ES2328140T3 - Hsp60 del arthrobacter. - Google Patents
Hsp60 del arthrobacter. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2328140T3 ES2328140T3 ES04710796T ES04710796T ES2328140T3 ES 2328140 T3 ES2328140 T3 ES 2328140T3 ES 04710796 T ES04710796 T ES 04710796T ES 04710796 T ES04710796 T ES 04710796T ES 2328140 T3 ES2328140 T3 ES 2328140T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- acid sequence
- hsp60
- nucleic acid
- arthrobacter
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6043—Heat shock proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica el hsp60 del Arthrobacter seleccionado del grupo que consiste de: la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1, el ORF de la SEQ ID NO;1 a partir de los nucleótidos 953 a 2578 de la SEQ ID NO.1 y una secuencia que codifica la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No.2
Description
Hps60 del Arthrobacter.
La presente invención se relaciona con genes de
proteína de choque térmico (hsp) y proteínas codificadas a partir
de la Corynebacteria. En particular, se refiere a la secuencia de
ADN aislada y secuencia de aminoácido de hsp60 a partir del género
Arthrobacter, y las secuencias relacionadas. Además, la
invención se relaciona con usos de hsp60 del Arthrobacter en
la preparación de vacunas, especialmente vacunas para peces, como un
adyuvante, y como un portador de los antígenos.
Una vacuna exitosa contra patógenos
intracelulares no solo estimularan la respuesta inmune humoral, vía
ruta del Complejo de Histocompatibilidad Principal (MHC) clase II,
pero (más notablemente) también inducirán la destrucción de células
infectadas a través de la activación de la ruta de MHC clase I. La
última respuesta se logra a través de la degradación citosólica de
proteína invasora en células infectadas, de tal manera que los
fragmentos del material invasor se transportan a la superficie
celular para la presentación a las CDB+ células T citotóxicas
(CTL). La falla para activar la ruta de MHC clase I, es una
deficiencia común de vacunas basadas en antígenos recombinantes
purificados.
Las proteínas de choque térmico ("Hsps")
son una familia de proteínas chaperonas moleculares producidas por
células procariotas y eucariotas, y que juegan papeles esenciales en
una multitud de procesos intra- e intercelulares, en particular en
el procedimiento de antígeno y presentación de fragmentos de
antígeno al sistema de MHC I en la superficie celular.
Una cepa viva, no-virulenta de
Arthrobacter (un miembro de la familia de Corynebacteria) se
comercializa bajo el nombre "Renogen" en una vacuna destinada
a proteger el salmón y otros peces de la piscifactoría contra la
enfermedad renal bacteriana (BKD). Las características de esta cepa
se revelan en WO 98/33884. Esta vacuna es única en el sentido de que
es el primer cultivo vivo que ha sido autorizado para utilizar en la
acuicultura.
Sorprendentemente, en la actualidad se ha
demostrado que el hsp60 del Arthrobacter se puede emplear
efectivamente en vacunas para peces contra variados patógenos.
En un primer aspecto, la invención proporciona
una secuencia de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia
del gen hsp60 del Arthrobacter. El gen incluye el ORF, 5'UTR
y 3'UTR, y cualquier componente promotor, potenciador, regulador,
terminador y los elementos de localización.
En un segundo aspecto la invención proporciona
una secuencia de aminoácido aislada que comprende la secuencia de
la proteína del hsp60 del Arthrobacter.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición de vacuna que comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica una proteína del hsp60 del Arthrobacter o que
comprende una molécula de polipéptido del hsp60 del
Arthrobacter, o un extracto celular de Arthrobacter
enriquecido en hsp60. La composición de vacuna se puede utilizar en
la preparación de un medicamento para uso humano o veterinario,
incluyendo uso en acuicultura.
En otro aspecto la invención proporciona un kit
que comprende una composición de vacuna de acuerdo con la invención
y un antígeno heterólogo o una secuencia de ácido nucleico que
codifica un antígeno heterólogo, para la administración por
separado, secuencial o simultánea.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión
del conjunto de la proteína de hsp60 del Arthrobacter con un
polipéptido heterólogo. También se proporciona la proteína de
fusión por sí misma.
La invención también proporciona vectores de
expresión de ADN, que llevan secuencias del hsp60 del
Arthrobacter, incluyendo secuencias quiméricas, y una célula
huésped transformada con dicho vector de expresión de ADN.
En aún otro aspecto de la invención se
proporciona una entidad que comprende un polipéptido que comprende
toda o parte de la proteína del hsp60 del Arthrobacter, la
cual se une covalentemente o no-covalentemente a
una molécula heteróloga.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
el uso de la proteína de Arthrobacter hsp60 o una secuencia
de ácido nucleico como un antígeno de la vacuna, como un adyuvante,
o como un portador para moléculas heterólogas, con el objetivo de
tratar o prevenir enfermedades de animales. También se proporcionan,
los anticuerpos construidos contra el hsp60 del Arthrobacter
y sus usos médicos.
En otro aspecto se proporciona un método para
inducir o mejorar una respuesta inmune a un inmunógeno o un hapteno
en un animal, el método que comprende la administración a dicho
animal de una composición farmacéutica que comprende una secuencia
de aminoácido del hsp60 de acuerdo con la invención, la cual se une
covalentemente o no-covalentemente a una molécula
heteróloga, en donde la molécula heteróloga, comprende dicho
inmunógeno o hapteno.
En otro aspecto la invención proporciona un
método de tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad
infecciosa en un pez, que comprende la administración a dicho pez de
una composición de tratamiento que comprende una secuencia de ácido
nucleico de hsp60 o secuencia de aminoácido de acuerdo con la
invención.
SEQ ID NO:1 es la secuencia codificante de ADN
(5' a 3') del gen hsp60 aislado a partir del Arthrobacter
ATCC 55921 (nt. 953-2578), junto con una porción de
la secuencia de 5' UTR (nt. 1-952).
SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácido
pronosticada del ORF de la secuencia del gen hsp60 de la SEQ ID
NO:1.
Las secuencias novedosas del gen hsp60 de la
invención y la proteína purificada o aislada codificada se
proporcionan como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. Para
nuestra sorpresa, descubrimos que el hsp60 del Arthrobacter
comparte un CTL que estimula el epitope con Micobacteria, un
nonapéptido específico (Mhsp65(369-377)). La
secuencia de este epitope es KLAGGVAVI. Esto sugiere fuertemente que
el hsp60 del Arthrobacter puede activar la ruta de MHC clase
I, y es por consiguiente un agente estimulante inmunológico muy
prometedor.
También comprendidas dentro de las secuencias de
ácido nucleico de la invención están las secuencias de ácido
nucleico homólogas que hibridiza a la referencia SEQ ID NO:1 bajo
condiciones rigurosas. Las condiciones de hibridación
"rigurosas" en el sentido de la presente invención se definen
como aquellas descritos por Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989), 1.101-1.104, i.e. una señal de hibridación
positiva, aún se observa después de lavar por 1 hora con 1x solución
reguladora SSC y 0.1% de SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más
preferiblemente a 68ºC, en particular por 1 hora en 0.2 x solución
reguladora SSC y 0.1% de SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más
preferiblemente a 68ºC.
Las secuencias de ácido nucleico de hsp60 de la
invención pueden incorporar el Marco de Lectura Abierto (ORF) del
gen hsp60, y también pueden incorporar la 5' Región No traducida
(UTR), o cualquier porción de esta.
