ES2328334T3 - Polipeptido y heterodimero de hormona glicoproteica similar a beta. - Google Patents

Polipeptido y heterodimero de hormona glicoproteica similar a beta. Download PDF

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Abstract

Un dispositivo, que comprende: (a) una membrana adecuada para implante y (b) células encapsuladas dentro de dicha membrana, donde dichas células se han modificado por ingeniería genética para expresar y secretar un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en: (i) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3; (ii) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos madura expuesta en SEC ID Nº: 3, que comprende un extremo amino maduro en el residuo 1, comprendiendo opcionalmente además una metionina amino-terminal; (iii) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para un ortólogo de SEC ID Nº: 3; (iv) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3; (v) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o al menos uno de (ii)-(iv); (vi) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 con al menos una sustitución de aminoácido conservativa; (vii) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 con al menos una inserción de aminoácido; (viii) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 con al menos una supresión de aminoácido; (ix) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 que tiene un truncamiento en el extremo C y/o en el extremo N y (x) un heterodímero de polipéptido a10 de hormona glicoproteica humano y polipéptido alfa2 de hormona glicoproteica humano o una variante alélica o variante de empalme de los mismos donde el polipéptido de (iii)-(ix), cuando se heterodimeriza al polipéptido alfa2 de hormona glicoproteica humano, tiene una actividad del heterodímero de hormona glicoproteica alfa2/Beta10 humano y donde dicha membrana es permeable a dicha proteína e impermeable a materiales nocivos para dichas células.

Description

Polipéptido y heterodímero de hormona glicoproteica similar a beta.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un miembro similar a beta nuevo (denominado en este documento "beta-10" o "\beta10") de la familia de hormonas glicoproteicas y moléculas de ácido nucleico que codifican los mismos. La invención también se refiere a una hormona glicoproteica heterodimérica nueva que comprende beta-10 y alfa-2 como las subunidades. La invención también se refiere a vectores, células hospedadoras y anticuerpos. También se proporcionan usos de beta-10 y el heterodímero de beta-10 y anticuerpos selectivos para beta-10 y heterodímero beta-10, que incluyen métodos para el diagnóstico de trastornos asociados con beta-10 o el heterodímero beta-10.
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Antecedentes de la invención
Como se acepta generalmente en la técnica, actualmente existen cinco polipéptidos de hormona glicoproteica conocidos producidos en seres humanos: subunidad-alfa, subunidad-\beta de TSH (hormona estimulante del a tiroides), subunidad-\beta de FSH (hormona folículoestimulante), subunidad-\beta de LH (hormona luteinizante) y subunidad-\beta de CG (gonadotropina coriónica); Thotakura y Blithe, Glycobiology, Volumen 5, páginas 3-10 (1995); Wondisford et al. en volumen 1, Endocrinology (editado por L. DeGroot), páginas 208-217, W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1995); Moyle y Campbell, en volumen 1, Endocrinology (editado por L. DeGroot), páginas 230-241, W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1995). Estos polipéptidos se producen por genes únicos, con la excepción de la subunidad-\beta de CG que está codificada por un grupo multigenes compuesto de seis secuencias homólogas enlazadas al gen de subunidad-\beta de LH único en el cromosoma 19, Bo y Boime, Journal of Biological Chemistry, vol. 267, págs. 3179-3184 (1992).
La subunidad alfa monomérica (FAS o subunidad alfa libre) tiene actividad hormonal y se secreta mediante la glándula pituitaria y la placenta. Se ha observado que FAS juega un papel en la diferenciación de células productoras de prolactina en la pituitaria y placenta; véase, Begeot et al., Science, vol. 226, págs. 566-568 (1984), Van-Bael y Denef, Journal of Neuroendocrinology, vol. 8, págs. 99-102 (1996) y Moy et al., Endocrinology, vol. 137, págs 1332-1339 (1996) y también estimula la secreción de prolactina placentaria; véase Blithe et al., Endocrinology, vol. 129, págs. 2257-2259 (1991).
La subunidad alfa también heterodimeriza con cada una de las cuatro subunidades beta para formar cuatro hormonas heterodiméricas (TSH, FSH, LH y CG). TSH, FSH y LH se producen en la pituitaria, se almacenan en gránulos de secreción y se secretan cuando se produce la hormona de liberación apropiada mediante el hipotálamo. CG se produce en la placenta y parece que se secreta de forma constitutiva (no se almacena en gránulos de secreción); véase Wondisford et al. en volumen 1, Endocrinology (ed. L. DeGroot), págs. 208-217, anteriormente y Hall y Crowley, Jr. en volumen 1, Endocrinology (ed. L. DeGroot), págs. 242-258, W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA
(1995).
TSH influye sobre el metabolismo basal regulando la producción de hormonas tiroideas y se usa clínicamente para mejorar la detección y tratamiento de carcinoma tiroideo; véase McEvoy, G. (ed.), AHFS Drug Information, págs. 2041-2042, American Society of Health-System Pharmacists, Inc., Bethesda, MD (1998). Además, los ensayos de diagnóstico para medir niveles de TSH en la sangre se usan comúnmente para determinar el estado funcional de la glándula tiroides cuando se sospecha de un trastorno de la glándula tiroides.
FSH y LH juegan papeles importantes en el mantenimiento de la función reproductiva en machos y hembras (es decir, maduración gonadal y producción de esteroides gonadales). CG está implicada en el mantenimiento de la gestación mediante la estimulación del cuerpo lúteo a producir hormonas esteroideas durante el primer trimestre. FSH, LH y GC se usan clínicamente para tratar infertilidad y también como reactivos en procedimientos de reproducción asistida tales como fertilización in vitro (IVF); véase, McEvoy, G. (ed.), AHFS Drug Information, págs. 2564-2567, American Society of Health-System Pharmacists, Inc., Bethesda, MD (1998). Los ensayos de diagnóstico para medir los niveles de FSH, LH y CG se usan para el diagnóstico de trastornos de fertilidad, así como para determinar el embarazo.
Se han descrito metabolitos de origen natural de los polipéptidos de hormona glicoproteica mencionados anteriormente, tales como el fragmento de núcleo \beta que se obtiene a partir de la subunidad beta de CG, pero todavía no se ha asignado ninguna función a estos metabolitos; Moyle y Campbell en volumen 1 Endocrinology (ed. L. DeGroot) págs. 230-241, anteriormente.
En 1994, los cinco polipéptidos de hormona glicoproteica conocidos se pusieron en la superfamilia estructural del factor de crecimiento del nudo de cistina, basándose en la estructura cristalina de CG humana; Lapthorn et al., Nature, vol. 369, págs. 455-61 (1994). Esta superfamilia incluye las familias de genes del TGF-\beta (factor de crecimiento transformante beta), NGF (factor de crecimiento nervioso) y PDGF (factor de crecimiento obtenido de las plaquetas). El nudo de cistina está formado por tres enlaces de disulfuro intramoleculares, tiene una estructura muy característica y es responsable de la estructura de tres dimensiones global de todos los miembros de la superfamilia; Isaacs, Current Opinion in Structural Biology, vol. 5, págs. 391-395 (1995). Una solicitud de patente publicada recientemente describe un miembro nuevo de la familia del nudo de cistina (zsig51); Sheppard y Lok, (1999) solicitud de patente WIPO W099/41377. De hecho, se ha determinado que zsig51 es un miembro nuevo similar a alfa de la familia de hormonas glicoproteicas y, por tanto, se denominará en este documento "\alpha-2" o "alfa-2" [Paszty et al. (2000) solicitud de patente WIPO WO 00/78964].
El documento WO 01/53346 describe una secuencia de ARNm que codifica un péptido de nudo humano expresado en pituitaria y endometrio.
El documento EP 1239039 describe polipéptidos y variantes polipeptídicas que tienen actividad fisiológica relacionada con hormonas de la pituitaria anterior tales como LH, FSH y TSH.
El documento WO 99/41377 describe el miembro de la familia del nudo de cistina zsig51, en el contexto del diagnóstico de trastornos de proliferación celular, por ejemplo, cáncer en tejido pancreático, de la pituitaria, testicular o del ojo.
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Sumario de la invención
La secuencia de aminoácidos de longitud completa de \beta10 humano de acuerdo con esta invención se muestra en la Figura 1. El péptido señal N terminal pronosticado para el polipéptido \beta10 se muestra subrayado. La asparagina (N) en la posición 87 de SEC ID Nº: 1 está localizada dentro de un motivo de glicosilación NxT clásico (donde x indica cualquier aminoácido excepto prolina y T indica treonina) y puede estar glicosilada. El sitio de escisión del péptido señal en la secuencia de aminoácidos de \beta10 se espera que esté dentro de la región de ocho aminoácidos mostrados en recuadros en la Figura 1. La escisión del péptido señal en el sitio que es más probable que sea el sitio de escisión in vivo auténtico se refleja en la secuencia del polipéptido \beta10 "maduro" (SEC ID Nº: 3).
La forma "madura" más probable (es decir, procesada in situ para retirar el péptido señal) de polipéptido \beta10 se desarrolló frente a la base de datos de Proteína No Redundante usando el programa de análisis informático conocido como BLAST para examinar homologías (específicamente, residuos de aminoácidos que ocurren de forma común o "conservados") con proteínas conocidas. Las 112 "coincidencias" superiores se observó que eran diversas subunidades \beta de hormona glicoproteica de diversas especies de mamíferos, aves y peces. Estas homologías indicaban claramente que \beta10 es un miembro similar a \beta nuevo de la familia de hormonas glicoproteicas.
Además, el análisis GAP indicó que la homología de \beta10 a las cuatro subunidades \beta de hormonas glicoproteicas humanas conocidas (mencionadas anteriormente) fue una identidad del 31-37% y similitud del 42-48% (véase la Figura 2A-D, a la que se hace referencia en este documento más adelante). Las formas maduras de los cuatro polipéptidos de hormonas glicoproteicas \beta humanos conocidos contienen doce residuos de cisteína, que forman seis enlaces de disulfuro intramoleculares. La forma madura del polipéptido \beta10 humano de la presente invención contiene diez residuos de cisteína, que puede formar cinco enlaces de disulfuro intramoleculares. Usando el emparejamiento de cisteína mediante enlace de disulfuro de CG-\beta como un modelo, el emparejamiento de cisteína mediante enlace disulfuro más probable para los cinco enlaces de disulfuro putativos en el polipéptido \beta10 de esta invención es el siguiente: C12-C60, C26-C75, C36-C91, C40-C93 y C96-C103 de SEC ID Nº: 3 (véase también la Figura 3).
La secuencia de aminoácidos de longitud completa del polipéptido \beta10 de ratón se expone en SEC ID Nº: 11 y la secuencia de nucleótidos de la región codificante completa del ADNc de \beta10 de ratón se expone en SEC ID Nº: 12. La escisión del péptido señal en el sitio que es probablemente el sitio de escisión in vivo auténtico se refleja en la secuencia de la forma "madura" del polipéptido \beta10 de ratón (SEC ID Nº: 13). El análisis BestFit indicó que la homología de aminoácidos de la forma madura del polipéptido \beta10 humano en comparación con la forma madura del polipéptido \beta10 de ratón era de una identidad del 93,4% y una similitud del 97,2% (véase la Figura 4, a la que se hace referencia en este documento más adelante).
Basándose en la inclusión lógica del polipéptido \beta10 de esta invención en la familia de hormonas glicoproteicas, este polipéptido podría ser un monómero (análogo al fragmento FAS y de núcleo \beta) y/o podría formar un heterodímero con uno o más polipéptidos de la familia de hormonas glicoproteicas (por ejemplo, heterodímeros \alpha/\beta10, \beta10/TSH-\beta, \beta10/LH-\beta). El polipéptido \beta10 también podría formar heterodímeros con polipéptidos que son diferentes de los polipéptidos de hormonas glicoproteicas conocidos. Basándose en estas posibilidades diversas, el polipéptido \beta10 puede formar más de una hormona (es decir, las hormonas \beta10).
Se usó un ensayo de heterodimerización para determinar que \beta10 humano forma un heterodímero con el polipéptido \alpha2 humano, descrito en las solicitudes de patente mencionadas anteriormente WO99/41377, WO00/78964, descubriendo y definiendo de ese modo una hormona glicoproteica heterodimérica nueva, \alpha2/\beta10.
El principio general del ensayo de heterodimerización para proteínas secretadas, tales como las hormonas glicoproteicas, es la co-transfección de los dos genes diferentes en células de mamífero, la recolección de los medios acondicionados, la inmunoprecipitación con un anticuerpo que se une específicamente a uno de los productos génicos y la transferencia de Western del inmunoprecipitado con un anticuerpo que se une específicamente al otro producto génico. Con los experimentos de control apropiados en su sitio, la presencia de una banda del tamaño correcto en el Western podría indicar heterodimerización de los dos productos génicos en las condiciones experimentales del ensayo, mientras que la ausencia de una banda del tamaño correcto en el Western indicaría que los dos productos génicos no se heterodimerizaron en las condiciones experimentales del ensayo. Debido a que las hormonas glicoproteicas heterodiméricas conocidas (LH, FSH, TSH y CG) se pueden producir fácilmente mediante co-transfección de células de mamífero con los genes apropiados, este tipo de ensayo de heterodimerización de co-transfección basado en células de mamífero es pertinente para miembros de la familia de hormonas glicoproteicas.
Un vector de expresión de mamífero de \alpha2 marcado con poliHis humano y un vector de expresión de mamífero de \beta10 marcado con FLAG humano se co-transfectaron en células 293 y se recogió medio acondicionado sin suero después de 72 horas. La inmunoprecipitación se realizó usando perlas de afinidad de M2-Agarosa anti-FLAG (Nº de Cat A1205, Sigma, St. Louis, MO). Una transferencia de Western de este inmunoprecipitado se sondeó con anticuerpos policlonales de conejo anti-\alpha2 purificados por afinidad (Ejemplo 4) que se habían conjugado a Peroxidasa de Rábano Picante (Kit de Conjugación de Proteínas Rápido Linx HRP, Nº de cat K8050-01, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Se observó una banda de \alpha2 marcado con poliHis fuerte usando el kit de detección de Transferencia de Western ECL (Nº de cat RPN 2106, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Los experimentos de control demostraron que la presencia de la banda de \alpha2 marcado con poliHis fuerte en la transferencia de Western dependía completamente de la co-transfección con el vector de expresión de mamífero de \beta10 marcado con FLAG humano y el uso de perlas de afinidad de M2-Agarosa anti-FLAG. No se observó banda de \alpha2 marcado con poliHis si cualquiera de estos dos componentes se dejaba fuera del experimento o si se usaban perlas de agarosa planas (es decir, sin anticuerpos anti-FLAG) para la etapa de inmunoprecipitación.
De forma similar a las hormonas glicoproteicas heterodiméricas conocidas (TSH, FSH, LH y CG), \alpha2/\beta10 es un heterodímero de un polipéptido de hormona glicoproteica similar a alfa y un polipéptido de hormona glicoproteica similar a beta.
Estos datos también indican que se puede producir heterodímero \alpha2/\beta10 recombinante, secretado (sin etiquetas de afinidad poliHis y FLAG) en células de mamífero para diversas utilidades terapéuticas y de diagnóstico como se ha descrito adicionalmente más adelante.
Las hormonas glicoproteicas heterodiméricas tales como CG también se pueden ensamblar in vitro después de la co-incubación de, por ejemplo, subunidad alfa aislada y subunidad \beta de CG aislada en condiciones adecuadas [véase Blithe y Iles, Endocrinology, volumen 136, páginas 903-910 (1995)]. El heterodímero \alpha2/\beta10 se podría ensamblar de forma similar in vitro después de la co-incubación de polipéptido \alpha2 aislado y polipéptido \beta10 aislado. Tal heterodímero \alpha2/\beta10 ensamblado se podría usar para diversas utilidades terapéuticas y de diagnóstico como se ha descrito adicionalmente más adelante.
Se prepararon ratones transgénicos que sobre-expresaban \alpha2 de ratón solo, \beta10 de ratón solo o el heterodímero \alpha2/\beta10 de ratón (véase el Ejemplo 6). Sólo los transgénicos que sobre-expresaban el heterodímero \alpha2/\beta10 mostraron diferencias fenotípicas marcadas en comparación con ratones de control. Los ratones transgénicos que sobre-expresaban \alpha2/\beta10 mostraron un fenotipo caracterizado por aumento tiroideo bilateral con múltiples adenomas papilares foliculares e hipertiroidismo resultante, como indicaron los niveles de T4 en suero elevados. Otros cambios fenotípicos se pensó que estaban relacionados con el estado hipertiroideo sistémico e incluían hepatomegalia moderada, hiperplasia hepatocelular y niveles de colesterol en suero ligeramente disminuidos, hipertrofia renal bilateral y una leucocitosis de leve a moderada con predominancia de linfocitos (véase el Ejemplo 6). Por tanto, en un entorno de ratón normal, \alpha2/\beta10 claramente tiene una actividad similar a la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Debido al nivel elevado de conservación de aminoácidos entre \alpha2 de ratón y \alpha2 humano [identidad del 88,5% y similitud del 90,4% para las formas maduras pronosticadas (es decir, sin péptido señal)], el nivel elevado de conservación de aminoácidos entre \beta10 de ratón y \beta10 humano [identidad del 93,4% y similitud del 97,2% para las formas maduras pronosticadas (es decir, sin péptido señal)] y el nivel muy alto de similitud entre la biología de la glándula tiroides de ratón y biología de la glándula tiroides humana, se espera que el heterodímero \alpha2/\beta10 humano tenga la misma actividad similar a la hormona estimulante de la tiroides (TSH) que la observada para el heterodímero \alpha2/\beta10 de ratón. Además de la actividad similar a TSH, \alpha2/\beta10 puede tener otros efectos biológicos diferentes en diferentes entornos fisiológicos (es decir, procesos patológicos), como se ha descrito con mayor detalle adicionalmente en este
documento.
TSH influye en el metabolismo basal regulando la producción de hormonas tiroideas y se usa clínicamente para mejorar la detección y tratamiento de carcinoma tiroideo; véase McEvoy, G. (ed.), AHFS Drug Information, págs. 2041-2042, American Society of Health-System Pharmacists, Inc., Bethesda, MD (1998). Además, los ensayos de diagnóstico para medir los niveles de TSH en la sangre comúnmente se usan para determinar el estado funcional de la glándula tiroides cuando se sospecha de un trastorno de glándula tiroides. Es probable que \alpha2/\beta10 humano tenga utilidades clínicas similares a TSH y sea útil para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades y trastornos relacionados con la glándula tiroides. Además, \alpha2/\beta10 puede tener otros usos terapéuticos y de diagnóstico que se describen en este documento. Es razonable suponer que los agentes de unión selectivos para \alpha2/\beta10 humano, por ejemplo, anticuerpos, tendrán utilidades clínicas similares a los agentes de unión selectivos de TSH y, por lo tanto, serán útiles para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades y trastornos relacionados con la glándula tiroides. Además, los agentes de unión selectivos para \alpha2/\beta10 humano pueden tener otros usos terapéuticos y de diagnóstico como se describe en este documento.
Esta invención proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en:
(i)
la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 2;
(ii)
una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 1;
(iii)
una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones altamente rigurosas al complemento de (i) o (ii);
(iv)
una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de (i) - (ii);
(v)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70 por ciento con el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 1;
(vi)
una secuencia de nucleótidos que codifica una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 2;
(vii)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido expuesto en SEC ID Nº 1 con al menos una sustitución de aminoácido conservativa;
(viii)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se expone en SEC ID Nº: 1 con al menos una inserción de aminoácido;
(ix)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se expone en SEC ID Nº: 1 con al menos una supresión de aminoácido;
(x)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se expone en SEC ID Nº 1 que tiene un truncamiento en el extremo C y/o N;
(xi)
una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones altamente rigurosas al complemento de cualquiera de (viii) - (xii);
(xii)
una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de (viii) - (xi) donde el polipéptido codificado de (iii), (v) - (xi), cuando se heterodimeriza al polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano, tiene una actividad del heterodímero de la hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 humana, para la preparación de un medicamento para modular los niveles de un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 en un animal.
La invención también proporciona un dispositivo, que comprende (a) una membrana adecuada para implante y (b) células encapsuladas dentro de dicha membrana, donde dichas células se han modificado por ingeniería genética para expresar y secretar un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:
(i)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3;
(ii)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos madura expuesta en SEC ID Nº: 3, que comprende un extremo amino maduro en el residuo 1 comprendiendo además opcionalmente una metionina amino terminal;
(iii)
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para un ortólogo de SEC ID Nº: 3;
(iv)
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70 por ciento con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3;
(v)
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3 o al menos una de (ii) - (iv);
(vi)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3 con al menos una sustitución de aminoácido conservativa;
(vii)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3 con al menos una inserción de aminoácido;
(viii)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3 con al menos una supresión de aminoácido;
(ix)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3 que tiene un truncamiento en el extremo C y/o N;
(x)
un heterodímero de polipéptido \beta10 de hormona glicoproteica humano y polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano o una variante alélica o variante de empalme de los mismos, en el que el polipéptido de (iii) - (ix), cuando se heterodimeriza a polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano, tiene una actividad del heterodímero de la hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 humana y en el que dicha membrana es permeable a dicha proteína e impermeable a materiales perjudiciales para dichas células.
La invención también proporciona un heterodímero de polipéptido \beta10 de hormona glicoproteica humana de sub-secciones (i) - (ix) del dispositivo anterior y polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano.
También se proporcionan polipéptidos de fusión que comprenden el heterodímero anterior o variante alélica o variante de empalme del mismo fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
La presente invención también proporciona un vector que comprende moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido \beta10 de hormona glicoproteica humano de sub-secciones (i) - (ix) del dispositivo anterior y polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano.
La presente invención también proporciona una célula hospedadora que comprende el vector anterior.
Adicionalmente se proporcionan anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen específicamente a (a) el heterodímero \alpha2/\beta10 de la invención, (b) un fragmento del heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 o (c) una variante alélica o variante de empalme de a o b. Tales anticuerpos y péptidos pueden ser agonistas o antagonistas a una actividad del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10.
La invención también abarca las composiciones que comprenden el heterodímero \alpha2/\beta10, una variante alélica o variante de empalme del mismo, o un anticuerpo de unión específica de la presente invención y uno o más agentes de formulación farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas se usan para proporcionar cantidades terapéuticamente eficaces de los polipéptidos de la presente invención. La invención también se refiere a métodos para usar las moléculas de ácido nucleico.
La presente invención también proporciona un método para ensayar moléculas de ensayo para identificar una molécula de ensayo que se une a un heterodímero \alpha2/\beta10. El método comprende poner en contacto el heterodímero \alpha2/\beta10 con un compuesto y determinar el alcance de unión del compuesto al heterodímero \alpha2/\beta10.
Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 representa en orden lineal la región codificante completa de polipéptido \beta10 humano de acuerdo con esta invención (SEC ID Nº: 1). La región de péptido señal pronosticada está subrayada y la región que contiene el sitio de escisión de péptido señal pronosticada está en un recuadro. El resto de asparagina (N) que está localizado dentro del motivo de glicosilación NxT clásico y que es muy probable que esté glicosilado, se muestra en una fuente más grande. La secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica este polipéptido (SEC ID Nº: 2) comprende los nucleótidos 1-390, inclusive, de la secuencia de ácido nucleico mostrada en esta figura.
La Figura 2A-2D ilustra el grado de relación de los polipéptidos de subunidad \beta de hormona glicoproteica humanos conocidos (técnica anterior) y el polipéptido \beta10 de esta invención. La forma madura de \beta10 usada para estas comparaciones (SEC ID Nº: 3) representa muy probablemente la forma in vivo auténtica del polipéptido \beta10. Las Figuras 2A-D comprenden el rendimiento de GAP que muestra la homología de aminoácidos entre la forma madura de \beta10 y, respectivamente, subunidad \beta de TSH (hormona estimulante de la tiroides), subunidad \beta de FSH (hormona folículoestimulante), subunidad \beta de LH (hormona luteinizante) y subunidad \beta de CG-(gonadotropina coriónica).
La Figura 3 muestra los pares de cisteína (C) unidos por disulfuro probablemente de los cinco enlaces de disulfuro putativos en la forma madura más probable de \beta10 humano (SEC ID Nº: 3). Los diez residuos de cisteína se muestran en fuente grande y los enlaces de disulfuro se dibujan como líneas sólidas. Los tres enlaces de disulfuro (C12-C60, C36-C91, C40-C93) que forman el nudo de cistina están dibujados sobre la secuencia de aminoácidos y los dos enlaces de disulfuro adicionales (C26-C75, C96-C103) están dibujados debajo de la secuencia de aminoácidos.
La Figura 4 es el rendimiento de BestFit que muestra la homología de aminoácidos entre la forma madura de \beta10 humano y la forma madura de \beta10 de ratón. La forma madura de \beta10 humano usada para esta comparación (SEC ID Nº: 3) representa muy probablemente la forma in vivo auténtica del polipéptido \beta10 humano. La forma madura de \beta10 de ratón usada para esta comparación (SEC ID Nº: 13) representa muy probablemente la forma in vivo auténtica de polipéptido \beta10 de ratón.
Descripción detallada de la invención
Los títulos de las secciones en este documento son sólo para propósitos organizacionales y no se deben interpretar como limitantes de la materia objeto descrita en este documento. Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente como referencia en este documento.
