece como tumor maligno en los órganos linfoides y el timo.

La US 5.104.652 describe composiciones así como un método para el tratamiento del cáncer por medio de anticuerpos monoclonales contra el gangliósido G_{D3} junto con IL-2.

Sumario de la invención

La invención está basada en el descubrimiento de anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a una proteína de 40 kDa expresada en la superficie de muchos tipos de células tumorales, pero que no se unen a las células hematopoyéticas adultas normales. Los nuevos anticuerpos monoclonales pueden bloquear la proliferación e inducir la apoptosis de las células tumorales a las que se unen específicamente.

En base a estos descubrimientos, la invención describe anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, donde los anticuerpos monoclonales (a) se unen a timocitos fetales, (b) inhiben la proliferación celular de una célula en referencia a su unión a la célula, y (c) no se unen a los timocitos adultos. Los anticuerpos monoclonales pueden inducir también la agregación homotípica en su unión a una célula, inducir la apoptosis en la célula a la que se unen, y pueden unirse específicamente a una o más líneas celulares tumorales del grupo E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat y Cos. Los anticuerpos se pueden etiquetar, por ejemplo, con una etiqueta detectable.

También dentro de la invención se encuentra el anticuerpo monoclonal DMF 10.62.3 producido por la línea celular de hibridomas ATCC Nº PTA-377, el anticuerpo monoclonal DMF10.167.4 producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 y el anticuerpo monoclonal DMF10.34.36 producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404.

La descripción de la presente invención se refiere también a anticuerpos monoclonales que se unen a la misma proteína que la proteína unida por el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 o la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404. El anticuerpo monoclonal puede ser humanizado.

En otro aspecto, la descripción de la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales o a fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen específicamente a una proteína de 40 kDa unida por el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 o la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404.

En todavía otro aspecto, la descripción de la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales quiméricos o a fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen a la misma proteína que la proteína unida por el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 o la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404, donde los anticuerpos quiméricos incluyen regiones variables no humanas y regiones constantes humanas de cadena ligera y pesada.

En todavía otro aspecto, la descripción de la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales o a fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 o la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404.

La descripción de la presente invención se refiere también a anticuerpos monoclonales o a fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen específicamente a una proteína caracterizada por (i) un peso molecular de 40 kDa, (ii) expresión en la superficie de timocitos fetales, (iii) no expresión en la superficie de timocitos adultos, (iv) capacidad de bloquear la proliferación celular a su unión por el anticuerpo, y (v) capacidad de inducir la agregación homotípica a su unión por el anticuerpo. El anticuerpo monoclonal se une específicamente a una proteína que se caracteriza además por (vi) la capacidad de inducir apoptosis en una célula a su unión por el anticuerpo, y (vii) la expresión en la superficie de un grupo de líneas celulares tumorales consistentes en E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat y Cos.

La invención caracteriza además fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos monoclonales aquí descritos. Los fragmentos de unión a antígenos se pueden etiquetar, por ejemplo, con una etiqueta detectable.

La invención caracteriza también las líneas celulares de hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales aquí descritos. Por ejemplo, la invención caracteriza la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 o la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404.

La descripción describe además una proteína sustancialmente pura caracterizada por (i) un peso molecular de 40 kDa, (ii) expresión en la superficie de timocitos fetales, (iii) no expresión en la superficie celular de timocitos adultos, (iv) capacidad de bloquear la proliferación celular a su unión por el anticuerpo aquí descrito y (v) capacidad de inducir la agregación homotípica a su unión por el anticuerpo aquí descrito. La proteína se puede caracterizar además por (vi) la expresión en un grupo de líneas celulares tumorales consistentes en E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat y Cos, y (vii) la capacidad de inducir apoptosis en una célula a su unión por el anticuerpo aquí descrito.

En otro aspecto, la descripción se refiere a proteínas sustancialmente puras que se unen al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-405 o la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-404.

La invención se refiere también a una composición (farmacéutica) que comprende el anticuerpo monoclonal aquí descrito, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención describe además la utilización de anticuerpos monoclonales en un método para detectar una célula tumoral en un sujeto. El método incluye la puesta en contacto de una muestra celular procedente del sujeto con uno o más de los anticuerpos monoclonales aquí descritos y la detección de la unión del anticuerpo a la muestra, donde la unión indica la presencia de una célula tumoral en el sujeto. Ejemplos de células tumorales incluyen linfoma tímico, tumor de células T, linfoma de células B, melanoma, osteosarcoma y leucemia aguda de células T. La célula tumoral puede encontrarse también en un paciente. Los anticuerpos monoclonales utilizados para detectar tumores se pueden etiquetar.

La invención describe asimismo la utilización de los anticuerpos monoclonales aquí descritos en un método para inhibir la proliferación de células tumorales. El método incluye la puesta en contacto de la célula tumoral con una cantidad suficiente de los anticuerpos monoclonales aquí descritos para inhibir la proliferación de la célula tumoral.

En otra realización, la invención describe la utilización de los anticuerpos monoclonales aquí descritos en un método de inducción de la apoptosis en una célula. El método incluye la puesta en contacto de la célula con una cantidad suficiente de uno o más de los anticuerpos monoclonales aquí descritos para inducir la apoptosis en la célula. La célula puede ser una célula tumoral seleccionada de entre el grupo consistente en linfoma tímico, tumor de células T, lin-
foma de células B, melanoma, osteosarcoma y leucemia aguda de células T. La célula puesta estar in vitro o in vivo.

La invención se extiende también a un kit para el diagnóstico tumoral que incluye uno o más de los anticuerpos monoclonales aquí descritos, así como las instrucciones para su uso. El kit puede contener una célula tumoral seleccionada de entre el grupo consistente en linfoma tímico, tumor de células T, linfoma de células B, melanoma, osteosarcoma y leucemia aguda de células T. La invención incluye también un agente de marcado celular tumoral que incluye uno o más de los anticuerpos monoclonales aquí descritos, que pueden estar conjugados con una fracción para suministrar dicha fracción a una célula tumoral. Ejemplos de fracciones incluyen agentes antitumorales, citotoxinas, citoquinas o grupos reporter.

Otra realización de la invención consiste en la utilización de un agente de marcado de células tumorales tal como se describe aquí en un método para suministrar selectivamente una fracción a una célula tumoral en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero del agente diana aquí descrito enlazado a la fracción y dejando tiempo suficiente para que el agente diana alcance la célula tumoral, donde el anticuerpo del agente diana se une a la célula tumoral, suministrando así selectivamente la fracción a la célula tumoral en el mamífero. Ejemplos de fracciones incluyen agentes antitumorales, citotoxinas, citoquinas y grupos reporter.

La invención se extiende además a un método para aislar la proteína de 40 kDa aquí descrita. El método incluye la puesta en contacto de una muestra que contiene la proteína con los anticuerpos monoclonales aquí descritos durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anticuerpo monoclonal/proteína, mediante la eliminación de uno o más de los complejos, si los hubiera, de la muestra y eliminación de la proteína del complejo, aislando así la proteína.

Una "secuencia aislada de ácido nucleico" es una secuencia de ácido nucleico que está sustancialmente exenta de los genes que flanquean la secuencia de ácido nucleico en el genoma del organismo en el que existe de forma natural. Por tanto, el término incluye secuencias de ácidos nucleicos recombinantes incorporadas en un vector, en un virus o en un plásmido de replicación autónoma, o secuencias de ácidos nucleicos genómicas de un procariota o eucariota. Incluye asimismo una molécula individual, tal como un cADN, un fragmento genómico, un fragmento producido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un fragmento de restricción.

Un anticuerpo que "se une específicamente" a una proteína es un anticuerpo que se une a una proteína, pero que no la reconoce y se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo una muestra biológica, incluyendo naturalmente la proteína, por ejemplo la proteína de 40 kDa.

Las sustituciones de aminoácidos "conservativas" son sustituciones en las que un residuo aminoácido se sustituye por otro residuo aminoácido de cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos aminoácidos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos de cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Se puede utilizar cualquiera de una familia de aminoácidos para sustituir cualquier otro elemento de la familia en una sustitución conservativa. Los términos "polipéptido, péptido y proteína" se utilizan de forma intercambiable aquí para referirse a una cadena de residuos aminoácidos.

Un "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo es una porción del anticuerpo que es capaz de unirse a un epítopo de un antígeno, por ejemplo la proteína de 40 kDa unida por la totalidad del anticuerpo.

Un "epítopo" es una región particular de un antígeno, por ejemplo una proteína, donde se une un anticuerpo y que es capaz de provocar una respuesta inmune.

