ES2328031T3 - Composiciones para distribuir acidos nucleicos a celulas. - Google Patents
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Abstract
Una composición para distribuir un polinucleótido a una célula que comprende un polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio cíclico de amidinio y el polinucleótido.
Description
Composiciones para distribuir ácido nucléicos a
células.
Esta solicitud está relacionada con las
solicitudes previas provisionales 60/383.201, presentada el 24 de
mayo de 2002 y 60/411.332 presentada el 17 de septiembre de
2002.
Los polímeros biológicamente activos tales como
las proteínas, las enzimas y los ácidos nucleicos (ADN y ARN) se
han distribuido a las células usando los compuestos anfifáticos que
contienen dominios tanto hidrófobos como hidrófilos. Típicamente,
estos compuestos anfifáticos se organizan en estructuras vesiculares
tales como los liposomas, micelas o estructuras de micelas
invertidas. Los liposomas pueden contener un volumen acuoso que se
rodea completamente de una membrana compuesta de moléculas de
lípidos (normalmente fosfolípidos) [New 1990]. Para distribuir los
ácidos nucleicos a las células se han usado liposomas cargados
positivamente, neutros y cargados negativamente. Por ejemplo, la
expresión de ADN plásmido en el hígado se ha logrado mediante
liposomas distribuidos por la vena de la cola o por vías
intraportales. Para empaquetar ácidos nucleicos en complejos para
la distribución de los ácidos nucleicos a las células se han usado,
también, las micelas cargadas positivamente.
Los polímeros se han usado, también,
ampliamente, para la distribución de polímeros biológicamente
activos a las células. Numerosas aplicaciones de distribución de
fármacos utilizan matrices polímeras como el excipiente del
fármaco. Se han usado polímeros para la distribución de ácidos
nucleicos (polinucleótidos, oligonucleótidos y ARN) a las células
con fines de investigación y terapéuticos. Esta aplicación se ha
denominado transfección y terapia génica o terapia antisentido,
respectivamente. Uno de los diversos métodos de distribución de
ácido nucleico a las células es el uso de complejos
ADN-policatión. Se mostró que proteínas catiónicas
como histonas y protaminas o polímeros sintéticos como polilisina,
poliarginina, poliornitina, DEAE dextrano, polibreno y
polietilenimina son eficaces agentes de distribución intracelular.
Los policationes son un enlazador muy conveniente para asociar
receptores o ligandos específicos con el complejo de ácido
nucleico-policatión y, como resultado, los
complejos de ácido nucleico-policatión pueden ser
dirigidos a tipos de células específicos. Los policationes también
protegen el ácido nucleico en los complejos contra la degradación de
la nucleasa. Esta protección es importante para la conservación
tanto extracelular como intracelular del ácido nucleico.
El principal mecanismo de la translocación del
ácido nucleico al espacio intracelular podía ser una endocitosis de
adsorción no específica. La distribución del gen usando polímeros
catiónicos puede incrementarse impidiendo la acidificación
endosómica tal como con NH_{4}Cl o clorocina. Algunos polímeros,
tales como polietilenimina y ácido
poli(propil-acrílico), pueden poseer también
membrana disruptiva o propiedades endosomalíticas. Varios informes
han atribuido las propiedades de polietilenimina de distribuir el
gen a un efecto tampón o de esponja de protones. La ruptura de
endosomas se ha informado, también, como un resultado del enlace a
los agentes disruptivos endosómicos del policatión tales como los
péptidos de fusión o los adenovirus.
Los policationes pueden, también, facilitar la
condensación del ácido nucleico. El volumen que una molécula de ADN
ocupa en un complejo con policationes es inferior, de manera
espectacular, al volumen de una molécula de ADN libre. El tamaño de
un complejo ADN/polímero es, probablemente, crítico para la
distribución de genes in vivo. En términos de inyección
intravenosa, el ADN necesita cruzar la barrera endotelial y llegar a
las células parenquimales de interés. Los más grandes ventanales
del endotelio (agujeros en la barrera endotelial) aparecen en el
hígado y tienen un diámetro medio de 100 nm. Los poros
trans-epiteliales en otros órganos son mucho más
pequeños, por ejemplo, el endotelio del músculo puede describirse
como una estructura que tiene un gran número de pequeños poros con
un radio de 4 nm, y un número muy bajo de poros grandes con un radio
de 20-30 nm. El tamaño de los complejos de ADN es,
también, importante para el proceso de absorción celular. Después
de enlazar con las células, el complejo
ADN-policatión se absorben, probablemente, por
endocitosis. Por tanto, los complejos de ADN más pequeños de 100 nm
son los preferidos.
En una realización preferida, los autores de la
invención describen composiciones para la distribución de un
polímero biológicamente activo a una célula que comprende:
compuestos que contienen amidinio cíclico. Los amidinio cíclico son
grupos derivados de la ciclación intramolecular de una amina con una
amida (que da como resultado la formación de un anillo que se
deshidrata) en el mismo polímero. La estructura de anillo resultante
tiene una carga formal positiva, pero puede encontrarse en un
polímero que tenga una carga global positiva, negativa o neutra. El
tamaño del anillo puede ser de 5 a 9 átomos pero, lo más
favorablemente, un anillo de 5, 6, u 8 miembros, tal como un
imidazolinio, un anillo 1,3-piperazinio y un anillo
heterocíclico de 8 miembros con nitrógeno en las posiciones 1 y 3.
La amida puede ser alquílica, arílica, o puede tener cualquier
sustitución o funcionalidad. Los polímeros y composiciones de la
invención, son útiles para la distribución de compuestos a las
células in vitro e in vivo. Los compuestos que pueden
distribuirse a las células pueden seleccionarse de la lista que
comprende: polinucleótidos, oligonucleótidos, ADN, ARN, siARN,
análogos de ADN y de ARN, y polímeros biológicamente activos.
La presente invención se refiere, también, a
composiciones que comprenden: policationes derivados de la ciclación
intramolecular de polietilenimina, lineal o ramificada, acilada.
Los polímeros obtenidos son copolímeros de las subunidades
seleccionadas del grupo constituido por: etilamina, imidazolinio
sustituido en posición 2, y
N-acil-etilenamina. Un
poliimidazolinio preferido es un derivado de polietilenimina lineal
con N-propionilo. Los polímeros y composiciones de
la invención pueden usarse para la distribución de compuestos a
células in vitro e in vivo. Los compuestos que pueden
ser distribuidos a las células usando los polímeros descritos
pueden ser seleccionados de la lista que comprende: polinucleótidos,
oligonucleótidos, ADN, ARN, si-ARN, análogos de ADN
y de ARN, y polímeros biológicamente activos.
La presente invención prevé la transferencia de
polinucleótidos, y otros polímeros biológicamente activos, a
células in vitro e in vivo, que comprende: asociar el
polímero biológicamente activo con un compuesto seleccionado del
grupo constituido por: compuestos que contienen amidinio cíclico,
compuestos que contienen amidinio policíclico, compuestos que
contienen imidazolinio, compuestos poliimidazolinio, compuestos que
contienen imidazolina, compuestos poliimidazolina, compuestos que
contienen anillos 1,3-piperazinio y compuestos con
anillo poli(1,3-piperazinio); y distribuir el
complejo a la célula. El complejo puede ser distribuido por vía
intravascular, intrarterial, intravenosa, oral, intraduodenal, por
el yeyuno (o por el íleon o por el colon), por vía rectal,
transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal,
intraparenteral, por inyecciones directas sobre el tejido, por las
membranas mucosas, o en los conductos de las glándulas exocrinas
salivales u otras. El polímero puede se modificado para contener
uno o más grupos funcionales que realcen la distribución del
polinucleótido de otro polímero biológicamente activo a la
célula.
Otros objetivos, características y ventajas de
la invención serán evidentes de la descripción detallada siguiente
cuando se toman conjuntamente con los dibujos que se adjuntan.
Fig. 1A-1B. Ilustraciones de las
estructuras químicas para (A) amidina cíclica y (B) amidinio
cíclico.
Fig. 2. Ilustración de una reacción de
transamidación.
Fig 3. Ilustraciones de las estructuras químicas
de anillos heterocíclicos de imidazolinio.
Fig. 4. Ilustración de la formación de
imidazolinio a partir de
N-acil-N,N'-difenil-etilendiamina.
Fig. 5. Ilustración de la formación de
imidazolinio a partir de N-alquilación de un anillo
de imidazolina.
Fig. 6. Ilustración de las formaciones de un
polímero de poliimidazolina y un polímero de
poli-imidazolinio.
Fig. 7. Ilustraciones para la hidrólisis ácida y
la hidrólisis básica de una amida.
Fig. 8. Ilustración de la estructura química de
2-imidazolina.
Fig. 9. Ilustración de la estructura química de
1,3-piperazinio.
Fig. 10. Ilustración de la polimerización
química para formar polietilenimina ramificada.
Fig. 11. Ilustración de la polimerización
química para formar polietilenimina lineal.
Fig. 12. Espectros UV de lPEI sustituida
un 10% con N-propionilo incubada a 4ºC (1) o agitada
a 37ºC (2). La concentración de polímero era de 0,2 mg/ml en
agua.
Fig. 13. Espectros de IR de lPEI
sustituida un 10% con N-propionilo incubada a 4ºC
(1) o agitada a 37ºC (2).
Fig. 14. Comparación de la transfección de
pulmón in vivo después de inyección, en la vena de la cola,
de complejos ADN/policatión que contienen lPEI (no curada)
sustituida con N-propionilo o polímero que contiene
imidazolinio (curado).
Fig. 15. Efecto del pH en la formación de anillo
de imidazolinio en lPEI sustituida con
N-propionilo medido por absorbancia UV.
Fig. 16. Ilustraciones de las estructuras
químicas de polímeros MC1016
(N,N'-dimetiletilendiamina monopropionilada) y
MC1017 (N,N'-dimetiletilendiamina
N,N'-dipropionilada).
Fig. 17. Espectros UV de MC1016 calentada a 70ºC
frente a no tratada.
Fig. 18. Espectros UV de la formación de
amidinio a partir de pentaetilenhexamina monoacilada.
Fig. 19. Espectros UV de la formación de
polímero de poliimidazolinio.
Fig. 20. Espectros UV de la formación de yoduro
de 1,2-dimetil-imidazolinio, yoduro
de 1,2,3-trimetil-imidazolinio y
1,1,4-trimetil-4-acil-etilendiamina.
Fig. 21. Espectros UV del polímero que contiene
imidazolinio derivado de la polimerización de
2-metil-2-imidazolina
y epiclorohidrina.
Fig. 22. Espectros UV del polímero que contiene
imidazolinio derivado de la polimerización de
2-metil-2-imidazolina
y poliepiclorohidrina.
Los autores de la invención describen una nueva
clase de compuestos que contienen amidinio cíclico (Fig. 1) que
facilitan la distribución de polímeros biológicamente activos a las
células. Específicamente, la invención se refiere a compuestos que
contienen estructuras de anillo heterocíclico catiónico derivado de
la adición en 1,2 intramolecular de una amina a una amida, seguido
por deshidratación. En esta invención, se contemplan polímeros con
cuatro a once, y más preferiblemente cuatro a siete, enlaces de
amina alejados de un carbonilo de amida que pueden experimentar
esta ciclación intermolecular. Estos polímeros contienen sistemas de
anillo 1,3-heterocíclico que poseen una carga
formal positiva. La amida puede formarse en un polímero preformado
mediante una reacción de acilación bien conocida en la técnica.