Definiciones
Las expresiones "gen de \beta10" o "molécula de ácido nucleico de \beta10" o "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 2, una secuencia de nucleótidos que comprende el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 1, un nucleótido del inserto de ADN en la ATCC con Nº de Depósito PTA-1210 y moléculas de ácido nucleico como se definen en este documento.
La expresión "polipéptido \beta10" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 y polipéptidos relacionados. Los polipéptidos relacionados incluyen: variantes alélicas de polipéptido \beta10, ortólogos de polipéptido \beta10, variantes de empalme de polipéptido \beta10, variantes del polipéptido \beta10 y derivados del polipéptido \beta10. Los polipéptidos \beta10 pueden ser polipéptidos maduros, como se define en este documento y pueden o no tener un residuo de metionina amino terminal, dependiendo del método mediante el cual se preparen.
La expresión "variante alélica de polipéptido \beta10" se refiere a una de varias formas posibles alternativas de origen natural de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma de un organismo o una población de organismos.
La expresión "derivados de polipéptido \beta10" se refiere al polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3, variantes alélicas polipeptídicas del mismo, ortólogos polipeptídicos del mismo, variantes de empalme polipeptídicas del mismo o variantes polipeptídicas del mismo, como se define en este documento, que se han modificado químicamente.
La expresión "fragmento de polipéptido \beta10" se refiere a un polipéptido que comprende un truncamiento en el extremo amino (con o sin una secuencia líder) y/o un truncamiento en el extremo carboxilo del polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3, variantes alélicas polipeptídicas del mismo, ortólogos polipeptídicos del mismo, variantes de empalme polipeptídicas del mismo y/o una variante polipeptídica del mismo que tienen uno o más adiciones o sustituciones o supresiones internas de aminoácidos (donde el polipéptido resultante tiene al menos 6 aminoácidos o más de longitud) en comparación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido \beta10 expuesta en SEC ID Nº: 3. Los fragmentos de polipéptido se pueden producir a partir del empalme de ARN alternativo o a partir de actividad de proteasa in vivo. En realizaciones preferidas, el truncamiento comprende aproximadamente 10 aminoácidos o aproximadamente 20 aminoácidos o aproximadamente 50 aminoácidos o aproximadamente 75 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos o más de aproximadamente 100 aminoácidos. Los fragmentos de polipéptido producidos de este modo comprenderán aproximadamente 25 aminoácidos contiguos o aproximadamente 50 aminoácidos o aproximadamente 75 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos o aproximadamente 150 aminoácidos o aproximadamente 200 aminoácidos. Tales fragmentos de polipéptido pueden comprender opcionalmente un resto de metionina amino terminal. Se apreciará que tales fragmentos se pueden usar, por ejemplo, para generar anticuerpos para polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10.
La expresión "polipéptido de fusión \beta10" se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tales como un péptido o polipéptido heterólogo) en el extremo amino o carboxilo del polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3, variantes alélicas polipeptídicas, ortólogos polipeptídicos, variantes de empalme polipeptídicas o variantes polipeptídicas que tienen una o más supresiones, sustituciones o adiciones internas de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del polipéptido \beta10 expuesta en SEC ID Nº: 3.
La expresión "ortólogo de polipéptido \beta10" se refiere a un polipéptido de otra especie que corresponde a la secuencia de aminoácidos del polipéptido \beta10 expuesta en SEC ID Nº: 3. Por ejemplo, los polipéptidos \beta10 de ratón y humano se consideran ortólogos entre sí.
La expresión "variante de empalme de polipéptido \beta10" se refiere a una molécula de ácido nucleico, habitualmente ARN, que se genera mediante procesamiento alternativo de secuencias intrónicas en un transcrito de ARN de la secuencia de aminoácidos del polipéptido \beta10 expuesta en SEC ID Nº: 3.
La expresión "variantes de polipéptido \beta10" se refiere a polipéptidos similares a \beta10 que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen una o más sustituciones, supresiones (tales como supresiones internas y/o fragmentos polipeptídicos) y/o adiciones (tales como adiciones internas y/o polipéptidos de fusión) de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de polipéptido \beta10 expuesta en SEC ID Nº: 3. Las variantes pueden ser de origen natural (por ejemplo, variantes alélicas de polipéptido similar a \beta10, ortólogos polipeptídicos y variantes de empalme polipeptídicas) o construida artificialmente. Tales variantes polipeptídicas se pueden preparar a partir de moléculas de ácido nucleico correspondientes que tienen una secuencia de ADN que varía en consecuencia a partir de la secuencia de ADN expuesta en SEC ID Nº: 2. En realizaciones preferidas, las variantes tienen de 1 a 3 o de 1 a 5 o de 1 a 10 o de 1 a 15 o de 1 a 20 o de 1 a 25 o de 1 a 50 o de 1 a 75 o de 1 a 100 o más de 100 sustituciones, inserciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos, donde las sustituciones puede ser conservativas o no conservativas o cualquier combinación de las mismas.
La expresión "heterodímero \alpha2/\beta10" se refiere a un heterodímero del polipéptido \beta10 y del polipéptido \alpha2.
El término "antígeno" se refiere a una molécula o una parte de una molécula capaz de estar unida por un agente de unión selectivo, tal como un anticuerpo y, adicionalmente, capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.
La expresión "polipéptidos \beta10 biológicamente activos" se refiere a polipéptidos similares a \beta10 que, cuando se heterodimerizan a polipéptido \alpha2 humano, tienen una actividad del heterodímero \alpha2/\beta10 humano.
Las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" cada una se refiere a la cantidad de una molécula de ácido nucleico \beta10 o un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención usada para apoyar un nivel observable de una o más actividades biológicas del heterodímero \alpha2/\beta10 descrito en este documento.
La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para uso en una célula hospedadora y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico heterólogas. La expresión incluye, pero sin limitación, procesos tales como transcripción, traducción y empalme de ARN, si están presentes intrones.
La expresión "célula hospedadora" se usa para referirse a una célula que se ha transformado o es capaz de transformarse con una secuencia de ácido nucleico y después de expresar un gen seleccionado de interés. La expresión incluye la descendencia de la célula parental, sea o no la descendencia idéntica en morfología o en construcción genética al progenitor original, siempre y cuando esté presente el gen seleccionado.
El término "identidad" como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, determinada al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de secuencia entre moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, como puede ser el caso, determinado por la coincidencia entre hileras de dos o más nucleótidos o dos o más secuencias de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de hueco (si existiera alguna), dirigida por un modelo matemático particular o programa informático (es decir, "algoritmos").
El término "similitud" es un concepto relacionado, pero a diferencia de "identidad", se refiere a una medida de similitud que incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias de sustituciones conservativas. Si dos secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos y el resto son sustituciones no conservativas, entonces el porcentaje de identidad y similitud serán ambos del 50%. Si en el mismo ejemplo, existen 5 posiciones más donde hay sustituciones conservativas, entonces el porcentaje de identidad permanece al 50%, pero el porcentaje de similitud sería del 75% (15/20). Por lo tanto, en los casos en los que hay sustituciones conservativas, el grado de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el porcentaje de identidad entre esos dos polipéptidos.
La expresión "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que está libre de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la se asocia de forma natural. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente libre de cualquier otra molécula o moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso en producción de polipéptidos o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.
La expresión "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la presente invención que está libre de al menos un polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.
La expresión "polipéptido \beta10 maduro" se refiere a un polipéptido \beta10 que carece de una secuencia líder. Un polipéptido \beta10 maduro también puede incluir otras modificaciones tales como procesamiento proteolítico del extremo amino (con o sin una secuencia líder) y/o el extremo carboxilo, escisión de un polipéptido más pequeño a partir de un precursor más grande, glicosilación enlazada a N y/o enlazada a O y similares.
La expresión "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. La expresión abarca moléculas formadas a partir de cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitación, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aciridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboxi-metilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil-metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.
Las expresiones "de origen natural" o "nativo" cuando se usan en relación con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospedadoras y similares, se refieren a materiales que se encuentran en la naturaleza y que no están manipulados por el hombre. De forma similar, "de origen no natural" o "no nativos" como se usan en este documento se refieren a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre.
La expresión "unido operativamente" se usa en este documento para referirse a un orden de secuencias flanqueantes en el que las secuencias flanqueantes descritas están configuradas o ensambladas para realizar su función habitual. Por tanto, una secuencia flanqueante unida operativamente a una secuencia codificante puede ser capaz de lograr la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia codificante. Por ejemplo, una secuencia codificante está unida operativamente a un promotor cuando el promotor es capaz de dirigir la transcripción de esa secuencia codificante. Una secuencia flanqueante no necesita ser contigua a la secuencia codificante, siempre y cuando funcione de forma correcta. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intervinientes no traducidas pero transcritas entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavía se puede considerar "unida operativamente" a la secuencia codificante.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable" como se usa en este documento se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para conseguir o mejorar la administración de una molécula de ácido nucleico \beta10, polipéptido \beta10/, heterodímero \alpha2/\beta10 o agentes de unión selectivos de la presente invención como una composición farmacéutica.
La expresión "agente de unión selectivo" se refiere a una molécula o moléculas que tienen especificidad por el polipéptido \beta10 y/o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención. Como se usan en este documento, los términos "específico" y "especificidad" se refieren a la capacidad de los agentes de unión selectivos de unirse a polipéptido \beta10 humano y/o heterodímero \alpha2/\beta10 y no unirse a polipéptido no \beta10 humano y/o heterodímero no \alpha2/\beta10. Sin embargo, se apreciará que los agentes de unión selectivos también se pueden unir a ortólogos del polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3 y/u ortólogos del heterodímero \alpha2/\beta10 humano, es decir, versiones interespecie de los mismos, tales como polipéptidos de ratón y de rata.
El término "transducción" se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente mediante un fago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucariotas mediante retrovirus.
El término "transfección" se usa para referirse a la captación de ADN ajeno o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. En el campo se conocen varias técnicas de transfección y se describen en este documento. Véase, por ejemplo, Graham et al., Virology, 52: 456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (Nueva York, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, 1986 y Chu et al., Gene, 13: 197 (1981). Tales técnicas se pueden usar para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células hospedadoras adecuadas.
El término "transformación" como se usa en este documento se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para que contenga un ADN nuevo. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo. A continuación de la transfección o transducción, el ADN transformante se puede recombinar con el de la célula integrándose físicamente en un cromosoma de la célula, se puede mantener transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse o se puede replicar independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado de forma estable cuando el ADN se replica con la división de la célula.
El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) usada para transferir información codificante a una célula hospedadora.
Grado de Relación de Moléculas de Ácido Nucleico y/o Polipéptidos
Se aprecia que las moléculas de ácido nucleico relacionadas incluyen variantes alélicas o de empalme de la molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 2 e incluyen secuencias que son complementarias a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende o consiste básicamente en una sustitución, modificación, adición y/o una supresión de uno o más restos aminoacídicos en comparación con el polipéptido en SEC ID Nº: 1.
Los fragmentos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de al menos aproximadamente 25 restos aminoacídicos o aproximadamente 50 o aproximadamente 75 o aproximadamente 100 o más de aproximadamente 100 restos aminoacídicos del polipéptido de SEC ID Nº: 1.
Además, las moléculas de ácido nucleico de \beta10 relacionadas incluyen aquellas moléculas que comprenden secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones moderadamente o altamente rigurosas, como se define en este documento, con la secuencia completamente complementaria de la molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 2 o de una molécula que codifica un polipéptido, polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 o de un fragmento de ácido nucleico como se define en este documento o de un fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en este documento. Se pueden preparar sondas de hibridación usando las secuencias de \beta10 proporcionadas en este documento para explorar genotecas de ADNc, genómicas o de ADN sintético para secuencias relacionadas. Las regiones del ADN y/o secuencias de aminoácidos del polipéptido \beta10 que muestran identidad significativa hacia secuencias conocidas se determinaron fácilmente usando algoritmos de alineación de secuencia como se describe en este documento y esas regiones se pueden usar para diseñar sondas para exploración.
La expresión "condiciones altamente rigurosas" se refiere a las condiciones que se diseñan para permitir la hibridación de hebras de ADN cuyas secuencias son altamente complementarias y para excluir la hibridación de ADN significativamente no coincidentes. La rigurosidad de hibridación está determinada principalmente por temperatura, fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tales como formamida. Los ejemplos de "condiciones altamente rigurosas" para hibridación y lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68ºC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50% a 42ºC. Véase Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N. Y. 1989); Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: a practical approach, C. 4, IRL Press Limited (Oxford,
Inglaterra).
También se pueden usar condiciones más rigurosas (tales como temperatura más alta, fuerza iónica más baja, formamida más alta u otros agentes desnaturalizantes), sin embargo, influirán sobre la velocidad de hibridación. Se pueden incluir otros agentes en los tampones de hibridación y lavado con el propósito de reducir la hibridación inespecífica y/o de fondo. Los ejemplos son albúmina sérica bovina al 0,1%, polivinil-pirrolidona al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, dodecilsulfato de sodio al 0,1% (NaDodSO_{4} o SDS), ficoll, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque también se pueden usar otros agentes adecuados. La concentración y tipos de estos aditivos se pueden cambiar sin influir considerablemente en la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los experimentos de hibridación habitualmente se realizan a pH 6,8-7,4, sin embargo, en condiciones de fuerza iónica típicas, la velocidad de hibridación es casi independiente del pH. Véase, Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: a Practical Approach, C. 4, IRL Press Limited (Oxford,
Inglaterra).
Los factores que influyen sobre la estabilidad de una doble hélice de ADN incluyen composición de bases, longitud y grado de desapareamiento de pares de bases. Las condiciones de hibridación las puede ajustar un especialista en la técnica para acomodar estas variables y permitir que los ADN de grado de relación de secuencia diferente formen híbridos. La temperatura de fusión de una doble hélice de ADN perfectamente apareada se puede estimar mediante la ecuación siguiente:
T_{m}(^{o}C) = 81.5\ +\ 16.6\ (log[Na+]\ +\ 0.41\ (%G+C) - 600/N - 0.72\ (%\ de\ formamida)
donde N es la longitud de la doble hélice formada, [Na+] es la concentración molar del ión sodio en la solución de hibridación o lavado, %G+C es el porcentaje de (guanina+citosina) bases en el híbrido. Para híbridos apareados de forma imperfecta, la temperatura de fusión se reduce en aproximadamente 1ºC para cada desapareamiento del
1%.
La expresión "condiciones moderadamente rigurosas" se refiere a condiciones en las que es capaz de formar una doble hélice de ADN con un grado mayor de desapareamiento de pares de bases que el que podría ocurrir en "condiciones altamente rigurosas". Los ejemplos de "condiciones moderadamente rigurosas" son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 50-65ºC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 20% a 37-50ºC. A modo de ejemplo, una condición "moderadamente rigurosa" de 50ºC en ión sodio 0,015 M permitirá un desapareamiento de aproximadamente el 21%.
Los especialistas en la técnica apreciarán que no existe diferencia absoluta entre condiciones "altamente" y "moderadamente" rigurosas. Por ejemplo, a ión sodio 0,015 M (sin formamida), la temperatura de fusión de ADN largo perfectamente apareado es aproximadamente 71ºC. Con un lavado a 65ºC (a la misma fuerza iónica), esto permitiría un desapareamiento de aproximadamente el 6%. Para capturar secuencias más lejanas, un especialista en la técnica puede simplemente disminuir la temperatura o aumentar la fuerza iónica.
Una buena estimación de la temperatura de fusión en NaCl* 1 M para sondas de oligonucleótidos de hasta aproximadamente 20 nucleótidos está dada por:
Tm = 2^{o}C\ por\ par\ de\ bases\ A-T\ +\ 4^{o}C\ por\ par\ de\ bases\ G-C
* La concentración de ión sodio en sal de citrato de sodio 6X (SSC) es 1 M. Véase Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes, pág. 683, Brown y Fox (eds.) (1981).
Las condiciones de lavado de rigurosidad alta para oligonucleótidos habitualmente son a una temperatura de 0-5ºC inferior a la Tm del oligonucleótido en SSC 6X y SDS al 0,1%.
En otra realización, las moléculas de ácido nucleico relacionadas comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 70 por ciento con la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1. En realizaciones preferidas, las secuencias de nucleótidos tienen una identidad de aproximadamente el 70 por ciento, el 75 por ciento, el 80 por ciento o aproximadamente el 85 por ciento o aproximadamente el 90 por ciento o aproximadamente el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 por ciento con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1.
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Las diferencias en la secuencia de ácido nucleico pueden dar como resultado modificaciones conservativas y/o no conservativas de la secuencia de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1.
Las modificaciones conservativas a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 (y las modificaciones correspondientes a los nucleótidos codificantes) producirán polipéptidos similares a \beta10 de acuerdo con esta invención que tengan características funcionales y químicas similares a las del polipéptido \beta10 de origen natural. Por el contrario, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas del polipéptido \beta10 se pueden conseguir seleccionado sustituciones en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 que difieran significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena de lateral.
Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un resto aminoacídico nativo con un resto no nativo de manera que exista poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del resto aminoacídico en esa posición. Además, cualquier resto nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina, como se ha descrito previamente para "mutagénesis mediante alanina".
Las sustituciones de aminoácidos conservativas también abarcan restos aminoacídicos de origen no natural que típicamente se incorporan mediante síntesis peptídica química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Los mismos incluyen peptidomiméticos y otras formas opuestas o invertidas de restos aminoacídicos.
Los restos de origen natural se pueden dividir en clases basándose en propiedades de cadena lateral comunes:
1)
hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2)
hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3)
ácidos: Asp, Glu;
4)
básicos: His, Lys, Arg;
5)
restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro y
6)
aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Por ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales restos sustituidos se pueden introducir en regiones del polipéptido \beta10 humano que sean homólogas con ortólogos de polipéptido \beta10 no humano o en las regiones no homólogas de la molécula.
Para realizar tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de aminoácidos. A cada aminoácido se ha asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina
(-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).
En la técnica se aprecia la importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir función interactiva biológica sobre una proteína. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Se conoce que se pueden sustituir determinados aminoácidos por otros aminoácidos que tengan índice o valor hidropático similar y aún conservar una actividad biológica similar. Para realizar cambios basándose en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de \pm 2, son particularmente preferidos aquellos que están dentro de \pm 1 y son aún más particularmente preferidos aquellos dentro de \pm 0,5.
También se aprecia en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar eficazmente en base a la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcionalmente equivalente creado de ese modo tenga por objeto usarse en realizaciones inmunológicas, como en el presente caso. La mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a restos aminoacídicos: arginina (+3,0), lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Para realizar estos cambios basándose en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de \pm 2, son particularmente preferidos aquellos que están dentro de \pm 1 y son aún más particularmente preferidos aquellos dentro de \pm 0,5. También se pueden identificar epítopos a partir de secuencias de aminoácidos principales en base a la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan "regiones de núcleo epitópico".
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (conservativas o no conservativas) las puede determinar un especialista en la técnica en el momento en el que se desean tales sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden usar para identificar restos importantes del polipéptido \beta10 o para aumentar o disminuir la afinidad de polipéptidos \beta10 o de los heterodímeros \alpha2/\beta10 descritos en este documento.
Las sustituciones de aminoácidos ilustrativas se exponen en la Tabla I.
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TABLA I Sustituciones de Aminoácidos
1 
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Un especialista será capaz de determinar variantes adecuadas de los polipéptidos de SEC ID Nº: 1 ó 3 usando técnicas bien conocidas. Para identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad, un especialista en la técnica puede fijar como dianas áreas que no se cree que sean importantes para actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares de la misma especie o de especies diferentes, un especialista en la técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 con tales polipéptidos similares. Con una comparación de este tipo, se pueden identificar restos y partes de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios en áreas de un polipéptido \beta10 que no están conservadas con relación a tales polipéptidos similares tendrían menos probabilidad de influir negativamente en la actividad biológica y/o estructura del polipéptido \beta10 o del heterodímero \alpha2/\beta10. Un especialista en la técnica también sabría que, incluso en regiones relativamente conservadas, se pueden sustituir aminoácidos químicamente similares por los restos de origen natural mientras se conserva la actividad (sustituciones de restos aminoacídicos conservativas). Por lo tanto, incluso áreas que pueden ser importantes para actividad biológica o para estructura se pueden someter a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin influir negativamente en la estructura del polipéptido.
Adicionalmente, un especialista en la técnica puede revisar estudios de estructura-función que identifican restos en polipéptidos similares que son importantes para actividad o estructura. Considerando una comparación de este tipo, se puede pronosticar la importancia de restos aminoacídicos en un polipéptido \beta10 que correspondan a restos aminoacídicos que son importantes para actividad o estructura en polipéptidos similares. Un especialista en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales restos aminoacídicos importantes pronosticados del polipéptido \beta10.
Un especialista en la técnica también puede analizar la estructura de tres dimensiones y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. Considerando esa información, un especialista en la técnica puede pronosticar la alineación de restos aminoacídicos de un polipéptido \beta10 con respecto a su estructura de tres dimensiones. Un especialista en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales a los restos aminoacídicos pronosticados que están en la superficie de la proteína, ya que tales restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un especialista en la técnica puede generar variantes de ensayo que contengan una sustitución de aminoácido única en cada resto aminoacídico deseado. Las variantes después se pueden explorar usando ensayos de actividad conocidos por los especialista en la técnica. Tales variantes se podrían usar para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se observa que un cambio en un resto aminoacídico particular da como resultado actividad destruida, reducida indeseablemente o inadecuada, se evitarían las variantes con un cambio de este tipo. En otras palabras, basándose en información recopilada a partir de experimentos de rutina, un especialista en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que se deben evitar sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.
Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. In Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Además, actualmente están disponibles programas informáticos para ayudar a pronosticar estructura secundaria. Un método para pronosticar estructura secundaria se basa en modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor del 30% o una similitud mayor del 40% con frecuencia tienen topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado previsibilidad mejorada de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol. 7(3): 369-376 (1997)) que existe un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto el número crítico de estructuras, la predicción estructural será espectacularmente más
precisa.
Los métodos adicionales para pronosticar estructura secundaria incluyen "reconocimiento de plegamiento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) y "enlace evolutivo" (véase Home, anteriormente y Brenner, anteriormente).
Las variantes de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 preferidas de acuerdo con esta invención incluyen variantes de glicosilación en las que el número y/o tipo de sitios de glicosilación se ha alterado en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1. En una realización, las variantes de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de acuerdo con esta invención comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación enlazados a N que la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1. Un sitio de glicosilación enlazado a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde el resto aminoacídico denominado X puede ser cualquier resto aminoacídico excepto prolina. La sustitución o las sustituciones de restos aminoacídicos para crear esta secuencia proporcionan un sitio nuevo potencial para la adición de una cadena de carbohidrato enlazada a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminan esta secuencia retirarán una cadena de carbohidrato enlazada a N existente. También se proporciona un rearreglo de cadenas de carbohidrato enlazadas a N donde se eliminan uno más sitios de glicosilación enlazados a N (típicamente los de origen natural) y se crean uno o más sitios enlazados a N nuevos. Las variantes de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 adicionales preferidas incluyen variantes de cisteína, en las que uno o más restos de cisteína se suprimen o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1. Las variantes de cisteína son útiles cuando el polipéptido \beta10 o el heterodímero \alpha2/\beta10 se tienen que volver a plegar en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína en general tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa y, típicamente, tienen un número par para minimizar interacciones que se producen como resultado de cisteínas sin emparejamiento.
Además, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 o una variante polipeptídica del mismo se puede fusionar a un polipéptido heterólogo, tal como pero sin limitación \alpha2, para formar un heterodímero. Los péptidos y polipéptidos heterólogos incluyen, pero sin limitación: un epítopo para permitir la detección y/o aislamiento de un polipéptido de fusión \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10; una proteína receptora transmembrana o una parte de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio transmembrana e intracelular; un ligando o una parte del mismo que se une a una proteína receptora transmembrana; una enzima o parte de la misma que es catalíticamente activa; un polipéptido o péptido que promueve oligomerización, tal como un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido con el cual \beta10 normalmente se dimeriza, tal como \alpha2; un polipéptido o péptido que aumenta la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina y un polipéptido que tiene una actividad terapéutica diferente del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o una variante polipeptídica del mismo.
Las fusiones se pueden preparar en el extremo amino o en el extremo carboxilo del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o una variante polipeptídica. Las fusiones pueden ser directas sin molécula enlazadora o adaptora o indirectas usando una molécula enlazadora o adaptora. Una molécula enlazadora o adaptora puede ser uno o más restos aminoacídicos, típicamente hasta aproximadamente 20 a aproximadamente 50 restos aminoacídicos. También se puede diseñar una molécula enlazadora o adaptadora con un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa para permitir la separación de los restos fusionados. Se apreciará que una vez construidos, los polipéptidos de fusión se pueden derivatizar de acuerdo con los métodos descritos en este documento.