Una proteína "sustancialmente pura" de 40 kDa es una proteína de 40 kDa que está al menos en un 60%, en peso, exenta de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que se asocia naturalmente. Preferentemente, la preparación es al menos en un 75%, con más preferencia al menos en un 90%, y especialmente al menos en un 99%, en peso, la proteína de 40 kDa. Se puede obtener una proteína de 40 kDa sustancialmente pura, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos o los anticuerpos monoclonales descritos aquí, y/o mediante técnicas de purificación físicas.

Un anticuerpo "aislado" es un anticuerpo que está sustancialmente libre de otras moléculas orgánicas naturales con las que se asocia naturalmente.

Un anticuerpo u otra molécula que bloquea la proliferación celular es un anticuerpo o molécula que inhibe el ciclo celular, la división celular o ambos.

Por "agregación homotípica" se indica un proceso biológicamente activo por medio del cual las células de mismo tipo son estimuladas para adherirse unas a otras.

Un "grupo reporter" es una molécula o compuesto que tiene una característica física o química tal como luminiscencia, fluorescencia, actividad enzimática, densidad electrónica o radioactividad, que puede ser medida o detectada fácilmente por sistemas o procedimientos detectores apropiados.

Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos empleados aquí tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una experto medio en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puedan utilizar en la práctica o pruebas de la presente invención métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, se describen a continuación los métodos y materiales apropiados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. La invención describe anticuerpos que reconocen una proteína de 40 kDa que se expresa en células tumorales. Se pueden utilizar los anticuerpos para inhibir la proliferación de células tumorales e inducir la apoptosis de células tumorales a las que se unen específicamente. Los anticuerpos monoclonales se pueden utilizar para el diagnóstico (por ejemplo para determinar la presencia de células malignas) o se pueden usar terapéuticamente para tratar células tumorales por sí mismos o por medio del suministro de un agente antitumoral unido.

Se evidenciarán otras características y ventajas de la invención a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

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Breve descripción de las figuras

Fig. 1A-D: cuatro gráficos citométricos de flujo que muestran la expresión de la proteína de 40 kDa en E710.2.3 (Fig. 1A), A20 (Fig. 1B), Jurkat (Fig. 1C) y RF33.70 (Fig. 1D) según es detectada por DMF10.62.3.

Fig. 2A-D: cuatro gráficos citométricos de flujo que muestran la expresión de la proteína de 40 kDa el día 14 en timo fetal (Fig. 2A), bazo total de adulto (Fig. 2B), timo total de adulto (Fig. 2C) y médula ósea total de adulto (Fig. 2D) según es detectada por DMF10.62.3.

Fig. 3A-G: siete gráficos citométricos de flujo que muestran la expresión de la proteína de 40 kDa en células T y B no estimuladas recién cosechadas (Fig. 3A), células T activadas a las 24 horas (Fig. 3B), células T activadas a las 48 horas (Fig. 3C), células T activadas a las 72 horas (Fig. 3D), células B esplénicas activadas a las 24 horas (Fig. 3E), células B esplénicas activadas a las 48 horas (Fig. 3F) y células B esplénicas activadas a las 72 horas (Fig. 3G) según es detectada por DMF10.62.3.

Fig. 4A-C: tres gráficos lineales que muestran la inhibición de la proliferación espontánea de células E710.2.3. (Fig. 4A), células RMA-S (Fig. 4B) o células RF33.70 (Fig. 4C), por el anticuerpo monoclonal DMF10.62.3

Fig. 5A-I: nueve gráficos citométricos de flujo que muestran la inducción de la apoptosis en células E710.2.3 tratadas con 1 \mug/ml de DMF10.62.3 durante 1 hora (Fig. 5A), 1 \mug/ml de DMF10.62.3 durante 2 horas (Fig. 5B), 1 \mug/ml de DMF10.62.3 durante 3 horas (Fig. 5C), IgG de hámster durante 3 horas (Fig. 5D), 15 \mug/ml de DMF10.62.3 durante 1 hora (Fig. 5E), 15 \mug/ml de DMF10.62.3 durante 2 horas (Fig. 5F), 15 \mug/ml de DMF10.62.3 durante 3 horas (Fig. 5G), IgG de hámster durante 3 horas (Fig. 5H) y sin anticuerpos (Fig. 5I).

Descripción detallada

La presente invención describe anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a una proteína de 40 kDa. La proteína de 40 kDa es una nueva proteína de la superficie celular expresada en diversos tipos de células tumorales, incluyendo linfoma tímico, tumor de células T, linfoma de células B, melanoma, osteosarcoma y leucemia aguda de células T, así como en distintas especies, incluyendo humanos, monos y ratones. Los anticuerpos no muestran reactividad alguna con las células hemopoyéticas de adulto normal. A la unión de un anticuerpo de la invención a una célula que expresa la proteína de 40 kDa, la célula interrumpe la proliferación y experimenta la apoptosis. La proteína de 40 kDa es una nueva proteína inductora de muerte basada en la observación de que cuando los anticuerpos monoclonales se unen a esta proteína en una célula, la célula experimenta una apoptosis.

En la ATCC se han depositado tres líneas celulares de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a la proteína de 40 kDa bajo el Nº de Referencia PTA-377 (DMF10.62.3), Nº de Referencia PTA-405 (DMF10.167.4) o Nº de Referencia PTA-404 (DMF10.34.36).

Los anticuerpos aquí descritos tienen diversas aplicaciones. Los anticuerpos se pueden utilizar en ensayos diagnósticos in vitro para determinar la presencia de células malignas en mamíferos, por ejemplo en tejidos humanos. Los anticuerpos se pueden utilizar también para localizar tumores in vivo mediante la administración a un sujeto de un anticuerpo aislado aquí descrito que se etiqueta con un grupo reporter. Los anticuerpos tienen también aplicaciones terapéuticas. Además, los anticuerpos se pueden emplear para tratar tumores o para suministrar un agente antitumoral.

Métodos para Elaborar Anticuerpos

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina. Ejemplos de fragmentos de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos de un anticuerpo, por ejemplo porciones F(ab) y F(ab')_{2}, que se pueden unir específicamente a la proteína de 40 kDa. Los fragmentos se pueden generar mediante el tratamiento del anticuerpo con una enzima tal como pepsina. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales" se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contiene sólo una especie de un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular de un polipéptido o proteína. Por tanto, una composición de anticuerpos monoclonales muestra típicamente una única afinidad de unión por la proteína a la que se une específicamente.

Inmunización

Los anticuerpos policlonales y monoclonales contra la proteína de 40 kDa pueden obtenerse mediante la inmunización de un sujeto adecuado (por ejemplo un conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con una preparación inmunogénica que contiene un inmunógeno apropiado. Los inmunógenos incluyen células tales como células procedentes de líneas celulares inmortalizadas E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI.231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat o Cos, que todas han demostrado expresar la nueva proteína de 40 kDa. Alternativamente, el inmunógeno puede ser la proteína misma de 40 kDa purificada o aislada. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridomas depositado como ATCC Nº PTA-377, PTA-405 ó PTA-404 se puede utilizar para aislar la proteína de una célula que produce la proteína, por ejemplo E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI.231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat o Cos, mediante cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación u otras técnicas bien conocidas en este campo.

Los anticuerpos producidos en el sujeto se pueden cribar entonces para determinar si se unen a timocitos fetales y a la vez no se unen a timocitos adultos. Estos anticuerpos se pueden cribar además en los ensayos descritos aquí. Por ejemplo, estos anticuerpos se pueden someter a ensayo para determinar si inhiben la proliferación celular de las células a las que se unen; si inducen la agregación homotípica de células; y/o inducen la apoptosis en las células a las que se unen. Se describen aquí métodos apropiados para identificar un anticuerpo con las características deseadas. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para inducir la muerte celular a su unión a una célula se puede someter a ensayo por medio de kits comerciales de R&D (Minneapolis, MN) o Pharmingen (San Diego, CA).

La unidad de dosificación de inmunógeno (por ejemplo la proteína purificada, la célula tumoral que expresa la proteína o la proteína de 40 kDa expresada de forma recombinante) y el régimen de inmunización dependerán del sujeto a ser inmunizado, de su condición inmune y de su peso corporal. Para mejorar una respuesta inmune en un sujeto, se puede administrar un inmunógeno con un adyuvante, tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund. La inmunización de un sujeto con un inmunógeno tal como se describe anteriormente induce una respuesta al anticuerpo policlonal. La valoración del anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede controlar en el tiempo por medio de técnicas estándar, tal como ELISA, utilizando un antígeno inmovilizado, por ejemplo la proteína de 40 kDa aquí descrita.