La lista de la secuencia del hsp60 del
Arthrobacter proporcionada aquí (SEQ ID NO:1) es la secuencia
del gen identificada por la clonación genómica que está presente en
Arthrobacter, y la SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácido
deducida de esta. Un cultivo de la cepa de Arthrobacter
fuente se depositó bajo el No. de Acceso ATCC 55921 con American
Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209) del 20 de Diciembre 1996.
Las proteínas hsp de la especie del mismo género
generalmente se conservan muy altamente, por lo que es de esperar
que las secuencias de los genes hsp60 y las proteínas nativas para
otra Corynebacteria, y especialmente otra especie
Arthrobacter, no difieran mucho de la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID
NO:2, respectivamente. El conocimiento de la secuencia del gen
hsp60 a partir de una especie Corynebacterial, facilita el
aislamiento de los mismos genes a partir de organismos
relacionados. Los procedimientos para el aislamiento de estos genes
son bien conocidos en el oficio.
Un gen hsp60 o la secuencia de ácido nucleico
"aislado", se entiende que significa el gen o la secuencia
diferente en su contexto natural dentro del genoma
Arthrobacter. El ADN que codifica el hsp60 se puede obtener a
partir de un biblioteca de cADN preparada de la materia celular que
expresa la hsp60 (hsps son ubicuas y se expresan en abundancia). El
gen que codifica hsp60 también se puede obtener de una biblioteca
genómica, siguiendo las etapas descritas en el Ejemplo 1, o por
síntesis de oligonucleótidos.
Las proteínas del hsp60 nativas, se pueden
aislar de fuentes de células bacterianas, mediante un esquema de
purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación
de proteínas. La identidad de la proteína se puede confirmar, por
ejemplo, por Western blotting o inmunoprecipitación utilizando
anticuerpos para el antígeno del hsp60 del Arthrobacter ATCC
55921. La secuenciación del aminoácido N-terminal se
puede utilizar para determinar las secuencias de aminoácido parcial
o completamente. Esto permite el diseño de sondas para facilitar el
aislamiento de la secuencia de hsp60 nativa a partir de una
biblioteca de cADN o genómica.
Las bibliotecas se pueden seleccionar con sondas
(tales como anticuerpos para el hsp60 o los oligonucleótidos de al
menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para
identificar el gen de interés o la proteína codificada por este.
Por ejemplo, las sondas se pueden diseñar para que sean homólogas a
las partes de la secuencia del gen del Arthrobacter,
revelada aquí. Alternativamente, las sondas pueden tener un alto
grado de homología con otros genes de hsp bacterianas, tales como
la secuencia del gen hsp60 Vibrio. La selección de la biblioteca
genómica o de cADN con la sonda seleccionada se puede conducir
utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en
Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio
alternativo para aislar el gen que codifica hsp60 es utilizar la
metodología de PCR (Sambrook et al., supra;
Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
Las secuencias identificadas en tales métodos de
selección de biblioteca se pueden comparar y alinear a la hsp60
revelada en SEQ ID NO:1 u otras secuencias de hsp conocidas,
depositadas y disponibles en bancos de datos públicos tales como
GenBank. La identidad de la secuencia (en tanto el aminoácido como
nivel de nucleótido) dentro de las regiones definidas de la
molécula o a través de la secuencia de cuerpo entero, se puede
determinar a través del alineamiento de la secuencia utilizando
programas de software de ordenador tales como BLAST,
BLAST-2, ALIGN, DNAstar, e INHERIT los cuales
emplean diferentes algoritmos para medir la homología.
El hsp60 del Arthrobacter se puede
utilizar como un adyuvante en forma pura o aislada en conjunción con
un antígeno. Un "adyuvante" como se define aquí es una
sustancia que aumenta no-específicamente la
respuesta inmune específica a un antígeno cuando se mezcla con el
antígeno antes de la administración, o cuando se administra por
separado en el mismo sitio. En un aspecto de la invención, la
proteína del hsp60 del Arthrobacter aislada o purificada se
utiliza como un adyuvante para una vacuna de animal, especialmente
una vacuna para peces. En una aplicación relacionada, el gen hsp60
o una porción de este se proporciona en un vector de ADN con objeto
de adyuvante de una vacuna de ácido nucleico. Dentro del alcance de
la invención se han proporcionado composiciones de la vacuna que
comprende las secuencias de aminoácido o del ácido nucleico de la
invención en conjunción con al menos otro antígeno o antígeno que
codifica la secuencia de ácido nucleico, y uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables. El otro antígeno puede ser un
recombinante o antígeno único aislado, o puede ser una mezcla de
moléculas de antígeno a partir de un patógeno.
El uso del hsp60 del Arthrobacter como un
adyuvante permite a los médicos y veterinarios alejarse del uso de
los tradicionales adyuvantes Micobacterianos vivos atenuados, que
presentan un riesgo para la salud de los animales debido al peligro
del retroceso a la cepa bacteriana virulenta. Existe un beneficio
adicional para la acuicultura en que la inyección del ácido
nucleico del hsp60 del Arthrobacter o proteína aislada en
peces no resulta en hinchazones desfigurantes o nódulos en el sitio
de inyección, que son comunes con adyuvantes convencionales y que
bajan el valor comercial de los peces.
La proteína del hsp60 del Arthrobacter
no es solamente efectiva en vacunas con adyuvantes que comprenden
otros antígenos, sino también tienen actividad inmunogénica en su
derecho propio. El hsp60 del Arthrobacter puede proporcionar
el principio activo de una vacuna para prevenir o tratar una
variedad de enfermedades humanas y veterinarias, incluyendo
enfermedades causadas por patógenos de peces, en particular, pero no
limitado a, SRS y BKD. En otro aspecto de la invención una
composición de vacuna comprende la proteína del hsp60 aislada o
purificada, como el único componente antigénico o inmunogénico,
junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
También se proporciona una composición de vacuna de ácido nucleico
que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de
ácido nucleico de hsp60 de la presente invención que codifica un
antígeno que es el único componente antigénico o inmunogénico de la
composición de vacuna, junto con uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables.
El potencial altamente inmunogénico de la hsp60
del Arthrobacter sugiere la posibilidad de preparar
conjugados covalentes del gen o péptido (por ejemplo, quimeras o
fusiones) de una proteína del hsp60 con una molécula heteróloga
(no-hsp60), generalmente, pero no limitado a, una
proteína no-hsp (por ejemplo, un hapteno). De esta
manera, la proteína del hsp60 del Arthrobacter actúa como un
portador libre de adyuvante para estimular la respuesta humoral e
inmune celular a la molécula heteróloga acompañante. Como se utiliza
aquí, el término "portador" se refiere a una molécula que
contiene epitopes de la célula T que, cuando se une covalentemente
a una segunda molécula, ayuda a provocar y potenciar la respuesta
inmune a la segunda molécula (que puede ser una proteína, péptido,
oligonucleótido o oligosacárido).
Esta metodología para desarrollar la vacuna es
particularmente ventajosa cuando el péptido antigénico afectado no
es muy grande y pobremente inmunogénico, sin embargo, sería un
objetivo apropiado para una vacuna. La molécula heteróloga lleva
mediante el hsp60 del Arthrobacter es ventajosamente una
proteína hapteno o una molécula no-proteína tal como
una fracción carbohidrato.
Como se utiliza aquí, una "proteína de
fusión" del hsp60 comprende un polipéptido de hsp60 ligado
operativamente a un polipéptido diferente (un "polipéptido
heterólogo"). Un "péptido heterólogo" o un "polipéptido
no-hsp60" se refiere a un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácido correspondiente a una proteína, la cual
no es sustancialmente homóloga a una proteína del hsp60. Dentro de
una proteína de fusión del hsp60, el polipéptido de hsp60 puede
corresponder a toda o una porción de una proteína del hsp60. Dentro
de la proteína de fusión, el término "ligado operativamente"
indica que el polipéptido del hsp60 y el polipéptido del
no-hsp60 se fusionan en marco uno al otro. El
polipéptido del no-hsp60 se puede fusionar al
N-terminal o C-terminal del
polipéptido del hsp60, o se puede insertar dentro del polipéptido de
hsp60.