En una realización adicional de la invención, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 o una variante polipeptídica se fusiona a uno o más dominios de una región Fc de IgG humana. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se une a antígeno, y un dominio constante conocido como "Fc", que está implicado en funciones efectoras tales como activación de complemento y ataque por células fagocíticas. Un Fc tiene una semivida en suero larga, mientras que un Fab es efímero. Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989). Cuando se construye junto con una proteína terapéutica, un dominio Fc puede proporcionar vida media más larga o incorporar funciones tales como unión de receptor de Fc, unión de proteína A, fijación de complemento y, tal vez, incluso transferencia placentaria. Igualmente, la Tabla II resume el uso de determinadas fusiones de Fc conocidas en la técnica.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA II Fusión de Fc con Proteínas Terapéuticas
2
En un ejemplo, todo o una parte de las regiones de bisagra CH2 y CH3 de IgG humana se pueden fusionar en cualquiera del extremo N o extremo C de un polipéptido \beta10 de esta invención usando métodos conocidos por el especialista. El polipéptido de fusión \beta10 o polipéptido de fusión \alpha2/\beta10 resultante se puede purificar mediante el uso de una columna de afinidad de Proteína A. Los péptidos y proteínas fusionados a una región Fc se ha observado que muestran una semivida sustancialmente mayor in vivo que el homólogo no fusionado. También, una fusión o una región Fc permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fc puede ser una región Fc de origen natural o puede estar alterada para mejorar determinadas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de circulación, reducir agregación, etc.
La identidad y similitud de moléculas de ácido nucleico relacionadas y polipéptidos se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero sin limitación, los descritos en Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991 y Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).
Los métodos preferidos para determinar identidad y/o similitud se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar identidad y similitud se describen en programas informáticos disponibles al público. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI). BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible al público en el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/MLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., anteriormente). También se puede usar para determinar identidad el conocido algoritmo de Smith Waterman.
Determinados esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la coincidencia de sólo una región corta de las dos secuencias y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta aunque no exista una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en una realización preferida, el método de alineación seleccionado (programa GAP) dará como resultado una alineación que se extiende a al menos cincuenta (50) aminoácidos contiguos del polipéptido diana.
Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), dos polipéptidos para los que el porcentaje de identidad de secuencia se tiene que determinar se alinean para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos ("el tramo coincidente" determinado por el algoritmo). Junto con el algoritmo se usan una penalización de abertura de hueco (que se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se está usando; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia de aminoácido perfecta por la matriz de comparación particular) y una penalización de extensión de hueco (que habitualmente es 1/10 veces la penalización de abertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. El algoritmo también usa una matriz de comparación convencional (véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62).
Los parámetros preferidos para una comparación de secuencia polipeptídica incluyen los siguientes:
\bullet
Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970);
\bullet
Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915-10919 (1992);
\bullet
Penalización de Hueco: 12
\bullet
Penalización de Longitud de Hueco: 4
\bullet
Umbral de similitud: 0.
El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de polipéptidos (junto con no penalización para huecos finales) usando el algoritmo GAP.
Los parámetros preferidos para comparaciones de secuencia de molécula de ácido nucleico incluyen los siguientes:
\bullet
Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970);
\bullet
Matriz de comparación: coincidencias = +10, falta de coincidencia = 0.
\bullet
Penalización de Hueco: 50
\bullet
Penalización de Longitud de Hueco: 3.
El programa GAP también es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de moléculas de ácido nucleico.
Se pueden usar otros algoritmos ilustrativos, penalizaciones de abertura de hueco, penalizaciones de extensión de hueco, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc., incluyendo los que se exponen en el Program Manual, Wisconsin Package, Versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares que se tienen que hacer serán evidentes para los especialistas en la técnica y dependerán de la comparación específica que se tiene que realizar, tal como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a ADN y, adicionalmente, si la comparación es entre pares dados de secuencias (en cuyo caso generalmente se prefieren GAP o BestFit) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).
Síntesis
Los especialitas en la técnica apreciarán que las moléculas de ácido nucleico y polipéptido descritas en este documento se pueden producir por medios recombinantes y otros medios.
Moléculas de Ácido Nucleico
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 de esta invención se pueden obtener fácilmente de una diversidad de maneras que incluyen, sin limitación, síntesis química, exploración de genoteca de ADNc o genómica, exploración de biblioteca de expresión y/o amplificación por PCR de ADNc.
Los métodos de ADN recombinante usados en este documento son, en general, los que se exponen en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y/o Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, NY, (1994). La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico descritas en este documento y métodos para obtener las moléculas.
Cuando un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 se ha identificado como de una especie, todo o una parte de ese gen se puede usar como una sonda para identificar ortólogos o genes relacionados de la misma especie. Las sondas o cebadores se pueden usar para explorar genotecas de ADNc a partir de diversas fuentes de tejido que se cree que expresan el polipéptido \beta10. Además, parte o toda una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2 se puede usar para explorar una biblioteca genómica para identificar y aislar un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10. Típicamente, se emplearán condiciones de rigurosidad moderada o alta para exploración para minimizar el número de falsos positivos obtenidos a partir de la exploración.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 también se pueden identificar mediante clonación de expresión que emplea detección de clones positivos basándose en una propiedad de la proteína expresada. Típicamente, se exploran bibliotecas de ácido nucleico mediante la unión de un anticuerpo u otro compañero de unión (por ejemplo, receptor o ligando) a proteínas clonadas que se expresan y presentan en la superficie de una célula hospedadora. El anticuerpo o compañero de unión se modifica con un marcador detectable para identificar las células que expresan el clon deseado.
Las técnicas de expresión recombinante conducidas de acuerdo con las descripciones expuestas más adelante se pueden seguir para producir estos polinucleótidos y para expresar los polipéptidos codificados. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 en un vector apropiado, un especialista en la técnica puede producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleótidos deseada. Después las secuencias se pueden usar para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Como alternativa, se puede insertar un polinucleótido que codifique la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 en un vector de expresión. Introduciendo el vector de expresión un hospedador apropiado, se puede producir el polipéptido \beta10 codificado en grandes cantidades.
Otro método para obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada es la reacción en cadena de polimerasa (PCR). En este método, se prepara ADNc a partir de ARN poli(A)+ o ARN total usando la enzima transcriptasa inversa. Después, se añaden al ADNc dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas de ADNc (oligonucleótidos) que codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10, junto con una polimerasa tal como Taq polimerasa y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.
Otro medio para preparar una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 es síntesis química usando métodos bien conocidos por los especialistas, tales como los descritos por Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-734 (1989). Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos de fosfotriéster, fosforamidita y H-fosfonato para síntesis de ácido nucleico. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis apoyada por polímero usando química de fosforamidita convencional. Típicamente, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 tendrá varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 nucleótidos se pueden sintetizar como varios fragmentos usando estos métodos. Los fragmentos después se pueden ligar entre sí para formar la secuencia de nucleótidos de longitud completa de un polipéptido \beta10. Habitualmente, el fragmento de ADN que codifica el extremo amino del polipéptido tendrá un ATG, que codifica un resto de metionina. Esta metionina puede o no estar presente en la forma madura del polipéptido \beta10, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula hospedadora está diseñado para secretarse a partir de esa célula. También se pueden usar otros métodos conocidos por el especialista.
En determinadas realizaciones, las variantes de ácido nucleico contienen codones que se han alterado para la expresión óptima de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en una célula hospedadora dada. Las alteraciones de codón particulares dependerán del polipéptido o polipéptidos \beta10 y la célula o células hospedadoras seleccionadas para expresión. Tal "optimización de codón" se puede realizar mediante una diversidad de métodos, por ejemplo, explorando codones que se prefieran para uso en genes altamente expresados en una célula hospedadora dada. Se pueden usar los algoritmos informáticos que incorporan tablas de frecuencia de codón tales como "Ecohigh._Cod" para preferencia de codón de genes bacterianos altamente expresados y se proporcionan por el Paquete de la Universidad de Wisconsin Versión 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI. Otras tablas de frecuencia de codón útiles incluyen "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod" y "Yeast_high.cod".
Vectores y Células Hospedadoras
Cuando se contempla la expresión de un heterodímero \alpha2/\beta10, se debe apreciar que el vector de expresión de polipéptido \beta10 así como un vector de expresión que codifica el polipéptido \alpha2 ambos se pueden introducir (por ejemplo, transformar, co-transformar, transfectar, co-transfectar, transducir, co-transducir) en una célula hospedadora, línea celular, tejido, órgano, animal o planta. También se aprecia que la introducción de un vector de expresión de polipéptido \beta10 solo en una célula hospedadora, línea celular, tejido, órgano, animal o planta que ya produce polipéptido \alpha2 puede dar como resultado la producción de novo o mejorada de un heterodímero \alpha2/\beta10. Como se ha descrito anteriormente, en el ensayo de heterodimerización se produjo heterodímero \alpha2/\beta10 recombinante marcado con poliHis y FLAG mediante co-transfección de células de mamífero. Las hormonas glicoproteicas heterodiméricas tales como CG también se pueden ensamblar in vitro tras la co-incubación de, por ejemplo, subunidad alfa aislada y subunidad \beta de CG aislada en condiciones adecuadas [véase Blithe e Iles, Endocrinology, volumen 136, páginas 903-910 (1995)]. De forma similar, el heterodímero \alpha2/\beta10 se podría ensamblar in vitro tras la incubación de polipéptido \alpha2 aislado y polipéptido \beta10 aislado. El resultado puede ser una mezcla de polipéptido \alpha2, polipéptido \beta10 y heterodímero \alpha2/\beta10. Cada uno de estos productos se podría aislar en forma purificada usando métodos convencionales tales como cromatografía de exclusión por tamaño y/o cromatografía de inmunoafinidad. Con respecto a esto, se pueden producir por separado polipéptido \alpha2 solo y polipéptido \beta10 solo y secretarse a partir de células de mamífero como se ha descrito más adelante. Un vector de expresión de mamífero \alpha2 marcado con poliHis humano se transfectó en células 293 y después de 72 horas se recogió medio acondicionado sin suero. La transferencia de Western de este medio acondicionado se sondeó con anticuerpos policlonales de conejo anti-\alpha2 purificados por afinidad (ejemplo 4) que se habían conjugado a Peroxidasa de Rábano Picante (Linx HRP Rapad Protein Conjugation Kit, Nº de Cat. K8050-01, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Se observó una banda marcada usando el kit de detección de Transferencia de Western ECL (Nº de Cat RPN 2106, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) demostrando que un polipéptido \alpha2 humano se podría secretar en ausencia de polipéptido \beta10. Un vector de expresión de mamífero \beta10 marcado con FLAG humano se transfectó en células 293 y 72 horas después se recogió medio acondicionado sin suero. La transferencia de Western en este medio acondicionado se sondeó con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 biotinilado (Nº de cat F9291, Sigma, St. Louis, MO) y después se sondeó con Peroxidasa de Rábano Picante enlazada a Estreptavidina (RPN 1231, Amersham Life Sciences). Se observó una banda marcada usando el kit de detección de Transferencia de Western ECL (Nº de cat. RPN 2106, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) demostrando que el polipéptido \beta10 humano se podría secretar en ausencia del polipéptido \alpha2.
Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 se puede insertar en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligamiento convencionales. El vector típicamente se selecciona para que sea funcional en la célula hospedadora particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora de manera que pueda ocurrir la amplificación del gen y/o expresión del gen). Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido \beta10 de acuerdo con esta invención se puede amplificar/expresar en células hospedadoras procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La selección de la célula hospedadora dependerá en parte de si el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se modificará post-traduccionalmente (por ejemplo, se glicosilará y/o fosforilará). Si es así, son preferibles las células hospedadoras de levadura, insecto o mamífero. Para una revisión de vectores de expresión, véase Meth. Enz., v. 185 D. V. Goeddel, ed. Academic Press Inc., San Diego, CA 1990).
Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospedadoras contendrán secuencias para mantenimiento de plásmido y para clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente "secuencias flanqueantes" en determinadas realizaciones típicamente incluirán uno o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio de empalme donador y un aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para secreción de polipéptido, un sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se tiene que expresar y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se analiza más adelante.
Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia codificante de "etiqueta", es decir, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificante del polipéptido \beta10; la molécula de oligonucleótido codifica poliHis (tal como hexaHis) u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (hemaglutinina de virus Influenza) o myc para las cuales existen anticuerpos disponibles en el mercado. Esta etiqueta está típicamente fusionada al polipéptido tras la expresión del polipéptido y puede servir como un medio para purificación por afinidad del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de la célula hospedadora. La purificación por afinidad se puede conseguir, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos frente a la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede retirar posteriormente a partir del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 purificado por diversos medios tales como usando determinadas peptidasas para escisión.
Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora), heterólogas (es decir, de una especie diferente a la especie o cepa de la célula hospedadora), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente) o sintéticas o las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias nativas que normalmente funcionan para regular la expresión de polipéptido \beta10. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, con tal que la secuencia flanqueante sea funcional en y se pueda activar por, la maquinaria de la célula hospedadora.
Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores se pueden obtener por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en este documento diferentes a las secuencias flanqueantes de genes de \beta10 se habrán identificado previamente mediante cartografía y/o mediante digestión con endonucleasa de restricción y, por tanto, se pueden aislar a partir de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar usando los métodos descritos en este documento para síntesis o clonación de ácido nucleico.
Cuando se conoce toda o sólo una parte de la secuencia flanqueante, ésta se puede obtener usando PCR y/o mediante exploración de una biblioteca genómica con oligonucleótidos y/o fragmentos de secuencia flanqueante adecuados de la misma o de otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante a partir de un trozo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede conseguir mediante digestión con endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido de aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por el especialista. La selección de enzimas adecuadas para conseguir este propósito será fácilmente evidente para un especialista en la técnica.
Un origen de replicación es típicamente una parte de esos vectores de expresión procariotas adquiridos en el mercado y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedadora. La amplificación del vector hasta un determinado número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión óptima del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, se puede sintetizar uno químicamente basándose en una secuencia conocida y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (Nº de Producto 303-3s, de New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas y diversos orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o papiloma virus tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el componente del origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 con frecuencia se usa sólo debido a que contiene el promotor temprano).
Una secuencia de terminación de transcripción típicamente está localizada 3' del extremo de una región codificante de polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procariotas es un fragmento con alto contenido en G-C seguido por una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere en el mercado como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente usando métodos para síntesis de ácido nucleico tales como los descritos en este documento.
Un elemento de gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedadora cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina a células hospedadoras procariotas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula o (c) suministran nutrientes importantes no disponibles a partir del medio complejo. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. También se puede usar un gen de resistencia a neomicina para selección en células hospedadoras procariotas y eucariotas.
Se pueden usar otros genes de selección para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que los genes que tienen una demanda mayor para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se repiten en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección que sólo los transformantes están adaptados de forma única para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a amplificación de tanto el gen de selección como del ADN que codifica un polipéptido \beta10 de esta invención. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir del ADN amplificado.
Habitualmente es necesario un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas). El elemento típicamente se localiza 3' al promotor y 5' a la secuencia codificante del polipéptido \beta10 que se tiene que expresar. La secuencia Shine-Dalgarno se varía pero es típicamente una polipurina (es decir, que tiene un contenido de A-G elevado). Se han identificado muchas secuencias Shine-Dalgarno, cada una de las cuales se puede sintetizar fácilmente usando métodos expuestos en este documento y usarse en un vector procariota.
Se puede usar una secuencia líder o señal, para dirigir el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 fuera de la célula hospedadora. Típicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia señal está localizada en la región codificante de una molécula de ácido nucleico \beta10 o directamente en el extremo 5' de una región codificante de polipéptido \beta10. Se han identificado muchas secuencias señal y cualquiera de las mismas que sea funcional en la célula hospedadora seleccionada se puede usar junto con una molécula de ácido nucleico \beta10. Por lo tanto, una secuencia señal puede ser homóloga (de origen natural) o heteróloga un gen o ADNc de \beta10. Adicionalmente, una secuencia señal se puede sintetizar químicamente usando métodos descritos en este documento. En la mayoría de los casos, la secreción de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir de la célula hospedadora a través de la presencia de un péptido señal dará como resultado la remoción del péptido señal del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 secretado. La secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte de una molécula de ácido nucleico \beta10 que está insertada en el vector.
Dentro del alcance de esta invención se incluye el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal de polipéptido \beta10 nativa unida a una región codificante de polipéptido \beta10 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal heteróloga unida a una región codificante de polipéptido \beta10. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que se reconozca y procese, es decir, se escinda mediante una peptidasa de señal, por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal de de polipéptido \beta10 nativa, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa o enterotoxina II termoestable. Para secreción en levadura, la secuencia señal de de polipéptido \beta10 nativa se puede sustituir por los líderes de invertasa de levadura, factor alfa o fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero la secuencia señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias señal de mamífero.
En algunos casos, tales como cuando se desea la glicosilación en un sistema de expresión de células hospedadoras eucariotas, se pueden manipular las diversas presecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal particular o añadir presecuencias, que también influyen en la glicosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición 1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales inherentes a la expresión, que pueden no haberse retirado totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos restos aminoacídicos encontrados en el sitio de escisión de peptidasa, unidos al extremo N. Como alternativa, el uso de algunos sitios de escisión de enzima puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 deseado si la enzima corta en tal área dentro del polipéptido maduro.
En muchos casos, la transcripción de una molécula de ácido nucleico está aumentada por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando se produce un polipéptido en células hospedadoras eucariotas, especialmente células hospedadoras de mamífero. Los intrones usados pueden ser de origen natural dentro del gen de \beta10, especialmente cuando el gen usado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no es de origen natural dentro del gen (como la mayoría de ADNc), el intrón o los intrones se pueden obtener a partir de otra fuente. La posición del intrón con respecto a secuencias flanqueantes y el gen de \beta10 generalmente es importante, ya que el intrón se tiene que transcribir para ser eficaz. Por tanto, cuando se está transcribiendo una molécula de ADNc de \beta10, la posición preferida para el intrón es 3' al sitio de inicio de transcripción y 5' a la secuencia de terminación de transcripción poliA. Preferiblemente, el intrón o intrones estarán localizados a un lado o al otro (es decir, 5' o 3') del ADNc de manera que no interrumpa la secuencia codificante. Para practicar esta invención se puede usar cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo viral, procariota y eucariota (planta o animal), con tal que sea compatible con la célula o células hospedadoras en las que se inserta. En este documento también se incluyen intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede usar más de un intrón en el vector.
Los vectores de expresión y clonación de la presente invención cada uno contendrá típicamente un promotor que se reconoce por el organismo hospedador y unido operativamente a la molécula que codifica un polipéptido \beta10. Los promotores son secuencias no transcritas localizadas cadena arriba (5') al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pares de bases) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan oportunamente en una de dos clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Por otra parte, los promotores constitutivos inician la producción de producto génico continua; es decir, existe poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conoce un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales. Un promotor adecuado está unido operativamente al ADN que codifica un polipéptido \beta10 retirando el promotor del ADN de fuente mediante digestión de enzima de restricción e insertando la secuencia promotora deseada en el vector. La secuencia promotora de gen \beta10 nativa se puede usar para dirigir la amplificación y/o expresión de una molécula de ácido nucleico \beta10. Sin embargo, se prefiere un promotor heterólogo si permite transcripción mayor y producciones mayores de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo y si es compatible con el sistema de célula hospedadora que se ha seleccionado para uso.
Los promotores adecuados para uso con hospedadores procariotas incluyen los sistemas de promotor de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Sus secuencias se han publicado, permitiendo de ese modo a un especialista en la técnica ligarlos a la secuencia o secuencias de ADN deseadas, usando enlazadores o adaptadores según sea necesario para suministrar cualquier sitio de restricción útil.
En la técnica también se conocen promotores adecuados para uso con hospedadores de levadura. Los potenciadores de levadura se usan provechosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para uso con células hospedadoras de mamífero se conocen e incluyen, pero sin limitación, los que se obtienen a partir de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus (CMV), un retrovirus, virus de hepatitis B y más preferiblemente Virus Simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.
Los promotores adicionales que pueden ser de interés para controlar la transcripción génica de \beta10 incluyen, pero sin limitación: la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)); el promotor CMV; el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell 22: 787-797 (1980)); el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 1444-1445 (1981)); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 75: 3727-3731 (1978)) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80: 21-25 (1983)). También son de interés las siguientes regiones de control transcripcional animales, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Omitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, Nature 315: 155-122 (1985)); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38: 647-658 (1984); Adames et al., Nature 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7: 1436-1444, 1987); la región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45: 485-495 1986); la región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., Genes and Devel. 1: 268-276 1987); la región de control del gen de alfa-feto-proteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5: 1639-1648 1985; Hammer et al., Science 235: 53-58 1987); la región de control del gen de alfa-1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171,1987); la región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., Nature 315: 338-340, 1985; Kollias et al., Cell 46: 89-94, 1986); la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., Cell 48: 703-712, 1987); la región de control del gen de cadena ligera-2 de miosina que es activa en el músculo esquelético (Sani, Nature 314: 283-286, 1985) y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Mason et al., Science 234: 1372-1378, 1986).
Se puede insertar una secuencia potenciadora en el vector para aumentar la transcripción de un ADN que codifica un polipéptido \beta10 de la presente invención mediante eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de actuación cis de ADN, habitualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan en el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de orientación y posición. Los mismos se han encontrado 5' y 3' a la unidad de transcripción. Varias secuencias de potenciadores están disponibles a partir de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Sin embargo, típicamente, se usará un potenciador de un virus. El potenciador SV40, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y los potenciadores de adenovirus son elementos potenciadores ilustrativos para la activación de promotores eucariotas. Aunque un potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' a una molécula de ácido nucleico \beta10, típicamente se localiza en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión de la invención se pueden construir a partir de un vector llamativo tal como un vector disponible en el mercado. Tales vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes deseadas no están presentes en el vector, las mismas se pueden obtener individualmente y ligarse en el vector. Un especialista en la técnica conoce los métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes.
Los vectores preferidos para practicar esta invención son aquellos que son compatibles con células hospedadoras bacterianas, de insecto y de mamífero. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, Carlsbad, CA), pBSlI (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacll, Invitrogen), pDSR-alfa (Publicación PCT Nº WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY).
Los vectores adecuados adicionales incluyen, pero sin limitación, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero se apreciará que el sistema de vector tiene que ser compatible con la célula hospedadora seleccionada. Tales vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos tales como derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido basado en ColE1 con número de copia elevado, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA), plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados con Taq (por ejemplo, kit TOPO^{TM} TA Cloning®, derivados del plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA) y vectores de mamífero, levadura o virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA).
Después que el vector se ha construido y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido \beta10 en el sitio apropiado del vector, el vector completado se puede insertar en una célula hospedadora adecuada para amplificación y/o expresión polipeptídica. La transformación de un vector de expresión para un polipéptido \beta10 en una célula hospedadora seleccionada se puede conseguir por métodos bien conocidos que incluyen métodos tales como transfección, infección, cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método de DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedadora que se tiene que usar. Los especialistas conocen estos métodos y otros métodos adecuados y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., anteriormente.
Las células hospedadoras pueden ser células hospedadoras procariotas (tales como E. coli) o células hospedadoras eucariotas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de vertebrado). La célula hospedadora, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 que posteriormente se puede recoger del medio de cultivo (si la célula hospedadora lo secreta en el medio) o directamente a partir de la célula hospedadora que lo produce (si no lo secreta). La selección de una célula hospedadora apropiada dependerá de diversos factores, tales como niveles de expresión deseados, modificaciones polipeptídicas que son deseables o necesarias para actividad, tales como glicosilación o fosforilación y facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.
Se conocen varias células hospedadoras adecuadas en la técnica y muchas están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, células de mamífero, tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) (ATCC Nº CCL61), células DHFR CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 4216-4220 (1980)), células 293 o 293T de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC Nº CRL1573) o células 3T3 (ATCC Nº CCL92). La selección de células hospedadoras de mamífero adecuadas y métodos para transformación, cultivo, amplificación, exploración y producción de producto y purificación se conocen en la técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas de células COS-1 (ATCC Nº CRL1650) y COS-7 (ATCC Nº CRL1651) de mono y la línea de células CV-1 (ATCC Nº CCL70). Las células hospedadoras de mamífero ilustrativas adicionales incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, que incluyen líneas celulares transformadas. También son adecuadas células diploides normales, cepas celulares obtenidas de cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidatas pueden carecer genotípicamente del gen de selección o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 obtenidas de ratones Suizo, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o HaK, que están disponibles en la ATCC. Cada una estas líneas celulares se conoce y está disponible para los especialistas en la técnica de expresión de proteínas.
De forma similar las células bacterianas son útiles como células hospedadoras adecuadas para la presente invención. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101 (ATCC Nº 33694), DH5\alpha, DH10 y MC1061 (ATCC Nº 53338)) se conocen como células hospedadoras en el campo de biotecnología. También se pueden emplear diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otras Bacillus spp., Streptomyces spp. y similares en este método.
También están disponibles muchas cepas de células de levadura conocidas para los especialistas en la técnica como células hospedadoras para la expresión de los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 de la presente invención. Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerivisiae y Pichia pastoris.
Adicionalmente, cuando se desee, se pueden utilizar sistemas de células de insecto en los métodos de la presente invención. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 564-572 (1993) y Lucklow et al., (J. Virol., 67: 4566-4579 (1993)). Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
También se pueden usar animales transgénicos no humanos para expresar polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 glicosilados. Por ejemplo, se puede usar un animal productor de leche transgénico no humano (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 glicosilado en la leche del animal. También se pueden usar plantas para producir polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, sin embargo, en general, la glicosilación que ocurre en plantas es diferente de la que se produce en células de mamífero y puede dar como resultado un producto glicosilado que no sea adecuado para uso terapéutico humano.