Otros métodos para producir anticuerpos contra la proteína de 40 kDa incluyen la utilización de ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana (véase por ejemplo Wood y col., la publicación PCT WO 91/00906, Kucherlapati y col., la publicación PCT WO 91/10741; o Lonberg y col., publicación PCT WO 92/03918). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales humanos se pueden producir mediante la introducción de un antígeno en ratones inmunodeficientes que han sido injertados con células o tejidos productores de anticuerpos humanos (por ejemplo células de médula ósea humana, linfocitos de sangre periférica (PBL), tejido fetal humano de nódulos linfáticos o células madre hematopoyéticas). Estos métodos incluyen la producción de anticuerpos en ratones SCID-hu (véase Duchosal y col., publicación PCT WO 93/05796; patente de Estados Unidos Nº 5.411.749; o McCune y col., (1988) Science 241:1632-1639)) o ratones deficientes en Rag-1/Rag-2. Se puede disponer también comercialmente de ratones inmunodeficientes en anticuerpos humanos. Por ejemplo, se dispone de ratones deficientes en Rag-2 de Taconic Farms (Germantown. NY).

Hibridomas

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener por inmunización de un sujeto con un inmunógeno. En el momento adecuado después de la inmunización, por ejemplo cuando las valoraciones de anticuerpos se encuentran a un nivel suficientemente alto, se pueden cosechar células productoras de anticuerpos de un animal inmunizado y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales siguiendo técnicas estándar. Por ejemplo, las células productoras de anticuerpos pueden ser fusionadas por procedimientos estándar de fusión de células somáticas con células inmortalizantes, tales como células de mieloma, para producir células hibridomas. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la técnica del hibridoma tal como la desarrollaron originalmente Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbar y col., (1983) Immunology Today, 4: 72) y la técnica del hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Es bien conocida la tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales.

Se pueden obtener también anticuerpos monoclonales mediante la cosecha de células productoras de anticuerpos, por ejemplo esplenocitos procedentes de ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana y que han sido inmunizados con la proteína de 40 kDa. Los esplenocitos se pueden inmortalizar mediante la fusión con mielomas humanos o a través de la transformación con el virus de Epstein-Barr (EBV). Estos hibridomas se pueden obtner por medio de técnicas del hibridoma-EBV o de células B humanas descritas en la técnica (véase, por ejemplo, Boyle y col., publicación de patente europea Nº 0.614.984).

Las células hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de 40 kDa se detectan mediante el cribado de los sobrenadantes del cultivo del hibridoma, por ejemplo mediante cribado para seleccionar los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína inmovilizada de 40 kDa, o mediante la prueba de anticuerpos tal como se describe aquí para determinar si los anticuerpos poseen las características deseadas, por ejemplo capacidad para inhibir la proliferación celular. Las células hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que dan positivo en los ensayos de cribado aquí descritos se pueden cultivar en un medio nutriente, en condiciones y durante un tiempo suficiente para que las células hibridomas puedan segregar los anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo, para producir así anticuerpos totales. Las técnicas de cultivo de tejidos y los medios de cultivo adecuados para las células hibridomas están generalmente descritas en la técnica (véase por ejemplo R.H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)). Se puede cosechar entonces el sobrenadante de cultivo de hibridoma acondicionado que contiene el anticuerpo.

Librerías Combinatorias de Anticuerpos Recombinantes

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante la construcción de una librería combinatoria de inmunoglobulina recombinante y mediante el cribado de la librería con la proteína de 40 kDa. Se dispone comercialmente de kits para generar y cribar las bibliotecas de visualización de fagos (por ejemplo Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo Nº 27-9400-01; y Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catálogo Nº 240612). Brevemente, la librería de anticuerpos se criba para identificar y aislar los fagos que expresan un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de 40 kDa. En un ejemplo específico, la criba primaria de la librería implica el cribado con una proteína inmovilizada de 40 kDa.

Después del cribado, el fago de visualización se aísla y el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado se puede recuperar del fago de visualización (por ejemplo a partir del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresión por medio de técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Además, el ácido nucleico puede ser manipulado (por ejemplo enlazado al ácido nucleico que codifica dominios adicionales de inmunoglobulina, tal como regiones adicionales constantes) y/o ser expresado en una célula huésped.

Anticuerpos Quiméricos y Humanizados

Se pueden preparar también formas recombinantes de los anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados, para minimizar la respuesta por un paciente humano al anticuerpo. Cuando los anticuerpos producidos en sujetos no humanos o procedentes de la expresión de genes de anticuerpos no humanos se utilizan terapéuticamente en humanos, en varios niveles se reconocen como extraños y se puede generar una respuesta inmune en el paciente. Una aproximación para minimizar o eliminar esta reacción inmune consiste en producir derivados de anticuerpos quiméricos, es decir moléculas de anticuerpos que combinan una región variable animal no humana y una región constante humana. Estos anticuerpos conservan la especificidad de unión al epítopo del anticuerpo monoclonal original, pero puede ser menos inmunogénica cuando se administra a humanos y, por tanto, es más probable que el paciente la tolere.

Los anticuerpos monoclonales quiméricos se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante de una molécula de anticuerpo no humano se sustituye por un gen que codifica una región constante humana (véase Robinson y col., publicación de patente PCT PCT/US86/02269; Akira y col., solicitud de patente europea 184.187; o Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171.496). Un anticuerpo quimérico se puede "humanizar" además mediante la sustitución de porciones de la región variable no implicada en la unión al antígeno por porciones equivalentes procedentes de regiones variables humanas. En Morrison, S.L. (1985) Science, 229:1202-1207 y Oi y col., (1986) Bio Techniques, 4:214, se proporciona una revisión general de los anticuerpos quiméricos "humanizados". Estos métodos incluyen el aislamiento, la manipulación y la expresión de las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican toda o parte de una región variable de inmunoglobulina procedente de al menos una cadena pesada o ligera. El cADN que codifica el anticuerpo quimérico humanizado, o un fragmento del mismo, se puede clonar entonces en un vector de expresión apropiado. Los anticuerpos "humanizados" adecuados se pueden producir alternativamente por medio de la sustitución de la región determinante de complementariedad (CDR) (véase la patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; Jones y col., (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan y col., (1988) Science 239:1534; y Beidler y col., (1988) J. Immunol. 141:4053-4060)).

Se puede utilizar también la impresión del epítopo para producir un dímero polipéptido anticuerpo "humano" que conserva la especificidad de unión de los anticuerpos de hámster específicos de la proteína de 40 kDa producida por el hibridoma depositado como ATCC Nº PTA-377, ATCC Nº PTA-405 ó ATCC Nº PTA-404. Brevemente, un gen que codifica una región variable no humana (VH) de unión específica a un antígeno y una región constante humana (CH1) se expresa en E. coli y se infecta con una librería de fagos de genes V\lambdaC\lambda humanos. Los fragmentos de anticuerpos de visualización de fagos se criban entonces en busca de la unión a la proteína de 40 kDa. Los genes V\lambda humanos seleccionados se vuelven a clonar para la expresión de las cadenas de V\lambdaC\lambda y las E. coli que albergan estas cadenas se infectan con una librería de fagos de genes VHCH1 humanos y ésta se somete a series de cribado con tubos recubiertos de antígenos. Véase la publicación PCT de Hoogenboom y col., WO 93/06213.

Fragmentos de Anticuerpos

La presente invención se extiende a nuevos anticuerpos antitumorales, y a cualquier fragmento de los mismos, que contienen la región de unión activa del anticuerpo tal como se describe aquí, tales como fragmentos Fab, F(ab')2 y Fv. Estos fragmentos se pueden producir a partir del anticuerpo por medio de técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo, Rousseaux y col., en Methods Enzymol., 121:663-69 Academic Press, (1986)). Por ejemplo, los fragmentos F(ab')_{2} se pueden producir por digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo y los fragmentos Fab se pueden generar mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}.

Utilidad de los Anticuerpos

Los anticuerpos aquí descritos tienen varios usos. Los anticuerpos se pueden utilizar in vitro con propósitos de diagnóstico para determinar la presencia de células malignas en tejidos humanos. El método implica el examen de una muestra de tejido en busca de la presencia de la proteína de 40 kDa. Por ejemplo, la muestra de tejido se puede poner en contacto con el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC Nº PTA-377, ATCC Nº PTA-405 o ATCC Nº PTA-404, determinándose la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente a las células en la muestra de tejido. La unión indica la presencia de una célula tumoral. Alternativamente, se puede utilizar también el anticuerpo para cribar muestras de sangre en busca del antígeno liberado.