Es posible unir un polipéptido del hsp60 y una
molécula heteróloga por medio de una unión covalente o
no-covalente, que no sea mediante la creación de
una proteína de fusión. Una "molécula heteróloga" es cualquier
molécula proteína, péptido, oligonucleótido o oligosacárido
diferente de una proteína del hsp60. Por ejemplo, se pueden
insertar grupos espaciadores químicos entre los polipéptidos, por
ejemplo, crear una molécula de fórmula general hsp60
-X-polipéptido heterólogo, donde X es un grupo
espaciador, tal como una secuencia corta de uno o más aminoácidos.
Alternativamente, el polipéptido del hsp60 puede ser ligado
covalentemente, de otra manera que a través de enlaces amida en una
cadena lineal de aminoácidos, por ejemplo por conjugación química o
por entrecruzamiento químico, luz (por ejemplo, UV)- o
radiación-inducida con la molécula
no-hsp. Los ligadores glutaraldehido y
mercapto-enlace, son ejemplos de apropiados
ligadores en cruz químicos. Las posibilidades específicas son EDC +
NHS o sulfo-NHS, sulfo-SMCC,
sulfo-SBED, y SAED, los cuales están disponibles
comercialmente en forma de kit.
En una modalidad preferida de la invención, el
polipéptido de hsp60 se conjuga con un hapteno. Un hapteno es una
sustancia de bajo peso molecular (por ejemplo, un péptido o un
oligosacárido) que puede unir anticuerpos, pero que inducirán una
respuesta inmune solamente si se une covalentemente a una molécula
portador grande.
Es posible conjugar el hsp60 con poblaciones
enteras de proteínas a partir de células antigénicas o partículas
por complejación in vitro de lisados celulares, fracciones,
extractos, partículas virales, y similares.
Las moléculas heterólogas o polipéptidos pueden
ser de cualquier fuente, pero tienen más probabilidad que sean
componentes de un organismo patogénico. En particular, pueden ser
polipéptidos a partir de patógenos virales, bacterianos, de
protozoarios, helminticos, o fúngicos de animales, especialmente
animales acuáticos.
El gen hsp60 aislado a partir del
Arthrobacter se puede explotar de manera convencional, por
clonación del gen en un vector de expresión para la generación de
grandes cantidades de proteína del hsp60 recombinante purificada o
aislada (o proteína del hsp60 de fusión). Un antígeno purificado de
hsp60 también se puede obtener por técnicas
no-recombinantes. La proteína es abundante y se
puede extraer de células por métodos de purificación convencionales.
Alternativamente, la proteína o polipéptido del hsp60 se puede
sintetizar químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de
péptidos. Una vacuna que comprende esta proteína recombinante o
no-recombinante purificada o aislada, se puede
denominar una vacuna a base de antígeno.
Una proteína "aislada" o "purificada"
se define como sustancialmente libre de material celular u otras
proteínas contaminantes a partir de la célula o fuente del tejido a
partir de la cual, se deriva la proteína del hsp60, o
sustancialmente libre de los precursores químicos u otros productos
químicos cuando se sintetiza químicamente. El lenguaje
"sustancialmente libre del material celular" incluye
preparaciones de proteína hsp60 en la cual se separa, la proteína
de los componentes celulares de las células a partir de las cuales
esta se aísla o produce recombinantemente. En una modalidad, el
lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye
preparaciones de proteína del hsp60 que tiene menos de
aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína del
no-hsp60 (también refiriéndose aquí, como una
"proteína contaminante"), más preferiblemente menos de
aproximadamente 20% de la proteína contaminante, aún más
preferiblemente menos de aproximadamente 10% de la proteína
contaminante, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de
la proteína contaminante. Cuando la proteína del hsp60 o la porción
biológicamente activa de esta se produce recombinantemente, también
se prefiere sustancialmente libre de medio de cultivo, i.e., el
medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más
preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y más preferiblemente
menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la
proteína.
Un extracto celular de Arthrobacter
"enriquecido" de hsp60, también se puede utilizar en la
ejecución de la invención como una alternativa al hsp60 aislado o
purificado. Un extracto celular "enriquecido" se puede obtener
por la inactivación o muerte completa de las células de
Arthrobacter, la lisis de las células, fraccionamiento del
lisado celular resultante por medios convencionales, e identificando
fracciones en las cuales la proteína del hsp60 es más abundante en
comparación con otras fracciones (por ejemplo por Western
blotting). Un extracto celular enriquecido de hsp60, también se
puede preparar, cultivando células Arthrobacter, bajo
condiciones que resultan en la expresión elevada de proteínas de
choque térmico (i.e. bajo calor u otras condiciones de estrés
celular), e inactivación o muerte, y la lisis de las células.
Opcionalmente el extracto celular resultante (lisado) se fracciona
y fracciones enriquecidas con hsp60 se identifican.
Preferiblemente, una proteína quimérica o de
fusión del hsp60 de la invención se produce por técnicas estándar
de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican
para las diferentes secuencias de polipéptido, se ligan juntos en
marco, de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando
terminales de extremo romo o extremo escalonado para ligadura,
digestión de enzima de restricción para proporcionar los terminales
apropiados, llenando de extremos cohesivos como apropiados,
tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar indeseables juntas, y
la unión enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión se puede
sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de
ADN automáticos. Alternativamente, la amplificación PCR de los
fragmentos del gen se pueden llevar a cabo utilizando cebadores
anclados que dan lugar a protuberancias complementarias entre dos
fragmentos consecutivos del gen, que posteriormente se pueden
hibridar y re-amplificar para generar una secuencia
quimérica del gen (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular
Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons:
1992).
Otro aspecto de la invención pertenece a los
vectores, preferiblemente vectores de expresión, que comprenden una
secuenciación de ácido nucleico que codifica hsp60 (o una porción de
este). Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a
una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido
nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un
"plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario
circular en el cual los segmentos de ADN adicionales se pueden
ligar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos
de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos
vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los
cuales se ligan operativamente. Tales vectores se refieren aquí como
"vectores de expresión". En general, los vectores de expresión
de utilidad en técnicas de ADN recombinante están en la forma de
plásmidos. Sin embargo, la invención se destina a incluir otras
formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por
ejemplo, virus incapaces de replicarse, retrovirus adenovirus y
virus adeno-asociados), que prestan funciones
equivalentes.
Los vectores de expresión de la invención
comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma apropiada,
para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que
significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una
o más secuencias reguladoras, seleccionadas de la base de las
células huésped que se utilizan para la expresión, ligado
operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se expresa. Los
vectores de expresión de la invención, se pueden utilizar para la
expresión dentro del recipiente deseado del antígeno de hsp60 (como
una vacuna de ADN) o para la expresión dentro un organismo huésped
diferente del receptor final (para la producción de vacunas de
antígeno recombinante).
Dentro de un vector de expresión, "ligado
operablemente" tiene el sentido que la secuencia de nucleótido de
interés se une a la(s) secuencia(s)
reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la
secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de
transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped
cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término
"secuencia reguladora" se destina a incluir promotores,
potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por
ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras
se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.