Producción de Polipéptido
Se pueden cultivar células hospedadoras que comprenden un vector de expresión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 usando medios convencionales conocidos por los especialistas. Los medios habitualmente contendrán todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli incluyen, por ejemplo, Luria Broth (LB) y/o Terrific Broth (TB). Los medios adecuados para cultivar células eucariotas incluyen medio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), Medio Esencial Mínimo (MEM) y/o Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), los cuales se pueden complementar con suero y/o factores de crecimiento según se indique por la línea celular particular que se esté cultivando. Un medio adecuado para cultivos de insecto es medio de Grace complementado con yeastolato, hidrolisato de lactalbúmina y/o suero fetal bovino, según sea necesario.
Típicamente, se añade un antibiótico u otro compuesto útil para cultivo selectivo de células transfectadas o transformadas como un complemento al medio. El compuesto que se tiene que usar estará regido por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que se ha transformado la célula hospedadora. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina.
La cantidad de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 producida por una célula hospedadora se puede evaluar usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia de Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad tales como ensayos de retardo en gel de unión a ADN.
Si se ha diseñado un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 para que se secrete a partir de las células hospedadoras, la mayoría del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se pueden encontrar en el medio de cultivo celular. Sin embargo, si el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 no se secreta a partir de las células hospedadoras, estará presente en el citoplasma y/o el núcleo (para células hospedadoras eucariotas) o en el citosol (para células hospedadoras bacterianas).
Para un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 situado en el citoplasma y/o el núcleo de la célula hospedadora (para células hospedadoras eucariotas) o en el citosol (para células hospedadoras bacterianas), se puede extraer material intracelular (incluyendo cuerpos de inclusión para bacterias gram-negativas) a partir de las células hospedadoras usando cualquier técnica convencional conocida por el especialista. Por ejemplo, las células hospedadoras se pueden lisar para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante prensa Francesa, homogenización y/o sonicación seguido de centrifugación.
Si el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión con frecuencia se pueden unir a membranas celulares internas y/o externas y, por tanto, se encontrarán principalmente en el material sedimentado después de la centrifugación. El material sedimentado después se puede tratar a pH extremos o con un agente caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, separar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en su forma ahora soluble después se puede analizar usando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, el aislamiento se puede conseguir usando métodos convencionales como los expuestos más adelante y en Marston et al., Meth. Enz., 182: 264-275 (1990).
En algunos casos, el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 puede no ser biológicamente activo después del aislamiento. Se pueden usar diversos métodos para "replegar" o convertir el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en su estructura terciaria y generar enlaces de disulfuro para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen exponer el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 solubilizado a un pH habitualmente superior a 7 y en presencia de una concentración particular de un caótropo. La selección de caótropo es muy similar a las elecciones usadas para solubilización de cuerpos de inclusión, pero habitualmente el caótropo se usa en una concentración más baja y no es necesariamente el mismo caótropo que el usado para solubilización. En la mayoría de los casos la solución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una proporción específica para generar un potencial redox particular que permita que ocurra la redistribución de disulfuro en la formación del puente o los puentes de cisteína de la proteína. Algunos de los pares de redox usados comúnmente incluyen cisteína/cistamina, glutatión (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT y 2-2mercaptoetanol (bME)/ditio-b(ME). Se puede usar un co-disolvente para aumentar la eficacia del replegamiento y los reactivos más comunes usados con este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, arginina y similares.
Si no se han formado cuerpos de inclusión en un grado significativo tras la expresión de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, entonces el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se encontrará principalmente en el sobrenadante después de la centrifugación del homogenado celular. El polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se puede aislar adicionalmente a partir del sobrenadante usando métodos tales como los descritos en este documento.
La purificación de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir de una solución se puede conseguir usando una diversidad de técnicas. Si el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se ha sintetizado de manera que contenga una etiqueta tal como Hexahistidina (polipéptido \beta10-hexaHis, heterodímero \alpha2/\beta10-hexaHis) u otros péptidos pequeños tales como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) en cualquiera de sus extremos carboxilo o amino, se puede purificar en un proceso de una etapa pasando la solución a través de una columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una afinidad elevada por la etiqueta.
Por ejemplo, polihistidina se une con gran afinidad y especificidad a níquel y, por tanto, se puede usar una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel Qiagen®) para purificación de polipéptido \beta10-poliHis o heterodímero\alpha2/\beta10-hexaHis. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York (1993).
Adicionalmente, el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se puede purificar mediante el uso de un anticuerpo monoclonal que es capaz de reconocer y unirse específicamente al polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10.
Por tanto, los procedimientos de purificación adecuados incluyen, sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC), electroforesis (incluyendo electroforesis en gel nativo) seguido de elución en gel y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific, San Francisco, CA). En algunos casos, se pueden combinar dos o más de estas técnicas para conseguir pureza aumentada.
Los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 también se pueden preparar mediante métodos de síntesis química (tales como síntesis peptídica en fase sólida) usando técnicas conocidas en el campo, tales como las expuestas por Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Houghten et al., Proc Natl Acad. Sci. EE.UU. 82: 5132 (1985) y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). Tales polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 se pueden sintetizar con o sin una metionina en el extremo amino. Los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 sintetizados químicamente se pueden oxidar usando métodos expuestos en estas referencias para formar puentes de disulfuro. Los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 se espera que tengan actividad biológica comparable con los polipéptidos \beta10 (cuando se heterodimerizan a \alpha2) o heterodímeros \alpha2/\beta10 producidos de forma recombinante o purificados a partir de fuentes naturales y, por tanto, se pueden usar de manera intercambiable con un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 recombinante o natural.
Otros medios para obtener un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de acuerdo con esta invención son a través de purificación de muestras biológicas tales como tejidos y/o fluidos de fuente en los que se encuentra el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 naturalmente. Tal purificación se puede conducir usando métodos para purificación de proteínas como se ha descrito en este documento. La presencia del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 durante la purificación se puede supervisar usando, por ejemplo, un anticuerpo correspondiente preparado frente al polipéptido \beta10 producido de forma recombinante o fragmento peptídico del mismo o preparado frente a heterodímero \alpha2/\beta10 o fragmento peptídico producido de forma recombinante.
En la técnica se conocen varios métodos adicionales para producir ácidos nucleicos y polipéptidos y se pueden usar para producir polipéptidos que tengan especificidad por polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 de esta invención. Véase, por ejemplo, Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 12297-12303 (1997), que describe la producción de proteínas de fusión entre un ARNm y su péptido codificado. Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.824.469, que describe métodos para obtener oligonucleótidos capaces de llevar a cabo una función biológica específica. El procedimiento implica generar un conjunto heterogéneo de oligonucleótidos, teniendo cada uno una secuencia aleatorizada 5', una secuencia preseleccionada central y una secuencia aleatorizada 3'. El conjunto heterogéneo resultante se introduce en una población de células que no muestra la función biológica deseada. Después se exploran subpoblaciones de células para determinar las que muestran una función biológica predeterminada. A partir de esa subpoblación, se aíslan los oligonucleótidos capaces de llevar a cabo la función biológica deseada.
Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.763.192, 5.814.476, 5.723.323 y 5.817.483 describen procesos para producir péptidos o polipéptidos. Esto se realiza produciendo genes estocásticos o fragmentos de los mismos y después introduciendo estos genes en células hospedadoras que producen una o más proteínas codificadas por los genes estocásticos. Después, las células hospedadoras se exploran para identificar los clones que producen péptidos o polipéptidos que tienen la actividad deseada.
Derivados Químicos
Un especialista en la técnica puede preparar derivados químicamente modificados de los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 de esta invención, dadas las descripciones expuestas en este documento más adelante. Tales derivados de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se modifican de una manera que es diferente, en el tipo o emplazamiento de las moléculas unidas de forma natural al polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Los derivados pueden incluir moléculas formadas por la supresión de uno o más grupos químicos unidos de forma natural. El polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, una variante polipeptídica similar a \beta10 del mismo o un heterodímero \alpha2/\beta10 se puede modificar mediante la unión covalente de uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado típicamente es soluble en agua de forma que la proteína a la que está unido no precipite en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Dentro del alcance de polímeros adecuados se incluye una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable.
Cada uno de los polímeros puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Cada uno de los polímeros típicamente tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado). El peso molecular promedio de cada polímero preferiblemente está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, más preferiblemente entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa y lo más preferible es que esté entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa.
Los polímeros solubles en agua adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero sin limitación, carbohidratos enlazados a N o enlazados a O, azúcares, fosfatos, polietilenglicol (PEG) (que incluye las formas de PEG que se han usado para derivatizar proteínas, incluyendo mono-(C_{1}-C_{10}) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol), monometoxi-polietilenglicol, dextrano (tal como dextrano de bajo peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 6 kD), celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil-pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico. La presente invención también abarca moléculas de reticulación bifuncionales que se pueden usar para preparar multímeros unidos covalentemente del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, una variante polipeptídica del mismo o un heterodímero \alpha2/\beta10.
En general, la derivatización química se puede realizar en cualquier condición adecuada usada para someter a reacción la proteína con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar derivados químicos de polipéptidos o heterodímeros generalmente comprenderán las etapas de (a) someter a reacción el polipéptido o heterodímero con la molécula de polímero activada (tal como un éster reactivo o derivado aldehído de la molécula de polímero) en condiciones mediante las cuales el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 o una variante polipeptídica del mismo o un heterodímero \alpha2/\beta10 se une a una o más moléculas de polímero y (b) obtener el producto o los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán basándose en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, a mayor proporción de moléculas de polímero:proteína, mayor será el porcentaje de molécula de polímero unida. En una realización, el derivado de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 puede tener un resto de molécula de polímero único en el extremo amino. Véase, por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.234.784.
La pegilación del polipéptido o heterodímero se puede realizar específicamente mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis et al., Focus on Growth Factors, 3, 4-10 (1992); los documentos EP 0154316; EP 0401384 y la Patente de Estados Unidos Nº 4.179.337. Por ejemplo, la pegilación se puede realizar a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe en este documento. Para las reacciones de acilación, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un grupo éster reactivo único. Para alquilación reductiva, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un grupo aldehído reactivo único. Un aldehído reactivo es, por ejemplo, polietilenglicol propionaldehído, que es estable en agua o derivados mono C_{1}-C_{10} alcoxi o ariloxi del mismo (véase la Patente de Estados Unidos
Nº 5.252.714).
En otra realización, un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 puede estar acoplado químicamente a biotina y se deja que las moléculas de biotina-polipéptido \beta10 o biotina-heterodímero \alpha2/\beta10 que están conjugadas se unan a avidina, dando como resultado moléculas tetravalentes de avidina/biotina/polipéptido \beta10 o moléculas tetravalentes de avidina/biotina/heterodímero \alpha2/\beta10. Los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 también se pueden acoplar covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los conjugados resultantes precipitarse con anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10.
En general, las afecciones que se pueden aliviar o modular mediante la administración de los presentes derivados de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 incluyen las que se describen en este documento para polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10. Sin embargo, los derivados de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 descritos en este documento pueden tener actividades adicionales, actividad biológica mejorada o reducida u otras características, tales como semivida aumentada o disminuida, en comparación con las moléculas no derivatizadas.
Animales No Humanos Modificados por Ingeniería Genética
Adicionalmente dentro del alcance de la presente invención se incluyen animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores, conejos, cabras, ovejas u otros animales de granja, en los que el gen (o los genes) que codifica el polipéptido \beta10 nativo se ha (han) alterado ("eliminado") de manera que el nivel de expresión de este gen o genes disminuye significativamente o se elimina por completo. Tales animales se pueden preparar usando técnicas y métodos tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.557.032.
La presente invención incluye además animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores, conejos, cabras, ovejas u otros animales de granja, en los que la forma nativa del gen o genes de \beta10 para ese animal o un gen o genes de \beta10 heterólogo se sobreexpresan en el animal, creando de ese modo un animal "transgénico". Tales animales transgénicos se pueden preparar usando métodos conocidos, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.489.743 y solicitud PCT Nº WO 94/28122.
La presente invención incluye además animales no humanos en los que el promotor de uno o más de los polipéptidos \beta10 se activa o inactiva (por ejemplo, usando métodos de recombinación homóloga) para alterar el nivel de expresión de polipéptido \beta10 nativo.
Estos animales no humanos se pueden usar para exploración de candidatos de fármaco. En tal exploración, se puede medir el impacto de un candidato de fármaco sobre el animal. Por ejemplo, los candidatos de fármaco pueden disminuir o aumentar la expresión del gen de \beta10. En determinadas realizaciones, la cantidad de polipéptido \beta10 que se produce se puede medir después de la exposición del animal al candidato de fármaco. Adicionalmente, en determinadas realizaciones, se puede detectar el impacto real del candidato de fármaco sobre el animal. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede dar como resultado o estar asociada con, una enfermedad o proceso patológico. En tales casos, se puede ensayar la capacidad de un candidato de fármaco de disminuir la expresión del gen o su capacidad de evitar o inhibir un proceso patológico. En otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular tal como un fragmento de un polipéptido puede dar como resultado o estar asociada con, una enfermedad o proceso patológico. En tales casos, se puede ensayar la capacidad de un candidato de fármaco de disminuir la producción de un producto metabólico de este tipo o su capacidad de prevenir o inhibir un proceso
patológico.
Microserie
Se apreciará que la tecnología de microserie de ADN se puede utilizar de acuerdo con la presente invención. Las microseries de ADN son series en miniatura de alta densidad de ácidos nucleicos colocadas sobre un soporte sólido, tal como vidrio. Cada célula o elemento dentro de la serie tiene numerosas copias de una especie única de ADN que actúa como una diana para hibridación para su ARNm afín. En la creación de perfiles de expresión usando tecnología de microserie de ADN, en primer lugar se extrae ARNm de una muestra celular o de tejido y después se convierte enzimáticamente en ADNc marcado de forma fluorescente. Este material se hibrida a la microserie y el ADNc no unido se retira mediante lavado. La expresión de genes diferentes representados en la serie después se visualiza cuantificando la cantidad de ADNc marcado que está unido específicamente a cada ADN de diana. De esta manera, se puede cuantificar la expresión de miles de genes de una manera de alto rendimiento y paralela a partir de una muestra única de material biológico.
Esta creación de perfiles de expresión de alto rendimiento tiene una amplia variedad de aplicaciones con respecto a la moléculas \beta10 de la invención, que incluyen, pero sin limitación: la identificación y validación de genes relacionados con enfermedad \beta10 como dianas para terapéuticos; toxicología molecular de moléculas \beta10 e inhibidores de los mismos; estratificación de poblaciones y generación de marcadores sustitutos para ensayos clínicos y el mejoramiento del descubrimiento de fármacos de molécula pequeña relacionados con \beta10 ayudando en la identificación de compuestos selectivos en exploraciones de alto rendimiento (HTS).
Agentes de Unión Selectivos
Como se usa en este documento, la expresión "agente de unión selectivo" se refiere a una molécula que tiene especificidad por uno o más polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10. Los agentes de unión selectivos adecuados son anticuerpos y derivados de los mismos. Los anticuerpos adecuados se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica. Un anticuerpo de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 ilustrativo de la presente invención es capaz de unirse a determinada parte del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 inhibiendo de ese modo la unión del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 al receptor o receptores del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10.
Los agentes de unión selectivos tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen a polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales incluyendo policlonales monoespecíficos, monoclonales (MAb), recombinantes, quiméricos, humanizados tales como con injerto de CDR, humanos, de cadena única y/o bioespecíficos, así como fragmentos, variantes o derivados de los mismos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas partes del anticuerpo que se unen a un epítopo en el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen fragmentos Fab y F(ab') generados mediante escisión enzimática de anticuerpos de longitud completa. Otros fragmentos de unión incluyen los que se generan mediante técnicas de ADN recombinante, tales como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican regiones variables de anticuerpo.
Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 generalmente se producen en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por medio de inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y adyuvante. Puede ser útil conjugar un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a una proteína transportadora que sea inmunógena en las especies que se tienen que inmunizar, tal como hemocianina de lapa californiana, suero, albúmina tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja. También, se usan agentes agregantes tales como alumbre para mejorar la respuesta inmune. Después de la inmunización, se toman muestras de sangre de los animales y el suero se ensaya para determinar el título de anticuerpo anti-polipéptido \beta10 o anti-heterodímero \alpha2/\beta10.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se producen usando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Los ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridoma de Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) y el método de hibridoma de células B humanas, Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987). La invención también proporciona líneas células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención.
Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden modificar para uso como terapéuticos. Una realización es un anticuerpo "quimérico" en el que una parte de la cadena pesada o ligera es idéntica u homóloga a una secuencia correspondiente en anticuerpos obtenidos a partir de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es idéntico u homólogo a una secuencia correspondiente en anticuerpos obtenidos a partir de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando los mismos muestren la actividad biológica deseada. Véase, la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855 (1985).
En otra realización, un anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo "humanizado". En la técnica se conocen métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.585.089 y 5.693.762. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoacídicos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. La humanización se puede realizar, por ejemplo, usando métodos descritos en la técnica (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo al menos una parte de una región determinante de complementariedad (CDR) de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.
La invención también abarca anticuerpos humanos que se unen a polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Usando animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena, tales anticuerpos se producen mediante inmunización con un antígeno de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 (es decir, que tiene al menos 6 aminoácidos contiguos), conjugados opcionalmente a un vehículo. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993). En un método, tales animales transgénicos se producen incapacitando los loci endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el mismo e insertando loci que codifican proteínas de cadena pesada y ligera humana en el genoma de los mismos. Los animales parcialmente modificados, es decir, los que tienen menos de las modificaciones de complemento completas, después se cruzan para obtener un animal que tiene todas las modificaciones del sistema inmune deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos con secuencias de aminoácidos humanas (en lugar de, por ejemplo, murinas), que incluyen regiones variables que son inmunoespecíficas para estos antígenos. Véanse las solicitudes PCT Nº PCT/US96/05928 y PCT/US93/06926. Los métodos adicionales se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.545.807, solicitudes PCT Nº PCT/US91/245, PCT/GB89/01207 y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1. También se pueden producir anticuerpos humanos mediante la expresión de ADN recombinante en células hospedadoras o mediante expresión en células de hibridoma como se ha descrito en este documento.
En una realización alternativa, se pueden producir anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de presentación de fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991). Estos procesos imitan la selección inmune a través de la presentación de repertorios de anticuerpo en la superficie de bacteriófagos filamentosos y selección posterior de fago de acuerdo con su unión a un antígeno de elección. Una técnica de este tipo se describe en la Solicitud PCT Nº PCT/US98/17364, que describe el aislamiento de anticuerpos agonistas de afinidad alta y funcionales para receptores MPL y msk usando un enfoque de este tipo.
Los anticuerpos quiméricos, con injerto de CDR y humanizados se producen típicamente mediante métodos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se introducen en células hospedadoras y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en este documento. En una realización preferida, los anticuerpos se producen en células hospedadoras de mamífero, tales como células CHO. Se pueden producir anticuerpos monoclonales (por ejemplo, humanos) mediante la expresión de ADN recombinante en células hospedadoras o mediante expresión en células de hibridoma como se ha descrito en este documento.
Los anticuerpos anti-polipéptido \beta10 o anti-heterodímero \alpha2/\beta10 de la invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158, CRC Press, Inc., 1987) para la detección y cuantificación de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Los anticuerpos se unirán al polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se está empleando.
Para aplicaciones de diagnóstico, en determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-polipéptido \beta10 o anti-heterodímero \alpha2/\beta10 se pueden marcar con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directamente o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un isótopo marcado radiactivamente, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, \alpha-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante (Bayer et al., Meth. Enz., 184: 138-163 (1990).
Los ensayos de unión competitiva dependen de la capacidad de un patrón marcado (por ejemplo, un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 o una parte inmunológicamente reactiva de los mismos) de competir con el analito de la muestra de ensayo (un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10) por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo anti-polipéptido \beta10 o anticuerpo anti-heterodímero \alpha2/\beta10. La cantidad de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos típicamente se insolubilizan antes o después de la competición, de manera que el patrón y el analito que están unidos a los anticuerpos se puedan separar de forma conveniente del patrón y el analito que permanecen sin unirse.
Los ensayos de sándwich típicamente implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una parte inmunogénica diferente o epítopo, de la proteína que se tiene que detectar y/o cuantificar. En un ensayo de sándwich, el analito de la muestra de ensayo típicamente se une a un primer anticuerpo que está inmovilizado sobre un soporte sólido y a partir de entonces un segundo anticuerpo se une al analito, formando de ese modo un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110. El segundo anticuerpo se puede marcar con un resto detectable (ensayo de sándwich directo) o se puede medir usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que esté marcado con un resto detectable (ensayos de sándwich indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo de sándwich es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), en cuyo caso el resto detectable es una
enzima.
Los agentes de unión selectivos, que incluyen anticuerpos anti-polipéptido \beta10 o anticuerpos anti-heterodímero \alpha2/\beta10, también son útiles para formación de imágenes in vivo. Un anticuerpo marcado con un resto detectable se puede administrar a un animal, preferiblemente en el torrente sanguíneo y se ensaya la presencia y emplazamiento de anticuerpo marcado en el hospedador. El anticuerpo se puede marcar con cualquier resto que sea detectable en un animal, mediante resonancia magnética nuclear, radiología u otros medios de detección conocidos en la técnica.
Los anticuerpos de la invención se pueden usar como terapéuticos. Estos agentes terapéuticos generalmente son agonistas o antagonistas, en el sentido de que los mismos mejoran o reducen, respectivamente, al menos una de las actividades biológicas de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de acuerdo con esta invención. En una realización, los anticuerpos antagonistas de la invención son anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y que son capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 in vivo o in vitro. En realizaciones preferidas, un anticuerpo antagonista inhibirá la actividad funcional de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en al menos aproximadamente el 50% y preferiblemente en al menos aproximadamente el 80%. En otra realización, el anticuerpo es capaz de interaccionar con un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 (un ligando o receptor) inhibiendo o eliminando de ese modo la actividad de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 in vitro o in vivo. Los anticuerpos agonistas y antagonistas anti-polipéptido \beta10 o anticuerpos anti-heterodímero \alpha2/\beta10, se identifican mediante ensayos de exploración que se conocen en la técnica.
El polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención también se puede usar para clonar receptor o receptores de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, usando una estrategia de "clonación de expresión". Se puede usar polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 marcado radiactivamente (yodo 125) o polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 "marcado para afinidad/actividad" (tal como una fusión Fc o una fusión de fosfatasa alcalina) en ensayos de unión para identificar un tipo de célula o línea celular o tejido que expresa receptor o receptores de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. El ARN aislado a partir de tales células o tejidos se convertiría en ADNc, se clonaría en un vector de expresión de mamífero y se transfectaría en células de mamífero (por ejemplo, COS, 293) para crear una biblioteca de expresión. Después, el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 marcado radiactivamente se usaría como un ligando de afinidad para identificar y aislar el subconjunto de células en esta biblioteca que expresan el receptor o receptores de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en su superficie. Se aislaría ADN a partir de estas células y se transfectaría en células de mamífero para crear una biblioteca de expresión secundaria en la que la fracción de células que expresa el receptor o receptores de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 sería muchas veces más alta que en la biblioteca original. Este proceso de enriquecimiento se repetiría de forma iterativa hasta que se aislara un clon recombinante único que contuviera un receptor de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. El aislamiento del receptor o receptores de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 sería muy útil en términos de ser capaz de identificar o desarrollar agonistas y antagonistas nuevos de la ruta o rutas de señalización de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Tales agonistas y antagonistas incluirían receptor o receptores de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 solubles, anticuerpos anti-receptor o receptores de polipéptido \beta10 o anticuerpos anti-receptor o receptores de heterodímeros \alpha2/\beta10, moléculas pequeñas u oligonucleótidos antisentido y estos se podrían usar en el diagnóstico y/o tratamiento de una o más de las enfermedades/trastornos enumeradas más adelante.
Ensayo para otros moduladores de actividad de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10
En algunas situaciones, puede ser deseable identificar moléculas que sean moduladores, es decir, agonistas o antagonistas, de la actividad de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención. Las moléculas naturales o sintéticas que modulan el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se pueden identificar usando uno o más ensayos de exploración, tales como los que se describen en este documento. Tales moléculas se pueden administrar de una manera ex vivo o de una manera in vivo mediante inyección o mediante administración oral, dispositivo de implante o similares.
"Molécula o moléculas de ensayo" se refiere a una molécula o moléculas que están en evaluación para determinar la capacidad de modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención. Más comúnmente, una molécula de ensayo interaccionará directamente con el polipéptido o heterodímero. Sin embargo, también se contempla que una molécula de ensayo pueda modular también la actividad del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 indirectamente, tal como influyendo en la expresión del gen de \beta10 o uniéndose a un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 (por ejemplo, receptor o ligando). En una realización, una molécula de ensayo se unirá a un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 con una constante de afinidad de al menos aproximadamente 10^{-6} M, preferiblemente aproximadamente 10^{-8} M, más preferiblemente aproximadamente 10^{-9} M y aún más preferiblemente aproximadamente 10^{-10} M.