Los anticuerpos se pueden utilizar también para localizar un tumor in vivo mediante la administración a un sujeto de un anticuerpo aislado de la presente invención que está etiquetado con un grupo reporter que produce una señal detectable. Los anticuerpos unidos se detectan entonces por escintigrafía externa, tomografía de emisión o exploración radionuclear. El método se puede utilizar para caracterizar un cáncer en un paciente en cuanto al alcance de la enfermedad y para controlar los cambios en respuesta a la terapia.

Los anticuerpos tienen también aplicaciones terapéuticas. Los nuevos anticuerpos se pueden utilizar para tratar tumores, debido a que la unión específica del anticuerpo a la célula tumoral hace que la célula deje de proliferar y muera.

Los anticuerpos se pueden utilizar también terapéuticamente, por ejemplo como agentes diana, para suministrar agentes antitumorales a los tumores. Estos agentes antitumorales incluyen medicamentos quimioterapéuticos, toxinas, moduladores de la respuesta inmunológica, enzimas y radioisótopos.

Etiquetas Detectables

Los anticuerpos que reaccionan con la proteína de 40 kDa se pueden utilizar de forma diagnóstica, por ejemplo para detectar la presencia de un tumor en un sujeto. La detección puede ser facilitada por el acoplamiento del anticuerpo a una etiqueta detectable. Ejemplos de etiquetas detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes, materiales bioluminescentes, etiquetas electrónicas densas, etiquetas para MRI y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos adecuados del grupo prostético incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es luminol; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S ó ^{3}H.

Anticuerpos como Agentes Diana

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aquí descritos se pueden conjugar con una fracción y se puede utilizar el anticuerpo para dirigir la fracción al sitio de una célula tumoral que expresa la proteína de 40 kDa. Los ejemplos de fracciones incluyen toxinas, radionúclidos o agentes quimioterapéuticos que se pueden utilizar para matar las células tumorales, o agentes de obtención de imágenes que se pueden emplear para localizar y dimensionar tumores que expresan la proteína de 40 kDa. Los anticuerpos utilizados para dirigir la fracción al tumor en los humanos son preferentemente anticuerpos monoclonales, por ejemplo anticuerpos monoclonales humanizados.

El anticuerpo se puede fusionar con la fracción, por ejemplo la toxina, bien sea en virtud de la fracción y del anticuerpo que está codificado por un gen fusionado que codifica una molécula de proteína híbrida, o bien por medio de conjugación, por ejemplo un enlace covalente no peptídico, por ejemplo un enlace no-amida, que se utiliza para unir el anticuerpo producido separadamente con la fracción. El anticuerpo aquí descrito se puede fusionar también a otro anticuerpo específico de las células inmunes y que estimula las células inmunes para matar el tumor.

Las moléculas de toxina útiles conjugadas con un anticuerpo tal como se describe aquí incluyen toxinas peptídicas, que son significativamente citotóxicas cuando están presentes intracelularmente. Ejemplos de toxinas incluyen citotoxinas, disruptores metabólicos (inhibidores y activadores) que interrumpen la actividad enzimática y matan así las células tumorales y moléculas radioactivas que matan todas las células dentro de un radio definido de la porción efectora. Un disruptor metabólico es una molécula, por ejemplo una enzima o citoquina, que cambia el metabolismo de una célula de modo tal que se altera su función normal. En términos generales, el término toxina incluye todo efector que provoque la muerte de una célula tumoral.

Numerosas toxinas peptídicas tienen un dominio generalizado de unión al receptor eucariota; en estos casos, la toxina debe ser modificada para impedir que se maten las células que no llevan la proteína diana (por ejemplo, para impedir la muerte de células que no llevan la proteína de 40 kDa pero que tienen un receptor para la toxina no modificada). Estas modificaciones se deben llevar a cabo de manera que se conserve la función citotóxica de la molécula. Las toxinas potencialmente útiles incluyen, pero no se limitan a, toxina de la difteria, toxina del cólera, ricina, toxina análoga a O-Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-II_{v}), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina Pertussis, toxina del tétanos, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saponina, modecina y gelanina. Otras toxinas incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha) y la linfotoxina (LT). Otra toxina que tiene actividad antitumoral es la caliqueamicina gamma 1, un diino-eno que contiene un antibiótico antitumoral con una potencia considerable contra los tumores (Zein, N., y col., Science, 240:1198-201 (1988)).

Como ejemplo, la toxina de la difteria se puede conjugar con los anticuerpos aquí descritos. La toxina de la difteria, de secuencia conocida, se describe en detalle en Murphy, patente de Estados Unidos Nº 4.675.382. La molécula de la toxina natural de la difteria segregada por Corynebacterium diphtheriae se compone de varios dominios funcionales que se pueden caracterizar, empezando por el extremo amino terminal de la molécula, por el Fragmento A enzimáticamente activo (aminoácidos Gly_{1}-Arg_{193}) y el Fragmento B (aminoácidos Ser_{194}-Ser_{535}), que incluye un dominio de translocación y un dominio generalizado de unión celular (residuos aminoácidos 475 a 535).

Enlace de las Toxinas a los Anticuerpos

El anticuerpo y la fracción de toxina se pueden unir de diversas maneras. Cuando el compuesto se produce mediante la expresión de un gen fusionado, un enlace peptídico sirve de enlace entre la citotoxina y el anticuerpo. Alternativamente, la toxina y el anticuerpo se pueden producir por separado y acoplarse más tarde por medio de un enlace covalente no peptídico. Por ejemplo, el enlace covalente puede adoptar la forma de un enlace disulfuro. En este caso, el ADN que codifica este anticuerpo se puede obtener mediante métodos convencionales para que contenga un codón extra de cisteína.

Para un enlace de unión disulfuro, la molécula de toxina se derivatiza también con un grupo sulfhidrilo reactivo con la cisteína del anticuerpo modificado. En el caso de una toxina peptídica, este enlace se puede llevar a cabo mediante la inserción de un codón de cisteína en la secuencia de ADN que codifica la toxina. Alternativamente, un grupo sulfhidrilo, bien por sí mismo o como parte de un residuo de cisteína, se puede introducir por medio de técnicas de polipéptidos en fase sólida. Por ejemplo, la introducción de grupos sulfhidrilo en péptidos se describe en Hiskey, Peptides, 3:137 (1981).

La derivatización se puede llevar a cabo también de acuerdo con el método descrito de derivatización de una hormona peptídica en Bacha y Col., patente de Estados Unidos Nº 4.468.382. La introducción de grupos sulfhidrilo en proteínas se describe en Maasen y col., Eur. J. Biochem., 134:32 (1983). Una vez presentes los grupos sulfhidrilo necesarios, se purifican la citotoxina y el anticuerpo, se reducen ambos grupos azufre, se mezclan la citotoxina y el anticuerpo (en una proporción de aproximadamente 1:5 a 1:20), y se deja que continúe la formación de la unión disulfuro hasta su finalización (generalmente de 20 a 30 minutos) a temperatura ambiente. Después, se dializa la mezcla contra una solución salina tamponada con fosfato para eliminar las moléculas de toxina y el anticuerpo no reaccionados. Se utiliza una cromatografía en Sephadex® o similar para separar los compuestos del conjugado deseado toxina-anticuerpo de los conjugados toxina-toxina y anticuerpo-anticuerpo en base al tamaño.

Moduladores de la Respuesta Inmune

La fracción antitumoral puede ser también un modulador del sistema inmune que activa o inhibe el sistema inmune del cuerpo a nivel local. Por ejemplo, las citoquinas, por ejemplo linfoquinas tal como IL-2, suministradas a un tumor pueden provocar la proliferación de linfocitos-T citotóxicos o células asesinas naturales en la proximidad del tumor.

Moléculas Radioactivas

La fracción o grupo reporter puede ser también una molécula radioactiva, por ejemplo un radionucléotido, o un denominado sensibilizador, por ejemplo una molécula precursora que se vuelve radioactiva en condiciones específicas, por ejemplo boro, cuando se expone a un haz de neutrones de baja energía, en la denominada "terapia por captura neutrónica en boro" (BNCT) (Barth y col., Scientific American, Octubre 1990:100-107 (1990)). Los compuestos con estas fracciones efectoras radioactivas se pueden utilizar tanto para inhibir la proliferación de células tumorales como para etiquetar las células tumorales con el propósito de obtener imágenes.