Además, puede sintetizarse un polímero que contiene una amida; por
ejemplo, el polímero resultante de la polimerización de una
2-oxazolina. Una hidrólisis de amida controlada
puede conducirse para sintetizar un polímero con la proporción
deseada de unidades que contienen amida y unidades que contienen
amina libre (o sal de amina protonada). El polímero resultante puede
entonces tamponarse entre pH 2-8 y dejar que
experimente la reacción de ciclación. Estos polímeros pueden
seleccionarse de la lista que comprende: polietileniminas
parcialmente aciladas (lPEI, brPEI), polivinilamina
parcialmente acilada, polialilamina parcialmente acilada, y
polipropilamina parcialmente acilada. Las estructuras de anillo
formadas pueden seleccionarse de la lista que comprende: anillos de
imidazolinio, anillos 1,3-piperazinio, y anillo
heterocíclico de 8 miembros con nitrógeno en posiciones 1 y 3.
La Fig. 1A representa un anillo de amidina. El
anillo de amidina puede ser alquilado en el nitrógeno para
proporcionar un anillo de amidinio (Fig. 1B). El anillo de amidinio
puede formarse, también, a partir de la ciclación intramolecular y
deshidratación de una amida y una amina.
En un amidinio (subunidad amidinio), los
sustituyentes R1, R2, R3 pueden ser independientemente un radical
hidrógeno o un radical carbono con cualquier sustitución. El anillo
puede ser de 5 a 12 átomos, y puede contener heteroátomos
adicionales además de los átomos de nitrógeno en posiciones 1 y 3.
Además, el anillo puede sustituirse en otras posiciones,
independientemente de que sea un radical hidrógeno, un radical
carbono con cualquier sustitución, o un radical heteroátomo con
cualquier sustitución. El contraión (X) puede ser cualquier
contraión. Los contraiones incluyen pero no se limitan a cloruro,
bromuro, yoduro y tosilato.
Un poliamidinio es un polímero (copolímero
aleatorio, copolímero de bloques u otro copolímero) que contiene
dos o más subunidades amidinio. Un poliamidinio significa, también,
un homopolímero de la subunidad amidinio. La subunidad amidinio
puede estar en la cadena principal del polímero o como una cadena
lateral fuera de la cadena principal del polímero. El polímero
puede ser un polímero neutro neto, un policatión o un polianión.
Una poli(2-amidina) es un
polímero (polímero aleatorio o polímero de bloques) que contiene una
o más subunidades amidina. Una
poli(2-amidina) significa también un
homopolímero de la subunidad 2-amidina. La subunidad
amidina puede estar en la cadena principal del polímero o como una
cadena lateral fuera de la cadena principal del polímero. El
polímero puede ser un polímero neutro neto, un policatión, o un
polianión.
En una 2-amidina (subunidad
amidina), los sustituyentes R1, R2 pueden ser, independientemente,
un radical hidrógeno o un radical carbono con cualquier
sustitución. El anillo puede ser de 5 a 12 átomos y puede contener
heteroátomos adicionales además de átomos
1,3-nitrógeno. Además, el anillo puede estar
sustituido en otras posiciones, siendo, independientemente, un
radical hidrógeno, un radical carbono con cualquier sustitución o
un radical heteroátomo con cualquier sustitución.
Las amidas experimentan diversas
transformaciones químicas. Por ejemplo, las amidas se conocen por
reaccionar con amidas o lactamos (amidas cíclicas) en una reacción
de transamidación, dando como resultado la formación de un nuevo
enlace amida (y un producto de expansión de anillo correspondiente
en el caso de lactamos) [Chimishkyan 1985; García 1982; Stach 188;
Krammer 1977; Krammer 1978; Askitoglu 1985]. Las reacciones de
transamidación se conocen por ser sustitución dependiente tanto de
la amina como de la amida. Fig. 2.
Se ha informado de las reacciones de
transamidación intramoleculares tanto en las amidas de alquilo como
en las amidas de arilo. También, se ha informado de las reacciones
intramoleculares entre aminas y amidas. En numerosos estudios, se
ha observado una deshidratación del producto inicial de la adición.
Esta reacción lleva a la formación de un anillo heterocíclico, en
concreto a la formación de un sistema de anillo imidazolinio (Fig.
3A) [May et al. 1951; Jaenicke et al 1959; Hafferl,
et al. 1963; Barnett et al. 1966]. En particular, la
reacción de ciclación se ha estudiado en derivados monoacilados de
N,N'-difeniletilendiamina (Fig. 4). A medida que el
anillo de imidazolinio (Fig. 4B) se forma en la ciclación, hay un
cambio en la absorbancia UV del material, con una nueva absorbancia
que se desarrolla en el intervalo de \lambda =
220-240 nm. Los informes indican que la reacción es
reversible, dependiendo del pH de la solución, favoreciendo un
imidazolinio en condiciones desde casi neutras a ácidas, y como un
anillo abierto \beta-amino-amida
en condiciones básicas. Además de los métodos de preparación
adición-deshidratación, puede formarse un anillo
imidazolinio mediante la N-alquilación de la
imidazolina correspondiente (Fig. 5) [Anderson et al. 1986;
Gruseck et al. 1987; Fernandez et al. 1987; Salerno
et al. 1992; Perillo et al. 1975] a través de una
ciclación de ión nitrilio [Leonard 1965; Pfeil et al. 1965;
Leonard et al. 1967], o por una reacción de ciclación de una
sal de diazapentadinio [Lloyd et al. 1978].
Los sistemas de imidazolinio se han desarrollado
como tensioactivos para uso como inhibidores de corrosión. Además,
se han preparado lípidos de imidazolinio, y se han formulado con ADN
en un complejo [Lasic et al. 1997], y con ADN para un
sistema de distribución liposómica in vivo [Niven et
al. 1998]. También, se han preparado polímeros de imidazolina e
imidazolinio (Fig. 6). Estos sistemas de polímeros han encontrado
uso como ayudantes de floculación para el desaguado de lodos. Los
autores de la invención muestran ahora que los sistemas de amidinio
policíclico son útiles para la distribución de ácido nucleico a las
células.
La hidrólisis de amidas es un método bien
conocido en la técnica y puede realizarse con procedimientos
catalizados tanto por ácidos como por bases (Fig. 7). Ambos métodos
dan como resultado la formación de 1 equivalente de ácido
carboxílico (o ión carboxilato) y 1 equivalente de amina (o ión de
amonio), y son fundamentalmente irreversibles. Generalmente, la
hidrólisis de amida catalizada por bases es menos fiable que la
hidrólisis ácida y por tanto, generalmente, no se usa. La
hidrólisis de amida no es tan fácil como la hidrólisis de ésteres y,
normalmente, requiere condiciones más rigurosas, tales como
temperatura elevada.
Poliimidazolinio: Un poliimidazolinio es
un polímero (copolímero aleatorio, copolímero de bloques u otro
copolímero) que contiene dos o más subunidades imidazolinio. Un
poliimidazolinio significa, también, un homopolímero de la
subunidad imidazolinio. La subunidad imidazolinio puede estar en la
cadena principal del polímero o como una cadena lateral fuera de la
cadena principal del polímero. El polímero puede ser un polímero
neutro neto, un policatión o un polianión.
Subunidad imidazolinio: En un
imidazolinio (subunidad imidazolinio), los sustituyentes R1, R2, R3,
R4a, R4b, R5a y R5b (Fig. 3) pueden ser, independientemente, un
radical hidrógeno o un radical carbono con cualquier sustitución.
El contraión (X) puede ser cualquier contraión. Los contraiones
incluyen pero no se limitan a cloruro, bromuro, yoduro y tosilato.
Un anillo de imidazolinio puede formarse mediante la
N-alquilación de la imidazolina correspondiente
(Fig. 5).
Poli-2-imidazolina:
Una poli-2-imidazolina es un
polímero (polímero aleatorio o polímero de bloques) que contiene 2
o más subunidades imidazolina. Una
poli-2-imidazolina significa,
también, un homopolímero de la subunidad
2-imidazolina. La subunidad imidazolina puede estar
en la cadena principal del polímero o como una cadena lateral fuera
de la cadena principal del polímero. El polímero puede ser un
polímero neto neutro neto, un policatión o un polianión.
Subunidad 2-imidazolina:
En una 2-imidazolina (subunidad imidazolina), los
sustituyentes R1, R2, R4a, R4b, R5a y R5b (Fig. 8) pueden ser,
independientemente, un radical hidrógeno o un radical carbono con
cualquier sustitución.
Poli(1,3-piperazinio):
Un poli(1,3-piperazinio) es un polímero
(copolímero aleatorio, copolímero de bloques u otro copolímero) que
contiene 2 o más subunidades 1,3-piperazinio. Un
poli(1,3-piperazinio) significa, también, un
homopolímero de la subunidad 1,3-piperazinio. La
subunidad 1,3-piperazinio puede estar en la cadena
principal del polímero o como una cadena lateral fuera de la cadena
principal del polímero. El polímero puede ser un polímero neutro
neto, un policatión o un polianión.
1,3-piperazinio (Subunidad
1,3-piperazinio) (Fig. 9): En un
1,3-piperazinio (subunidad
1,3-piperazinio), los sustituyentes R1, R2, R3,
R4a, R4b, R5a, R5b, R6a y R6b pueden ser, independientemente, un
radical hidrógeno o un radical carbono con cualquier sustitución.
El contraión (X) puede ser cualquier contraión. Los contraiones
incluyen pero no se limitan a cloruro, bromuro, yoduro y
tosilato.
Los polímeros de amidinio policíclico pueden
prepararse a partir de una clase de polímeros denominados
polietileniminas. Las propias polietileniminas se han usado
frecuentemente en el área de la distribución de ácido nucleico. La
polietilenimina se conoce en dos versiones preparadas mediante dos
procesos de polimerización característicos. La polietilenimina
ramificada (brPEI) se prepara por polimerización de aziridina
(etilenimina) (Fig. 10). Durante la reacción de polimerización, las
aminas primaria y secundaria formadas pueden actuar como
nucleófilos, atacando otra molécula de aziridinio para producir una
estructura muy ramificada. La composición de brPEI
comercialmente disponible se ha evaluado recientemente que contiene
una proporción de los grupos aminos de amina primaria : amina
secundaria : amina terciaria de 1:1:1 [Kissel 2000]. La brPEI
se puede polimerizar, también, en condiciones de que se obtenga un
grado inferior de ramificación, dando como resultado una proporción
de los grupos aminos de amina primaria : amina secundaria : amina
terciaria de 1:2:1.
Se ha mostrado que la polietilenimina lineal
(lPEI) exhibe una inferior citotoxicidad si se compara con
la brPEI y es un eficaz agente de transferencia de genes.