(1990). Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la
expresión esencial de una secuencia de nucleótido en muchos tipos
de célula huésped y aquellas que dirigen la expresión de la
secuencia del nucleótido solamente en ciertas células huésped (por
ejemplo, secuencias reguladoras de tejido específico). Será
apreciado por aquellos de habilidad en el oficio, que el diseño del
vector de expresión puede depender de dichos factores como la
elección de la célula huésped que se transforma, el nivel de
expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de
la invención, se puede introducir en las células huésped para
producir, por consiguiente proteínas o péptidos, incluyendo
proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos
como se describe aquí (por ejemplo, proteínas del hsp60, formas
mutantes del hsp60, proteínas de fusión del hsp60 con un péptido
heterólogo, etc.).
Otro aspecto de la invención pertenece a las
células huésped en las cuales un vector de expresión recombinante
de la invención ha sido introducidas. Una célula huésped puede ser
cualquier célula procariota o eucariota (incluyendo un célula
eucariota dentro de un organismo eucariota multicelular). Por
ejemplo, las proteínas hsp se pueden expresar en células
bacterianas tales como E. coli, células de insectos
(utilizando vectores de expresión baculovirus), células de levadura
o células de mamífero. Otras células huésped apropiadas se conocen
por aquellos de habilidad en el oficio (por ejemplo, Goeddel,
supra). El vector de expresión recombinante se puede diseñar
que se expresa en una célula de pez huésped (continuando la
vacunación de ADN). Alternativamente, el vector de expresión
recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por
ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotor T7 y polimerasa
T7.
La expresión de las proteínas en procariotas se
lleva a cabo con mayor frecuencia en E. coli con vectores
que contienen promotores esenciales o inducibles que dirigen la
expresión de tanto las proteínas de fusión o
no-fusión. Los vectores de fusión adicionan un
número de aminoácidos a una proteína codificada en esta,
generalmente al terminal amino de la proteína recombinante. A
menudo, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de
división proteolítica se introduce en la unión de la fracción de
fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la
proteína recombinante a partir de la fracción de fusión posterior a
la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus
secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa,
trombina y enteroquinasa. Vectores de expresión de fusión típicas
incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. and Johnson, K.
S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England
Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que
fusionan la glutationa S-transferasa (GST), maltosa
unida a la proteína, o proteína A, respectivamente, a la proteína
recombinante diana.
El gen hsp60 se puede incorporar en una Vacuna
de Ácido Nucleico (NAV), por lo cual la NAV se ocupa por las
células huésped de un animal vivo, y la expresión del gen hsp60
tiene lugar dentro del citosol. Debido a los péptidos pequeños de
los antígenos de hsp60 intracelular se transportan a la superficie
celular donde pueden hacer contacto con el sistema de MHC I,
antígenos de hsp60 que originan NAV se ubican idealmente para
inducir una respuesta inmune celular.
Un gen hsp60 insertado dentro de un vector de
ADN se puede inocular directamente dentro de un pez (por ejemplo,
vía oral, intramuscular o intraperitoneal) para la expresión in
vivo dentro de las células de peces. La vacunación de ADN
también se puede llevar a cabo en otra especie animal. De esta
manera, en un aspecto de la invención se proporciona una vacuna de
ácido nucleico que comprende un portador farmacéuticamente aceptable
y un plásmido de ADN sobre el cual una secuencia de ácido nucleico
que codifica el hsp60 del Arthrobacter se liga operablemente
a una secuencia reguladora transcripcional. Las secuencias
reguladoras transcripcionales incluyen promotores, secuencias de
poliadenilación y otras secuencias de nucleótidos, tales como los
oligonucleótidos que estimulan la inmunidad que tienen
dinucleótidos CpG no-metilados, o secuencia de
nucleótidos que codifican para otras proteínas antigénicas o
citoquinas de adyuvante. La presencia de secuencia(s)
reguladora(s) transcripcionales eucariotas o virales,
permite la expresión del gen hsp60 en células de peces. El plásmido
de ADN por sí mismo, se puede replicar en células bacterianas con
el fin de preparar una composición de vacuna, pero generalmente
carece de secuencias reguladoras transcripcionales que permiten la
expresión del gen hsp60 dentro de las células procariotas. Para una
óptima expresión in vivo se puede preferir seleccionar
secuencias reguladoras transcripcionales endógenas al peces que se
vacuna. Por ejemplo, se pueden considerar los promotores del gen de
actina o citoquina endógenos. El ADN puede estar presente en forma
desnuda o se puede administrar junto con un agente que facilita la
absorción celular (por ejemplo, liposomas o lípidos catiónicos). La
tecnología de vacunación de ADN de peces se explica con más detalle
en US 5,780,448, la cual se incorpora aquí por referencia.
La presente invención también se relaciona con
un método para generar anticuerpos monoclonales o policlonales a
una molécula utilizando un conjugado de una proteína de hsp60
acoplada a la molécula. En esta modalidad, una cantidad efectiva
del conjugado (i.e., una cantidad que resulta en una respuesta
inmune en el huésped) se introduce en un animal huésped resultando
en la producción de anticuerpos a la sustancia en el huésped. Los
anticuerpos se retiran a partir del huésped y se purifican
utilizando técnicas conocidas (por ejemplo, cromatografía),
resultando por consiguiente en la producción de anticuerpos
policlonales. Alternativamente, los anticuerpos producidos
utilizando el método de la presente invención se puede utilizar para
generar células hibridoma que producen anticuerpos monoclonales
utilizando técnicas conocidas.
Las vacunas fabricadas de acuerdo con la
metodología de la invención se conforman para administrar a
cualquier especie de animal que tiene un sistema inmune humoral y/o
celular comparable con aquellos de los mamíferos. Los seres humanos
se incluyen dentro del significado de "animal" y
"mamífero" en el presente contexto. El hsp60 del
Arthrobacter se puede emplear como adyuvante de cualquier
vacuna para mamíferos, pájaros, reptiles o peces. De manera
similar, el hsp60 del Arthrobacter se puede utilizar en
vacunas como portadores para antígenos unidos covalentemente,
opcionalmente a la exclusión de cualquier adyuvante convencional
(así llamada vacunas "sin-adyuvante"). El
hsp60 del Arthrobacter también es capaz de ser utilizado como
un inmunógeno (opcionalmente como el único inmunógeno) en una
vacuna para aumentar una respuesta inmune contra enfermedades
específicas, notablemente Septicemia Rickettsial del Salmón (SRS),
Enfermedad Renal Bacteriana (BKD) y otras enfermedades infecciosas
en
peces.
peces.
El término "vacuna" se utiliza en sentido
amplio, e incluye no solamente las composiciones que se utilizan
para la inmunización contra patógenos, sino también vacunas
anti-tumor, vacunas basadas en antígenos autógenos
(por ejemplo, por castración química), y así sucesivamente. Dentro
de la campo de acción de la vacunación veterinaria, la principal
especie de animales de tierra que se consideran para la inmunización
incluyen ganado vacuno, caballos, ovejas, ganado porcino y aves de
corral. Para la acuicultura, las vacunas de la invención se pueden
emplear en mariscos o pez de aleta, especialmente para el
tratamiento de teleósteos, tales como salmón, trucha, carpa, besugo
de mar, lubina, limanda, bagre, halibut, liba, u opcionalmente para
el tratamiento de otro especie acuática tal como crustáceos (por
ejemplo, langostinos, camarones, bogavante, cangrejos) y moluscos
(por ejemplo, ostras, mejillones). No hay límites para los antígenos
candidato apropiados para combinar con las secuencias del hsp60 del
Arthrobacter en una vacuna. Los antígenos patogénicos se
pueden derivar a partir de bacterias, virus, protozoarios,
nemátodos y hongos. Un enfoque particular es sobre los antígenos,
particularmente antígenos superficiales, de organismos patogénicos
de peces.