Los radionúclidos son moléculas radioactivas de un solo átomo que pueden emitir partículas \alpha, \beta o \gamma. Son preferentes los emisores de partículas alfa frente a los emisores de partículas \beta o \gamma, ya que liberan emisiones de energía mucho más altas a una menor distancia, y son por tanto eficaces sin penetrar y dañar significativamente los tejidos normales. Los radionúclidos adecuados emisores de partículas incluyen ^{211}At, ^{212}Pb y ^{212}Bi.

La molécula radioactiva debe estar estrechamente enlazada al anticuerpo bien sea directamente o por un quelato bifuncional. Este quelato no debe permitir la elución y, por tanto, la liberación prematura de la molécula radioactiva in vivo (Waldmann, Science, 252: 1657-62 (1991)). Para adaptar el BNCT a la presente invención, se selecciona un isótopo estable de boro, por ejemplo boro 10, como fracción antitumoral o porción efectora del compuesto. Se suministra el boro y se concentra en o sobre las células tumorales por medio de la unión específica del anticuerpo a la célula tumoral. Después de un tiempo que permita la acumulación de una cantidad suficiente de boro se obtienen imágenes del tumor y se irradia con un haz de neutrones de baja energía, con una energía de aproximadamente 0,025 eV. Aunque esta irradiación de neutrones, en sí, cause poco daño al tejido sano que rodea el tumor o al tumor mismo, el boro 10 (por ejemplo en la superficie de una célula tumoral) captura los neutrones, formando así un isótopo inestable, boro 11. El boro 11 se fisiona instantáneamente produciendo núcleos de litio 7 y partículas energéticas \alpha, aproximadamente 2,79 millones de eV. Estas partículas pesadas representan una forma de radiación altamente letal pero muy localizada, ya que las partículas tienen un recorrido de sólo un diámetro celular aproximadamente (10 micras).

Los cálculos han demostrado que para destruir una célula tumoral se necesitan aproximadamente un billón de átomos de boro junto con un flujo de neutrones térmicos de 10^{12} a 10^{13} neutrones por centímetro cuadrado, de modo tal que la radiación generada por las partículas \alpha sobrepasa la radiación de fondo generada por las reacciones de captura de neutrones con nitrógeno e hidrógeno.

Fracciones para la Obtención de Imágenes

Los anticuerpos aquí descritos se unen específicamente a la proteína de 40 kDa y, por tanto, sirven también para detectar tumores en humanos. Una aproximación como ésta implica la detección de tumores in vivo por medio de técnicas de obtención de imágenes de los tumores utilizando el anticuerpo etiquetado con una fracción apropiada o con un grupo reporter, por ejemplo un reactivo de obtención de imágenes que produce una señal detectable. Los reactivos de obtención de imágenes y los procedimientos para etiquetar anticuerpos con estos reactivos son bien conocidos (véase, por ejemplo, Wensel y Meares, Radio Immunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York (1983); Colcher y col., Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986)). El anticuerpo etiquetado puede ser detectado por medio de técnicas tales como exploración radionuclear (véase, por ejemplo, Bradwell y col., en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin y col., (eds.), pp. 65-85, Academic Press (1985)).

Administración

Los anticuerpos aquí descritos se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo animal o humano, para obtener imágenes o tratar tumores. Los anticuerpos se pueden administrar solos o en una mezcla, por ejemplo en presencia de un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo una solución salina fisiológica). El excipiente o vehículo se selecciona según el modo o la vía de administración. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences (E.W. Martin), texto de referencia muy conocido en este campo, y en USP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formularly).

Se formula una composición farmacéutica de forma que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, una solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metilparaben; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes de ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa; el pH se puede ajustar con ácidos o bases tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede cargar en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis de vidrio o plástico.

El modo más eficaz de administración y el régimen de dosificación para las composiciones de esta invención dependen de la gravedad y el curso de la enfermedad, de la salud del paciente y de su respuesta al tratamiento, así como de la opinión del médico tratante. En consecuencia, la dosificación de las composiciones debe ser valorada para cada paciente individual. Una dosis eficaz de las composiciones de anticuerpos de esta invención se encuentra en el rango de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5.000 mg, preferentemente de 1 aproximadamente a 500 mg aproximadamente, en especial de 100-200 mg aproximadamente.

Kits de Diagnóstico

La invención se extiende también a kits de diagnóstico para llevar a cabo los métodos descritos anteriormente. El kit de diagnóstico incluye un anticuerpo monoclonal descrito aquí. El kit puede incluir además un conjugado de una pareja de unión específica para el anticuerpo y una etiqueta para detectar el anticuerpo unido. El kit puede incluir asimismo agentes auxiliares, tales como agentes de tamponamiento y agentes estabilizadores de proteína, por ejemplo polisacáridos y similares. El kit de diagnóstico puede incluir además, cuando sea necesario, otros componentes de un sistema productor de señales incluyendo agentes para reducir la interferencia de fondo, reactivos de control y un aparato para realizar una prueba. El kit de diagnóstico puede incluir también un conjugado de un anticuerpo monoclonal de la invención y una etiqueta capaz de producir una señal detectable. También pueden estar presentes los agentes auxiliares mencionados anteriormente. En general, se incluyen también instrucciones sobre cómo utilizar el kit de diagnóstico.

Polipéptidos

Los anticuerpos monoclonales aquí descritos se pueden utilizar para aislar y caracterizar la proteína de 40 kDa a la que se unen. La proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal es una nueva proteína expresada en la superficie celular que se encuentra en varias células tumorales, incluyendo linfoma tímico, tumor de células T, linfoma de células B, melanoma, osteosarcoma y leucemia aguda de células T. La proteína es una molécula inductora de muerte basada en la observación de que, cuando los anticuerpos monoclonales se unen a esta proteína, la célula sobre la cual se expresa la proteína muere.

La proteína reconocida por los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar de las células que expresan la proteína (por ejemplo E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat y Cos). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales aquí descritos se pueden utilizar para la inmunoprecipitación de la proteína. Para determinar la secuencia proteica, la proteína se puede purificar por SDS-PAGE, electrosecarse en una membrana Immobilon (Millipore Corp., Bedford, MA), y la membrana teñirse con azul brillante de coomassie. La banda de proteína tintada (Mr = 40 kDa) se puede después cortar con una cuchilla de afeitar para el análisis posterior de la secuencia amino-terminal. El análisis de la secuencia amino-terminal, tal como la degradación automatizada de Edman, es bien conocido en la técnica.

La descripción de la presente invención se refiere también a proteínas de fusión que incluyen la proteína de 40 kDa fusionada a una proteína no asociada. Se puede elegir la proteína no asociada de forma que se facilite la purificación, detección, solubilización, o para proporcionar alguna otra función. Las proteínas de fusión se pueden producir sintéticamente o la proteína se puede enlazar a una proteína no asociada utilizando un reactivo de acoplamiento apropiado, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida (DCC). Alternativamente, las proteínas de fusión se pueden producir de forma recombinante mediante la clonación de una secuencia de nucleótidos que expresa la proteína de fusión, en un vector de expresión adecuado. El polipéptido de fusión recombinante se puede entonces purificar del medio de cultivo o de los lisatos celulares.

La proteína de 40 kDa es útil, por ejemplo, como vacuna para inmunizar contra ciertos tumores. Los procedimientos para preparar estas vacunas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Estin y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 85:1052 (1988)). Brevemente, se construyen los virus recombinantes con el fin de expresar la proteína clonada asociada al tumor. Las células infectadas con los virus recombinantes expresarán la proteína en la superficie de las células junto con los antígenos de histocompatibilidad del huésped y las proteínas virales inmunogénicas. Esto favorece la inducción de inmunidad celular, que desempeña un papel clave en el rechazo del tumor. La descripción de la presente invención incluye también un método para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes de prueba (por ejemplo péptidos, péptidos miméticos, pequeñas moléculas o medicamentos) que se unen a la proteína de 40 kDa o que tienen un efecto estimulador o inhibidor de la expresión o actividad de la proteína de 40 kDa. Por ejemplo, un antagonista de la proteína de 40 kDa sería útil para inhibir la apoptosis en una célula. Este antagonista puede desempeñar un papel en la inhibición de la apoptosis aberrante en un sujeto.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generación de Anticuerpos Antitumorales

En un intento para identificar nuevas moléculas funcionales que puedan estar implicadas en el crecimiento o la supervivencia de linfomas y/o en la función normal de los timocitos, se generaron hibridomas de hámsters inyectados con E710.2.3 de la forma siguiente. Se inyectaron vía intraperitoneal a hámsters armenios 10 millones de E710.2.3 y se estimularon 7-10 veces antes de la fusión. Las fusiones se llevaron a cabo utilizando la pareja de fusión P3X63-AG8.653 tal como se describe (Schreiber y col., (1985) Immunol. 134:1609). En primer lugar se cribaron los sobrenadantes de los híbridos por inmunofluorescencia y citometría de flujo en cuanto a su capacidad de unirse a E710.2.3A. Un anticuerpo particular, denominado aquí DMF 10.62.3, tiñó de forma brillante la superficie de E710.2.3.