[Boussif et al. 1995; Behr 1999; Reny 1998; Patente de
Estados Unidos Nº 6.013.240; Park et al. 2001]. La PEI lineal
se obtiene mediante una polimerización de apertura de anillo de la
N-alquil-2-oxazolina,
seguido por desprotección inducida por ácidos de la amida
resultante (Fig. 11). El polímero se representa por la fórmula
general:
HO-(CH_{2})_{2}N-(CH_{2}-CH_{2}-NH)_{n}-(CH_{2})_{2}-N-R,
en la que el grupo R se deriva del iniciador usado en la reacción
de polimerización (la figura representa el oxazolinio final que es
hidrolizado al hidroxilo terminal). Por ejemplo, se la
polimerización se inicia con yoduro de metilo, el grupo R en la
estructura sería CH_{3}. La PEI lineal vendida para aplicaciones
de terapia génica [Polyplus-transfección SAS
(JetPEI); Fermentas (ExGen500)], se ha descrito como un polímero
lineal de etilamina, que contiene todas las aminas secundarias, como
se representa en la figura.
Las polietileniminas pueden acilarse en el átomo
de nitrógeno según métodos bien conocidos en la técnica. Los
polímeros resultantes tienen cuatro enlaces carbonilo de amida a
partir de una amina. Estos polímeros pueden recogerse en soluciones
acuosas a pH 8 o inferior, y calentarse suavemente o almacenarse
durante períodos a temperatura ambiente para facilitar la reacción
de ciclación para formar el anillo de amidinio cíclico, en concreto
un anillo de imidazolinio. El polímero resultante es, por tanto, una
combinación de etilenimina,
N-acil-etilenimina (de amidas que no
ciclan), y monómeros de imidazolinio sustituidos en posición 2. La
proporción de los monómeros en el polímero final puede controlarse
por el nivel de acilación de la polietilenimina. Además, se
contempla la funcionalidad adicional puede incluirse fácilmente en
el sistema uniendo la funcionalidad a un átomo de nitrógeno en la
polietilenimina mediante una acilación. La amida resultante estaría
disponible para experimentar la reacción de ciclación,
proporcionando un imidazolinio 2-sustituido que
contiene la funcionalidad atada a la posición 2 del anillo de
imidazolinio.
El tamaño de un complejo de ácido
nucleico/policatión puede ser un factor para la distribución de
genes a las células, particularmente in vivo. Habitualmente,
el tamaño de un ácido nucleico de interés es grande, demasiado
grande para facilitar la distribución sin compactar, o condensar, el
ácido nucleico. Para la distribución in vivo, el complejo
necesita cruzar la barrera endotelial para alcanzar las células
parenquimales. Los ventanales más grandes del endotelio (agujeros
en la barrera endotelial) aparecen en el hígado y tienen diámetros
medios de 100 nm. Los poros trans-epiteliales en
otros órganos son mucho más pequeños. El endotelio del músculo, por
ejemplo, puede describirse como una estructura que tiene un gran
número de pequeños poros, de radio 4 nm, y un número muy bajo de
grandes poros con un radio de 20-30 nm. El tamaño
del complejo puede, también, ser importante para la absorción
celular, siendo las partículas más pequeñas las más fácilmente
endocitadas.
Hay dos métodos principales para compactar el
ácido nucleico: 1. Se ha mostrado que los cationes multivalentes
con una carga de tres o superior condensan espontáneamente el ácido
nucleico en condiciones tampón apropiadas. Estos cationes
multivalentes incluyen espermidina, espermina,
Co(NH_{3})_{6}^{3+}, Fe^{3+} y polímeros
naturales o sintéticos tales como histona H1, protamina, polilisina
y polietilenimina. Un análisis ha mostrado que la condensación de
ácido nucleico se ve favorecida cuando el 90% o más de las cargas a
lo largo de la cadena principal azúcar-fosfato se
neutralizan [Wilson et al. 1979]. 2. Los polímeros (neutros o
aniónicos) pueden incrementar la repulsión entre el ácido nucleico
y su entorno, y se ha mostrado que compactan el ácido nucleico. Lo
más significativamente, se ha mostrado que el proceso espontáneo de
automontaje y agregación del ácido nucleico resulta de la
restricción de grandes cantidades de ácido nucleico, debido al
efecto del volumen excluido. [Strzelecka 1990a; Strzelecka 1990b].
Ya que el auto-montaje se asocia con soluciones
densas de ácido nucleico local o macroscópicamente, se espera que
la inserción de ácido nucleico en pequeñas cavidades de agua con un
tamaño comparable al ácido nucleico tenderá a formar estructuras,
monomoleculares u oligomoleculares, compactas.
El mecanismo de condensación de ácido nucleico
no está claro. La fuerza electrostática entre hélices no perturbadas
se eleva principalmente a partir de un mecanismo de fluctuación del
contraión que requiere cationes multivalentes y juega un papel
principal en la condensación del ácido nucleico. Las fuerzas de
hidratación predominan sobre las fuerzas electrostáticas cuando las
hélices del ácido nucleico se acercan más que unos pocos diámetros
de agua. En un ejemplo de interacciones de ácido nucleico/policatión
polímero, la condensación de ácido nucleico es un proceso más
complicado que el ejemplo de policationes de bajo peso molecular.
Diferentes proteínas policatiónicas pueden generar formaciones en
toroide y en varilla con un ácido nucleico en una proporción de
carga positiva a negativa de 2-5. Los complejos de
ADN T4 con poliarginina o histona pueden formar dos tipos de
estructuras; una estructura alargada con una longitud del eje mayor
de aproximadamente 350 nm (como ADN libre) y partículas esféricas
densas. Ambas formas existen simultáneamente en la misma solución.
La razón para la coexistencia de las dos formas puede explicarse
como una distribución irregular de las cadenas de policatión entre
las moléculas de ácido nucleico. La distribución irregular genera
dos conformaciones termodinámicamente favorables.
La movilidad electroforética de los complejos de
ácido nucleico/policatión puede cambiar de negativo a positivo en
presencia de policatión en exceso. Probablemente es que los grandes
policationes no se alinean completamente a lo largo del ácido
nucleico sino que forman bucles de polímero que interaccionan con
otras moléculas de ácido nucleico. La rápida agregación y las
grandes fuerzas intermoleculares entre diferentes moléculas de
ácido nucleico pueden impedir el lento ajuste entre hélices
necesario para formar partículas compacta y ordenadamente
empaquetadas.
Los polímeros de amidinio policíclico pueden
prepararse tal que tengan suficiente carga positiva para formar
complejos con el ácido nucleico. Alternativamente, los monómeros de
amidinio cíclico y los pequeños monómeros de amidinio policíclico
pueden polimerizarse usando un proceso denominado de polimerización
por plantilla. Los cationes de bajo peso molecular con valencia, es
decir carga, <+3 no condensan el ADN en soluciones acuosas en
condiciones normales. Sin embargo, las moléculas catiónicas con la
carga <+3 pueden polimerizarse en presencia de ácido
polinucleico y los polímeros resultantes pueden causar que el ácido
polinucleico condense en estructuras compactas. Tal método se
conoce en la química de los polímeros sintéticos como polimerización
por plantilla. Durante este proceso, los monómeros (que están
inicialmente débilmente asociados con la plantilla) se colocan a lo
largo de la cadena principal de la plantilla, fomentando de ese modo
su polimerización. La débil asociación electrostática del polímero
activo y de la plantilla se vuelve más fuerte con el crecimiento de
la cadena del polímero. Trubetskoy et al usaron dos tipos de
reacciones de polimerización para lograr la condensación del ADN:
polimerización por etapas y polimerización en cadena [Trubetskoy
et al. 1998; U.S. 08/778.657; U.S 09/000.692; U.S.
97/24.089; U.S. 09/070.299; y U.S. 09/464.871]. La
bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD), una tetramina con 2,5 cargas positivas por molécula a pH 8
se polimerizó en presencia de ADN plásmido usando los reticuladores
divisibles de disulfuro amino-reactivos
ditiobis-(succinimidil-propionato) y
dimetil-3,3'-ditiobis-propionimidato.
Ambas reacciones produjeron complejos ADN/polímero con un retraso
significativo en la electroforesis de geles de agarosa, demostrando
así una unión significativa y condensación de ADN. Blessing et
al usaron un derivado de bis-tiol de espermina
y una reacción de intercambio tiol-disulfuro para
activar el crecimiento de la cadena. La presencia de ADN aceleró la
reacción de polimerización que se midió por la velocidad de
desaparición de los tioles libres en la mezcla de reacción
[Blessing et al. 1998].
Para incrementar la estabilidad de un complejo
poli(amidinio cíclico)/ácido nucleico el polímero puede
reticularse. La estabilidad de las partículas de ácido nucleico,
basadas en la condensación de ácido polinucleico, es generalmente
baja in vivo o en presencia de otros polianiones porque los
complejos se comprometen fácilmente en reacciones de intercambio de
polianiones. El proceso de intercambio consta de dos etapas: 1)
formación rápida de un complejo triple ácido
nucleico-policatión-polianión, 2)
sustitución lenta de un polianión (ácido nucleico) con otro. En
condiciones de equilibrio, este proceso da como resultado la
formación de un nuevo complejo binario y un exceso de un tercer
polianión. La presencia de una sal de bajo peso molecular puede
acelerar enormemente tales reacciones de intercambio, que a menudo
dan como resultado el completo desmontaje de las partículas de ácido
nucleico condensadas. En consecuencia, es deseable obtener
estructuras más coloidalmente estables en las que el ácido nucleico
sea retenido en forma condensada en el complejo con el policatión
independiente de las condiciones ambientales.
En los complejos típicos ácido
nucleico/policatión, en los que el ácido nucleico se condensa
completamente, las cargas positivas desapareadas en el policatión
quedan disponibles. Si el policatión contiene grupos reactivos,
tales como aminas primarias, estas cargas positivas desapareadas
pueden modificarse. Esta modificación permite posibilidades
prácticamente ilimitadas de modular las propiedades coloidales de
los complejos mediante modificaciones químicas del complejo. Los
autores de la invención han demostrado la utilidad de tales
reacciones usando un sistema
ADN/poli-L-lisina (ADN/PLL)
reticulado con el reactivo de reticulación bifuncional
dimetil-3,3'-ditiobispropionimidato
(DTBP) que reacciona con grupos amino primarios [Trubetskoy et
al. 1999b; documentos U.S. 08/778.657; U.S. 09/000.692; U.S.
97/24.089; U.S. 09/070.299; y U.S. 09/464.871]. Resultados similares
se lograron con otros policationes incluyendo
poli(alilamina) e histona H1. El uso de otro reactivo
bifuncional, glutaraldehído, se ha descrito por estabilización de
complejos de ADN con péptido catiónico CWK18 [Adam et al.
1999].
La aproximación de enjaulado descrita
anteriormente puede conducir a partículas que contienen ácido
nucleico condensado más coloidalmente estables. Sin embargo, para
algunas aplicaciones de distribución puede desearse alterar la
carga superficial de un complejo ácido nucleico/policatión. El
fenómeno de recargar la superficie es bien conocido en la química
coloidal y se describe en gran detalle por sistemas
lipófobos/lipófilos (por ejemplo, hidrosoles de haluro de plata).