La presente invención abarca métodos para identificar compuestos que interaccionan con polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 de esta invención. En determinadas realizaciones, un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se incuba con una molécula de ensayo en condiciones que permiten la interacción de la molécula de ensayo con el polipéptido y se puede medir el alcance de la interacción. La molécula o las moléculas de ensayo se pueden seleccionar en una forma sustancialmente purificada o en una mezcla bruta.
En determinadas realizaciones, un agonista o antagonista de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula de bajo peso molecular que interacciona con el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 para regular su actividad. Las moléculas que regulan la expresión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 incluyen ácidos nucleicos que son complementarios a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido \beta10 de esta invención o son complementarios a secuencias de ácido nucleico que dirigen, controlan o influyen en la expresión del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y que actúan como reguladores de expresión antisentido.
Una vez que se ha identificado que un conjunto de moléculas de ensayo interacciona con un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, las moléculas se pueden evaluar adicionalmente para determinar su capacidad de aumentar o disminuir la actividad de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. La medición de la interacción de moléculas de ensayo con polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 se puede realizar en varios formatos, que incluyen ensayos de unión basados en células, ensayos de unión a membrana, ensayos en fase de solución e inmunoensayos. En general, las moléculas de ensayo se incuban con un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 durante un periodo de tiempo especificado y se determina la actividad de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 mediante uno o más ensayos para medir la actividad biológica.
La interacción de las moléculas de ensayo con polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 de acuerdo con esta invención también se puede ensayar directamente usando anticuerpos policlonales o monoclonales en un inmunoensayo. Como alternativa, se pueden usar formas modificadas de polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 que contienen etiquetas de epítopo en inmunoensayos como se ha descrito en este documento.
En el caso de que los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 presenten actividad biológica a través de una interacción con un compañero de unión (por ejemplo, un receptor o un ligando), se puede usar una diversidad de ensayos in vitro para medir la unión de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 al compañero de unión correspondiente (tal como un agente de unión selectivo, receptor o ligando). Estos ensayos se pueden usar para seleccionar moléculas de ensayo para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la velocidad y/o el alcance de unión de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a su compañero de unión. En un ensayo, un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se inmoviliza en los pocillos de una placa de microtitulación. Después, el compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 marcado radiactivamente (por ejemplo, compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 yodinado) y la molécula o las moléculas de ensayo se pueden añadir una por una (en cualquier orden) o simultáneamente a los pocillos. Después de incubación, los pocillos se pueden lavar y recontar usando un contador de centelleo para radiactividad, para determinar el alcance al que el compañero de unión se unió al polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Típicamente, las moléculas se ensayarán a lo largo de una variedad de concentraciones y se pueden usar una serie de pocillos de control que carezcan de uno o más elementos de los ensayos de prueba para precisión en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método implica invertir las "posiciones" de las proteínas, es decir, inmovilizar el compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a los pocillos de la placa de microtitulación, incubar con la molécula de ensayo y polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 marcado radiactivamente y determinar el alcance de unión del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Véase, por ejemplo, capítulo 18, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Nueva York, NY (1995).
Como una alternativa al marcaje radiactivo, un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 o su compañero de unión respectivo se pueden conjugar a biotina y después se puede detectar la presencia de proteína biotinilada usando estreptavidina enlazada a una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), que se puede detectar colorimétricamente o por marcaje fluorescente de estreptavidina. También se puede usar un anticuerpo dirigido hacia un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 o hacia un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y conjugado a biotina y se puede detectar después de la incubación con estreptavidina enlazada a enzima enlazada a AP o HRP.
Un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 o un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 también se puede inmovilizar mediante unión a perlas de agarosa, perlas acrílicas u otros tipos de tales sustratos de fase sólida inertes. El complejo sustrato-proteína se puede colocar en una solución que contenga la proteína complementaria y el compuesto de ensayo. Después de la incubación, las perlas se pueden precipitar por centrifugación y se puede evaluar la cantidad de unión entre un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y su compañero de unión respectivo usando los métodos descritos en este documento. Como alternativa, el complejo sustrato-proteína se puede inmovilizar en una columna y la molécula de ensayo y la proteína complementaria se pasan a través de la columna. La formación de un complejo entre un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y su compañero de unión respectivo se puede evaluar después usando cualquiera de las técnicas expuestas en este documento, es decir, marcaje radiactivo, unión de anticuerpo o similares.
Otro ensayo in vitro que es útil para identificar una molécula de ensayo que aumenta o disminuye la formación de un complejo entre un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 correspondiente es un sistema detector de resonancia de plasmón superficial tal como el sistema de ensayo Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema BIAcore se puede llevar a cabo usando el protocolo del fabricante. Este ensayo implica básicamente la unión covalente de un polipéptido \beta10, heterodímero \alpha2/\beta10, compañero de unión de polipéptido \beta10 o compañero de unión de heterodímero \alpha2/\beta10 a una microplaca sensora recubierta con dextrano que está localizada en un detector. El compuesto de ensayo y la otra proteína complementaria después se pueden inyectar, simultáneamente o secuencialmente, en la cámara que contiene la microplaca sensora. La cantidad de proteína complementaria que se une se puede evaluar basándose en el cambio en la masa molecular que está físicamente asociada con el lado recubierto con dextrano de la microplaca sensora; el cambio en la masa molecular se puede medir mediante el sistema detector.
En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o más compuestos de ensayo juntos para determinar su capacidad de aumentar o disminuir la formación de un complejo entre un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 correspondiente. En estos casos, los ensayos expuestos en este documento se pueden modificar fácilmente añadiendo tal o tales compuestos de ensayo adicionales simultáneamente con o posteriormente al primer compuesto de ensayo. Las etapas restantes en el ensayo son como se ha expuesto en este documento.
Se pueden usar provechosamente ensayos in vitro tales como los que se han descrito en este documento para explorar rápidamente grandes cantidades de compuestos por sus efectos en la formación de complejo mediante el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 correspondiente. Los ensayos pueden ser automatizados para explorar compuestos generados en presentación de fago, péptido sintético y bibliotecas de síntesis química.
Los compuestos que aumentan o disminuyen la formación de un complejo entre un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 correspondiente también se pueden explorar en cultivo celular usando células y líneas celulares que expresan el polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 y un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 correspondiente. Las células y líneas celulares se pueden obtener a partir de cualquier mamífero, pero preferiblemente serán de ser humano o de otras fuentes de primate, canino o roedor. La unión de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a células que expresan el compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 correspondiente en la superficie se evalúa en presencia o ausencia de moléculas de ensayo y el alcance de unión se puede determinar mediante, por ejemplo, citometría de flujo usando un anticuerpo biotinilado para un compañero de unión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Los ensayos de cultivo celular se pueden usar provechosamente para evaluar adicionalmente compuestos que puntúan positivo en ensayos de unión a proteína descritos en este documento.
También se pueden usar cultivos celulares para explorar el impacto de un candidato de fármaco. Por ejemplo, los candidatos de fármaco pueden disminuir o aumentar la expresión del gen de \beta10. En determinadas realizaciones, la cantidad de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 que se produce se puede medir después de la exposición del cultivo celular al candidato de fármaco. En determinadas realizaciones, se puede detectar el impacto real del candidato de fármaco sobre el cultivo celular. Por ejemplo, la sobreexpresión de un gen particular puede tener un impacto particular sobre el cultivo celular. En tales casos, se puede ensayar la capacidad de un candidato de fármaco de aumentar o disminuir la expresión del gen o su capacidad de evitar o inhibir un impacto particular sobre el cultivo celular. En otros ejemplos, la producción de un producto metabólico particular tal como un fragmento de un polipéptido, puede dar como resultado o estar asociada con, una enfermedad o proceso patológico. En tales casos, se puede ensayar la capacidad de un candidato de fármaco de disminuir la producción de un producto metabólico de este tipo en un cultivo celular.
Aplicaciones Terapéuticas/de Diagnóstico de Polipéptidos \beta10, Heterodímeros \alpha2/\beta10 y Ácidos Nucleicos
Se prevé que la función biológica para un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 es similar a la de las hormonas glicoproteicas FAS, TSH, FSH, LH y CG, las cuales, entre otras cosas, se conoce que actúan como factores de crecimiento promoviendo el desarrollo (proliferación, diferenciación) de células productoras de prolactina, la glándula tiroides y las gónadas. Estas glicoproteínas también actúan como hormonas endocrinas en su papel como reguladores de la función placentaria, tiroidea y gonadal. FAS juega un papel en la estimulación de la secreción de prolactina a partir de células deciduales en la placenta, TSH juega un papel principal en la regulación del metabolismo basal a través de la glándula tiroides y FSH, LH y CG juegan papeles críticos en fertilidad masculina y femenina, así como en la gestación. Como tal, un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 también pueden jugar papeles en la regulación de metabolismo basal, el desarrollo/función de las gónadas, fertilidad y gestación.
Como se muestra en el ejemplo más adelante, el polipéptido \beta10 se expresa en el cerebro, hígado, hígado fetal, estómago, pituitaria, colon, intestino delgado, glándula tiroides, glándula adrenal, páncreas, piel, leucocitos de sangre periférica, bazo, testículos y placenta. El hecho de que \beta10 se expresa en muchos de los órganos y tejidos que forman el sistema endocrino sugiere un papel importante de un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 en la regulación y coordinación de una o más fusiones del sistema endocrino. Se conoce que el sistema endocrino ejerce un control principal sobre el metabolismo, respuesta fisiológica al estrés y el desarrollo y función de órganos reproductores.
La expresión de \beta10 en pituitaria, páncreas, glándula adrenal, glándula tiroides, estómago, intestino delgado, colon e hígado indica un papel posible para un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 en la función común de estos órganos o tejidos, concretamente, metabolismo y homeostasis de energía/nutricional (es decir, equilibrio energético, tasa metabólica basal, digestión, homeostasis de glucosa, distribución de grasa corporal y crecimiento general).
La expresión de \beta10 en las glándulas pituitaria y adrenal indica un papel posible para un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 en una de las funciones críticas favorecidas por estos dos órganos importantes, concretamente, la capacidad del organismo de hacer frente a una diversidad de estreses ambientales y fisiológicos (por ejemplo, infección, fiebre, inflamación, ayuna, presión sanguínea alta y baja, ansiedad y choque). La expresión de \beta10 en células y órganos que se sabe que son componentes importantes del sistema inmune (leucocitos de sangre periférica, bazo, intestino delgado) es coherente con estas funciones posibles de un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10.
Además, la expresión de \beta10 en la pituitaria, testículos y placenta indica un papel posible de un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 en la función compartida de estos órganos, específicamente, fertilidad y gestación.
El polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 también puede actuar como un factor de crecimiento implicado en la regeneración (proliferación y diferenciación) de tejidos o tipos celulares especializados presentes en el cerebro, hígado, estómago, pituitaria, colon, intestino delgado, glándula tiroides, glándula adrenal, páncreas, piel, leucocitos de sangre periférica, bazo, testículos y placenta.
El hecho de que \alpha2, que forma un heterodímero con \beta10, se expresa (véase el Ejemplo 2 más adelante) en muchos de los mismos órganos/tejidos (pituitaria anterior, placenta, páncreas, corteza adrenal, criptas intestinales y mucosa de la vesícula biliar) que juegan papeles importantes en tres áreas principales, es coherente con las 3 áreas principales de función potencial de polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10, es decir (1) metabolismo y homeostasis de energía/nutricional, (2) respuestas fisiológicas al estrés, (que incluyen función del sistema inmune) y (3) fertilidad y gestación.
Basándose en las funciones potenciales descritas anteriormente, el polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 pueden ser útiles para el tratamiento y/o diagnóstico de trastornos metabólicos u homeostáticos de la energía/nutricionales. Los ejemplos de tales trastornos incluyen, pero sin limitación, obesidad, síndromes de debilitamiento (por ejemplo, caquexia asociada con cáncer), miopatías, trastornos gastrointestinales, diabetes, fallo del crecimiento, hipercolesterolemia, aterosclerosis y envejecimiento. Dentro de las utilidades terapéuticas y de diagnóstico que son parte de la invención se abarcan otras enfermedades que implican trastornos metabólicos u homeostásicos de energía/nutricionales.
Basándose en las funciones potenciales descritas anteriormente, un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 pueden ser útiles para el tratamiento y/o diagnóstico de trastornos relacionados con respuestas fisiológicas al estrés (que incluyen funciones del sistema inmune). Los ejemplos de tales trastornos incluyen, pero sin limitación, hipertensión, disfunción del sistema inmune (por ejemplo, inflamación excesiva, enfermedad autoinmune, propensión a infección tal como SIDA, mala curación de heridas, psoriasis, asma, artritis y alergias), choque, ansiedad y presión sanguínea alta o baja. Otras enfermedades que implican respuestas fisiológicas al estrés, que incluyen, pero sin limitación, funciones del sistema inmune, también están abarcadas dentro de las utilidades terapéuticas y de diagnóstico que son parte de la invención.
Basándose en las funciones potenciales descritas anteriormente, un polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 pueden ser útiles para el tratamiento y/o diagnóstico de trastornos relacionados con la gestación y/o el desarrollo y función de órganos reproductores. Los ejemplos de tales trastornos incluyen, pero sin limitación, infertilidad, fertilidad (anticoncepción), impotencia, endometriosis, menopausia, aborto, trabajo de parto y parto prematuro. Otras enfermedades que implican gestación y/o el desarrollo y función de órganos reproductores también están abarcadas dentro de las utilidades terapéuticas y de diagnóstico que son parte de la invención.
Basándose en el hecho de que el polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 probablemente tenga actividades hormonales/de factor de crecimiento, el polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 pueden ser útiles para el tratamiento y/o diagnóstico de trastornos que se podrían tratar aumentando la proliferación y/o diferenciación celular. Los ejemplos de tales trastornos incluyen, pero sin limitación, daño/degeneración de tejido (tal como causado por tratamientos de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes), envejecimiento y curación de heridas. Otras enfermedades que se podrían tratar aumentando la proliferación y/o diferenciación celular también están abarcadas dentro de las utilidades terapéuticas y de diagnóstico que son parte de la invención.
Basándose en el hecho de que el polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 probablemente tengan actividades hormonales/de factor de crecimiento, el polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 puede ser útil para el tratamiento y/o diagnóstico de trastornos que se podrían tratar disminuyendo la proliferación y/o diferenciación celular. Los ejemplos de tales trastornos incluyen, pero sin limitación, cánceres, hiperplasias e hipertrofias. Otras enfermedades que se podrían tratar disminuyendo la proliferación y/o diferenciación celular también están abarcadas dentro de las utilidades terapéuticas y de diagnóstico que son parte de la invención.
Otras enfermedades causadas o mediadas por niveles indeseables de polipéptido \beta10 o un heterodímero \alpha2/\beta10 están abarcadas dentro de las utilidades terapéuticas y de diagnóstico que son parte de la invención. A modo de ilustración, tales niveles indeseables incluyen niveles excesivamente elevados y niveles subnormales.
Se prepararon ratones transgénicos que sobre-expresaban \alpha2 de ratón solo, \beta10 de ratón solo o el heterodímero \alpha2/\beta10 (véase el Ejemplo 6). Sólo los transgénicos que sobre-expresaban el heterodímero \alpha2/\beta10 mostraron diferencias fenotípicas marcadas en comparación con los ratones de control. Los ratones transgénicos que sobre-expresaban \alpha2/\beta10 mostraron un fenotipo caracterizado por aumento tiroideo bilateral con múltiples adenomas papilares foliculares e hipertiroidismo resultante, como se indicó mediante niveles de T4 en suero elevados. Otros cambios fenotípicos se pensó que estaban relacionados con el estado hipertiroideo sistémico e incluyeron hepatomegalia moderada, hiperplasia hepatocelular y niveles de colesterol en suero ligeramente disminuidos, hipertrofia renal bilateral y una leucocitosis leve a moderada con predominancia de linfocitos (véase el Ejemplo 6). Por tanto, en un entorno de ratón normal, \alpha2/\beta10 tiene claramente una actividad similar a la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Debido al nivel elevado de conservación de aminoácidos entre \alpha2 de ratón y \alpha2 humano [identidad del 88,5% y similitud del 90,4% para las formas maduras pronosticadas (es decir, sin péptido señal)], el nivel elevado de conservación de aminoácidos entre \beta10 de ratón y \beta10 humano [identidad del 93,4% y similitud del 97,2% para las formas maduras pronosticadas (es decir, sin péptido señal)] y el nivel muy elevado de similitud entre la biología de la glándula tiroides de ratón y la biología de la glándula tiroides humana, se prevé que el heterodímero \alpha2/\beta10 humano tiene la misma actividad similar a la hormona estimulante de la tiroides (TSH) que la observada para el heterodímero \alpha2/\beta10 de ratón. Además de la actividad similar a TSH, \alpha2/\beta10 puede tener otros efectos biológicos diferentes en entornos fisiológicos diferentes (es decir, procesos patológicos), como se ha descrito con mayor detalle adicionalmente en este documento.
TSH influye en el metabolismo basal regulando la producción de hormonas tiroideas y se usa clínicamente para mejorar la detección y tratamiento de carcinoma tiroideo; véase McEvoy, G. (ed.), AHFS Drug Information, págs. 2041-2042, American Society of Health-System Pharmacists, Inc., Bethesda, MD (1998). Además, los ensayos de diagnóstico para medir niveles de TSH en la sangre se usan comúnmente para determinar el estado funcional de la glándula tiroides cuando se sospecha de trastorno de glándula tiroides. Es probable que \alpha2/\beta10 humano tenga utilidades clínicas similares a TSH y sea útil para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades y trastornos relacionados con la glándula tiroides. Además, \alpha2/\beta10 humano puede tener otros usos terapéuticos y de diagnóstico que se describen en este documento. Es razonable suponer que los agentes de unión selectivos de \alpha2/\beta10 humano, por ejemplo, anticuerpos, tendrán utilidades clínicas similares a los agentes de unión selectivos de TSH y, por lo tanto, serán útiles para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades y trastornos relacionados con la glándula tiroides. Además, los agentes de unión selectivos de \alpha2/\beta10 humano pueden tener otros usos terapéuticos y de diagnóstico como se describe en este documento.
Composiciones y Administración
Las composiciones terapéuticas están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido \beta10, heterodímero \alpha2/\beta10 o una molécula de ácido nucleico en mezcla con un agente de formulación farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable seleccionado por su adecuidad con el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos selectivos de heterodímero \alpha2/\beta10 en mezcla con un agente de formulación farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable seleccionado por su adecuidad con el modo de administración.
Los materiales de formulación aceptables preferiblemente son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación y la adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero sin limitación, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógenosulfito de sodio), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de volumen (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)), agentes de formación de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saporíferos y diluyentes, agentes emulsificantes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sal (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietielenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal), agentes potenciadores de estabilidad (sucrosa o sorbitol), agentes potenciadores de tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos (preferiblemente cloruro de sodio o potasio), manitol, sorbitol), vehículos de administración, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]).
Un especialista en la técnica determinará la composición farmacéutica óptima dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración pretendida, formato de administración y dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de la molécula de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10.
El vehículo o medio de soporte principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o medio de soporte adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cerebro espinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ilustrativos adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ilustrativas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5 o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden además incluir sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En una realización de la presente invención, las composiciones de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sucrosa.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden seleccionar para administración parenteral. Como alternativa, las composiciones se pueden seleccionar para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la especialidad de la técnica.
Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa sin pirógenos, parenteralmente aceptable que comprenda la molécula deseada de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula una molécula de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 como una solución estéril isotónica, conservada de forma apropiada. Otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico) o perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto que después se puede administrar como una inyección de liberación prolongada. También se puede usar ácido hialurónico y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de administración de fármaco implantables.
En una realización, una composición farmacéutica se puede formular para inhalación. Por ejemplo, se puede formular una molécula de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 como un polvo seco para inhalación. Las soluciones de inhalación de moléculas de polipéptido \beta10, heterodímero \alpha2/\beta10 o ácido nucleico \beta10 también se puede formular con un propulsor para administración de atomizador. En otra realización, se pueden nebulizar las soluciones. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT Nº PCT/US94/001875, que describe administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente.
También se contempla que determinadas formulaciones se pueden administrar por vía oral. En una realización de la presente invención, las moléculas de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 que se administran de esta manera se pueden formular con o sin esos vehículos usados normalmente en la preparación de compuestos de formas farmacéuticas sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, se puede diseñar una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal en el que la biodisponibilidad esté maximizada y la degradación presistémica esté minimizada. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción de la molécula de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. También se pueden emplear diluyentes, saporíferos, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes.
Otra formulación farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de moléculas de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en una mezcla con un excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril u otro vehículo apropiado, las soluciones se pueden preparar en forma farmacéutica unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes de unión, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los especialistas en la técnica, incluyendo formulaciones que implican polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 en formulaciones de administración sostenida o controlada. Las técnicas para formular una diversidad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como vehículos de liposoma, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de liberación prolongada, también son conocidas por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento PCT/US93/00829 que describe liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (documentos U.S. 3.773.919 y EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), etileno vinil acetato (Langer et al., anteriormente) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); los documentos EP 36.676; EP 88.046 y EP 143.949.
La composición farmacéutica que se tiene que usar para administración in vivo típicamente tiene que ser estéril. Esto se puede conseguir mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización usando estos métodos se puede conducir antes o a continuación de liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de entrada estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un obturador perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración.
En una realización específica, la presente invención se refiere a kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits pueden contener tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Dentro del alcance de esta invención también se incluyen kits que contienen jeringas únicas y pre-cargadas de cámaras múltiples (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).
Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que se tiene que emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y de los objetivos. Un especialista en la técnica apreciará que los niveles de dosis apropiados para tratamiento variarán por tanto, dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la cual se esté usando la molécula de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. En consecuencia, el médico puede titular la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica puede variar de aproximadamente 0,1 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, las dosis puede variar de 0,1 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o 1 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o 5 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en la formulación usada. Típicamente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo o como una infusión continua a través de un dispositivo de implante o catéter. El perfeccionamiento adicional de la dosis apropiada se realiza de forma rutinaria por un especialista en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas de forma rutinaria por ellos. Las dosis apropiadas se pueden determinar a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados.
La vía de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oral, inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquinal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional o mediante sistemas de liberación sostenida o dispositivo de implante. Cuando se desea, las composiciones se pueden administrar mediante inyección de bolo o de forma continua mediante infusión o mediante un dispositivo de implante.
Como alternativa o adicionalmente, la composición se puede administrar localmente a través del implante de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implante, el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado y la administración de la molécula deseada puede ser a través de difusión, bolo de liberación temporalizada o administración continua.
En algunos casos, puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de acuerdo con esta invención de una manera ex vivo. En tales casos, las células, tejidos u órganos que se han retirado del paciente se exponen a composiciones farmacéuticas después de lo cual, las células, tejidos y/u órganos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.
En otros casos, se puede administrar un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención implantando determinadas células que se han modificado genéticamente, usando métodos tales como los que se describen en este documento, para expresar y secretar el polipéptido o heterodímero. Tales células pueden ser células animales o humanas y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. Opcionalmente, las células se pueden inmortalizar. Para disminuir la posibilidad de una respuesta inmune, las células se pueden encapsular para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente cubiertas o membranas biocompatibles semipermeables poliméricas que permiten la liberación del producto o los productos de proteína pero evitan la destrucción de la célula por el sistema inmune del paciente o por otros factores nocivos de los tejidos circundantes.
Realizaciones adicionales de la presente invención se refieren a células para tanto la producción in vitro de polipéptidos terapéuticos como para la producción y administración de polipéptidos terapéuticos mediante terapia génica o terapia celular. Se pueden usar métodos de recombinación homóloga y de otro tipo para modificar una célula que contiene un gen del \beta10 normalmente transcripcionalmente silente o un gen subexpresado y producir, de ese modo, una célula que exprese cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10.
La recombinación homóloga es una técnica desarrollada originalmente para dirigir genes para inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. & Mol. Biol., 36: 301, 1989). La técnica básica se desarrolló como un método para introducir mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de mamífero (Thomas et al., Cell, 44: 419-428, 1986; Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583-8587, 1988) o para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman et al., Nature, 330: 576-578, 1987). Las técnicas de recombinación homólogas ilustrativas se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.272.071 (el documento EP 9193051, Publicación EP Nº 505500; el documento PCT/US90/07642 y la Publicación Internacional Nº WO 91/09955).
A través de la recombinación homóloga, la secuencia de ADN que se tiene que insertar en el genoma se puede dirigir hacia una región específica del gen de interés uniéndola a ADN de dirección. El ADN de dirección es una secuencia de nucleótidos que es complementaria (homóloga) a una región del ADN genómico. Pequeños trozos de ADN de dirección que son complementarios a una región específica del genoma se ponen en contacto con la hebra parental durante el proceso de replicación de ADN. Es una propiedad general del ADN que se ha insertado en una célula hibridarse y, por lo tanto, recombinarse con otros trozos de ADN endógeno a través de regiones homólogas compartidas. Si esta hebra complementaria se une a un oligonucleótido que contiene una mutación o una secuencia diferente o un nucleótido adicional, éste también se incorpora en la hebra recién sintetizada como resultado de la recombinación. Como resultado de la función de corrección de errores, es posible que la secuencia nueva de ADN sirva como el molde. Por tanto, el ADN transferido se incorpora en el genoma.