El análisis por inmunofluorescencia descubrió que el DMF10.62.3 reaccionaba con diversas líneas celulares murinas (Tabla 1), pero estaba ausente en otras (Tabla 2). Las líneas celulares positivas incluían algunas líneas de células T (por ejemplo RMA-S), varios linfomas de célula B (por ejemplo A20 y WEHI-231) y una línea celular de macrófagos (C2.3). DMF10.62.3 se unía también específicamente a varias células inmortalizadas de origen no hematopoyético, induciendo una línea celular estromal (PHK101A2), un melanoma (B16), un sarcoma (MC57) y un fibroblasto transformado por polioma (WOP-3027). Varias otras células T inmaduras (por ejemplo G58.2) y maduras (por ejemplo EL4), un macrófago (por ejemplo A3.1), una célula dendrítica (DC2.4) y una línea celular de fibroblastos (LADp31) fueron negativas para DMF10.62.3. Es interesante observar cómo mAb reaccionaba también con varias líneas celulares humanas inmortalizadas, incluidas Jurkat, 293T y 143Btk y también con una línea celular de riñón de mono transformada con SV40, Cos7. DMF10.62.3 no se unió a ciertas líneas celulares humanas, tales como células linfoblastoides B, 721 y la célula de carcinoma cervical HeLa. Los modelos de tinción de las líneas celulares representativas se muestran en la Fig. 1 en caso de las células positivas para DMF10.62.3 E710.2.3 (Fig. 1A), A20 (Fig. 1B) y Jurkat (Fig. 1C) y de la célula negativa para DMF10.62.3, RF33.70 (Fig. 1D).

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TABLA 1

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Los datos anteriores indican que los nuevos anticuerpos se unen específicamente a diversas líneas celulares inmortalizadas, pero no a todas, y que la unión no se limita a la especie o linaje celular.

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TABLA 2

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Ejemplo 2

Expresión de la Molécula Reconocida por DMF10.62.3

Se examinó la expresión de la molécula reconocida por DMF10.62.3 en timocitos fetales de la forma siguiente. Embarazos calculados de ratones C57BI/10 produjeron embriones que se sacrificaron el día fetal 14. Los timos fetales se cosecharon en PBS utilizando un émbolo de tubo de vidrio Eppendorf. Se incubaron las suspensiones monocelulares durante 20 minutos en hielo con un receptor II/III anti-Fc gamma (Pharmingen) para bloquear los receptores Fc. Se tiñeron posteriormente las células con DMF10.62.3 o IgG de hámster durante 30 minutos seguido de cabra anti-hámster FITC conjugado, junto con anti-Thy 1.2 aloficocianina (APC)-conjugada (Pharmingen). En algunos experimentos, se incluyeron también CD25 conjugado con PE y anti-CD44 conjugado con Cy-Chrome (Pharmingen). Las células teñidas se fijaron durante toda la noche en un 1% de paraformaldehído y se analizaron posteriormente por citometría de flujo.

Los resultados demostraron que, el día 14, los timocitos fetales teñidos con DMF10.62.3 eran positivos para la proteína de 40 kDa y se descubrió que la proteína estaba presente en las células positivas Thy 1.2 (Fig. 2A). Es interesante comprobar que la proteína estaba presente tanto en los timocitos fetales CD25^{+}CD44^{+} como en los timocitos fetales CD44^{+}CD25^{-}. Sin embargo, la tinción de timo adulto (Fig. 2C), bazo adulto (Fig. 2B) y células de médula ósea adultas (Fig. 2D) mostraron que la proteína reconocida por DMF10.62.3 no estaba presente en ninguna de estas células a niveles por encima de los que se observan con el IgG del hámster de control. Además, la proteína no se pudo detectar en los timocitos CD4^{-}CD8^{-} adultos después de la activación y desactivación en las células CD4^{-}CD8^{-} en un análisis multiparámetro, por citometría de flujo o análisis de esta población a partir de ratones RAG-/-. El día 14, las células fetales de hígado también eran no-reactivas con DMF10.62.3.

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Para determinar si la proteína reconocida por DMF10.62.3 estaba presente en células normales activadas, se activaron células T esplénicas con el mitógeno ConA de célula T y se tiñeron para la expresión de la proteína reconocida por DMF10.62.3 de la forma siguiente. Se prepararon células de bazo, timo y médula ósea procedentes de ratones adultos (edad de 4-6 meses) Balb/c o C57B1/6. Se retiraron los glóbulos rojos de suspensiones de células de bazo utilizando lisis con tris(cloruro de amonio). Las células no estimuladas se tiñeron inmediatamente. Los linfoblastos se estimularon en cultivo con 1 \mug/ml de ConA o 10 \mug/ml de LPS. Después de 1-3 días de cultivo, se tiñeron las células para la expresión de DMF10.62.3. No se vio ninguna coloración significativa por encima del fondo en las células no estimuladas (Fig. 3A) o las células estimuladas con ConA a las 24 (Fig. 3B), 48 (Fig. 3C) o 72 (Fig. 3D) horas después de la activación (ningún cambio en el perfil de FAC). Como control positivo, se tiñeron con CD25 las células estimuladas con ConA. Tal como se esperaba, el tratamiento con ConA resultó en un aumento significativo en la expresión de CD25 en estas células en comparación con las células no estimuladas (la unión de CD25 a las células provoca un cambio del perfil de FAC). Similarmente, cuando las células B esplénicas se activaron con el lipopolisacárido (LPS), no se vio ninguna coloración con DMF10.62.3 a las 24 (Fig. 3E), 48 (Fig. 3F) y 72 (Fig. 3G) horas (ningún cambio en el perfil de FAC), mientras que estas células expresaban realmente CD25 (cambio en el perfil de FAC). La proteína reconocida por DMF10.62.3 no está presente en las células de médula ósea adulta (Fig. 2D). Estos datos indican que la proteína reconocida por DMF10.62.3 está presente en algunos timocitos fetales, pero no en las células normales quiescentes o activadas de origen hematopoyético en los animales adultos.

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Ejemplo 3

DMF10.62.3 Inhibe la Proliferación de Células Tumorales

Cuando crecen a baja densidad y se mantienen en ausencia de PMA, las células E170.2.3 proliferan lentamente o no proliferan. Sin embargo, proliferan cuando se cultivan conjuntamente con timocitos. DMF10.62.3 se identificó inicialmente por su capacidad para bloquear esta proliferación inducida por timocitos. Como se muestra en la Tabla 3, DMF10.62.3 inhibe completamente esta respuesta (Fig. 4A). Se realizaron ensayos sobre la proliferación de la forma siguiente. Las células E10.2.3 se lavaron sin PMA y se cultivaron en RPMI completo durante 48 horas a baja densidad celular (< 10^{5}/ml) para reducir la proliferación de fondo. Posteriormente, se cultivaron 5 x 10^{3} células durante 72 horas en placas microvaloradas de fondo plano con 25 ng/ml de PMA o 5 x 10^{5} timocitos en presencia o ausencia de anticuerpos. En los experimentos que examinan los efectos de los anticuerpos sobre la proliferación espontánea de células, se cultivaron células E710.2.3 (cultivadas a alta densidad > 10^{5}/ml) o RMA-S durante 36 horas en presencia o ausencia de distintas concentraciones de anticuerpo. Se añadió ^{3}H-timidina (1 TCi/pocillo) durante las últimas 5 horas y se midió la incorporación de la etiqueta en el ADN en un contador de J-escintilación (Wallac, Gaithersburg,
MD).