La adición de poli-ion a una suspensión de
partículas de látex con la superficie con carga opuesta conduce a
la absorción permanente de este poli-ion sobre la
superficie y, después de alcanzar la estequiometría apropiada,
invertir la carga de la superficie. Los autores de la invención han
demostrado que puede lograrse la estratificación similar de
polielectrolitos sobre la superficie de las partículas de
ADN/policatión [Trubetskoy et al. 1999c]. El principal
complejo ADN-policatión (ADN/pC) usado en este
estudio era el ADN/PLL (relación de carga 1:3) formado en tampón
poco salino HEPES de 25 mM y recargado con cantidades crecientes de
varios polianiones. Las partículas de ADN se caracterizaban después
de añadir un tercer componente poli-ion a un
complejo ADN/policatión [Trubetskoy et al. 1999c]. Se
encontró que ciertos polianiones, tales como poli(ácido
metacrílico) y poli(ácido aspártico), descondensaban ADN en
complejos de ADN/PLL. Polianiones de densidad de carga inferior,
tales como PLL y poli(ácido glutámico) succinilados, no
descondensaban ADN en los complejos ADN/PLL (1:3) incluso cuando se
añadían a PLL 20 veces en exceso de carga. Estudios adicionales han
encontrado que los efectos de desplazamiento dependen de las sales.
Las medidas del potencial-\zeta de las partículas
de ADN/PLL durante la titulación con SPLL reveló el cambio de carga
superficial de la partícula en aproximadamente el punto de
equivalencia de la carga. Por ello, puede concluirse que la adición
de polianión de baja densidad de carga a las partículas catiónicas
de ADN/PLL da como resultado la inversión de la carga superficial
de la partícula mientras se mantiene intacto el núcleo del ADN
condensado. Por último, los complejos de ADN/policatión pueden ser
tanto recargados como reticulados o enjaulados [U.S. 08/778.657,
U.S. 09/000.692, U.S. 97/24.089, U.S. 09/070.299 y U.S. 09/464.871].
Esta capa de polianión que se recarga puede reticularse para sí
misma o para los policationes en el complejo para aumentar la
estabilidad
coloidal.
coloidal.
Varias modificaciones de las partículas de ácido
nucleico/catión se han creado para eliminar las interacciones no
específicas de las partículas de ácido
nucleico-catión y la toxicidad de las partículas
catiónicas. Ejemplos de estas modificaciones incluyen la unión de
estabilizantes estéricos, por ejemplo, polietilenglicol, que
inhiben las interacciones no específicas entre el catión y los
polianiones biológicos.
Un polímero es una molécula aumentada
mediante uniones repetitivas entre sí de unidades más pequeñas
denominadas monómeros. En esta aplicación, el término polímero
incluye tanto oligómeros, que tienen de dos a aproximadamente 80
monómeros, y polímeros que tienen más de 80 monómeros. El polímero
puede ser de los tipos de polímero lineal, de red ramificada, de
estrella, de peine, o de rosario. El polímero puede ser un
homopolímero en el que se usa un solo monómero o puede ser un
copolímero en el que se usan dos o más monómeros. Los tipos de
copolímeros incluyen alternantes, aleatorios, de bloques o
injertados.
Para los especialistas en la técnica de la
polimerización, hay varias categorías de procesos de polimerización
que pueden ser utilizados en el procedimiento descrito. La
polimerización puede ser en cadena o por etapas. Esta descripción
de la clasificación se usa más frecuentemente que la terminología
previa de polímero de adición y de condensación. "La mayoría de
las polimerizaciones por reacción en etapas son procesos de
condensación y la mayoría de las polimerizaciones por reacción en
cadena son procesos de adición" [Stevens 1990]. La polimerización
por plantilla puede usarse para formar polímeros a partir de
polímeros hijos.
La polimerización en cadena: En la
polimerización por reacción en cadena el crecimiento del polímero
tiene lugar por adición sucesiva de unidades de monómero hasta un
número limitado de cadenas en crecimiento. Los mecanismos de
iniciación y propagación son diferentes y hay normalmente una etapa
de terminación de la cadena. La velocidad de polimerización
permanece constante hasta que el monómero se consume. Los monómeros
que contienen (pero no se limitan a ellos) grupos vinilo, acrilato,
metacrilato, acrilamida y metacrilamida pueden experimentar
reacción en cadena que puede ser por radicales, aniónica o
catiónica. La polimerización en cadena puede también realizarse
mediante polimerización por apertura de ciclo o de anillo. Varios
tipos diferentes de iniciadores por radicales libres podían usarse
que incluyen peróxidos, hidroxiperóxidos, y azocompuestos tales como
dihidrocloruro de
2,2'-azo-bis-(amidinopropano)
(AAP).
\vskip1.000000\baselineskip
En los procesos de polimerización pueden usarse
una gran variedad de monómeros. Estos incluyen monómeros orgánicos
de carga positiva tales como sales de aminas, imidina, guanidina,
imina, hidroxilamina, hidroziina, de heterociclo (sales) como
imidazol, piridina, morfolina, pirimidina o pireno. Las aminas
podían ser sensibles al pH en el que el pKa de la amina está dentro
del intervalo fisiológico de 4 a 8. Aminas específicas incluyen
espermina, espermidina,
N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina
(AEPD) y bromuro de
3,3'-diamino-N,N-dimetildipropilamonio.
Los monómeros también pueden ser hidrófobos,
hidrófilos o anfifáticos. Los compuestos anfifáticos tienen partes
tanto hidrófilas (solubles en agua) como hidrófobas (insolubles en
agua). Los grupos hidrófilos indican en términos cualitativos que
el resto químico prefiere agua. Típicamente, tales grupos químicos
son solubles en agua y son dadores o aceptores de enlaces de
hidrógeno con el agua. Ejemplos de grupos hidrófilos incluyen
compuestos con los siguientes restos químicos: carbohidratos,
polioxietilenos, péptidos, oligonucleótidos y grupos que contienen
aminas, amidas, alcoxi-amidas, ácidos carboxílicos,
azufres o hidroxilos. Grupos hidrófobos indican en términos
cualitativos que el resto químico evita el agua. Típicamente, tales
grupos químicos no son solubles en agua y no tienden a formar
enlaces de hidrógeno. Los hidrocarburos son grupos hidrófobos.
Los monómeros pueden ser, también, agentes
intercalantes tales como acridina, naranja de tiazol, o bromuro de
etidio. Los monómeros pueden contener, también, restos químicos que
pueden ser modificados antes o después de la polimerización
incluyendo (pero no limitándose a eso) aminas (primaria, secundaria
y terciaria), amidas, ácido carboxílico, éster, hidroxilo,
hidracina, haluro de alquilo, aldehído y cetona.
Un policatión es un polímero que contiene una
carga neta positiva. El policatión puede contener unidades monómeras
que son de carga positiva, de carga neutra o de carga negativa, sin
embargo, la carga neta del polímero debe ser positiva. Un
policatión también puede significar una molécula no polímera que
contiene dos o más cargas positivas. Un polianión es un polímero
que contiene una carga neta negativa, por ejemplo ácido
poliglutámico. El polianión puede contener unidades monómeras que
son de carga negativa, de carga neutra o de carga positiva, sin
embargo, la carga neta en el polímero debe ser negativa. Un
polianión puede significar, también, una molécula no polímera que
contiene dos o más cargas negativas. El término polianión incluye
policatión, polianión, polímeros híbridos y polímeros neutros. El
término híbrido se refiere al producto (sal) de la reacción entre un
grupo ácido y un grupo básico que forman parte de la misma
molécula.
Los polímeros tienen otros grupos funcionales
que incrementan su utilidad. Estos grupos pueden incorporarse en el
monómero antes de la formación del polímero o unirse al polímero
después de su formación.
Grupo funcional. Los grupos funcionales
incluyen señales que se dirigen a las células, señales de
localización nuclear, compuestos que realzan la liberación de los
contenidos desde endosomas u otras vesículas intracelulares (que
liberan señales), y otros compuestos que alteran el comportamiento o
las interacciones del compuesto o complejo al que están unidos.
Señales que se dirigen a la célula son
cualquiera de las señales que realzan la asociación del polímero
biológicamente activo con una célula. Estas señales pueden
modificar un polímero biológicamente activo tal como un fármaco o
un ácido nucleico y pueden dirigirlo a una posición de la célula
(tal como un tejido) o una posición en una célula (tal como el
núcleo) en un cultivo o en un organismo completo. La señal puede
incrementar la unión del compuesto a la superficie de la célula y/o
su asociación con un compartimento intracelular. Modificando la
posición celular o del tejido del gen foráneo, puede realzarse la
función del polímero biológicamente activo. La señal que se dirige
a la célula puede ser, pero no se limita a, una proteína, un
péptido, un lípido, un esteroide, un azúcar, un carbohidrato, un
ácido polinucleico (sin expresar) o un compuesto sintético. Las
señales que se dirigen a la célula tales como los ligandos refuerzan
la unión celular a los receptores. Se han usado diversos ligandos
que dirigen fármacos y genes a células y a receptores celulares
específicos. El ligando puede buscar una diana dentro de la
membrana celular, en la membrana celular o cerca de una célula. La
unión de los ligandos a los receptores inicia típicamente la
endocitosis. Los ligandos incluyen agentes que se dirigen al
receptor asialoglucoproteína usando residuos de asialoglucoproteína
o galactosa. Otras proteínas tales como insulina, EGF o
transferrina pueden usarse para el direccionamiento. Los péptidos
que incluyen la secuencia RGD pueden usarse para direccionarse a
muchas células. Los grupos químicos que reaccionan con grupos tiol,
sulfhidrilo o disulfuro en las células pueden también usarse para
dirigirse a muchos tipos de células. Folato y otras vitaminas
pueden usarse también para ser direccionados. Otros grupos de
direccionamiento incluyen moléculas que interaccionan con membranas
tales como lípidos, ácidos grasos, colesterol, compuestos de
DANSILO y derivados de anfotericina. Además, las proteínas víricas
pueden usarse para unir células.
Después de la interacción de un compuesto o
complejo con la célula, pueden usarse otros grupos de
direccionamiento para incrementar la distribución del polímero
biológicamente activo a ciertas partes de la célula.
Las señales de localización nuclear
realzan el direccionamiento del compuesto farmacéutico en las
proximidades del núcleo y/o su entrada en el núcleo durante la
interface del ciclo celular. Tales señales de transporte nuclear
pueden ser una proteína o un péptido tal como el NLS antígeno T
grande SV40 o el NLS nucleoplasmino. Estas señales de localización
nuclear interaccionan con diversos factores de transporte nuclear
tal como el receptor NLS (carioferina alfa) que después interactúa
con carioferina beta. Las propias proteínas de transporte nuclear
podían también funcionar como NLS ya que son direccionadas al poro
nuclear y al núcleo. Por ejemplo, la propia carioferina beta podía
direccionar el ADN al complejo del poro nuclear. Varios péptidos se
han derivado del antígeno T SV40. Otros péptidos NLS se han
derivado de la proteína hnRNP A1, del nucleoplasmino, del
c-myc, etc.