Las secuencias de aminoácido o de ácido nucleico
del Hsp60 se pueden utilizar en composiciones de vacuna en
conjunción con, o combinadas con, antígenos bacterianos, de
protozoarios, virales o fúngicos de enfermedades que afectan
mariscos o pez de aleta, incluyendo antígenos (o sus secuencias
codificantes) derivadas de: Virus de la Anemia Infecciosa del
Salmón (ISAV), Virus de Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV),
Virus de Necrosis Hematopoyética Infecciosa (IHNV), Iridovirus,
Virus de Necrosis Nerviosa (NNV), Virus de Enfermedad del Páncreas
del Salmón (SPDV), Virus de la Viremia Primaveral de la Carpa
(SVCV), Virus de Septicemia Hemorrágica Viral (VHSV), Virus de
Cabeza Amarilla (YHV), Virus del Síndrome de Taura (TSV), Virus del
Síndrome de Mancha Blanca (WSSV), Renibacterium salmoninarum
(agente causativo de Enfermedad Renal Bacteriana),
Piscirickettsia salmonis (agente causativo de Septicemia
Rickettsial Salmonídea), Vibrio spp, Aeromonas spp, Yersinia
ruckerii, Pseudomonas spp, Photobacterium damselae, etc. Un gran
y creciente número de polipéptidos a partir de estos y otros
organismos patogénicos han sido purificados y/o clonados y
expresados y son disponibles para ser combinados a, o
proporcionados en conjunción con, del hsp60 del Arthrobacter
o su secuencia codificante en una composición de vacuna. Ejemplos
preferidos incluyen proteínas IPNV VP1, VP2, VP3 y NS y sus
secuencias codificantes de nucleótidos; proteínas ISAV reveladas en
WO 01/10469 incluyendo hemaglutinina, nucleocápsida, polimerasa y
proteínas del segmento 7 P4 y P5, y su secuencia codificante de
nucleótidos; proteínas de P. salmonis reveladas en WO
01/68865 incluyendo OspA e IcmE y su secuencia codificante de
nucleótidos; proteínas de nodavirus tales como la nucleocápsida; y
polipéptidos estructurales a partir de SPDV y su secuencia
codificante de nucleótidos (revelada en WO 99/58639). Una
composición de vacuna preferida de acuerdo con la invención
comprende un vector de expresión de ADN que lleva la secuencia de
nucleótido de hsp60 fusionado en marco con la secuencia IPNV VP2 o
la secuencia IPNV VP3. Opcionalmente, la vacuna comprende un primer
plásmido que lleva la fusión hsp60-VP2 y un segundo
plásmido que lleva la fusión hsp60-VP3.
Las secuencias de Hsp60 también se pueden
utilizar en conjunción con, o combinadas con, antígenos (o sus
secuencias codificantes) a partir de otros patógenos y parásitos de
animales, incluyendo: Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV), Virus
de Herpes Bovino (BHV), virus de enfermedad de pies y boca, Virus
Sincitial respiratorio Bovino (BRSV), virus Parainfluenza tipo 3
(PI3), Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR), Virus del Síndrome
Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV), Mycobacteria,
Leishmania, Ehrlichia, Eimeria, Clostridia, Pasteurella,
Mycoplasma (por ejemplo, M. bovis, M. hyopneumoniae)
Leptospira, Brachyspira, Salmonella, Brucella, Neospora,
Cryptosporidium, Fusobacterium, E. coli, Rotavirus, Coronavirus,
Mannheimia haemolytica, Haemophilus somnus, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Trypanosoma, Anaplasma, Treponema, etc.
La invención abarca el uso de secuencias de
hsp60 en conjunción con cualquiera de los antígenos mencionados
anteriormente o sus secuencias codificantes, en la fabricación de
una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de
enfermedad causada por la infección con el agente de la enfermedad
de la cual el antígeno se deriva.
En una modalidad de la invención, la proteína
del hsp60 del Arthrobacter o secuencia de ácido nucleico se
incluye en una vacuna que además comprende la proteína del hsp70 del
Arthrobacter o secuencia de ácido nucleico. La combinación
de estos dos genes o antígenos en una única composición de vacuna
puede conducir a mejoras aditivas o sinergistas en la eficacia de
la vacuna. El hsp70 del Arthrobacter es el sujeto de la
aplicación co-pendiente PCT/EP03/07602, archivada el
14 de Julio de 2003.
Los antígenos de la vacuna, proporcionados en
conjunción con el gen hsp60 o la proteína se pueden combinar
químicamente al hsp60 (en una proteína quimera o de fusión) o se
pueden proporcionar como moléculas separadas a la vez en una única
composición de vacuna. Como otra opción, el gen hsp60 o proteína se
puede proporcionar con un antígeno o secuencia de ácido nucleico
que codifica el antígeno en un kit, para la administración por
separado, secuencial o simultánea. Los antígenos de la vacuna
proporcionados en conjunción del ion con el gen hsp60 o la
proteína, pueden ser bacterinas, extractos celulares, proteínas
recombinantes, genes que llevan plásmidos, o cepas de patógeno
vivas/atenuadas.
Es posible inmunizar un sujeto con las formas
neutra o de sal de las presentes proteínas de fusión o proteína del
hsp60 aislada, ya sea administrada sola o en mezcla con un vehículo
o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por lo general, las
vacunas se preparan como soluciones líquidas o suspensiones; formas
sólidas (por ejemplo, materia liofilizada) apropiadas para la
solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la
administración también se puede preparar. La preparación puede ser
emulsificada o el ingrediente activo encapsulado en vehículos de
liposoma. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden
administrar en una forma para liberación inmediata o para liberación
prolongada.
Los excipientes o vehículos farmacéuticamente
aceptables que se mezclan con el antígeno o molécula de ácido
nucleico de la invención en la preparación de una composición de
vacuna son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol,
sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o
emulsificación, agentes de hinchamiento, aglutinantes,
desintegrantes, diluentes, lubricantes, agentes reguladores de pH, o
adyuvantes tales como muramil dipéptidos, avridina, hidróxido de
aluminio, aceites, saponinas, co-polímeros en bloque
y otras sustancias conocidas en el oficio.
Para inmunizar un sujeto, un antígeno de hsp60 o
proteína de fusión hsp o vector del gen hsp60 se puede administrar
vía parenteral, generalmente mediante inyección intramuscular en un
vehículo apropiado, pero opcionalmente por la ruta subcutánea, por
inyección intravenosa o por entrega intradérmica o intranasal. En el
caso de inmunización de antígeno de peces, las rutas de
administración típicas son por inyección dentro de la cavidad
peritoneal, inyección intra-muscular, vía oral en
el alimento, o por inmersión. Las composiciones preferidas
antigénicas de vacuna de la invención están en una forma apropiada
para la administración por inyección o inmersión. La vacunación de
ADN es generalmente por inyección
intra-muscular.
La dosificación efectiva, puede variar
dependiendo del tamaño y especie del sujeto, y de acuerdo con el
modo de administración. La dosificación óptima se puede determinar
a través de ensayo y error por un doctor o veterinario. Por lo
general, una dosis única de antígeno de hsp60 estará en el rango de
aproximadamente 0.01 a 1000 \mug por kg de peso corporal,
preferiblemente 0.5 a 500 \mug por kg, más preferiblemente 0.1 a
100 \mug por kg. Para las vacunas de ADN, una dosificación mínima
de 10pg hasta dosificaciones de 1000 \mug de plásmido por animal
permitirá la expresión del antígeno in vivo.