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TABLA 3

3

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Se investigó también la capacidad de DMF10.62.3 para inhibir la respuesta de E710.2.3 a otros estímulos. Como se muestra en la Tabla 3, el anticuerpo bloqueó también la proliferación inducida por PMA de E710.2.3. Además, E710.2.3 proliferó espontáneamente cuando se cultivó a alta densidad, y DMF10.62.3 inhibió esta respuesta (Fig. 4A). La proliferación se inhibe significativamente a 3 \mug/ml y se observa una inhibición completa a 12,5 \mug/ml. Por el contrario, el IgG de hámster no tuvo ningún efecto sobre la respuesta de E710.2.3 (Fig. 4A) a ninguno de estos estímulos. Similarmente, muchos de los mAbs procedentes de la fusión original se unieron a E710.2.3, pero no inhibieron su proliferación (por ejemplo DMF10.132) (Tabla 3). Por tanto, DMF10.62.3 inhibió específicamente la proliferación de E710.2.3 sin tener en cuenta el estímulo utilizado para inducir la proliferación.

La proteína reconocida por DMF10.62.3 está presente en otras diversas líneas celulares. Por tanto, era interesante determinar si el anticuerpo tenía un efecto similar sobre su proliferación espontánea. DMF10.62.3 inhibió la proliferación de RMA-S (Fig. 4B), así como ciertas otras líneas celulares sometidas a prueba. Por contraste, el anticuerpo no tuvo ningún efecto sobre la proliferación espontánea de RF33.70, que fue negativa por la presencia de la proteína de DMF10.62.3 (Fig. 4C).

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Ejemplo 4

DMF10.62.3 Induce la Muerte Celular por Apoptosis

Se ensayó la apoptosis utilizando kits de R&D (Minneapolis, MN) y Pharmingen (San Diego, CA). Brevemente, 2 x 10^{5} células se incubaron con varias concentraciones de anticuerpo en 200 il de medio. Al final de la incubación, se lavaron las células 2X en PBS, se trataron con PI y FTTC anexina durante 15 minutos y luego se analizaron por citometría de flujo. La fragmentación de ADN se evaluó por electroforesis en gel de agarosa en geles de agarosa al 2% tal como se describe en Schattner y col. ((1995) J. Exp. Med. 182:1557).

Los cultivos de células tratadas con el anticuerpo DMF10.62.3 se inspeccionaron visualmente y se tomó nota del número de células intactas, que se reducía. Además, las células ya no excluían el colorante vital azul de tripano. Esta observación, así como la inhibición de la proliferación, sugirieron que el anticuerpo era citotóxico para las células. Por tanto, se realizaron estudios para determinar el mecanismo por el que DMF10.62.3 estaba induciendo la muerte celular.

Las células pueden morir por apoptosis o necrosis. Uno de los primeros cambios vistos en las células que experimentan apoptosis es la externalización de la fosfatidilserina en la membrana plasmática, y ésta se puede detectar por tinción con FTTC-anexina. Pronto en el proceso, las células apoptóticas pueden excluir colorantes vitales tales como yoduro de propidio y, por tanto, se pueden identificar como positivas a FITC-anexina y negativas a PI. Más tarde en el proceso apoptótico, se pierde la integridad de la membrana y las células positivas a FITC-anexina se convierten en positivas a PI. Por contraste, durante la necrosis, las células pierden la integridad de la membrana y se convierten simultáneamente en positivas a PI y positivas a FITC-anexina, sin ninguna etapa de positiva a FTTC-anexina y negativa a PI.

En los perfiles FAC de las Fig. 5A a 5I, las células en el cuadrante inferior izquierdo son células vivas, las células en el cuadrante inferior derecho están experimentando apoptosis (positiva a FTTC-anexina), y las células en el cuadrante superior derecho son células que están muertas por apoptosis y/o necrosis (positivas a PI y positivas a FTTC-anexina). Se muestra también el porcentaje de células en cada cuadrante. En el presente estudio, un porcentaje de células E710.2.3 experimentó la apoptosis espontánea en el cultivo (del 10,9 al 15% Anexina+, PI-). Sin embargo, una cantidad tan pequeña como de 1 \mug/ml de DMF10.62.3 provocó un aumento significativo de la apoptosis en 1 hora (un 28,9% de Anexina+, PI-; Fig. 5A), y esta apoptosis se incrementó con el tiempo (un 48,6% de positiva a Anexina+, a PI- en 3 horas) (Fig. 5C). Cantidades superiores de DMF10.62.3 (15 \mug/ml) estimularon la apoptosis más rápidamente en el tiempo (un 37,1% de positiva a Anexina+, PI- en 1 hora) y en más células (Fig. 5E-G). Por contraste, el tratamiento con cantidades similares de IgG de hámster no tuvo un efecto significativo sobre el tratamiento con el medio solo (Fig. 5D, 5H, 5I). Se comprobó también la apoptosis visualizando la fragmentación de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa.

Debido a que la proteína reconocida por DMF10.62.3 se expresó en otras células y a que este anticuerpo inhibió su proliferación (donde se sometió a prueba), se investigó además si DMF10.62.3 las estimulaba también para experimentar apoptosis. DMF10.62.3 causó una apoptosis significativa en las líneas celulares murinas RMA-S, CTLL, LB27.4 y A20 y en las líneas celulares humanas Jurkat y 143BTK- (Tabla 4). La apoptosis fue inducida por medio de 15 \mug/ml de DMF10.62.3 y fue incrementada con concentraciones más altas de anticuerpo. Por contraste, DMF10.62.3 no provocó apoptosis en RF33.70, lo que es negativo para la proteína. El nivel de apoptosis inducida por DMF10.62.3 variaba entre las distintas líneas celulares y parecía depender del nivel de expresión superficial, así como del porcentaje de células en la población que expresa la proteína (Tabla 4). Por ejemplo, la mayor parte de E710.2.3 y las células RMA expresó la proteína a altos niveles y DMF10.62.3 indujo altos niveles de apoptosis en ambas líneas celulares. Por contraste, pocas células A20 y LB27.4 expresaron la proteína de 40 kDa a niveles más bajos y DMF10.62.3 indujo niveles más bajos de apoptosis en estas células (Tabla 4). El estímulo de la apoptosis por DMF10.62.3 parece ser independiente de fas, ya que E710.2.3 y las células RMA-S no expresan fas (Tabla 4).

TABLA 4

4

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Ejemplo 5

DMF10.62.3 Provoca Agregación Homotípica en E710.2.3 y Otras Líneas Celulares

La agregación homotípica es un proceso biológicamente activo por medio del cual se estimulan las células para que adhieran entre sí. Los ensayos de agregación se establecieron de la forma siguiente. Se incubaron 10^{5} células con varias concentraciones de DMF10.62.3 o IgG de hámster o sin anticuerpo en 200 il de RPMI completo. Para probar el efecto de los inhibidores, se preincubaron 10^{5} células con el inhibidor durante 30 minutos y luego se añadió DMF10.62.3 mAb (10 \mug/ml) con presencia continuada del inhibidor durante 6 horas. Para ensayar el efecto del paraformaldehído sobre la agregación, se fijaron las células en un 1% de paraformaldehído durante 10 minutos, se lavaron y después se añadió DMF10.62.3 durante 6 horas. Se observó visualmente la agregación. Se tomaron microfotografías 6 horas después utilizando una cámara con dispositivo de carga acoplada termoeléctrico refrigerado (CCD) (Princeton Instruments, Trenton, NJ). Se descubrió que DMF10.62.3 inducía la agregación homotípica de E710.2.3 en el cultivo. Después de 6 horas, se observó una agregación significativa con las células tratadas con 5 \mug/ml o más de anticuerpo. Por contraste, no se observó ninguna agregación en los cultivos tratados con IgG de hámster o el medio. Esta agregación fue bloqueada por el tratamiento con varios agentes, incluida la citocalasina-B, que interrumpe los microfilamentos de actina, la trifluoperazina, que inhibe los procesos calmodulina dependientes, azida sódica + 2-desoxiglucosa, que inhibe la síntesis de ATP, y EDTA quelante de Ca^{2+} y Mg^{2+}. Por contraste, la agregación no se vio afectada por la colchicina, que inhibe la formación de microtúbulos. La agregación se inhibió también mediante la incubación a 4ºC y el tratamiento con paraformaldehído (Tabla 5). Estos resultados indican que la agregación es un proceso activo y que no es simplemente una aglutinación.

TABLA 5

6

DMF10.62.3 provocó también la agregación homotípica de algunas otras líneas celulares (por ejemplo RMA-S, CTLL) que expresan la proteína de unión a DMF10.62.3. Sin embargo, se observó una pequeña agregación por encima del fondo para algunas otras líneas celulares positivas a DMF10.62.3 (por ejemplo Jurkat, LB27.4, A20, 143Btk-). No se observó ninguna agregación con RF33.70, a la que DMF10.62.3 no se une.