Muchos polímeros biológicamente activos, en
particular compuestos grandes y/o cargados, son incapaces de cruzar
las membranas biológicas. Para que estos compuestos entren en las
células, o las células deben absorberlos por endocitosis, es decir,
en endosomas, o debe haber una ruptura de la membrana celular que
permita al compuesto cruzar. En el caso de la entrada endosómica,
la membrana endosómica debe romperse para permitir el movimiento
fuera del endosoma y en el interior del citoplasma. Cualquier camino
de entrada en la célula requiere una ruptura o alteración de la
membrana celular. Los compuestos que rompen las membranas o
promueven la fusión de la membrana se denominan compuestos con
membrana activa. Estos compuestos con membrana activa o que
liberan señales, realzan la liberación de material endocitado desde
los compartimentos intracelulares tales como endosomas (tempranos y
tardíos), lisosomas, fagosomas, vesícula, retículo endoplásmico,
aparato de Golgi, red trans-Golgi (TGN) y retículo
sarcoplásmico. La liberación incluye el movimiento fuera de un
compartimiento intracelular en el citoplasma o en un orgánulo tal
como el núcleo. Las señales que se liberan incluyen productos
químicos tales como la clorocina, bafilomicina o Brefeldin A1 y la
señal que retiene ER (secuencia KDEL), componentes víricos tales
como los péptidos HA-2 de la subunidad hemaglutinina
del virus de la gripe y otros tipos de péptidos anfifáticos. El
control de cuándo y dónde es activo el compuesto con membrana activa
es crucial para un transporte eficaz. Si el agente con membrana
activa funciona en un cierto tiempo y lugar facilitaría el
transporte del polímero biológicamente activo a través de la
membrana biológica. Si el compuesto con membrana activa es
demasiado activo o activo en el tiempo equivocado, entonces no tiene
lugar ningún transporte o el transporte está asociado con la
ruptura celular y la muerte celular. La naturaleza ha desarrollado
varias estrategias para tener en cuenta el transporte a la membrana
de polímeros biológicamente activos que incluyen fusión de la
membrana y el uso de compuestos con membrana activa cuya actividad
se modula tal que la actividad ayuda al transporte sin toxicidad.
Muchas formulaciones de transporte basadas en lípidos cuentan con la
fusión de la membrana y algunas actividades de péptidos con
membrana activa se modulan mediante el pH. En particular, las
proteínas que revisten los virus son a menudo sensibles al pH,
inactivas a pH neutro o básico, y activas en las condiciones ácidas
encontradas en el endosoma.
Otro grupo funcional comprende compuestos, tales
como polietilenglicol, que disminuyen las interacciones entre las
moléculas y ellos mismos, y con otras moléculas. Tales grupos son
útiles en las interacciones limitantes tales como entre los
factores séricos y la molécula o el complejo a ser distribuido.
Por distribuido, los autores quieren indicar que
el polinucleótido u otro polímero biológicamente activo llega a
asociarse con la célula. El polinucleótido u otro polímero
biológicamente activo puede estar en la membrana de la célula o
dentro del citoplasma, del núcleo o de otro orgánulo de la célula.
El proceso de distribuir un ácido nucleico a una célula se ha
denominado comúnmente transfección o el proceso de
transfectar y, también, se ha denominado transformación. El término
transfectar usado aquí se refiere a la introducción de un ácido
nucleico foráneo u otro polímero biológicamente activo en las
células. El polímero biológicamente activo podía usarse con fines
investigadores o para producir un cambio en una célula que puede ser
terapéutico. La distribución de ácido nucleico con fines
terapéuticos se denomina comúnmente terapia génica. La distribución
del ácido nucleico puede conducir a la modificación del material
genético presente en la célula diana. El término transfección
estable o establemente transfectado se refiere, generalmente, a la
introducción e integración de ácido nucleico exógeno en el genoma
de la célula transfectada. El término transfectante estable se
refiere a una célula que ha integrado de forma estable el ácido
nucleico foráneo en el ADN genómico. La transfección estable puede
también obtenerse usando vectores episómicos que se replican durante
la división celular eucariótica (por ejemplo, vectores ADN plásmido
que contienen un papiloma virus origen de replicación, cromosomas
artificiales). El término transfección transitoria o transfectado
de forma transitoria se refiere a la introducción de ácido nucleico
foráneo en una célula en la que el ácido nucleico foráneo no se
integra en el genoma de la célula transfectada. Un polímero
biológicamente activo es un compuesto que tiene el potencial para
reaccionar con compuestos biológicos. Los compuestos farmacéuticos,
proteínas, péptidos, hormonas, citocinas, antígenos y ácidos
nucleicos son ejemplos de polímeros biológicamente activos. Estos
procesos pueden usarse para transferir ácidos nucleicos o
biolomoléculas en células o en un organismo tal como en la
distribución de fármacos, o pueden usarse, también, en métodos
analíticos.
Un sistema de distribución es el medio
por el que un polímero biológicamente activo llega a ser
distribuido. Es decir, todos los compuestos, incluyendo el propio
polímero biológicamente activo, que se requieren para la
distribución y todos los procedimientos que se requieren para la
distribución incluyendo la forma (tal volumen y fase (sólido,
líquido o gas)) y método de administración (tal como pero sin
limitarse a los métodos de distribución orales o subcutáneos).
El término polinucleótido, o ácido nucleico o
ácido polinucleico, es un término de la técnica que se refiere a un
polímero que contiene al menos dos nucleótidos. Los nucleótidos son
unidades monómeras de polímeros polinucleótidos. Los
polinucleótidos con menos de 120 unidades monómeras se llaman, a
menudo, oligonucleótidos. Los ácidos nucleicos naturales tienen una
cadena principal de desoxirribosa-fosfato o de
ribosa-fosfato. Un polinucleótido artificial o
sintético es cualquier polinucleótido que sea polimerizado in
vitro o en un sistema de células libre y contiene la misma base
o bases similares pero puede contener una cadena principal de un
tipo distinto de la cadena principal de
ribosa-fosfato natural. Estas cadenas principales
incluyen: PNA (ácidos péptido-nucleicos),
fosforotioatos, fosforodiamidatos, morfolinos y otras variantes de
la cadena principal fosfato de los ácidos nucleicos naturales. Las
bases incluyen purinas y pirimidinas, que además incluyen los
compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo,
inosina y análogos naturales. Derivados sintéticos de purinas y
pirimidinas incluyen, pero no se limitan a, modificaciones que
colocan nuevos grupos reactivos tales como, pero sin limitarse a,
aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y haluros de alquilo. El
término base abarca cualquiera de los conocidos análogos de bases
de ADN y ARN incluyendo, pero sin limitarse a,
4-acetil-citosina,
8-hidroxi-N-6-metil-adenosina,
aziridinil-citosina,
pseudo-isocitosina,
5-(carboxihidroximetil)uracilo,
5-fluoro-uracilo,
5-bromo-uracilo,
5-carboximetil-aminometil-2-tiouracilo,
5-carboximetil-aminometil-uracilo,
dihidro-uracilo, inosina,
N-6-isopentenil-adenina,
1-metil-adenina,
1-metil-pseudo-uracilo,
1-metil-guanina,
1-metil-inosina,
2,2-dimetil-guanina,
2-metil-adenina,
2-metil-guanina,
3-metil-citosina,
5-metilcitosina,
N-6-metil-adenina,
7-metil-guanina,
5-metilaminometil-uracilo,
5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo,
beta-D-manosil-queosina,
5'-metoxicarbonilmetil-uracilo,
5-metoxi-uracilo,
2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina,
éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético,
oxi-butoxosina, pseudo-uracilo,
queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metil-uracilo, éster metílico del
ácido
N-uracil-5-oxiacético,
ácido uracil-5-oxiacético,
pseudo-uracilo, queosina,
2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.
El término polinucleótido incluye ácido desoxirribonucleico (ADN) y
ácido ribonucleico (ARN) y combinaciones de ADN y ARN, y otros
nucleótidos naturales y sintéticos.
El ADN puede estar en forma de cADN, ADN
polimerizado in vitro, ADN plásmido, partes de un ADN
plásmido, material genético derivado de un virus, ADN lineal,
vectores (P1, PAC, BAC, YAC, cromosomas artificiales), casetes de
expresión, secuencias quiméricas, ADN recombinante, ADN cromosómico,
un oligonucleótido, ADN antisentido, o derivados de estos grupos.
El ARN puede estar en forma de oligonucleótido ARN, tARN (ARN
transferente), snARN (ARN nuclear pequeño)), rARN (ARN ribosómico),
mARN (ARN mensajero), ARN polimerizado in vitro, ARN
recombinante, secuencias quiméricas, ARN antisentido, siARN (ARN
interferente pequeño), ribocimas, o derivados de estos grupos. Un
polinucleótido antisentido es un polinucleótido que interfiere con
la función de ADN y/o ARN. Los polinucleótidos antisentido
incluyen, pero no se limitan a: morfolinos,
2'-O-metil polinucleótidos, ADN,
ARN y similares. El siARN comprende una estructura de doble hebra
que contiene, típicamente, de 15-50 pares de bases
y, preferiblemente, 21-25 pares de bases, y que
tiene una secuencia de nucleótidos idéntica o casi idéntica a un
gen o ARN diana expresado dentro de la célula. La interferencia
puede dar como resultado la supresión de la expresión. El
polinucleótido puede ser una secuencia cuya presencia o expresión en
una célula altera la expresión o función de los genes o ARN
celulares. Además, el ADN y el ARN pueden ser de hebra simple,
doble, triple o cuádruple. El polinucleótido con hebra doble, triple
y cuádruple puede contener tanto ARN como ADN u otras combinaciones
de ácidos nucleicos naturales y/o sintéticos.
Un polinucleótido distribuido puede estar dentro
del citoplasma o del núcleo aparte del material genético endógeno.
De forma alternativa, el ADN puede recombinarse con (llegar a ser
parte de) el material genético endógeno. La recombinación puede
causar que el ADN se inserte en el ADN cromosómico mediante
cualquier recombinación homóloga o no homóloga.
Un polinucleótido puede ser distribuido a una
célula para expresar una secuencia exógena de nucleótidos, para
inhibir, eliminar, aumentar o alterar la expresión de una secuencia
endógena de nucleótidos o para afectar a una característica
fisiológica específica no asociada, de forma natural, con la célula.
Los polinucleótidos pueden contener una casete de expresión
codificada para expresar una proteína completa o parcial, o ARN. Una
casete de expresión se refiere a un polinucleótido natural o
producido de forma recombinante que puede expresar un gen o genes.
El término recombinante usado aquí se refiere a una molécula
de polinucleótido que está comprendida de segmentos de
polinucleótidos unidos entre sí por medio de técnicas de biología
molecular. La casete contiene la región codificante del gen de
interés junto con cualquier otra secuencia que afecta a la expresión
del gen. Una casete de expresión de ADN incluye, típicamente, un
activador (que permite el inicio de la transcripción), y una
secuencia que codifica una o más proteínas. Opcionalmente, la casete
de expresión puede incluir, pero no se limita a, reforzadores de
transcripción, secuencias no codificantes, señales de corte y
empalme, señales de terminación de la transcripción y señales de
poliadenilación. Una casete de expresión de ARN incluye,
típicamente, un codón de iniciación de la traducción (que permite
el inicio de la traducción), y una secuencia que codifica una o más
proteínas. Opcionalmente, la casete de expresión puede incluir, pero
no se limita a, señales de terminación de la traducción, una
secuencia de poliadenosina, sitios internos de entrada de ribosoma
(IRES) y secuencias no codificantes.
El polinucleótido puede contener secuencias que
no desempeñan una función específica en la célula diana pero se
usan en la generación del polinucleótido. Tales secuencias incluyen,
pero no se limitan a, secuencias requeridas para la replicación o
selección del polinucleótido en un organismo anfitrión.
Un polinucleótido puede usarse para modificar
las secuencias de ADN genómico o extracromosómico. Esto puede
lograrse distribuyendo un polinucleótido que es expresado.
Alternativamente, el polinucleótido puede efectuar un cambio en la
secuencia de ADN o de ARN de la célula diana. Esto puede lograrse
por hibridación, formación de polinucleótido multihebra,
recombinación homóloga, transformación del gen u otros mecanismos
todavía por
describir.
describir.