Unidas a estas piezas de ADN de dirección existen regiones de ADN que pueden interaccionar con o controlar la expresión de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, por ejemplo, secuencias flanqueantes. Por ejemplo, un elemento promotor/potenciador, un supresor o un elemento modulador de la transcripción exógeno se inserta en el genoma de la célula hospedadora pretendida cerca y con la orientación suficiente para influir en la transcripción del ADN que codifica el polipéptido \beta10 deseado. El elemento de control controla una parte del ADN presente en el genoma de la célula hospedadora. Por tanto, la expresión del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 deseado se puede conseguir no sólo por transfección de ADN que codifica el mismo gen de \beta10, sino en lugar de ello mediante el uso de ADN de dirección (que contiene regiones de homología con el gen endógeno de interés) acoplado con segmentos reguladores de ADN que proporcionan la secuencia de gen endógena con señales reconocibles para la transcripción del gen de \beta10.
En un método ilustrativo, la expresión de un gen fijado como diana deseado en una célula (es decir, un gen celular endógeno deseado) se altera a través de la recombinación homóloga en el genoma celular en un sitio preseleccionado, mediante la introducción de ADN que incluye al menos una secuencia reguladora, un exón y un sitio donador de empalme. Estos componentes se introducen en el ADN cromosomal (genómico) de una manera tal que esto, en efecto, dé como resultado la producción de una unidad de transcripción nueva (en la que la secuencia reguladora, el exón y el sitio donador de empalme presentes en la construcción de ADN están unidos operativamente al gen endógeno). Como resultado de la introducción de estos componentes en el ADN cromosomal, se altera la expresión del gen endógeno deseado.
La expresión génica alterada, como se describe en este documento, abarca activar (o causar que se exprese) un gen que normalmente está silente (que no se expresa) en la célula obtenida, así como aumentar la expresión de un gen que no se expresa en niveles fisiológicamente significativos en la célula obtenida. Las realizaciones abarcan además cambiar el patrón de regulación o inducción de manera que sea diferente del patrón de regulación o inducción que ocurre en la célula obtenida y reducir (que incluye eliminar) la expresión de un gen que se expresa en la célula obtenida.
Un método mediante el cual la recombinación homóloga se puede usar para aumentar o provocar la producción de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir de un gen de \beta10 endógeno de una célula implica en primer lugar usar recombinación homóloga para colocar una secuencia de recombinación desde un sistema de recombinación específico de sitio (por ejemplo, Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, Current Opinion In Biotechnology, 5: 521-527, 1994; Sauer, Methods In Enzymology 225: 890-900, 1993) cadena arriba (es decir, 5' a) de la región codificante de polipéptido \beta10 genómica endógena de la célula. Un plásmido que contiene un sitio de recombinación homólogo al sitio que se ha puesto inmediatamente cadena arriba de la región codificante de polipéptido \beta10 genómica se introduce en la línea celular modificada junto con la enzima recombinasa apropiada. Esta recombinasa provoca que el plásmido se integre, a través del sitio de recombinación de plásmido, en el sitio de recombinación localizado inmediatamente cadena arriba de la región codificante de polipéptido \beta10 genómica en la línea celular (Baubonis y Sauer, Nucleic Acids Res., 21: 2025-2029, 1993; O'Gorman et al., Science, 251: 1351-1355, 1991). Cualquier secuencia flanqueante conocida por aumentar la transcripción (por ejemplo, potenciadora/promotora, intrón, potenciadora transduccional), si está colocada apropiadamente en este plásmido, se integraría de una manera tal que crearía una unidad transcripcional nueva o modificada que daría como resultado la producción de novo o aumentada de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir del gen de \beta10 endógeno de la célula.
Un método adicional para usar la línea celular en la que se ha colocado una secuencia de recombinación específica de sitio inmediatamente cadena arriba de la región codificante del polipéptido \beta10 genómica endógena de la célula es usar recombinación homóloga para introducir un segundo sitio de recombinación en cualquier lugar en el genoma de la línea celular. Después, se introduce la enzima recombinasa apropiada en la línea celular con dos sitios de recombinación, provocando un acontecimiento de recombinación (supresión, inversión, translocación) (Sauer, Current Opinion In Biotechnology, anteriormente, 1994; Sauer, Methods In Enzymology, anteriormente, 1993) que crearía una unidad transcripcional nueva o modificada que daría como resultado la producción de novo o aumenta de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir del gen de \beta10 endógeno de la célula.
Un enfoque adicional para aumentar o provocar la expresión del polipéptido \beta10 a partir de un gen de \beta10 endógeno de una célula implica aumentar o provocar la expresión de un gen o genes (por ejemplo, factores de transcripción) y/o disminuir la expresión de un gen o genes (por ejemplo, represores transcripcionales) de una manera que dé como resultado la producción de novo o aumentada de polipéptido \beta10 a partir del gen de \beta10 endógeno de la célula. Este método incluye la introducción de un polipéptido de origen no natural (por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de unión de ADN específico de sitio fusionado a un dominio de factor transcripcional) en la célula de manera que se produzca la producción de novo o aumentada de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 a partir del gen de \beta10 endógeno de la célula.
La presente invención se refiere además a construcciones de ADN útiles en el método de alterar la expresión de un gen diana. En determinadas realizaciones, las construcciones de ADN ilustrativas comprenden: (a) una o más secuencias de dirección; (b) una secuencia reguladora; (c) un exón y (d) un sitio donador de empalme sin emparejamiento. La secuencia de dirección en la construcción de ADN dirige la integración de elementos (a)-(d) en un gen diana en una célula de manera que los elementos (b)-(d) estén unidos operativamente a secuencias del gen diana endógeno. En otra realización, las construcciones de ADN comprenden: (a) una o más secuencias de dirección, (b) una secuencia reguladora, (c) un exón, (d) un sitio donador de empalme, (e) un intrón y (f) un sitio aceptor de empalme, donde la secuencia de dirección dirige la integración de elementos (a)-(f) de manera que los elementos de (b)-(f) estén unidos operativamente al gen endógeno. La secuencia de dirección es homóloga al sitio preseleccionado en el ADN cromosomal celular con el cual tiene que ocurrir la recombinación homóloga. En la construcción, el exón generalmente está 3' de la secuencia reguladora y el sitio donador de empalme está 3' del
exón.
Si se conoce la secuencia de un gen particular, tal como la secuencia de ácido nucleico del gen de \beta10 presentado en este documento, se puede sintetizar un trozo de ADN que sea complementario a una región seleccionada del gen u obtenerse de otra manera, tal como mediante restricción apropiada del ADN nativo en sitios de reconocimiento específicos que se unen a la región de interés. Este trozo sirve como una secuencia o unas secuencias de dirección tras la inserción en la célula y se hibridará a su región homóloga dentro del genoma. Si esta hibridación ocurre durante la replicación de ADN, este trozo de ADN y cualquier secuencia adicional unida al mismo, actuará como un fragmento de Okazaki y se incorporará en la hebra hija recién sintetizada de ADN. Por lo tanto, la presente invención incluye nucleótidos que codifican un polipéptido \beta10, nucleótidos que se pueden usar como secuencias de dirección.
También se contempla la terapia celular de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10, por ejemplo, el implante de células que producen polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10. Esta realización implica implantar células capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente activa del polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Tales células productoras de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 pueden ser células que son productoras naturales de polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 o pueden ser células recombinantes cuya capacidad de producir polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 se ha aumentado mediante transformación con un gen que codifica el polipéptido \beta10 deseado o con un gen que aumente la expresión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10. Una modificación de este tipo se puede conseguir por medio de un vector adecuado para administrar el gen así como promover su expresión y secreción. Para minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes a los que se está administrando un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 como puede ocurrir con la administración de un polipéptido de una especie ajena, se prefiere que las células naturales que producen polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 sean de origen humano y produzcan polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 humano. Análogamente, se prefiere que las células recombinantes que producen polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 se transformen con un vector de expresión que contenga un gen que codifique un polipéptido \beta10 humano.
Las células implantadas pueden estar encapsuladas para evitar la infiltración de tejido circundante. Se pueden implantar células de animales humanos o no humanos en pacientes en cubiertas o membranas biocompatibles semipermeables y poliméricas que permitan la liberación de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 pero que eviten la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores nocivos del tejido circundante. Como alternativa, las propias células del paciente, transformadas para producir polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 ex vivo, se pueden implantar directamente en el paciente sin tal encapsulación.
Las técnicas para la encapsulación de células vivas se conocen en el campo y la preparación de las células encapsuladas y su implante en pacientes se puede conseguir de forma rutinaria. Por ejemplo, Baetge et al. (los documentos WO95/05452; PCT/US94/09299), describen cápsulas de membrana que contienen células modificadas por ingeniería genética para la administración eficaz de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son fácilmente recuperables. Las cápsulas encapsulan células transfectadas con moléculas de ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican moléculas biológicamente activas unidas operativamente a promotores que no están sometidos a regulación negativa in vivo tras el implante en un hospedador mamífero. Los dispositivos proporcionan la administración de las moléculas a partir de células vivas a sitios específicos dentro de un receptor. Además, véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.892.538, 5.011.472 y 5.106.627. Un sistema para encapsular células vivas se describe en la Solicitud PCT Nº PCT/US91/00157 de Aebischer et al. Véase también, la Solicitud PCT Nº PCT/US91/00155 de Aebischer et al., Winn et al. Exper. Neurol. 113: 322-329 (1991), Aebischer et al. Exper. Neurol., 111: 269-275 (1991) y Tresco et al., ASAIO 38: 17-23 (1992).
También se prevé la administración de terapia génica in vivo e in vitro de polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10. Un ejemplo de una técnica de terapia génica es usar el gen de \beta10 (ADN, ADNc genómico y/o ADN sintético) que codifica un polipéptido \beta10 que puede estar unido operativamente a un promotor constitutivo o inducible para formar una "construcción de ADN de terapia génica". El promotor puede ser homólogo o heterólogo al gen endógeno, con tal que sea activo en el tipo de célula o tejido en el que se insertará la construcción. Otros componentes de la construcción de ADN de terapia génica pueden incluir opcionalmente, moléculas de ADN diseñadas para integración específica de sitio (por ejemplo, secuencias flanqueantes endógenas útiles para recombinación homóloga), un promotor específico de tejido, potenciador o potenciadores o lentificador o lentificadores, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula parental, moléculas de ADN útiles como marcadores para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específicos de célula (como, por ejemplo, para dirección de células), factores de interiorización específicos de célula y factores de transcripción para mejorar la expresión mediante un vector así como factores para posibilitar la fabricación del vector.
Después, se puede introducir una construcción de ADN de terapia génica en las células del paciente (ex vivo o in vivo) usando vectores virales o no virales. Un medio para introducir la construcción de ADN de terapia génica es por medio de vectores virales como se ha descrito en este documento. Determinados vectores, tales como vectores retrovirales, administrarán la construcción de ADN al ADN cromosomal de las células y el gen se puede integrar en el ADN cromosomal. Otros vectores funcionarán como episomas y la construcción de ADN de terapia génica permanecerá en el citoplasma.
En otras realizaciones, se pueden incluir elementos reguladores para la expresión controlada del gen de \beta10 en la célula diana. Tales elementos se activan en respuesta a un efector apropiado. De esta manera, se puede expresar un polipéptido terapéutico cuando se desee. Un medio de control convencional implica el uso de dimerizadores o rapálogos de molécula pequeña (como se describe en los documentos WO9641865 (PCT/US96/099486); WO9731898 (PCT/US97/03137) y WO9731899 (PCT/US95/03157) usados para dimerizar proteínas quiméricas que contienen un dominio de unión de molécula pequeña y un dominio capaz de iniciar procesos biológicos, tal como una proteína de unión a ADN o una proteína de activación transcripcional. La dimerización de las proteínas se puede usar para iniciar la transcripción del transgén.
Una tecnología de regulación alternativa usa un método para almacenar proteínas expresadas a partir del gen de interés dentro de la célula como un agregado o grupo. El gen de interés se expresa como una proteína de fusión que incluye un dominio de agregación condicional que da como resultado la retención de la proteína agregada en el retículo endoplasmático. Las proteínas almacenadas son estables e inactivas dentro de la célula. Sin embargo, las proteínas se pueden liberar administrando un fármaco (por ejemplo, ligando de molécula pequeña) que retira el dominio de agregación condicional y, de ese modo, separa específicamente los agregados o grupos para que las proteínas se puedan secretar a partir de la célula. Véase, Science, 287: 816-817 y 826-830 (2000).
Otros medios de control o interruptores de genes adecuados incluyen, pero sin limitación, los sistemas siguientes. Mifepristona (RU486) se usa como un antagonista de progesterona. La unión de un dominio de unión a ligando de receptor de progesterona modificado al antagonista de progesterona activa la transcripción formando un dímero de dos factores de transcripción que después pasa al núcleo para unirse al ADN. El dominio de unión a ligando se modifica para eliminar la capacidad del receptor de unirse al ligando natural. El sistema receptor de hormona esteroidea modificado se describe adicionalmente en los documentos U.S. 5.364.791; WO9640911 y WO9710337.
Otro sistema de control usa ecdisona (una hormona esteroidea de la mosca de la fruta) que se une y activa un receptor de ecdisona (receptor citoplasmático). Después, el receptor se desplaza al núcleo para unirse a un elemento de respuesta de ADN específico (promotor del gen sensible a ecdisona). El receptor de ecdisona incluye un dominio de transactivación/dominio de unión a ADN/dominio de unión a ligando para iniciar la transcripción. El sistema de ecdisona se describe adicionalmente en los documentos U.S. 5.514.578; WO9738117; WO9637609 y
WO9303162.
Otros medios de control usan un transactivador controlable por tetraciclina positivo. Este sistema implica un dominio de unión a ADN de proteína represora tet mutada (cambios de aminoácidos de tet R-4 mutados que dieron como resultado una proteína transactivadora regulada por tetraciclina inversa, es decir, se une a un operador tet en presencia de tetraciclina) unido a un polipéptido que activa la transcripción. Tales sistemas se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.464.758; 5.650.298 y 5.654.168.
En las Patentes de Estados Unidos Nº 5.741.679 y 5.834.186 de Innovir Laboratories Inc. se describen sistemas de control de expresión y construcciones de ácido nucleico adicionales.
La terapia génica in vivo se puede conseguir introduciendo el gen que codifica un polipéptido \beta10 en células a través de inyección local de una molécula de ácido nucleico \beta10 o mediante otros vectores de administración virales o no virales apropiados. Hefti, Neurobiology, 25: 1418-1435 (1994). Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido \beta10 de esta invención puede estar contenida en un vector de virus adenoasociado (AAV) para administrarse a las células fijadas como diana (por ejemplo, Johnson, Publicación Internacional Nº WO95/34670; Solicitud Internacional Nº PCT/US95/07178). El genoma de AAV recombinante típicamente contiene repeticiones terminales invertidas de AAV flanqueando una secuencia de ADN que codifica un polipéptido \beta10 unido operativamente a secuencias promotoras y de poliadenilación funcionales.
Los vectores virales adecuados alternativos, incluyen, pero sin limitación, vectores de retrovirus, adenovirus, virus de herpes simple, lentivirus, virus de hepatitis, parvovirus, papovavirus, poxvirus, alfavirus, coronavirus, rabdovirus, paramixovirus y virus de papiloma. La Patente de Estados Unidos Nº 5.672.344 describe un sistema de transferencia génica mediada por virus in vivo que implica un vector HSV-1 neurotrófico recombinante. La Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346 proporciona ejemplos de un proceso para proporcionar a un paciente una proteína terapéutica mediante la administración de células humanas que se han tratado in vitro para insertar un segmento de ADN que codifica una proteína terapéutica. Los métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia génica se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.631.236 que implica vectores adenovirales; la Patente de Estados Unidos Nº 5.672.510 que implica vectores retrovirales y el documento U.S. 5.635.399 que implica vectores retrovirales que expresan citoquinas.
Los métodos de administración no viral incluyen, pero sin limitación, transferencia mediada por liposoma, administración de ADN desnudo (inyección directa), transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN), electroporación, precipitación de fosfato de calcio y bombardeo de micropartículas (por ejemplo, pistola de gen). Los materiales y métodos de terapia génica también pueden incluir el uso de promotores inducibles, promotores-potenciadores específicos de tejido, secuencias de ADN diseñadas para integración específica de sitio, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula parental, marcadores para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa y sistemas de control de expresión (medidas de seguridad), agentes de unión específicos de célula (para dirección de célula), factores de interiorización específicos de célula y factores de transcripción para mejorar la expresión mediante un vector así como métodos de fabricación de vector. Tales métodos y materiales adicionales para la práctica de las técnicas de terapia génica se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.970.154 que implica técnicas de electroporación; el documento WO96/40958 que implica ligandos nucleares; la Patente de Estados Unidos Nº 5.679.559 que describe un sistema que contiene lipoproteína para administración génica; la Patente de Estados Unidos Nº 5.676.954 que implica transportadores de liposomas; la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.875 que se refiere a métodos para transfección con fosfato de calcio y la Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050 en la que se propulsan partículas biológicamente activas a células a una velocidad mediante la cual las partículas penetran la superficie de las células y se incorporan en el interior de las
células.
También se contempla que la terapia génica de \beta10 o terapia celular pueda incluir además la administración de uno o más polipéptidos adicionales en la misma o en una célula o células diferentes. Tales células se pueden introducir por separado en el paciente o las células pueden estar contenidas en un dispositivo implantable único, tal como la membrana de encapsulación descrita anteriormente o las células se pueden modificar por separado por medio de vectores virales.
Un medio para aumentar la expresión de polipéptido \beta10 endógeno en una célula a través de terapia génica es insertar uno o más elementos potenciadores en el promotor de polipéptido \beta10, donde el elemento o los elementos potenciadores pueden servir para aumentar la actividad transcripcional del gen de \beta10. El elemento o los elementos potenciadores usados se seleccionarán basándose en el tejido en el que se desea activar el gen o los genes; se seleccionarán elementos potenciadores que se conoce que confieren activación de promotor en ese tejido. Por ejemplo, si un gen que codifica un polipéptido \beta10 se tiene que "activar" en células T, se puede usar el elemento potenciador de promotor lck. Aquí, la parte funcional del elemento transcripcional que se tiene que añadir se puede insertar en un fragmento de ADN que contiene el promotor de polipéptido \beta10 (y, opcionalmente, insertarse en un vector y/o secuencia o secuencias flanqueantes 5' y/o 3', etc.) usando técnicas de clonación convencionales. Esta construcción, conocida como una "construcción de recombinación homóloga", después se puede introducir en las células deseadas ex vivo o in vivo.
La terapia génica también se puede usar para disminuir la expresión de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 modificando la secuencia de nucleótidos del promotor o los promotores endógenos. Tal modificación se consigue típicamente a través de métodos de recombinación homóloga. Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene todo o una parte del promotor del gen o los genes de \beta10 seleccionada para inactivación se puede modificar por ingeniería genética para retirar y/o reemplazar trozos del promotor que regulan la transcripción. Por ejemplo, se pueden suprimir la caja TATA y/o el sitio de unión de un activador transcripcional del promotor usando técnicas de biología molecular convencionales; tal supresión puede inhibir la actividad promotora reprimiendo de ese modo la transcripción del gen de \beta10 correspondiente. La supresión de la caja TATA o el sitio de unión de activador de transcripción en el promotor se puede conseguir generando una construcción de ADN que comprenda toda o la parte pertinente del promotor o los promotores de polipéptido \beta10 (a partir de la misma especie o de una especie relacionada al gen o los genes de \beta10 que se tienen que regular) en el que uno o más de la caja TATA y/o los nucleótidos del sitio de unión de activador transcripcional se mutan a través de sustitución, supresión y/o inserción de uno o más nucleótidos. Como resultado, la caja TATA y/o el sitio de unión de activador ha disminuido la actividad o se deja completamente inactivo. La construcción típicamente contendrá al menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las secuencias de ADN 5' y 3' nativas (endógenas) adyacentes al segmento de promotor que se ha modificado. La construcción se puede introducir en las células apropiadas (ex vivo o in vivo) directamente o a través de un vector viral como se ha descrito en este documento. Típicamente, la integración de la construcción en el ADN genómico de las células será a través de recombinación homóloga, donde las secuencias de ADN 5' y 3' en la construcción de promotor pueden servir para ayudar a integrar la región promotora modificada a través de hibridación al ADN cromosomal
endógeno.
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Otros Usos de los Ácidos Nucleicos y Polipéptidos de esta Invención
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (que incluyen aquellas que no codifican polipéptidos biológicamente activos) se pueden usar para cartografiar los emplazamientos del gen de \beta10 y genes relacionados en los cromosomas. La cartografía se puede realizar mediante técnicas conocidas en el campo, tales como amplificación por PCR e hibridación in situ.
Las moléculas de ácido nucleico de \beta10 (que incluyen aquellas que no codifican polipéptidos biológicamente activos), pueden ser útiles como sondas de hibridación en ensayos de diagnóstico para ensayar, cualitativamente o cuantitativamente, la presencia de un ADN o ARN correspondiente de \beta10 en muestras de tejido o fluidos corporales de mamíferos.
Los polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 se pueden usar (simultáneamente o secuencialmente) en combinación con una o más citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos, anti-inflamatorios y/o agentes quimioterapéuticos según sea apropiado para la indicación que se este tratando.
También se pueden emplear otros métodos cuando sea deseable inhibir la actividad de uno o más polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10 de esta invención. Tal inhibición se puede lograr mediante moléculas de ácido nucleico que son complementarias e hibridan a secuencias de control de expresión (formación de triple hélice) o a ARNm de \beta10. Por ejemplo, se pueden introducir en la célula moléculas de ADN o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria a al menos una parte del gen o los genes de \beta10 seleccionados. Se pueden diseñar sondas antisentido mediante técnicas disponibles usando la secuencia del polipéptido \beta10 descrito en este documento. Típicamente, cada molécula antisentido tal será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') de cada gen de \beta10 seleccionado. Cuando la molécula antisentido después hibrida al ARNm de \beta10 correspondiente, se evita o reduce la traducción de este ARNm. Los inhibidores antisentido proporcionan información con referencia a la disminución o ausencia de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en una célula u organismo.
Como alternativa, se puede emplear terapia génica para crear un inhibidor negativo dominante de uno o más polipéptidos \beta10 o heterodímeros \alpha2/\beta10. En esta situación, el ADN que codifica un polipéptido mutante de cada polipéptido \beta10 seleccionado se puede preparar e introducir en las células de un paciente usando métodos virales o no virales como se ha descrito en este documento. Cada mutante tal típicamente se diseña para competir con polipéptidos o heterodímeros endógenos en su papel biológico.
Además, un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 de esta invención, biológicamente activo o no, se puede usar como un inmunógeno, es decir, el polipéptido contiene al menos un epítopo frente al cual se pueden generar anticuerpos. Se pueden usar agentes de unión selectivos que se unen a un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 (como se ha descrito en este documento) con propósitos de diagnóstico in vivo e in vitro, incluyendo, pero sin limitación, uso en forma marcada para detectar la presencia de polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 en una muestra de fluido corporal o celular. Los anticuerpos también se pueden usar para prevenir, tratar o diagnosticar varias enfermedades y trastornos, que incluyen los que se enumeran en este documento. Los anticuerpos se pueden unir a un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 para disminuir o bloquear al menos una actividad característica de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 o se pueden unir a un polipéptido para aumentar al menos una actividad característica de un polipéptido \beta10 o heterodímero \alpha2/\beta10 (incluyendo aumentar la farmacocinética de un polipéptido \beta10 o heterodímero
\alpha2/\beta10).
ADNc que codifica polipéptido \beta10 humano en E. coli se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, el 28 de diciembre de 1999, con el número de entrada PTA-1210.
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Ejemplo 1
ADN que Codifica Beta-10 Humano
La secuencia de aminoácidos de la subunidad-\beta de CG (gonadotropina coriónica) se sometió a Blast frente a una base de datos de Proteína Virtual, de generación interna, obtenida de las secuencias genómicas humanas públicas presentes en GenBank. Se identificó una proteína virtual que contenía una región de 45 aminoácidos con homología significativa a la mitad carboxilo de CG-\beta. La región corta (135 pares de bases) de secuencia genómica humana que codificaba el tramo de 45 aminoácidos procedía de una secuencia de ADN genómico humano de GenBank de más de 160 pares de kilobases (Nº de entrada AL049871). Analizando un tramo de 8 pares de kilobases de secuencia genómica inmediatamente 5' de la secuencia de 135 pares de bases, se identificó una región que tenía homología significativa (y que contenía un cambio de fase) con la mitad N terminal de CG-\beta. La secuencia de nucleótidos de este gen nuevo se recopiló a partir de las secuencias genómicas. La secuencia de aminoácidos de este gen recopilado tenía homología significativa con los cuatro polipéptidos de subunidad \beta de hormona glicoproteica humanos conocidos y tenía un péptido señal pronosticado N terminal, coherente con que este gen humano nuevo es un miembro nuevo similar a \beta de la familia de hormona glicoproteica. Había un intrón de 4,5 kb localizado entre los dos exones codificantes putativos de la mitad N terminal y la mitad C terminal. La amplificación de intrones por PCR (véase la sección de Expresión en Tejido de \beta10 más adelante) de ADNc de diversas fuentes de tejidos puso de manifiesto que \beta10 se expresaba en numerosos tejidos incluyendo la pituitaria.