El ensayo de agregación se puede utilizar para ayudar a determinar si un nuevo anticuerpo es uno de los nuevos anticuerpos antitumorales de la invención.

Ejemplo 6

DMF10.62.3 Inmunoprecipita una Proteína de 40 kDa No Enlazada a GPI

Para caracterizar la proteína unida por DMF10.62.3, se llevó a cabo el etiquetado con ^{35}S y la inmunoprecipitación de la forma siguiente. 5 x 10^{6} células de E710.2.3 se subalimentaron durante 1 hora en un medio libre de metionina y luego se incubaron durante 2 horas con ^{35}S metionina a 0,5 mCi/ml. Las células etiquetadas se lisaron en un tampón de inmunoprecipitación tal como se describe en Townsend y col. ((1990) J. Immunol. 146:2235). Los lisatos clarificados se preaclararon con IgG de hámster, se inmunoprecipitaron con DMF10.62.3 unido a Proteína-A-sefarosa y se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en un 14% de gel. Para determinar el peso molecular de la proteína de unión a DMF10.62.3, se etiquetaron las células de E170.2.3 durante 2 horas con ^{35}S metionina. Los inmunoprecipitados procedentes de las células etiquetadas se analizaron por SDS-PAGE en condiciones de reducción.

El mAb DMF10.62.3 inmunoprecipitó una proteína de aproximadamente 40 kDa procedente de E710.2.3 en condiciones de reducción. La movilidad electroforética de esta proteína no se alteró en condiciones no reductoras. No se vio esta banda en los inmunoprecipitados con IgG normal de hámster o en los inmunoprecipitados con un anticuerpo anti-MHC de clase I, Y-3. Se identificó también una proteína de 40 kDa en los lisatos de las células RMA-S y E710.2.3 etiquetadas en la superficie.

Varias moléculas en la superficie celular tales como Thy-1 y Ly-6 A/E están enlazadas a la superficie celular por medio de anclajes glicosilfosfatidilinositol (GPI). Este enlace superficial es sensible al tratamiento con PI-PLC. Para determinar si la proteína reconocida por DMF10.62.3 estaba enlazada a GPI, células de RMA-S que expresan la proteína en la superficie celular se trataron con PI-PLC. El tratamiento con PI-PLC no redujo la tinción de DMF10.62.3, pero disminuyó realmente la tinción para la molécula enlazada a GPI Thy-1; lo que sugiere que la proteína de 40 kDa reconocida por DMF10.62.3 no está anclada a la superficie celular por un GPI.

Ejemplo 7

Efecto in vivo del anticuerpo DMF62.3

Ratones AKR fueron inyectados IV o IP con 5 x 10^{6} células tumorales singénicas E710.2.3 y recibieron una solución salina o una inyección IP de 0,5 mg de control o anticuerpo DMF62.3 el primer día y luego 10 días más tarde. La supervivencia de los animales se siguió durante 50 días (Tabla 6).

TABLA 6

7

Declaración de Depósito

La línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal DMF10.62.3 fue recibida por la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, el 20 de julio de 1999, y las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales DMF10.167.4 y DMF10.34.36 fueron recibidas por la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, el 22 de julio de 1999. Los hibridomas han sido depositados en condiciones que aseguran que su accesibilidad estará disponible durante la progresoa de la solicitud de patente que los describe a una persona determinada por el Comisionario de Patentes y Marcas con derecho al mismo, bajo la referencia 37 CFR 1.14 y 35 USC 122. Los depósitos están disponibles según es exigido por las leyes de patentes extranjeras en países en los que los duplicados de la presente solicitud o sus consecuencias están archivados. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una autorización para poner en práctica la presente invención en detrimento de los derechos de las patentes otorgados por la acción gubernamental.

Además, los depósitos del presente cultivo se almacenarán y se pondrán a disposición del público de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir que se almacenarán con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante un período de al menos cinco años después de la petición más reciente de suministro de una muestra de los depósitos, y en cualquier caso, durante un período de al menos 30 (treinta) años después de la fecha de depósito o durante el tiempo aplicable de cualquier patente que pueda publicar el descubrimiento de los cultivos más cinco años después de la última petición de una muestra procedente del depósito. El depositante reconoce la obligación de sustituir el depósito si el depositante no pudiera suministrar una muestra cuando se le pide, debido a la condición de los depósitos. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del depósito de cultivo del asunto serán eliminadas irrevocablemente a la concesión de la patente que los describe.

Otras realizaciones

Se debe entender que aunque la invención ha sido descrita conjuntamente con la descripción detallada de la misma, la descripción anteriormente mencionada pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención que viene definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones se encuentran dentro de los límites del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo, seleccionado de entre:

un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma seleccionada de entre ATCC Nº PTA-377, PTA-404 y PTA-405, caracterizado porque dicho anticuerpo es DMF10.62.3, DMF10.167.4 o DMF10.34.36 respectivamente;

un anticuerpo quimérico que incluye regiones constantes humanas de cadenas ligeras y pesadas y regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado entre DMF10.62.3, DMF10.167.4 y DMF10.34.36; y

un anticuerpo humanizado que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo seleccionado entre DMF10.62.3, DMF10.167.4 y DMF10.34.36.

2. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo induce la agregación homotípica a su unión a una célula.

3. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a una o más líneas celulares tumorales del grupo E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat y Cos.

4. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a las células E710.2.3.

5. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende las CDRs de un anticuerpo DMF10.62.3.

6. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende la región variable de un anticuerpo DMF10.167.4 y una región constante de un anticuerpo humano.

7. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una CDR de un anticuerpo DMF10.167.4.

8. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende la región variable de un anticuerpo DMF10.34.36 y una región constante de un anticuerpo humano.

9. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende las CDRs de un anticuerpo DMF10.34.36.

10. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además una etiqueta detectable.

11. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 10, caracterizado porque la etiqueta detectable se selecciona de entre el grupo consistente en un material fluorescente, un material luminiscente, un material bioluminiscente y un material radioactivo.

12. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se conjuga con un radioisótopo.

13. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según la reivindicación 12, caracterizado porque el radioisótopo se selecciona de entre el grupo consistente en boro 10, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S y ^{3}H.

14. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a un antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se conjuga con un radionúclido que emite una partícula seleccionada de entre el grupo consistente en una partícula alfa, una partícula beta y una partícula gamma.

15. Hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

16. Composición que comprende el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Kit para el diagnóstico de tumores que comprende el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, así como las instrucciones para su uso.

18. Kit según la reivindicación 17, caracterizado porque el tumor a ser diagnosticado se selecciona de entre el grupo consistente en linfoma tímico, tumor de células T, linfoma de células B, melanoma, osteosarcoma y leucemia aguda de células T.

19. Agente diana para células tumorales que comprende el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con una etiqueta detectable o una fracción tóxica.

20. Agente según la reivindicación 19, caracterizado porque la fracción se selecciona de entre el grupo consistente en una molécula radioactiva, un radionúclido, un radioisótopo y una toxina.

21. Utilización de un anticuerpo monoclonal aislado o de un fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de una composición para la detección de una célula tumoral en un sujeto, caracterizada porque la unión específica de la composición a una muestra celular procedente del sujeto en condiciones suficientes para permitir la unión específica indica la presencia de una célula tumoral en el sujeto.

22. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque la célula tumoral es una célula de linfoma tímico, de tumor de células T, de linfoma de células B, de melanoma, de osteosarcoma o de leucemia aguda de células T.

23. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque la célula tumoral se encuentra en un paciente.

24. Utilización del anticuerpo monoclonal aislado o de un fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales.

25. Utilización del anticuerpo monoclonal aislado o de un fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de un medicamento para inducir la apoptosis en una célula tumoral.

26. Utilización según la reivindicación 25, caracterizada porque la célula es una célula tumoral seleccionada de entre el grupo consistente en linfoma tímico, tumor de células T, linfoma de células B, melanoma, osteosarcoma o leucemia aguda de células T.

27. Utilización según la reivindicación 25, caracterizada porque la célula está in vitro o in vivo.

28. Utilización de un agente diana según la reivindicación 19 ó 20 en la producción de una composición para suministrar selectivamente una fracción a una célula tumoral en un mamífero.

29. Método para aislar una proteína, comprendiendo el método:

poner en contacto una muestra que contiene proteínas con el anticuerpo monoclonal aislado o con el fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anticuerpo-proteína;

retirar el complejo, si lo hubiese, de la muestra; y

recuperar la proteína del complejo, aislando así la proteína.