El término gen se refiere, generalmente,
a una secuencia de polinucleótidos que comprende secuencias
codificantes necesarias para la producción de un polinucleótido
terapéutico (por ejemplo, ribocima) o un polipéptido o precursor.
El polipéptido puede ser codificado mediante una secuencia
codificante de longitud completa o mediante cualquier parte de la
secuencia codificante con tal de que se mantengan las deseadas
propiedades de actividad o funcionales (por ejemplo, actividad
enzimática, unión de ligandos, transducción de señal) del
polipéptido de longitud completa o del fragmento. El término
abarca, también, la región codificante de un gen y las secuencias
de inclusión situadas adyacentes a la región codificante en los
extremos tanto 5' como 3' para una distancia de aproximadamente 1
kb o más en cualquier extremo tal que el gen corresponde a la
longitud del mARN de longitud completa. Las secuencias que se
sitúan en el 5' de la región codificante y que están presentes en el
mARN se denominan secuencias no traducidas 5'. Las secuencias que
se sitúan en 3' o aguas abajo de la región codificante y que están
presentes en el mARN se denominan secuencias no traducidas 3'. El
término gen abarca tanto cADN como las formas genómicas de un gen.
Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante
interrumpida con secuencias no codificantes denominadas intrones,
regiones intermedias o secuencias intermedias. Los intrones son
segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear. Los intrones
pueden contener elementos reguladores tales como reforzadores. Los
intrones se separan o se cortan y empalman del transcrito nuclear o
primario; los intrones, por tanto, están ausentes en el transcrito
del ARN mensajero (mARN). El mARN funciona durante la traducción
especificando la secuencia u orden de aminoácidos en un polipéptido
activo. El término secuencias no codificantes se refiere, también,
a otras regiones de una forma genómica de un gen que incluye, pero
sin limitarse a, activadores, reforzadores, sitios de unión del
factor de transcripción, señales de poliadenilación, sitios
internos de entrada del ribosoma, silenciadores, secuencias
aislantes y regiones de unión a la matriz. Estas secuencias pueden
estar presentes cerca de la región codificante del gen (dentro de
10.000 nucleótidos) o en sitios distantes (más de 10.000
nucleótidos). Estas secuencias no codificantes influyen en el nivel
o velocidad de transcripción y de traducción del gen. La
modificación covalente de un gen puede influir en la velocidad de
transcripción (por ejemplo, metilación del ADN genómico), la
estabilidad del mARN (por ejemplo, longitud de la cola de
poliadenosina en 3'), velocidad de traducción (por ejemplo, el
casquete 5'), reparación de ácido nucleico e inmunogenicidad. Un
ejemplo de modificación covalente de ácido nucleico supone la acción
de reactivos Label IT (Mirus Corporation, Madison, WI).
El término expresión del gen, usado aquí,
se refiere al procedimiento para transformar la información genética
codificada en un gen en ARN (por ejemplo, mARN, rARN, tARN o snARN)
por transcripción de un gen desoxirribonucleico (por ejemplo,
mediante la acción enzimática de ARN-polimerasa), y
para genes que codifican proteínas, en la proteína por traducción
de mARN. La expresión del gen puede regularse en muchas etapas del
proceso. La regulación por incremento o activación se refiere a la
regulación que aumenta la producción de productos de expresión del
gen (es decir, ARN o proteína), mientras la regulación por
decremento o represión se refiere a la regulación que disminuye la
producción. Las moléculas (por ejemplo, factores de transcripción)
que están involucradas en la regulación por incremento o en la
regulación por decremento se denominan, a menudo, activadoras y
represoras, respectiva-
mente.
mente.
Un polímero biológicamente activo es un
compuesto que tiene el potencial para reaccionar con componentes
biológicos. Más particularmente, los polímeros biológicamente
activos utilizados en esta memoria descriptiva se diseñan para
cambiar los procesos naturales asociados con una célula viva. Para
los fines de esta memoria descriptiva, un proceso natural celular
es un proceso que está asociado con una célula antes de la
distribución de un polímero biológicamente activo. Los polímeros
biológicamente activos pueden seleccionarse del grupo que comprende:
compuestos farmacéuticos, proteínas, péptidos, polipéptidos,
hormonas, citocinas, antígenos, virus, oligonucleótidos, y ácidos
nucleicos o polinucleótidos.
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Ejemplo
1
La polietilenimina lineal sustituida con
N-propionilo (10% de aminas aciladas, 90% de
etilamina por 1H NMR, Polysciences, Inc., 1H NMR (D_{2}O, sal
sódica del ácido
2,2,3,3-d4-3-(trimetilsilil)-propiónico
como patrón interno) \delta 3,65-3,45, m, 6H;
\delta 3,15-2,80, m, 47H; \delta 2,46, q, 2H;
\delta 1,09, t, 3H) se disolvió en agua hasta una concentración
de 20 mg/ml. El pH de la solución se ajustó a pH 5,0 con ácido
hidroclórico (12 M). La solución se dividió en dos partes. Una
parte se colocó a 4ºC durante 48 h. La segunda parte se colocó a
37ºC durante 48 h. Se obtuvo el perfil de exclusión por tamaño para
cada muestra (250 \mug en 250 \mul de solución salina tamponada
Hepes, BioCad-Sprint, Perseptive Biosystems, Inc.,
columnas de Eichrome Technologies, SPCCS201-30 y
SPCCS203-30 conectadas en serie, eluyente de NaCl
0,2 M, controlado a \lambda210 y \lambda240. Las trazas para las
muestras eran fundamentalmente idénticas, indicando que el peso
molecular del polímero no era afectado por el proceso. La única
diferencia observada en el ejemplo era que la muestra a 37ºC tenía
una absorbancia mucho mayor a \lambda240. Se obtuvieron los
espectros UV para cada muestra (0,2 mg/ml en H_{2}O, \lambda 190
nm-300 nm). La muestra almacenada a 4ºC exhibió una
\lambdamáx a 205 nm, que era idéntica al material inicial de la
reacción (material inicial no mostrado). La muestra mantenida a 37ºC
exhibió un \lambdamáx a 235 nm. Los espectros IR para cada
muestra mostraron señales muy similares, con ligeras diferencias en
la región de 1240-1300 cm^{-1} y en la región de
1550-1640 cm^{-1}. El análisis por 1H NMR indicó
(D_{2}O, sal sódica del ácido
2,2,3,3-d4-3-(trimetilsilil)-propiónico
como patrón interno) \delta 3,91, s, 8,2H; \delta
3,65-3,45, m, 15,6H; \delta
3,15-2,80, m, 131H; \delta 2,66, q, 4,4H; \delta
2,46, q, 2H; \delta 1,22, t, 7,6H, \delta 1,09, t, 3H. Las
nuevas señales a \delta 3,91, \delta 2,66 y \delta 1,22 son
consecuentes con el sistema de anillo de imidazolinio. La 1H NMR
apoya la atribución de 3,3% de aminas aciladas, 7,26% de
imidazolinio y 89,1% de etilamina. Estos resultados muestran que
las secciones de etilamina original permanecen y que el nuevo
sistema de anillo surge con una disminución correspondiente en la
amida (Fig. 12).
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Ejemplo
2
Las mismas muestras generadas en el Ejemplo 1 se
formularon en preparados que contenían ADN para la transferencia de
genes sistémicos por vía intravenosa. Se formaron dos complejos.
Complejo I. El pADN (50 \mug, 25 \mul de una solución acuosa de
2 \mug/\mul) se diluyó con HEPES 10 mM, glucosa 0,29 M, pH 7,5
(200 \mul). A esta solución se añadió la muestra a 4ºC (400
\mug, 20 \mul de una solución acuosa de 20 mg/ml). A esta
solución se añadió ácido poliacrílico (50 \mug, 5 \mul de una
solución acuosa de 10 mg/ml).
Complejo II. El pADN (50 \mug, 25 \mul de
una solución acuosa de 2 \mug/\mul) se diluyó con HEPES 10 mM,
glucosa 0,29 M, pH 7,5 (200 \mul). A esta solución se añadió la
muestra a 37ºC (400 \mug, 20 \mul de una solución acuosa de 20
mg/ml). A esta solución se añadió ácido poliacrílico (50 \mug, 5
\mul de una solución acuosa de 10 mg/ml).
Usando una aguja de calibre 30, de 0,5 pulgadas
(1,27 cm), se realizaron inyecciones de 250 \mul del complejo en
la vena de la cola en ratones ICR (Complejo I, n=4; Complejo II,
n=3). A los 30 min después de la inyección, a los animales se les
inyectó ácido poliacrílico (1500 \mug, 150 \mul de una solución
acuosa de 10 mg/ml). Un día después de la inyección, los animales
fueron sacrificados, y se realizaron ensayos de luciferasa en las
muestras de pulmón. La expresión de la luciferasa se determinó como
se ha informado previamente [Wolff et al. 1990]. Se usó un
luminómetro Lumat LB 9507 (EG&G Berthold,
Bad-Wildbad, Alemania). Los resultados, resumidos
en la Fig. 14, indican que el complejo de poliimidazolinio es más
eficaz en la transferencia del gen al pulmón que la polietilenimina
lineal sustituida con 10% con N-propionilo.
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Ejemplo
3
La polietilenimina lineal sustituida con
N-propionilo (10% de aminas aciladas, 90% de
etilamina mediante 1H NMR, Polysciences, Inc.) se disolvió en agua
a una concentración de 20 mg/ml, y el pH se ajustó a 7,4. De este
patrón, se prepararon dos muestras, una en la que el pH se elevó a
8, y una segunda muestra con un pH de 5. Las muestras se calentaron
a 37ºC durante 64 h y se analizaron mediante espectroscopía UV. Se
obtuvieron los espectros UV para cada muestra (0,2 mg/ml en
H_{2}O, \lambda 190 nm-300 nm). La muestra
almacenada a pH 5 mostró el mayor incremento en absorbancia a
\lambda235-240. La muestra a pH 8 también mostró
un incremento en absorbancia a \lambda235-240,
indicando que la ciclación tiene lugar por encima de pH 8 (Fig.
15).
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Ejemplo
4
Síntesis de MC1016 (monoadición) y MC1017
(diadición). La N,N'-dimetiletilendiamina (500 mg,
11,3 mmol amina, Aldrich Chemical Company) se transfirió a matraz
de fondo redondo desecado con llama y se recogió con diclorometano
(100 ml, 0,1 M). A la solución resultante se añadió
diisopropiletilamina (0,99 ml, 730 mg, 5,67 mmol, Aldrich Chemical
Company) y la solución se agitó a temperatura ambiente bajo
nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo
seco/acetona. A la solución de reacción se añadió, durante 5
minutos, gota a gota, con agitación, cloruro de propionilo (0,49
ml, 525 mg, 5,67 mmol, Aldrich Chemical Company). La reacción se
dejó calentar, con agitación y bajo nitrógeno, a temperatura
ambiente. Después de 30 min a temperatura ambiente, la mezcla de
reacción se analizó mediante TLC (cromatografía de capa fina) y
espectroscopía de masas (Sciex API 150EX) para verificar que la
reacción era completa. La mezcla se concentró a presión reducida, y
una parte (100 mg) se llevó con H_{2}O. Esta solución se purificó
mediante HPLC (columna C18 de Aquasil, TFA al 0,1%/H_{2}O y TFA al
0,1%/MeCN como eluyente, con un gradiente 10-90%
(orgánico) durante 20 min, velocidad de elución de 1 ml/min, las
fracciones se recogieron a 210 nm). Las fracciones
1-6 (de dos series) se concentraron a presión
reducida, y se liofilizaron para dar
N,N-dimetiletilendiamina monopropionilada en forma
de un sólido blanco (MC1016, 91,7 mg, Fig. 16), analizado mediante
espectroscopía de masas (Sciex API 150EX). La fracción 10 (de dos
series) se concentró a presión reducida, y se liofilizó para dar
N,N'-dimetiletilendiamina
N,N'-dipropionilada en forma de un sólido blanco
(MC1017, 7,8 mg, Fig. 16), analizado mediante espectroscopía de
masas (Sciex API 150EX).