La región codificante completa (ATG a codón de parada TGA) y algo de la 3' UTR (región no traducida) de \beta10 se clonó como un fragmento mediante PCR usando la siguiente mezcla de reacción y condiciones de PCR:
Molde: diez microlitos de ADNc Marathon Ready de Pituitaria Humana (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; Nº de catálogo 7424-1).
Cebador directo: 5' -ATGAAGCTGGCATTCCTCTTCCTT- 3' (SEC ID Nº: 4)
Cebador inverso: 5' -GCATGTGCTGCTCACACAGGT- 3' (SEC ID Nº: 5)
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Concentración final de dNTP: 200 micromolar.
Cinco unidades de Pfu polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA).
Diez microlitros de tampón de reacción de Pfu 10 x (Stratagene, La Jolla, CA).
Diez microlitros de GC melt (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; kit de PCR de ADNc Advantage GC; Nº de catálogo K1907-1).
Volumen final de reacción: 100 microlitros.
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 45 ciclos de 94ºC (diez segundos), 60ºC (veinte segundos), 72ºC (noventa segundos) y después al final del 45to ciclo una incubación a 72ºC durante siete minutos, después 10 ciclos adicionales de 94ºC (diez segundos), 60ºC (veinte segundos), 72ºC (noventa segundos) y después al final del 10º ciclo adicional una incubación a 72ºC durante siete minutos.
La reacción de PCR se desarrolló en un gel de agarosa y se observó una banda única. Esta banda de ADN se clonó en pPCR-Script AMP (Stratagene). La secuencia del inserto en uno de los clones resultantes es la de SEC ID Nº: 2 que contiene la región codificante completa (ATG al codón de parada TGA) y algo de la 3'UTR (región no traducida) de \beta10.
La siguiente es una lista y descripción de secuencias de \beta10 a partir de bases de datos disponibles al público:
Nº de Entrada de GenBank AL049871: 170 pares de kilobases de secuencia genómica humana. No se identifican exones, genes u homologías en este registro y la secuencia de región codificante completa de \beta10 está interrumpida por una secuencia intrónica.
Nº de Entrada de GenBank AL118555: 126 pares de kilobases de secuencia genómica humana. No se identifican exones, genes u homologías en este registro y la secuencia de región codificante completa de \beta10 está interrumpida por una secuencia intrónica.
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Ejemplo 2
Expresión en Tejido, Beta-10
Usando un fragmento de PCR como una sonda, no fue posible obtener una señal de hibridación en diversas Transferencias de Northern de Tejido Múltiple Humano (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Se usó amplificación de intrón por PCR para determinar el patrón de expresión de beta-10 como se ha descrito más adelante.
Para los Paneles de Sure-RACE Humanos (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD; Nº de catálogo HRAA-101) las muestras de ADNc representaron cerebro, corazón, riñón, bazo, hígado, colon, pulmón, intestino delgado, músculo, estómago, testículos, placenta, pituitaria, glándula tiroides, glándula adrenal, páncreas, ovario, útero, próstata, leucocitos de sangre periférica, cerebro fetal, hígado fetal, grasa y glándula mamaria. Cada muestra de ADNc estaba en un tubo separado en forma de un sedimento seco de ADN. La mezcla de reacción estaba compuesta de la manera siguiente:
Cebador directo: 5' -CTGCAGGTGCCTTCGGATC- 3' (SEC ID Nº: 6)
Cebador inverso: 5' -GCATGTGCTGCTCACACAGGT- 3' (SEC ID Nº: 5);
Cantidad de cada cebador: 0,5 picomoles;
Concentración final de dNTP: 200 micromolar;
2,5 microlitos de GC melt (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; kit de PCR de ADNc Advantage GC; Nº de catálogo K1907-1);
2,5 unidades de Taq (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; PCR Core Kit; Nº de catálogo 1578 553);
2,5 microlitros de tampón de reacción de PCR 10x (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; PCR Core Kit; Nº de catálogo 1578 553);
Para cada muestra de ADNc la mezcla de reacción anterior estaba preparada a un volumen de 25 microlitros y 20 microlitros de esta mezcla se añadieron al sedimento de ADNc seco. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 5 ciclos de 94ºC (diez segundos) y 72ºC (cuarenta segundos), seguido por 5 ciclos de 94ºC (diez segundos) y 70ºC (cuarenta segundos), seguido por 35 ciclos de 94ºC (diez segundos) y 68ºC (cuarenta segundos) y después seguido por 68ºC durante siete minutos.
Después, los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El tamaño correcto del producto de PCR de 293 pares de bases, que indicaba expresión de \beta10, se observó en colon, intestino delgado, testículo, pituitaria e hígado fetal.
Para la Placa Rapid-Scan Humana (OriGene Technologies, Inc., Rockville MD; Nº de catálogo HSCA-101) las muestras de ADNc representaban cerebro, corazón, riñón, bazo, hígado, colon, pulmón, intestino delgado, músculo, estómago, testículo, placenta, glándula salival, glándula tiroides, glándula adrenal, páncreas, ovario, útero, próstata, piel, leucocitos de sangre periférica, médula ósea, cerebro fetal e hígado fetal. Cada muestra de ADNc estaba un tubo separado en forma de un sedimento seco de ADN.
La mezcla de reacción que se utilizó fue la siguiente:
Cebador directo: 5' - CTGCAGGTGCCTTCGGATC- 3' (SEC ID Nº: 6),
Cebador inverso: 5' -GCATGTGCTGCTCACACAGGT- 3' (SEC ID Nº: 5);
Cantidad de cada cebador: 0,5 picomoles;
Concentración final de dNTP: 200 micromolar;
2,5 microlitos de GC melt (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; kit de PCR de ADNc Advantage GC; Nº de catálogo K1907-1);
2,5 unidades de Taq (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; PCR Core Kit; Nº de catálogo 1578 553);
2,5 microlitros de tampón de reacción de PCR 10x (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; PCR Core Kit; Nº de catálogo 1578 553).
Para cada muestra de ADNc la mezcla de reacción anterior estaba preparada a un volumen de 25 microlitros y después 20 microlitros de esta mezcla se añadieron al sedimento de ADNc seco. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 5 ciclos de 94ºC (diez segundos), 72ºC (cuarenta segundos) y después seguido por 5 ciclos de 94ºC (diez segundos), 70ºC (cuarenta segundos) y después seguido por 35 ciclos de 94ºC (diez segundos), 68ºC (cuarenta segundos) y después seguido por 68ºC durante siete minutos.
Después, los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El tamaño correcto del producto de PCR de 293 pares de bases, que indicaba expresión de \beta10, se observó en cerebro, bazo, hígado, colon, estómago, placenta, glándula tiroides, glándula adrenal, páncreas, piel y leucocitos de sangre periférica.
La combinación de los resultados de expresión de los Paneles Sure-RACE Humanos y la Placa Rapid-Scan Humana indicó que \beta10 se expresa en cerebro, hígado, hígado fetal, estómago, pituitaria, colon, intestino delgado, glándula tiroides, glándula adrenal, páncreas, piel, leucocitos de sangre periférica, bazo, testículos y placenta.
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Ejemplo 3
Expresión en Tejido, \alpha2
Se realizó análisis de Northern para determinar el patrón de expresión de alfa-2. La sonda para los Northern fue un producto de PCR de 390 pares de bases (correspondiente a los nucleótidos 56-445 de SEC ID Nº: 1 del documento WO99/41377). Este producto de PCR se generó a través de un intermediario de PCR de 466 pares de bases de la forma siguiente:
En primer lugar se usó PCR para clonar un fragmento de 466 pares de bases de alfa-2 a partir de ADNc de testículo de humano usando la siguiente mezcla de reacción y condiciones de PCR:
Molde: diez microlitos de ADNc Marathon Ready de Testículo Humano (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; Nº de catálogo 7414-1).
Cebador directo: 5' -GAGACATCTCCCCACTGTGTTT- 3' (SEC ID Nº: 7)
Cebador inverso: 5' -GTTTCCCCCAACAGAATGTCAA- 3' (SEC ID Nº: 8)
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar;
Concentración final de dNTP: 200 micromolar;
Cinco unidades de Pfu polimerasa;
Volumen final de reacción: 100 microlitros;
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 35 ciclos de 94ºC (diez segundos), 60ºC (treinta segundos), 72ºC (sesenta segundos) y después al final del 35to ciclo una incubación a 72ºC durante cinco minutos.
La reacción de PCR se desarrolló en un gel de agarosa y se observaron cuatro bandas diferentes. Las bandas múltiples se originaron a partir de amplificación por PCR de ADN genómico humano contaminante presente en el ADNc Marathon Ready de Testículo Humano. El producto de PCR de 466 pares de bases se aisló a partir del gel de agarosa y se clonó. Un clon de plásmido que contenía la secuencia de 466 pares de bases se usó como un molde para generar el fragmento de PCR de 390 pares de bases usando la siguiente mezcla de reacción y condiciones de
PCR:
Molde: diez picogramos del clon de plásmido que contenía la secuencia de 466 pares de bases mencionada anteriormente;
Cebador directo: 5' -ATGCCTATGGCGTCCCCTCAAAC- 3' (SEC ID Nº: 9)
Cebador inverso: 5' -CTAGTAGCGAGAGAGGCGACACATGTCA- 3' (SEC ID Nº: 10)
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Concentración final de dNTP: 200 micromolar;
Diez unidades de polimerasa Taq;
Volumen final de reacción: 100 microlitros;
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 35 ciclos de 94ºC (diez segundos), 68ºC (sesenta segundos) y después al final del 35to ciclo una incubación a 68ºC durante seis minutos.
El producto de PCR de 390 pares de bases después se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento de PCR se marcó con ^{32}P y se hibridó a diversas transferencias de Northern de Tejidos Múltiples Humanos Clontech (los tejidos/células representados fueron: páncreas, médula adrenal, tiroides, corteza adrenal, testículos, timo, intestino delgado, estómago, bazo, próstata, ovario, colon, leucocitos de sangre periférica, cerebro, corazón, músculo esquelético, riñón, hígado, placenta y pulmón) y a una transferencia de Northern preparada con ARNm de pituitaria usando condiciones de rigurosidad alta de la manera siguiente:
La hibridación se realizó durante 1 hora a 68ºC usando "ExpressHyb Hybridization Solution" de Clontech. Las transferencias se lavaron en SSC 2x, SDS al 0,1% a temperatura ambiente dos veces, durante veinte minutos cada vez. Después las transferencias se lavaron en SSC 0,1x, SDS al 0,1% a 50ºC durante diez minutos y después se expusieron a película.
Se obtuvo una señal marcada que representaba una banda única en el carril del ARNm de páncreas y el carril de ARNm de pituitaria. Se observó una señal significativamente más débil en el carril de ARNm de placenta.
La hibridación in situ se realizó para determinar además sitios de expresión de gen de \alpha2. Un panel de tejidos embrionarios normales (E10.5 a E18.5) y de ratón adulto y tejidos de mono rhesus adulto se fijaron en paraformaldehído al 4%, se incrustaron en parafina y se cortaron a 5 micrómetros. Antes de la hibridación in situ, los tejidos se permeabilizaron con HCl 0,2 M, seguido de digestión con Proteinasa K y acetilación con trietanolamina y anhídrido acético. Los cortes se hibridaron durante la noche a 55ºC con una sonda de ARN antisentido marcada con ^{33}P complementaria a la secuencia de \alpha2 de ratón o humana (para tejidos de rhesus) y son sondas sentido (de control). Las sondas de ARN marcadas con ^{33}P antisentido y sentido se obtuvieron mediante transcripción in vitro de ADN de plásmido que contenían el ADNc de \alpha2 de ratón (clon bacteriano Nº 1224990 del Proyecto EST de Ratón WashU-HHMI público) o el ADNc de \alpha2 humano (clon de plásmido que contenía la secuencia de región codificante de \alpha2 humana de 390 pares de bases generada por PCR descrita anteriormente).
Después de la hibridación, los cortes se lavaron en tampón, se trataron con ARNasa para retirar sonda no hibridada y después se sometieron a lavado de rigurosidad alta en SSC 0,1X a 55ºC. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión NTB2 Kodak, se expusieron a 4ºC durante dos-tres semanas, se desarrollaron y después se tiñeron con colorante de contraste. Los cortes se examinaron con campo oscuro e iluminación convencional para permitir evaluación simultánea de morfología de tejido y señal de hibridación. Después, se examinaron los siguientes tejidos:
Tejidos de ratón: cerebro (cortes: 1 sagital, 2 coronarios); tracto GI (esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, colon proximal y distal); pituitaria; hígado; pulmón; corazón; bazo; timo; nódulos linfáticos; riñón; adrenal; vejiga; páncreas; glándula salival; órganos reproductores masculinos y femeninos (ovario, oviducto y útero en la hembra; testículo, epidídimo, próstata, vesícula seminal y conductos deferentes en el macho); BAT y WAT (subcutáneno, peri-renal); hueso (fémur); piel; mamario y músculo esquelético.
Tejidos de rhesus: glándula adrenal; hígado; vesícula biliar; intestino; páncreas y glándula salival.
Las sondas antisentido tanto de ratón como humana produjeron señal positiva detectable por encima de un nivel muy bajo de fondo observado con los controles de hebra sentido. En el ratón embrionario, no se observó señal en ningún órgano principal de E8.5 a E18.5. En E15.5 y E18.5, estuvo presente señal sobre células dispersas adyacentes a algunos de los huesos en desarrollo de la cabeza y los dientes. En el ratón adulto, estuvo presente un nivel de señal moderado en la corteza adrenal. Un nivel menor de señal fue detectable en los lóbulos anterior e intermedio de la pituitaria así como en el epitelio intestinal a nivel de las criptas. Además, la densidad de grano fue ligeramente superior al fondo en esperma en desarrollo dentro de los túbulos seminíferos de los testículos y en células de la granulosa que rodean los folículos en desarrollo en el ovario.
En los tejidos de rhesus, se observó señal moderada en la corteza adrenal, epitelio de vesícula biliar y en el epitelio intestinal principalmente a nivel de las criptas.
La combinación de los resultados de expresión de los Northern de \alpha2 y el análisis in situ de \alpha2 indica que \alpha2 se expresa en la pituitaria anterior, placenta, páncreas, corteza adrenal, criptas intestinales y mucosa de la vesícula biliar.
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Ejemplo 4
Anticuerpos frente a \alpha2
Se generaron anticuerpos policlonales de conejo frente a \alpha2 inmunizando conejos con péptido CSPRYSVL
VASGYRHN (SEC ID Nº: 28) que se había conjugado a Hemocianina de Lapa Californiana (Nº de cat. 77605 Pierce Inc., Rockford, IL). El péptido se sintetizó con una amida C terminal de manera que en lugar de que el extremo C fuera COOH el extremo C fue CONH_{2}. La parte RYSVLVASGYRHN de la secuencia peptídica está totalmente conservada entre \alpha2 humano y de ratón. Esta región se eligió de manera que los anticuerpos fueran capaces de unirse a \alpha2 humano y \alpha2 de ratón. Los anticuerpos se purificaron por afinidad a partir de suero de conejo sobre una columna (Kit SulfoLink, Nº de cat. 44895, Pierce Inc., Rockford, IL) a la cual se había unido el antígeno peptídico (SEC ID Nº: 28). El análisis de transferencia de Western de medio acondicionado recogido a partir de células 293 que se habían transfectado con un vector de expresión de mamífero de \alpha2 marcado con poliHis humano o un vector de expresión de mamífero de subunidad-alfa marcada con poliHis humano demostró que estos anticuerpos policlonales purificados por afinidad tenían especificidad alta por el polipéptido \alpha2 y no reaccionaron de forma cruzada con la subunidad
alfa.
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Ejemplo 5
ADN que Codifica Beta-10 de Ratón
Se usaron diversas sondas de ADNc de \beta10 humano para sondear una biblioteca BAC 129SvJ genómica de ratón dispuesta en filtros de densidad alta (Nº de catálogo FBAC-4431, Genome Systems, St. Louis, MO). Se obtuvo el clon BAC de ratón en la placa#218-pocillo#P22 (Nº de catálogo FBAC-4432, Genome Systems, St. Louis, MO). Un subfragmento HindIII de 10 kb de este clon BAC se hibridó fuertemente a una sonda de ADNc de Beta-10 humano. Este fragmento HindIII de 10 kb se subclonó en pBluescriptII-KS(-) y se secuenció completamente. El análisis informático de esta secuencia genómica de ratón de 10 kb se usó para identificar dos exones que codificaban el ortólogo de ratón de Beta-10 humano.
Se diseñaron cebadores a partir de esta secuencia electrónica para clonar el ADNc de Beta-10 de ratón de la manera siguiente:
Molde: veinte microlitos de ADNc Marathon Ready de testículo de ratón (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; Nº de catálogo 7455-1).
Cebador directo: 5' -ATTACTAGTTCCACCATGAAGTTGGTATACCTTGTCCTT- 3' (SEC ID Nº: 14);
Cebador inverso: 5' -TTAATAATCGATCGTCAGATGGTCTCACACTCAGTG- 3' (SEC ID Nº: 15);
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Kit de PCR: Expand High Fidelity PCR System (Nº de catálogo 1732641, Boehringer Mannheim Corporation, Indianápolis, IN).
Volumen final de reacción: 50 microlitros;
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 55 ciclos de 94ºC (diez segundos), 65ºC (veinte segundos), 72ºC (cuarenta segundos) y después al final del 55to ciclo una incubación a 72ºC durante siete minutos.
El producto de PCR de 0,4 kb después se purificó mediante electroforesis en gel agarosa y se clonó en PCR2.1 (Invitrogen Inc., Carlsbard, CA). Se identificó un clon que contenía el ADNc de región codificante completa de Beta-10 de ratón (SEC ID Nº: 12) mediante secuenciación.
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Ejemplo 6
Producción y Análisis de Ratones Transgénicos que sobre-expresan \alpha2 solo, \beta10 solo y que co-expresan \alpha2 y \beta10
Se generaron ratones transgénicos que sobre-expresaban \alpha2 solo, \beta10 solo y que co-expresaban \alpha2 y \beta10 a partir del promotor de apolipoproteína E humano básicamente como se ha descrito previamente (Simonet et al., 1997, Cell vol 89 págs. 308-319). Este vector de promotor de apoE humano dirige expresión génica de nivel alto específica de hígado en ratones transgénicos y se ha usado previamente para generar ratones transgénicos que tienen niveles altos de proteína secretada codificada por transgén en su circulación. Para todos los análisis fenotípicos descritos más adelante los controles no transgénicos fueron ratones que se produjeron durante la misma serie de microinyecciones que los expresores transgénicos en cuestión.
Se usaron transgenes genómicos (es decir, que contenían exones e intrones de \alpha2 y \beta10) para generar transgénicos para maximizar la expresión. Adicionalmente, en todos los casos se modificó por ingeniería genética un sitio Kozak (CCACC) inmediatamente 5' del sitio de inicio ATG.
El vector de expresión de promotor de apoE humano contiene el HCR (elemento potenciador específico de hígado) seguido del promotor de apoE y primer intrón (en 5' UTR de apoE) y después por la señal/terminador de poliA de SV40. Existen sitios únicos SpeI y SfiI (compatibles con PvuI) para clonación direccional de genes entre el primer intrón del promotor de apoE y las regiones de señal de poliA/terminadora de SV40 del vector.
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Se usó el siguiente procedimiento para generar el "transgén de vector de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón":
Se exploraron conjuntos del kit de Exploración Genómica (Nº de catálogo BDTW- 7460, Genome Systems, St. Louis, MO) de ES de Ratón BAC (129SvJ) mediante PCR usando cebadores específicos de \alpha2 de ratón. Se obtuvo el clon BAC de ratón en la placa#44-pocillo#H19 (Nº de catálogo FBAC-4432, Genome Systems, St. Louis, MO). Un subfragmento XbaI de 12 kb de este clon BAC se hibridó marcadamente a una sonda de ADNc de \alpha2 de ratón. Este fragmento XbaI de 12 kb se subclonó en pBluescriptII-KS(-) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) y se secuenció completamente. El análisis informático de esta secuencia genómica de ratón de 12 kb se usó para identificar los tres exones codificantes de \alpha2.
Se diseñaron cebadores para amplificar la secuencia codificante de \alpha2 genómica de ratón completa (inicio ATG a parada TAG; SEC ID Nº: 18) de la manera siguiente:
Molde: 5 nanogramos del ADN de clon pBluescriptII-KS(-) XbaI de 12 kb
Cebador directo: 5' -CCGCACTAGTTCCACCATGCCCATGGCACCACGAGT- 3' (SEC ID Nº: 16);
Cebador inverso: 5' -GCGGCGTTCGATCGCTAGTAGCGGGAGAAACGGCACATATC- 3' (SEC ID Nº: 17);
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Kit de PCR: kit de ADN Polimerasa de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA).
Volumen final de reacción: 50 microlitros;
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 40 ciclos de 94ºC (diez segundos), 60ºC (veinte segundos), 72ºC (180 segundos), y después al final de 40mo ciclo una incubación a 72ºC durante cuatro minutos.
El producto de PCR de 0,8 kb se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, se cortó con SpeI y PvuI y se clonó en el vector de expresión de apoE humano cortado SpeI-SfiI. Se identificó un clon que contenía la región codificante genómica completa precisa de \alpha2 de ratón mediante secuenciación. El ADN de este clon de "transgén de vector de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón" se digirió con ClaI y ApaLI; la banda de 4 kb se purificó mediante electroforesis en gel y se usó para generar ratones transgénicos como se ha descrito previamente (Simonet et al. 1997, Cell, vol 89, págs. 309-319).
Se identificaron ratones transgénicos por PCR de la manera siguiente:
Molde: ADN de perforación de oreja;
Cebador directo: 5' -GCCTCTAGAAAGAGCTGGGAC- 3' (SEC ID Nº: 19);
Cebador inverso: 5' -CGCCGTGTTCCATTTATGAGC- 3' (SEC ID Nº: 20);
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Kit de PCR: Perlas de PCR Ready-to-Go (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).
Volumen final de reacción: 25 microlitros;
Condiciones de ciclado: 30 ciclos de 94ºC (sesenta segundos), 62ºC (veinte segundos) y 72ºC (treinta segundos).
Tras la electroforesis del producto de PCR la presencia de la banda de 0,37 kb indicó que el ratón particular era transgénico.
Se identificaron transgénicos que sobre-expresaban \alpha2 mediante transferencia de Western de plasma (usando el anticuerpo policlonal anti-\alpha2 purificado por afinidad descrito anteriormente en el Ejemplo 4) obtenidos a partir de diversos transgénicos identificados por PCR. Se analizaron fenotípicamente seis sobre-expresores de \alpha2 (Nº 7, 8, 26, 28, 156 y 186) así como seis ratones de control no transgénicos (Nº 10, 11, 12, 18, 20, 21). A todos los ratones se inyectaron 50 mg/kg de BrdU una hora antes de la recolección, la radiografía y el sacrificio. Los ratones se sacrificaron a las 12 semanas de edad. No se observaron hallazgos significativos durante la necropsia.
Para todos los ratones, se tomaron los pesos corporales y de órganos seleccionados, se extrajo sangre para hematología y química sérica y se recogieron órganos para análisis histológico y marcaje con BrdU.
Se examinaron secciones teñidas con H&E de hígado, vesícula biliar, bazo, pulmón, cerebro, pituitaria, corazón, riñón, adrenal, estómago, intestino delgado, páncreas, ciego, colon, nódulos linfáticos mesentéricos, piel, glándula mamaria, tráquea, esófago, tiroides, paratiroides, glándulas salivales, vejiga urinaria, ovario o testículo, útero o próstata y vesícula seminal, hueso y médula ósea.
No existieron diferencias biológicamente significativas en los pesos de órganos medios o individuales de animales, valores de hematología, valores de química clínica o hallazgos histológicos entre los ratones transgénicos sobre-expresores de \alpha2 y los ratones de control no transgénicos. En otras palabras, los ratones transgénicos sobre-expresores de \alpha2 no tienen un fenotipo.
Se usó el siguiente procedimiento para generar el "transgén de vector de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón".
Se diseñaron cebadores para amplificar la secuencia codificante de \beta10 genómica de ratón completa (inicio ATG a parada TGA, SEC ID Nº: 23) de la manera siguiente:
Molde: 10 nanogramos del ADN de clon pBluescriptII-KS(-) HindIII de 10 kb de \beta10 genómico de ratón descrito en el Ejemplo 5.
Cebador directo: 5' -ATTACTAGTTCCACCATGAAGTTGGTATACCTTGTCCTT- 3' (SEC ID Nº: 21);
Cebador inverso: 5' -TTAATAATCGATCGTCAGATGGTCTCACACTCAGTG- 3' (SEC ID Nº: 22);
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Kit de PCR: kit de ADN Polimerasa de PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, CA).
Volumen final de reacción: 50 microlitros;
Condiciones de ciclado: 92ºC durante sesenta segundos, seguido por 15 ciclos de 92ºC (diez segundos), 65ºC (veinte segundos) y 68ºC (cuatro minutos).