Los antígenos novedosos revelados como parte de
la presente invención también son útiles en la selección de
anticuerpos contra proteínas patogénicas, y en selección de efectos
tóxicos y de estrés ambiental/estrés. La invención adicionalmente
incluye usos de diagnósticos de estos antígenos, por ejemplo en la
preparación de un kit de diagnóstico, útil para animales de prueba
para la presencia de organismos que causan enfermedades.
Los anticuerpos construidos contra el antígeno
de hsp60 y/o proteínas de fusión del hsp60 purificados según se
revela aquí, también se comprenden dentro de la invención. Se
contempla que tales anticuerpos podrían tener ambas aplicaciones
terapéuticas y de diagnóstico en el manejo de la enfermedad y la
salud de los peces. Ambos anticuerpos policlonales y anticuerpos
monoclonales, pueden ser útiles en este sentido. Los procedimientos
para la inmunización de los animales, por ejemplo, ratones, con
proteínas y selección de hibridomas que producen anticuerpos
monoclonales inmunogen específicos, son bien conocidos en el oficio
(ver por ejemplo Kohler and Milstein (1975) Nature 256:
495-497). Ensayos en sándwich y ELISA se pueden
mencionar como ejemplos específicos de ensayos de diagnóstico.
La secuencia de ácido nucleico del hsp60 de la
invención tiene aplicaciones de diagnóstico, por ejemplo en el
diseño de cebadores para análisis de amplificación de PCR.
Un cultivo de 5 ml de Arthrobacter ATCC
55921 se cultiva durante la noche en agitación a 30ºC en LB que
contiene kanamicina (30 \mug/ml). La extracción de ADN luego se
realiza utilizando el kit de aislamiento de ADN Puregene (Gentra) o
InstageneTM Resin, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Las zonas de mayor similitud entre varias
secuencias (groEL) del hsp60 micobacterianas y estreptomicinas en
el nivel de nucleótido se utilizan para diseñar cebadores para PCR y
la secuenciación del gen hsp60 del Arthrobacter. Los
cebadores seleccionados incluyen groEL-OFP
(5'-GTCCGTCGCGGGCACT-3'),
groEL-1F
(5'-CCCACGATCACCAACGA-3'),
groEL-1R
(5'-CCTCGATGCGGTGCTTG-3'),
groEL-2R,
(5'-CCTTGTCCATSGCCTCg-3'). Estos
cebadores se utilizan para la amplificación de ADN del
Arthrobacter en una reacción de PCR con una temperatura de
hibridación de 50ºC o 60ºC y variando las cantidades de Magnesio y
DMSO. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 595 bp y 1050 bp se
amplifican utilizando cebadores OFP/2R y 1F/1R respectivamente. Los
productos PCR se limpian utilizando el kit de limpieza de PCR
Qiagen (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y
secuenciados de acuerdo con las instrucciones del fabricante
utilizando BigDye primer chemistry (Applied Biosystems), empleando
cada uno de los cebadores empleados para la PCR. Brevemente, las
mezclas de reacción de extensión se preparan utilizando la mezcla
ABI PRISM (8 \mul) BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction, -600 ng de la plantilla de ADN, 3.2 pmol del cebador
apropiado y ddH_{2}O a 20 \mul. Las condiciones para el ciclo de
secuenciación son las siguientes: el termociclador se ajusta a 25
ciclos que consisten de 96ºC por 10 s, 50ºC por 5 s, y 60ºC por 4
min. La secuencia muestra que este fragmento contiene alta homología
con los genes groEL de varias micobacterias y se utiliza como un
punto inicial para la técnica de recorrido genómico.
El recorrido genómico se utiliza para extender
la secuencia 5' y 3' de las secuencias ya identificadas. Los
cebadores se diseñan a partir de las secuencias similares a hsp60
descritas anteriormente, según se describe en el Genome Walker
manual (Glontech). Inicialmente, cuatro bibliotecas genómicas se
hacen (Dral, EcoRV, Pvull, Stul), y posteriormente tres bibliotecas
adicionales se hacen (Alul, Scal, y SnaF1). Todas las bibliotecas y
las posteriores reacciones de PCR son como se describen en el Genome
Walker manual. Varias rondas del Genome walking se realizan para
extender la secuencia del gen.
Las secuencias se alinean en cóntigos utilizando
el software Genecode's Sequencher. Una búsqueda Genbank utilizando
las secuencias de clones solapados confirma que el cóntigo contiene
el gen hsp60.
La proteína del hsp60 del Arthrobacter (y
el gen) se puede ver que soporta un parecido a los homólogos en
otros géneros, especialmente especie bacteriana.
Salmón atlántico (Salmo salar) salmónidos
juveniles (35-40 g) mantenidos en el flujo a través
de agua fresca, se anestesiaron con benzocaina diluida en agua de
acuario limpia. Antes de la vacunación 6 peces se sometieron a
eutanasia por sobredosis letal de anestésico y se dejan desangrar a
partir de la vena caudal para el suero
pre-inmune.
Las vacunas de ácidos nucleicos y control de PBS
se vacunaron vía intramuscular en el flanco dorsal izquierdo, justo
debajo de la aleta dorsal, con 50 \mul de la vacuna. Cuarenta
peces se vacunaron por duplicado (80 por grupo, divididos en dos
tanques). Después de la vacunación, los peces se dejaron recuperar
en agua fresca y se asignaron a su tanque apropiado.
Las vacunas de ácido nucleico de experimentación
en las pruebas son: pUKrsxHSP60-ipnVP2 y
pUKrsxHSP60-ipnVP3. Estos plásmidos llevan, bajo el
control de un promotor CMV, una fusión en marco de las secuencias
codificantes completas del hsp60 del Arthrobacter e IPNV VP2
o IPNV VP3, respectivamente. pUKrsxHSP60-ipnVP2 se
probó sola, y ambos plásmidos también se probaron juntos.
Por comparación, también se prepararon plásmidos
que contienen proteína IPN VP2 fusionada 3' de una secuencia
conocida a partir de estudios previos, para estimular la eficacia
inmunoprotectora del componente VP2 por aproximadamente 20% (i.e.
un "patrón oro" vacuna IPNV de ácido nucleico con base en
VP2).
6 semanas después de la vacunación los peces se
transfirieron a agua de mar. En el día antes el suero de desafío se
muestrea a partir de 4 peces por duplicado de grupo. Una muestra de
músculo a partir del sitio de inyección también se toma y se fija
en formalina para ver la presencia de la vacuna. En el día 21
después del desafío, el suero se muestreo a partir de un máximo de
4 peces que sobreviven por duplicado del grupo. Después del
desafío, la mortalidad se retira diariamente en la primera
observación y riñones se muestrean y congelan para el análisis por
ELISA.
El desafío se lleva a cabo de
4-6 semanas después de la transferencia al agua de
mar, mediante convivencia con peces hermanos marcados, que han sido
desafiados por inyección intraperitoneal de IPNV virulento (10^{6}
cfu). La prueba se termina después de 20 semanas.
Los resultados indican que todas las vacunas de
ácido nucleico basadas en la secuencia de VP2 del IPNV son
protectoras contra el desafío por el virus, incluyendo la fusión
hsp60-VP2.
Salmón atlántico parr se aclimata a 0.5 m
manteniéndolo en tanques aprovisionados con agua de pozo corriente
gasificada (10ºC) por una semana antes del inicio del experimento y
se alimenta diariamente a lo largo de todo el experimento. Cada
grupo de 55 peces se divide en 2 tanques de 25 para proporcionar la
réplica de grupos de tratamiento. El salmón atlántico parr
experimenta entre 60 y 80% de mortalidad cuando se desafía con
ISAV.