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Ejemplo
5
La N,N-dimetiletilendiamina
monopropionilada (MC1016) se recogió en agua hasta una
concentración final de 20 mg/ml. El pH de la solución se ajustó a pH
5 con HCl concentrado. La solución resultante se calentó a 70ºC
durante 72 h. La muestra se analizó por espectroscopía UV (Fig.
17). El análisis indicó un incremento en la absorción a \lambda210
nm para la solución calentada respecto a la muestra almacenada a
4ºC.
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Ejemplo
6
La pentaetilenhexamina (10 mg, 0,043 mmol,
Aldrich Chemical Company) se recogió en diclorometano (1 ml). La
solución se enfrió en un baño de hielo bajo nitrógeno, y se añadió
cloruro de acetilo (3,4 mg, 0,043 mmol, Aldrich). La solución se
dejó calentar a temperatura ambiente y se concentró a presión
reducida. El aceite resultante se recogió en agua hasta una
concentración de 20 mg/ml, y el pH se ajustó a 7 con HCl (6 M). La
muestra se dividió en dos partes. La muestra 1 se dejó a
temperatura ambiente mientras la muestra 2 se calentó a 80ºC.
Después de 48 h, las muestras se analizaron por espectroscopía UV
(Espectrofotómetro Beckman DU530; Fig. 18). Los resultados
indicaron un incremento de absorbancia a
\lambda230-235 para las muestras tanto a
temperatura ambiente como a 80ºC.
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Ejemplo
7
Se prepararon tres muestras de poliimidazolinio
a partir de
poli(2-etil-2-oxazolina),
que estaba desaminada al 90% (PolySciences), disolviendo el
polímero hasta 20 mg/ml en agua, ajustando el pH a 7,4, y realizando
la ciclación por incubación a elevada temperatura. El
Poliimidazolinio 1 se preparó 6 semanas antes de usar, y se dejó
asentar a temperatura ambiente. El Poliimidazolinio 2 se preparó 4
semanas antes de usar y se dejó asentar a temperatura ambiente. El
Poliimidazolinio 3 se preparó inmediatamente antes de usar. Los tres
preparados de poliimidazolinio se analizaron por espectroscopía UV
(\lambda190 nm-300 nm; Fig. 19). El
Poliimidazolinio 1 mostró un gran incremento en absorbancia a
\lambda235, mientras que para Poliimidazolinio 2, este pico
estaba presente pero en una menor cantidad. El poliimidazolinio no
mostró absorbancia a \lambda235. Los tres preparados de
poliimidazolinio se usaron para elaborar varios complejos.
Complejo I. Se diluyó pADN (150 \mug, 75
\mul de una solución acuosa de 2 \mug/\mul) con HEPES 10 mM,
glucosa 0,29 M, pH 7,5 (600 \mul). A esta solución se añadió
poliimidazolinio 1 (1200 \mug, 60 \mul de una solución acuosa
de 20 mg/ml). A esta solución se añadió ácido poliacrílico (150
\mug, 15 \mul de una solución acuosa de 10 mg/ml).
Complejo II. Se diluyó pADN (150 \mug, 75
\mul de una solución acuosa de 2 \mug/\mul) con HEPES 10 mM,
glucosa 0,29 M, pH 7,5 (600 \mul). A esta solución se añadió
poliimidazolinio 2 (1200 \mug, 60 \mul de una solución acuosa
de 20 mg/ml). A esta solución se añadió ácido poliacrílico (150
\mug, 15 \mul de una solución acuosa de 10 mg/ml).
Complejo III. Se diluyó pADN (150 \mug, 75
\mul de una solución acuosa 2 \mug/\mul) con HEPES 10 mM,
glucosa 0,29 M, pH 7,5 (600 \mul). A esta solución se añadió
poliimidazolinio 3 (1200 \mug, 60 \mul de una solución acuosa
de 20 mg/ml). A esta solución se añadió ácido poliacrílico (150
\mug, 15 \mul de una solución acuosa de 10 mg/ml).
Las inyecciones en la vena de la cola de 250
\mul del complejo se realizaron en ratones ICR (n=3) usando una
aguja de calibre 30 de 0,5 pulgadas (1,27 cm). A los 30 minutos
después de la inyección, a los animales se les inyectó ácido
poliacrílico (1500 \mug, 150 \mul de una solución de 10 mg/ml en
agua). Un día después de la inyección, los animales fueron
sacrificados, y se realizó un ensayo de luciferasa en tejido del
pulmón. Se usó un luminómetro Lumat LB 9507 (EG&G Berthold,
Bad-Wildbad, Alemania). Los resultados se resumen en
la tabla siguiente:
Los resultados indican que las formulaciones de
poliimidazolinio distribuyen pADN al pulmón.
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Ejemplo
8
Se formaron varios complejos para la
transfección de las células. Se disolvió polietilenimina lineal
sustituida con N-propionilo (10% de aminas
aciladas, 90% de etilamina mediante 1H NMR, Polysciences, Inc.,
lPEI10%NPr en agua hasta una concentración de 20 mg/ml. El
pH de la solución se ajustó a pH 7,5 con ácido hidroclórico (12 M).
El polimidazolinio derivado de este polímero se utilizó también en
la formación del complejo.
Las células 3T3 se mantuvieron en DMEM.
Aproximadamente 24 horas antes de la transfección, las células se
llevaron a placas en una densidad apropiada en placas de 48 pocillos
y se incubaron durante la noche. Los cultivos se mantuvieron en una
atmósfera humidificada que contenía 5% de CO_{2} a 37ºC. La
cantidad indicada de complejo se combinó, entonces, con las células
en 1 ml de medio de cultivo. Las células se recolectaron después de
24 h y se analizó la actividad de la luciferasa usando un
luminómetro Lumat LB 9507 (EG&G Berthold,
Bad-Wildbad, Alemania). La cantidad de expresión de
luciferasa se registró en unidades lumínicas relativas (ULR). Los
números son los promedios de dos pocillos separados.
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Los resultados indican que el poliimidazolinio
puede transfectar células 3T3 con menor eficacia que la
lPEI10%NPr en esas condiciones. La lPEI10%NPr mostró
un perfil de toxicidad (juzgado por la confluencia final) similar
al polímero de poliimidazolinio.
\newpage
Ejemplo
9
La polietilenimina lineal sustituida con
N-propionilo (10% de aminas aciladas, 90% de
etilamina mediante 1H NMR, PolySciences, Inc.), se disolvió en agua
hasta una concentración de 20 mg/ml. El pH de la solución se ajustó
a pH 7,5 con ácido hidroclórico (12 M), y se formó poliimidazolinio
(PI) a elevada temperatura. Las muestras se recargaron con varias
cantidades de ácido poliacrílico (10 mg/ml de solución acuosa).
Las células HUH-7 se mantuvieron
en DMEM. Aproximadamente 24 h antes de la transfección, las células
se llevaron a placas en una densidad apropiada en placas de 48
pocillos y se incubaron durante la noche. Los cultivos se
mantuvieron en una atmósfera humidificada que contenía 5% de
CO_{2} a 37ºC. La cantidad indicada de complejo se combinó,
entonces, con las células en 1 ml de medio de cultivo. Las células
se recolectaron después de 24 h y se analizó la actividad de
luciferasa usando un luminómetro Lumat LB 9507 (EG&G Berthold,
Bad-Wildbad, Alemania). La cantidad de expresión de
luciferasa se registró en unidades lumínicas relativas. Los números
son los promedios para dos pocillos separados.
Los resultados indican que las formulaciones de
poliimidazolinio recargadas son eficaces en la transfección de
células HUH-7.
Ejemplo
10
La polietilenimina lineal sustituida con
N-propionilo (lPEI10%NPr, 10% de aminas
aciladas, 90% de etilamina mediante 1H NMR, PolySciences, Inc.), se
disolvió en agua hasta una concentración de 20 mg/ml. El pH de la
solución se ajustó a pH 7,5 con ácido hidroclórico (12 M). Una
parte de esta solución se usó para formar el poliimidazolinio (PI)
manteniendo la solución a elevada temperatura. Las muestras se
recargaron con varias cantidades de ácido poliacrílico (10 mg/ml de
solución acuosa).
Las células HUH-7 se mantuvieron
en DMEM. Aproximadamente 24 h antes de la transfección, las células
se llevaron a placas en una densidad apropiada en placas de 48
pocillos y se incubaron durante la noche. Los cultivos se
mantuvieron en una atmósfera humidificada que contenía 5% de
CO_{2} a 37ºC. La cantidad indicada de complejo se combinó
después con las células en 1 ml de medio de cultivo. Las células se
recolectaron después de 24 h y se analizó la actividad de la
luciferasa usando un luminómetro Lumat LB 9507 (EG&G Berthold,
Bad-Wildbad, Alemania). La cantidad de expresión de
luciferasa se registró en unidades lumínicas relativas. Los números
son los promedios para dos pocillos separados.
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Los resultados indican que el polímero
poliimidazolinio es eficaz en la transfección de células
HUH-7 como un complejo recargado tanto binario como
ternario. Los resultados indican que el complejo recargado es más
eficaz que la partícula correspondiente en el polímero no
ciclado.
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Ejemplo
11
A una solución de
2-metil-2-imidazolina
(52,7 mg, 0,626 mmol, Aldrich Chemical Company) en 3 ml de
acetonitrilo se añadió yoduro de metilo (86 \mul, 1,377 mmol,
Aldrich Chemical Company). La solución resultante se calentó a
reflujo. Después de 3 días, la solución se retiró del calor y se
añadió éter dietílico para precipitar las sales. El precipitado
resultante se secó en vacío. El material se analizó por
espectroscopía de masas (Sciex API 150EX) e indicó una mezcla de
yoduro de 1,2-dimetilimidazolinio (M=99), yoduro de
1,2,3-trimetilimidazolinio (M=113) y
1,1,4-trimetil,
4-acil-etilendiamina (M+1 = 145). La
mezcla se analizó por espectroscopía UV (Espectrofotómetro Beckman
DU530), e indicó un cambio en \lambdamáx de 214 nm a 224 nm para
la muestra de yoduro de imidazolinio respecto a la imidazolina de
partida (Fig. 20).
\newpage
Ejemplo
12
A una solución de
2-metil-2-imidazolina
(200 mg, 2,38 mmol, Aldrich Chemical Company) en 5 ml de DMF se
añadió éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (458
\mul, 2,38 mmol, Aldrich Chemical Company). La solución se calentó
a reflujo durante 1,5 h y el gel polímero resultante se lavó con
éter dietílico. La mezcla se analizó por espectroscopía UV
(Espectrofotómetro Beckman DU 530), e indicó un hombro de
absorbancia de \lambda235 nm para el polímero de imidazolinio,
indicando la incorporación del sistema de anillo en el polímero.