El producto de PCR de 3 kb se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, se cortó con SpeI y PvuI y se clonó en vector de expresión de apoE humano cortado con SpeI-SfiI. Se identificó un clon de "transgén de vector de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" que contenía la región codificante genómica completa precisa de \beta10 de ratón mediante secuenciación.
Después, se usó el siguiente procedimiento para generar el "transgén de vector de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón de \beta10 genómico de ratón" combinado.
ADN de clon de "transgén de vector de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" se cortó con HindIII y SacII y los extremos se hicieron romos con Fragmento Grande (Klenow) de ADN polimerasa I (New England Biolabs, Bervely, MA). El fragmento de 5,6 kb se purificó en gel y se clonó en pBluescript II KS(-) cortado con HincII. Se identificó un clon con el "casete de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" de 5,6 kb en la orientación que tiene la región de señal poliA/terminadora de SV40 del casete próximo al sitio HindIII en el polienlazador de pBluescript II KS(-). El ADN de este clon se cortó con HindIII y SacII y se ligó al "casete de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón" HindIII-SacII de 3,4 kb que se había aislado a partir del clon "de transgén de vector de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón" descrito anteriormente. La construcción final de "transgén de vector de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón de \beta10 genómico de ratón" de 11,8 kb consiste en el "casete de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" y el "casete de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón" clonados en tándem (es decir, ambos en la misma orientación transcripcional) en pBluescript II KS(-). En esta construcción, cada uno de \beta10 y \alpha2 tiene su propio promotor HCR/apoE y señal poliA/terminadora de SV40 con propósitos de expresión.
ADN de este clon "de transgén de vector de expresión de apoE humano \alpha2 genómico de ratón de \beta10 genómico de ratón" se digirió con BssHII; la banda de 9 kb se purificó mediante electroforesis en gel y se usó para generar ratones transgénicos como se ha descrito previamente (Simonet et al., 1997, Cell vol 89 págs. 309-319).
Se identificaron ratones transgénicos para el "casete de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón" mediante PCR de la manera siguiente:
Molde: ADN de perforación de oreja
Cebador directo: 5' -CCAGTGTGATATGTGCCGTTTC- 3' (SEC ID Nº: 24);
Cebador inverso: 5' -GAAGAGCGCAGAGCTCGGTA- 3' (SEC ID Nº: 25);
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Kit de PCR: Perlas de PCR Ready-to-Go (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).
Volumen final de reacción: 25 microlitros
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 35 ciclos de 94ºC (diez segundos), 60ºC (veinte segundos), 72ºC (cuarenta segundos) y después al final del 35to ciclo una incubación a 72ºC durante siete minutos.
El cebador directo [5' -CCAGTGTGATATGTGCCGTTTC- 3' (SEC ID Nº: 24)] para esta PCR está localizado en el 3^{er} exón codificante de \alpha2 (este exón contiene el codón de parada).
El cebador inverso [5' -GAAGAGCGCAGAGCTCGGTA- 3' (SEC ID Nº: 25)] para esta PCR está localizado en la región de señal de poliA/terminadora de SV40.
Tras la electroforesis del producto de PCR la presencia de la banda de 0,31 kb indicó que el ratón particular era transgénico para el "casete de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón". Los números de esos ratones eran: 25, 45, 53, 76, 94, 95 y 113.
Se identificaron por PCR ratones transgénicos para el "casete de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" de la manera siguiente:
Molde: ADN de perforación de oreja.
Cebador directo: 5' -TGGAGTCGATCCTTTCTACACCTA- 3' (SEC ID Nº: 26);
Cebador inverso: 5' -AGAGCGCAGAGCTCGGTAC- 3' (SEC ID Nº: 27);
Concentración final de cada cebador: 1,0 micromolar.
Kit de PCR: Perlas de PCR Ready-to-Go (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).
Volumen final de reacción: 25 microlitros;
Condiciones de ciclado: 94ºC durante sesenta segundos, seguido por 35 ciclos de 94ºC (diez segundos), 60ºC (veinte segundos), 72ºC (cuarenta segundos), y después al final del 35to ciclo una incubación a 72ºC durante siete minutos.
El cebador directo [5' -TGGAGTCGATCCTTTCTACACCTA- 3' (SEC ID Nº: 26)] para esta PCR está localizado en el 2º exón codificante de \beta10 (este exón contiene el codón de parada).
El cebador inverso [5' -AGAGCGCAGAGCTCGGTAC- 3' (SEC ID Nº: 27)] para esta PCR está localizado en la región de señal de poliA/terminadora de SV40.
Tras la electroforesis del producto de PCR la presencia de la banda de 0,37 kb indicó que el ratón particular era transgénico para el "casete de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón". Los números de esos ratones eran: 25, 31, 45, 53, 76, 94, 95 y 113. Se ha de observar, que el ratón Nº 31 que fue positivo por PCR para el "casete de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" fue negativo por PCR para el "casete de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón".
Los ratones Nº 76 y Nº 113 murieron poco después del genotipado por PCR. Los seis transgénicos restantes [Nº 25 (hembra), 31 (macho), 45 (hembra), 53 (macho), 94 (macho) y 95 (macho)] así como cinco ratones de control no transgénicos [Nº 17 (macho), 18 (hembra), 19 (hembra), 20 (macho) y 21 (macho)] se sometieron a necropsia a las 7 semanas de edad para análisis fenotípico posterior. A todos los ratones se inyectaron 50 mg/kg de BrdU una hora antes de la recolección, la radiografía y el sacrificio. Tras la necropsia se observaron glándulas tiroides anormalmente grandes en algunos de los ratones transgénicos. Como parte de la necropsia, los ratones se pesaron, se extrajo sangre para hematología y química sérica y se pesaron el hígado, el bazo, el riñón, el corazón y el timo. Se recogieron cortes de hígado, vesícula biliar, bazo, pulmón, cerebro, pituitaria, corazón, riñón, adrenal, timo, estómago, intestino delgado, páncreas, ciego, colon, nódulo linfático mesentérico, piel, glándula mamaria, tráquea, esófago, tiroides, paratiroides, glándula salival, vejiga urinaria, ovario o testículo, útero o próstata y vesícula seminal, hueso y médula ósea para análisis histológico.
Se usó análisis de transferencia de Northern para determinar los niveles de ARNm de \alpha2 y \beta10 en los hígados de todos los ratones transgénicos y de control no transgénicos como se ha descrito más adelante.
Se aisló ARN total a partir de muestras de hígado, se cuantificó y 10 microgramos de ARN total de cada ratón se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa de desnaturalización de formaldehído y se transfirieron a una membrana de nylon. Esto se realizó por duplicado para generar dos transferencias de Northern para sondeo. La tinción con Bromuro de Etidio de los geles de agarosa reveló carga prácticamente igual de ARN a lo largo de todos los pocillos y entre ambos geles. Una transferencia de Northern se sondeó con una sonda marcada con P32 preparada de forma aleatoria que abarcaba la región codificante completa del ADNc de \alpha2 (de ATG a TAG) para evaluar la expresión de \alpha2. La segunda transferencia de Northern se sondeó con una sonda marcada con P32 preparada de forma aleatoria que abarcaba la región codificante completa del ADNc de \beta10 (de ATG a TGA) para evaluar la expresión de \beta10.
La hibridación fue durante una hora a 65ºC en solución "ExpressHyb Hybridization Solution" (Clontech, Palo Alto, CA). Las transferencias se lavaron en SSC 2x, SDS al 0,1% a temperatura ambiente dos veces, durante veinte minutos cada vez. Después las transferencias se lavaron en SSC 0,1x, SDS al 0,1% a 50ºC durante 10 minutos y después se expusieron a película.
Los resultados del análisis de Northern son los siguientes:
Para los ratones de control no transgénicos no se observó señal para \alpha2 o \beta10.
Para el ratón transgénico Nº 94 (macho) no se observó señal para \alpha2 o \beta10.
Para el ratón transgénico Nº 25 (hembra) y 45 (hembra) se observó una señal marcada tanto para \alpha2 como para \beta10.
Para el ratón transgénico Nº 95 (macho) se observó una señal moderada para tanto \alpha2 como para \beta10.
Para el ratón transgénico Nº 53 (macho) se observó una señal moderada para \alpha2 y una señal más débil para \beta10.
Para el ratón transgénico Nº 31 (macho) se observó una señal moderada para \beta10 pero no se observó señal para \alpha2, indicando que el ratón Nº 31 sobre-expresaba sólo \beta10 y no \alpha2. El nivel de expresión de \beta10 en el ratón Nº 31 fue significativamente mayor que el observado en el ratón Nº 53.
Los resultados de expresión para el ratón transgénico Nº 31 son coherentes con el genotipado por PCR descrito anteriormente para el cual el Nº 31 fue positivo para el "casete de expresión de apoE humano de \beta10 genómico de ratón" pero negativo para el "casete de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón". Los datos para el ratón Nº 31 indican que la región de "casete de expresión de apoE humano \alpha2 genómico de ratón" del ADN del "transgén de vector de expresión de apoE humano de \alpha2 genómico de ratón de \beta10 genómico de ratón" se truncaba en algún punto durante el proceso de microinyección que daba como resultado un ratón que sobre-expresa \beta10 pero no \alpha2.
La rotura/truncamiento del ADN del transgén durante el proceso de creación de ratones transgénicos se ha indicado previamente en la bibliografía de transgénicos.
Se examinaron los cortes teñidos con H&E y BrdU de hígado, vesícula biliar, bazo, pulmón, cerebro, pituitaria, corazón, riñón, adrenal, timo, estómago, intestino delgado, páncreas, ciego, colon, nódulo linfático mesentérico, piel, glándula mamaria, tráquea, esófago, tiroides, paratiroides, glándula salival, vejiga urinaria, ovario o testículo, útero o próstata y vesícula seminal, hueso y médula ósea de los 4 sobre-expresores de \alpha2/\beta10 (Nº 25, 45, 53 y 95), los 5 ratones de control no transgénicos (Nº 17, 18, 19, 20 y 21) y el ratón transgénico Nº 31, que sólo sobre-expresaba \beta10 pero no \alpha2.
La tinción inmunohistoquímica para BrdU se realizó en cortes incrustados en parafina de 4 \mum de grosor usando un Sistema de Tinción Histoquímica automatizado DPC Mark 5 (Diagnostic Products Corp., Randolph, NJ). Los cortes de tejido desparafinados se digirieron con proteasa al 0,1% y después se trataron con ácido clorhídrico 2 N. Los cortes se bloquearon con CAS BLOCK (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de rata anti-BrdU (Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY). El anticuerpo primario se detectó con un anticuerpo policlonal anti-inmunoglobulina de rata de conejo biotinilado (Dako, Carpinteria, CA). Después, los cortes se inactivaron con peróxido de hidrógeno al 3% y se sometieron a reacción con un complejo terciario de avidina-biotina (Vector Laboratories). La reacción de tinción se visualizó con diaminobencidina (DAB, Dako Carpinteria, CA) y los cortes se tiñeron por contraste con hematoxilina.
Los cuatros sobre-expresores de \alpha2/\beta10 mostraron hepatomegalia (6,75 \pm 0,68% de PC frente a 4,98 \pm 0,29% de PC en ratones de control no transgénicos, p = 0,0011) e hipertrofia renal (2,23 \pm 0,21% de PC frente a 1,75 \pm 0,12% de PC en ratones de control no transgénicos, p = 0,0033). Los ratones sobre-expresores de \alpha2/\beta10 también tuvieron un peso corporal medio ligeramente menor que sus homólogos de control no transgénicos; esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Los ratones sobre-expresores de \alpha2/\beta10 Nº 45 y 53 también mostraron esplenomegalia moderada. El ratón transgénico Nº 31, que sólo sobre-expresaba \beta10 y no \alpha2, tenía peso de hígado, riñón y bazo normal.
Los cuatro ratones sobre-expresores de \alpha2/\beta10 tuvieron niveles de T4 en suero elevados (23,1 \pm 5,4 microgramos/dl frente a 5,0 \pm 0,7 microgramos/dl en ratones de control no transgénicos, p = 0,0001) y los ratones transgénicos Nº 25 y 45 tuvieron linfocitosis circulatoria moderada. El ratón transgénico Nº 31, que sólo sobre-expresaba \beta10 y no \alpha2, tenía niveles de T4 en suero y recuento linfocítico normales. Los valores de T4 en suero individuales para cada ratón son los siguientes: Nº 17 (5,0 microgramos/dl), Nº 18 (4,8 microgramos/dl), Nº 19 (6,3 microgramos/dl), Nº 20 (4,4 microgramos/dl), Nº 21 (4,7 microgramos/dl), Nº 25 (28,5 microgramos/dl), Nº 45 (26,9 microgramos/dl), Nº 53 (18,2 microgramos/dl), Nº 95 (18,7 microgramos/dl) y Nº 31 (3,2 microgramos/dl).
Se examinaron los cortes teñidos con H&E y BrdU de hígado, vesícula biliar, bazo, pulmón, cerebro, pituitaria, corazón, riñón, adrenal, timo, estómago, intestino delgado, páncreas, ciego, colon, nódulo linfático mesentérico, piel, glándula mamaria, tráquea, esófago, tiroides, paratiroides, glándula salival, vejiga urinaria, ovario o testículo, útero o próstata y vesícula seminal, hueso y médula ósea de los cuatro ratones sobre-expresores de \alpha2/\beta10, los 5 ratones de control no transgénicos y el ratón Nº 31, que sólo sobre-expresaba \beta10 y no \alpha2. Histológicamente, los cuatro ratones sobre-expresores de \alpha2/\beta10 mostraron glándulas tiroides aumentadas bilateralmente que contenían múltiples adenomas papilares foliculares. Los cuatros ratones sobre-expresores de \alpha2/\beta10 también mostraron hiperplasia hepatocelular de leve a moderada con un aumento en el marcaje con BrdU hepatocelular frente a los ratones no transgénicos. El ratón transgénico Nº 31 no tuvo ninguna de estas características.
En resumen, los cuatro ratones transgénicos sobre-expresores de \alpha2/\beta10 mostraron un fenotipo caracterizado por aumento tiroideo bilateral con múltiples adenomas papilares foliculares e hipertiroidismo resultante, como se indicó mediante los niveles de T4 en suero elevados. Se pensó que otros cambios fenotípicos estaban relacionados con el estado hipertiroideo sistémico e incluían hepatomegalia moderada, hiperplasia hepatocelular y niveles de colesterol en suero ligeramente disminuidos, hipertrofia renal bilateral y una leucocitosis leve a moderada con una predominancia de linfocitos.
Los ratones transgénicos que sobre-expresan \alpha2 y no \beta10 de ratón (Nº 7, 8, 26, 28, 156 y 186), descritos anteriormente, no tenían fenotipo y el ratón transgénico Nº 31 que sobre-expresaba \beta10 y no \alpha2 no tenía fenotipo. Esto indica que el fenotipo hipertiroideo observado en los cuatro ratones transgénicos sobre-expresores de \alpha2/\beta10 (Nº 25, 45, 53 y 95) se pueden atribuir a la hormona heterodimérica de \alpha2/\beta10 descrita en la presente invención.
<110> Amgen Inc.
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<120> Polipéptido y Heterodímero de Hormona Glicoproteica Similar a Beta
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<130> A-676B
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<140> Todavía no asignado
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<141> 27-03-3001
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<150> 09/723.970
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<151> 27-11-2000
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<150> 60/199.211
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<151> 24-04-2000
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<150> 60/192.654
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<151> 28-03-2000
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<160> 28
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<170> PatentIn versión 3.0
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<210> 1
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<211> 130
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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\hskip0,8cm
3 
\hskip0,8cm
4 
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<210> 2
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<211> 390
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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\hskip0,8cm
5 
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<210> 3
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<211> 106
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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\hskip0,8cm
6 
\hskip0,8cm
7 
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<210> 4
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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atgaagctgg cattcctctt cctt 
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24 
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<210> 5
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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gcatgtgctg ctcacacagg 
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21 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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ctgcaggtgc cttcggatc 
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19 
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<210> 7
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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gagacatctc cccactgtgt tt 
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22 
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<210> 8
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 8
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gtttccccca acagaatgtc aa 
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22 
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<210> 9
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 9
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atgcctatgg cgtcccctca aac 
\hfill
23 
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<210> 10
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 10
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ctcgtcgcga gagaggcgac acatgtca 
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28 
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<210> 11
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<211> 130
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 11
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8 
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<210> 12
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<211> 393
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<400> 12
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9 
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<210> 13
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<211> 06
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 13
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\hskip0,8cm
10 
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<210> 14
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 14
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attactagtt ccaccatgaa gttggtatac cttgtcctt 
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39 
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<210> 15
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 15
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ttaataatcg atcgtcagat ggtctcacac tcagtg 
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36 
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<210> 16
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 16
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ccgcactagt tccaccatgc ccatggcacc acgagt 
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36 
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<211> 41
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 17
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gcggcgttcg atcgctagta gcgggagaaa cggcacatat c 
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41 
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<210> 18
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<211> 815
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<400> 18
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\hskip0,8cm
11 
\newpage
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<210> 19
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcctctagaa agagctggga c 
\hfill
21 
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<210> 20
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgtgttc catttatgag c 
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21 
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<210> 21
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskip
attactagtt ccaccatgaa gttggtatac cttgtcctt 
\hfill
39 
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<210> 22
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaataatcg atcgtcagat ggtctcacac tcagtg 
\hfill
36 
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<210> 23
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<211> 2985
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
\newpage
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<400> 23
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\hskip0,8cm
12 
\hskip0,8cm
13 
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<210> 24
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<400> 24
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ccagtgtgat atgtgccgtt tc 
\hfill
22 
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<210> 25
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Virus Simio 40
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<400> 25
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaagagcgca gagctcggta 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<400> 26
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\hskip-.1em\dddseqskip
tggagtcgat cctttctaca ccta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 27
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Virus Simio 40
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<400> 27
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agagcgcaga gctcggtac 
\hfill
19 
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<210> 28
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligopéptido
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<400> 28
\hskip0,8cm
14

Claims (34)

1. Un dispositivo, que comprende: (a) una membrana adecuada para implante y (b) células encapsuladas dentro de dicha membrana, donde dichas células se han modificado por ingeniería genética para expresar y secretar un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:
(i)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3;
(ii)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos madura expuesta en SEC ID Nº: 3, que comprende un extremo amino maduro en el residuo 1, comprendiendo opcionalmente además una metionina amino-terminal;
(iii)
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para un ortólogo de SEC ID Nº: 3;
(iv)
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3;
(v)
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos para una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o al menos uno de (ii)-(iv);
(vi)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 con al menos una sustitución de aminoácido conservativa;
(vii)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 con al menos una inserción de aminoácido;
(viii)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 con al menos una supresión de aminoácido;
(ix)
un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 que tiene un truncamiento en el extremo C y/o en el extremo N y
(x)
un heterodímero de polipéptido \beta10 de hormona glicoproteica humano y polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano o una variante alélica o variante de empalme de los mismos
donde el polipéptido de (iii)-(ix), cuando se heterodimeriza al polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano, tiene una actividad del heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 humano y donde dicha membrana es permeable a dicha proteína e impermeable a materiales nocivos para dichas células.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un heterodímero de polipéptido \beta10 de hormona glicoproteica humano de la reivindicación 1(i) a 1(ix) y polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano.
3. La variante alélica o variante de empalme del heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 de la reivindicación 2.
4. El heterodímero de la reivindicación 2 o variante alélica o variante de empalme del mismo que está modificado covalentemente con un polímero soluble en agua.
5. El heterodímero de la reivindicación 4 en el que el polímero soluble en agua se selecciona entre el grupo que consiste en polietilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, poli-(N-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, co-polímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico.
6. Un vector que comprende moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido \beta10 de hormona glicoproteica humano de la reivindicación 1(i) a 1(ix) y polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica humano.
7. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de la reivindicación 6.
8. La célula hospedadora de la reivindicación 7 que es una célula procariota.
9. La célula hospedadora de la reivindicación 7 que es una célula eucariota.
10. Un proceso para producir un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para expresar el heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 y, opcionalmente, aislar el heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 del cultivo.
\newpage
11. Un proceso para determinar si un compuesto modula la actividad o la producción de heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 que comprende exponer una célula de acuerdo con la reivindicación 7 al compuesto y medir la actividad o producción de heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 en dicha célula.
12. Un anticuerpo producido inmunizando un animal con un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 humano, donde el anticuerpo se une específicamente al heterodímero \alpha2/\beta10.
13. El anticuerpo de la reivindicación 12 o un fragmento del mismo que comprende al menos una región determinante de complementariedad con especificidad por un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10.
14. El anticuerpo de la reivindicación 12 o un fragmento del mismo que se une específicamente a al menos uno de los siguientes:
(a)
el heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 de la reivindicación 2;
(b)
un fragmento del heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 de la reivindicación 2 y
(c)
una variante alélica o variante de empalme de (a) o (b).
\vskip1.000000\baselineskip
15. El anticuerpo de la reivindicación 14 que es un anticuerpo humanizado.
16. El anticuerpo de la reivindicación 14 que es un anticuerpo humano o fragmento del mismo.
17. El anticuerpo de la reivindicación 14 que es un anticuerpo policlonal o fragmento del mismo.
18. El anticuerpo de la reivindicación 14 que es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo.
19. El anticuerpo de la reivindicación 14 que es un anticuerpo quimérico o fragmento del mismo.
20. El anticuerpo de la reivindicación 14 que es un anticuerpo con injerto de CDR o fragmento del mismo.
21. Un fragmento del anticuerpo de la reivindicación 14 que es un fragmento de región variable.
22. El fragmento de la reivindicación 21, donde el fragmento de región variable es un fragmento de Fab o Fab'.
23. El anticuerpo de la reivindicación 14 que está unido a un marcador detectable.
24. El anticuerpo de la reivindicación 14 que antagoniza una actividad biológica del heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10.
25. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 18 que es específico para un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10.
26. Un método in vitro para detectar o cuantificar la cantidad de un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 usando el anticuerpo de la reivindicación 14.
27. Uso de un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 de acuerdo con la reivindicación 2 o un anticuerpo de unión específica que se une específicamente a dicho heterodímero o fragmento o fragmento de origen natural del mismo para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno relacionado con la glándula tiroides, una enfermedad o trastorno homeostásico metabólico o de energía/nutricional, una enfermedad o trastorno relacionado con el estrés, una enfermedad o trastorno relacionado con la reproducción o gestación o una enfermedad o trastorno relacionada con la proliferación y/o diferenciación celular.
28. Una composición que comprende el heterodímero de la reivindicación 2 o una variante alélica o variante de empalme de dicho heterodímero o un fragmento de dicho heterodímero o un anticuerpo de unión específica de cualquiera de los anteriores y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
29. La composición de la reivindicación 28 en la que el agente de formulación farmacéuticamente aceptable es un vehículo, adyuvante, solubilizante, estabilizante o antioxidante.
30. Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en:
(i)
la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 2;
(ii)
una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 1;
(iii)
una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones altamente rigurosas al complemento de (i) o (ii);
(iv)
una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de (i)-(iii);
(v)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70 por ciento con el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 1
(vi)
una secuencia de nucleótidos que codifica una variante alélica o variante de empalme de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 2;
(vii)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como el expuesto en SEC ID Nº: 1 con al menos una sustitución de aminoácido conservativa.
(viii)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se expone en SEC ID Nº: 1 con al menos una inserción de aminoácido;
(ix)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como el expuesto en SEC ID Nº: 1, con al menos una supresión de aminoácido;
(x)
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como el expuesto en SEC ID Nº: 1 que tiene un truncamiento en el extremo C y/o N;
(xi)
una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones altamente rigurosas al complemento de cualquiera de (viii)-(xii) y
(xii)
una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de (viii)-(xi)
donde el polipéptido codificado de (iii), (v)-(xi), cuando se heterodimeriza a polipéptido \alpha2 de hormona glicoproteica, tiene una actividad del heterodímero \alpha2/\beta10 de hormona glicoproteica humano, para la preparación de un medicamento para modular niveles de un heterodímero de hormona glicoproteica \alpha2/\beta10 en un animal.
\vskip1.000000\baselineskip
31. Un polipéptido de fusión que comprende el heterodímero de la reivindicación 2 o variante alélica o variante de empalme del mismo fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
32. El polipéptido de fusión de la reivindicación 31 en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es un dominio constante de IgG o fragmento del mismo.
33. Un método para diagnosticar un proceso patológico o una propensión a un proceso patológico en el que el proceso patológico o la propensión al proceso patológico es un proceso patológico relacionado con la glándula tiroides o una propensión a un proceso patológico relacionado con la glándula tiroides basándose en la presencia o cantidad de expresión del heterodímero en un sujeto que comprende:
(a)
determinar la presencia o cantidad de expresión del heterodímero de la reivindicación 2 o variante alélica o variante de empalme del mismo en una muestra y
(b)
diagnosticar un proceso patológico o una propensión a un proceso patológico basándose en la presencia o cantidad de expresión del heterodímero.
en el que el heterodímero es capaz de regular la función tiroidea o promover la diferenciación o proliferación tiroidea.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Un método para identificar un compuesto que se une a un heterodímero que comprende:
(a)
poner en contacto el heterodímero de la reivindicación 2 con un compuesto y
(b)
determinar el alcance de unión del heterodímero al compuesto.
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