Los peces se anestesiaron y luego se vacunaron
por inyección intraperitoneal con 0.2 ml de solución salina, o 0.2
ml de solución salina que contiene las proteínas recombinantes
específicas. El control negativo es una inyección de PBS (solución
salina). Los grupos de tratamiento son: (A) proteína recombinante
purificada de hsp60 Arthrobacter His-tagged,
12 \mug; (B) proteína nucleocápsida (NC)
His-tagged recombinante ISAV, 12 \mug; (C)
proteína recombinante purificada de hsp60 del Arthrobacter
His-tagged, 12 \mug, mezcla con
His-tagged ISAV NC, 12 \mug; (D) proteína
recombinante purificada de hsp60 del Arthrobacter
His-tagged, 12 \mug, ligada en cruz a
His-tagged ISAV NC, 12 \mug.
El grupo de tratamiento D recibe las proteínas
ligadas en cruz covalentemente. EDC y sulfo-NHS se
utilizan como agentes de entrecruzamiento, y empleadas de acuerdo
con protocolos estándar.
Un desafío de convivencia se utiliza, en el cual
a un número pequeño de salmón se le da una inyección i.p. con 0.1
ml de ISAV virulento cultivado (\sim10^{4} TCID_{50} por pez)
y se adiciona a cada tanque de peces tratados. La mortalidad en
cada tanque se monitoreó diariamente.
El porcentaje de supervivencia relativo se
evaluó por comparación de la mortalidad entre los diferentes grupos
de tratamiento y controles en puntos de tiempo específicos
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet WO 9833884 A [0004]
\bullet US 5780448 A [0047]
\bullet WO 0110469 A [0051]
\bullet WO 0168865 A [0051]
\bullet WO 9958639 A [0051]
\bullet EP 0307602 W [0054]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989, 1.101-1.104
[0019]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 [0025]
\bulletDieffenbach et al. PCR
Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1995 [0025]
\bullet Current Protocols in Molecular
Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0040]
\bulletGoeddel. Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology. Academic Press,
1990, 185 [0043]
\bulletSmith, D. B.; Johnson,
K. S. Gene, 1988, vol. 67, 31-40
[0045]
\bulletKohler; Milstein.
Nature, 1975, vol. 256, 495-497
[0061].
<110> Novartis AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Hsp60 del Arthrobacter
\vskip0.400000\baselineskip
<130> VA/H-32879A
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arthrobacter sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (26)
1. Una secuencia de ácido nucleico aislado que
codifica el hsp60 del Arthrobacter seleccionado del grupo
que consiste de: la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1,
el ORF de la SEQ ID NO;1 a partir de los nucleótidos 953 a 2578 de
la SEQ ID NO.1 y una secuencia que codifica la secuencia de
aminoácido de la SEQ ID No.2.
2. Una secuencia de ácido nucleico del hsp60
aislado de acuerdo con la reivindicación 1, la cual es de la cepa
del Arthrobacter depositada bajo el número de acceso ATCC
55921.
3. Una secuencia quimérica de ácido nucleico que
comprende la secuencia de ácido nucleico aislado que codifica el
hsp60 del Arthrobacter de acuerdo con las reivindicaciones 1
o 2 fusionado en marco a una secuencia codificante heteróloga.
4. Una secuencia quimérica de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha secuencia
codificante heteróloga codifica un antígeno a partir de un patógeno
animal.
5. Un vector de expresión de ADN que comprende
la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en donde dicha secuencia de ácido nucleico se liga
operablemente a una secuencia reguladora transcripcional.
6. Una célula huésped transformada con el vector
de expresión de ADN de la reivindicación 5.
7. Una secuencia de aminoácido de
Arthrobacter hsp60 aislada que consiste de la SEQ ID
No.2.
8. Una secuencia de aminoácido de hsp60 aislada
de acuerdo con la reivindicación 7 la cual es de la cepa de
Arthrobacter depositada bajo el número de acceso ATCC
55921.
9. Una secuencia de aminoácido aislada de
acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8 que comprende
un fragmento inmunogénico de la SEQ ID NO:2 que incorpora la
secuencia nonapéptido KLAGGVAVI.
10. Una secuencia de aminoácido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 la cual se une
covalentemente o no-covalentemente a una molécula
heteróloga, para formar una molécula conjugada.
11. Una secuencia de aminoácido de acuerdo con
la reivindicación 10 en donde dicha molécula conjugada es una
proteína de fusión.
12. Una secuencia de aminoácido de acuerdo con
la reivindicación 10 o la reivindicación 11 en donde dicha molécula
heteróloga se selecciona de antígenos bacterianos, virales,
fúngicos, de protozoarios, de nemátodos y de tumores.
13. Una secuencia de aminoácido aislada
codificada por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
14. Una secuencia de ácido nucleico aislado que
codifica la secuencia de aminoácido aislada de cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12.
15. Una composición de vacuna que comprende la
secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1
a 4, o el vector de expresión de ADN de la reivindicación 5, o la
secuencia de aminoácido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a
12, o un extracto celular de Arthrobacter enriquecido en
hsp60 de acuerdo con las reivindicaciones 7-9 y un
portador farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 15 y que además comprende al menos un antígeno
heterólogo o una secuencia de ácido nucleico que codifica para un
antígeno heterólogo.
17. Un kit que comprende una composición de
vacuna de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16 y
un antígeno heterólogo o una secuencia de ácido nucleico que
codifica para un antígeno heterólogo, para la administración por
separado, secuencial o simultánea.
18. Uso de una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una secuencia
de aminoácido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a
12 como un adyuvante de vacuna no-específico.
19. Un método de adyuvantes para una vacuna que
comprende la mezcla de un antígeno de la vacuna con una secuencia de
aminoácido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a
12.
20. Un anticuerpo construido contra la secuencia
de aminoácido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
\newpage
21. Uso de la secuencia de ácido nucleico de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el vector de expresión
de ADN de la reivindicación 5, o la secuencia de aminoácido de
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, o un extracto celular de
Arthrobacter enriquecido en hsp60, de acuerdo con las
reivindicaciones 7-9 en la fabricación de un
medicamento para la inmunización de un animal contra enfermedad
infecciosa.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 en
donde dicho animal es un pez teleósteo.
23. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la
reivindicación 22 en donde dicho medicamento es una vacuna para la
prevención o tratamiento de cualquiera de; Enfermedad Renal
Bacteriana (BKD); Septicemia por Rickettsial del Salmón (SRS);
Virus de Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV); y Virus de Necrosis
Pancreática Infecciosa (IPNV).
24. Uso de la secuencia de ácido nucleico de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el vector de expresión
de ADN de la reivindicación 5, o la secuencia de aminoácido de
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, o un extracto celular de
Arthrobacter enriquecido en hsp60 de acuerdo con las
reivindicaciones 7-9, para la fabricación de un
medicamento para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa o un
estrés ambiental.
25. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 20 en la fabricación de un medicamento para el
diagnóstico o tratamiento de una enfermedad infecciosa.