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Ejemplo
13
A una solución de
2-metil-2-imidazolina
(200 mg, 2,38 mmol, Aldrich Chemical Company) en 5 ml de DMF se
añadió epiclorohidrina (186 \mul, 2,38 mmol, Aldrich Chemical
Company). La solución se calentó a reflujo durante 16 h y el gel
polímero resultante se precipitó con éter dietíco. La mezcla se
analizó por espectroscopía UV (Espectrofotómetro Beckman DU 530), e
indicó una absorbancia a \lambda235 nm para el polímero de
imidazolinio, indicando la incorporación del sistema de anillo en
el polímero (Fig. 21).
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Ejemplo
14
A una solución de poliepiclorohidrina (102,9
mg, 1,48 mmol en Cl_{2}) en 2 ml de acetonitrilo, se añadió
2-metil-2-imidazolina
(125 mg, 1,48 mmol, Aldrich Chemical Company). La solución se
calentó a reflujo durante 16 h y el polímero resultante se precipitó
con éter dietílico. El precipitado se analizó por espectroscopía UV
(Espectrofotómetro Beckman DU 530), e indicó un nuevo hombro de
absorbancia de \lambda220 nm para el polímero de imidazolinio,
indicando la incorporación del sistema de anillo en el polímero
(Fig. 22).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
A. A una solución de
2-etil-2-oxazolina
(5,00 g, 50,4 mmol en amida, Aldrich Chemical Company) en 40 ml de
agua se añadió HCl (conc., 2,05 ml, 25,2 mmol, 0,5 equiv.) gota a
gota durante varios minutos. La solución resultante se calentó a
reflujo durante 56 h. El pH se neutralizó a pH 7 con NaOH (12 M). La
solución se concentró a presión reducida y se recogió en EtOH y se
filtró para retirar el NaCl. La filtración de etanol se repitió 5
veces para dar un copolímero de las siguientes subunidades:
etil-amina, 2-etilimidazolinio y
N-propionil-etil-amina.
Las proporciones de las subunidades se determinaron por 1H NMR
siendo 88,9%, 4,9% y 6,2%, respectivamente.
B. A una solución de
2-etil-2-oxazolina
(5,00 g, 50,4 mmol en amida, Aldrich Chemical Company), en 40 ml de
agua se añadió HCl (conc., 2,67 ml, 32,8 mmol, 0,65 equiv.) gota a
gota durante varios minutos. La solución resultante se calentó a
reflujo durante 56 h. El pH se neutralizó a pH 7 con NaOH (12 M). La
solución se concentró a presión reducida y se recogió en EtOH y se
filtró para retirar el NaCl. La filtración de etanol se repitió 5
veces para dar un copolímero de las siguientes subunidades:
etil-amina, 2-etilimidazolinio y
N-propionil-etil-amina.
Las proporciones de las subunidades se determinaron por 1H NMR
siendo 92,8%, 4% y 3,2%, respectivamente.
C. A una solución de
2-etil-2-oxazolina
(5,00 g, 50,4 mmol en amida, Aldrich Chemical Company) en 40 ml de
agua se añadió HCl (conc., 3,48 ml, 42,8 mmol, 0,85 equiv.) gota a
gota durante varios minutos. La solución resultante se calentó a
reflujo durante 56 h. El pH se neutralizó a pH 7 con NaOH (12 M). La
solución se concentró a presión reducida y se recogió en EtOH y se
filtró para retirar el NaCl. La filtración de etanol se repitió 5
veces para dar un copolímero de las siguientes subunidades:
etil-amina, 2-etilimidazolinio y
N-propionil-etil-amina.
Las proporciones de las subunidades se determinaron por 1H NMR
siendo 95%, 3,35% y 1,65%, respectivamente.
D. A una solución de
2-etil-2-oxazolina
(5,00 g, 50,4 mmol en amida, Aldrich Chemical Company) en 40 ml de
agua se añadió HCl (conc., 6,14 ml, 75,6 mmol, 1,5 equiv.) gota a
gota durante varios minutos. La solución resultante se calentó a
reflujo durante 48 h. El pH se neutralizó, haciéndolo básico, hasta
pH 14 con NaOH (12 M). La solución se calentó a reflujo durante 16
h. Después de 16 h, el pH se neutralizó a pH 7 con HCl (conc.). La
solución se concentró a presión reducida y se recogió en EtOH y se
filtró para retirar el NaCl. La filtración de etanol se repitió 5
veces para dar un copolímero de las siguientes subunidades:
etil-amina, 2-etilimidazolinio y
N-propionil-etil-amina.
Las proporciones de las subunidades se determinaron por 1H NMR
siendo 100%, 0% y 0% respectiva-
mente.
mente.
\newpage
E. A una solución de
2-etil-2-oxazolina
(5,00 g, 50,4 mmol en amida, Aldrich Chemical Company) en 40 ml de
agua se añadió NaOH (3,024 g, 75,6 mmol, Aldrich Chemical Company)
en partes adecuadas durante varios minutos. El polímero empezó a
desaparecer a medida que el pH se incrementaba. La suspensión
resultante se calentó a reflujo durante 56 h. El pH se neutralizó a
pH 7 con HCl (conc.). La solución se concentró a presión reducida y
se recogió en EtOH y se filtró para retirar el NaCl. La filtración
de etanol se repitió 5 veces para dar un copolímero de las
siguientes subunidades: etil-amina,
2-etilimidazolinio y
N-propionil-etil-amina.
Las proporciones de las subunidades se determinaron por 1H NMR
siendo % a nivel de trazas, % a nivel de trazas y 98%,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
A una solución de hidrocloruro de
polivinilamina (40 mg, 0,503 mmol en amina, 25 K, Aldrich Chemical
Company) en 400 \mul de agua se añadió diisopropiletilamina (35
\mul, 1,00 mmol, Aldrich Chemical Company), seguido de anhídrido
acético (9,6 \mul, 0,503 mmol, Aldrich Chemical Company). La
solución resultante se agitó durante 12 h, y se dividió en dos
partes de igual tamaño. La Muestra 1 (MC 1025) se calentó a 70ºC
durante 16 h. La muestra 2 (MC1026) se almacenó a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
A una solución de hidrocloruro de polialilamina
(40 mg, 0,428 mmol en amina, 15 K, Aldrich Chemical Company) en 400
\mul de agua se añadió diisopropiletilamina (30 \mul, 0,855
mmol, Aldrich Chemical Company), seguido de anhídrido acético (8,1
\mul, 0,428 mmol, Aldrich Chemical Company). La solución
resultante se agitó durante 12 h, y se dividió en dos partes de
igual tamaño. La Muestra 1 (MC 1029) se calentó a 70ºC durante 16 h.
La muestra 2 (MC1030) se almacenó a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Se prepararon varios complejos para la
transfección in vitro de células 3T3-Luc.
Algunas formulaciones incluyen un lípido (MC 798), mientras que
otras están exentas de lípido. Las transfecciones se realizaron en
suero al 10%. Las células 3T3-Luc se mantuvieron en
DMEM. Aproximadamente 24 h antes de la transfección, las células se
llevaron a placas en una densidad apropiada en placas de 48
pocillos y se incubaron durante la noche. Los cultivos se
mantuvieron en una atmósfera humidificada que contenía 5% de
CO_{2} a 37ºC. La cantidad indicada de complejo que contenía siARN
anti-luciferasa (GL-2) y el
polímero indicado se combinaron después con las células en 1 ml de
medio de cultivo. Las células se recolectaron después de 24 horas y
se analizó la actividad de la luciferasa usando un luminómetro Lumat
LB 9507 (EG&G Berthold, Bad-Wildbad, Alemania).
La cantidad de expresión de luciferasa se registró en unidades
lumínicas relativas. Los números son los promedios de dos pocillos
separados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican que el siARN puede ser
distribuido a las células usando los polímeros indicados inhibiendo
así la expresión del gen luciferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
Se prepararon varios complejos para la
transfección in vitro de células HEPA. Las formulaciones
incluyen un lípido (MC798). Las transfecciones se realizaron en
suero al 10%. Las células HEPA se mantuvieron en DMEM.
Aproximadamente 24 horas antes de la transfección, las células se
llevaron a placas en una densidad apropiada en placas de 48 pocillos
y se incubaron durante una noche. Los cultivos se mantuvieron en
una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO_{2} a 37ºC. La
cantidad indicada de complejo se combinó entonces con las células en
1 ml de medio de cultivo. Las células se recolectaron después de 24
horas y se analizó la actividad de la luciferasa usando un
luminómetro Lumat LB 9507 (EG&G Berthold,
Bad-Wildbad, Alemania). La cantidad de expresión de
luciferasa se registró en unidades lumínicas relativas. Los números
son los promedios de dos pocillos separados.
Los resultados indican que el polímero de
poliamidinio puede transferir ADN a las células in vitro.
Lo anteriormente mencionado se considera sólo
ilustrativo de los principios de la invención. Además, como para
los especialistas en la técnica tendrán lugar, fácilmente, numerosas
modificaciones y cambios, no se desea limitar la invención a la
exacta construcción y al funcionamiento, mostrada y descrito. Por
tanto, todas las adecuadas modificaciones y equivalentes caen
dentro del alcance de la invención.
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Claims (19)
1. Una composición para distribuir un
polinucleótido a una célula que comprende un polímero que contiene
dos o más subunidades de amidinio cíclico de amidinio y el
polinucleótido.
2. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polinucleótido consiste en ADN.
3. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polinucleótido consiste en ARN.
4. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polinucleótido consiste en un siARN.
5. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio
cíclico consiste en un polimidazolinio.
6. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio
cíclico consiste en un
poli-1,3-piperazinio.
7. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio
cíclico consiste en un poli(anillo heterocíclico de 8
miembros con 1,3-nitrógeno).
8. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio
cíclico consiste en una polietilenimina parcialmente acilada.
9. La composición de la reivindicación 8, en la
que la polietilenimina parcialmente acilada consiste en un derivado
N-propionilado de polietilenimina.
10. La composición de la reivindicación 8, en la
que la polietilenimina consiste en polietilenimina lineal.
11. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio
cíclico consiste en polialilamina parcialmente acilada.
12. La composición de la reivindicación 1, en la
que el polímero que contiene dos o más subunidades de amidinio
cíclico consiste en polivinilamina parcialmente acilada.
13. La composición de la reivindicación 1, en la
que la célula consiste en una célula in vivo.
14. La composición de la reivindicación 13, en
la que la célula in vivo consiste en una célula de
pulmón.
15. La composición de la reivindicación 13, en
la que la célula in vivo consiste en una célula de
hígado.
16. La composición de la reivindicación 15, en
la que la célula de hígado consiste en un hepatocito.
17. Una composición para distribuir un
polinucleótido a una célula que comprende: un polímero que contiene
dos o más subunidades de amidinio cíclico, el polinucleótido, y un
polianión en un complejo en el que el complejo tiene un potencial
Zeta negativo.
18. Un proceso in vitro para distribuir
un polinucleótido a una célula que comprende: proporcionar una
composición definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17 y asociar la composición con la célula.
19. Una composición definida en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso como medicamento.
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