26. Un método para preparar una composición de
vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, que comprende
una etapa de mezcla de dicha secuencia de aminoácido o dicha
molécula de ácido nucleico con un excipiente farmacéuticamente
aceptable, y opcionalmente una etapa de mezclado de dicho antígeno
heterólogo o dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para un
antígeno heterólogo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0303507.8A GB0303507D0 (en) | 2003-02-14 | 2003-02-14 | Organic compounds |
| GB0303507 | 2003-02-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2328140T3 true ES2328140T3 (es) | 2009-11-10 |
Family
ID=9953082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04710796T Expired - Lifetime ES2328140T3 (es) | 2003-02-14 | 2004-02-13 | Hsp60 del arthrobacter. |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7297783B2 (es) |
| EP (1) | EP1597274B1 (es) |
| JP (1) | JP5561892B2 (es) |
| CN (1) | CN1751064B (es) |
| AT (1) | ATE437177T1 (es) |
| AU (1) | AU2004212322B2 (es) |
| CA (1) | CA2513061C (es) |
| CL (1) | CL2004000262A1 (es) |
| CY (1) | CY1109349T1 (es) |
| DE (1) | DE602004022138D1 (es) |
| DK (1) | DK1597274T3 (es) |
| ES (1) | ES2328140T3 (es) |
| GB (1) | GB0303507D0 (es) |
| IS (1) | IS8018A (es) |
| NO (1) | NO20054239L (es) |
| NZ (1) | NZ541507A (es) |
| PT (1) | PT1597274E (es) |
| SI (1) | SI1597274T1 (es) |
| WO (1) | WO2004071387A2 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1292795C (zh) * | 2002-07-15 | 2007-01-03 | 诺瓦提斯公司 | 基于节杆菌细胞的抗鲑鱼立克次氏体败血病疫苗 |
| CN105039221B (zh) * | 2015-08-07 | 2019-04-16 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 一株冷水鱼益生菌节杆菌菌株及其用途 |
| CN113493788B (zh) * | 2021-05-24 | 2023-06-23 | 上海晶诺生物科技有限公司 | 一种分枝杆菌启动子库及其应用 |
| WO2023078279A1 (zh) * | 2021-11-04 | 2023-05-11 | 澄交生物科技股份有限公司 | 免疫原性组合物及其用途 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988005823A2 (en) * | 1987-02-02 | 1988-08-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Mycobacterium tuberculosis genes encoding protein antigens |
| WO1994029459A1 (en) | 1993-06-04 | 1994-12-22 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Stress proteins and uses therefor |
| US5165925A (en) * | 1989-05-02 | 1992-11-24 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Vaccine for immunizing fish against infectious pancreatic necrosis virus |
| FR2666588B1 (fr) * | 1990-09-10 | 1994-02-11 | Pasteur Institut | Sequence nucleotidique regulatrice de l'initiation de transcription. |
| WO1997006821A1 (en) * | 1995-08-18 | 1997-02-27 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
| EP1044273A2 (en) * | 1997-12-23 | 2000-10-18 | Genesis Research & Development Corporation Limited | COMPOSITIONS DERIVED FROM $i(MYCOBACTERIUM VACCAE) AND METHODS FOR THEIR USE |
| CA2378097A1 (en) * | 1999-07-08 | 2001-01-18 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Induction of a th1-like response in vitro |
| WO2001014572A2 (de) * | 1999-08-26 | 2001-03-01 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzliche genexpression unter der kontrolle von konstitutiven pflanzlichen v-atpase promotoren |
| WO2001016174A2 (en) * | 1999-08-30 | 2001-03-08 | Rolf Kiessling | Induction of cytotoxic t lymphocyte response by hla class ia restricted epitopes of mycobacterial heat shock protein 65 |
| US6921534B2 (en) * | 2001-02-05 | 2005-07-26 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Hepatitis B virus treatment |
| GB0216414D0 (en) * | 2002-07-15 | 2002-08-21 | Novartis Ag | Organic compounds |
-
2003
- 2003-02-14 GB GBGB0303507.8A patent/GB0303507D0/en not_active Ceased
-
2004
- 2004-02-13 EP EP04710796A patent/EP1597274B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-13 SI SI200431244T patent/SI1597274T1/sl unknown
- 2004-02-13 CN CN2004800041383A patent/CN1751064B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-13 AU AU2004212322A patent/AU2004212322B2/en not_active Ceased
- 2004-02-13 DE DE602004022138T patent/DE602004022138D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-13 WO PCT/EP2004/001368 patent/WO2004071387A2/en not_active Ceased
- 2004-02-13 AT AT04710796T patent/ATE437177T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-02-13 DK DK04710796T patent/DK1597274T3/da active
- 2004-02-13 PT PT04710796T patent/PT1597274E/pt unknown
- 2004-02-13 US US10/543,366 patent/US7297783B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-13 ES ES04710796T patent/ES2328140T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-13 CL CL200400262A patent/CL2004000262A1/es unknown
- 2004-02-13 NZ NZ541507A patent/NZ541507A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-02-13 JP JP2006501838A patent/JP5561892B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-13 CA CA2513061A patent/CA2513061C/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-09-12 IS IS8018A patent/IS8018A/is unknown
- 2005-09-13 NO NO20054239A patent/NO20054239L/no not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-10-26 US US11/924,986 patent/US7803924B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-08-28 CY CY20091100901T patent/CY1109349T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1597274B1 (en) | 2009-07-22 |
| IS8018A (is) | 2005-09-12 |
| NZ541507A (en) | 2008-03-28 |
| US7803924B2 (en) | 2010-09-28 |
| GB0303507D0 (en) | 2003-03-19 |
| US20080287664A1 (en) | 2008-11-20 |
| SI1597274T1 (sl) | 2009-12-31 |
| WO2004071387A3 (en) | 2005-03-24 |
| DE602004022138D1 (de) | 2009-09-03 |
| ATE437177T1 (de) | 2009-08-15 |
| NO20054239L (no) | 2005-11-03 |
| CN1751064B (zh) | 2010-05-26 |
| US20060127416A1 (en) | 2006-06-15 |
| WO2004071387A2 (en) | 2004-08-26 |
| CL2004000262A1 (es) | 2005-03-28 |
| CY1109349T1 (el) | 2014-07-02 |
| CA2513061A1 (en) | 2004-08-26 |
| AU2004212322B2 (en) | 2008-01-17 |
| AU2004212322A1 (en) | 2004-08-26 |
| JP5561892B2 (ja) | 2014-07-30 |
| US7297783B2 (en) | 2007-11-20 |
| JP2006517406A (ja) | 2006-07-27 |
| NO20054239D0 (no) | 2005-09-13 |
| DK1597274T3 (da) | 2009-11-23 |
| CN1751064A (zh) | 2006-03-22 |
| EP1597274A2 (en) | 2005-11-23 |
| HK1085487A1 (en) | 2006-08-25 |
| PT1597274E (pt) | 2009-08-24 |
| CA2513061C (en) | 2015-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2792124T3 (es) | Vacunas de inmersión en subunidades para peces | |
| US7026156B1 (en) | Diagnostic and protective antigen gene sequences of ichthyophthirius | |
| US7674892B2 (en) | Hsp70 from Arthrobacter | |
| US7803924B2 (en) | HSP60 from arthrobacter | |
| WO2000046373A9 (en) | Diagnostic and protective antigen gene sequences of ichthyophthirius | |
| WO2000046373A1 (en) | Diagnostic and protective antigen gene sequences of ichthyophthirius | |
| JP4578973B2 (ja) | 免疫刺激のためのｉｈｎｖｇ蛋白質 | |
| HK1085487B (en) | Hsp60 from arthrobacter | |
| KR20030078807A (ko) | 양식 연어류 바이러스에 대한 복합 ｄｎａ 및 단백질백신의 개발과 백신 처리 방법의 최적화 | |
| ES2358733T3 (es) | Vacuna derivada de levadura contra ipnv. | |
| HK1075901B (en) | Hsp70 from arthrobacter |